CN110225759B - 用于治疗皮肤真菌病和酵母感染的寡雄腐霉制剂，施用方法和测定寡雄腐霉细胞活力的方法 - Google Patents

用于治疗皮肤真菌病和酵母感染的寡雄腐霉制剂，施用方法和测定寡雄腐霉细胞活力的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110225759B
CN110225759B CN201680088849.6A CN201680088849A CN110225759B CN 110225759 B CN110225759 B CN 110225759B CN 201680088849 A CN201680088849 A CN 201680088849A CN 110225759 B CN110225759 B CN 110225759B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pythium oligandrum
formulation
microorganism
administration
dermatomycosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680088849.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110225759A (zh
Inventor
M·沙涅克
R·克利麦斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIO AGENS RESEARCH AND DEVELOPMENT - BARD SRO
Original Assignee
BIO AGENS RESEARCH AND DEVELOPMENT - BARD SRO
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from CZ2016-417A external-priority patent/CZ307642B6/cs
Application filed by BIO AGENS RESEARCH AND DEVELOPMENT - BARD SRO filed Critical BIO AGENS RESEARCH AND DEVELOPMENT - BARD SRO
Publication of CN110225759A publication Critical patent/CN110225759A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110225759B publication Critical patent/CN110225759B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种含有真菌寄生微生物寡雄腐霉(Pythium oligandrum)的制剂，其用于治疗皮肤和粘膜上的皮肤真菌病和酵母感染，其得自含有0.1至99.9重量％的真菌寄生微生物寡雄腐霉和0.1至99.9％的辅助物质的干燥混合物，所述辅助物质含有至少一种选自吸附剂、缓冲剂、保湿剂、除臭剂和芳香剂的组分。该制剂在施用制剂部位每1ml水性悬浮液含有1至10×106个，优选10至50个微生物寡雄腐霉的活细胞，其中寡雄腐霉微生物的活细胞包含休眠的卵孢子、被囊的游动孢子和活的多核菌丝体。要求保护使用该制剂的不同施用方法。示例性实施方案显示使用在皮肤科医生、口腔科医师和兽医的监督下进行的遗传测试和实际测试的细胞活力。

Description

用于治疗皮肤真菌病和酵母感染的寡雄腐霉制剂，施用方法 和测定寡雄腐霉细胞活力的方法
技术领域
本发明涉及一种具有真菌寄生微生物寡雄腐霉(Pythium oligandrum)的制剂，其用于治疗皮肤和粘膜上的皮肤真菌病(dermaphytoses)和酵母感染。该制剂以水性悬浮液的形式存在，所述水性悬浮液由含有0.1至99.9重量％的真菌寄生微生物寡雄腐霉和0.1至99.9％的辅助物质的干燥混合物制备，所述辅助物质含有至少一种选自吸附剂、缓冲剂、保湿剂、除臭剂和芳香剂的组分。
此外，本发明涉及测定微生物寡雄腐霉的细胞活力的方法。
本发明还涉及施用该制剂的方法。
背景技术
皮肤真菌病是由皮肤真菌引起的真菌感染，所述皮肤真菌是特别攻击皮肤、指甲和毛发的喜角质真菌，并且所述喜角质真菌的特征在于长的潜伏期。由于这些喜角质真菌表面的有效掩蔽使其免于免疫分子识别，这主要由宿主免疫系统的最小反应促进。喜角质真菌通过有效的酶促降解和代谢消化的组分的优势，使用存在于人体整个表面的皮肤中的角蛋白作为其重要的营养物质。这些霉菌由毛癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)和小孢子菌属(Microsporum)物种代表，并且已经鉴定了使这些微生物以其生活方式生存的因子的分子性质(6)。皮肤和粘膜真菌病的特征在于不同的表现，通常包括刺激、发红、剥落片或甚至更大的皮肤区域，皮肤有时是白色的并且在更高敏感性的区域软化。常见的伴随症状包括出汗增加和社交麻烦的气味(臭气)症状，证明在受影响部位的晚期生态失调(dysbiosis)。
皮肤真菌病(dermaphytosis)的同义词是癣(tinea)，其中，根据其解剖学定位，最常见的皮肤真菌病(dermatophytosis)形式是脚癣(脚上)、甲癣(指甲下)、体癣(身体上的真菌感染，主要在躯干的无毛部分和下肢的近端部分)、股癣(腹股沟区，最常见于夏季穿着紧身衣出汗后的年轻男性)、头癣(在浓密头发中短碎毛发的圆形病灶，大多数是在与嗜动物皮肤真菌如犬小孢子(Microsporum canis)接触的儿童之间)。尽管皮肤真菌病通常不是致命疾病，但它们是非常普遍的感染，其影响了相当大百分比的人群，并且其症状使得工作和社交生活对于患有这些疾病的人来说是不愉快的。
机会性微生物酵母感染在人类中是相对普遍的现代疾病，其中生活在人的皮肤和粘膜中的通常无害的共生酵母由于在压力、工作超负荷、病毒感染或其他压力情况期间免疫系统的弱化而被活化，并转变为侵略性形式，其特征在于不同形态和代谢。研究主要集中在最常见的致病酵母白色念珠菌(Candida albicans)和其相关物种。最近，分子和遗传研究有助于鉴定负责致病酵母这种异常行为的各个因子，这些因子随后是新开发的疗法的重要目标(2)。
目前可用于治疗皮肤真菌和酵母感染的疗法主要是来自唑类、烯丙胺类和棘白菌素类的化学抗真菌产品，然而，这些产品因其低效和频繁的副作用而不利于广泛的使用者群体(老年人、糖尿病或肝病患者、免疫力减弱的人)而声名狼藉。使用这些产品的疗法相对非常昂贵，且只产生暂时的效果。他们无法以任何方式处理与此类疾病相关的生态失调(破坏正常的生理微生物群落)。出于这个原因，长期有效的以稳定正常微生物群落的现代治疗是一项主要挑战。
迄今为止，使用天然生物制品来治疗皮肤真菌病和酵母感染仅开发了很小的程度。使用寡雄腐霉微生物来保护皮肤的问题在Biopreparáty spol s r.o.的员工、发明人等人的实用新型CZ 9883U(优先权日期为1999年11月18日)中有涉及。作者使用一种卵孢子的量为每1g产品不超过2×105个卵孢子悬浮液来处理9组患者的某些皮肤问题。然而，正如CZ 9883U的作者错误地认为的那样，这不是消除皮肤真菌病起源的情况，其中在文件中并没有任何证据来证实这种争论。作者展示了寡雄腐霉微生物对Scopulariopsisbreviacaulis效果的实验室结果；然而，这种微生物是腐生土壤微生物(而不是皮肤真菌)。在CZ UV9883监测的任何患者中都没有进行微生物检查，因此不可能证明他们实际上是如何受到皮肤真菌的影响。就所宣称的治疗效果而言，文件中没有提及患者受到医学监测，并且在许多情况下，所涉及的描述的效果(指甲颜色的变化、疼痛消失)更多地是他们的主观感受问题。由本发明的申请人拥有的专利CZ 302297在要求的毒理学测试后首次使用更高浓度的卵孢子(每1g产品超过2×105)，但不涉及更具体的人皮肤真菌病或酵母感染的问题。相反，该解决方案的优点在于它首先阐明了真菌寄生微生物寡雄腐霉在除水性悬浮液之外的环境(例如软膏、油和其它施用形式)中起作用的能力。此外，首次强调了除休眠卵孢子以外的寡雄腐霉微生物的活细胞形式的重要性，特别是被囊的游动孢子和菌丝体的活片段作为直接真菌寄生中最有效的寡雄腐霉微生物的形式。由本发明的申请人拥有的实用新型CZ 28816 U详细地涉及使用二元微生物制剂的机会性微生物感染的问题；然而，这些二元微生物制剂特征在于使用菌落形成单位(CFU)的经典方式，其使用在寡雄腐霉微生物的情况下并非没有缺陷。
因此，现有解决方案的缺点和对开发医药产品的道路的显著限制是缺乏对有效物质寡雄腐霉的性质的充分理解，寡雄腐霉在制剂中的量通常不能精确测定。因此，确定这些制剂的强度和有效性可能很难确定和再现。
发明内容
根据本发明权利要求1，在治疗皮肤和粘膜上的皮肤真菌病和酵母感染中，以上所述的缺点由含有真菌寄生生物体寡雄腐霉的制剂消除或显著限制，其实质是基于以下事实：在施用部位施用的每1ml水性悬浮液制剂含有1至10×106个，优选10至50个微生物寡雄腐霉的活细胞，其中寡雄腐霉微生物的活细胞含有休眠的卵孢子、被囊的游动孢子和活的多核菌丝体。
此外，所述发明的新主题也是测定微生物寡雄腐霉的细胞活力的方法。所提交的发明的真菌寄生微生物寡雄腐霉的细胞活力是指通过制剂的遗传测试、通过测量寡雄腐霉微生物的β-微管蛋白的组成型基因的表达水平来测定的活力(11)，所述微生物在30℃在正常大气中保持在富含营养物的培养基中。
所提交的发明还涉及施用根据本发明的制剂的方法，其实质基于以下事实：所述方法包括以下步骤：a)在确定体积的微温水或生理溶液中机械分散干燥混合物来制备水性悬浮液，以获得在施用部位含量为每1ml水性悬浮液1至10×106个真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞，有利地1至500个真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞，优选10至50个真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞；b)根据所治疗的诊断类型，使用推荐量的真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞，施用以这种方式产生的水性悬浮液；c)根据所治疗的诊断，在施用部位定殖真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞；d)根据所治疗的诊断，在施用部位繁殖真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞以消除皮肤真菌或酵母；e)随后在施用部位进行孢子形成并同时消除制剂，促进正常微生物群落的稳定和发展，以确保长期治疗效果。
根据本发明的制剂以软膏、油、凝胶、喷雾、保湿膏药或粉末形式的施用以本领域技术人员已知的方式进行，其目的是对应于特定诊断要求使用一定量的活细胞在受影响的施用部位定殖。
本领域技术人员已知的生理溶液被理解为例如最常见的浓度为每1升9g的NaCl溶液，或者例如通过以每1升10毫克的量的磷酸钠缓冲的生理溶液-所谓的PBS(磷酸盐缓冲盐水)。
原则上，任何活细胞都能够确保真菌寄生微生物寡雄腐霉在施用部位的定殖和繁殖。在润湿干燥混合物后24-48小时内能够根据局部条件提供活细胞的休眠卵孢子在根据本发明制剂中以最高量表示。根据本发明的制剂还含有被囊的游动孢子和活的多核菌丝体，其通常能够在润湿干燥混合物后20分钟内提供活细胞。
根据所治疗的诊断，在施用部位以本领域技术人员已知的方式进行定殖真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞。根据我们的经验，根据所提交的发明的制剂中的所有这些方法取决于在施用部位靶微生物如皮肤真菌或酵母的存在。如果存在真菌寄生微生物寡雄腐霉的这种靶微生物，则这导致活细胞在附着于这些靶微生物即皮肤真菌或酵母后1-2小时内定殖。使用由靶微生物提供的营养物，寡雄腐霉微生物在一到两天内繁殖。在消除靶微生物约两周内，活细胞从施用部位消失。此时，由于来自靶微生物的营养物已经耗尽，我们看到了寡雄腐霉微生物在施用部位转变为空闲(idle)形式，即孢子形成。以这种方式产生的休眠卵孢子在皮肤和粘膜上不能存活很长时间，因为它们通常在这些施用部位通过动态过程去除，即例如通过从受影响的部位分离死细胞和释放粘膜上的分泌物。根据经验确定，真菌寄生微生物寡雄腐霉离开施用部位为正常微生物群落的发展和稳定创造了条件。
当将根据本发明的制剂与推荐量的真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞一起施用时，申请人凭经验确定在治疗皮肤真菌病和甲癣中，在1ml水性悬浮液中推荐的活细胞量是50，而它在消除非愈合伤口中的酵母中是30，在消除口腔中的酵母中是10。
为了治疗根据本发明的甲癣形式的皮肤真菌病，施用一种制剂，其在每1ml水性悬浮液制剂中理想地含有50个活细胞，以每1cm2受影响区域0.15ml该悬浮液的量、以湿包裹形式或以乳霜、软膏、湿巾、抗微生物喷雾、湿润贴剂和粉末形式施用。
为了治疗根据本发明的非愈合伤口中的酵母感染，该制剂使用每1ml在生理溶液中的水性悬浮液理想地含有30个活细胞的湿敷料以湿性愈合产品的形式施用，并且随后在8小时后用每1ml在生理溶液中的水性悬浮液理想地含有30个活细胞的湿敷料替换，为期4天。湿性愈合形式也可以以该浓度的乳霜、软膏、湿巾、抗微生物喷雾、湿润贴剂的形式施用，并且随后在8小时后施用这些湿性愈合产品，为期4天。
为了治疗根据本发明的口腔中的酵母感染，通过用以水性悬浮液(其每1ml施用水性悬浮液理想地含有10个活细胞)形式的产品冲洗来进行施用，其中冲洗每天至少进行两次，为期连续5天。寡雄腐霉微生物的活细胞也可用于牙膏、凝胶或口腔喷雾，或者可使用注射器和针头将水性悬浮液施用于待治疗的部位。所有这些施用每天至少进行两次，为期连续5天。
本发明的主要优点是证实了真菌寄生微生物寡雄腐霉细胞的活力，在监测的诊断中实现了显著和长期的治疗效果，制剂的稳定性，其可在干燥状态被控制和储存更长的时间(长达2年)，并且在施用期间可以有更精确和控制的剂量。已证实的真菌寄生微生物寡雄腐霉抑制和杀死致病酵母白色念珠菌的能力可以作为开发其他制剂以抵抗其他诊断(例如阴道真菌病(念珠菌病))的起点。
就目前的技术水平和迄今为止施用的杀真菌生物制剂而言，本发明的另一个优点是用于治疗皮肤和粘膜上的皮肤真菌病和酵母感染的根据本发明的制剂含有精确确定量的有效生物物质，其基于测量的真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞的量，其中精确的分子方法用于测定活细胞，以及施用该制剂的方法，这些都是临床测试的。
本发明有助于产生新一代制剂，其使用低微生物污染值的具有已知休眠卵孢子、被囊的游动孢子和活的多核菌丝体的活力的寡雄腐霉微生物。要求保护的制剂可以包括在批准的剂型和公告的制剂中，其具有实验室中描述的新的和可再现的治疗效果和实施例中描述的实施测试。描述了在实验室悬浮试验中抑制皮肤真菌和致病酵母的生长，以及在施用期间对动物皮肤真菌病的效果、人类甲癣的治疗和在糖尿病患者和非糖尿病患者的非愈合伤口和口腔中对致病酵母的抑制。
在先前的研究中采用了几种解决方案和方法来测定活力参数，尽管这些都不是特别适合于此目的。这些包括基于不同染色活力技术的方法，这些方法适用于其他类型的细胞，但在寡雄腐霉微生物中已知其程序复杂和结果不太可靠。本发明的申请人知道在高浓度渗压剂的质壁分离技术，这提供了可靠的结果，但这取决于观察者显微镜下的主观评价。除此之外，它还提供了有关寡雄腐霉卵孢子的完整性的信息，而没有其活力的信息。
另一组广泛使用的方法是基于在培养皿上铺板含有寡雄腐霉活细胞的制剂，随后监测形成的菌落数。不幸的是，寡雄腐霉的生物学特性和其活跃生活方式以及通过多核菌丝体的高速线性传播与这些方法并不特别相容，否则这些方法是微生物学中的常见标准。通常，测定寡雄腐霉微生物休眠卵孢子制剂活力的最终可能性是直接显微镜监测萌发的卵孢子。然而，相反，这要求时间并且是从所使用的实验技术(视频镜头)的角度。
鉴于上述问题，测定寡雄腐霉微生物细胞活力的巨大希望被放在分子遗传技术上。在我们以前的工作中，我们尝试使用基于该微生物的两个独立靶基因序列的qPCR扩增的分子测试来测定活力(4)。尽管如此，由于该方法的相当大的背景，这种方法被证明不适用于许多含有高含量的寡雄腐霉微生物死亡细胞的制剂。在这方面，仅通过寡雄腐霉微生物的活细胞表达的某些组成性转录物的监测证明是更好的解决方案，最终选择了β-微管蛋白的转录物，其是该微生物丰富表达的蛋白质。整个实验需要一周的时间，并且包括在含有青霉素(以抑制污染细菌的生长)的培养基中培养休眠的卵孢子，为期4天，每24小时采样一次，并通过逆转录酶使用RT-PCR方法转录来进行分析。我们通过外推线性化、测量的生长到零点的时间依赖性指数曲线来找到活力值。
这种测定方法的优点是无论其年龄和制备方法如何，都可以精确测定任何寡雄腐霉微生物制剂中活细胞的量。必须强调的是，含有寡雄腐霉微生物的制剂中细胞的活力在很大程度上取决于其制备和储存方法。由于这个原因，几乎不可能用显微镜在制剂中测定的休眠卵孢子的总数来判断该参数(不同的测定表明，寡雄腐霉微生物的活细胞量为监测的休眠卵孢子量的0.01％至30％，这提供高度不确定的数据)。从上面指出的原因可以清楚地看出，现有的基于所声明的卵孢子总数表达寡雄腐霉微生物的生物效力(有效剂量)而不测定其活力的做法提供了难以重复的结果，这些结果基本上难以使用，并且即使在校正所施用物质的量后，也不可能测定最佳施用剂量。当使用新建立的方法时，实验室和实际测试的结果是一致的，并且都指出在每毫升施用的混合物含有10至50个活卵孢子的悬浮液中的不同实际施用中的最佳活性。
除了施用方案的最佳设置之外，申请人进行的休眠卵孢子活力的测量，以及在所提交的发明的下文中描述的测量对于监测各批次制剂的稳定性测试也是重要的。我们对于有效性测试的实践经验毫不含糊地证明，当休眠卵孢子数量下降至低于每克制剂330个(每毫升施用的混合物10个)时，消除皮肤真菌和酵母的效果下降，而在该值下降至低于33个/g(每毫升施用的混合物1个)时，不可能保证阳性效果。相反，在具有非常高含量的休眠卵孢子的制剂中，浓度和有效性的关系不能明确表达，主要取决于这种制剂的纯度与输入成分的纯度和观察的技术的细致性有关。当出现污染物质时，在每1克混合物含有超过33，000个休眠卵孢子(每毫升施用的混合物1，000个)的制剂中可观察到有效性的必然下降，这可能是基于未知杂质的干扰影响。虽然在这种类型的制剂方面的经验非常有限，但在高度纯化形式的真菌寄生卵菌寡雄腐霉中没有观察到这种有效性的下降。
寡雄腐霉微生物的有效性的快速测试(特别是用皮肤真菌的小分生孢子或酵母悬浮液进行的悬浮测试)的另一个缺点是休眠卵孢子活力缓慢，至少需要48小时。出于这个原因，似乎优选用根据公开方法制备的被囊的游动孢子替换休眠卵孢子以进行这种测试。我们确定通过实验直接比较的两种制剂，即新制备的被囊的游动孢子和具有确定活力的休眠卵孢子，表现出相同的抑制皮肤真菌和致病酵母的能力。此外，在被囊的游动孢子的情况下，它是真菌寄生微生物寡雄腐霉的活细胞的可存储形式。
所提出的方法与测试活微生物医学制剂的要求高度兼容，其中需要定殖的证据以及在靶施用部位的生物学、代谢、形态学和其他活动的描述。根据本发明的方法在这方面已经成功地应用于动物皮肤真菌病的治疗，其中尤其使得可以阐明寡雄腐霉微生物在皮肤和其他施用部位(例如粘膜)消除生态失调和建立正常生理微生物平衡中的作用(4，9)。
附图说明
在示例性实施方案中进一步详细描述了技术方案，并且在所附的示意图中更详细地解释了该技术方案，其中：
图1显示了抑制皮肤真菌和酵母的有效性的实验室测试，这取决于添加的寡雄腐霉微生物的活的被囊的游动孢子的量，其中更详细地参考：
图1A和图1B描绘了使用皮肤真菌指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)var.mentagrophytes的集合菌株DMF2374在孵育24和48小时后的有效性测试。
图1C和图1D描绘了使用皮肤真菌犬小孢子菌(Microsporum canis)集合菌株CCM8353在孵育24和48小时后的有效性测试。
图1E和图1F描绘了使用皮肤真菌絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)集合菌株PL231在孵育24和48小时后的有效性测试。
图1G和图1H描绘了使用致病酵母白色念珠菌(Candida albicans)集合菌株CCF8261在孵育24和48小时后的有效性测试。
图2显示了治疗豚鼠的实验性皮肤真菌病的临床结果，该图的上半部分显示了用安慰剂治疗的豚鼠的结果，该图的下半部分显示了使用根据本发明的示例性实施方案1的悬浮液治疗的豚鼠的结果，并且更详细地说明于：
图2A显示了在治疗的第16天施用安慰剂的麻醉豚鼠背部照片，感染部位的皮肤有特征性的发红。
图2B描绘了施用安慰剂的动物皮肤的组织切片，显示皮肤上层中角质形成细胞的特征性增殖，其对未处理的皮肤真菌的刺激作出反应。
图2C描绘了在各治疗日施用安慰剂的动物皮肤真菌病的临床指数，标记为发红指数(浅灰色柱)和皮肤损伤指数(深灰色柱)。
图2D显示了在治疗的第16天施用根据本发明的示例性实施方案1的悬浮液的麻醉豚鼠背部照片，感染区域的皮肤的发红水平较低。
图2E描绘了施用根据本发明的示例性实施方案1的悬浮液的动物皮肤的组织切片，显示成功治疗的动物中角质形成细胞的增殖水平显著降低。
图2F描绘了在各治疗日施用根据本发明示例性实施方案1的悬浮液的动物皮肤真菌病的临床指数，标记为发红指数(浅灰色柱)和皮肤损伤指数(深灰色柱)。
实施例
我们提出的解决方案基于进一步的实验室分析和根据本发明的人和兽药制剂的实际测试而成为可能，其基于CZ 302297(其具体剂型现已指定用于治疗皮肤真菌病和甲癣、从非愈合伤口和口腔中消除酵母)。所提交的发明在以下示例性实施方案中进一步详细描述，但不应限于此。呈现这些示例性实施方案是为了确保描述是彻底的并且在专利权利要求的范围内描述本发明的实质。
实施例1
含有已知测定的活力的寡雄腐霉微生物的干燥混合物的制剂，其用于治疗豚鼠的皮肤真菌病、甲癣和在非愈合伤口和口腔中消除酵母。
(表1，表2，表3)
a)真菌寄生微生物寡雄腐霉的制备
将寡雄腐霉菌株M1(菌株DV74，其序列方案见下页)保持在琼脂中，并通过液体培养制备起始培养物。用液体培养物接种灭菌的小米谷粒(Panicum miliaceum L.)。培养在无菌条件下进行约7天，然后将湿生物质小心地干燥并研磨成含有平均尺寸为35-50μm的颗粒的粉末。在显微镜下估计卵孢子的量，并根据CZ 302297的条件将制剂标准化至每1g含量为7±1×106个卵孢子。
b)分3批测量微生物寡雄腐霉的细胞活力
为了测定微生物寡雄腐霉的活细胞数，所提交发明的申请人开发了一种原始方法，该方法使用根据本发明的水性悬浮液形式的制剂的遗传测试进行，测量在30℃在标准大气保持在富含营养物的培养基中的微生物寡雄腐霉的β-微管蛋白的组成型基因的表达水平。
使用以下程序测定分析材料中活细胞的量：称出1g干燥物质并在厨房搅拌器中与100ml水混合。将0.5ml该悬浮液与4.5ml培养基混合置于六孔培养皿中在30℃孵育，在孵育开始后48小时、72小时和96小时取50μl样品。提取核酸，将提取物用无核酸酶的水稀释50倍。然后根据标准方案在含有4μl提取物、1μl用于扩增寡雄腐霉的β-微管蛋白的引物混合物(3)和5μl酶混合物的反应混合物中进行逆转录和PCR扩增。将获得的指数曲线线性化并外推至初始零时间。以这种方式确定真菌寄生微生物寡雄腐霉(A)批次的情况中活力为每克物质41,700个，在真菌寄生微生物寡雄腐霉(B)批次的情况中活力为每克物质12,500个，在真菌寄生微生物寡雄腐霉(C)批次的情况中活力为每克物质8,300个。注意：在该实施方案和其他实施方案中括号中的字母A，B和C标记具有上述活力的各真菌寄生微生物寡雄腐霉的批次。
施用的寡雄腐霉M1的测序方案如下所示：
测试菌株DV74的寡雄腐霉M1_ITS4_rRNA
测试菌株DV74的寡雄腐霉M1，COXII线粒体细胞色素氧化酶
c)制备和施用治疗皮肤真菌病和甲癣的混合物
表1用于治疗皮肤真菌病和甲癣的制剂的组合物
d)制备和施用消除非愈合伤口中的酵母的混合物
表2用于消除非愈合伤口中酵母的制剂的组合物
e)制备和施用消除口腔中的酵母的混合物
表3：消除口腔中的酵母的制剂的组合物
实施例2
在实验室测试中抑制皮肤真菌和酵母的生长和消除皮肤真菌和酵母
(图1)
选择施用根据公开的方案(5)制备的被囊的游动孢子形式的微生物寡雄腐霉用于实验室有效性测试。选择悬浮测试方法，其优选用于验证其他制剂的抗微生物活性(1)。通过涡旋振荡2分钟来被囊的游动孢子，并在这些条件下在16℃保持直至实验开始。根据公开的方法(7，1)制备来自皮肤真菌指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)var.mentagrophytes DMF2374、犬小孢子菌(Microsporum canis)CCM8353、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)PL231的小分生孢子悬浮液以及白色念珠菌(Candidaalbicans)CCM8261酵母的悬浮液。将游动孢子的悬浮液和小分生孢子或酵母细胞的悬浮液稀释至所需浓度，并将细胞在六孔塑料皿中的悬浮液中在30℃培养48小时。在24和48小时后取出用于通过培养方法测定活细胞数的样品。
实验结果如图1所示。结果表明，在所有测试的情况中，被囊的游动孢子的量对于抑制皮肤真菌和致病酵母白色念珠菌的生长最佳，所述皮肤真菌和致病酵母白色念珠菌在每1ml 10至50个活细胞的含有皮肤真菌和酵母的检查溶液中进行研究。如果被囊的游动孢子的量较少，则无法保证有效抑制生长。令人惊讶的是，甚至更高量的游动孢子都不能在抑制靶微生物的生长方面产生更好的结果，这种生长相同或更高。
实施例3
在皮肤真菌感染的豚鼠中消除皮肤真菌并建立生理微生物群落
(图2)
该测试根据公开的方案(4，7)进行，通过经验证的指间毛癣菌(Trichophytoninterdigitale)var.Mentagrophytes DMF2374菌株进行感染。与本发明示例性实施方案中相同的混合物在施用期间用作安慰剂，培养生物质用水和根据本发明示例性实施方案1c的杀真菌物质替代作为实验物质。
该测试的结果在图2中描述。图2下半部分的治疗的豚鼠的整体外观和动物皮肤的组织学以及动物的临床皮肤真菌病指数的值清楚地显示了与使用安慰剂(其中省略了活性物质寡雄腐霉)治疗的动物相比，在治疗实验性皮肤真菌病中具有显著的临床效果。
实施例4
皮肤真菌的消除及改善患有甲癣患者的临床病况
(表4)
下页的表4显示了涉及21名受甲癣影响与其他皮肤真菌病相结合的患者的研究结果。在施用根据本发明的制剂之前，所有21名患者通过显微镜检查具有阳性结果，并且通过培养在所有患者中确认至少一种皮肤真菌的存在，在一些病例中两种皮肤真菌的存在。致病酵母白色念珠菌的存在是迄今为止伴随微生物学中最常见的。在伴随诊断中最常见的是糖尿病、脚癣和指间脚癣，并且在一个病例中，观察到手的真菌疾病。脚部的一个或多个指甲受到影响，达到平均1.5个指甲面积的程度。
对于研究中的所有患者，以夜间指甲包裹的形式连续两晚进行根据示例性实施方案1c的制剂的施用，并在14天和一个月后重复施用。
在施用结束后9个月进行有效性评估，即研究开始后10个月。大多数患者在显微镜下呈阴性，而培养显示两名患者有残留零星的皮肤真菌红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)存在，这种皮肤真菌在一名患者中存在的程度提高，一名患者零星存在白色念珠菌酵母。总的来说，真菌治疗的水平可以被评估为非常令人满意，其中解决了95％的患者的真菌负荷，且临床治疗在六分制评估中平均评估为2.1(1-完全治疗，没有指甲畸形，6-病况恶化)。尽管医学文献表明在这些病例中再感染的可能性很高，总共有12例患者治愈了甲癣，且没有任何指甲畸形(54.5％)，1例治疗患者残余畸形(4.5％)，超过50％的临床改善在6例患者(27.3％)中是明显的，一例患者(4.5％)有不显著的至多50％的改善，两例患者的临床病况即使在施用结束后9个月内没有变化(9.2％)。没有患者的临床病况恶化。
实施例5
在患者的非愈合伤口中抑制和消除致病酵母
(表5)
在初步实际研究中监测了施用根据本发明的制剂对12名患有非愈合伤口并发致病酵母白色念珠菌酵母感染的患者的影响。其中六名患者患有糖尿病，六名患者没有。糖尿病组患者的平均年龄为77.5岁，非糖尿病组为57.2岁。女性占绝大多数，她们已知对于曲张性溃疡和非愈合伤口的发生具有更高的易感性。从患者的既往病历中进一步发现，在治疗开始后至少6个月期间，使用常用的医疗制剂(包括抗生素)治疗非愈合伤口没有进展，并且对于一些患者治疗时间更长(长达2年)。
使用根据示例性实施方案1d的制剂制备的悬浮液作为湿性愈合的一部分，为患者提供湿处理。施用敷料，每8小时更换一次，共为期4天。所述施用非常显著地降低了微生物负荷，其中在糖尿病患者病例中致病酵母的存在降低了95.3％，在非糖尿病患者中降低了75.3％，在整个研究中观察到降低了85.3％。根据参与医生的评估，通过评价炎症过程的程度，脓液排出的强度等，感染的临床情况有所改善，糖尿病患者改善78.3％，非糖尿病患者改善67.2％，意味着整个研究总共改善了72.8％。在微生物负荷的减少和微生物感染的临床情况的改善之间发现了高度显著的相关性，这是在已发表的医学文献的背景中非常重要的发现。
表5
实施例6
抑制和消除口腔中的致病酵母
(表6)
在牙齿卫生救护车中的口腔科医生的监督下，对在口腔中存在致病酵母的12名患者进行了研究。
在微生物取样和诊断性质的说明之后，通知患者并提供一包含有5个根据示例性实施方案1d的泡腾片的制剂以消除口腔中的致病酵母。在晚上口腔卫生后，患者仔细清洗口腔，然后用制剂冲洗至少5分钟，条件是在微温水中预先活化后，所述制剂含有平均10个微生物寡雄腐霉的活孢子。在此之后没有冲洗口腔，使得施用溶液的剩余部分保持在口腔中过夜。早上重复施用，患者继续以这种方式持续为期5天，使用包装中的5个泡腾片。
随后的临床监测和有效性评估在施用后约6个月进行。在67.1％的病例中，致病酵母从口腔中消除，这伴随着受影响患者的临床病况平均改善66.8％。患者主要患有口腔和牙周疾病的反复炎症。再次确定口腔中酵母的存在减少和临床病况的改善之间的相关性。
表6
10例在口腔中患有酵母感染的患者微生物负荷改善与临床病况改善的相关性
工业实用性
在皮肤和粘膜上治疗皮肤真菌病和酵母感染的制剂可用于抑制与皮肤和粘膜上的皮肤真菌或酵母感染相关的症状，例如社交麻烦的气味症状、脚部过度排汗、刺激和灼伤、并且用于抑制和消除皮肤真菌和酵母在非愈合伤口中、口腔中、皮肤上、泌尿生殖系统粘膜上、头发中和受这些微生物影响的其他地方的存在。
参考文献
1.Barros MES，Santos DA，Hamdan JS(2006)Mycol Res 110，1355-1360.
2.Calderona RA，Fonzi WA(2001)Trends Microbiol 9，327-335.
3.Homer NR，Grenville-Briggs LJ，van West P(2012)Fungal Biol 116，24-41.
4.R，Suchánek M，/>L et al(2016)Vet Dermatol，in print.
5.Madsen AM，Robinson HL，Deacon JW(1995)Mycol Res 99，1417-1424.
6.Martinez DA，Oliver BG，Graser Y et al(2012)mBio 3，e00259-12.
7.Saunte DM，Simmel F，Frimodt-Moller N(2007)Antimicrob Agents Chemother 51，3317-3321.
8.CZ 302297(published 2011)Suchánek M，R
9.CZ 28816 U(published 16.11.2015)Suchánek M，R
10.CZ 9883 U(published 14.4.2000)D，/>L
11.Yacoub A，Berger H，Gerbore J et al.(2016)Genome Announcements4，e00215-16.

Claims (1)

1.一种含有真菌寄生微生物寡雄腐霉(Pythium oligandrum)菌株DV74的制剂，其用于治疗皮肤和粘膜上的皮肤真菌病和酵母感染，其中所述制剂在施用部位处于水性悬浮液形式，
其得自含有0.1至99.9重量％的真菌寄生微生物寡雄腐霉菌株DV74和0.1至99.9％重量的辅助物质的干燥混合物，所述辅助物质含有至少一种选自吸附剂、缓冲剂、保湿剂、除臭剂和芳香剂的组分，其中
所述制剂每1ml的水性悬浮液含有1至10×106个所述微生物寡雄腐霉DV74的活细胞，并且其中微生物寡雄腐霉的活细胞包含休眠的卵孢子、被囊的游动孢子和活的多核菌丝体，
其中所述制剂每1ml以水性悬浮液施用的制剂含有10至50个微生物寡雄腐霉菌株DV74的活细胞。
CN201680088849.6A 2016-07-01 2016-08-22 用于治疗皮肤真菌病和酵母感染的寡雄腐霉制剂，施用方法和测定寡雄腐霉细胞活力的方法 Active CN110225759B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZPV2016-403 2016-07-01
CZ2016403 2016-07-01
CZ2016-417A CZ307642B6 (cs) 2016-07-08 2016-07-08 Přípravek s mykoparazitickým mikroorganizmem Pythium oligandrum pro užití při léčbě dermatofytos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích
CZPV2016-417 2016-07-08
PCT/CZ2016/000095 WO2018001392A1 (en) 2016-07-01 2016-08-22 Preparation with the viable mycoparasitic microorganism pythium oligandrum for the treatment of dermaphytoses and yeast infections on the skin and mucous membranes, method of determining the cell's viability of the microorganism pythium oligandrum and method of applying the preparation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110225759A CN110225759A (zh) 2019-09-10
CN110225759B true CN110225759B (zh) 2023-09-29

Family

ID=66847908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680088849.6A Active CN110225759B (zh) 2016-07-01 2016-08-22 用于治疗皮肤真菌病和酵母感染的寡雄腐霉制剂，施用方法和测定寡雄腐霉细胞活力的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11331356B2 (zh)
EP (1) EP3478302B1 (zh)
JP (2) JP6667501B2 (zh)
KR (1) KR20190064563A (zh)
CN (1) CN110225759B (zh)
BR (1) BR112018077463B1 (zh)
CA (1) CA3029484A1 (zh)
ES (1) ES2957887T3 (zh)
MX (1) MX2019000269A (zh)
WO (1) WO2018001392A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210386073A1 (en) * 2016-10-14 2021-12-16 Biopreparáty, Spol. S R.O Biological antifugal liquid preparation with microorganism pythium oligandrum and method of production
CZ309743B6 (cs) * 2021-12-14 2023-09-06 Ústav chemických procesů AV ČR, v.v.i. Způsob výroby extraktu z Pythium oligandrum pro potlačení růstu buněk kožního melanomu, extrakt připravitelný tímto způsobem a jeho použití

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102655754A (zh) * 2009-11-04 2012-09-05 生物药物研究和开发-巴德有限公司 包含真菌生物寡雄腐霉的抗真菌混合物
CZ28816U1 (cs) * 2015-01-16 2015-11-16 Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. Duální mikrobiální preparát pro dloubodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí
CN105274241A (zh) * 2015-11-21 2016-01-27 云南省烟草公司大理州公司 一种烟草根黑腐病菌分子检测引物及其快速检测方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CS213659B1 (en) * 1978-07-05 1982-04-09 Dasa Vesely Means for protection the sugar beet against the scarlet fever on the base of cospor mykroparazita pythium oligandrum
US5961971A (en) * 1996-10-17 1999-10-05 University Of Florida Biocontrol of fungal soilborne pathogens by Pythium oligandrum
CZ9883U1 (cs) 1999-11-18 2000-04-14 Dasa Doc Ing Drsc Vesely Prostředek na ochranu pokožky využívající houbu Pythium oligandrum
WO2012076563A1 (en) * 2010-12-08 2012-06-14 Basf Se Fungicidal mixtures
EP3200584B1 (en) * 2014-10-02 2019-01-23 Bayer CropScience Biologics GmbH Composition essentially free of water and comprising at least one spore forming fungal biological control agent, a polyether-modified trisiloxane and fumed or precipitated silica
CZ201523A3 (cs) * 2015-01-16 2016-07-27 Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102655754A (zh) * 2009-11-04 2012-09-05 生物药物研究和开发-巴德有限公司 包含真菌生物寡雄腐霉的抗真菌混合物
CZ28816U1 (cs) * 2015-01-16 2015-11-16 Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. Duální mikrobiální preparát pro dloubodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí
CN105274241A (zh) * 2015-11-21 2016-01-27 云南省烟草公司大理州公司 一种烟草根黑腐病菌分子检测引物及其快速检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
寡雄腐霉Pythium oligandrum;佚名;《农业科学与管理》;20101231;第31卷(第8期);第58页，尤其是左栏第1段 *
腐霉属的DNA条形码和分子系统学研究;龙艳艳;《中国优秀博士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20150115(第01期);第A006-63页，尤其是摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3478302B1 (en) 2023-07-05
MX2019000269A (es) 2019-05-27
ES2957887T3 (es) 2024-01-29
JP2018528154A (ja) 2018-09-27
JP6667501B2 (ja) 2020-03-18
JP2020073475A (ja) 2020-05-14
KR20190064563A (ko) 2019-06-10
US20200085893A1 (en) 2020-03-19
EP3478302A1 (en) 2019-05-08
CA3029484A1 (en) 2018-01-04
CN110225759A (zh) 2019-09-10
BR112018077463A2 (pt) 2019-04-02
WO2018001392A1 (en) 2018-01-04
BR112018077463B1 (pt) 2021-12-07
US11331356B2 (en) 2022-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101885403B1 (ko) 신규 락트산 박테리아 및 그를 함유하는 조성물
Vianna et al. Efficacy of sodium hypochlorite combined with chlorhexidine against Enterococcus faecalis in vitro
EP2496088B1 (en) Antifungal mixture with fungal organism pythium oligandrum
JP2021505667A (ja) ざ瘡およびバイオフィルムに対するバクテリオファージ処置
Nakagawa et al. Tacrolimus has antifungal activities against Malassezia furfur isolated from healthy adults and patients with atopic dermatitis
Nabila et al. The effect of Aloe vera ethanol extract on the growth inhibition of Candida albicans
CN110225759B (zh) 用于治疗皮肤真菌病和酵母感染的寡雄腐霉制剂，施用方法和测定寡雄腐霉细胞活力的方法
US8506952B2 (en) Probiotic compositions and process thereof
EP3244902B1 (en) Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections
TWI383798B (zh) 改善口腔內細菌群的發酵乳酸桿菌ＳＧ－Ａ９５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＧ－Ａ９５）及其保健組合物
Alves et al. The patenting and technological trends in candidiasis treatment: a systematic review (2014-2018)
Shurrab Antimicrobial efficiency of some antiseptic products on endodontic microflora isolated from gangrenous pulp tissue
CN116474178A (zh) 一种重组人胶原蛋白肽润滑剂及其制备方法
US20170291930A1 (en) Histatin-5 Based Synthetic Peptides and Uses Thereof
Khazia et al. Antifungal activity of combination of medicinal plant extracts with terbinafine through regulating subtilisin virulence genes in Microsporum canis.
CN114657106A (zh) 一株植物乳植杆菌及其在防治痤疮中的应用
EP3362043A1 (en) Antifungal topical composition for the use in the treatment of onychomycosis
CZ307642B6 (cs) Přípravek s mykoparazitickým mikroorganizmem Pythium oligandrum pro užití při léčbě dermatofytos a kvasinkových infekcí na kůži a sliznicích
Rojat et al. Accidental Trichophyton mentagrophytes fungemia during the course of kerion celsi.
RU2539378C2 (ru) Состав для лечения повреждений кожи
Al-Masaudi et al. Antimicrobial activity of different types of honey on some multiresistant microorganisms.
KR20210068170A (ko) 오미자 추출물을 이용한 구강 청정제의 제조방법
Kędzia et al. Activity of Dentosept on yeastlike fungi responsible for infections of oral cavity
Kosek Microbes indicatorts of cosmetic preservation efficiecy. Part III: Candida albicans
CN115715799A (zh) 用于预防或治疗真菌感染的组合物及其制剂、制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant