CN110346559A - 一种冻干型测定pt试剂制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种冻干型测定PT试剂制备方法，包括HEPES缓冲液、合成磷脂、重组羊组织因子、冻干保护剂和防腐剂；将冻干保护剂加入到配置好的HEPES缓冲液中，将适量的合成磷脂溶于含有1％曲拉通X‑100的HEPSE缓冲液中，羊组织因子溶于适量PBS缓冲液中形成55ug/ml的组织因子溶液，重组羊组织因子加入磷脂溶液中，最后将防腐剂、保护剂溶液加入到磷脂组织因子溶液中，得到的上清液，通过常规技术冻干，即得到PT试剂产品。本发明在已有成分的基础上，对制备的凝血活酶冻干保护剂配方进行优化，克服了现有凝血酶原检测试剂冻干过程中凝血活酶的损耗问题，灵敏度较高，且增加了试剂的有效期，易于生产。本发明具有很高的临床应用价值，及潜在的市场效益。

Description

一种冻干型测定PT试剂制备方法
技术领域
本发明属于生物医药检测技术领域，具体涉及一种冻干型测定PT试剂制备方法。
背景技术
组织因子(TF)是一种由外膜成纤维细胞合成的跨膜糖蛋白，血管损伤后，当血液与内皮下细胞接触时，因子VII在钙离子存在下与TF结合形成双分子复合物，引起凝血，TF是一种单链蛋白，含有263个氨基酸，合成大小为32个氨基酸的信号肽，TF的胞外或细胞表面结构域为219个残基，包含三个Trp-Lys-Ser重复序列，它还含有两个连接Cys 49与Cys57和Cys 186与Cys 209的二硫键。
兔脑凝血活酶由于具有副作用低、活性明确、特异性强等特点，成为近年来(PT)诊断试剂研发的热点，越来越多品牌的凝血活酶应用于现有诊断试剂，但是，凝血活酶作为一种单链蛋白，也存在着缺点，其中该类物质在水分散体系中的物理和化学不稳定性使其常常在制备及储存过程中发生变性、活性丧失或者产生潜在免疫原性产物。
冷冻干燥技术是目前制备稳定固体蛋白类药物应用最广泛的有效手段，大部分蛋白需要保护剂与其共同冻干，以在冻结、干燥及贮藏过程中保护蛋白质，并使酶类拥有较长的产品有效期，这对蛋白最终是否产出有效的产品是至关重要的。关于冷冻干燥保护剂的研究表明，不同的蛋白质药品对冷冻干燥保护剂的选择不能一概而论，在实际应用中，一种保护剂往往不能解决所有蛋白质在冷冻干燥过程中产生的稳定性问题；相同的蛋白质，也可能由于干燥条件的不同而产生不同的应力条件。
目前的冻干型PT试剂中大多只是采用了一种能够起到冻干保护效果的冻干保护剂，例如：牛血清白蛋白等，其保护效果远远是不够的，且有效期不能达到明显的延长。
发明内容
根据上述阐述，本发明的目的在于提供一种冻干型测定PT试剂，有效延长冻干型试剂的有效期。
本发明提供的技术方案：
一种冻干型测定PT试剂制备方法，包括HEPES缓冲液、合成磷脂、重组羊组织因子、冻干保护剂和防腐剂；制备包括如下步骤：
Q1、将冻干保护剂加入到配置好的HEPES缓冲液中，HEPES缓冲液的pH值在6.4-7.4之间，搅拌10-20分钟，获得均匀的保护剂溶液；
Q2、将适量的合成磷脂溶于含有1％曲拉通的HEPSE缓冲液中，HEPSE缓冲液pH为7.2-7.6之间，搅拌60-120分钟后，获得均匀分散的磷脂溶液；
Q3、用基因工程的方法在大肠杆菌中表达羊组织因子，制备纯度在90％以上的羊组织因子，将该羊组织因子溶于适量PBS缓冲液中形成55ug/ml的重组羊组织因子溶液；
Q4、将重组羊组织因子溶液和加入磷脂溶液中，磷脂与重组羊组织因子的质量比在2.8×103-4×103：1之间，然后继续搅拌40-90分钟，得到磷脂组织因子溶液；
Q5、将防腐剂ProClin 300、保护剂溶液加入到磷脂组织因子溶液中，搅拌30-40分钟，充分混合，用滤布进行过滤，得到上清液，将该上清液分装入10mL的血清瓶中，再通过常规技术冻干，即得到PT试剂产品。
上述技术方案中，所述Q2中含有表面活性剂的HEPES缓冲液，表面活性剂为1％-1.5％的曲拉通X-100。
上述技术方案中，所述冻干保护剂为谷氨酸钠、菊粉低聚糖、牛血清白蛋白中的一种或多种的混合。
上述技术方案中，所述谷氨酸钠、菊粉低聚糖、牛血清白蛋白的比例，按照质量比为3-5：5-10：1-2进行混合。
有益效果：本发明在已有成分的基础上，对制备的凝血活酶冻干保护剂配方进行优化，克服了现有凝血酶原检测试剂冻干过程中凝血活酶的损耗问题，灵敏度较高，且增加了试剂的有效期，易于生产，本发明具有很高的临床应用价值，及潜在的市场效益。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
包括如下步骤：
Q1、将按照3％谷氨酸钠、10％菊粉低聚糖、1％牛血清白蛋白的质量分数比加入到配置好的HEPES缓冲液中，HEPES缓冲液的pH值在6.4-7.4之间，搅拌15分钟，获得均匀的保护剂溶液；
Q2、将适量的合成磷脂溶于含有1％曲拉通的HEPSE缓冲液中，搅拌120分钟后，获得均匀分散的磷脂溶液，表面活性剂的质量分数为1.0％；
Q3、用基因工程的方法在大肠杆菌中表达羊组织因子，制备纯度在90％以上的羊组织因子，将该羊组织因子溶于适量PBS缓冲液中形成55ug/ml的重组羊组织因子溶液；
Q4、将重组羊组织因子溶液和加入磷脂溶液中，磷脂与重组羊组织因子的质量比在2.8×103-4×103:1之间，然后继续搅拌80分钟，得到磷脂组织因子溶液；
Q5、将适量防腐剂为ProClin 300、保护剂溶液加入到磷脂组织因子溶液中，搅拌30分钟，充分混合，用滤布进行过滤，得到上清液，将该上清液分装入10mL的血清瓶中，再通过常规技术冻干，即得到PT试剂产品。
实施例2：
包括如下步骤：
Q1、将按照5％谷氨酸钠、5％菊粉低聚糖、2％牛血清白蛋白的质量分数比加入到配置好的HEPES缓冲液中，HEPES缓冲液的pH值在6.4-7.4之间，搅拌15分钟，获得均匀的保护剂溶液；
Q2、将适量的合成磷脂溶于含有1％曲拉通的HEPSE缓冲液中，搅拌120分钟后，获得均匀分散的磷脂溶液，表面活性剂的质量分数为1.5％；
Q3、用基因工程的方法在大肠杆菌中表达羊组织因子，制备纯度在90％以上的羊组织因子，将该羊组织因子溶于适量PBS缓冲液中形成55ug/ml的重组羊组织因子溶液；
Q4、将重组羊组织因子溶液和加入磷脂溶液中，磷脂与重组羊组织因子的质量比在2.8×103-4×103:1之间，然后继续搅拌90分钟，得到磷脂组织因子溶液；
Q5、将适量防腐剂为ProClin 300、保护剂溶液加入到磷脂组织因子溶液中，搅拌30分钟，充分混合，用滤布进行过滤，得到上清液，将该上清液分装入10mL的血清瓶中，再通过常规技术冻干，即得到PT试剂产品。
上述实例1或2中制备的而得的PT试剂与市售PT试剂相比，稳定性显著增强，冻干品37℃条件下热稳定时间达到7周，预计冻干品在2℃-8℃摄氏度的温度条件下稳定时间可至少达到四年，在冻干过程中，凝血酶的损耗率较低，且降低了冻干过程中的成本。
表1
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种冻干型测定PT试剂制备方法，包括HEPES缓冲液、合成磷脂、重组羊组织因子、冻干保护剂和防腐剂；其特征在于：制备包括如下步骤：
Q1、将冻干保护剂加入到配置好的HEPES缓冲液中，HEPES缓冲液的pH值在6.4-7.4之间，搅拌10-20分钟，获得均匀的保护剂溶液；
Q2、将适量的合成磷脂溶于含有1％曲拉通X-100的HEPSE缓冲液中，HEPSE缓冲液pH为7.2-7.6之间，搅拌60-120分钟后，获得均匀分散的磷脂溶液；
Q3、用基因工程的方法在大肠杆菌中表达羊组织因子，制备纯度在90％以上的羊组织因子，将该羊组织因子溶于适量PBS缓冲液中形成55ug/ml的重组羊组织因子溶液；
Q4、将重组羊组织因子溶液和加入到磷脂溶液中，磷脂与重组羊组织因子的质量比在2.8×103-4×103：1之间，然后继续搅拌40-90分钟，得到磷脂组织因子溶液；
Q5、将防腐剂ProClin 300、保护剂溶液加入到磷脂组织因子溶液中，搅拌30-40分钟，充分混合，用滤布进行过滤，得到上清液，将该上清液分装入10mL的血清瓶中，再通过常规技术冻干，即得到PT试剂产品。
2.根据权利要求1所述的一种冻干型测定PT试剂制备方法，其特征在于：所述Q2为含有表面活性剂的HEPES缓冲液，表面活性剂为曲拉通X-100。
3.根据权利要求2所述的一种冻干型测定PT试剂制备方法，其特征在于：上述技术方案中，所述冻干保护剂为谷氨酸钠、菊粉低聚糖、牛血清白蛋白中的一种或多种的混合。
4.根据权利要求3所述的一种冻干型测定PT试剂制备方法，其特征在于：所述谷氨酸钠、菊粉低聚糖、牛血清白蛋白的比例，按照质量比为3-5：5-10：1-2进行混合。
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