CN115508569A - 蛋白s试剂及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及蛋白S试剂及检测试剂盒。本发明提供的蛋白S试剂中包括：无机盐、NiCl2、HEPES、HEPES‑Na、聚凝胺、NP‑40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C。本发明提供的试剂盒包括蛋白S试剂、蛋白S缺乏血浆、校准品、凝血分析用稀释液和钙试剂。试剂盒中其他试剂能够与蛋白S试剂良好的配合，从而使本发明提供的试剂盒灵敏度高，重复性好，稳定性佳，价格低廉，使用简便快速，检测样本准确，且适用机型多，能满足门急诊等需要，可以在临床上广泛应用。

Description

蛋白S试剂及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及蛋白S试剂及检测试剂盒。
背景技术
蛋白S是一种在肝脏中合成的维生素K依赖的非酶性的血浆糖蛋白，是活化蛋白C的重要辅因子。蛋白S以2种形式存在于血浆：游离蛋白S(40％)和与补体相结合的蛋白S(60％)。一般认为只有游离蛋白S才具有抗凝活性，但并非所有的游离蛋白S均具有抗凝活性。具有活性的蛋白S可与活化蛋白C(APC)形成复合物加速灭活活化V因子(FVa)、活化VIII因子(FVIIIa)，从而导致血浆样本凝血时间延长，且凝血时长与血浆中蛋白S活性成正比。蛋白S的缺乏会使凝血与抗凝及纤溶系统发生紊乱而引发血栓性疾病，如深静脉血栓形成、弥散性血管内凝血等；许多常见疾病，如肝病、肾病、心脑血管疾病等都会影响血液中蛋白S的水平，因此测定血浆中蛋白S对上述疾病的预防诊断、观察病情及判断预后都有重要价值。
蛋白S缺乏症可分为遗传型(常染色体显性疾病，源于PROS1基因突变)和获得型(源于肝肾疾病，维生素K拮抗剂存在，抗蛋白S抗体存在等)。根据蛋白S在血浆中的状态将蛋白S缺乏症分为3种类型：I型为蛋白S数量缺乏，即血浆中总蛋白S与游离蛋白S含量均下降，且抗凝活性降低；Ⅱ型为游离蛋白S含量与活性下降而总蛋白S浓度正常；ⅡI型为总蛋白S与游离蛋白S浓度正常，但抗凝血活性低下。临床上I型最为常见，II、III型较少见。
基于蛋白S缺乏症的类型，目前蛋白S检测技术主要分为两大类：一类是对抗原即其含量的检测，主要有火箭电泳法、放射免疫分析法和酶联免疫法；另一类是对其活性的检测，主要为凝固法。由于对蛋白S活性的检测最能反映血浆中实际发挥抗凝作用的蛋白S水平，且凝固法操作简单、快速，故临床上凝固法应用最为广泛。
近年来，凝固法用于蛋白S活性测定已经在凝血分析仪上实现了自动化检测，虽然具有操作简便、快速、定量准确及高通量等优点，但是还是不能满足门急诊等需要，无法在临床上广泛应用，因为目前市场存在的多家蛋白S测定试剂盒(凝固法)虽然可以用于蛋白S活性测定，但是存在价格高昂、重复性差、稳定性不佳的问题，且只能应用于特定的仪器，适用性有限，不利于基层推广使用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供蛋白S试剂及检测试剂盒，该蛋白S试剂及检测试剂盒可以在临床上广泛应用，价格实惠、稳定性佳，适用性好，利于在基层推广使用。
本发明的蛋白S检测试剂盒包括蛋白S试剂、蛋白S缺乏血浆、校准品、凝血分析用稀释液和钙试剂。
本发明的检测原理为：组织因子触发凝血因子X(FX)的激活，具有活性的蛋白S与活化蛋白C(APC)形成复合物加速灭活部分活化凝血因子V(FVa)，活化凝血因子X(FXa)在剩余FVa及其他因素(如磷脂)作用下，使凝血酶原形成凝血酶，凝血酶最终使纤维蛋白原转化为纤维蛋白。纤维蛋白形成所需的时间与受检血浆中的蛋白S活性成正相关。受检血浆中蛋白S活性可通过校准曲线计算得到(图2)。
本发明提供了蛋白S试剂，其包括：无机盐、镍离子、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C；
其中，所述无机盐选自NaCl和/或KCl；
其中，所述镍离子由NiCl2或NiSO4提供；
所述无机盐、镍离子、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C的质量比为(11～12)：(2.592～7.128)：(26～27)：(30～32)：(3～4)：(0.1～1):(4～6):(0.5～2):(0.001～0.005):(0.001～0.01):(0.1～1)。
一些实施例中，所述无机盐、镍离子、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C的质量比为11.688：3.888：26.213：31.2348：3.5：0.5：5：1：0.003：0.006：0.5。
另一些实施例中，所述无机盐、镍离子、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C的质量比为11.688：2.592：26.213：31.2348：3.5：0.1：5：1：0.003：0.006：0.5。
另一些实施例中，所述无机盐、镍离子、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C的质量比为11.688：7.128：26.213：31.2348：3.5：1：5：1：0.003：0.006：0.5。
进一步的，本发明所述的蛋白S试剂，其由水和如下组分组成：无机盐11.688g/L、镍离子2.592g/L～7.128g/L、HEPES 26.213g/L、HEPES-Na 31.2348g/L、聚凝胺3.5g/L、NP-40 0.1g/L～1g/L、BSA 5g/L、防腐剂1g/L、组织因子0.003g/L、磷脂0.006g/L和活化蛋白C0.5g/L。
一些具体实施例中，本发明所述的蛋白S试剂，由水和NaCl 11.688g/L、NiCl23.888g/L、HEPES 26.213g/L、HEPES-Na 31.2348g/L、聚凝胺3.5g/L、NP-40 0.5g/L、BSA5g/L、NaN3 1g/L、重组人组织因子0.003g/L、磷脂0.006g/L和活化蛋白C 0.5g/L组成。
另一些具体实施例中，所述蛋白S试剂由水和NaCl 11.688g/L、NiCl2 2.592g/L、HEPES 26.213g/L、HEPES-Na 31.2348g/L、聚凝胺3.5g/L、NP-40 0.1g/L、BSA 5g/L、NaN31g/L、重组人组织因子0.003g/L、磷脂0.006g/L和活化蛋白C 0.5g/L组成。
另一些具体实施例中，所述蛋白S试剂由水和NaCl 11.688g/L、NiCl2 7.128g/L、HEPES 26.213g/L、HEPES-Na 31.2348g/L、聚凝胺3.5g/L、NP-40 1g/L、BSA 5g/L、NaN3 1g/L、重组人组织因子0.003g/L、磷脂0.006g/L和活化蛋白C 0.5g/L组成。
本发明所述的蛋白S试剂中，所述防腐剂选自NaN3、环丙沙星、庆大霉素、吡啶硫酮钠和/或硫柳汞。一些实施例中，所述蛋白S试剂中的防腐剂为NaN3。
本发明中，所述组织因子是人组织因子，其可为天然提取也可为人工合成，所述人工合成的方式包括但不限于基因工程合成重组人组织因子，本发明对此不做限定。在本发明实施例中，所述组织因子是重组人组织因子。
本发明中，所述磷脂为天然提取磷脂也可为人工合成的磷脂，本发明对此不做限定，在本发明实施例中，采用人工合成磷脂。该合成磷脂为含二油酰磷脂酰乙醇胺(PE)、二油酰磷脂酰丝氨酸(PS)和二油酰磷脂酰胆碱(PC)的混合物，摩尔浓度之比约3：2：2。
本发明中，所述蛋白C是机体一种重要的依赖维生素K生理性抗凝蛋白(其辅因子蛋白S)。所述活化蛋白C，可以在制备成试剂前活化制备完成，也可在试剂中添加蛋白C和蛋白C激活剂，使其在试剂中完成活化，本发明对此不做限定。在本发明实施例中，在试剂中添加活化后的蛋白C。
本发明所述的蛋白S试剂中，所述蛋白S试剂的pH值为7～8。一些实施例中，所述蛋白S试剂的pH值为7.5。
本发明所述的蛋白S检测试剂盒具有良好的重复性和稳定性，其重复性优于市售进口试剂盒，而复溶稳定性在2℃～8℃可达到72h，也优于市售的进口试剂盒。本发明提供的蛋白S检测试剂盒中蛋白S试剂的组成和试剂浓度对稳定性和重复性的提高起到至关重要的作用。本发明经过对蛋白S试剂配方进行优化，优化后的S试剂中各组分选择合理，浓度得当，功能上彼此互相支持，存在相互作用关系，彼此配合从而使蛋白S检测试剂盒获得了良好重复性和稳定性。
本发明所述的蛋白S试剂是蛋白S检测试剂盒的重要组分，其中蛋白S试剂在检测中，用作凝血因子的活化剂，主要用于触发凝血因子X的激活，蛋白S缺乏血浆用作凝血因子的供给剂，用于提供足够的纤维蛋白原、凝血因子V及其他必需的凝血因子，校准品用于蛋白S活性的校准，凝血分析用稀释液用于样本的稀释，钙试剂用作凝血反应的启动试剂。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括所述的蛋白S试剂；所述试剂盒还包括蛋白S缺乏血浆、校准品、凝血分析用稀释液和钙试剂。
所述蛋白S缺乏血浆为蛋白S含量小于1％的血浆，其中还包括10mM～30mM Tris、1％(w/v)～3％(w/v)蔗糖和0.001％(w/v)～0.1％(w/v)环丙沙星；pH值7.0～8.0。
所述校准品包括：血浆和稳定剂，其中血浆中蛋白S活性为80％～90％。所述稳定剂包括10mM～50mM Tris、1％(w/v)～5％(w/v)甘露醇和0.001％(w/v)～0.1％(w/v)环丙沙星；pH值7.0～8.0。
所述凝血分析用稀释液包括水、NaCl 15mM～45mM和NaN3 0.01％(w/v)～0.2％(w/v)。
所述钙试剂包括水、CaCl2 20mM～60mM和NaN3 0.01％(w/v)～0.2％(w/v)。
一些实施例中，本发明所述的试剂盒中，所述血浆可以为猪血浆，也可以为其他动物来源的血浆，或人源血浆。作为优选，本发明试剂盒中所述血浆为猪血浆。
本发明所述的试剂盒中，所有试剂包括蛋白S试剂。还包括蛋白S缺乏血浆、校准品、凝血分析用稀释液和钙试剂。为了维持蛋白S试剂的活性，配合其获得良好的检测效果，本发明对蛋白S缺乏血浆、校准品、凝血分析用稀释液和钙试剂的浓度进行了优化，使各种试剂能够更好的配合，相互支持，从而进一步提高稳定性和重复性。
本发明还提供了所述的蛋白S试剂或所述的试剂盒在蛋白S测定中的应用。
更进一步的，本发明提供了检测蛋白S活性的方法，其包括使用所述的试剂盒检测蛋白S活性。
本发明所述的检测蛋白S的方法用于临床中对患者血浆的蛋白S的活性进行检测。
本发明所述的方法中，其包括校准曲线和样本检测；更具体的，所述检测方法包括：将待测血浆样本经稀释液(1:4)稀释后，依次添加蛋白S缺乏血浆、蛋白S试剂、钙试剂，测定凝血时间后根据校准曲线计算蛋白S活性。
所述校准曲线包括：将校准品与凝血分析用稀释液按体积比1:3、1:4、1:8、1:16、1:32稀释，得到稀释后样本；取稀释后样本，与蛋白S缺乏血浆混匀，得到混合液1；再将混合液1与蛋白S试剂混匀得到混合液2；再将混合液2与钙试剂混匀得到混合液3，测定凝血时间；以凝血时间为X轴，蛋白S活性为Y轴，绘制校准曲线；
所述样本检测包括：取待测血浆样本，与蛋白S缺乏血浆混匀得到混合液A；再将混合液A与蛋白S试剂混匀得到混合液B；再将混合液B与钙试剂混匀后测定凝血时间，根据校准曲线计算血浆样本的蛋白S活性。
本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，其包括：分别制备蛋白S试剂、蛋白S缺乏血浆、校准品、凝血分析用稀释液和钙试剂。
本发明所述的制备方法中，所述蛋白S试剂制备方法包括：将无机盐、NiCl2、HEPES、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C混合，得到混合液1，用水溶解，搅拌混匀，将混合液1与HEPES-Na混合，调pH为7.5，搅拌混匀，静置，分装并真空冷冻干燥。
本发明所述的制备方法中，所述蛋白S缺乏血浆的制备方法包括：将血浆中蛋白S去除，使蛋白S含量小于1％，与Tris、蔗糖和环丙沙星混合，调节pH值为7.5，搅拌混匀，分装真空冷冻干燥。
本发明所述的制备方法中，所述校准品的制备方法包括将血浆与Tris、甘露醇和环丙沙星混合，调节pH值为7.5，搅拌混匀，分装真空冷冻干燥。
本发明所述的制备方法中，所述凝血分析用稀释液的制备方法包括：将NaCl和NaN3搅拌混匀，分装。
本发明所述的制备方法中，所述钙试剂的制备方法包括：将CaCl2和NaN3搅拌混匀，分装。
本发明提供的蛋白S试剂中包括：无机盐、镍离子、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C，该试剂具有良好的重复性和稳定性，试剂盒中其他试剂能够与蛋白S试剂良好的配合，从而使本发明提供的试剂盒灵敏度高，重复性好，稳定性佳，价格低廉，使用简便快速，检测样本准确，且适用机型多，能满足门急诊等需要，可以在临床上广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1示本发明试剂盒与市售试剂盒测定结果具有良好的一致性；
图2示蛋白S活性检测基本反应原理。
具体实施方式
本发明提供了蛋白S测定试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
1.1本发明提出的蛋白S测定试剂盒(凝固法)由五部分组成，分别是蛋白S试剂、蛋白S缺乏血浆、校准品、凝血分析用稀释液、钙试剂，五部分分别储存在不同的容器中。制备方法如下：
1.1.1蛋白S试剂的制备：蛋白S试剂由重组人组织因子、合成磷脂、活化蛋白C和缓冲液体系构成。缓冲液体系中所含的NaCl可保证蛋白S试剂的离子强度，还可有效提高试剂盒检测的灵敏度，NiCl2、NP-40和BSA三者共同用作稳定剂和活性物质保护剂，聚凝胺用作抗干扰剂并可提高试剂盒的检测灵敏度。重组人组织因子是作为凝血反应的启动因子，合成磷脂用来促进凝血进程，活化蛋白C为抗凝剂。本发明中，重组人组织因子含量在0.0001％～0.0005％，优选含量0.0003％；合成磷脂含量在0.0002％～0.001％，优选含量0.0006％；活化蛋白C含量在0.02％～0.1％，优选含量0.05％。缓冲液体系包括NaCl、NiCl2、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、NaN3，其余为去离子水。NaCl浓度在0.1M～0.5M，优选浓度0.2M；NiCl2浓度在20mM～55mM，优选浓度30mM；HEPES浓度在80mM～140mM，优选浓度110mM；HEPES-Na浓度在90mM～150mM，优选浓度120mM；聚凝胺含量在0.2％～0.7％，优选含量0.35％；NP-40含量在0.01％～0.1％，优选含量0.05％；BSA含量在0.2％～2.0％，优选含量0.5％；NaN3含量在0.01％～0.2％，优选含量0.1％，缓冲液体系pH值为7.0～8.0，优选7.5。配制步骤(配制量为1L时)：按蛋白S试剂配比分别移取NaCl、NiCl2、HEPES、聚凝胺、NP-40、BSA、NaN3、重组人组织因子、合成磷脂、活化蛋白C于容器中，加入800mL去离子水溶解，25℃下120rpm搅拌混匀1小时，加入HEPES-Na调pH至设定值，再加入去离子水定容至1L，25℃下120rpm搅拌混匀0.5小时，分装并真空冷冻干燥，即得到蛋白S试剂。
1.1.2蛋白S缺乏血浆的制备：含有除去蛋白S的健康人类血浆及稳定剂缓冲体系，蛋白S含量小于1％，要求蛋白S含量小于1％。稳定剂缓冲体系含Tris浓度在10mM～30mM，优选20mM；蔗糖含量在1％～3％，优选含量2％；环丙沙星含量在0.001％～0.1％，优选含量0.002％，HCl调节pH值在7.0～8.0，优选7.5。制备步骤：取健康人血浆，通过免疫沉淀法去除血浆中蛋白S(蛋白S含量小于1％)，加入Tris、蔗糖、环丙沙星，加入HCl调节pH值，25℃下70rpm搅拌混匀30min，分装后真空冷冻干燥，即得到蛋白S缺乏血浆。
1.1.3校准品的制备：含健康人类血浆及稳定剂缓冲体系，要求蛋白S活性为80％～90％。稳定剂缓冲体系含Tris浓度在10mM～50mM，优选30mM；甘露醇含量在1％～5％，优选含量3％；环丙沙星含量在0.001％～0.1％，优选含量0.002％，HCl调节pH值在7.0～8.0，优选7.5。制备步骤：取健康人血浆，加入Tris、甘露醇、环丙沙星，加入HCl调节pH值，25℃下70rpm搅拌混匀30min，分装后真空冷冻干燥，即得到校准品。
1.1.4凝血分析用稀释液的制备：含NaCl、NaN3。NaCl浓度在15mM～45mM，优选浓度20mM；NaN3含量在0.01％～0.2％，优选含量0.1％。配制步骤：按凝血分析用稀释液配比分别移取NaCl、NaN3于容器中，25℃下120rpm搅拌混匀0.5小时，分装，即得到凝血分析用稀释液。
1.1.5钙试剂的制备：含CaCl2、NaN3。CaCl2浓度在20mM～60mM，优选浓度40mM；NaN3含量在0.01％～0.2％，优选含量0.1％。配制步骤：按钙试剂配比分别移取CaCl2、NaN3于容器中，25℃下120rpm搅拌混匀0.5小时，分装，即得到钙试剂。
1.2所述蛋白S测定试剂盒(凝固法)的检测方法，包括：
1.2.1校准曲线：将校准品和凝血分析稀释液按体积比1:3、1:4、1:8、1:16、1:32稀释，得到稀释后校准品；取稀释后校准品，分别加入蛋白S缺乏血浆，混匀，加入蛋白S试剂，混匀，加入钙试剂，混匀后测定凝血时间；以凝血时间为X轴，蛋白S活性为Y轴，绘制校准曲线。
1.2.1样本检测：取待测血浆样本稀释后，加入蛋白S缺乏血浆，混匀，加入蛋白S试剂，混匀，加入钙试剂，混匀后测定凝血时间，根据校准曲线计算血浆样本的蛋白S活性。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。其中，重组人组织因子又称重组凝血活酶，简称rh-TF由市场购得。
实施例1
蛋白S试剂：0.2M NaCl、30mM NiCl2、110mM HEPES、120mM HEPES-Na、0.35％聚凝胺、0.05％NP-40、0.5％BSA、0.1％NaN3、0.0003％重组人组织因子、0.0006％合成磷脂、0.05％活化蛋白C，pH为7.5。
表1：蛋白S试剂的配方(1L)
组分 添加量/g
NaCl 11.688g
NiCl<sub>2</sub> 3.888g
HEPES 26.213g
HEPES-Na 31.2348g
聚凝胺 3.5g
NP-40 0.5g
BSA 5g
NaN<sub>3</sub> 1g
重组人组织因子 0.003g
合成磷脂 0.006g
活化蛋白C 0.5g
实施例2
蛋白S试剂：NiCl2含量为20mM，NP-40含量为0.01％，其余组分同表1。
表2：蛋白S试剂的配方(1L)
组分 添加量/g
NaCl 11.688g
NiCl<sub>2</sub> 2.592g
HEPES 26.213g
HEPES-Na 31.2348g
聚凝胺 3.5g
NP-40 0.1g
BSA 5g
NaN<sub>3</sub> 1g
重组人组织因子 0.003g
合成磷脂 0.006g
活化蛋白C 0.5g
实施例3
蛋白S试剂：NiCl2含量为55mM，NP-40含量为0.1％，其余组分同表1。
表3：蛋白S试剂的配方(1L)
组分 添加量/g
NaCl 11.688g
NiCl<sub>2</sub> 7.128g
HEPES 26.213g
HEPES-Na 31.2348g
聚凝胺 3.5g
NP-40 1g
BSA 5g
NaN<sub>3</sub> 1g
重组人组织因子 0.003g
合成磷脂 0.006g
活化蛋白C 0.5g
对比例1
蛋白S试剂：不含NiCl2和NP-40，其余组分同表1。
表4：蛋白S试剂的配方(1L)
组分 添加量/g
NaCl 11.688g
HEPES 26.213g
HEPES-Na 31.2348g
聚凝胺 3.5g
BSA 5g
NaN<sub>3</sub> 1g
重组人组织因子 0.003g
合成磷脂 0.006g
活化蛋白C 0.5g
对比例2
蛋白S试剂：NiCl2含量为70mM，NP-40含量为0.2％，其余组分同表1。
表5：蛋白S试剂的配方(1L)
Figure BDA0003847779370000101
Figure BDA0003847779370000111
对比例3
蛋白S试剂：NiCl2含量为30mM，不含NP-40，其余组分同表1。
表6：蛋白S试剂的配方(1L)
组分 添加量/g
NaCl 11.688g
NiCl<sub>2</sub> 3.888g
HEPES 26.213g
HEPES-Na 31.2348g
聚凝胺 3.5g
BSA 5g
NaN<sub>3</sub> 1g
重组人组织因子 0.003g
合成磷脂 0.006g
活化蛋白C 0.5g
对比例4
蛋白S试剂：不含NiCl2，NP-40含量为0.5％，其余组分同表1。
表7：蛋白S试剂的配方(1L)
Figure BDA0003847779370000112
Figure BDA0003847779370000121
效果检测
1、本发明蛋白S测定试剂盒(凝固法)与市售进口试剂盒的相关性
从上海中医药大学附属龙华医院的住院及门诊随机抽取病人血液样本共200份。血液按9:1的比例与0.109mol/L枸橼酸钠抗凝液混匀后，2500rpm离心15分钟，分离得到血浆。用本发明试剂盒(实施例1)和市售进口试剂盒分别对样本测定，计算两者的相关系数，并进行线性回归。结果显示两种试剂盒的相关系数r＝0.9807，线性回归方程为y＝1.0001x+1.4297，本发明试剂盒和市售进口试剂盒的检测数据具有良好的一致性。见下图。
2、本发明蛋白S测定试剂盒(凝固法)的重复性
用本发明试剂盒(实施例1)和市售进口试剂盒分别测定低值血凝质控品和正常值血凝质控品，计算两者的CV。重复性结果显示本发明的重复性较市售进口试剂盒更好。
表8：重复性检测结果
Figure BDA0003847779370000122
Figure BDA0003847779370000131
3、本发明蛋白S测定试剂盒(凝固法)的复溶稳定性
(1)蛋白S试剂稳定剂浓度的筛选
将实验例1～3与对比例1～4的试剂置于2℃～8℃的医用冷藏箱中，在第0小时、24小时、48小时及72小时取出进行检测。每个检测时间间隔下，分别采用实验例1～3与对比例1～4试剂检测低值血凝质控品和正常值血凝质控品，重复测定3次，根据其检测结果的均值分别计算第24小时、48小时及72小时与第0小时检测结果均值的相对偏差，结果如表4所示。结果显示，蛋白S试剂中同时含有NiCl2和NP-40且NiCl2含量在20mM～55mM，NP-40含量在0.01％～0.1％时可于2℃～8℃稳定72h。特别地，NiCl2含量优选在30mM，NP-40含量优选0.05％。
表9：PS试剂稳定剂浓度的筛选结果
Figure BDA0003847779370000132
Figure BDA0003847779370000141
(2)本发明试剂盒和市售进口试剂盒稳定性比较
用本发明试剂盒(实施例1)和市售进口试剂盒分别测定于2℃～8℃，0h、24h及72h测定低值血凝质控品和正常值血凝质控品，计算相对偏差(％)。结果显示本发明的复溶稳定性在市售进口试剂盒宣称的2℃～8℃24h标准下更好。更进一步地，本发明试剂盒复溶稳定性在2℃～8℃可达到72h，稳定性更佳。
表10：复溶稳定性测试结果
Figure BDA0003847779370000142
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.蛋白S试剂，其特征在于，包括：无机盐、镍离子、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C；
其中，所述无机盐选自NaCl和/或KCl；
其中，所述镍离子由NiCl2或NiSO4提供；
所述无机盐、镍离子、HEPES、HEPES-Na、聚凝胺、NP-40、BSA、防腐剂、组织因子、磷脂和活化蛋白C的质量比为(11～12)：(2.592～7.128)：(26～27)：(30～32)：(3～4)：(0.1～1)：(4～6):(0.5～2):(0.001～0.005):(0.001～0.01):(0.1～1)。
2.根据权利要求1所述的蛋白S试剂，其特征在于，由水和如下组分组成：无机盐11.688g/L、镍离子2.592g/L～7.128g/L、HEPES 26.213g/L、HEPES-Na 31.2348g/L、聚凝胺3.5g/L、NP-40 0.1g/L～1g/L、BSA 5g/L、防腐剂1g/L、组织因子0.003g/L、磷脂0.006g/L和活化蛋白C 0.5g/L。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白S试剂，其特征在于，
由水和NaCl 11.688g/L、NiCl2 3.888g/L、HEPES 26.213g/L、HEPES-Na 31.2348g/L、聚凝胺3.5g/L、NP-40 0.5g/L、BSA 5g/L、NaN3 1g/L、重组人组织因子0.003g/L、合成磷脂0.006g/L和活化蛋白C 0.5g/L组成；
或由水和NaCl 11.688g/L、NiCl2 2.592g/L、HEPES 26.213g/L、HEPES-Na 31.2348g/L、聚凝胺3.5g/L、NP-40 0.1g/L、BSA 5g/L、NaN3 1g/L、重组人组织因子0.003g/L、合成磷脂0.006g/L和活化蛋白C 0.5g/L组成；
或由水和NaCl 11.688g/L、NiCl2 7.128g/L、HEPES 26.213g/L、HEPES-Na 31.2348g/L、聚凝胺3.5g/L、NP-40 1g/L、BSA 5g/L、NaN3 1g/L、重组人组织因子0.003g/L、合成磷脂0.006g/L和活化蛋白C 0.5g/L组成。
4.根据权利要求1或2所述的蛋白S试剂，其特征在于，所述防腐剂选自NaN3、环丙沙星、庆大霉素、吡啶硫酮钠和/或硫柳汞。
5.根据权利要求1～4任一项所述的蛋白S试剂，其特征在于，所述蛋白S试剂的pH值为7～8。
6.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的蛋白S试剂；所述试剂盒还包括蛋白S缺乏血浆、校准品、凝血分析用稀释液和钙试剂；
所述蛋白S缺乏血浆为蛋白S含量小于1％的血浆，其中还包括10mM～30mM Tris、1％(w/v)～3％(w/v)蔗糖和0.001％(w/v)～0.1％(w/v)环丙沙星；pH值7.0～8.0；
所述校准品包括：血浆和稳定剂，其中血浆中蛋白S活性为80％～90％；所述稳定剂包括10mM～50mM Tris、1％(w/v)～5％(w/v)甘露醇和0.001％(w/v)～0.1％(w/v)环丙沙星；pH值7.0～8.0；
所述凝血分析用稀释液包括水、NaCl 15mM～45mM和NaN3 0.01％(w/v)～0.2％(w/v)；
所述钙试剂包括水、CaCl2 20mM～60mM和NaN3 0.01％(w/v)～0.2％(w/v)。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述血浆为猪血浆。
8.权利要求1～5任一项所述的蛋白S试剂或权利要求6或7所述的试剂盒在蛋白S检测中的应用。
9.检测蛋白S活性的方法，其特征在于，包括使用权利要求1～5任一项所述的蛋白S试剂或权利要求6或7所述的试剂盒检测待测血浆中蛋白S的活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括校准曲线和样本检测；
所述校准曲线包括：将校准品与凝血分析用稀释液按体积比1:3、1:4、1:8、1:16、1:32稀释，得到稀释后校准品；取稀释后校准品，与蛋白S缺乏血浆混匀，得到混合液1；再将混合液1与蛋白S试剂混匀得到混合液2；再将混合液2与钙试剂混匀得到混合液3，测定凝血时间；以凝血时间为X轴，蛋白S活性为Y轴，绘制校准曲线；
所述样本检测包括：取待测血浆样本稀释后，与蛋白S缺乏血浆混匀得到混合液A；再将混合液A与蛋白S试剂混匀得到混合液B；再将混合液B与钙试剂混匀后测定凝血时间，根据校准曲线计算血浆样本的蛋白S活性。
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5625036A (en) * 1991-10-04 1997-04-29 Dade International Inc. Preparation of prothrombin time reagents from recombinant human tissue factor and purified natural and synthetic phospholipids
US6090570A (en) * 1994-11-10 2000-07-18 Dade Behring Marburg Gmbh Method for specifically detecting a coagulation factor V which has an increased stability toward activated protein C in the activated state
US20030073070A1 (en) * 2000-12-19 2003-04-17 Yong Dai Protein S functional assay
CN101183109A (zh) * 2006-11-14 2008-05-21 希森美康株式会社 凝固检查用试剂及其试剂的生产方法
US20080241941A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-02 Sysmex Corporation Reagent for measuring clotting time and method for stabilizing tissue factor
US20100086953A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Blood Coagulation Assays
JP2017003307A (ja) * 2015-06-05 2017-01-05 公立大学法人奈良県立医科大学 凝固第ｖｉｉｉ因子の複合体形成能に関する情報の取得方法および試薬キット
CN106645751A (zh) * 2016-12-27 2017-05-10 北京赛科希德科技股份有限公司 一种纤维蛋白原含量检测试剂盒
CN110346559A (zh) * 2019-07-16 2019-10-18 山东艾科达生物科技有限公司 一种冻干型测定pt试剂制备方法
CN114594269A (zh) * 2022-03-16 2022-06-07 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5625036A (en) * 1991-10-04 1997-04-29 Dade International Inc. Preparation of prothrombin time reagents from recombinant human tissue factor and purified natural and synthetic phospholipids
US6090570A (en) * 1994-11-10 2000-07-18 Dade Behring Marburg Gmbh Method for specifically detecting a coagulation factor V which has an increased stability toward activated protein C in the activated state
US20030073070A1 (en) * 2000-12-19 2003-04-17 Yong Dai Protein S functional assay
CN101183109A (zh) * 2006-11-14 2008-05-21 希森美康株式会社 凝固检查用试剂及其试剂的生产方法
US20080241941A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-02 Sysmex Corporation Reagent for measuring clotting time and method for stabilizing tissue factor
US20100086953A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Blood Coagulation Assays
JP2017003307A (ja) * 2015-06-05 2017-01-05 公立大学法人奈良県立医科大学 凝固第ｖｉｉｉ因子の複合体形成能に関する情報の取得方法および試薬キット
CN106645751A (zh) * 2016-12-27 2017-05-10 北京赛科希德科技股份有限公司 一种纤维蛋白原含量检测试剂盒
CN110346559A (zh) * 2019-07-16 2019-10-18 山东艾科达生物科技有限公司 一种冻干型测定pt试剂制备方法
CN114594269A (zh) * 2022-03-16 2022-06-07 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法

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