JPH04350560A - プロテインｓ活性の機能的測定方法 - Google Patents

プロテインｓ活性の機能的測定方法

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JPH04350560A
JPH04350560A JP3057633A JP5763391A JPH04350560A JP H04350560 A JPH04350560 A JP H04350560A JP 3057633 A JP3057633 A JP 3057633A JP 5763391 A JP5763391 A JP 5763391A JP H04350560 A JPH04350560 A JP H04350560A
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protein
clot formation
reagent
chromogenic
activator
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JP3057633A
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Karl Dr Fickenscher
カール・フイケンシヤー
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Behringwerke AG
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は液体中、特に血漿中の、
プロテインＳの機能的測定方法およびこれに適した試薬
に関する。
【０００２】
【従来の技術】プロテインＳは血餅形成阻害剤であり、
そして血餅形成因子ＶａおよびＶＩＩＩａのタンパク質
加水分解において活性化プロテインＣのコファクターと
して働く。
【０００３】プロテインＳの先天的または後天性の欠乏
は血栓塞栓合併症を招くことがある。
【０００４】プロテインＳは肝臓で合成される（Ｓｔｅ
ｒｎ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８６），　Ｊ．　
Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０２，　１９７１■１９７８）
。 その生合成はビタミンＫ依存性があり、従って血中濃度
はビタミンＫ拮抗剤で処理すると低下する。プロテイン
Ｓ欠乏が存するときにその処理を開始すると患者の健康
の重大な障害に到ることがある（Ｇｒｉｍａｎｄｏ，Ｖ
．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）　ＢＭＪ　２９８，　２
３３〜２３４）。
【０００５】播種性血管内血餅形成または血栓塞栓症の
場合も活性が低下することがある。
【０００６】前述の知見より、プロテインＳがプロテイ
ンＣ／トロンボモジュリン阻害剤系の能力に対し決定的
な影響を有していること、また信頼性ある診断系がその
ために必要とされることは明らかである。血漿中ではプ
ロテインＳの約４０％しか遊離状態で存在しない。残り
の約６０％はＣ４ｂ−結合性タンパク質との複合体とし
て存在する（Ｄａｈｌｂａｅｃｋ，　Ｂ．　（１９８１
），　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．
　７８，　２５１２〜２５１６）。
【０００７】この結合型プロテインＳは活性化プロテイ
ンＣのコファクターとして利用できず、従って抗凝血作
用を持たない。過剰割合の結合型プロテインＳは従って
、抗原は正常またはほぼ正常であると認められるときに
、機能欠損として認めることもできる（Ｃｏｍｐ，　Ｐ
．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８６），　Ｂｌｏｏｄ
　６７，　５０４〜５０８；　Ｇｉｒｏｌａｍｉ，　Ｓ
．　ｅｔａｌ．　（１９８９），　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｈ
ａｅｍｏｓｔ．　６１，　１４４〜１４７）。
【０００８】一方、新生児においては通常のことである
が、不活性結合型として存在する割合が極めて小さいも
のでありさえすれば、プロテインＳ抗原が低下した場合
に活性は正常であり得る（Ｓｃｈｗａｒｚ，　Ｈ．　Ｐ
．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８），　Ｂｌｏｏｄ　７１
，　５６２〜５６５）。
【０００９】プロテインＳを免疫学的に測定することは
知られている。しかしながらこれらの方法は該プロテイ
ンの活性に関する情報を全く与えないものであり、本発
明の主題とするところではない。
【００１０】プロテインＳの活性を測定する方法も記載
されている。
【００１１】ＤＥ　３７２４４４３　Ａ１はプロテイン
Ｓの活性の測定方法を記載している。この測定方法は比
較的複雑な試薬、例えば合成基質血漿、精製されたＸａ
因子およびプロトロンビンなどを必要とし、またインキ
ュベーション時間の点で実施上不便である。更に、それ
は例えば検体中のヘパリンによって干渉される。
【００１２】ＤＥ　３６０７５５９　Ａ１はプロテイン
ＳとプロテインＣの組合せの機能的測定を記載している
。 各検体についてプロテインＣアクチベーターを含まない
基準値を測定することが必要である。Ｆ　ＶＩＩまたは
Ｆ　ＩＩのアクチベーターの使用もクレームされている
が、それ以上の裏付けは示されていない。期待される測
定に関するデータまたはすべての試験系についての干渉
性の影響は与えられていない。
【００１３】機能的測定方法の一つがＣｏｍｐ，　Ｐ．
　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅ
ｓｔ．　７４，　２０８２〜２０８８（１９８４）に記
載されている。この場合、第一段階のＸａ因子測定にお
いて活性化プロテインＣによる血餅形成時間の延長を測
定する。この測定方法は、この方法で測定可能な最大濃
度５０％に対しわずか２４秒の延長を示すに過ぎず、比
較的低感度である。ビタミンＫ拮抗剤処理を受けている
とか肝損傷を有する患者からの血漿を測定することはで
きなかった。
【００１４】Ｂｅｒｔｉｎａ　ｅｔ　ａｌ．　（Ｔｈｒ
ｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓｔ．　１９８５，　５３（２）
，　２６８〜２７２）はヒト血漿中の機能性プロテイン
Ｓを測定する可能性を示唆している。しかしながらその
試験は、測定すべき血漿中の内生ＶＩＩＩ因子またはＶ
因子をコントロールできない限りプロテインＳを定量的
に評価することができず、また時間延長はこれら２因子
に決定的に依存する。これらの因子が高いまたは低い濃
度で検体中に存在する場合には、それに応じて低いまた
は高い測定結果がプロテインＳについて得られる。
【００１５】Ｖａｎ　ｄｅ　Ｗａａｒｔ　ｅｔ　ａｌ．
　（１９８７，　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．　４８，　
４２７〜４３７）は、吸着基質血漿、添加プロトロンビ
ン、活性化プロテインＣ、燐脂質および塩化カルシウム
より成る系を用いている。検体中のプロテインＳ含量が
１００％相違しても約２０秒の延長が生じるにすぎない
。すなわち、この測定方法もやはり相対的に低感度であ
る。
【００１６】Ｓｕｚｕｋｉ　Ｋ．　およびＮｉｓｈｉｏ
ｋａ　Ｊ．　（１９８８，　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．
　４９，　２４１〜２５１）は別の測定系を記載してい
る。彼等は蛇毒からのプロテインＣアクチベーターであ
るＰｒｏｔａｃＲ　を用いている。この方法も時間がか
かり不便である。活性が１００％相違しても延長は１３
秒であり、感度が極めて低い。
【００１７】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．
　（１９８９，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３５，　１
６４４〜１６４８）も同じく修飾されたａＰＴＴ測定を
介する測定であるプロテインＳ測定方法を提案している
。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】これまでに知られてい
る試験方法に共通している点は多くの試薬を使うために
手順が不便であることに加えて、プロテインＳ活性度に
関する反応時間の延長により測定される感度が低いこと
である。
【００１９】従って、本発明の目的は、血漿中のプロテ
インＳの活性を簡単にかつ信頼性よく、高感度で特異的
に測定することを可能にする方法および試薬を開発する
ことにあった。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明により、アクチベ
ーターの添加量を血餅形成時間が正常血餅形成時間より
も延長されるように調整することにより成る生物学的検
体の血餅形成時間測定によるプロテインＳの測定方法が
開示される。
【００２１】血餅形成時間の延長により驚くほど簡単に
感度を著しく増大させることが可能になった（またその
感度増加は諸要件に適合させることができる）。
【００２２】血餅形成時間の測定方法は、自体、当業者
に知られている。それらは、特に、血餅形成または色素
原性基質の転化を介してプロトロンビンからのトロンビ
ン遊離を測定する方法であってよい。この関連で好まし
い方法は色素原性の方法であり、特に色素原性トロンビ
ン基質、特にＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＮＢ
Ａ−ＩＰＡを用いるのが好ましい。
【００２３】本発明による方法の好ましい一態様におい
ては、過剰のプロテインＳ−欠乏血漿を未希釈検体に添
加し、次いで活性化プロテインＣ、外生または内生的血
餅形成経路のアクチベーター、燐脂質、Ｃａ＋＋、トロ
ンビンの色素原性基質およびヘパリン中和物質より成る
試薬を混合することにより血餅形成時間を測定する。前
記活性化プロテインＣは、残りの試薬を添加する少し前
に別個に検体に添加することもできる。
【００２４】本発明による方法の特に好ましい一態様で
は、未希釈検体を４〜１０倍容のプロテインＳ−欠乏血
漿と混合する。血餅形成反応は、プロテインＣ（１〜５
０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、血餅形成系のアクチベーター、好
ましくはトロンボプラスチンまたは蛇毒プロテアーゼ、
燐脂質（５〜３００ｐｐｍ（ｗ／ｖ））、例えばセファ
リン、カルシウムイオン（２〜１０ｍｍｏｌ／ｌ）、好
ましくはＣａＣｌ２、ヘパリン中和物質、例えばＰｏｌ
ｙｂｒｅｎ（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）および色素原性
トロンビン基質例えばＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−ＡＮＢＡ−ＩＰＡ、より成る（検体容量の５〜１０倍
容の）試薬を混合することにより開始される。試薬添加
から遊離された色素団（Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）の至
適吸収（例えば４０５ｎｍ）においてある吸光度（例え
ば０．１）に達するまでの時間を測定する。
【００２５】与えられた反応条件下に少なくとも５０秒
の血餅形成時間を（プロテインＳなしに）保証するアク
チベーター濃度は個々の場合について簡単な実験により
決めることができる。
【００２６】格別に好ましい方法および試薬は実施例に
記載のものである。
【００２７】血餅形成時間は、色素原性基質を用いる場
合には、好ましくは、試薬添加から、遊離される発色団
の至適吸収において一定の吸光度に達するまでの時間を
測定することにより測定される。評価を行うには、この
測定方法にプール血漿の各種希釈液（例えば１００％、
７５％、５０％、２５％、１２．５％、１０％）を用い
そして血餅形成時間を測定することにより検量線を作成
するのが有利である。
【００２８】生物学的検体は、好ましくは、人間からの
血漿とすることができ、この場合に未希釈検体を用いる
のが特に好ましい。
【００２９】適当なプロテインＳ−欠乏血漿は自体当業
者に知られた方法により、例えば免疫吸着により得るこ
とができる。ＶＩＩＩ因子は、必要に応じ、精製ＶＩＩ
Ｉ因子の添加により調整する。Ｖ因子は、必要に応じ、
多量のＶ因子を含むプロテインＳ−欠乏ウサギ血漿の添
加により調整することができる。検体：プロテインＳ−
欠乏血漿の容量比は好ましくは１：４〜１：１０である
。
【００３０】前記欠乏血漿は、好ましくは約２０〜１０
０％、特に好ましくは５０〜８０％のＶ因子含有率を有
する。
【００３１】プロテインＣは報告されている（例えばＢ
ａｊａｊ　Ｓ．　Ｐ．ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１
３（３）　１９１〜２１４）様々な方法により血漿から
精製することができ、あるいは生物工学的方法により調
製することができる。精製されたプロテインＣは支持体
材料、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）などに結合され
たトロンビンまたはＰＲＯＴＡＣ（Ｒ）により活性化す
ることができ、あるいは遺伝子工学的方法により直接得
られる活性化されたプロテインＣ（Ｅｈｒｌｉｃｈ　Ｈ
．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅ
ｍ．２６４（２４）　１４２９８〜１４３０９）を用い
ることができる。この測定方法における活性化プロテイ
ンＣの濃度は１〜５０ｐｍｏｌ／ｍｌとするのが有利で
ある。
【００３２】好ましくは、アグキストロドン・コントル
トリックス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔ
ｒｉｘ）の毒液からの蛇毒プロテアーゼにより活性化さ
れたプロテインＣを用いることができる。
【００３３】血餅形成系のアクチベーターは自体当業者
に知られている。本発明のためのアクチベーターは、蛇
毒プロテアーゼおよび血餅形成カスケードの活性化され
た因子、例えばＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子およびＸａ因
子であってもよい。好ましくは、ラッセル蝮蛇（Ｖｉｐ
ｅｒａ　ｒｕｓｓｅｌｌｉｉ）の毒液からのプロテアー
ゼ、スルファチド、エラグ酸、トロンボプラスチンおよ
び／またはシリカ粒子を用いることができる（Ｓｈｉｍ
ａｄａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８５）　Ｊ．　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．　９７，　４２９〜４３９）。個々のア
クチベーターの至適濃度は簡単な実験により測定するこ
とができる。
【００３４】燐脂質は自体当業者に知られた方法により
調製されるかまたは商業的に入手できる既知の物質群で
ある。試験混合物中の濃度は５〜３００ｐｐｍ（ｗ／ｖ
）とするのが好ましい。Ｃａ２＋イオンは有利にはＣａ
Ｃｌ２を添加することにより発生させることができる。 試験混合物中の濃度は２〜１０ｍＭとするのが好ましい
。
【００３５】ヘパリン中和物質は当業者に知られた化合
物群、例えばＰｏｌｙｂｒｅｎ、プロタミンクロライド
、プロタミンサルフェートなどである。
【００３６】反応は１５〜４０℃、好ましくは２０〜４
０℃、特に好ましくは３７℃で行うことができる。
【００３７】血漿中に存在するプロテインＳを記載の測
定方法において高感度でかつ特異的に測定できることが
見出された（表１）。５０〜１５０％のＶＩＩＩ因子濃
度変化、ビタミンＫ依存性血餅形成因子例えばプロトロ
ンビンまたはプロテインＣなど（プロテインＳ自体は除
く）の５０〜１５０％の濃度変化、または０．４Ｕ／ｍ
ｌまでのヘパリンの存在は影響しない。検体のＶ因子含
量は予測どおり一定の影響を示す。何故なら、検体中の
変動はプロテインＳ−欠乏血漿中の含量から完全にはバ
ランスされず、またこの因子の阻害がプロテインＳの活
性の尺度だからである。
【００３８】本発明は更に、プロテインＳを含まない検
体の血餅形成時間が少なくとも５０秒である本発明方法
によりプロテインＳを測定するための試薬に関する。
【００３９】これに関し、好ましい試薬はラッセル蝮蛇
の毒液からのプロテアーゼをアクチベーターとして含む
もの、およびトロンボプラスチンをアクチベーターとし
て含むものである。
【００４０】式Ｉ
【化２】 （式中ＲはＣ１〜５−アルキルまたは−ＣＨ〔ＣＨ（Ｃ
Ｈ３）２〕ＣＯＯＣＨ３であり、そしてｘはＨ−Ｄ−Ｐ
ｈｅ−、Ｂｏｃ−Ｇｌｙまたはトシル−Ｇｌｙである）
で示される色素原性トロンビン基質を含むものも好まし
い試薬である。
【００４１】
【表１】
【００４２】以下の実施例は本発明を例説するためのも
のであって本発明をいささかも限定するものではない。
【００４３】実施例　　１ ａＰＴＴ試薬に基づく使用準備の整った試薬の調製０．
５単位の活性化プロテインＣおよび１０μｇのポリブレ
ン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を、燐脂質、スルファチド、
Ｐｏｌｙｂｒｅｎ、色素原性トロンビン基質（Ｔｏｓ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−イソプロピルアミ
ド）およびＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．６より成るａＰＴＴ試
薬（Ｐａｒｔｏｃｈｒｏｍ（Ｒ），　Ｂｅｈｒｉｎｇｗ
ｅｒｋｅ　ＡＧ，　Ｄ−３５５０　Ｍａｒｂｕｒｇ）に
添加し、そしてその混合物を３７℃に加熱する。その時
点で試薬は使用準備が整う。
【００４４】実施例　　２ ＰＴ試薬に基づく使用準備の整った試薬の調製０．５単
位の活性化プロテインＣを、燐脂質、低濃度のトロンボ
プラスチン、色素原性トロンビン基質（Ｔｏｓ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−イソプロピルアミド）お
よびＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、より成るＰＴ試薬（Ｂｅ
ｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ，Ｄ−３５５０　Ｍａｒｂ
ｕｒｇ）に添加し、そしてその混合物を３７℃に加熱す
る。その時点で試薬は使用準備が整う。
【００４５】実施例　　３ 蛇毒からのアクチベーターに基づく使用準備の整った試
薬の調製 ４０ｎｇ／ｍｌのラッセル蝮蛇の蛇毒を、燐脂質、色素
原性トロンビン基質（Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−ＡＮＢＡ−イソプロピルアミド）、ヘパリン拮抗剤（
Ｐｏｌｙｂｒｅｎ）、塩化ナトリウムおよびＨｅｐｅｓ
、ｐＨ７．０、より成る緩衝液に添加し、そしてその混
合物を３７℃に加熱する。その時点で試薬は使用準備が
整う。
【００４６】実施例　　４ 血漿中のプロテインＳ含有率の測定 検量線作成のために、ホスフェート緩衝等張食塩水中で
健常供血者血漿の１００％、７５％、５０％、２５％、
１０％および０％希釈液を調製する。標準および検体の
測定は下記の如く行う：
【００４７】１０μｌの検体 ５０μｌのプロテインＳ−欠乏血漿 ５００μｌの試薬（ａ）実施例１によるもの、ｂ）実施
例２によるもの）をピペットでキュベットにとる。
【００４８】試薬を添加した時点で、時計をスタートさ
せ、そして一定の値（例えば０．１）だけ吸収が増加す
るまで４０５ｎｍにおける吸光度をモニターする。０％
プロテインＳについての値を超える血餅形成時間の延長
は検体中のプロテインＳの濃度に比例する（図１）。
【００４９】ＤＥ　３７　２４　４４３に記載の方法に
よる測定データはドイツ国出願公開ＤＥ　３７　２４　
４４３　Ａ１の第１図からとってある。
【００５０】実施例　　５ 活性化プロテインＣを別個に添加しての血漿中プロテイ
ンＳ含有率の測定 検量線作成のために、食塩水中で健常供血者血漿の１０
０％、７５％、５０％、２５％、１０％および０％希釈
液を調製する。標準および検体の測定は下記の如く行う
：
【００５１】１０μｌの検体 ５０μｌのプロテインＳ−欠乏血漿 ２５μｌの活性化プロテインＣ ５００μｌの実施例３による試薬 をピペットでキュベットにとる。
【００５２】試薬添加時に時計をスタートさせ、そして
吸収が一定の値（例えば０．１）だけ増加するまで４０
５ｎｍにおける吸光度をモニターするか、または血餅形
成の発生を測定する。０％プロテインＳについての値を
超える血餅形成時間の延長は検体中のプロテインＳの濃
度に比例する（図２）。
【図面の簡単な説明】
【図１】血漿中のプロテインＳ含有率を測定するための
検量線を例示する図。
【図２】活性化プロテインＣを別個に添加した場合の検
量線を例示する図。

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　アクチベーターの添加量を血餅形成時
    間が正常血餅形成時間よりも延長されるように調整する
    ことより成る生物学的検体中で血餅形成時間を測定する
    ことによるプロテインＳの測定方法。
  2. 【請求項２】　　過剰のプロテインＳ−欠乏血漿を検体
    に添加し、そして血餅形成アクチベーター、カルシウム
    イオン、燐脂質、活性化プロテインＣ、ヘパリンの阻害
    剤、および適切な場合には、トロンビンの色素原性ペプ
    チド基質より成る試薬を混合した後、遊離発色団の至適
    吸収において所定の吸光度増加が得られるまでまたは血
    餅形成が起こるまでの時間を測定する請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】　　検体をまず過剰のプロテインＳ−欠乏
    血漿と共に導入し、そして血餅形成アクチベーター、カ
    ルシウムイオン、燐脂質、ヘパリンの阻害剤およびトロ
    ンビンの色素原性ペプチド基質より成る試薬を添加する
    ことにより活性化プロテインＣを別個に添加した後、遊
    離発色団の至適吸収において所定の吸光度増加が得られ
    るまでまたは血餅形成が起こるまでの時間を測定する請
    求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】　　未希釈検体をその４〜１０倍容のプロ
    テインＳ−欠乏血漿と混合し、活性化プロテインＣ（１
    〜５０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、血餅形成系のアクチベーター
    、好ましくはトロンボプラスチンまたは蛇毒プロテアー
    ゼ、燐脂質（５〜３００ｐｐｍ（ｗ／ｖ））、例えばセ
    ファリン、カルシウムイオン（２〜１０ｍｍｏｌ／ｌ）
    、好ましくはＣａＣｌ２、ヘパリン中和物質例えばＰｏ
    ｌｙｂｒｅｎ（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）および色素原
    性トロンビン基質、例えばＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
    ｒｇ−ＡＮＢＡ−ＩＰＡ、より成る（検体容量の５〜１
    ０倍容の）試薬を混合することにより血餅形成反応を開
    始し、そして試薬を添加してから、遊離発色団の至適吸
    収（例えば４０５ｎｍ）において所定の吸光度が得られ
    るまでの時間を測定する請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】　　血餅形成時間を色素原性基質を用いて
    測定する請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】　　欠乏血漿のＶ因子含有率が２０〜１０
    ０％である請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】　　プロテインＣがアグキストロドン・コ
    ントルトリックス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔ
    ｏｒｔｒｉｘ）という蛇の毒液からの蛇毒プロテアーゼ
    により活性化されたものである請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】　　プロテインＳが存在しない場合の血餅
    形成時間が少なくとも５０秒である、生物学的検体中で
    血餅形成時間を測定することによるプロテインＳの機能
    的測定用試薬。
  9. 【請求項９】　　特に、活性化プロテインＣ、内生また
    は外生的血餅形成経路のアクチベーター、燐脂質、カル
    シウムイオン、適切な場合にはトロンビンの色素原性基
    質、およびヘパリン中和物質を含む請求項８記載の試薬
    。
  10. 【請求項１０】　　アクチベーターが蛇毒または再分画
    された蛇毒からのプロテアーゼである請求項８記載の試
    薬。
  11. 【請求項１１】　　トロンボプラスチンをアクチベータ
    ーとして用いる請求項８記載の試薬。
  12. 【請求項１２】　　アクチベーターがスルファチドまた
    はスルファチドの混合物である請求項８記載の試薬。
  13. 【請求項１３】　　ヘパリン阻害剤がＰｏｌｙｂｒｅｎ
    である請求項８記載の試薬。
  14. 【請求項１４】　　使用色素原性トロンビン基質が式Ｉ
    【化１】 〔式中ＲはＣ１〜５−アルキルまたは−ＣＨ〔ＣＨ（Ｃ
    Ｈ３）２〕ＣＯＯＣＨ３であり、そしてｘはＨ−Ｄ−Ｐ
    ｈｅ−、Ｂｏｃ−Ｇｌｙまたはトシル−Ｇｌｙである〕
    で示される化合物である請求項８記載の試薬。
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