JPH0583A - 一微生物及びその微生物から得られるプロテアーゼ類 - Google Patents
一微生物及びその微生物から得られるプロテアーゼ類Info
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトのカルス（皮膚硬結）を可溶ならしめ、
他の蛋白質性物質を減成しうる細胞外のプロテアーゼ類
を提供する。 【構成】 ヒトのカルスを含む蛋白質の減成活性を有す
プロテアーゼの１種以上を含有する、ミクロコッカス
セデンタリウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎ
ｔａｒｉｕｓ）培養液から分離された酵素物質とその製
造法である。プロテアーゼ活性を示すミクロコッカス
セデンタリウスの細胞を含まない培養液であり、蛋白質
に加えることよりなる蛋白質の減成法と減成生成物製造
法である。ミクロコッカス セデンタリウスＮＣＩＭＢ
４０２８７である。上記酵素物質あるいは培養液の製
薬上問題のない担体または賦形剤を併用する薬用組成物
であり、それらをヒトのカルスまたは鶏眼物質削除のた
めの薬剤製造用のために使用することである。さらに、
酵素物質あるいは培養液を局所用基剤中に含有する、皮
膚または人体の局所的治療用組成物である。
他の蛋白質性物質を減成しうる細胞外のプロテアーゼ類
を提供する。 【構成】 ヒトのカルスを含む蛋白質の減成活性を有す
プロテアーゼの１種以上を含有する、ミクロコッカス
セデンタリウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎ
ｔａｒｉｕｓ）培養液から分離された酵素物質とその製
造法である。プロテアーゼ活性を示すミクロコッカス
セデンタリウスの細胞を含まない培養液であり、蛋白質
に加えることよりなる蛋白質の減成法と減成生成物製造
法である。ミクロコッカス セデンタリウスＮＣＩＭＢ
４０２８７である。上記酵素物質あるいは培養液の製
薬上問題のない担体または賦形剤を併用する薬用組成物
であり、それらをヒトのカルスまたは鶏眼物質削除のた
めの薬剤製造用のために使用することである。さらに、
酵素物質あるいは培養液を局所用基剤中に含有する、皮
膚または人体の局所的治療用組成物である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物ミクロコッカス
セダンタリウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｓｅｄｅｎｔ
ａｒｉｕｓ）、この微生物ミクロコッカス セダンタリ
ウスから得られるプロテアーゼ類及びそれらの用途に関
するものである。
セダンタリウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｓｅｄｅｎｔ
ａｒｉｕｓ）、この微生物ミクロコッカス セダンタリ
ウスから得られるプロテアーゼ類及びそれらの用途に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質類を消化する酵素類は広く自然界
に分布している。広く各種の微生物中に細胞間並びに細
胞外のプロテアーゼ類が存在している。細胞外のプロテ
アーゼ類は微生物類がその生長のために必要な炭素及び
エネルギーの要求及び／または窒素の要求を満たすべく
蛋白質をその細胞内に送りこむための低分子量ペプチド
類に転換しうるように微生物類によって生産される。細
菌類、菌類及び酵母類は種々のプロテアーゼ類を生産す
ることが知られており、細胞間のもの及び細胞外のもの
いずれもその生化学的特徴並びに性状は例えば「酵素」
ポール・ディー・ボイヤー（Ｐａｕｌ Ｄ．Ｂｏｙｅ
ｒ）編、第３巻「加水分解：ペプチド結合」第３版１９
７１年に記述されている。
に分布している。広く各種の微生物中に細胞間並びに細
胞外のプロテアーゼ類が存在している。細胞外のプロテ
アーゼ類は微生物類がその生長のために必要な炭素及び
エネルギーの要求及び／または窒素の要求を満たすべく
蛋白質をその細胞内に送りこむための低分子量ペプチド
類に転換しうるように微生物類によって生産される。細
菌類、菌類及び酵母類は種々のプロテアーゼ類を生産す
ることが知られており、細胞間のもの及び細胞外のもの
いずれもその生化学的特徴並びに性状は例えば「酵素」
ポール・ディー・ボイヤー（Ｐａｕｌ Ｄ．Ｂｏｙｅ
ｒ）編、第３巻「加水分解：ペプチド結合」第３版１９
７１年に記述されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】我々はヒトのカルス
（皮膚硬結）を可溶ならしめ、他の蛋白質性物質を減成
しうる細胞外のプロテアーゼ類をミクロコッカス セダ
ンタリウスから生産し得ることを今や発見するに至っ
た。
（皮膚硬結）を可溶ならしめ、他の蛋白質性物質を減成
しうる細胞外のプロテアーゼ類をミクロコッカス セダ
ンタリウスから生産し得ることを今や発見するに至っ
た。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の一態様によれ
ば、ヒトのカルスを含む蛋白質を減成しうる能力のある
１種類以上のプロテアーゼよりなる酵素物質がミクロコ
ッカス セダンタリウスの培養液から分離され提供され
る。本発明のもう一つの態様によれば下記の特徴を有す
る一酵素物質が提供される。 水溶性、 非透析性（１０ＫＤａの遮断分子量を有する膜を通し
て）、 等電点 ４．６、 分子量 ３０．３ＫＤａ、 プロテアーゼ活性の最適ｐＨ約８．２、及び 最適温度約４０℃。 ミクロコッカス セダンタリウスから得られる酵素物質
はヒトのカルスを減成する活性に対する最適ｐＨは約
７．１であり、また最適温度は約４０℃であることが判
明した。３５℃でこの酵素物質は約５．１〜約１０．９
のｐＨ範囲内でプロテアーゼ活性を有し、４０℃でヒト
のカルスを減成する活性は約５．９〜約８．０の範囲内
にあることが分かっている。
ば、ヒトのカルスを含む蛋白質を減成しうる能力のある
１種類以上のプロテアーゼよりなる酵素物質がミクロコ
ッカス セダンタリウスの培養液から分離され提供され
る。本発明のもう一つの態様によれば下記の特徴を有す
る一酵素物質が提供される。 水溶性、 非透析性（１０ＫＤａの遮断分子量を有する膜を通し
て）、 等電点 ４．６、 分子量 ３０．３ＫＤａ、 プロテアーゼ活性の最適ｐＨ約８．２、及び 最適温度約４０℃。 ミクロコッカス セダンタリウスから得られる酵素物質
はヒトのカルスを減成する活性に対する最適ｐＨは約
７．１であり、また最適温度は約４０℃であることが判
明した。３５℃でこの酵素物質は約５．１〜約１０．９
のｐＨ範囲内でプロテアーゼ活性を有し、４０℃でヒト
のカルスを減成する活性は約５．９〜約８．０の範囲内
にあることが分かっている。
【０００５】本発明の更に他の態様によれば下記の特徴
を有する酵素物質が提供される。 水溶性、 非透析性（１０ＫＤａの遮断分子量を有する膜を通し
て）、 等電点 ２．７、 分子量 ５０ＫＤａ、 プロテアーゼ活性の最適ｐＨ約１０．２、及び 最適温度約４６℃。 ミクロコッカス セダンタリウスから得られるこの酵素
物質もヒトのカルスを減成するための最適のｐＨは約
７．５、また最適温度は約５０℃であることが判明し
た。３５℃でのこの酵素物質は約５．１〜約１１．３の
ｐＨ範囲内でプロテアーゼ活性を有し、５０℃でヒトの
カルスを減成する活性は約４．３乃至約１０．０の範囲
内にあることが分かっている。
を有する酵素物質が提供される。 水溶性、 非透析性（１０ＫＤａの遮断分子量を有する膜を通し
て）、 等電点 ２．７、 分子量 ５０ＫＤａ、 プロテアーゼ活性の最適ｐＨ約１０．２、及び 最適温度約４６℃。 ミクロコッカス セダンタリウスから得られるこの酵素
物質もヒトのカルスを減成するための最適のｐＨは約
７．５、また最適温度は約５０℃であることが判明し
た。３５℃でのこの酵素物質は約５．１〜約１１．３の
ｐＨ範囲内でプロテアーゼ活性を有し、５０℃でヒトの
カルスを減成する活性は約４．３乃至約１０．０の範囲
内にあることが分かっている。
【０００６】本発明の更に他の態様によれば、ミクロコ
ッカス セダンタリウスの培養液から酵素物質を分離す
ることよりなる本発明の酵素物質類の製法が提供され
る。本発明の更に他の態様により、プロテアーゼ活性を
示すミクロコッカスセダンタリウスの細胞を含有しない
培養液が提供される。上記のどの態様においても、下記
のミクロコッカス セダンタリウス（ＮＣＩＭＢ Ｎ
Ｏ．４０２８７）の新規な菌株を採用することが好まし
い。本発明の他の態様によれば、本発明の酵素物質また
は細胞を含有しない培養液をヒトのカルスあるいは鶏眼
に適用することよりなるヒトのカルスあるいは鶏眼を減
成する方法が提供される。
ッカス セダンタリウスの培養液から酵素物質を分離す
ることよりなる本発明の酵素物質類の製法が提供され
る。本発明の更に他の態様により、プロテアーゼ活性を
示すミクロコッカスセダンタリウスの細胞を含有しない
培養液が提供される。上記のどの態様においても、下記
のミクロコッカス セダンタリウス（ＮＣＩＭＢ Ｎ
Ｏ．４０２８７）の新規な菌株を採用することが好まし
い。本発明の他の態様によれば、本発明の酵素物質また
は細胞を含有しない培養液をヒトのカルスあるいは鶏眼
に適用することよりなるヒトのカルスあるいは鶏眼を減
成する方法が提供される。
【０００７】本発明のまた他の態様によれば、本発明の
酵素物質または細胞を含まない培養液を蛋白質に適用す
ることよりなる蛋白質の減成法が提供される。本発明の
更にまた他の態様によれば、本発明の酵素物質を蛋白質
性物質に適用することよりなる蛋白質性物質からの減成
物製造法が提供される。
酵素物質または細胞を含まない培養液を蛋白質に適用す
ることよりなる蛋白質の減成法が提供される。本発明の
更にまた他の態様によれば、本発明の酵素物質を蛋白質
性物質に適用することよりなる蛋白質性物質からの減成
物製造法が提供される。
【０００８】本発明の更に別の態様によれば、ブダペス
ト条約の下に１９９０年５月２４日に受入れ番号ＮＣＩ
ＭＢ４０２８７で国立工業用細菌、海洋細菌収集所に寄
託されたミクロコッカス セダンタリウス株が提供され
る。本発明の蛋白質減成法或いは消化法においては、そ
の処理されるべき物質に純粋な酵素物質、その調合物、
またはミクロコッカス セダンタリウスの細胞を含有し
ない培養液を用いることが好ましい。 好ましい一つの
態様においては、本発明の酵素物質はミクロコッカス
セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２８７株から分離され
る。
ト条約の下に１９９０年５月２４日に受入れ番号ＮＣＩ
ＭＢ４０２８７で国立工業用細菌、海洋細菌収集所に寄
託されたミクロコッカス セダンタリウス株が提供され
る。本発明の蛋白質減成法或いは消化法においては、そ
の処理されるべき物質に純粋な酵素物質、その調合物、
またはミクロコッカス セダンタリウスの細胞を含有し
ない培養液を用いることが好ましい。 好ましい一つの
態様においては、本発明の酵素物質はミクロコッカス
セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２８７株から分離され
る。
【０００９】本発明の第２番目及び第３番目の態様の酵
素物質はミクロコッカスセダンタリウスＮＣＩＭＢ４０
２８７株を培養して得られるものとして以下これらをプ
ロテアーゼ１及びプロテアーゼ２と称することにする。
ミクロコッカス セダンタリウスの他の菌株のものも、
生物学的活性に関する限り、プロテアーゼ１及び２と類
似したプロテアーゼを生産するであろう。このようなプ
ロテアーゼ類も本発明の範囲内に含まれるものとする。
素物質はミクロコッカスセダンタリウスＮＣＩＭＢ４０
２８７株を培養して得られるものとして以下これらをプ
ロテアーゼ１及びプロテアーゼ２と称することにする。
ミクロコッカス セダンタリウスの他の菌株のものも、
生物学的活性に関する限り、プロテアーゼ１及び２と類
似したプロテアーゼを生産するであろう。このようなプ
ロテアーゼ類も本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００１０】
【実施例】本発明の種々の好ましい特色並びに態様につ
いて、限定を意図しない次の実施例を挙げ且つ添付の図
面により記述することにする。微生物ミクロコッカス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０
２８７ プロテアーゼ１及び２の製出のために用いられる微生物
は成人の足の皮膚から分離された。特にミクロコッカス
セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２８７株は成人の足の
皮膚から分離され、クルースら（１）及びシュライフェ
ルら（４）に従って同定された。この生物の培養菌は上
述の如く寄託されている。ここに記述され特徴づけられ
ている特定の微性物以外の、他の菌株の微生物が培養さ
れ生成物を生産し得ることは明らかであり、この種のす
べての菌株も本発明の範囲内にあるものとする。下記の
培養基をこの微生物の生育に使用することができる．加
熱した馬の血液寒天、及び液体培養には、１％（ｗ／
ｖ）の細菌学用ペプトン、１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物
及び０．５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ（ＢＰＹＥ）。貯蔵
は４０％（ｖ／ｖ）のグリセリン−ＰＢＳ（燐酸塩緩衝
食塩溶液）中−２０℃で行うかまたは凍結乾燥により行
う。ミクロコッカス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２
８７のコロニイは、加熱した血液寒天上では皺がよって
いて、淡黄色であり、また蛋白質加水分解性である。下
記の特性が見られる。顕微鏡検査 四分子においてグラム陽性球菌不動性 嫌気性状態での生育 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ − 体外色素の生成 ＋褐色 シモンスのクエン酸塩寒天上の生育 − 無機窒素寒天上の生育 − ７．５％ＮａＣｌ寒天上の生育 ＋ 硝酸塩の還元 − アセトインの生成 − −ガラクトシダーゼの生成 − ブドー糖からの酸 − グリセリン − マンノース − エスクリンの加水分解 − ３７℃での生育 ＋ アギニンの加水分解 ＋ カゼインの加水分解 ＋ メチオニンからメタンチオールの生成 ＋
いて、限定を意図しない次の実施例を挙げ且つ添付の図
面により記述することにする。微生物ミクロコッカス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０
２８７ プロテアーゼ１及び２の製出のために用いられる微生物
は成人の足の皮膚から分離された。特にミクロコッカス
セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２８７株は成人の足の
皮膚から分離され、クルースら（１）及びシュライフェ
ルら（４）に従って同定された。この生物の培養菌は上
述の如く寄託されている。ここに記述され特徴づけられ
ている特定の微性物以外の、他の菌株の微生物が培養さ
れ生成物を生産し得ることは明らかであり、この種のす
べての菌株も本発明の範囲内にあるものとする。下記の
培養基をこの微生物の生育に使用することができる．加
熱した馬の血液寒天、及び液体培養には、１％（ｗ／
ｖ）の細菌学用ペプトン、１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物
及び０．５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ（ＢＰＹＥ）。貯蔵
は４０％（ｖ／ｖ）のグリセリン−ＰＢＳ（燐酸塩緩衝
食塩溶液）中−２０℃で行うかまたは凍結乾燥により行
う。ミクロコッカス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２
８７のコロニイは、加熱した血液寒天上では皺がよって
いて、淡黄色であり、また蛋白質加水分解性である。下
記の特性が見られる。顕微鏡検査 四分子においてグラム陽性球菌不動性 嫌気性状態での生育 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ − 体外色素の生成 ＋褐色 シモンスのクエン酸塩寒天上の生育 − 無機窒素寒天上の生育 − ７．５％ＮａＣｌ寒天上の生育 ＋ 硝酸塩の還元 − アセトインの生成 − −ガラクトシダーゼの生成 − ブドー糖からの酸 − グリセリン − マンノース − エスクリンの加水分解 − ３７℃での生育 ＋ アギニンの加水分解 ＋ カゼインの加水分解 ＋ メチオニンからメタンチオールの生成 ＋
【００１１】円板法による抗生物質に対する感受性 抗生物質
円板量
ペニシリン １単位 Ｒ
エリスロマイシン １０μｇ Ｓ
クロラムフェニコール １０μｇ Ｓ
カナマシイン ３０μｇ Ｓ
ストレプトマイシン １０μｇ Ｓ
ノヴォビオシン ５μｇ Ｓ
テトラサイクリン １０μｇ Ｓ
ネオマイシン ３０μｇ Ｓ
ヴァノマイシン ３０μｇ Ｓ
メチシリン １０μｇ Ｒ
（Ｒ：抵抗性、Ｓ：感受性）
【００１２】ミクロコッカス セダンタリウスの生育及
びプロテアーゼ類の生産 プロテアーゼ１及び２はミクロコッカス セダンタリウ
スを培養することにより生産される。既述の如くミクロ
コッカス セダンタリウスはグリセリン−ＰＢＳ中に貯
蔵あるいは凍結乾燥して貯蔵することができ、またＢＰ
ＹＥを用いて培養することができる。その際培養液を遠
心分離することにより粗製上澄液を作ることができる。
その上澄液はついで脱塩し濃縮される。下記の限定を意
図しない実施例は更によくプロテアーゼ１及び２の製法
を説明する。
びプロテアーゼ類の生産 プロテアーゼ１及び２はミクロコッカス セダンタリウ
スを培養することにより生産される。既述の如くミクロ
コッカス セダンタリウスはグリセリン−ＰＢＳ中に貯
蔵あるいは凍結乾燥して貯蔵することができ、またＢＰ
ＹＥを用いて培養することができる。その際培養液を遠
心分離することにより粗製上澄液を作ることができる。
その上澄液はついで脱塩し濃縮される。下記の限定を意
図しない実施例は更によくプロテアーゼ１及び２の製法
を説明する。
【００１３】実施例１ 培養
細い紙片上の凍結乾燥細胞が下記の組成をもつ１００ｍ
ｌのＢＰＹＥ中に接種された。 細菌学用ペプトン（オキソイドＬ３７） １％（ｗ／ｖ） 酵母抽出物（オキソイドＬ２１） １％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ（シグマ） ０．５％（ｗ／ｖ） 培養液は３７℃で４８時間軌道運動的振盪（１６０ｒｐ
ｍ）を行いつつ培養された。この培養液１０ｍｌをＢＰ
ＹＥ＋０．０５％（ｖ／ｖ）ポリプロピレングリコール
１０２５（ＢＤＨ）を接種するのに用いた。この培養基
は窒素圧下に０．２μｍ多孔性の濾器を通し、ＬＨエン
ジニヤリング５００系統の連続式培養装置の栄養素貯蔵
器中に入れ１８ｌ回分ずつ滅菌された、この装置にはｐ
Ｈ，酵素張力及び温度の監視並びに制御ができるように
なっており、一回の培養液量は６７０ｍｌであった。培
養液は９００ｒｐｍで直接駆動により撹拌され、ｐＨは
８．５±０．１，温度は３５±０．２℃，空気に関して
酵素張力は７４±４％に保たれた。接種の２日後に、装
置は連続式に切り換えられ希釈率は０．２５ｈ−１に設
定された。６回の培養液量が用いられた後に、新しい収
穫貯蔵器が連結され、室温下に、７．３ｌの培養液が収
穫され、ＮａＮ３が０．０５％（ｗ／ｖ）にまで添加さ
れた。
ｌのＢＰＹＥ中に接種された。 細菌学用ペプトン（オキソイドＬ３７） １％（ｗ／ｖ） 酵母抽出物（オキソイドＬ２１） １％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ（シグマ） ０．５％（ｗ／ｖ） 培養液は３７℃で４８時間軌道運動的振盪（１６０ｒｐ
ｍ）を行いつつ培養された。この培養液１０ｍｌをＢＰ
ＹＥ＋０．０５％（ｖ／ｖ）ポリプロピレングリコール
１０２５（ＢＤＨ）を接種するのに用いた。この培養基
は窒素圧下に０．２μｍ多孔性の濾器を通し、ＬＨエン
ジニヤリング５００系統の連続式培養装置の栄養素貯蔵
器中に入れ１８ｌ回分ずつ滅菌された、この装置にはｐ
Ｈ，酵素張力及び温度の監視並びに制御ができるように
なっており、一回の培養液量は６７０ｍｌであった。培
養液は９００ｒｐｍで直接駆動により撹拌され、ｐＨは
８．５±０．１，温度は３５±０．２℃，空気に関して
酵素張力は７４±４％に保たれた。接種の２日後に、装
置は連続式に切り換えられ希釈率は０．２５ｈ−１に設
定された。６回の培養液量が用いられた後に、新しい収
穫貯蔵器が連結され、室温下に、７．３ｌの培養液が収
穫され、ＮａＮ３が０．０５％（ｗ／ｖ）にまで添加さ
れた。
【００１４】実施例２粗製上澄液の製造
４℃で１０分間、５０００ｇで２５０ｍｌずつ遠心分離
により培養液から細胞が除去された上澄液は集めて貯留
され、プラスチック製の血液貯蔵袋中にポンプで送り込
み、−３０℃で貯蔵された。
により培養液から細胞が除去された上澄液は集めて貯留
され、プラスチック製の血液貯蔵袋中にポンプで送り込
み、−３０℃で貯蔵された。
【００１５】実施例３ プロテアーゼ類の脱塩及び濃縮
上澄液は、ポンプによりその中の液体が流動しているア
ミコンＴＣＦ１０Ａのセル内に４℃で保持されている９
０ｍｍＰＭ１０限外濾過膜（遮断分子量１０，０００，
アミコン）を使用し、脱塩及び濃縮が行われた。限外濾
過は３０ｐｓｉ（２０６，８２０Ｐａ）の酵素を含まな
い窒素を用い企画された。濾過膜上の液容が２２０ｍｌ
になった時に、２２０ｍｌの０．０５％（ｗ／ｖ）Ｎａ
Ｎ３を加えてから再び液容を２２０ｍｍに減らした。更
に４ｌの０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３の連続流を用い
て脱塩が行われた。残留分の容積は１８３ｍｌに減り、
２０ｍｌずつその小分け分を作り、それらを−３０℃で
貯蔵した。プロテアーゼ１及び２の精製 １５ｍｌの残留分からプロテアーゼ類の分離及び精製は
最初はイオン交換により、次には疏水性相互作用によ
り、そして最後には親和力によるカラムクロマトグラフ
ィを用いる。これら各クラマトグラフィの操作から得ら
れるプロテアーゼ含有のフラクションは必要の時まで−
３０℃で貯蔵された。下記の限定を意図しない実施例が
更に精製について説明する。
ミコンＴＣＦ１０Ａのセル内に４℃で保持されている９
０ｍｍＰＭ１０限外濾過膜（遮断分子量１０，０００，
アミコン）を使用し、脱塩及び濃縮が行われた。限外濾
過は３０ｐｓｉ（２０６，８２０Ｐａ）の酵素を含まな
い窒素を用い企画された。濾過膜上の液容が２２０ｍｌ
になった時に、２２０ｍｌの０．０５％（ｗ／ｖ）Ｎａ
Ｎ３を加えてから再び液容を２２０ｍｍに減らした。更
に４ｌの０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３の連続流を用い
て脱塩が行われた。残留分の容積は１８３ｍｌに減り、
２０ｍｌずつその小分け分を作り、それらを−３０℃で
貯蔵した。プロテアーゼ１及び２の精製 １５ｍｌの残留分からプロテアーゼ類の分離及び精製は
最初はイオン交換により、次には疏水性相互作用によ
り、そして最後には親和力によるカラムクロマトグラフ
ィを用いる。これら各クラマトグラフィの操作から得ら
れるプロテアーゼ含有のフラクションは必要の時まで−
３０℃で貯蔵された。下記の限定を意図しない実施例が
更に精製について説明する。
【００１６】実施例４ イオン交換クロマトグラフィ
１５ｍｌの残留液を３．７５ｍｌの５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ，０．２５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ８．０）緩
衝液と混ぜ、ＤＥＡＥ−セファローズ高速流陰イオン交
換カラム（カラム寸法２．２×５０ｃｍ、ベッド容積３
６ｍｌ）を予め開始時使用の緩衝液（１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ，０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３，ｐＨ８．０）で
平衡させておいたものに４℃で６０ｍｌｈ−１の流速
（線流速１５．８ｃｍｈ−１）で通す。負荷が終了後、
ベッド容積の２０倍の前記緩衝液でカラムを洗浄して結
合していない物質を溶離し、１２ｍｌずつフラクション
に分けて集めた。これらのフラクションには蛋白質分解
活性が認められなかった。結合した物質は、次に前記緩
衝液中に０〜０．５ＭＮａＣｌを含有し、イオン強度の
増加する線勾配液１．６ｌを用いて溶離した。フラクシ
ョン（８ｍｌ）として集められ、このＮａＣｌ勾配溶離
の開始後７０乃至４４０ｍｌの間でプロテアーゼ１が溶
離された。０．０３〜０．０５ＮａＣｌに相当する８つ
のフラクション（勾配溶離の開始後１１２〜１７６ｍ
ｌ）中にプロテアーゼ１がもっともよく溶離された。こ
れら８つのフラクションの各々の４μｌをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ及び銀染色により分析して、３０．３ｋＤａの一重
プロテインバンドが観察された。プロテアーゼ２はＮａ
Ｃｌ勾配溶離の開始後７２０〜９１２ｍｌの間で溶離さ
れ、その内０．２３〜０．２５ＭＮａＣｌに相当する１
３のフラクション（勾配溶離の開始後７３６〜８４０ｍ
ｌ）中にプロテアーゼ２の活性がもっともよく溶離され
た。これら１３のフラクションの各々の４ｍｌをＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及び銀染色により分析すると多重ポリペプチ
ドバンドが見られ、５０ｋＤａにに主バンドがあった。
残留液中のものに比較してポリペプチドの種別の数が著
しく減少していた。先の１３のフラクションの等容ずつ
を集めて（全容９２ｍｌ）、ＰＭ１０限外濾過膜（遮断
分子量１０，０００；アミコン）を用い、４℃で３０ｐ
ｓｉの酵素を含まない窒素を用いて１０．３倍濃縮し、
８５％脱塩した。その結果８．８ｍｌの半純プロテアー
ゼ２が得られた。
Ｃｌ，０．２５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ８．０）緩
衝液と混ぜ、ＤＥＡＥ−セファローズ高速流陰イオン交
換カラム（カラム寸法２．２×５０ｃｍ、ベッド容積３
６ｍｌ）を予め開始時使用の緩衝液（１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ，０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３，ｐＨ８．０）で
平衡させておいたものに４℃で６０ｍｌｈ−１の流速
（線流速１５．８ｃｍｈ−１）で通す。負荷が終了後、
ベッド容積の２０倍の前記緩衝液でカラムを洗浄して結
合していない物質を溶離し、１２ｍｌずつフラクション
に分けて集めた。これらのフラクションには蛋白質分解
活性が認められなかった。結合した物質は、次に前記緩
衝液中に０〜０．５ＭＮａＣｌを含有し、イオン強度の
増加する線勾配液１．６ｌを用いて溶離した。フラクシ
ョン（８ｍｌ）として集められ、このＮａＣｌ勾配溶離
の開始後７０乃至４４０ｍｌの間でプロテアーゼ１が溶
離された。０．０３〜０．０５ＮａＣｌに相当する８つ
のフラクション（勾配溶離の開始後１１２〜１７６ｍ
ｌ）中にプロテアーゼ１がもっともよく溶離された。こ
れら８つのフラクションの各々の４μｌをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ及び銀染色により分析して、３０．３ｋＤａの一重
プロテインバンドが観察された。プロテアーゼ２はＮａ
Ｃｌ勾配溶離の開始後７２０〜９１２ｍｌの間で溶離さ
れ、その内０．２３〜０．２５ＭＮａＣｌに相当する１
３のフラクション（勾配溶離の開始後７３６〜８４０ｍ
ｌ）中にプロテアーゼ２の活性がもっともよく溶離され
た。これら１３のフラクションの各々の４ｍｌをＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及び銀染色により分析すると多重ポリペプチ
ドバンドが見られ、５０ｋＤａにに主バンドがあった。
残留液中のものに比較してポリペプチドの種別の数が著
しく減少していた。先の１３のフラクションの等容ずつ
を集めて（全容９２ｍｌ）、ＰＭ１０限外濾過膜（遮断
分子量１０，０００；アミコン）を用い、４℃で３０ｐ
ｓｉの酵素を含まない窒素を用いて１０．３倍濃縮し、
８５％脱塩した。その結果８．８ｍｌの半純プロテアー
ゼ２が得られた。
【００１７】実施例５ 疏水性相互作用クロマトグラフィ
半純プロテアーゼ２の２ｍｌが、フェニル セファロー
ズＣＬ−４Ｂ疏水性相互作用カラム（カラム寸法２×１
５ｃｍ，ベッド容積１３．７ｍｌ）を開始時使用の緩衝
液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ），
ＮａＮ３ｐＨ８．０）中の１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４
と予め平衡させておいたものに４℃で流速１２ｍｌｈ
−１（線流速６ｃｍｈ−１）で通された。負荷が終了
後、ベッド容積の５倍の前記緩衝液でカラムを洗浄して
結合していない物質を溶離し、４ｍｌずつフラクション
に分けて集めた。これらのフラクションには蛋白質分解
活性が認められなかった。結合した物質は、次に前記緩
衝液中に１．５〜０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有し、そ
の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度の減少する線勾配液２７４ｍ
ｌを用いて溶離され、４ｍｌずつフラクションに分けて
集められた。プロテアーゼ２は、７つのフラクション
（勾配溶離の開始後２３２〜２６０ｍｌ）中に溶離し、
その内約０．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４に相当する勾配溶
離の開始後２４６〜２５６ｍｌの間でプロテアーゼ２が
もっともよく溶離した。これら７つのフラクションの各
々の４μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により分析し
て５０ｋＤａの主ポリペプチドバンドが観察された。わ
ずかに高分子量である一つの弱いポリペプチドバンドも
また観察された。これら７つのフラクションの各容積
（０．３ｍｌ）を集めて、遮断分子量１０，０００のセ
ントリコン１０ミクロ濃縮器（アミコン）を用い８２μ
ｌにまで濃縮した。
ズＣＬ−４Ｂ疏水性相互作用カラム（カラム寸法２×１
５ｃｍ，ベッド容積１３．７ｍｌ）を開始時使用の緩衝
液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ），
ＮａＮ３ｐＨ８．０）中の１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４
と予め平衡させておいたものに４℃で流速１２ｍｌｈ
−１（線流速６ｃｍｈ−１）で通された。負荷が終了
後、ベッド容積の５倍の前記緩衝液でカラムを洗浄して
結合していない物質を溶離し、４ｍｌずつフラクション
に分けて集めた。これらのフラクションには蛋白質分解
活性が認められなかった。結合した物質は、次に前記緩
衝液中に１．５〜０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有し、そ
の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度の減少する線勾配液２７４ｍ
ｌを用いて溶離され、４ｍｌずつフラクションに分けて
集められた。プロテアーゼ２は、７つのフラクション
（勾配溶離の開始後２３２〜２６０ｍｌ）中に溶離し、
その内約０．１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４に相当する勾配溶
離の開始後２４６〜２５６ｍｌの間でプロテアーゼ２が
もっともよく溶離した。これら７つのフラクションの各
々の４μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により分析し
て５０ｋＤａの主ポリペプチドバンドが観察された。わ
ずかに高分子量である一つの弱いポリペプチドバンドも
また観察された。これら７つのフラクションの各容積
（０．３ｍｌ）を集めて、遮断分子量１０，０００のセ
ントリコン１０ミクロ濃縮器（アミコン）を用い８２μ
ｌにまで濃縮した。
【００１８】実施例６ 親和力クロマトグラフィ
疏水性相互作用クロマトグラフィからの濃縮フラクショ
ン５０μｌを２５０μｌの５ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．
５％ＮａＮ３（ｐＨ８．０）緩衝液と混ぜ、予め５ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、０．０５％ＮａＮ３（ｐＨ８．０）の
開始時の緩衝液と平衡させておいたベンザミジン−セフ
ァローズ６Ｂ親和力カラム（カラム寸法１×１５ｃｍ，
ベッド容積５．８ｍｌ）に、４℃で流速６ｍｌｈ
−１（線流速７．５ｃｍｈ−１）で負荷した。負荷の終
了後、試料を３０分間、緩衝液を流すことなしに吸収す
るままに放置し、次いでベッド容積の６．７倍の開始時
緩衝液を用いてカラムを洗浄し、結合していない物質を
溶離した。フラクション（１．５ｍｌ）として集められ
た。これらのフラクションには蛋白分解活性が認められ
なかった。結合した物質は次に７５ｍｌＭトリス−ＨＣ
ｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ８．０）緩衝
液中に０〜０．２ＭＮａＣｌを含有し、イオン強度の増
加する線勾配液の２９ｍｌを用いて溶離しフラクション
（１．５ｍｌ）として集められた。プロテアーゼ２は約
０．１８ＭＮａＣｌに相当する４つのフラクション（勾
配溶離の開始後２２．５〜２８．５ｍｌ）中に溶離し
た。これら４つのフラクションの各々の４μｌをＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及び銀染色で分析した５０ｋＤａの分子量を
持った一重ポリペプチドバンドが観察される。プロテア
ーゼ２を含有するこの４つのフラクションは、−３０℃
で貯蔵された。
ン５０μｌを２５０μｌの５ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．
５％ＮａＮ３（ｐＨ８．０）緩衝液と混ぜ、予め５ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、０．０５％ＮａＮ３（ｐＨ８．０）の
開始時の緩衝液と平衡させておいたベンザミジン−セフ
ァローズ６Ｂ親和力カラム（カラム寸法１×１５ｃｍ，
ベッド容積５．８ｍｌ）に、４℃で流速６ｍｌｈ
−１（線流速７．５ｃｍｈ−１）で負荷した。負荷の終
了後、試料を３０分間、緩衝液を流すことなしに吸収す
るままに放置し、次いでベッド容積の６．７倍の開始時
緩衝液を用いてカラムを洗浄し、結合していない物質を
溶離した。フラクション（１．５ｍｌ）として集められ
た。これらのフラクションには蛋白分解活性が認められ
なかった。結合した物質は次に７５ｍｌＭトリス−ＨＣ
ｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ８．０）緩衝
液中に０〜０．２ＭＮａＣｌを含有し、イオン強度の増
加する線勾配液の２９ｍｌを用いて溶離しフラクション
（１．５ｍｌ）として集められた。プロテアーゼ２は約
０．１８ＭＮａＣｌに相当する４つのフラクション（勾
配溶離の開始後２２．５〜２８．５ｍｌ）中に溶離し
た。これら４つのフラクションの各々の４μｌをＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及び銀染色で分析した５０ｋＤａの分子量を
持った一重ポリペプチドバンドが観察される。プロテア
ーゼ２を含有するこの４つのフラクションは、−３０℃
で貯蔵された。
【００１９】プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の性質
本発明のプロテアーゼ類の活性を測定するために下記の
方法が用いられた。蛋白質分解活性の検出 蛋白質分解活性は、クロマトグラフィのカラムから溶離
されるフラクション中においてか、あるいはカゼインを
基質として用いる等電集束（ＩＥＦ）分析用ゲルに加え
られる試料中において測定される。カラムフラクション
中の蛋白質分解活性の検出には下記の操作が用いられ
た。ハムマーステンカゼイン（Ｈａｍｍａｒｓｔｅｎ
ｃａｓｅｉｎ）を、０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で０．１
５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０．０）中に２分間煮沸して溶かした。このカゼイン
溶液の１０ｍｌを同緩衝液中の溶融した（６０℃）２％
（ｗ／ｖ）アガロースの等容積に加え、８．４×１２．
７ｃｍの微量滴定板面上に注いで固まらせる。このアガ
ロースにくぼみ（直径２．５ｍｍ）を作り、その中へ各
試験液の５μｌをピペットで計り入れる。板は湿気のあ
る室内に入れ３７℃で培養される。一晩培養した後で、
その板に１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を
十分に注ぎかけると、ゲル内にカゼインが沈殿すること
により蛋白質分解活性が目視可能となる。蛋白質分解活
性は沈殿したカゼインを白い背景にしてくぼみの回りに
透明域ができていることで分かる。ＩＥＦゲル中のプロ
テアーゼ類の検出にはｐＨ１０．０の緩衝液を含有する
アガロースカゼインが用いられた。アガロースカゼイン
ゲルはカラムフラクション中の蛋白質分解活性検出のた
めに上述したと同じようにして作られた。ＩＥＦゲル中
でのプロテアーゼの位置は負荷された、そして電気集束
されたＩＥＦゲルを注意深くカゼインアガロースゲルの
表面上に置くことにより測定された。３７℃で一晩培養
した後、そのＩＥＦゲルの位置を印してからＩＥＦゲル
は取り除かれた。カゼインアガロース板には１０％（ｗ
／ｖ）ＴＣＡが十分に注がれ、プロテアーゼの位置は一
つの透明帯として観察された。
方法が用いられた。蛋白質分解活性の検出 蛋白質分解活性は、クロマトグラフィのカラムから溶離
されるフラクション中においてか、あるいはカゼインを
基質として用いる等電集束（ＩＥＦ）分析用ゲルに加え
られる試料中において測定される。カラムフラクション
中の蛋白質分解活性の検出には下記の操作が用いられ
た。ハムマーステンカゼイン（Ｈａｍｍａｒｓｔｅｎ
ｃａｓｅｉｎ）を、０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で０．１
５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０．０）中に２分間煮沸して溶かした。このカゼイン
溶液の１０ｍｌを同緩衝液中の溶融した（６０℃）２％
（ｗ／ｖ）アガロースの等容積に加え、８．４×１２．
７ｃｍの微量滴定板面上に注いで固まらせる。このアガ
ロースにくぼみ（直径２．５ｍｍ）を作り、その中へ各
試験液の５μｌをピペットで計り入れる。板は湿気のあ
る室内に入れ３７℃で培養される。一晩培養した後で、
その板に１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を
十分に注ぎかけると、ゲル内にカゼインが沈殿すること
により蛋白質分解活性が目視可能となる。蛋白質分解活
性は沈殿したカゼインを白い背景にしてくぼみの回りに
透明域ができていることで分かる。ＩＥＦゲル中のプロ
テアーゼ類の検出にはｐＨ１０．０の緩衝液を含有する
アガロースカゼインが用いられた。アガロースカゼイン
ゲルはカラムフラクション中の蛋白質分解活性検出のた
めに上述したと同じようにして作られた。ＩＥＦゲル中
でのプロテアーゼの位置は負荷された、そして電気集束
されたＩＥＦゲルを注意深くカゼインアガロースゲルの
表面上に置くことにより測定された。３７℃で一晩培養
した後、そのＩＥＦゲルの位置を印してからＩＥＦゲル
は取り除かれた。カゼインアガロース板には１０％（ｗ
／ｖ）ＴＣＡが十分に注がれ、プロテアーゼの位置は一
つの透明帯として観察された。
【００２０】定量法
プロテアーゼ活性の定量的測定のために更に付加的な方
法が用いられた。これらの方法は以下定量法と呼ぶこと
にする。定量法−プロテアーゼ１ １ｍｌの酵素溶液と１ｍｌ４％（ｗ／ｖ）アゾカゼイン
を１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（室温下ｐＨ８．５
或いは４０℃でｐＨ８．１）中に含有する反応混合物が
３０分間４０℃で培養され、この反応混合物には時間が
０の時に、また別にこれと同様な反応混合物には培養後
に、２ｍｌのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（１０％，ｗ／
ｖ）が添加された。ＴＣＡで沈殿した物質はワットマン
Ｎｏ．１濾紙で濾過して除去し、１．５ｍｌ濾液を０．
２２５ｍｌのＮａＯＨ（１０Ｍ）に加え、その吸光度を
４４０ｎｍで分光光度法により測定した。酵素を含まな
い場合も含め、また分析は２回繰り返して行った。
法が用いられた。これらの方法は以下定量法と呼ぶこと
にする。定量法−プロテアーゼ１ １ｍｌの酵素溶液と１ｍｌ４％（ｗ／ｖ）アゾカゼイン
を１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（室温下ｐＨ８．５
或いは４０℃でｐＨ８．１）中に含有する反応混合物が
３０分間４０℃で培養され、この反応混合物には時間が
０の時に、また別にこれと同様な反応混合物には培養後
に、２ｍｌのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（１０％，ｗ／
ｖ）が添加された。ＴＣＡで沈殿した物質はワットマン
Ｎｏ．１濾紙で濾過して除去し、１．５ｍｌ濾液を０．
２２５ｍｌのＮａＯＨ（１０Ｍ）に加え、その吸光度を
４４０ｎｍで分光光度法により測定した。酵素を含まな
い場合も含め、また分析は２回繰り返して行った。
【００２１】定量法−プロテアーゼ２
プロテアーゼ２は２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（室
温下ｐＨ１０．７５或いは４５℃でｐＨ１０．１）を使
用し、また反応混合物が９分間４５℃で培養されたこと
以外はプロテアーゼ１について述べたと同じようにして
定量された。これらの定量のための緩衝液のｐＨはいず
れも室温下で調整された。次に述べる定量法を用いたプ
ロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の最適ｐＨ並びに活性
範囲の測定は別にして、上に述べた定量法は次いでプロ
テアーゼ１及びプロテアーゼ２の活性測定に用いられ
た。表１中「フラクション」として示されている酵素含
有溶液のそれぞれの容量のものが定量法によりプロテア
ーゼ活性が測定され、プロテインに対してはその製造業
者の指定に従い、ＢＣＡプロテイン試薬（ピヤース・ケ
ミカル・カンパニー，チェスター，英国）が用いられ
た。プロテアーゼ２の定量体（プロテアーゼ活性）は、
プロテアーゼ１について述べた定量法を用いた「イオン
交換Ｐ１」を除き、すべてのフラクションを測定するた
るめに用いられた。結果は、表１に示されている。プロ
テアーゼ１は粗製培養液上澄液の７．３ｌから精製さ
れ、精製係数は２．２−倍、収率は０．３％であった。
プロテアーゼ２は粗製上澄液から精製係数２８．９−
倍、収率３８．５％で精製された。表１中、精製係数は
粗製上澄液からの全プロテアーゼ活性に関して示されて
いる。
温下ｐＨ１０．７５或いは４５℃でｐＨ１０．１）を使
用し、また反応混合物が９分間４５℃で培養されたこと
以外はプロテアーゼ１について述べたと同じようにして
定量された。これらの定量のための緩衝液のｐＨはいず
れも室温下で調整された。次に述べる定量法を用いたプ
ロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の最適ｐＨ並びに活性
範囲の測定は別にして、上に述べた定量法は次いでプロ
テアーゼ１及びプロテアーゼ２の活性測定に用いられ
た。表１中「フラクション」として示されている酵素含
有溶液のそれぞれの容量のものが定量法によりプロテア
ーゼ活性が測定され、プロテインに対してはその製造業
者の指定に従い、ＢＣＡプロテイン試薬（ピヤース・ケ
ミカル・カンパニー，チェスター，英国）が用いられ
た。プロテアーゼ２の定量体（プロテアーゼ活性）は、
プロテアーゼ１について述べた定量法を用いた「イオン
交換Ｐ１」を除き、すべてのフラクションを測定するた
るめに用いられた。結果は、表１に示されている。プロ
テアーゼ１は粗製培養液上澄液の７．３ｌから精製さ
れ、精製係数は２．２−倍、収率は０．３％であった。
プロテアーゼ２は粗製上澄液から精製係数２８．９−
倍、収率３８．５％で精製された。表１中、精製係数は
粗製上澄液からの全プロテアーゼ活性に関して示されて
いる。
【００２２】カルス減成活性
足のカルスの懸濁液を次の如くして作り、これを微細に
磨砕したカルスと呼ぶことにする。足のカルスをガラス
ペトリ皿中でメスにより細断し、液体窒素中で乳鉢と乳
棒を用い磨砕し、金網（１ｍｍ網目）を通して篩い、グ
リッフイン ホモジナイザー（ＴＫＷ−３００−０５０
Ｎ，ガレンカンプ）を用いて水中に均一に分散させ、１
５分間５０００ｇで遠心分離する。これから得られる小
粒塊を凍結乾燥し、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、得られ
る微細に磨砕したカルスを−３０℃で貯蔵する。カルス
減成活性はこの足のカルスを基質として用い、液状試料
中において、またはＩＥＦ分析用ゲルに加えた試料中に
おいて測定された。カルス−アガロースは次の如くして
作られた。７００ｎｍにおける光学密度が０．６〜０．
７である微細に磨砕されたカルスの懸濁液が０．２Ｍ燐
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中に作られ、この懸
濁液１０ｍｌを６０℃に加熱、同じ緩衝液中の溶融した
（６０℃）２％（ｗ／ｖ）アガロースの等容積に加え、
８．４×１２．７ｃｍの微量滴定板面上に注いで固まら
せる。このアガロースにくぼみ（直径２．５ｍｍ）をつ
くり、その中へ各試験液の５μｌをピペットで計り入れ
る。これらの板は蛋白質分解活性の場合と同じように培
養される。培養が終了後、カルス減成活性は透明域によ
り示されるが、背景を暗くした明るい箱を用いると最も
よく観察できる。ＩＥＦゲル上にカルス減成を生ぜしめ
た蛋白質の位置はカゼインアガロースがカルスアガロー
スに置き換えられたことと、板にＴＣＡが注ぎかけられ
なかったこと以外は、蛋白質分解活性の場合と同じよう
にして測定された。
磨砕したカルスと呼ぶことにする。足のカルスをガラス
ペトリ皿中でメスにより細断し、液体窒素中で乳鉢と乳
棒を用い磨砕し、金網（１ｍｍ網目）を通して篩い、グ
リッフイン ホモジナイザー（ＴＫＷ−３００−０５０
Ｎ，ガレンカンプ）を用いて水中に均一に分散させ、１
５分間５０００ｇで遠心分離する。これから得られる小
粒塊を凍結乾燥し、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、得られ
る微細に磨砕したカルスを−３０℃で貯蔵する。カルス
減成活性はこの足のカルスを基質として用い、液状試料
中において、またはＩＥＦ分析用ゲルに加えた試料中に
おいて測定された。カルス−アガロースは次の如くして
作られた。７００ｎｍにおける光学密度が０．６〜０．
７である微細に磨砕されたカルスの懸濁液が０．２Ｍ燐
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中に作られ、この懸
濁液１０ｍｌを６０℃に加熱、同じ緩衝液中の溶融した
（６０℃）２％（ｗ／ｖ）アガロースの等容積に加え、
８．４×１２．７ｃｍの微量滴定板面上に注いで固まら
せる。このアガロースにくぼみ（直径２．５ｍｍ）をつ
くり、その中へ各試験液の５μｌをピペットで計り入れ
る。これらの板は蛋白質分解活性の場合と同じように培
養される。培養が終了後、カルス減成活性は透明域によ
り示されるが、背景を暗くした明るい箱を用いると最も
よく観察できる。ＩＥＦゲル上にカルス減成を生ぜしめ
た蛋白質の位置はカゼインアガロースがカルスアガロー
スに置き換えられたことと、板にＴＣＡが注ぎかけられ
なかったこと以外は、蛋白質分解活性の場合と同じよう
にして測定された。
【００２３】定量法
カルス減成活性の定量のためにも、付加的な方法がやは
り用いられた。これは次の如くにして行われた（その細
部の詳細については後記本文中適所に述べられてい
る）。７００ｎｍにおける光学密度が０．６〜０．７の
微細に磨砕されたカルス（上記）の懸濁液が０．０２％
（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有する緩衝液中に作ら
れた。１ｍｌの酵素溶液が分光光度計キュベット内で２
ｍｌの予熱されたカルス懸濁液（必要とされる温度下）
に加えられた。攪拌しつつ必要とされる温度下このＯＤ
７００を直ちに記録し、また１時間培養後にも記録す
る。カルス減成活性の１単位（Ｕ）をＯＤ７００が１時
間につき０．００１減少を起こすものと定義する。その
方法は、Ｋ．Ｔ．ホランドら（６）の論文中にも開示さ
れている。
り用いられた。これは次の如くにして行われた（その細
部の詳細については後記本文中適所に述べられてい
る）。７００ｎｍにおける光学密度が０．６〜０．７の
微細に磨砕されたカルス（上記）の懸濁液が０．０２％
（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有する緩衝液中に作ら
れた。１ｍｌの酵素溶液が分光光度計キュベット内で２
ｍｌの予熱されたカルス懸濁液（必要とされる温度下）
に加えられた。攪拌しつつ必要とされる温度下このＯＤ
７００を直ちに記録し、また１時間培養後にも記録す
る。カルス減成活性の１単位（Ｕ）をＯＤ７００が１時
間につき０．００１減少を起こすものと定義する。その
方法は、Ｋ．Ｔ．ホランドら（６）の論文中にも開示さ
れている。
【００２４】プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の等電
点（ｐＩ） プロテアーゼ１及び２の等電点（ｐＩ）は次の如くにし
て測定される。ポリアクリルアミドＩＥＦゲルがウイン
ターら（５）の方法に従って作られたが、ただしここで
は脱気されたゲル溶液にそれが型に注入される前に１０
μｌのＮ−Ｎ−Ｎ−Ｎテトラメチルエチレンジアミンが
添加されたこととキャリヤー両性電解質混合物が２．７
６ｍｌのファーマライト２．５〜５．０と０．２４ｍｌ
のアンフォリン５．０〜８．０を含有していたことが異
なっている。ファーマライト及びアンフォリンはファー
マシャ社から市販されている。電極溶液は０．１Ｍ燐酸
（陽極）及び０．１Ｍ水酸化ナトリウム（陰極）であっ
た。試料（２０μｌ）は紙製の用具を用いて添加し、ゲ
ルは３時間９Ｗ一定で操作された。ゲルには３組の試料
が負荷された。電気泳動の終了後、ゲルを３つの等しい
区分に切断し、その各区分が試料の一組分をすっかり含
有できるようにした。その一区分は蛋白質分解活性検出
のためのカゼインアガロースゲル上に載せ、もう一つの
区分はカルス減成活性検出のためのカルスアガロースゲ
ル上に載せ、後の残りの区分はウインターら（５）に記
載されているように、プロテイン検出のために固定し染
色した。各プロテアーゼの位置はカゼインアガロース上
の透明域の中心と陽極の位置との間の距離を測ることに
より測定された。各プロテアーゼのｐＩはその際ゲルｐ
Ｈ（表面ｐＨ電極を用いて測った）対陽極からの距離の
校正曲線を用いて求められた。プロテアーゼ１のｐＩは
４．６であり、プロテアーゼ２のｐＩは２．７であっ
た。プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２はともに蛋白質
分解性であり、またカルスを減成した。
点（ｐＩ） プロテアーゼ１及び２の等電点（ｐＩ）は次の如くにし
て測定される。ポリアクリルアミドＩＥＦゲルがウイン
ターら（５）の方法に従って作られたが、ただしここで
は脱気されたゲル溶液にそれが型に注入される前に１０
μｌのＮ−Ｎ−Ｎ−Ｎテトラメチルエチレンジアミンが
添加されたこととキャリヤー両性電解質混合物が２．７
６ｍｌのファーマライト２．５〜５．０と０．２４ｍｌ
のアンフォリン５．０〜８．０を含有していたことが異
なっている。ファーマライト及びアンフォリンはファー
マシャ社から市販されている。電極溶液は０．１Ｍ燐酸
（陽極）及び０．１Ｍ水酸化ナトリウム（陰極）であっ
た。試料（２０μｌ）は紙製の用具を用いて添加し、ゲ
ルは３時間９Ｗ一定で操作された。ゲルには３組の試料
が負荷された。電気泳動の終了後、ゲルを３つの等しい
区分に切断し、その各区分が試料の一組分をすっかり含
有できるようにした。その一区分は蛋白質分解活性検出
のためのカゼインアガロースゲル上に載せ、もう一つの
区分はカルス減成活性検出のためのカルスアガロースゲ
ル上に載せ、後の残りの区分はウインターら（５）に記
載されているように、プロテイン検出のために固定し染
色した。各プロテアーゼの位置はカゼインアガロース上
の透明域の中心と陽極の位置との間の距離を測ることに
より測定された。各プロテアーゼのｐＩはその際ゲルｐ
Ｈ（表面ｐＨ電極を用いて測った）対陽極からの距離の
校正曲線を用いて求められた。プロテアーゼ１のｐＩは
４．６であり、プロテアーゼ２のｐＩは２．７であっ
た。プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２はともに蛋白質
分解性であり、またカルスを減成した。
【００２５】プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の分子
量 プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の分子量は次の如く
にして決定される。プロテアーゼ１及び２の変性し低減
したポリペプチド分子量がレンムリ（２）の方法に従っ
てＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された。試料（１０μ
ｌ）を２分間６％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１０％（ｖ／
ｖ）メルカプトエタノールを含有する１０μｌ試料緩衝
液とともに煮沸した。その煮沸した試料８μｌをＬＫＢ
ミジェット電気泳動装置内で１２％（ｗ／ｖ）ポリアク
リルアミドゲル（０．０７５×５．５×８ｃｍ）上に負
荷した。そのゲルは製造業者の指定に従い、ゲルコード
（ピヤース社）で固定し銀染色された。各プロテアーゼ
の分子量はポリペプチドの位置対既知の標準ポリペプチ
ド分子量の校正曲線を用いて決定された。プロテアーゼ
１及び２のこのようにして得られた分子量はそれぞれ３
０．３と５０．０ｋＤａであった。
量 プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の分子量は次の如く
にして決定される。プロテアーゼ１及び２の変性し低減
したポリペプチド分子量がレンムリ（２）の方法に従っ
てＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された。試料（１０μ
ｌ）を２分間６％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１０％（ｖ／
ｖ）メルカプトエタノールを含有する１０μｌ試料緩衝
液とともに煮沸した。その煮沸した試料８μｌをＬＫＢ
ミジェット電気泳動装置内で１２％（ｗ／ｖ）ポリアク
リルアミドゲル（０．０７５×５．５×８ｃｍ）上に負
荷した。そのゲルは製造業者の指定に従い、ゲルコード
（ピヤース社）で固定し銀染色された。各プロテアーゼ
の分子量はポリペプチドの位置対既知の標準ポリペプチ
ド分子量の校正曲線を用いて決定された。プロテアーゼ
１及び２のこのようにして得られた分子量はそれぞれ３
０．３と５０．０ｋＤａであった。
【００２６】プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の最適
ｐＨ及び活性範囲 プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の最適ｐＨ及び活性
範囲は次の如く、また添付図面を参照して得られる。但
し、添付図面中図１はプロテアーゼ１の活性に対するｐ
Ｈの影響を示し、また図２はプロテアーゼ２の活性に対
するｐＨの影響を示す。プロテアーゼ１及びプロテアー
ゼ２の未知の割合の混合物であるミクロコッカス セダ
ンタリウス培養液からの上澄液を用いる予備実験が行わ
れ、それによって０．１５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素
ナトリウム緩衝液中ではｐＨ１０．０で最大の蛋白質分
解活性が得られることが分かった。精製されたプロテア
ーゼ１及び２はミレット（３）に記載されたプロテアー
ゼ定量法を用い、ｐＨ値が５．１〜１１．４での０．１
５Ｍ緩衝液範囲内で試験された。緩衝液中に１ｍｌの酵
素溶液と４ｍｌの２％（ｗ／ｖ）アゾカゼインを含有す
る反応混合物が２時間，３５℃で培養された。各反応混
合物のｐＨは３５℃で２時間培養後に測定された。時間
０と２時間培養後とに、２ｍｌの反応混合物が２ｍｌの
ＴＣＡ（１０％，ｗ／ｖ）に加えられた。ワットマンＮ
ｏ．１濾紙を通して濾過後、蛋白質分解活性により放出
されたＴＣＡに可溶性のアゾ−ペプチド類の濃度を４４
０ｎｍで分光光度法により測定した。酵素の含まれない
場合についても行われた。酵素活性の１単位は４４０ｎ
ｍでの吸光度を３５℃で１時間に０．００１増加せしめ
るような量であると定義した。もっと一般的には、酵素
活性の一単位は４４０ｎｍでの吸光度を一時間（その測
定時の温度の下）に０．００１増加せしめるような量で
あると定義される。これらの結果は図１及び２に示され
ている。プロテアーゼ１及び２はそれぞれ５．１〜１
０．９及び５．１〜１１．３の範囲で検出された。最大
活性は、プロテアーゼ１は０．１５Ｍトリス−ＨＣｌ緩
衝液中ｐＨ８．２、またプロテアーゼ２は０．２５Ｍ燐
酸塩緩衝液中ｐＨ１０．２で検出された。
ｐＨ及び活性範囲 プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２の最適ｐＨ及び活性
範囲は次の如く、また添付図面を参照して得られる。但
し、添付図面中図１はプロテアーゼ１の活性に対するｐ
Ｈの影響を示し、また図２はプロテアーゼ２の活性に対
するｐＨの影響を示す。プロテアーゼ１及びプロテアー
ゼ２の未知の割合の混合物であるミクロコッカス セダ
ンタリウス培養液からの上澄液を用いる予備実験が行わ
れ、それによって０．１５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素
ナトリウム緩衝液中ではｐＨ１０．０で最大の蛋白質分
解活性が得られることが分かった。精製されたプロテア
ーゼ１及び２はミレット（３）に記載されたプロテアー
ゼ定量法を用い、ｐＨ値が５．１〜１１．４での０．１
５Ｍ緩衝液範囲内で試験された。緩衝液中に１ｍｌの酵
素溶液と４ｍｌの２％（ｗ／ｖ）アゾカゼインを含有す
る反応混合物が２時間，３５℃で培養された。各反応混
合物のｐＨは３５℃で２時間培養後に測定された。時間
０と２時間培養後とに、２ｍｌの反応混合物が２ｍｌの
ＴＣＡ（１０％，ｗ／ｖ）に加えられた。ワットマンＮ
ｏ．１濾紙を通して濾過後、蛋白質分解活性により放出
されたＴＣＡに可溶性のアゾ−ペプチド類の濃度を４４
０ｎｍで分光光度法により測定した。酵素の含まれない
場合についても行われた。酵素活性の１単位は４４０ｎ
ｍでの吸光度を３５℃で１時間に０．００１増加せしめ
るような量であると定義した。もっと一般的には、酵素
活性の一単位は４４０ｎｍでの吸光度を一時間（その測
定時の温度の下）に０．００１増加せしめるような量で
あると定義される。これらの結果は図１及び２に示され
ている。プロテアーゼ１及び２はそれぞれ５．１〜１
０．９及び５．１〜１１．３の範囲で検出された。最大
活性は、プロテアーゼ１は０．１５Ｍトリス−ＨＣｌ緩
衝液中ｐＨ８．２、またプロテアーゼ２は０．２５Ｍ燐
酸塩緩衝液中ｐＨ１０．２で検出された。
【００２７】プロテアーゼ活性−最適温度
プロテアーゼ１及び２を定量するための最適温度が測定
された。定量分析方法がプロテアーゼ活性を測定するた
めに、下記の如く改変して用いられた。プロテアーゼ１
はｐＨを次のようにとって２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液中で行われた。ｐＨ 温度 ８．５ 室温 ８．２ ３５℃ ８．１ ４０℃ １．３６プロテアーゼ単位が２７分間種々の温度下に測
定系内で培養された。プロテアーゼ１の活性は２０〜６
０℃に検出され、４０℃が最適温度であった。プロテア
ーゼ２は次の如くｐＨをとり、１５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ中で行われた。ｐＨ 温度 １０．７５ 室温 １０．２ ３５℃ ９．９ ４６℃ ４．１プロテアーゼ単位が９分間種々の温度下に測定系
内で培養された。プロテアーゼ２の活性は２０〜５０℃
に検出され、４６℃が最適温度であった。これらの結果
は図３に示されている。
された。定量分析方法がプロテアーゼ活性を測定するた
めに、下記の如く改変して用いられた。プロテアーゼ１
はｐＨを次のようにとって２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液中で行われた。ｐＨ 温度 ８．５ 室温 ８．２ ３５℃ ８．１ ４０℃ １．３６プロテアーゼ単位が２７分間種々の温度下に測
定系内で培養された。プロテアーゼ１の活性は２０〜６
０℃に検出され、４０℃が最適温度であった。プロテア
ーゼ２は次の如くｐＨをとり、１５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ中で行われた。ｐＨ 温度 １０．７５ 室温 １０．２ ３５℃ ９．９ ４６℃ ４．１プロテアーゼ単位が９分間種々の温度下に測定系
内で培養された。プロテアーゼ２の活性は２０〜５０℃
に検出され、４６℃が最適温度であった。これらの結果
は図３に示されている。
【００２８】カルス減成活性−最適温度
予備実験によりプロアーゼ１および２は約７．６のｐＨ
で最高のカルス減成活性をもっていることが分かった。
それゆえ、プロテアーゼ１およびプロテアーゼ２のカル
ス減成活性を測定するための最適温度は定量分析法を用
いｐＨ７．６で測定された。プロテアーゼ１ （３プロテアーゼ単位）が種々の温度下
に１５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中で
培養された。カルス減成活性は２０〜６５℃に検出さ
れ、４０℃が最適であった。図４にその結果を示す。プロテアーゼ２ （３プロテアーゼ単位）が種々の温度下
に１５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中で
培養された。カルス減成活性は２０〜８０℃に検出され
５０℃が最適であった。図５にその結果を示す。
で最高のカルス減成活性をもっていることが分かった。
それゆえ、プロテアーゼ１およびプロテアーゼ２のカル
ス減成活性を測定するための最適温度は定量分析法を用
いｐＨ７．６で測定された。プロテアーゼ１ （３プロテアーゼ単位）が種々の温度下
に１５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中で
培養された。カルス減成活性は２０〜６５℃に検出さ
れ、４０℃が最適であった。図４にその結果を示す。プロテアーゼ２ （３プロテアーゼ単位）が種々の温度下
に１５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中で
培養された。カルス減成活性は２０〜８０℃に検出され
５０℃が最適であった。図５にその結果を示す。
【００２９】カルス減成活性−最適ｐＨ
プロテアーゼ１および２の活性に対する最適ｐＨはそれ
らの最適温度の下で測定された。図６および７に示した
如く１５０ｍＭ緩衝液を用い定量分析法が用いられた。プロテアーゼ１ （４．５プロテアーゼ単位）が４０℃で
測定された。カルス減成活性はトリス−ＨＣｌ緩衝液中
でｐＨ５．９〜８．０に検出され、ｐＨ７．１が最適で
あった。図６にその結果を示す。プロテアーゼ２ （５９プロテアーゼ単位）が５０℃で測
定された。カルス減成活性はｐＨ４．３〜１０．０に検
出され、ｐＨ４．９と７．５の２ケ所に活性のピークが
あった。最適活性は１００ｍＭＮａＣｌを含有するトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液中ｐＨ７．５で認められた。図７にそ
の結果を示す。 カルス減成活性のためのｐＨ測定はすべてその活性測定
の温度の下で行われた。
らの最適温度の下で測定された。図６および７に示した
如く１５０ｍＭ緩衝液を用い定量分析法が用いられた。プロテアーゼ１ （４．５プロテアーゼ単位）が４０℃で
測定された。カルス減成活性はトリス−ＨＣｌ緩衝液中
でｐＨ５．９〜８．０に検出され、ｐＨ７．１が最適で
あった。図６にその結果を示す。プロテアーゼ２ （５９プロテアーゼ単位）が５０℃で測
定された。カルス減成活性はｐＨ４．３〜１０．０に検
出され、ｐＨ４．９と７．５の２ケ所に活性のピークが
あった。最適活性は１００ｍＭＮａＣｌを含有するトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液中ｐＨ７．５で認められた。図７にそ
の結果を示す。 カルス減成活性のためのｐＨ測定はすべてその活性測定
の温度の下で行われた。
【００３０】プロテアーゼ １および２のその他の特性 プロテアーゼ活性に対するシステインの影響 プロテアーゼ１
が１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）中に１００ｍＭシステインの存在及び不存在
の場合１．２プロテアーゼＵｍｌ１−１の濃度において
１時間、４℃で培養された。１００ｍＭシステインとと
もに培養後のプロテアーゼ１の活性はシステイン不在の
場合の１０６％であった。プロテアーゼ２ が２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１０．７５）中に１００ｍＭシステインの存在および
不存在の場合３．０プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度にお
いて一時間、４℃で培養された。１００ｍＭシステイン
とともに培養後のプロテアーゼ２の活性はシステイン不
在の場合の１０５％であった。
Ｈ８．５）中に１００ｍＭシステインの存在及び不存在
の場合１．２プロテアーゼＵｍｌ１−１の濃度において
１時間、４℃で培養された。１００ｍＭシステインとと
もに培養後のプロテアーゼ１の活性はシステイン不在の
場合の１０６％であった。プロテアーゼ２ が２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１０．７５）中に１００ｍＭシステインの存在および
不存在の場合３．０プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度にお
いて一時間、４℃で培養された。１００ｍＭシステイン
とともに培養後のプロテアーゼ２の活性はシステイン不
在の場合の１０５％であった。
【００３１】プロテアーゼ活性に対するＥＤＴＡの影響 プロテアーゼ１
が１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）中に１０ｍＭＥＤＴＡの存在および不存在場
合０．７５プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度において１時
間、４℃で培養された。１０ｍＭＥＤＴＡとともに培養
後のプロテアーゼ１の活性はＥＤＴＡ不存在の場合の３
４％であった。プロテアーゼ２ が２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１０．７５）中に１０ｍＭＥＤＴＡの存在および不存
在の場合３．０プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度において
１時間、４℃で培養された。１０ｍＭＥＤＴＡとともに
培養後のプロテアーゼ２の活性はＥＤＴＡ不存在の場合
の１７％であった。
Ｈ８．５）中に１０ｍＭＥＤＴＡの存在および不存在場
合０．７５プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度において１時
間、４℃で培養された。１０ｍＭＥＤＴＡとともに培養
後のプロテアーゼ１の活性はＥＤＴＡ不存在の場合の３
４％であった。プロテアーゼ２ が２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１０．７５）中に１０ｍＭＥＤＴＡの存在および不存
在の場合３．０プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度において
１時間、４℃で培養された。１０ｍＭＥＤＴＡとともに
培養後のプロテアーゼ２の活性はＥＤＴＡ不存在の場合
の１７％であった。
【００３２】プロテアーゼ活性に対するＰＭＳＦの影響
プロテアーゼ１が１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）中に５ｍＭＰＭＳＦ（弗化フェニルメチルス
ルフォニル）の存在および不存在の場合１．２プロテア
ーゼＵｍｌ−１の濃度において１時間、４℃で培養され
た。５ｍＭＰＭＳＦの存在の下に培養後のプロテアーゼ
１の活性はＰＭＳＦ不存在の場合の０％であった。プロ
テアーゼ２が２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０．７５）中に５ｍＭＰＭＳＦの存在および不存在の場
合に３．１プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度において１時
間、４℃で培養された。５ｍＭＰＭＳＦの存在の下に培
養後のプロテアーゼ２の活性はＰＭＳＦ不存在の場合の
５８％であった。
Ｈ８．５）中に５ｍＭＰＭＳＦ（弗化フェニルメチルス
ルフォニル）の存在および不存在の場合１．２プロテア
ーゼＵｍｌ−１の濃度において１時間、４℃で培養され
た。５ｍＭＰＭＳＦの存在の下に培養後のプロテアーゼ
１の活性はＰＭＳＦ不存在の場合の０％であった。プロ
テアーゼ２が２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０．７５）中に５ｍＭＰＭＳＦの存在および不存在の場
合に３．１プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度において１時
間、４℃で培養された。５ｍＭＰＭＳＦの存在の下に培
養後のプロテアーゼ２の活性はＰＭＳＦ不存在の場合の
５８％であった。
【００３３】ＣａＣｌ２不存在の下でのプロテアーゼ１
および２の活性と安定性活性 ０および１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する１５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）の中に１．２プロテ
アーゼＵｍｌ−１の濃度においてプロテアーゼ１が培養
された。プロテアーゼ１の活性に対するＣａＣｌ２の影
響がＣａＣｌ２の添加直後（ｔ＝０）にプロテアーゼ活
性を測定することにより測定された。ＣａＣｌ２存在の
場合のプロテアーゼ１の活性はＣａＣｌ２不存在の場合
の１２９％であった。安定性 プロテアーゼ１の安定性に対するＣａＣｌ２の影響を調
べるためにプロテアーゼ活性が１０ｍＭＣａＣｌ２とと
もに３７℃で１時間培養後測定された。ＣａＣｌ２の存
在下培養後のプロテアーゼ１の活性はｔ＝０の場合の１
１４％であった。しかしＣａＣｌ２不存在の場合の培養
の後ではその活性はｔ＝０の場合の１９％であった。そ
れゆえ１０ｍＭのＣａＣｌ２は３７℃においてプロテア
ーゼ１の活性および安定性を増加した。
および２の活性と安定性活性 ０および１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する１５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）の中に１．２プロテ
アーゼＵｍｌ−１の濃度においてプロテアーゼ１が培養
された。プロテアーゼ１の活性に対するＣａＣｌ２の影
響がＣａＣｌ２の添加直後（ｔ＝０）にプロテアーゼ活
性を測定することにより測定された。ＣａＣｌ２存在の
場合のプロテアーゼ１の活性はＣａＣｌ２不存在の場合
の１２９％であった。安定性 プロテアーゼ１の安定性に対するＣａＣｌ２の影響を調
べるためにプロテアーゼ活性が１０ｍＭＣａＣｌ２とと
もに３７℃で１時間培養後測定された。ＣａＣｌ２の存
在下培養後のプロテアーゼ１の活性はｔ＝０の場合の１
１４％であった。しかしＣａＣｌ２不存在の場合の培養
の後ではその活性はｔ＝０の場合の１９％であった。そ
れゆえ１０ｍＭのＣａＣｌ２は３７℃においてプロテア
ーゼ１の活性および安定性を増加した。
【００３４】プロテアーゼ２
プロテアーゼ２の安定性は増大しているので１０ｍＭＣ
ａＣｌ２により安定化されるのか否かを明らかにするた
めには酵素を６０℃で培養することが必要であった。プ
ロテアーゼ２が種々のｐＨ値の下で、ＣａＣｌ２は０お
よび１０ｍＭを含有し、時間は４時間までとして緩衝液
中６３プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度で培養された。緩
衝液は下記の如くであり、またｐＨは室温で測定され
た。ｐＨ 緩衝液（３０ｍＭ） ５ 酢酸ナトリウム ６ ＭＥＳ ７〜９ トリス−ＨＣｌ プロテアーゼ活性は１０ｍＭＣａＣｌ２の添加直後およ
びその後の種々の時間に測定された。これらの結果は図
８に示されている。１ｍＭのＣａＣｌ２の存在はｔ＝０
でｐＨ６または７の場合プロテアーゼ２の活性を昂進し
なかった。しかしｔ＝０でｐＨ５および８で活性は１ｍ
ＭＣａＣｌ２により昂進され、ｐＨ９では僅かながら抑
制された。ＣａＣｌ２不存在の場合にはｐＨ８でプロテ
アーゼ２の安定性は最大（ｔ＝０の場合の２８％）であ
った。ＣａＣｌ２存在の場合にはすべてのテストされた
ｐＨ値（５〜９）で安定であり、ｐＨ６〜９の間で活性
が明らかに増大した。
ａＣｌ２により安定化されるのか否かを明らかにするた
めには酵素を６０℃で培養することが必要であった。プ
ロテアーゼ２が種々のｐＨ値の下で、ＣａＣｌ２は０お
よび１０ｍＭを含有し、時間は４時間までとして緩衝液
中６３プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度で培養された。緩
衝液は下記の如くであり、またｐＨは室温で測定され
た。ｐＨ 緩衝液（３０ｍＭ） ５ 酢酸ナトリウム ６ ＭＥＳ ７〜９ トリス−ＨＣｌ プロテアーゼ活性は１０ｍＭＣａＣｌ２の添加直後およ
びその後の種々の時間に測定された。これらの結果は図
８に示されている。１ｍＭのＣａＣｌ２の存在はｔ＝０
でｐＨ６または７の場合プロテアーゼ２の活性を昂進し
なかった。しかしｔ＝０でｐＨ５および８で活性は１ｍ
ＭＣａＣｌ２により昂進され、ｐＨ９では僅かながら抑
制された。ＣａＣｌ２不存在の場合にはｐＨ８でプロテ
アーゼ２の安定性は最大（ｔ＝０の場合の２８％）であ
った。ＣａＣｌ２存在の場合にはすべてのテストされた
ｐＨ値（５〜９）で安定であり、ｐＨ６〜９の間で活性
が明らかに増大した。
【００３５】種々の温度におけるプロテアーゼ１および
２の安定性 プロテアーゼ１および２を種々のｐＨで３０ｍＭ緩衝液
中で培養し、時間に間隔をおいてプロテアーゼ活性が測
定された。緩衝液は下記の如くであり温度は室温であ
る。ｐＨ 緩衝液 ５．０ 酢酸ナトリウム ５．９ ＭＥＳ ６．９〜８．７ トリス−ＨＣｌ ９．８ 炭酸塩−重炭酸塩 １０．７ 燐酸ナトリウム 緩衝液はすべて０．０５％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウ
ムを含有した。貯蔵緩衝液中プロテアーゼ１は１．０プ
ロテアーゼＵｍｌ−１、またプロテアーゼ２は１５．８
プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度で培養された。プロテアーゼ１ 図９にその結果を示す。プロテアーゼ
１の活性はｐＨにより著しく左右された。ｐＨ５および
６では１４日後に原活性のほぼ８０％が残留した。ｐＨ
が高くなると安定性が減少し、ｐＨ１０．７で１４日後
には原活性の５％が残留した。プロテアーゼ２ 図１０にその結果を示す。プロテアー
ゼ２はプロテアーゼ１よりも安定である。この酵素は１
５週間後に、ｐＨ７以下および９以下で不安定であっ
た。ｐＨ７では１５週間後にも活性が全然失われなかっ
た。常温 プロテアーゼ１ 図１１にその結果を示す。プロテアー
ゼ１はｐＨ６の場合以外あまり安定ではなく、ｐＨ６の
場合には８日後原活性の４％が残留した。プロテアーゼ２ 図１２にその結果を示す。プロテアー
ゼ２はプロテアーゼ１よりも安定であり、ｐＨ６ないし
１０の間で最大の安定性が認められ、７日後原活性の５
０％が残留した。
２の安定性 プロテアーゼ１および２を種々のｐＨで３０ｍＭ緩衝液
中で培養し、時間に間隔をおいてプロテアーゼ活性が測
定された。緩衝液は下記の如くであり温度は室温であ
る。ｐＨ 緩衝液 ５．０ 酢酸ナトリウム ５．９ ＭＥＳ ６．９〜８．７ トリス−ＨＣｌ ９．８ 炭酸塩−重炭酸塩 １０．７ 燐酸ナトリウム 緩衝液はすべて０．０５％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウ
ムを含有した。貯蔵緩衝液中プロテアーゼ１は１．０プ
ロテアーゼＵｍｌ−１、またプロテアーゼ２は１５．８
プロテアーゼＵｍｌ−１の濃度で培養された。プロテアーゼ１ 図９にその結果を示す。プロテアーゼ
１の活性はｐＨにより著しく左右された。ｐＨ５および
６では１４日後に原活性のほぼ８０％が残留した。ｐＨ
が高くなると安定性が減少し、ｐＨ１０．７で１４日後
には原活性の５％が残留した。プロテアーゼ２ 図１０にその結果を示す。プロテアー
ゼ２はプロテアーゼ１よりも安定である。この酵素は１
５週間後に、ｐＨ７以下および９以下で不安定であっ
た。ｐＨ７では１５週間後にも活性が全然失われなかっ
た。常温 プロテアーゼ１ 図１１にその結果を示す。プロテアー
ゼ１はｐＨ６の場合以外あまり安定ではなく、ｐＨ６の
場合には８日後原活性の４％が残留した。プロテアーゼ２ 図１２にその結果を示す。プロテアー
ゼ２はプロテアーゼ１よりも安定であり、ｐＨ６ないし
１０の間で最大の安定性が認められ、７日後原活性の５
０％が残留した。
【００３６】プロテアーゼ１およびプロテアーゼ２のカ
ルス減成活性に対するＮａＣｌの影響 カルス減成定量法を用いてプロテアーゼ１および２が定
量された。プロテアーゼ１ （４．５プロテアーゼ単位）が種々の濃
度のＮａＣｌ（０〜１．６Ｍ）を含有する１５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）中で４０℃培養された。図
１３にその結果を示す。最高のカルス減成活性が１００
ｍＭ濃度のＮａＣｌの場合に認められ、それはＮａＣｌ
不存在の場合の活性の１．７倍であった。プロテアーゼ２ （８８．２プロテアーゼ単位）が種々の
濃度のＮａＣｌ（０〜１．６Ｍ）含有する１５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で５０℃で培養された。
図１３にその結果を示す。最高のカルス減成活性が１．
６Ｍ濃度のＮａＣｌの場合に認められ、それはＮａＣｌ
不在の場合の活性の４．５倍であった。それゆえプロテ
アーゼ２のカルス減成活性はプロテアーゼ１のそれより
もＮａＣｌあるいはイオン強度によりずっと著しく左右
されることになる。
ルス減成活性に対するＮａＣｌの影響 カルス減成定量法を用いてプロテアーゼ１および２が定
量された。プロテアーゼ１ （４．５プロテアーゼ単位）が種々の濃
度のＮａＣｌ（０〜１．６Ｍ）を含有する１５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）中で４０℃培養された。図
１３にその結果を示す。最高のカルス減成活性が１００
ｍＭ濃度のＮａＣｌの場合に認められ、それはＮａＣｌ
不存在の場合の活性の１．７倍であった。プロテアーゼ２ （８８．２プロテアーゼ単位）が種々の
濃度のＮａＣｌ（０〜１．６Ｍ）含有する１５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で５０℃で培養された。
図１３にその結果を示す。最高のカルス減成活性が１．
６Ｍ濃度のＮａＣｌの場合に認められ、それはＮａＣｌ
不在の場合の活性の４．５倍であった。それゆえプロテ
アーゼ２のカルス減成活性はプロテアーゼ１のそれより
もＮａＣｌあるいはイオン強度によりずっと著しく左右
されることになる。
【００３７】プロテアーゼ１および２のカルス減成活性
に対するイオン強度の影響 イオン強度そしてまたはイオン種がカルス減成活性を昂
進させうるものかどうかを明らかにするために種々の化
合物の影響を調べた。ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｃ
ｓＣｌ（イオン強度０．１Ｍ），Ｎａ２ＳＯ４，ＭｇＣ
ｌ２，ＣａＣｌ２（イオン強度０．３Ｍ）を含有する緩
衝液および全然添加塩のない緩衝液を用いてカルス減成
の定量分析が行われた。１０ｍＭＥＤＴＡの存在の下で
も、ＥＤＴＡはカルス気質中にある２価のイオンとキレ
ート化合物をつくるので調べてみた。プロテアーゼ１ （３プロテアーゼ単位）が必要とする化
合物を含有する１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
１）中で４０℃で培養された。図１４にその結果を示
す。一価イオン類（イオン強度０．１ｍＭ）の添加はカ
ルス減成活性に対してほとんど無影響であった。０．３
Ｍのイオン強度では活性が増大し、しかもこれは特定の
イオン種に依存するものではなかった。カルス減成活性
は１０ｍＭＥＤＴＡが存在すると減少したからこのこと
は基質中にある少量の２価イオンがプロテアーゼ１の活
性を増大していたことを示す。プロテアーゼ２ （８８．２プロテアーゼ単位）が必要と
する化合物を含有する１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）中で５０℃で培養された。図１５にその結果を
示す。一価イオン類（イオン強度０．１Ｍ）の添加はカ
ルス減成活性を著しくし増大し、ＮａＳＯ４（イオン強
度０．３Ｍ）では活性がさらに増大した。ＭｇＣｌ２お
よびＣａＣｌ２（イオン強度０．３Ｍ）の存在ではさら
に強力な活性が認められた。１０ｍＭＥＤＴＡの存在で
は活性が全然認められなかった。それゆえプロテアーゼ
２はその環境のイオン強度により、また二価のイオン類
により、プロテアーゼ１よりもずっと著しく影響をうけ
ることになる。
に対するイオン強度の影響 イオン強度そしてまたはイオン種がカルス減成活性を昂
進させうるものかどうかを明らかにするために種々の化
合物の影響を調べた。ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｃ
ｓＣｌ（イオン強度０．１Ｍ），Ｎａ２ＳＯ４，ＭｇＣ
ｌ２，ＣａＣｌ２（イオン強度０．３Ｍ）を含有する緩
衝液および全然添加塩のない緩衝液を用いてカルス減成
の定量分析が行われた。１０ｍＭＥＤＴＡの存在の下で
も、ＥＤＴＡはカルス気質中にある２価のイオンとキレ
ート化合物をつくるので調べてみた。プロテアーゼ１ （３プロテアーゼ単位）が必要とする化
合物を含有する１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
１）中で４０℃で培養された。図１４にその結果を示
す。一価イオン類（イオン強度０．１ｍＭ）の添加はカ
ルス減成活性に対してほとんど無影響であった。０．３
Ｍのイオン強度では活性が増大し、しかもこれは特定の
イオン種に依存するものではなかった。カルス減成活性
は１０ｍＭＥＤＴＡが存在すると減少したからこのこと
は基質中にある少量の２価イオンがプロテアーゼ１の活
性を増大していたことを示す。プロテアーゼ２ （８８．２プロテアーゼ単位）が必要と
する化合物を含有する１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）中で５０℃で培養された。図１５にその結果を
示す。一価イオン類（イオン強度０．１Ｍ）の添加はカ
ルス減成活性を著しくし増大し、ＮａＳＯ４（イオン強
度０．３Ｍ）では活性がさらに増大した。ＭｇＣｌ２お
よびＣａＣｌ２（イオン強度０．３Ｍ）の存在ではさら
に強力な活性が認められた。１０ｍＭＥＤＴＡの存在で
は活性が全然認められなかった。それゆえプロテアーゼ
２はその環境のイオン強度により、また二価のイオン類
により、プロテアーゼ１よりもずっと著しく影響をうけ
ることになる。
【００３８】プロテアーゼ１および２のカルス減成活性
に対するＭｇＣｌ２の影響 プロテアーゼ１および２のカルス減成活性が定量法を用
いて測定された。プロテアーゼ１ （４．５プロテアーゼ単位）が種々の濃
度のＭｇＣｌ２（０〜３５ｍＭ）を含有する１５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）中で４０℃で培養され
た。プロテアーゼ１は又４５ｍＭＮａＣｌを含有する緩
衝液中でも定量された。図１６にこれらの結果を示す。
ＭｇＣｌ２を含有しない対照に比べて５ｍＭのＭｇＣｌ
２の存在でカルス減成活性が僅かに増大した。４５ｍＭ
ＮａＣｌが存在する場合の活性は１５ｍＭＭｇＣｌ２の
存在の場合（図示されていない）の活性と同量であっ
た。プロテアーゼ２ （３１．５プロテアーゼ単位）が種々の
濃度のＭｇＣｌ２（０〜１００ｍＭ）を含有する１５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で５０℃で培養さ
れた。プロテアーゼ２は又６０ｍＭＮａＣｌを含有する
緩衝液中でも定量された。図１７にこれらの結果を示
す。プロテアーゼ２のカルス減成活性はＭｇＣｌ２の濃
度増加ととも増大した。ＭｇＣｌ２存在下の活性はこれ
と量価のイオン強度のＮａＣｌ存在下の活性の４．７倍
であった。プロテアーゼ２のカルス減成活性はプロテア
ーゼ１のそれと対比して高イオン強度およびＭｇＣｌ２
により著しく増強される。
に対するＭｇＣｌ２の影響 プロテアーゼ１および２のカルス減成活性が定量法を用
いて測定された。プロテアーゼ１ （４．５プロテアーゼ単位）が種々の濃
度のＭｇＣｌ２（０〜３５ｍＭ）を含有する１５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）中で４０℃で培養され
た。プロテアーゼ１は又４５ｍＭＮａＣｌを含有する緩
衝液中でも定量された。図１６にこれらの結果を示す。
ＭｇＣｌ２を含有しない対照に比べて５ｍＭのＭｇＣｌ
２の存在でカルス減成活性が僅かに増大した。４５ｍＭ
ＮａＣｌが存在する場合の活性は１５ｍＭＭｇＣｌ２の
存在の場合（図示されていない）の活性と同量であっ
た。プロテアーゼ２ （３１．５プロテアーゼ単位）が種々の
濃度のＭｇＣｌ２（０〜１００ｍＭ）を含有する１５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で５０℃で培養さ
れた。プロテアーゼ２は又６０ｍＭＮａＣｌを含有する
緩衝液中でも定量された。図１７にこれらの結果を示
す。プロテアーゼ２のカルス減成活性はＭｇＣｌ２の濃
度増加ととも増大した。ＭｇＣｌ２存在下の活性はこれ
と量価のイオン強度のＮａＣｌ存在下の活性の４．７倍
であった。プロテアーゼ２のカルス減成活性はプロテア
ーゼ１のそれと対比して高イオン強度およびＭｇＣｌ２
により著しく増強される。
【００３９】ケラチナーゼ活性の立証 微細に磨砕されたカルスからケラチンの抽出
微細に磨砕されたカルス（０．４ｇ）を５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、６Ｍ尿素および２％（ｖ／
ｖ）β−メルカプトエタノールよりなる２５ｍｌの抽出
用緩衝液に加えた。その懸濁液をウルトラ−トウラック
スホモジナイザー（ＴＰ１８／１０、ヤンケ・アンド・
クンケル社）を使用し、２０時間、４℃で攪拌するその
前後に、２分間フルスピードで均一分散させた。この懸
濁液を４℃で３０分間、５０，０００ｇで遠心分離し、
えられた上澄液を２４時間にわたって４ｌのＣＡＳＣ緩
衝液（０．１Ｍクエン酸でｐＨを２．６５に調節した
０．１Ｍクエン酸ナトリウム）に対して三回透析した。
透析された液体を前と同じく遠心分離し、ケラチンを含
有するその上澄液を別のの遠心分離管に移し、１ＭＮａ
ＯＨでｐＨを４．０に調節した。このようにして得た懸
濁液を２分間、４，０００ｇで遠心分離した。このケラ
チン含有水粒塊を１ｍｌのＣＡＳＬ緩衝液中にもう一度
懸濁し、ｐＨを１ＭＮａＯＨで４．０に調節した。この
懸濁液を遠心分離した（４，０００ｇ、２分間）。その
少粒塊を１ｍｌのＣＡＳＣ緩衝液中に懸濁した。（ｐＨ
を４．０に調節して懸濁液を遠心分離した（４，０００
ｇ、２分間）。その小粒塊を１ｍｌのＣＡＳＣ緩衝液中
に再び懸濁し、それをいくつかの部分に分けたケラチン
溶液として−２０℃で貯蔵した。ケラチンの濃度は乾燥
重量の測定によりほぼ７ｍｇｍｌ−１であった。
−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、６Ｍ尿素および２％（ｖ／
ｖ）β−メルカプトエタノールよりなる２５ｍｌの抽出
用緩衝液に加えた。その懸濁液をウルトラ−トウラック
スホモジナイザー（ＴＰ１８／１０、ヤンケ・アンド・
クンケル社）を使用し、２０時間、４℃で攪拌するその
前後に、２分間フルスピードで均一分散させた。この懸
濁液を４℃で３０分間、５０，０００ｇで遠心分離し、
えられた上澄液を２４時間にわたって４ｌのＣＡＳＣ緩
衝液（０．１Ｍクエン酸でｐＨを２．６５に調節した
０．１Ｍクエン酸ナトリウム）に対して三回透析した。
透析された液体を前と同じく遠心分離し、ケラチンを含
有するその上澄液を別のの遠心分離管に移し、１ＭＮａ
ＯＨでｐＨを４．０に調節した。このようにして得た懸
濁液を２分間、４，０００ｇで遠心分離した。このケラ
チン含有水粒塊を１ｍｌのＣＡＳＬ緩衝液中にもう一度
懸濁し、ｐＨを１ＭＮａＯＨで４．０に調節した。この
懸濁液を遠心分離した（４，０００ｇ、２分間）。その
少粒塊を１ｍｌのＣＡＳＣ緩衝液中に懸濁した。（ｐＨ
を４．０に調節して懸濁液を遠心分離した（４，０００
ｇ、２分間）。その小粒塊を１ｍｌのＣＡＳＣ緩衝液中
に再び懸濁し、それをいくつかの部分に分けたケラチン
溶液として−２０℃で貯蔵した。ケラチンの濃度は乾燥
重量の測定によりほぼ７ｍｇｍｌ−１であった。
【００４０】プロテアーゼ１と２および粗製アミコン残
留液によるケラチン減成 ＮａＯＨ（２５μｌ、０．５Ｍ）と５０μｌトリス−Ｈ
Ｃｌ（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）を５０μｌのケラチン溶
液に加え、そのｐＨを８に調節した。この調節したケラ
チン溶液とともに１．５時間、４０℃で２５μｌの濃縮
粗製アミコン残留液（前記方法で得られたような）また
はプロテアーゼ１（２．４プロテアーゼ単位）が培養さ
れた。プロテアーゼ２（３．０プロテアーゼ単位）が１
００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中でＮからＮ／
１０２４（倍増し希釈）に希釈された。各希釈液の２５
μｌが１０分間、４８℃で調節されたケラチン溶液とと
もに培養された。培養の末期において２倍強度のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ負荷の緩衝液（１５０μｌ）が各反応混合液
に加えられた。これらの試料は２分間煮沸され、各試料
の２μｌがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えられた。これら
の結果は図１８ａおよび１８ｂに示されている。高分子
質量のケラチンポリペプチド（４５〜６６ｋＤａ）がプ
ロテアーゼ１およびプロテアーゼ２により、また粗製ア
ミコン残留液中の酵素により減成されたことは、これら
の酵素と共に培養された後に分子質量の小さな減成生成
物（＞３６ｋＤａ）が存在していることより示されてい
る。このことはプロテアーゼ１もプロテアーゼ２も共に
ケラチナーゼ活性をもつということである。
留液によるケラチン減成 ＮａＯＨ（２５μｌ、０．５Ｍ）と５０μｌトリス−Ｈ
Ｃｌ（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）を５０μｌのケラチン溶
液に加え、そのｐＨを８に調節した。この調節したケラ
チン溶液とともに１．５時間、４０℃で２５μｌの濃縮
粗製アミコン残留液（前記方法で得られたような）また
はプロテアーゼ１（２．４プロテアーゼ単位）が培養さ
れた。プロテアーゼ２（３．０プロテアーゼ単位）が１
００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中でＮからＮ／
１０２４（倍増し希釈）に希釈された。各希釈液の２５
μｌが１０分間、４８℃で調節されたケラチン溶液とと
もに培養された。培養の末期において２倍強度のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ負荷の緩衝液（１５０μｌ）が各反応混合液
に加えられた。これらの試料は２分間煮沸され、各試料
の２μｌがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えられた。これら
の結果は図１８ａおよび１８ｂに示されている。高分子
質量のケラチンポリペプチド（４５〜６６ｋＤａ）がプ
ロテアーゼ１およびプロテアーゼ２により、また粗製ア
ミコン残留液中の酵素により減成されたことは、これら
の酵素と共に培養された後に分子質量の小さな減成生成
物（＞３６ｋＤａ）が存在していることより示されてい
る。このことはプロテアーゼ１もプロテアーゼ２も共に
ケラチナーゼ活性をもつということである。
【００４１】他の基質に対する活性の立証 幼鶏の羽毛
幼鶏の綿羽を蒸留水で３回洗浄した。粗製アミコン残留
液を凍結乾燥し、これを１００，０００プロテア−ゼＵ
ｍｌ−１の濃度で０．０５％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリ
ウムを含有する１５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中に入
れ、元の液状に戻した。２００μｌのこの液を５０℃で
そのままの綿羽とともに培養した。１８時間後にはこの
綿羽の羽枝が全部羽軸から離脱した。コラゲナーゼ活性 アガロース（０．３ｇ）を５０ｍｌのトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ）中に溶解し、５０℃に
冷却した。３．５％（ｗ／ｖ）のコラーゲンを含有する
アガロースの１ｍｌずつを１．５ × １．５ｃｍの型
の中へ注入して固まらせた。粗製アミコン残留液（上に
得られたような）を凍結乾燥し、これを１５０ｍｌトス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に入れて元の液状に戻し、そ
の１０μｌ（５１４プロテアーゼ単位）をコラーゲンゲ
ルの表面に加えた。１５０ｍＭトリス−Ｈｃ１（ｐＨ
７．５）を含有する対照試料をもう一つ別のゲルに加え
た。これらのゲルは３７℃で培養された。本発明のプロ
テアーゼ含有およびそれらの製薬上問題のない調合物
は、天然蛋白質性物質を減成するための薬剤として、特
に医療の目的に使用することができる。本発明のプロテ
アーゼ含有組成物およびそれらの製薬上問題のない調合
物は、既述の如く皮膚から得られたヒトのカルスを試験
管内で減成しうる能力を持っており、生体でのたとえば
足にできる鶏眼やカルスを治療する減成剤として使用す
ることができる。本発明の組成物は好ましくは溶液、ク
リーム、軟膏、軟膏棒、ゲル、粉末または粘着性膏薬の
ような局所塗布用の製剤の形になっている。このような
局所用組成物は坑生物質または殺菌剤、ならびにこのよ
うな組成物に対する従来慣用の添加物のような他の活性
成分を含有していてもよい。本発明のプロテアーゼ類お
よびそれらの調合物はまた、蛋白質性物質を減成または
消化すること、蛋白質性原料物質を変性すること、ある
いは有益な蛋白質減成生成物を製造することが望まれる
ような他の応用の場合にも使用することができる。この
ような応用例としてはコンタクトレンズをも含め蛋白質
性材質の表面の清浄化；織物類などの清浄化；食品加
工；および獣皮類の脱毛がある。
液を凍結乾燥し、これを１００，０００プロテア−ゼＵ
ｍｌ−１の濃度で０．０５％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリ
ウムを含有する１５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中に入
れ、元の液状に戻した。２００μｌのこの液を５０℃で
そのままの綿羽とともに培養した。１８時間後にはこの
綿羽の羽枝が全部羽軸から離脱した。コラゲナーゼ活性 アガロース（０．３ｇ）を５０ｍｌのトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ）中に溶解し、５０℃に
冷却した。３．５％（ｗ／ｖ）のコラーゲンを含有する
アガロースの１ｍｌずつを１．５ × １．５ｃｍの型
の中へ注入して固まらせた。粗製アミコン残留液（上に
得られたような）を凍結乾燥し、これを１５０ｍｌトス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に入れて元の液状に戻し、そ
の１０μｌ（５１４プロテアーゼ単位）をコラーゲンゲ
ルの表面に加えた。１５０ｍＭトリス−Ｈｃ１（ｐＨ
７．５）を含有する対照試料をもう一つ別のゲルに加え
た。これらのゲルは３７℃で培養された。本発明のプロ
テアーゼ含有およびそれらの製薬上問題のない調合物
は、天然蛋白質性物質を減成するための薬剤として、特
に医療の目的に使用することができる。本発明のプロテ
アーゼ含有組成物およびそれらの製薬上問題のない調合
物は、既述の如く皮膚から得られたヒトのカルスを試験
管内で減成しうる能力を持っており、生体でのたとえば
足にできる鶏眼やカルスを治療する減成剤として使用す
ることができる。本発明の組成物は好ましくは溶液、ク
リーム、軟膏、軟膏棒、ゲル、粉末または粘着性膏薬の
ような局所塗布用の製剤の形になっている。このような
局所用組成物は坑生物質または殺菌剤、ならびにこのよ
うな組成物に対する従来慣用の添加物のような他の活性
成分を含有していてもよい。本発明のプロテアーゼ類お
よびそれらの調合物はまた、蛋白質性物質を減成または
消化すること、蛋白質性原料物質を変性すること、ある
いは有益な蛋白質減成生成物を製造することが望まれる
ような他の応用の場合にも使用することができる。この
ような応用例としてはコンタクトレンズをも含め蛋白質
性材質の表面の清浄化；織物類などの清浄化；食品加
工；および獣皮類の脱毛がある。
【００４２】参考文献
１．クルース、トーナベン、およびシュライフェル（Ｋ
ｌｏｏｓ，Ｗ．Ｅ．，Ｔｏｒｎａｂｅｎｅ，Ｔ．＆Ｇ．
Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．）（１９７４），インタ
ーナショナル ジャーナル オブ システマテイック
バクテリオロジイ２４， ７９〜１０１。 ２．レンムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．）（１９７
０）”バクテリアオファージＴ４の頭の組立て時構造蛋
白質の開裂”ネーチャー ２２７，６８０〜６８５。 ３．ミレット（Ｍｉｌｌｅｔ，Ｊ．）（１９７０）”胞
子形成時バチルススブティルスマールブルグ株により排
泄されたプロテイナーゼの特性解析”ジャーナルオブ
アプライド バクテリオロジィ ３３，２０７〜２１
９。 ４．シュライフェル、クルーおよびコカー（Ｓｃｈｌｅ
ｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｋｌｏｏｓ，Ｗ．Ｅ．＆ Ｋｏｃ
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ス属”「バクテリアの棲み場、分離および同完に関する
便覧」第２巻、１５３９〜１５４７。スタール，ストル
プ，トルーパー，バーロースおよびシュレーゲル（Ｓｔ
ａｒｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｔｏｌｐ，Ｈ．，Ｔｒｕｐｅｒ，
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Ｈ．Ｇ．）編、ニューヨーク：シュプリンゲル−フェア
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析のための電気集束”ＬＫＢ アプリケーション ノー
ト ２５０。 ６．ホランダら（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａ
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性検出のための定性および定量的試験法”レターズイン
アプライド ミクロバイオロジィ１１，２２４〜２２
７。
ｌｏｏｓ，Ｗ．Ｅ．，Ｔｏｒｎａｂｅｎｅ，Ｔ．＆Ｇ．
Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．）（１９７４），インタ
ーナショナル ジャーナル オブ システマテイック
バクテリオロジイ２４， ７９〜１０１。 ２．レンムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．）（１９７
０）”バクテリアオファージＴ４の頭の組立て時構造蛋
白質の開裂”ネーチャー ２２７，６８０〜６８５。 ３．ミレット（Ｍｉｌｌｅｔ，Ｊ．）（１９７０）”胞
子形成時バチルススブティルスマールブルグ株により排
泄されたプロテイナーゼの特性解析”ジャーナルオブ
アプライド バクテリオロジィ ３３，２０７〜２１
９。 ４．シュライフェル、クルーおよびコカー（Ｓｃｈｌｅ
ｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｋｌｏｏｓ，Ｗ．Ｅ．＆ Ｋｏｃ
ｕｒ，Ｍ．）（１９８１）”原核生物中のミクロコッカ
ス属”「バクテリアの棲み場、分離および同完に関する
便覧」第２巻、１５３９〜１５４７。スタール，ストル
プ，トルーパー，バーロースおよびシュレーゲル（Ｓｔ
ａｒｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｔｏｌｐ，Ｈ．，Ｔｒｕｐｅｒ，
Ｈ．Ｇ．，Ｂａｌｏｗｓ，Ａ．＆ Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，
Ｈ．Ｇ．）編、ニューヨーク：シュプリンゲル−フェア
ラーク。 ５．ウインターおよびアンデルソン（Ｗｉｎｔｅｒ，
Ａ．Ｅｋ．Ｋ．＆ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．−Ｂ．）
（１９７７），”ポリアクリルアミドゲルの薄層内の分
析のための電気集束”ＬＫＢ アプリケーション ノー
ト ２５０。 ６．ホランダら（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ．）（１９９０）。”バクテリヤによるカルス減成活
性検出のための定性および定量的試験法”レターズイン
アプライド ミクロバイオロジィ１１，２２４〜２２
７。
【図１】プロテアーゼ１のプロテアーゼ活性に対すＨの
影響を示す。
影響を示す。
【図２】プロテアーゼ２のプロテアーゼ活性に対すＨの
影響を示す。
影響を示す。
【図３】プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２に対する温
度最適条件曲線を示す。
度最適条件曲線を示す。
【図４】プロテアーゼ１のカルス減成に対する温度の影
示す。
示す。
【図５】プロテアーゼ２のカルス減成に対する温度の影
示す。
示す。
【図６】プロテアーゼ１のカルス減成に対するｐＨの影
示す。
示す。
【図７】プロテアーゼ２のカルス減成に対するｐＨの影
示す。
示す。
【図８】プロテアーゼ２の安定性に対する塩化カルシウ
ムの影響を示す。
ムの影響を示す。
【図９】プロテアーゼ１の４℃におけるｐＨ安定性を示
【図１０】プロテアーゼ２の４℃におけるｐＨ安定性を
示
示
【図１１】プロテアーゼ１の常温におけるｐＨ安定性を
示
示
【図１２】プロテアーゼ２の常温におけるｐＨ安定性を
示
示
【図１３】プロテアーゼ１及びプロテアーゼ２のカルス
減成活性に対するＮａＣｌの影示す。
減成活性に対するＮａＣｌの影示す。
【図１４】プロテアーゼ１のカルス減成活性に対するイ
オ度及びイオン種の影響を示す。
オ度及びイオン種の影響を示す。
【図１５】プロテアーゼ２のカルス減成活性に対するイ
オ度及びイオン種の影響を示す。
オ度及びイオン種の影響を示す。
【図１６】プロテアーゼ１のカルス減成活性に対するＭ
ｇ２の影響を示す。
ｇ２の影響を示す。
【図１７】プロテアーゼ２のカルス減成活性に対するＭ
ｇ２の影響を示す。
ｇ２の影響を示す。
【図１８ａ】プロテアーゼ１及び粗製アミコン残留液に
よるケラチンの減成を示す。
よるケラチンの減成を示す。
【図１８ｂ】プロテアーゼ２の倍増し希釈によるケラチ
ンの減成を示す。
ンの減成を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年８月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】
【実施例】本発明の種々の好ましい特色並びに態様につ
いて、限定を意図しない次の実施例を挙げ且つ添付の図
面により記述することにする。微生物ミクロコッカス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０
２８７ プロテアーゼ１及び２の製出のために用いられる微生
物は成人の足の皮膚から分離された。特にミクロコッカ
ス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２８７株は成人の足
の皮膚から分離され、クルースら（１）及びシュライフ
ェルら（４）に従って同定された。この生物の培養菌は
上述の如く寄託されている。ここに記述され特徴づけら
れている特定の微性物以外の、他の菌株の微生物が培養
され生成物を生産し得ることは明らかであり、この種の
すべての菌株も本発明の範囲内にあるものとする。下記
の培養基をこの微生物の生育に使用することができる。
加熱した馬の血液寒天、及び液体培養には、１％（ｗ／
ｖ）の細菌学用ペプトン、１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物
及び０．５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ（ＢＰＹＥ）。貯蔵
は４０％（ｖ／ｖ）のグリセリン−ＰＢＳ（燐酸塩緩衝
食塩溶液）中−２０℃で行うかまたは凍結乾燥により行
う。ミクロコッカス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２
８７のコロニイは、加熱した血液寒天上では皺がよって
いて、淡黄色であり、また蛋白質加水分解性である。下
記の特性が見られる。顕微鏡検査 四分子においてグラム陽性球菌不動性 嫌気性状態での生育 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ − 体外色素の生成 ＋褐色 シモンスのクエン酸塩寒天上の生育 − 無機窒素寒天上の生育 − ７．５％ＮａＣｌ寒天上の生育 ＋ 硝酸塩の還元 − アセトインの生成 −β −ガラクトシダーゼの生成 − ブドー糖からの酸 −ブドー糖からの グリセリン −ブドー糖からの マンノース − エスクリンの加水分解 − ３７℃での生育 ＋アルギニン の加水分解 ＋ カゼインの加水分解 ＋ メチオニンからメタンチオールの生成 ＋
いて、限定を意図しない次の実施例を挙げ且つ添付の図
面により記述することにする。微生物ミクロコッカス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０
２８７ プロテアーゼ１及び２の製出のために用いられる微生
物は成人の足の皮膚から分離された。特にミクロコッカ
ス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２８７株は成人の足
の皮膚から分離され、クルースら（１）及びシュライフ
ェルら（４）に従って同定された。この生物の培養菌は
上述の如く寄託されている。ここに記述され特徴づけら
れている特定の微性物以外の、他の菌株の微生物が培養
され生成物を生産し得ることは明らかであり、この種の
すべての菌株も本発明の範囲内にあるものとする。下記
の培養基をこの微生物の生育に使用することができる。
加熱した馬の血液寒天、及び液体培養には、１％（ｗ／
ｖ）の細菌学用ペプトン、１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物
及び０．５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ（ＢＰＹＥ）。貯蔵
は４０％（ｖ／ｖ）のグリセリン−ＰＢＳ（燐酸塩緩衝
食塩溶液）中−２０℃で行うかまたは凍結乾燥により行
う。ミクロコッカス セダンタリウスＮＣＩＭＢ４０２
８７のコロニイは、加熱した血液寒天上では皺がよって
いて、淡黄色であり、また蛋白質加水分解性である。下
記の特性が見られる。顕微鏡検査 四分子においてグラム陽性球菌不動性 嫌気性状態での生育 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ − 体外色素の生成 ＋褐色 シモンスのクエン酸塩寒天上の生育 − 無機窒素寒天上の生育 − ７．５％ＮａＣｌ寒天上の生育 ＋ 硝酸塩の還元 − アセトインの生成 −β −ガラクトシダーゼの生成 − ブドー糖からの酸 −ブドー糖からの グリセリン −ブドー糖からの マンノース − エスクリンの加水分解 − ３７℃での生育 ＋アルギニン の加水分解 ＋ カゼインの加水分解 ＋ メチオニンからメタンチオールの生成 ＋
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】プロテアーゼ１と２および粗製アミコン残
留液によるケラチン減成 ＮａＯＨ（２５μｌ、０．５Ｍ）と５０μｌトリスー
ＨＣｌ（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）を５０μｌのケラチン
溶液に加え、そのｐＨを８に調節した。この調節したケ
ラチン溶液とともに１．５時間、４０℃で２５μｌの濃
縮粗製アミコン残留液（前記方法で得られたような）ま
たはプロテアーゼ１（２．４プロテアーゼ単位）が培養
された。プロテアーゼ２（３．０プロテアーゼ単位）が
１００ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ８．０）中でＮからＮ
／１０２４（倍増し希釈）に希釈された。各希釈液の２
５μｌが１０分間、４８℃で調節されたケラチン溶液と
ともに培養された。培養の末期において２倍強度のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ負荷の緩衝液（１５０μｌ）が各反応混合
液に加えられた。これらの試料は２分間煮沸され、各試
料の２μｌがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えられた。これ
らの結果は図１８ａおよび１８ｂに示されている。高分
子質量のケラチンポリペプチド（４５〜６６ｋＤａ）が
プロテアーゼ１およびプロテアーゼ２により、また粗製
アミコン残留液中の酵素により減成されたことは、これ
らの酵素と共に培養された後に分子質量の小さな減成生
成物（＜３６ｋＤａ）が存在していることより示されて
いる。このことはプロテアーゼ１もプロテアーゼ２も共
にケラチナーゼ活性をもつということである。
留液によるケラチン減成 ＮａＯＨ（２５μｌ、０．５Ｍ）と５０μｌトリスー
ＨＣｌ（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）を５０μｌのケラチン
溶液に加え、そのｐＨを８に調節した。この調節したケ
ラチン溶液とともに１．５時間、４０℃で２５μｌの濃
縮粗製アミコン残留液（前記方法で得られたような）ま
たはプロテアーゼ１（２．４プロテアーゼ単位）が培養
された。プロテアーゼ２（３．０プロテアーゼ単位）が
１００ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ８．０）中でＮからＮ
／１０２４（倍増し希釈）に希釈された。各希釈液の２
５μｌが１０分間、４８℃で調節されたケラチン溶液と
ともに培養された。培養の末期において２倍強度のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ負荷の緩衝液（１５０μｌ）が各反応混合
液に加えられた。これらの試料は２分間煮沸され、各試
料の２μｌがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えられた。これ
らの結果は図１８ａおよび１８ｂに示されている。高分
子質量のケラチンポリペプチド（４５〜６６ｋＤａ）が
プロテアーゼ１およびプロテアーゼ２により、また粗製
アミコン残留液中の酵素により減成されたことは、これ
らの酵素と共に培養された後に分子質量の小さな減成生
成物（＜３６ｋＤａ）が存在していることより示されて
いる。このことはプロテアーゼ１もプロテアーゼ２も共
にケラチナーゼ活性をもつということである。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
//(Ｃ１２Ｎ 9/52
Ｃ１２Ｒ 1:265）
(Ｃ１２Ｎ 1/20
Ｃ１２Ｒ 1:265）
(Ｃ１２Ｎ 5/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (21)
- 【請求項１】 ヒトのカルスを含む蛋白質の減成活性を
有すプロテアーゼの１種以上を含有する、ミクロコッカ
ス セデンタリウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄ
ｅｎｔａｒｉｕｓ）培養液から分離された酵素物質。 - 【請求項２】 下記の特性を有する酵素物質： 水溶性、 非透析性（遮断分子量１０ｋＤａの膜を通して） 等電点 ４．６、 分子量 ３０．３ｋＤａ、 プロテアーゼ活性の最適ｐＨ約８．２、及び 最適温度約４０℃。
- 【請求項３】 ミクロコッカス セデンタリウスからえ
られる請求項２の酵素物質。 - 【請求項４】 ヒトのカルス減成活性を有し、その活性
の最適ｐＨが約７．１また最適温度が約４０℃である請
求項２の酵素物質。 - 【請求項５】 下記の特性を有する酵素物質： 水溶性、 非透析性（遮断分子量１０ｋＤａの膜を通して） 等電点 ２〜７、 分子量 ５０ｋＤａ、 プロテアーゼ活性の最適ｐＨ約１０．２、及び 最適温度約４６℃。
- 【請求項６】 ミクロコッカス セデンタリウスからえ
られる請求項５の酵素物質。 - 【請求項７】 ヒトのカルス減成活性を有し、その活性
の最適ｐＨが約７．５また最適温度が５０℃である請求
項５の酵素物質。 - 【請求項８】 （酵素物質）がほぼ純粋な形状にある
か、あるいはミクロコッカス セデンタリウスの細胞を
含まない培養液の形状にある請求項２ないし７の内の何
れかの酵素物質。 - 【請求項９】 その原料源がミクロコッカス セデンタ
リウスＮＣＩＢＭ４０２８７である前記の請求項の何れ
もの酵素物質。 - 【請求項１０】 ミクロコッカス セデンタリウスの培
養液から分離することよりなる前記の請求項の何れかの
酵素物質の製造法。 - 【請求項１１】 ミクロコッカス セデンタリウスの培
養液がミクロコッカス セデンタリウスＮＣＩＭＢ ４
０２８７の培養液である請求項５の製造法。 - 【請求項１２】 プロテアーゼ活性を示すミクロコッカ
ス セデンタリウスの細胞を含まない培養液。 - 【請求項１３】 ミクロコッカス セデンタリウスＮＣ
ＩＭＢ ４０２８７から得られる請求項１２の細胞を含
まない培養液。 - 【請求項１４】 請求項１ないし９の何れかの酵素物質
あるいは請求項１２または１３の細胞を含まない培養液
を蛋白質に加えることよりなる蛋白質の減成法。 - 【請求項１５】 請求項１ないし９の何れかの酵素物質
あるいは請求項１２または１３の細胞を含まない培養液
をヒトのカルスに用いることよりなるヒトのカルスの減
成法。 - 【請求項１６】 請求項１ないし９の何れかの酵素物質
あるいは請求項１２または１３の細胞を含まない培養液
をヒトの鶏眼に用いることよりなるヒトの鶏眼の減成
法。 - 【請求項１７】 請求項１ないし９の何れかの酵素物質
あるいは請求項１２または１３の細胞を含まない培養液
を蛋白質性物質に加えることよりなる蛋白質性物質から
の減成生成物製造法。 - 【請求項１８】 ミクロコッカス セデンタリウスＮＣ
ＩＭＢ ４０２８７° - 【請求項１９】 請求項１ないし９の何れかの酵素物質
あるいは請求項１２または１３の細胞を含まない培養液
の製薬上問題のない担体または賦形剤を併用することよ
りなる薬用組成物。 - 【請求項２０】 請求項１ないし９の何れかの酵素物質
あるいは請求項１２または１３の細胞を含まない培養液
をヒトのカルスまたは鶏眼物質削除のための薬剤製造用
のための使用。 - 【請求項２１】 請求項１ないし９の何れかの酵素物質
あるいは請求項１２または１３の細胞を含まない培養液
を局所用基剤中に含有する、皮膚または人体の局所的治
療用組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909011807A GB9011807D0 (en) | 1990-05-25 | 1990-05-25 | A micro organism and proteases therefrom |
| GB9011807.6 | 1990-05-25 | ||
| CA002051350A CA2051350A1 (en) | 1990-05-25 | 1991-09-13 | Micro-organism and proteases therefrom |
| AU83850/91A AU637936B2 (en) | 1990-05-25 | 1991-09-13 | A micro-organism and proteases therefrom |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0583A true JPH0583A (ja) | 1993-01-08 |
Family
ID=27156533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3223763A Pending JPH0583A (ja) | 1990-05-25 | 1991-05-27 | 一微生物及びその微生物から得られるプロテアーゼ類 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5213978A (ja) |
| EP (1) | EP0458644A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0583A (ja) |
| AU (1) | AU637936B2 (ja) |
| CA (1) | CA2051350A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU637936B2 (en) * | 1990-05-25 | 1993-06-10 | Scholl Plc | A micro-organism and proteases therefrom |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19835055A1 (de) * | 1998-08-04 | 2000-02-24 | Wella Ag | Verfahren zur Bestimmung des Zustandes von Haaren sowie hierfür geeignete Vorrichtungen und Mittel |
| US20030026794A1 (en) * | 2001-07-31 | 2003-02-06 | Howard Fein | Selective enzyme treatment of skin conditions |
| US6835385B2 (en) * | 2002-06-14 | 2004-12-28 | Carol J. Buck | Compositions and methods for softening, thinning and removing hyperkeratotic tissue |
| US6858215B2 (en) * | 2002-06-14 | 2005-02-22 | Carol J. Buck | Compositions and methods for softening, thinning and removing hyperkeratotic tissue |
| WO2008156409A1 (en) * | 2007-06-19 | 2008-12-24 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation method using polymer multi phase systems |
| CN102471766A (zh) * | 2009-07-17 | 2012-05-23 | 科洛普拉斯特公司 | 带有酶的粘性贴片 |
| EP2316438A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-04 | Johnson & Johnson GmbH | Tape , in particular adhesive tape, for the treatment of skin disorders comprising at least one hyperkeratosis inhibitor and/or at least one keratinolytic agent |
| EP2316436A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-04 | Johnson & Johnson GmbH | Tape, in particular adhesive tape, for the treatment of skin disorders comprising a film , in particular dissolvable film, containing at least one enzyme |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3707504A (en) * | 1969-12-19 | 1972-12-26 | Procter & Gamble | Detergent composition containing proteolytic enzyme elaborated by thermoactinomyces vulgaris atcc 15734 |
| US3692631A (en) * | 1970-02-19 | 1972-09-19 | Research Corp | Method for bacterial proteinase |
| JPS56106593A (en) * | 1980-01-24 | 1981-08-24 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Alkali protease m3 |
| JPS5959189A (ja) * | 1982-09-28 | 1984-04-04 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 新規なアルカリプロテア−ゼ |
| EP0458644A1 (en) * | 1990-05-25 | 1991-11-27 | Scholl Plc | A micro-organism and proteases therefrom |
| ZA917690B (en) * | 1991-09-26 | 1992-06-24 | Scholl Plc | A micro-organism and proteases therefrom |
-
1991
- 1991-05-23 EP EP91304698A patent/EP0458644A1/en not_active Ceased
- 1991-05-24 US US07/705,090 patent/US5213978A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-27 JP JP3223763A patent/JPH0583A/ja active Pending
- 1991-09-13 AU AU83850/91A patent/AU637936B2/en not_active Ceased
- 1991-09-13 CA CA002051350A patent/CA2051350A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU637936B2 (en) * | 1990-05-25 | 1993-06-10 | Scholl Plc | A micro-organism and proteases therefrom |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU637936B2 (en) | 1993-06-10 |
| EP0458644A1 (en) | 1991-11-27 |
| AU8385091A (en) | 1993-03-25 |
| US5213978A (en) | 1993-05-25 |
| CA2051350A1 (en) | 1993-03-14 |
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