JPH04304887A - リゾチーム・グアーガム酵素加水分解物複合体及び その製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はリゾチームとグアーガム
酵素加水分解物とをアミノカルボニル反応によって結合
させてなるリゾチーム・グアーガム酵素加水分解物複合
体及びその製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、蛋白質に化学修飾（Ｊ．Ａｇｒｉ
ｃ．Ｆｏｏｄ　　Ｃｈｅｍ．，３３，１２５（１９８５
））や酵素修飾（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
５０，３０２５（１９８６））を施したり、加熱等によ
り蛋白質を変性させたり（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，４５，２７７５（１９８１））することによっ
て、蛋白質の機能性を改善しようとする研究が数多くな
されてきた。

【０００３】しかしながら、従来の化学修飾すなわち蛋
白質のアシル化、アルキル化、アミド化、脱アミド化、
エステル化等の処理及び蛋白質に炭水化物や脂肪酸を結
合させる処理においては薬剤を用いるため、安全性の面
からこれらの化学修飾により得られた蛋白質を食品原料
として使用するには問題があった。また、一般に蛋白質
は乳化活性を有するが、加熱等の処理による変性に伴っ
て不溶化がおこり、乳化剤等に用いる場合、品質上の欠
陥が生じる。本発明者らはこれまで行なわれてきた化学
修飾・酵素修飾の大部分が低分子物質を結合させる試み
であったという現状を踏まえ、また現在、一般的によく
用いられているショ糖−脂肪酸エステル等の低分子系乳
化剤がｐＨや塩濃度の影響を受けやすいという欠点を有
していたことから、優れた高分子系乳化剤を得るべく多
糖類のような高分子物質を蛋白質に結合させることを試
み、その結果活性化した分枝状多糖類を結合させること
によって水溶性でかつ乳化特性に優れた機能性蛋白質が
得られることを発見した。（特開平１−２３３３００；
Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ　　Ｃｈｅｍ．３６，４２１
（１９８８）；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３
，２１４７（１９８９））しかしながら、この方法は分
枝状多糖類を活性化することが必須であるため、活性化
剤として臭化シアン、過ヨード酸ナトリウム、塩化シア
ヌル等の薬剤を用いており、先に述べた様に安全性の面
で問題が残っていた。

【０００４】また、得られた機能性蛋白質は分子量分布
が広く製品の規格基準をそろえにくいという欠点も有し
ていた。本発明者らは上記問題点を解決すべくさらに研
究を重ねた結果、薬剤による活性化処理を施さずにアミ
ノカルボニル反応により形成された蛋白質・多糖類複合
体が高い乳化活性を示し、またとりわけ蛋白質としてリ
ゾチーム・多糖としてデキストランを用いるとグラム陰
性菌に対する抗菌活性が発現することを先に見い出した
。〔特願平２−３５５９号，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ　　
Ｃｈｅｍ．，５４，３０５７−３０５９（１９９０）〕
　　しかしながら、多糖としてデキストランを用いると
価格的に高価であり、またリゾチームが本来有している
溶菌活性がリゾチーム・デキストラン複合体では残存活
性３２％まで低下するという欠点を有していた。（ＡＣ
Ｓ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　Ｓｅｖｉｅｓ　　Ｎｏ．
４４８　　Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　　ａｎｄ　
　Ｂｍｕｌｓｉｏｎｓ　　ｉｓ　　Ｆｏｏｄｓ　　（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，
１９１）

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、前述の
諸問題を解決すベくさらに鋭意研究を重ねた結果、多糖
類としてデスキトランより安価なグアーガム酵素加水分
解物を用いてリゾチーム・グアーガム酵素加水分解物複
合体を形成させた場合、リゾチーム本来の溶菌活性の阻
害が少なく、乳化活性が高く、さらに静菌力をも含めた
、リゾチームには無いグラム陰性菌に対する抗菌活性が
発現することなどを見出し、本発明を完成するに到った
。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、リゾチームと
グアーガム酵素加水分解物とをアミノカルボニル反応に
よって結合させてなる新規なリゾチーム・グアーガム酵
素加水分解物複合体及びその製造法に関するものである
。本発明で利用するリゾチームは動植物いずれの起源の
ものでもよく、その代表例としては、例えばニワトリ卵
白、尿、パパイヤ、酵母等を起源とするものが挙げられ
る。

【０００７】グアーガム酵素加水分解物としては、グア
ーガムに例えばガラクトマンナーゼ、セルラーゼ等の酵
素を作用させて低粘度化したものが利用出来る。通常、
このグアーガム酵素加水分解物は分解により生じた低分
子の画分を除去するための透析処理を施して利用するの
が望ましい。透析処理を施す場合は、グアーガム酵素加
水分解物を水溶液としたものを例えば分子量１万程度の
透析膜を用いて充分量の脱塩水に対して一晩攪拌しなが
ら透析した後、凍結乾燥を行い粉末として次の反応に利
用すればよい。

【０００８】本発明に於けるアミノカルボニル反応は、
例えば次のようにして行うことが出来る。即ち、リゾチ
ームとグアーガム酵素加水分解物を重量比で１：２乃至
２：１程度の割合で混合した混合粉末又は両者を混合水
溶液とした後、凍結乾燥して得た粉末を反応温度５０〜
８０℃（好ましくは６０℃）、相対湿度６０〜８５％（
好ましくは７９％）の条件下で１〜６週間反応させるこ
とにより本発明の複合体が形成される。

【０００９】反応条件を５０℃未満あるいは相対湿度６
０％未満にするとアミノカルボニル反応がおこりにくく
、８０℃を超える高温では褐変が急激におこるため、蛋
白質の乳化活性や抗菌活性が低下する原因となる。また
相対湿度が８５％を超えるとベタつきがおこり品質の安
定性が望ましくない。１週間未満では反応が十分に進ま
ず、また６週間を超えて反応させても複合体の乳化活性
は向上しない。本発明の複合体は必要に応じてゲル濾過
等によって精製して用いることができる。

【００１０】こうして得られた本発明の複合体は水に可
溶で乳化活性が高く、リゾチーム本来の溶菌活性の阻害
が少なく、さらにリゾチーム単独では得られなかったグ
ラム陰性菌に対する抗菌性を発揮する。

【００１１】

【実施例】本発明の実施態様を詳細に説明するため以下
に実施例を示すが、本発明は実施例のみに限定されるも
のではない。

【００１２】

【実施例１】　　本発明複合体の製造 卵白リゾチームとグアーガム酵素加水分解物を重量比１
：１及び２：１の割合で混合して水溶液とした後、凍結
乾燥した。得られた凍乾粉末をガラスシャーレに入れ、
飽和ヨウ化カリウム溶液で約６５％湿度及び飽和臭化カ
リウム溶液で約７９％湿度に調整したデシケーター中で
６０℃で１〜３週間保持して反応させ反応条件の異なる
１２種の本発明複合体の粗製物を得た。得られた各粗成
物の反応条件は表１に示す通りである。

【００１３】

【表１】

【００１４】なお、本実施例１の出発原料のグアーガム
酵素加水分解物は市販の製品（商品名：サンファイバー
、太陽化学製）を水溶液とし、分画分子量１２０００〜
１４０００の透析膜（三光純薬製）を用いて充分量の脱
塩水に対して一晩攪拌しながら透析し、透析内液を凍結
乾燥して得た粉末（回収率６０％）を用いた。

【００１５】

【実施例２】　　本発明複合体の精製 実施例１で製造した前記１２種の本発明複合体粗製物を
それぞれセファロースＣＬ６Ｂを用いるゲル濾過により
精製した。溶出は１０ｍＭ　　ＮａＣｌを含有する５０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて流速は毎分１ｍ
ｌで行ない、３．０ｍｌずつ分画し、活性画分を採取し
た。

【００１６】本実施例の溶出パターンは各反応原料混合
物の溶出パターンと共に図１に示した。図１において、
実線は２８０ｎｍにおける吸光度（蛋白質の吸収）を、
破線はフェノール硫酸法で発色させた後の４７０ｎｍに
おける吸光度（糖の吸収）を示している。本発明の複合
体中の卵白リゾチームの溶出位置は卵白リゾチーム単独
の溶出位置より高分子側に移り、又、その位置がグアー
ガム酵素加水分解物の溶出位置とほぼ一致した。これら
の事から卵白リゾチーム・グアーガム酵素加水分解物が
形成されている事を確認した。

【００１７】図１の矢印で示した範囲の画分が本発明の
卵白リゾチーム・グアーガム酵素加水分解物複合休を含
む活性画分であり、この画分を脱イオン水に対して透析
後凍結乾燥した物は本発明複合体として好適に利用する
ことが出来る。また、さらに複合体の生成を確認するた
めに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
った結果を図２に示す。複合体は６０℃、湿度７９％の
条件下で１：１の重量比で反応させたものを用いた。 （標品ａ〜ｃ）電気泳動は、０．１％ＳＤＳを含む１０
％アクリクアミド分離ゲルと３％固定ゲルを用いてＬａ
ｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１
９７０）に準じて行なった。蛋白質試料（２０μ１，０
．１％）は１％ＳＤＳと１％メルカプトエタノールを含
むトリスーグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）で調整し、電
気泳動は０．１％ＳＤＳを含むトリスーグリシン泳動用
緩衝液を用い、１０ｍＡの一定電流で５時間行なった。 ゲルはクーマシーブルーＧ−２５０とフクシンを用いて
蛋白質及び糖染色を行なった。

【００１８】図２より、本発明複合体は固定ゲルと分離
ゲルの間の境目付近に蛋白質と糖染色の単一バンドが出
ていることから、卵白リゾチームがグアーガム酵素加水
分解物に共有結合していることがわかる。

【００１９】

【実施例３】　　本発明複合体の乳化特性の測定本発明
の代表的複合体２種（標品ｄ及び標品ｂ）と卵白リゾチ
ームの乳化特性を測定した。乳化特性はＰｅａｒｃｅら
の方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ　　Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，２
６，７１６−７２３（１９７８））に準じて測定した。

【００２０】すなわち、油１．０ｍｌと卵白リゾチーム
・グアーガム酵素加水分解物複合体の０．１％（ｗ／ｖ
）水溶液３．０ｍｌをよく振盪した後１２０００ｒｐｍ
で室温で１分間ホモゲナイズして乳化物を得た。得られ
た乳化物を経時的に底から１００μｌ取り、０．１％Ｓ
ＤＳ水溶液５ｍｌで希釈し、５００ｎｍにおける吸光度
を測定した。尚、乳化直後に測定した吸光度を乳化活性
とした。

【００２１】図３に各試料についての経時的吸光度の測
定値を示した。各試料の乳化活性は「標品ｂ＞標品ｄ〉
〉〉卵白リゾチーム」の関係を示す、本発明の複合体は
いずれも卵白リゾチームに比較して著しく高い値を示し
た。標品ｂの方が標品ｄより乳化活性が高いことから、
本発明の複合体を製造する際の反応条件として、湿度は
６５％より７９％の方が乳化活性の高い複合体が得られ
ることが分った。

【００２２】

【実施例４】　　本発明複合体のリゾチーム含量及び遊
離アミノ基量の分析 本発明複合体（標品ｂ）について、２８０ｎｍに於ける
吸光度を測定し、リゾチーム含量を求めた。次に、Ｈａ
ｙｎｅｓ等の方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．６，　　５４１（
１９６７）〕により遊離アミノ基を定量した。以上の結
果を表２に示す。

【００２３】

【表２】

【００２４】表２の成績から、リゾチームに存在する遊
離アミノ基の約２０％がグアーガム酵素加水分解物と結
合していることが示唆されている。

【００２５】

【実施例５】　　本発明複合体の溶菌活性の測定本発明
複合体（標品ｂ）、本発明者等の先願発明の複合体〔特
願平２−３５５９号の実施例３、ＡＣＳ　　Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ　　Ｓｅｒｉｅｓ　　Ｎｏ．４４８，Ｍｉｃｒ
ｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　　ａｎｄ　　Ｅｍｕｌｓｉｏｎ
ｓ　　ｉｎ　　Ｆｏｏｄ，ｂｙ　　ｔｈｅ　　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｓｏｃｉｅｔｙ（１
９９１）による卵白リゾチーム・デキストラン複合体〕
及び卵白リゾチームの３種を試料として、それぞれの溶
菌活性を測定した。

【００２６】溶菌活性はミクロコッカス　　ルテウス菌
体を用いて常法により測定した。基質のミクロコッカス
　　ルテウス菌体（シグマ社製）を６６０ｎｍにおける
吸光度が０．８程度になるよう５０ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁させた液２−２．５ｍｌに２８０
ｎｍにおける吸光度が０．０４〜０．１になるように同
緩衝液に溶解した試料溶液０．１ｍｌを加え、３７℃で
約５分間反応させ、その間経時的に６６０ｎｍにおける
吸光度を測定し、比例関係にある部分から１分間あたり
の濁度減少率を算出し、溶菌活性とした。さらに卵白リ
ゾチーム単独の活性を１００％とし、本発明及び先願発
明の複合体の相対活性を求めた結果を表３に示す。

【００２７】

【表３】

【００２８】表３の成績から本発明複合体は先願発明の
複合体に比べて卵白リゾチーム本来の溶菌活性の阻害が
少ないことが分った。この事実は本発明複合体を構成す
るリゾチームの活性部位がより多く残存していることを
示唆するものである。

【００２９】

【実施例６】　　本発明複合体の抗菌活性の測定本発明
の複合体（標品ｂ）及び卵白リゾチームを試料としてＥ
．ｃｏｌｉに対する抗菌活性を以下のようにして測定し
た。即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＩＦＯ　　１２７１３）を表
４に示す組成からなる培地で３０℃，１８〜２４時間振
とう培養後、集菌して滅菌水で洗浄した。

【００３０】

【表４】

【００３１】この菌体を約１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌにな
るように５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁さ
せ、これに最終蛋白質濃度が０．０５％になるように試
料を添加し、５０℃で振とうしながら４０分間反応させ
た。その間反応混合液を経時的にサンプリングし、氷冷
して室温に戻し、適宜希釈してマッコンキー寒天平板培
地に塗抹し、３７℃で１８〜２４時間培養し、コロニー
を計測することによって各反応混合液中のＥ．ｃｏｌｉ
の生存率を経時的に求めた。対照として、試料を添加し
ないで同様に処理して求めた値と併せて図４に示す。

【００３２】図４の成績から明らかなように、卵白リゾ
チームが対照と殆んど差異が無く抗菌活性が認められな
いのに対し、本発明複合体（標品ｂ）は５０℃で１０分
以上処理した場合に顕著な抗菌活性を示した。さらに抗
菌活性メカニズムを解明するため、反応条件を２０℃，
１時間及び５０℃，３０分に変更した以外は上述の抗菌
活性測定の場合と全く同様にして、Ｅ．Ｃｏｌｉ懸濁液
に所定の試料を添加して反応させた後１２０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離して反応混液から菌体を除去し、上
清の２００〜３００ｎｍに於ける吸光度を測定した。こ
の吸光度曲線は図５に示し、菌体内から溶出した核酸の
量に相関する２６０ｎｍに於ける吸光度は表５に示した
。

【００３３】

【表５】

【００３４】表５から明らかなように、５０℃，３０分
処理の場合、卵白リゾチームより本発明複合体を添加し
た方が２６０ｎｍの吸光度が大きい値を示しており、菌
体内から溶出する核酸の量が増加した。

【００３５】

【実施例７】　　本発明複合体の静菌効果試験本発明複
合体（粗製物Ｎｏ．５及び標品ｂ）と卵白リゾチームの
グラム陰性菌に対する静菌効果をカップ法により比較検
討した。供試菌として、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＩＦＯ　　３２
０８）及びＰ．ｍｉｒａｂｉ１ｉｓ（ＩＦＯ　　１３３
００）の２種のグラム陰性菌を用い、それぞれ表４に示
した組成の培地で３０℃，１８〜２４時間振とう培養後
、滅菌生理的食塩水に懸濁し、マッコンキー寒天平板培
地にコンラージ氏棒で塗抹し風乾した。ステンレスカッ
プ（径８ｍｍ，高さ１０ｍｍ）をセットし、各試料をそ
れぞれ１〜２％水溶液とし、滅菌濾過して１００μｌ注
入した後、３５℃，２４時間培養した。

【００３６】結果は図６−■，■に示した。中央部分の
リゾチーム単独では静菌効果が認められないが、本発明
複合体粗製物Ｎｏ．５及びそのゲル瀘過精製品の標品ｂ
ではいずれも静菌効果を示すクリアーゾーンが大きく静
菌効果が認められ、ゲル濾過精製品の標品ｂは特に優れ
た静菌効果を示した。また、試料（標品ｂ）を０．０５
％水溶液とし供試菌としてＥ．ｃｏｌｉ（１ＦＤ（２７
１３））を用いた場合の結果を図６−■に示した。この
ように濃度を下げた場合も静菌効果が認められた。

【００３７】

【実施例８】透析処理を施さないグアーガム酵素加水分
解物を用いて実施例１及び２と同様な方法で複合体を調
製した。得られた複合体はほぼ同様な溶菌活性、乳化性
及び抗菌性を示した。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、安価な原料から複合体
を得ることができ、乳化剤、抗菌剤として有利に使用で
きるため食品、医薬品、化粧品等の分野において多大な
貢献をするものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】卵白リゾチーム−グアーガム酵素分解物複合体
のゲル濾過パターンを示す図。

【図２】本発明複合体のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動の泳動パターンを示す図。

【図３】ゲル濾過によって分離精製した卵白リゾチーム
−グアーガム酵素加水分解物複合体の乳化製を示す図。

【図４】本発明複合体のＥ．ｃｏｌｉに対する抗菌効果
を示す図。

【図５】本発明複合体による菌体からの溶出成分を分析
するための吸光度曲線を示す図°

【図６】本発明複合体の静菌効果を示す写真。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　リゾチームとグアーガム酵素加水分解
   物とをアミノカルボニル反応によって結合させてなるリ
   ゾチーム・グアーガム酵素加水分解物複合体。
2. 【請求項２】　　グアーガムの加水分解に用いる酵素が
   ガラクトマンナーゼ及び／又はセルラーゼであることを
   特徴とする請求項１記載の複合体。
3. 【請求項３】　　グアーガム酵素加水分解物が分子量約
   １２０００〜１４０００の画分を少なくとも６０％以上
   含有するものであることを特徴とする請求項１又は２記
   載の複合体。
4. 【請求項４】　　乳化活性を有する請求項１乃至３記載
   の複合体。
5. 【請求項５】　　抗菌活性を有する請求項１乃至３記載
   の複合体。
6. 【請求項６】　　リゾチームとグアーガム酵素加水分解
   物とをアミノカルボニル反応によって結合させることを
   特徴とするリゾチーム・グアーガム酵素加水分解物複合
   体の製造法。
7. 【請求項７】　　リゾチームとグアーガム酵素加水分解
   物とを重量比で１：２乃至２：１の割合で反応させるこ
   とを特徴とする請求項６記載の複合体の製造法。
8. 【請求項８】　　アミノカルボニル反応を相対湿度６０
   〜８０％の雰囲気中温度５０〜８０℃で１〜６週間行な
   うことを特徴とする請求項６又は７記載の複合体の製造
   法。