DE69020276T2 - Amylose-Lysozym-Hybrid, ein Aktivzucker und Verfahren zur Herstellung. - Google Patents

Amylose-Lysozym-Hybrid, ein Aktivzucker und Verfahren zur Herstellung.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Hybridmolekül, das aus einem Zucker mit einem reduzierenden Ende und ohne Carboxylgruppe, der an Lysozym über eine Peptidbrücke gebunden ist, gebildet ist, und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Die Aufgabe besteht darin, die Stabilität des Lysozyms zu verbessern. Es ist eine weitere Aufgabe, einen aktivierten Zucker, der einen Zucker mit einem reduzierenden Ende und ohne Carboxylgruppe, gebunden an N-Hydroxysuccinimid über eine Peptidbrücke, enthält, wobei der aktivierte Zucker erforderlich ist, um das obige Zucker-Lysozym-Hybrid herzustellen, und ein Verfahren zur Herstellung des aktivierten Zuckers zur Verfügung zu stellen.
  • Proteine sind durch eine Primärstruktur charakterisiert, welche durch Verbinden von 20 Arten von Aminosäuren gebildet wird, und durch eine sterische Struktur, die durch die obige Struktur definiert wird. Es ist bereits bekannt, daß Proteine verschiedene Funktionen aufweisen und daß selbst Proteine, die in vivo stabil sind, instabil werden, wenn sie in vitro verwendet werden.
  • Wenn die überlegenen Funktionen der Proteine für verschiedene Zwecke eingesetzt werden sollen, besitzen Proteine die folgenden Nachteile:
  • 1. sie sind gegenüber Wärme, Alkalien und Säuren instabil und unterliegen der Denaturierung;
  • 2. sie sind in organischen Lösungsmitteln unlöslich und verlieren ihre Aktivität;
  • 3. sie haben antigene Eigenschaften; usw.
  • Zur Beseitigung dieser Nachteile wurden Proteine chemisch modifiziert. Durch eine solche chemische Modifizierung von Proteinen zu Proteinhybriden wurde es möglich, die obigen Nachteile zu kompensieren. Für solche chemischen Modifizierungen wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen. Unter diesen Verfahren ist ein Verfahren, das am häufigsten verwendet wird, ein Verfahren, bei dem ein Modifizierungsmittel, ein Polyethylenglykol (im folgenden als PEG abgekürzt), welches eine synthetische Verbindung mit hohem Molekulargewicht und nicht immunogen ist, verwendet.
  • Gemäß dem obigen Verfahren wird, wie es in den folgenden Gleichungen dargestellt wird, eine synthetische Verbindung (ein aktiviertes PEG) aus Monomethoxypolyethylenglykol und einem Cyanursäurechlorid (2,4,6-Trichlor-S-triazin) hergestellt, und dann wird dieses aktivierte PEG mit einem Protein unter Bildung eines PEG-Proteinhybrids umgesetzt.
  • Unter Verwendung dieses Proteinhybrids wurden verschiedene Anwendungsbeispiele, wie im folgenden gezeigt wird, in der Literatur beschrieben, aber praktisch technisch verwendete Beispiele sind rar.
  • Dies liegt daran, daß das aktivierte PEG instabil ist, kein Produkt mit einheitlichen Eigenschaften erhalten wird, weiterhin Cyanursäurechlorid giftig ist und die Reaktion des aktivierten PEG mit Proteinen nicht quantitativ und glatt verläuft. Protein -NH&sub2; + aktiviertes PEG (aktiviertes PEG) Protein (PEG-Protein-Hybrid)
  • Die Anwendungsbeispiele von PEG-Protein-Hybrid werden im folgenden angegeben.
  • (1) PEG-Asparaginase (T. Pharmac., Y. Kamisaki et al.; Exp. Therap. 216, 410).
  • Sie verlängert die Halbwertszeit im Blut von Asparaginase als Anti-Tumorenzym und verringert seine antigenen Eigenschaften.
  • (2) Unter Verwendung eines PEG-Enzym-Hybrids wurden Enzymreaktionen selbst in organischen Lösungsmitteln möglich. (Y. Imada et al.; Trends in Biotechnology 4 190 (1986) K. Takahashi et al.; J. Org. Chem. 50 3414 (1985), K. Takahashi et al.; Enzyme 32 235 (1984), K. Takahashi et al.; Biochem. Biophys. Res. Commun.: 125 761 (1984)). Katalase, Lipase, Chymotrypsin, Peroxidase, etc.
  • (3) PEG-Adenosindeaminase (M.S. Hershfield et al.; N. Engl. J. Mol. 316, 493 (1985))
  • Unter den genetischen Enzymmangelphänomenen ist das Adenosinaminase-(ADA)-Mangelphänomen. Wenn dieses ADA verabreicht wird, wurde berichtet, daß wenn es zu einem PEG- ADA-Hybrid hergerichtet wurde, daß dieses Hybrid Wirkungen besitzt, daß die Halbwertszeit im Blut bemerkenswert verlängert wird.
  • (4) PEG-Interleukin 2 (Taiji Imoto; Chemistry and Organism, Bd. 27, S. 426, 1989)
  • Interleukin 2, das eine Art von Lymphokinenen ist, wurde gemäß der rekombinanten DNA-Technik in der Masse produziert. Es besitzt jedoch in seiner Zuckerkette einen Mangel, so daß es instabil ist. Wenn es jedoch zu einem PEG- Interleukin 2-Hybrid verarbeitet wird, konnte es stabilisiert werden und weiterhin konnte seine Anti-Tumorwirkung verbessert werden.
  • Zur Herstellung eines Hybrids mit Proteinen wurden Zucker außer PEG ebenfalls verwendet. Als Verfahren, bei denen Zucker verwendet werden, können die folgenden Verfahren (i) bis (iv) erwähnt werden, und die Wirkungen der entstehenden Hybride sind fast gleich wie bei PEG. (i) Periodsäureoxidations-Verfahren: Protein (ii) Bromcyan-Verfahren: Protein (iii) Cyanursäurechlorid-Verfahren Protein (iv) Epichlorhydrin-Verfahren Protein
  • Das Verfahren (i) besitzt den Nachteil, daß die Reaktion mit Periodsäure so stark ist, daß die Zucker oft zersetzt werden, die Bindung mit den Proteinen erfordert die Verwendung eines Reduktionsmittels, so daß die Möglichkeit besteht, daß die Proteine denaturiert werden, etc.
  • Das Verfahren (ii) hat den Nachteil, daß giftiges Bromcyanin verwendet wird. Werden Proteine gebunden, ist es erforderlich, den pH bei dem Verfahren strikt einzustellen.
  • Das Verfahren (iii) hat den Nachteil, daß Cyanursäurechlorid giftig ist. Die Reaktion der Cyanursäure mit den Zukkern verläuft nicht glatt, usw.
  • Das Verfahren (iv) hat den Nachteil, daß sich die Zucker miteinander, bedingt durch das Epichlorhydrin usw., vernetzen. Die gemeinsamen Nachteile dieser Verfahren bestehen darin, daß die obigen entsprechenden Substanzen mit dem -OH der Zuckergrundbestandteile reagieren, die Bindungsstelle unbestimmt ist und da sie mit irgendeinem -OH der Zucker reagieren, die Eigenschaften, die den entsprechenden Zuckern innewohnen, verlorengehen.
  • Lysozym wurde als bakteriolytisches Enzym in der medizinischen Industrie usw. vielfach verwendet. Zur Verbesserung seiner Stabilität sind komplizierte Verfahren oder schwierige Reaktionen erforderlich. Beispielsweise wird die Zusammensetzung der Bestandteilsaminosäuren entsprechend dem gentechnologischen Verfahren variiert. Die Vernetzung erfolgt zwischen den entsprechenden Aminosäuren (siehe Taiji Imoto; Chemistry an Organism, Bd. 27, S. 426, 1989).
  • Der vorliegenden Erfindung liegen die folgenden drei Hauptaufgaben zugrunde:
  • (1) Es ist eine Aufgabe, einen aktivierten Zucker zur Verfügung zu stellen, der nützlich ist, um einen Zucker mit einem reduzierenden Ende und keiner Carboxylgruppe mit der Aminogruppe eines Proteins nur am reduzierenden Ende des Zuckers umzusetzen, ohne Verwendung irgendeines giftigen Reagens, wobei eine glatte Reaktion zur Bindung des Zukkers an das Protein ablaufen soll, ohne daß die inhärenten Eigenschaften des Zuckers verloren gehen.
  • (2) Gemäß einer weiteren Aufgabe soll ein Lysozym-Hybrid mit einem Zucker zur Verfügung gestellt werden, wobei der obige aktivierte Zucker verwendet wird, und wobei die Stabilität des Lysozyms verbessert wird.
  • (3) Erfindungsgemäß sollen Verfahren zur Herstellung des obigen aktivierten Zuckers und des obigen Zucker-Lysozyms zur Verfügung gestellt werden.
  • Andere Aufgaben folgen aus der folgenden Beschreibung:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft:
  • (1) Ein Hybridmolekül, gebildet durch einen Zucker mit einem reduzierenden Ende und ohne Carboxylgruppe, der an Lysozym über eine Peptidbrücke gebunden ist.
  • (2) Hybrid gemäß Punkt (1), wobei der Zucker Amylose ist.
  • (3) Hybrid gemäß Punkt (1), wobei das Peptid Glycylglycin ist.
  • (4) Hybrid gemäß Punkt (1), wobei der Zucker mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden ist.
  • (5) Aktivierter Zucker, der einen Zucker mit einem reduzierenden Ende und ohne Carboxylgruppe aufweist, der an N- Hydroxysuccinimid über eine Peptidbrücke gebunden ist.
  • (6) Aktivierter Zucker nach Punkt (5), wobei das Peptid Glycylglycin ist.
  • (7) Aktivierter Zucker nach Punkt (5), wobei der Zucker mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden ist.
  • (8) Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Zuckers, gemäß dem ein Zucker mit einem reduzierenden Ende und ohne Carboxylgruppe mit einem Peptid, das eine Aminogruppe an einem Ende und eine Carboxylgruppe am anderen Ende aufweist, in Anwesenheit eines Reduktionsmittels, umgesetzt wird und anschließend N-Hydroxysuccinimid mit dem entstehenden Material in Anwesenheit eines Kondensationsmittels umgesetzt wird.
  • (9) Ein Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Zukkers nach Punkt (8), bei dem das Peptid Phenylglycin ist.
  • (10) Ein Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Zukkers gemäß Punkt (8), wobei der Zucker mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden, ist.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Fig. 1 bis 4 zeigen graphische Darstellungen, welche die erfindungsgemäßen Beispiele erläutern:
    • GENAUE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN A. Herstellung des aktivierten Zuckers (1) Erste Stufe:
  • Ein Zucker mit einem reduzierenden Ende wird in einer Pufferlösung oder einem organischen Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid, usw., gelöst, und anschließend wird zu der Lösung ein Peptid mit einer Aminogruppe an einem Ende und einer Carboxylgruppe am anderen Ende und ein Reduktionsmittel zugegeben, und das Gemisch wird unter Herstellung einer Verbindung, wie sie durch die nachfolgend angegebene Formel (I) dargestellt wird, umgesetzt.
  • Für die Pufferlösung gibt es bei dieser Stufe keine besondere Beschränkung, aber sie kann keine Aminogruppe enthalten und besitzt einen pH von 5 bis 9. Der Zucker ist ein Monosaccharid, ein Oligosaccharid oder ein Polysaccharid. Für das Peptid gibt es keine besonderen Beschränkungen, aber die Zahl der Aminosäuren, die Bestandteile von ihm sind, beträgt geeigneterweise 2 bis 10. Als Reduktionsmittel sind Natriumborhydrid (im folgenden als SBH abgekürzt), Natriumcyanoborhydrid (NaBH&sub3;CN, im folgenden als SCBH abgekürzt) und Dimethylaminoboran ((CH&sub3;)&sub2;HNBH&sub3;, im folgenden als DMAB abgekürzt) bevorzugt. Die Reaktionstemperatur beträgt bevorzugt 10ºC bis 60ºC. Nach Beendigung der Reaktion werden nicht umgesetztes Peptid und Reduktionsmittel abgetrennt und mittels Gelfiltration oder einer Ultrafiltrationsmembran entfernt. Reduktionsmittel NH&sub2;-Lysozym
    • (2) Zweite Stufe:
  • Die obige Verbindung der Formel (I) wird in einer Pufferlösung oder in einem organischen Lösungsmittel gelöst und anschließend werden zu der Lösung N-Hydroxysuccinimid (im folgenden als HONSu abgekürzt) und ein Kondensationsmittel zur Herstellung der Verbindung der Formel (II) gegeben.
  • Das Kondensationsmittel ist geeigneterweise Dicyclohexylcarbodiimid (im folgenden als DCC abgekürzt), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (im folgenden als EEDQ abgekürzt), Disuccinimidcarbonat (im folgenden als DSC abgekürzt), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (im folgenden als EDC abgekürzt), usw.
  • Die Verbindung der Formel (II) ist eine Verbindung aus einem Peptidzucker, gebunden an HONSu und eine neue Verbindung, die in der Vergangenheit noch nicht hergestellt wurde. Sie liegt in einer Form vor, die mit der Aminogruppe eines Proteins leicht reagiert (im folgenden als aktivierter Zucker bezeichnet).
    • B. Herstellung des Lysozym-Zucker-Hybrids:
  • Der aktivierte Zucker [II] wird mit Lysozym in einer Pufferlösung, die keine Aminogruppe enthält, umgesetzt und anschließend wird das Zucker-Lysozym-Hybrid von dem aktivierten Zucker [II] mittels Gelfiltrationschromatographie oder einer Ultrafiltrationsmembran getrennt.
  • Die obige Reaktion verläuft fast quantitativ, wenn jedoch nichtumgesetztes Lysozym vorhanden ist, ist es möglich, ein Lysozym-Zucker-Hybrid durch Abtrennen des Lysozyms von dem Zucker-Lysozym-Hybrid mittels CM-Ionenaustauscher als Kationaustauscher herzustellen.
  • Wie oben beschrieben, ist es erfindungsgemäß möglich, ein Lysozym zu erhalten, das an das reduzierende Ende eines Zucker-Zucker-Hybrids auf vergleichsweise einfache Weise gebunden wurde. Dies ist epochemachend. Mit anderen Proteinen außer Lysozym ist es ebenfalls möglich, ein Zucker-Protein-Hybrid herzustellen.
    • C. Stabilität des Zucker-Lysozym-Hybrids
  • Um zu bestimmen, in welchem Umfang die Stabilität des Zukker-Lysozym-Hybrids, verglichen mit dem Lysozym alleine, verbessert wurde, wurde die Aktivität des Lysozyms in der Wärme geprüft. Die Aktivität des Lysozyms wurde unter Verwendung von Glykolchitin als Substrat bestimmt.
  • Es wurde gefunden, daß die Aktivität von nichtmodifiziertem Lysozym bei 80ºC oder darüber bemerkenswert erniedrigt wird, wohingegen ein Zucker-Lysozym-Hybrid seine Aktivität so weit wie 80%, selbst bei hohen Temperaturen von 90 bis 100ºC, beibehält. Somit ist eine so hohe Stabilität epochemachend.
  • Als Zucker kann nicht nur Amylose, sondern es können ebenfalls Aminopektin, Chitosan, Dextran, Agarose, usw., verwendet werden.
  • Es ist nicht wünschenswert, Zucker mit Carboxylgruppen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden, da diese eine intermolekulare Vernetzung der Proteine miteinander bewirken.
  • Wenn Pharmazeutika von Enzymproteinen in ihrer eigenen Form verabreicht werden, ist die Halbwertszeit so kurz, daß sie von der Niere schnell ausgeschieden werden, oder daß sie zersetzt werden, so daß oft die Wirksamkeit des Arzneimittels nicht erwartet werden kann. Die Anwendung der vorliegenden Erfindung bewirkt eine Erhöhung der Stabilität der Enzymproteine im Blut, eine Erhöhung ihrer Retentionszeit im Blut, usw. In einem Beispiel, das später beschrieben wird, wird die Erhöhung in der Verweilzeit von Superoxiddimustase (im folgenden als SOD abgekürzt) im Blut beschrieben, die ein Enzym ist, welches spezifisch das Superoxid-Anion von aktiven Enzymen zersetzt und seit kurzem verwendet wird, um Hindernisse in Blutgefäßen im Gehirn und Herzen zu beseitigen, um die Behcet-Krankheit zu behandeln, usw.
    • (Beispiel)
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung genauer, ohne sie zu beschränken.
    • Beispiel 1 Herstellung von Amylose-Glycylglycin
  • Amylose (gewichtsdurchschnittliches Molekulargewicht: 29 000 (1,0 g)) wurde in 0,1 M Phosphorsäurepuffer (pH: 8,5) (10 ml) gelöst und anschließend wurde Glycylglycin in einer fünffachen Molmenge, bezogen auf Amylose, und SCBH in einer fünfzigfachen Molmenge, bezogen auf Amylose, zugegeben. Das Gemisch wird bei 80ºC während 2 Tagen gerührt, dann wird der pH auf 3 mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure eingestellt, und dann wird weiter bei 60ºC während 5 Stunden gerührt, und der pH wird auf 7 mit n-NaOH eingestellt.
  • Die entstehende Reaktionsflüssigkeit wird der Gelfiltrationschromatographie mit einem Gelfiltriermedium (Marke Cellulofine GCL-25) zur Entfernung von nicht umgesetztem Glycylglycin-SCBH unterworfen. Die Gelfiltrationsergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Der erste Peakteil wird getrennt. Der darauffolgende Peak ist Glycylglycin-SCBH. Die abgetrennte Flüssigkeit wird gefriergetrocknet. Zusätzlich wird die Gelfiltration bei folgenden Säulenbedingungen ausgeführt: 1,2 x 60 cm, Eluierungsmittel: Wasser, Strömungsgeschwindigkeit: 10 ml/h. 0,9 g Amylose-Glycylglycin wurden erhalten.
    • Beispiel 2 Herstellung von aktivierter Amylose
  • Amylose-Glycylglycin (0,5 g), erhalten gemäß Beispiel 1, wurde in Dimethylsulfoxid (2 ml) gelöst, und anschließend wurden HONSu und DCC, je in einer Menge von der zehnfachen Molmenge, bezogen auf Amylose-Glycylglycin, zugegeben, und dann wurde das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
  • Die entstehenden unlöslichen Substanzen wurden abfiltriert, dann wurde Aceton (20 ml) zugegeben, das Gemisch wurde bei 3000 Upm 5 Minuten gerührt, und dann wurde der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert und bei solch einem Druck getrocknet, wobei aktivierte Amylose (0,4 g) erhalten wurde.
    • Beispiel 3 Herstellung von Amylose-Lysozym-Hybrid
  • Lysozym (11 mg) wurde in 0,1 M Borsäurepuffer (pH: 8,5) gelöst und anschließend wurde die aktivierte Amylose, erhalten gemäß Beispiel 2, zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt.
  • Das entstehende Material wurde gegenüber 0,1 M Phosphorsäurepuffer (pH: 6,0) + 0,1 M NaCl dialysiert, anschließend wurde das unlösliche Material abfiltriert und das entstehende Filtrat der Gelchromatographie mit einem Gelfiltriermedium (Marke Cellulofine GCL-300) unterworfen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Der erste Peakteil wurde getrennt. Der darauffolgende Peakteil war nicht umgesetzte aktivierte Amylose. Zusätzlich wurde bei folgenden Säulenbedingungen eine Gelfiltration durchgeführt: 1,5 x 64 cm, Puffer: 0,1 M Phosphorsäurepuffer + 0,1% NaCl, Strömungsgeschwindigkeit: 10,2 ml/h.
  • Der abgetrennte Teil wurde entsalzt und anschließend wurde gefriergetrocknet, wobei Amylose-Lysozym-Hybrid (8 mg) erhalten wurde.
    • Beispiel 4 Messung der Lysozym-Aktivität
  • Lysozym oder Amylose-Lysozym-Hybrid (0,1 ml) wurde zu 0,1%iger Glykol-Chitinlösung (1 ml) gegeben, und dann wurde das Gemisch bei 40ºC während 30 Minuten stehengelassen. Dann wurden 0,05% K&sub3;Fe(CN)&sub6; (2 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten zum Sieden erhitzt, und dann wurde die Absorption bei 420 nm gemessen. Die Beziehung zwischen der Proteinkonzentration und der Absorption ist in Fig. 3 dargestellt.
    • Beispiel 5 Stabilität des Amylose-Lysozym-Hybrids:
  • Eine Lysozymlösung oder eine Amylose-Lysozym-Hybrid-Lösung (500 ul) wurde bei 20ºC, 80ºC, 90ºC und 100ºC während 30 Minuten stehengelassen.
  • Sie wurde bei Raumtemperatur während 2,5 Stunden stehengelassen, und dann wurde die Lysozym-Aktivität gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Das Amylose-Lysozym-Hybrid behielt 90% der Aktivität von Lysozym bei. Aus Fig. 4 folgt, daß zum Zeitpunkt der Behandlung bei 100ºC während 30 Minuten die Aktivität des nicht modifizierten Lysozym bemerkenswert erniedrigt wurde, wohingegen die Aktivität des Amylose-Lysozym-Hybrids bei 90º erhalten blieb, d.h. die Wärmestabilität wurde wesentlich verbessert.
    • Beispiel 6 Herstellung von Dextran-Glycylglycin
  • Glycylglycin (0,5 g) wurde in Wasser (60 ml) gelöst, anschließend wurden Triethylamin (7 ml) und Dextran (durchschnittliches Molekulargewicht 10 000) (1 g) und SCBH (0,3 g) gelöst in Wasser (40 ml), zugegeben, und dann wurde das Gemisch bei 38ºC während 4 Tagen gerührt und die entstehende Reaktionslösung wurde der Gelfiltration auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen, wobei Dextran-Glycylglycin (0,85 g) erhalten wurde.
    • Beispiel 7 Herstellung von aktiviertem Dextran
  • Dextran-Glycylglycin (0,5 g), erhalten gemäß Beispiel 6, wurde in Dimethylsulfoxid (5 ml) gelöst und anschließend wurden HONSu (0,1 g) und DCC (0,15 g) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, die unlöslichen Materialien wurden abfiltriert, dann wurde wurde Aceton (30 ml) zugegeben, das Gemisch wurde bei 3000 Upm während 5 Minuten gerührt und dann wurde der abgeschiedene Niederschlag abfiltiert und es wurde bei verringertem Druck getrocknet, wobei ein aktiviertes Dextran (0,35 g) erhalten wurde.
    • Beispiel 8 Herstellung von Dextran-SOD-Hybrid
  • SOD, welches aus Bacillus stearothermophilus stammte (gekauft von Biochemical Industry Co., Ltd.) (10 mg) (ca. 100 000 E) wurde in 0,1 M Phosphorsäurepuffer (pH: 7,5) (10 ml) gelöst und anschließend wurde aktiviertes Dextran (30 mg), erhalten gemäß Beispiel 7 zugegeben und dann wurde das Gemisch bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das entstehende Material wurde mit 0,1 M Phosphorsäurepuffer (pH: 6,0) + 0,1 M NaCl dialysiert und anschließend wurden die unlöslichen Materialien abfiltriert, das entstehende Filtrat wurde der Gelchromatographie auf gleiche Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, unterworfen, der abgetrennte Teil wurde entsalzt und gefriergetrocknet, wobei Dextran-SOD-Hybrid (7 mg) erhalten wurde.
    • Beispiel 9 Test für die Erhaltung des Dextran-SOD-Hybrids im Blut:
  • SOD oder Dextran-SOD-Hybrid, hergestellt in Beispiel 8, je in 1200 E, wurden entsprechenden Mäusen intravenös injiziert. Bei der Verabreichung von nicht modifiziertem SOD war der SOD-Aktivitätsgehalt im Blut nach 30 Minuten fast Null, wohingegen im Falle der Maus, der Dextran-SOD-Hybrid verabreicht wurde, der Aktivitätsgehalt bei 90% erhalten blieb.

Claims (10)

1. Hybridmolekül, gebildet durch einen Zucker mit einem reduzierenden Ende und ohne Carboxylgruppe, der an Lysozym über eine Peptidbrücke gebunden ist.
2. Hybrid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker Amylose ist.
3. Hybrid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid Glycylglycin ist.
4. Hybrid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden, ist.
5. Aktivierter Zucker, der einen Zucker mit einem reduzierenden Ende und ohne Carboxylgruppe aufweist, der an N-Hydroxysuccinimid über eine Peptidbrücke gebunden ist.
6. Aktivierter Zucker nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid Glycylglycin ist.
7. Aktivierter Zucker nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden, ist.
8. Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Zuckers, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zucker mit einem reduzierenden Ende und ohne Carboxylgruppe mit einem Peptid, das eine Aminogruppe am Ende und eine Carboxylgruppe am anderen Ende aufweist, in Anwesenheit eines Reduktionsmittels umgesetzt wird und anschließend N-Hydroxysuccinimid mit dem entstehenden Material in Anwesenheit eines Kondensationsmittels umgesetzt wird.
9. Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Zuckers nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid Glycylglycin ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Zuckers nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide, ist.
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