DE1915970C3 - Verfahren zur Herstellung von durch Dialdehyde an inaktive Proteine gebundenen aktiven Proteinsubstanzen durch Vernetzung - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von durch Dialdehyde an inaktive Proteine gebundenen aktiven Proteinsubstanzen durch Vernetzung

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Description

a) die Vernetzung so unterbricht, daß das gebildete Produkt in wäßrigen Lösungsmitteln löslich bleibt, oder
b) die Vernetzung bis zur Bildung einer festen und unlöslichen Masse, wie einer Membran fortschreiten läßt
20
und das nach a) oder b) entstandene Produkt anschließend isoliert
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktive Proteinsubstanzen Enzyme, Antikörper, Antigene, Allergene oder Hormone einsetzt
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet daß man als inaktives Protein Plasma-Albumin verwendet.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Brückenbildner Glutaraldehyd einsetzt
35
Enzyme und unlösliche Träger wurden bereits mit Hilfe von Adsorptionsverfahren kombiniert (I. Langmir und V. Schaefer, J. Am. Chem. Soc. 60,1351 [1938], aber die erhaltenen Produkte denaturierten teilweise und die Enzyme wurden allmählich freigesetzt, während sie sich mit den Substraten in Berührung befanden. Die Fixierung der Enzyme war somit nicht stabil mit' der Zeit oder blieb gegenüber äußeren Einwirkungen schlecht.
Kombinationen von Cellulosederivaten und Enzymen wurden von A. Mitz und J. Summaria hergestellt (Nature 189, 576 [1961]), die beispielsweise eine Carboxymethylcellulose in die Azidform überführten und dann dieses Azid mit einer stabilisierten Lösung eines Enzyms umsetzten.
Ein ähnliches Verfahren wird von J. Epstein und B. Anfinsen in J. Biol. Chem. 237 (1962) beschrieben. Hierbei handelt es sich um eine Kupplung zwischen Carboxymethylcellulose und Ribonuklease oder Trypsin.
Von P. Bernfeld wird in Science 142, 678 (1963) ein Verfahren beschrieben, bei dem Antigene und Enzyme durch Bindung in Netzen von synthetischen Polymeren unlöslich gemacht werden. Das Verfahren besteht darin, daß die löslichen makromolekularen Verbindungen in den »Maschen« eines stark vernetzten Polymeren mechanisch eingeschlossen werden, indem gewisse synthetische Monomere in wäßriger Lösung in Gegenwart der zu fixierenden, biologisch aktiven, makromolekularen Substanz polymerisiert werden.
Die vorstehend genannten Verfahren haben insbesondere die folgenden Nachteile: Die Ausbeuten an fixierten Proteinen sind gering. Die Fixierung der Proteine ist rächt dauerhaft und während ihrer Fixierung werden die Proteine denaturiert
In The Journal of Cell Biology, VoL 17,19-58 (1963) beschreiben D. D. Sabatini et al Untersuchungen über fixierende Substanzen, die geeignet sind, die Feinstruktur von Zellen und Organel'en zu erhalten und damit die Untersuchung enzymatischer Aktivität in intakten Zellen auf histochemischen und elektronenmikroskopischen Wegen zu ermöglichen. Die Verfasser schlagen zur Verbesserung bekannter Techniken vor, die zu analysierende Materie (z. B. Gewebe) mit geeigneten Reagenzien zu verfestigen, um daraus saubere Sd-jiitte zu machen, die elektronenmikroskopischen Untersuchungen zur Verfügung stehen. Ziel der Untersuchungen war, enzymatische Aktivitäten in intakten Zellen oder Zellorganellen zu lokalisieren. Ein Verlust enzymatischer Aktivität z. B. dadurch, daß die brückenbildenden Reagenzien auch mit den Aminogruppen der aktiven Zentren der Enzyme reagieren, konnte deswegen in Kauf genommen wenden.
Aus diesem Grunde verzichten die Verfasser auch auf eine quantitative Messung der verbliebenen Enzym-Aktivität und beschränken sich auf optisch gewonnene, qualitative Angaben.
Aus A. S. F. A. Habeeb, Arch. Biochem. Biophys, Vol. 119, 264-268 (1967) ist die Herstellung von wasserunlöslichen Trypsinderivaten durch Umsetzung des Enzymproteins Trypsin und des Polysaccharidderivate Aminoethylcellulose unter Verwendung von Glutaraldehyd als brückenbildendem Reagens bekannt Außerdem wird die Umsetzung von Trypsin mit Glutaraldehyd beschrieben, wobei teilweise Ammoniumsulfat zur Vernetzung und Ausfällung hinzugegeben wird. Eine Vernetzung von zwei verschiedenen Proteinen wird nicht beschrieben.
A. F. Schick und S. J. Singer beschreiben in J. Biol. Chem. 236,2477 (1961), daß man zwei.verschiedene Proteine mit einem bifunktionellen, niedermolekularen Brückenbildner verknüpfen kann, wobei die biologische Aktivität wenigstens eines der Proteine erhalten bleibt. Als Brückenbildner werden Diisocyanate genannt Bevorzugt werden für den Erhalt kovalenter Bindungen Diisocyanat mit funktioneilen Gruppen, die unterschiedliche Reaktivität aufweisen. Zu brauchbaren Ergebnissen gelangt man jedoch nur in«inem zweistufigen Verfahren, da bei der direkten Reaktion mit dem Brükkenbildner das aktive Protein inaktiviert wird. Darüber hinaus sind die Diisocyanate schlecht wasserlöslich.
In einem Artikel von S. Avrameas und T. Termynck »Biologically Active Waterinsoluble Protein Polymers« in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 242, Nr. 7,10. 4. 67, S. 1651 -1659 wird die Herstellung biologisch aktiver unlöslicher Polymerer von Proteinen mit Hilfe von Ethylchloroformiat in wäßrigem Medium sowie die Verwendung dieser Proteinpolymeren für die Isolierung von Antigenen und Antikörpern beschrieben. Durch die Einwirkung des in Wasser nicht löslichen Ethylchloroformiats entsteht ein Gel als Polymerisationsprodukt. Ein solches Gel hat keine mechanische Festigkeit.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das die obengenannten Nachteile nicht aufweist und die Herstellung von trägergebundenen aktiven Proteinsubstanzen zum Gegenstand hat, wobei hohe Ausbeuten an fixierten Proteinen ermöglicht werden, die Fixierung der Proteine stabil ist und die Proteine während ihrer Fixierung nicht denaturiert werden.
Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.
Die aktiven Proteinsubstanzen, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, können allgemein natürlich oder durch Synthese erhaltene Produkte sein, die im Rohzustand oder nach vorheriger Reinigung verwendet werden können. Diese Substanzen werden aus Enzymen, Antikörpern, Antigenen, Allergenen und Hormonen ausgewählt
Diese aktiven Proteinsubstanzen werden im allgemeinen in gepufferten wäßrigen Medien gelöst Die Puffer sind in den meisten Fällen mineralische Puffer, z. B. auf Basis von Alkaliphosphaten oder Erdalkaliphosphaten und sind allgemein bekannt
Beim Verfahren gemäß der Erfindung können alle geeigneten inaktiven Proteine verwendet werden, die mit. der aktiven Proteinsubstanz verträglich sind, d. h. diese Substanz nicht denaturieren. Wie nachstehend näher ausgeführt wird, können die Produkte, die nach einem solchen Verfahren erhalten werden, die verschiedensten Formen haben.
Die Produkte können in wäßrigen Medien löslich sein und somit die Form einer wäßrigen Lösung haben, oder sie können in wäßrigen Medien suspendiert werden. Die Produkte können die Form von Feststoffen in Form von Granulat, Pillen, Tabletten, Platten, Kuchen und anderen geformten Massen, z. B. die Form eines Films, einer Membran oder eines inerten und porösen Materials haben.
Nachstehend werden einige Ausführungsbeispiele und Anwendungen des Verfahrens gemäß der Erfindung beschrieben.
Bei einer Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung fixiert man ein Enzym wie Glucoseoxydase durch Vernetzung auf einem als Träger dienenden inerten Protein, z. B. Albumin, in Gegenwart eines kennzeichengemäßen Brückenbildners wie Glutaraldehyd. In der gleichen Weise wird ein Film aus aktivem Protein durch Bildung von Brückenbindungen zwischen Albuminmolekülen und Carboanhydrase mit Hilfe kennzeichengemäßer Brückenbildner, im vorliegenden Fall Glutaraldehyd, hergestellt. Der auf diese Weise erhaltene Film hat wertvolle Eigenschaften und kann beispielsweise als biologische Membran verwendet werden. Es ist auch möglich, andere Enzyme in einen solchen Film einzubauen, wobei man ihm die spezifischen Eigenschaften des jeweiligen Enzyms verleiht, wie dies bei Carboanhydrase der Fall ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man in Gegenwart eines Brückenbildners ein aktives Protein, z. B. ein Enzym, ein Antigen oder eine analoge Proteinsubstanz, in Gegenwart eines als Träger dienenden inerten Proteins und unterbricht die Vernetzung so, daß das erhaltene Produkt in wäßrigen Lösungsmitteln löslich bleibt.
Als Brückenbildner eignet sich Glutaraldehyd. Als inertes Protein, das sich als Träger eignet, kann beispielsweise Plasma-Albumin verwendet werden.
Die folgenden aktiven Proteine können eingesetzt werden: Hydrolasen, ζ. B. insbesondere proteolytische, lipolytische und amylolytische Hydrolasen des Verdauungstraktes sowie Urease, Asparaginase und andere hydrolytische Enzyme, Oxydasen, z. B. Uricase, Glucoseoxydase, Peroxydase, Katalyse, Hydroxylasen, z. B. Phenylalaninhydroxylase, die Isomerasen und Transferasen, ζ. B. Galactosephosphaturidyltransferase, und die Lyasen, die die C-C-, C-O- und C —N-Bindungen lösen.
Als aktive Proteine können ferner lösliche Antigene und Allergene eingesetzt werden.
Ein solches Verfahren kann für die Herstellung von Produkten angewandt werden, die in der Therapie wirksam sind, und in denen die Wirkungsweise der aktiven Proteine verbessert ist Zum Beispiel können die nach diesem Verfahren aufgepfropften proteolytischen Enzyme oral verabfolgt werden, um die Verdauung zu erleichtern oder zu aktivieren.
ίο Die erhaltenen löslichen Produkte können intravenös injiziert werden. Gewisse, z. B. Uricase und Aspariginase enthaltende Produkte können intravenös injiziert werden und haben eine therapeutische Wirkung bei Gicht bzw. bei akuter Leukose.
Galactosephosphat-Uridyltransferase kann ebenso wie Phenylalaninhydroxylase durch die Produkte zugeführt werden, um Personen, die gewisse Enzyme nicht mehr oder nur in ungenügenden Mengen bilden können, normalen Stoffwechsel zu ermöglichen.
Die Injektion von aufgepfropften Antigenen führt zu bleibender Bildung von Antikörpern über einen langen Zeitraum, und die Injektion von Allergenen ermöglicht es, den empfangenden Organismus dauerhaft zu desensibilisieren.
In allen Fällen hat die Konstitution der nach einem solchen Verfahren erhaltenen aufgepfropften Proteine bei der Verabfolgung protrahierte Wirkung oder lang anhaltende therapeutische Wirkung zur Folge.
Bei einer Variante des Verfahrens gemäß der Erfindung vernetzt man aktive Proteine in Gegenwart eines Brückenbildners mit einem inaktiven Prpteinträger, um feine unlösliche Teilchen zu bilden, die in einer physiologischen Lösung oder einer wäßrigen Lösung suspen-
■ diert werden können.
Als inerter Proteinträger kann Plasma-Albumin und: als Vernetzungsmittel oder Brückenbildner Glutaraldehyd verwendet werden. Die Moleküle der einsetzbaren aktiven Proteine sind Enzyme, Antigene, Allergene oder andere Proteinsubstanzen. Bei diesem Verfahren können Suspensionen gebildet werden, die proteolytische Enzyme, Oxydoreduktasen, Lyasen, die die C — C-, C-O- und C —N-Bindungen lösen, Isomerasen, Transferasen oder andere Enzyme enthalten. Außerdem werden bei diesem Verfahren Suspensionen erhalten, die in der Therapie verwendet werden können. Beispielsweise können aufgepfropfte proteolytische, lipolytische und amylolytische aufgepfropfte Enzyme oral verabfolgt werden, um die Verdauung zu aktivieren. Suspensionen von Enzymen wie Uricase oder Asparaginase sind subkutan oder intramuskulär oder intravenös injizierbar, um gewisse toxische oder schädliche Produkte wie Harnsäure oder Asparagin abzubauen oder um die ungenügende Versorgung gewisser Personen, beispielsweise mit Galactosephosphaturidyltransferase bei Fällen von Galactosämie zu ergänzen. In der gleichen Weise können Antigene subkutan injiziert werden, um die langanhaltende Bildung von entsprechenden Antikörpern zu bewirken. Ebenso kann die Injektion von Allergenen, die auf feine Teilchen aufgebracht sind, die Desensibilisierung gegenüber diesen Proteinen begünstigen. Ferner ist es möglich, Membrane bakteriellen Ursprungs oder ganze Bakterien mit Albuminmolekülen so zu koppeln, daß feine Teilchen gebildet werden, die die Bildung von antibakteriellen Antikörpern in sehr dauerhafter Weise bewirken.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung vernetzt man ein aktives Protein in Gegenwart eines Brückenbildners und eines inakti-
ven Proteins, das als Träger dient, bis eine feste und unlösliche Masse von genügender Größe erhalten wird, die die aktiven Proteine enthält, die ihre ursprünglichen Eigenschaften bewahrt haben. In diesem Fall sind die aktiven Proteine in einen Träger gepfropft, der aus einer unlöslichen Proteinmasse besteht und beispielsweise die Form von Granulat, Pillen oder Tabletten hat Zahlreiche Enzyme können auf diese Weise in ein Polymeres von Plasma-Albumin eingearbeitet werden, insbesondere proteolytische, lipolytische und amyiolytiscne Hydrolasen.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung vernetzt man in Gegenwart eines Brückenbildners ein Enzym oder ein beliebiges anderes aktives Protein in Kombination mit einem inaktiven Protein im Innern eines inerten Materials, z. B. einer Prothese, einer Plastik usw, das an der Oberfläche leicht porös ist, wodurch die Proteine eindringen und fixiert werden können.
Die Verwendung solcher Prothesen, auf die ein Film als Träger von enzymatischen Funktionen gepfropft ist, kann in Fällen empfohlen werden, in denen entweder die Bedeckung der Oberflächen der Prothese mit angrenzendem Gewebe erleichtert oder diese Bedeckung verhindert werden sol. Dies ist insbesondere der Fall bei Prothesen, die bei plastischen Operationen verwendet werden, bei Starr-Klappen, bei Zellen, die bei der Osteosynthese verwendet werden, und bei allen Oberflächen von unlöslichem und inertem Material, das in den Organismus als Plastik oder Prothese eingeführt wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht ferner die Herstellung von Produkten, bei denen die Enzyme auf einen Träger gepfropft sind, der aus einem Proteinfilm besteht. Solche Filme können nach entsprechender Behandlung auch in der Kosmetik und Therapie verwendet werden.
Die nach dem Aufpfropfen der Enzyme erhaltenen Filme müssen anschließend getrocknet und durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht sterilisiert werden, bevor sie in sterilen Beuteln konditioniert werden.
Die kutane Anwendung solcher Filme oder ihre Aufbringung auf leicht zugängliche Schleimhäute ermöglicht die örtliche Einwirkung gewisser Enzyme, insbesondere proteolytischer Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin, Papasin, Keratinase und Elastase, Subtilisin, Pronase, Kollagenase, Pepsin usw. Diese Enzyme können eine therapeutische Wirkung bei gewissen Hautkrankheiten und bei gewissen Störungen der Narbenbildung haben.
Die Proteinfilme als Enzymträger können auch in der Kosmetik für die Hautpflege verwendet werden.
Außer für die obengenannten Anwendungen eignen sich die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Produkte für die Verwendung auf dem Gebiet der aktiven Filtration, der selektiven Adsorption, der Elektrophorese, der Chromatographie und für andere analoge Anwendungen.
Beispielsweise kann man bei der aktiven und selektiven Filtration durch Filtration durch eine Membran, die Träger eines proteolytischen Enzyms wie Trypsin ist, eine Lösung von Proteinen zu entsprechenden Aminosäuren und Peptiden abbauen.
Bei der Elektrophorese und bei der Chromatographie kann man die Affinitäts- und Umwandlungskpnstanten einer Verbindung, die durch ein Enzym angreifbar ist, bestimmen, indem man diese Verbindung in einem Film, der Enzymträger ist, wandern läßt.
Beispiel 1
Herstellung eines Films aus einem Copolymeren von Glucoseoxydase und Albumin
50 mg Glucoseoxydase werden in 0,7 ml eines Phosphatpuffers von pH 6,8 gelöst Ferner werden 50 mg Albumin in 0,7 ml des gleichen Puffers gelöst Die beiden Lösungen werden gemischt und bewegt, bis ein homogenes Gemisch erhalten wird. Anschließend wird eine Lösung, die 2,5 Gew.-% Glutaraldehyd enthält, unter Bewegung zugetropft Die hierbei erhaltene Lösung wird in eine Glasform mit flachem Boden, der eine Fläche von 40 cm2 hat gegeben. Nach einer Stunde wird eine Membran einer Dicke von 0,1 bis 0,2 mm erhalten, die in Wasser aufbewahrt wird, um Austrocknung zu vermeiden.
Enzymatische Ausbeute 90%. Die enzymatische Ausbeute ist das Verhältnis von im Endprodukt enthaltener Aktivität zur in das Milieu eingeführten Aktivität auf 100 bezogen.
Wenn ein Träger verwendet wird, der für Proteinlösungen und für Lösungen von Brückenbildnern undurchlässig ist wird ein abstreifbarer Film erhalten, der allein oder nach Aufbringung auf einen anderen Träger verwendbar ist.
Beispiel 2
Eine Lösung von 3 mg Carboanhydrase in 0,4 ml eines 0,02molaren Phosphatpuffers, der einen pH-Wert von 6,8 hat wird mit einer Lösung von 50 mg Plasma-Albumin in 1,4 ml des gleichen Puffers gemischt Zu dieser Lösung werden 1,2 ml einer Lösung gegeben, die 2,5% Glutaraldehyd in destilliertem Wasser enthält Die Vernetzung findet bei 4° C im Verlauf von 12 Stunden statt. Erhalten wird ein geschlossener und geschmeidiger Proteinfilm, der gute mechanische Eigenschaften hat. Die nicht umgesetzten Moleküle werden durch Spülen mit destilliertem Wasser entfernt.
Enzymatische Ausbeute ~ 40%.
Ein solcher Film hat nach guter Spülung gewisse Eigenschaften von biologischen Membranen. Insbesondere verändert er nicht die Elemente von Blut, die mit ihm in Berührung kommen.
An Stelle von Carboanhydrase können auch andere Enzyme in einen solchen Film eingearbeitet werden. Die Einarbeitung von Carboanhydrase macht diesen Film sehr durchlässig für Kohlensäure und ermöglicht seine Verwendung in Membranoxygeneratoren.
Beispiel 3
Man mischt eine Lösung von 10 mg Glucoseoxydase in 0,4 ml eines 0,02molaren Phosphatpuffers, der einen pH-Wert von 6,8 hat, mit einer Lösung, die 50 mg Plasma-Albumin in 1,4 ml des gleichen Puffers enthält. Man gibt zu dieser Lösung 1,2 ml einer Lösung von 2,5% Glutaraldehyd in destilliertem Waser. Man läßt die Vernetzung 1 Stunde bei der Laboratoriumstemperatur vonstatten gehen. Man gibt anschließend zum Reaktionsgemisch 0,05 ml eines 0,05molaren Tris(hydroxymethyl)aminoäthan-HCl-Puffers, der einen pH-Wert von 7,8 hat, wodurch die weitere Vernetzung unmittelbar vor dem Erscheinen einer unlöslichen Phase verhindert wird. Man erhält hierbei Albuminverknüpfungen, an die eine, zwei oder mehrere Glucoseoxydasemolekü-Ie gebunden sind. Die Glucoseoxydase bewahrt ihre Ak-
tivität und Spezifität. Wie die Messung des Molekulargewichts ergibt, sind Polymere gebildet worden.
Die kleinen Moleküle, z. B. die Glutaraldehydmolekü-Ie1 die nicht umgesetzt worden sind, werden durch Dialyse gegen 10 Volumina Pufferlösung und dann gegen 10 Volumina Wasser entfernt. Jede Flüssigkeit der Gegendialyse wird dreimal von Stunde zu Stunde erneuert.
Das Polymere wird anschließend lyophilisiert. Die Sterilisation wird durch Ultraviolettbestrahlung vorgenommen. Das Produkt wird in einer injizierbaren physiologischen Lösung aufgenommen. Das Polymere ist besonders beständig gegenüber einer Temperaturerhöhung und widersteht den meisten proteolytischen Enzymen.
Enzymatische Ausbeute 60%.
Ebenso gute Ergebnisse werden erhalten, wenn bei dem vorstehend beschriebenen Beispiel die Glucoseoxydase durch eines der folgenden Enzyme ersetzt wird: proteolytische, lipolytische und amylolytische Hydrolasen des Verdauungstraktes, Urease, Asparaginase und andere hydrolytische Enzyme, Oxydasen, z. B. Uritase, Peroxydase, Katalase, Hydroxylasen, z. B. Phenylalaninhydroxylase, Isomerasen und Transferasen, z. B. Galactosephosphat-uridyltransferase, Lyasen, die die C-C-, C-O- und C- N-Bindungen lösen, und lösliche Antigene oder Allergene, die vorher vom natürlichen unlöslichen Träger befreit worden sind.
Beispiel 4
Man mischt eine Lösung von 11 mg Trypsin in 0,4 ml 0,02molarem Phosphatpuffer, der einen pH-Wert von 6,8 hat, mit einer lösung von 50 mg Albumin in 1,4 ml des gleichen Puffers. Man gibt zu dieser Lösung 1,2 ml einer Lösung von 2,5% Glutaraldehyd in destilliertem Wasser. Das Gemisch wird in Formen der gewünschten Gestalt gegeben. Man läßt die Vernetzung 48 Stunden bei einer Temperatur des Laboratoriums vonstatten gehen, bis das in der Form enthaltene Material vollständig erstarrt ist Man entformt die auf diese Weise gebildeten Teilchen, die anschließend gut gespült werden, um nicht umgesetzte Moleküle zu eluieren. Die Wirksamkeit der Spülung wird durch Absorption von Licht einer Wellenlänge von 280 Γημ überprüft Die Spülung gilt als beendet, wenn keine Absorption bei dieser Wellenlänge stattfindet Die in dieser Masse fixierten aktiven Moleküle bewahren ihre Aktivität und ihre Spezifität.
Enzymatische Ausbeute 70% unter Verwendung von B.A.E.E. als Substrat
Äquivalente Ergebnisse werden erhalten, wenn bei dem vorstehend beschriebenen Versuch das Trypsin durch eine proteolytische, lipolytische oder amylolytische Hydrolase ersetzt wird.
Die erfindungsgemäß hergestellten, aktive Proteine enthaltende Produkte haben eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Denaturierung in der Wärme und gegen Proteolyse. Die aktiven Proteinsubstanzen behalten ihre Aktivität in einer Pufferlösung bei 25 und 37°C während mehrerer Monate.
Die gestiegene Widerstandsfähigkeit gegen Denaturierung und Proteolyse der gemäß der Erfindung fixierten Enzyme wurde bei jedem der getesteten Enzyme beobachtet. Zum Beispiel wurde Glukoseoxydase der Einwirkung von Trypsin, Chymotrypsin und einer enzymatischen Zusammensetzung, die im Handel erhältlich ist, unterworfen. Lediglich löslich gemachte Glukoseoxydase wurde innerhalb 5 — 20 Stunden inaktiv. Dagegen hatte Glukoseoxydase, die mit Hilfe von Glutaraldehyd in einer Cellulosemembran zusammen mit Fibrinogen gemäß der Erfindung gebunden war, nach wenigstens 40 Stunden noch 100% ihrer ursprünglichen Aktivital.
Zur Prüfung der Denaturierung durch Wärme wurde eine Probe hergestellt, die aus mit Hilfe von Glutaraldehyd zusammenvernetzten Glukoseoxydase und Albumin gemäß der Erfindung bestand. Die Probe würde bei 55° C während verschiedener Zeiträume gehalten. Die enzymatische Aktivität wurde bei 25°C gemessen.
Was das freie Enzym betrifft, so nahm die Aktivität der freien Glykoseoxydase bis zu 50% seines ursprünglichen Werts in 6 —7 Stunden bei 55° C ab und war nach 40 Stunden praktisch gleich Null. Im Gegensatz dazu zeigte die Probe mehr als 90% ihrer Aktivität nach 6 — 7 Stunden bei 55° C und sogar noch etwa 60% nach mehr als 40 Stunden bei der gleichen Temperatur.
Zur Bestimmung der enzymatischen Ausbeute wurden verschiedene Vergleichsteste mit verschiedenen Enzymen durchgeführt. Verglichen wurde die enzymatische Ausbeute, die einmal nach Vernetzung eines Enzyms mit einem Träger und zum anderen nach Immobilisierung eines Enzyms mit einer inaktiven Proteinsubstanz gemäß der Erfindung erhalten worden ist Im ersten Fall wurde das Enzym gemäß den bekannten Zweistufenverfahren an verschiedene unlösliche Träger, wie in der nachstehenden Tabelle angegeben, gebunden. Beispielsweise wurde in dem Fall, in dem ein Blatt aminiertes Papier verwendet wurde, dieses mit 0,5 N-NaOH und dann mit Wasser, dann mit 0,5 N-HCl und mit Wasser, bis es frei von Chlorid war, gewaschen. Das nasse Blatt wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet und dann gemahlen. 1 g des trockenen aminierten Papierpulvers wurde zu 0,5 g Enzym gegeben, das in 100 ml Wasser gelöst war. Dann wurden 0,4 ml 50%iger Glutaraldehyd zugegeben und die Suspension auf den benötigten pH eingestellt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde die Suspension zentrifugiert und der Rückstand mehrere Male mit 0,1 molarem Natriumcarbonat, dann mit Wasser, dann mit'0,01 N-HC! und mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und dann gefriergetrocknet
Im zweiten Fall wurde die Fixierung bzw. Co-Vernetzung gemäß dem vorliegenden Verfahren durchgeführt Das inaktive Protein wird in der nachstehenden Tabelle in Klammern angegeben.
Tabelle 19 15 970 I Erfindungsgemäße Ausbeute,
9 Wirksam gebundene Enzyme 10 I erhalten durch Co-Vernetzung
Gebundene Enzyme 1 mit einem inaktiven Protein
Ausbeute, erhalten durch Immobilisierung 80% (Albumin)
Oxido Reduktasen auf einem Träger gemäß Stand der Technik 30% (Albumin)
Glukoseoxydase 50% (Albumin)
Urateoxydase 60% (Albumin)
L-Aminosäureoxydase 10%aufCellophan 80% (Albumin) |
Xanthinoxydase 5% auf Cellophan 60% (Albumin) §
Catalase I
Peroxydase 30% (Albumin) |
Transferasen 5% auf Aktivkohle 30% (Albumin) |
i !exokinase 5% auf Whatman 3-Filterpapier I
Ribonuklease I
Isomerasen 3% auf aminicrtem Papier 50% (Albumin) 1
Glukose-6 Phosphat 1
Isomerase 50% (Hämoglobin) |
Triose-phosphat 1
Isomerase 50% (Albumin) 1
Lyasen
Carbonanhydrase		 Sw
Tyrosindecarboxylase 60% (Albumin) §
Phenylalanin 5% auf Silikonfolie i
Decarboxylase 1
Hydrolasen 80% (Abumin) g
(einige Beispiele) %
alpha-Amylase 1
/9-Galactosidase m
Trypsin 2% auf Seide 60% (Albumin) 1
Chymotrypsin nichts (Cellophan) 30% (Albumin) 1
Urease 30% auf Cellophan Verfahren gemäß der Erfindung immer |
Asparaginase 30% auf Cellophan
nichts
Wie man aus den Resultaten eindeutig entnehmen kann, werden mit dem
unvorhersehbar viel bessere Ergebnisse erzielt.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Produkten mit aktiven Proteinsubstanzen, die durch einen bifunktionellen, niedermolekularen Brückenbildner an inaktive Proteine gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus aktiven Proteinen und inaktiven Proteinen in gepufferter wäßriger Lösung in Gegenwart eines Dialdehyds vernetzt und-daß man
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