-
-
VERFAHREN ZUR IMMOBILISIERUNG VON MIKROBEN-
-
ZELLEN MIT EINER GLUCOSE-ISOMERASE-AKTIVITÄT Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Immobilisierung (biologische Festlegung) von Mikrobenzellen, die
eine Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisen, bei welchem die von Glutaraldehyd induzierte
Polymerisation in Anwesenheit eines Eiweißträgers erfolgt.
-
Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen mit Glucose se-Isomerase-Aktivität
sind bekannt.
-
Nach der US-PS 1 401 946 wird die Polymerisation der Zellen auf der
Basis der Querverbindung in Anwesenheit einer diazotierten einen bis drei Hetero
(atom) ringe enthaltenden Diaminoverbindung, wie 2,6-Diaminopyridin, 3, 6-Diaminoacridin
u.a. durchgeführt.
-
Nach der US-PS 3 694 319 werden thermisch behandelte ganze Arthrobacter-Zellen
für die Isomerisation der Glucose in Fructose in einem kontinuierlichen Verfahren
benutzt.
-
Nach der DK-PS 390 521 werden ganze Zellen von Bacillus sp.
-
NRLL 5656 mit Glutaraldehyd behandelt, wonach das so erhaltene
Präparat
zur Isomerisierung von Glucose in Fructose verwendet wird, indem die Isomerisierung
in einem kontinuierlich arbeitenden Reaktor erfolgt.
-
Ganze Actinomycetes (Streptomycetes)-Zellen, wie DEAE-Zellulose oder
ECTEOLA-Zellulose können durch Ionenaustauscher mittels Ionenbindungen immobilisiert
werden (3 788 945 und US-PS 3 708 397). Eine Immobilisierung kann auch auf Collagen-Gel
mit anschließender Oberflächenbehandlung des Gemisches mit Glutaraldehyd (M.J. Kolarik,
B.J. Chen, A.H.Jr.
-
Emmery, H.C. Lin in "Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes",
Pergamon Press, 71-83, 1974) durchgeführt werden, wobei das Gemisch in einen unlösbaren
Zustand versetzt wird.
-
Die direkte thermische Behandlung der Zellen durchgeführt, um die
Durchlässigkeit der Zellenmembrane zu vermindern, führt gewöhnlich zur Herstellung
von Präparaten mit niedriger Aktivität und einer kurzen Lebensdauer während der
Isemerisation. Die Immobilisierung der Zellen (wie z.B.
-
DEAE-Zellulose) mittels Ionenaustauschern führt zu allmählichem Abwaschen
der enzymatischen Aktivität von der Substratlösung. Dasselbe wird auch bei der Immobilisierung
von Zellen in einer Gel-Struktur wie Polyacrylamid oder Collagen beobachtet.
-
Für gewöhnlich werden die dauerhaftesten Präparate von immobilisierten
Enzymen bei einer kovalenten Bindung der an der Oberfläche der Zellenmembrane befindlichen
Reaktivgruppen hergestellt. Ähnliche Verfahren werden ebenso für die Immobilisierung
von Zellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität angewandt. Die Polymerisation mittels
Reaktion diazotierter Diamine führt zu einer guten Rückgewinnung der Zellenaktivität.
Doch wegen der hohen Trjxizität und canzerogenen Eigenschaften der eingesetzten
Reaktions'c&inehmer (Reagenzien) (2,6-Diaminopyridin, 3,6-Dami rd ist sie beschränkt.
-
Die direkte Zellerpolymer tit Mitte behandlung mit
Glutaraldehyd
führt zu einem niedrigen Polymerisationsgrad, was durch die ungenügende Anzahl freier
Reaktivgruppen auf der Zellenoberfläche bedingt ist. Demzufolge ist es nicht möglich,
eine Netzstruktur in ausreichendem Ausmaß zu erhalten, welche einen besseren Kontakt
zwischen dem benutzten Substrat und dem immobilisierten Enzym sichert. Das bekannte
Verfahren bietet keine Möglichkeit für die Standardisierung des Endproduktes. Es
wurden Versuche zur Bindung (Immobilisierung) von Zellen mi Glucose-Isomerase-Aktivität
auf Blutfraktionen (z.B. die Fraktion fünf nach Kon, Fibrin u.a.) gemacht, doch
wurden dabei keine Präparate mit guter Aktivität hergestellt.
-
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren für die Immobilisierung
von Bakterienzellen (Mikrobenzellen) mit Glucose-Isomerase-Aktivität bei Verwendung
eines leicht erhältlichen Eiweißträgers zu schaffen, mit dem Ziel ein hochaktives
und stabiles Präparat zu erhalten, welches die Herstellung hochfructoser Sirupe
in einem kontinuierlichen technologischen Verfahren gewährleistet.
-
Bei der Ausarbeitung des Verfahrens wurde die mittels Glutaraldehyd
induzierte: Polymerisation der Zellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität angewandt.
Es wurde festgestellt, daß die Glucose-Isomerase-Aktivität erhalten bleibt, wenn
die Polymerisation mit Glutaraldehyd in Anwesenheit von Blutserum oder Blutplasma
als Eiweißträger durchgeführt wird.
-
Das Blutserum oder Blutplasma, welches von gesunden Schlachttieren
(Rind- und Kleinvieh, Schweinen u.a.) entnommen wird, muß den Veterinär-Sanitätserfordernissen
entsprechen und wird in gekühltem, eingefrorenem oder getrocknetem Zustand verwendet.
Bei den letzteren zwei Fällen muß das Blutserum oder das Blutplasma in Wasser bis
zu einer Konzentration von 10 bis 12 % Trockensubstanz aufgelöst werden. Das nach
der Polymerisation erhaltene Produkt wird mit Wasser gespült.
-
In diesem Zustand oder nach Einfrieren bei -5 bis -100C während 12
Stunden wird das Produkt gepreßt, danach granuliert
und bei Temperaturen
nicht höher als 50 0C unter Vakuum oder im Trockenluftstrom getrocknet. Außer in
granulierter Form kann das trockene Präparat auch gemahlen und dann gesiebt benutzt
werden, indem man die Fraktion mit einer Korngröße von 10 bis 30 Maschenweite wählt.
-
Das hergestellte immobilisierte Präparat wird zum Füllen einer Reaktionskolonne
oder Kolonnenbatterie benutzt, durch welche eine Aktivatoren enthaltende 2 bis 3
M Glucose-Lösung (Magnesium- und Cobaltionen in für das gegebene Enzym optimalen
Konzentrationen) bei Temperaturen von 45 bis 750 durchgelassen wird. Die Strömungsgeschwindigkeit
des Substrats ist so eingestellt, daß eine 40 bis 50%-ige Umwandlung der Glucose
in Fructose gewährleistet ist (z.B. das Ausgleichen der Reaktion der Isomerisierung).
-
Die Glucose-Isomerase-Aktivität in der Reaktionskolonne oder in der
Kolonnenbatterie und die Lebens zeitdauer des enzymatischen Präparats sind eine
Funktion der Berührungsdauer des Enzyms mit dem Substrat (Strömungsgeschwindigkeit
der Kolonne), der angewandten Temperatur, der Aktivität und der Menge des angelegten
Präparats und des Vorhandenseins von Aktivatoren (Magnesium- und Cobaltionen). Die
Glucose-Isomerase-Aktivität wird in einem Reaktionsapparat nach dem von Thompson
et al (US-PS 3 788 945) beschriebenen Verfahren bestimmt.
-
Das in Fructose umgewandelte Glucosequantum wird kolorimetrisch nach
dem Dische et al.-Verfahren oder anhand der Polarimetrie bestimmt. Diese Festsetzung
wird in bestimmten sich wiederholenden Zeitintervallen während der Arbeit der Kolonne
vorgenommen. Der Aktivitätsindex der Kolonne wird nach der nachstehend angeführten
Formel bestimmt: A = RIE x log 0,504 (0,505-1)7 1 in der'A die Effektivität der
Kolonne ist, I das in Fructose umgewandelte Glucosequantum (in g), R die Strömungsgeschwin
digkeit
(in cm3 pro Minute), E die Anzahl der internationalen Einheiten Glucose-Isomerase-Aktivität,
welche sich in der Kolonne oder Kolonnenbatterie befinden.
-
Das Gleichgewicht der Isomerisationsreaktion kann beim Vorhandensein
von Minimum 2.000 internationalen Glucose-Isomerase-Einheiten erlangt werden.
-
Die Nebenprodukte der Reaktion und die Cobalt- und Magnesiumionen
können mittels Behandlung mit Aktivkohle und Kationenaustauscherharz, wie z.B. Vofatit,
Duolit, Amberlite, Dowex u.a. entfernt werden. Der Farbindex des Hoch-Fructose-Sirups
wird spektrophotometrisch in einer spektralphotometrischen Küvette von 1 cm3 bei
einer Wellenlänge von 450 und 600 nm bestimmt. Die Farbeinheiten des Hoch-Fructose-Sirups
werden mit Hilfe folgender Formel berechnet: 109 (A450 - A600) B = C II in der B
den Farbindex bedeutet, A450 und A600 die Lichtabsorption bei einer Wellenlänge
von 450 und 600 nm, C die Konzentration der Lösung (in g/100 cm3).
-
Die hergestellten immobilisierten enzymatischen Präparate weisen im
Vergleich mit den bisher bekannten Präparate folgende Vorteile auf: Hohe Aktivität
pro Gramm immobilisiertes Präparat (150 bis 200 GIU/g), günstiges pH-Optimum (7,0),
hohes Temperaturoptimum (70 bis 750C) und eine wesentliche Wärmestandfestigkeit
(Thermostabilität bei Temperaturen von 45 bis 650C). Die Produktivität (der Umwandungseffekt)
des hergestellten Präparats ist 1,5 GIU für 1 g Glucose bei einer Konvertierungsstufe
von 45 bis 50 %.
-
Anhand der nachstehend angeführten Beispiele wird die Erfindung näher
erläutert;
BeisPiel 1 Die nach einer Fermentation von Mikrobenzellen
erhaltene Kulturflüssigkeit wird zentrifugiert oder filtriert. Die abfiltrierte
Biomasse wird nur einmal mit Wasser gespült.
-
Die nach dem Zentrifugieren oder Filtrieren erhaltenen feuchten Zellen
müssen 10 bis 12 X trockene Substanz enthalten.
-
Bei einer Abweichung von diesen Werten wird eine entsprechende Korrektion
der Menge des benutzten Blut serums oder Blutplasmas vorgenommen. Die frische Biomasse
wird mit frisch erhaltenem Blutserum oder Blutplasma in einem Verhältnis 1:1 bis
1:10 Gewicht/Volumen vermischt, so daß das Präparat nach der Polymerisation von
150 bis 200 GIU/g, Trokkensubstanz Glucose-Isomerase-Aktivität enthält. Es werden
380 bis 400 cm3 25%-ige wässerige Glutaraldehyd-Lösung pro Kilogramm Trockensubstanz
im Reaktionsgemisch zugegeben, wonach es ca. eine Stunde mit einem mechanischen
Rührer bei Zimmertemperatur gerührt wird. Das erhaltene polymerisierte Produkt wird
filtriert und mehrfach mit Wasser gespült, bis das Spülwasser keine gelbe Färhung
mehr aufweist. Das überschüssige Wasser wird mittels Pressen ausgeschieden, wonach
das Präparat während 12 Stunden und bei einer Temperatur von -5 bis -100C eingefroren
wird. Nach diesem Arbeitsgang wird das Präparat entfrostet, das ausgeschiedene Wasser
mittels Pressen abgetrennt und die entstandene porö-se Masse einer Granulation unterzogen,
wonach sie bei einer Temperatur nicht höher als 5000C unter Vakuum oder im Trockenluftstrom
getrocknet wird. Außer in granulierter Form kann das Präparat auch nachdem es bis
zu einer Korngröße von 10 bis 30 Maschenweite (mesh) gemahlen und gesiebt wird,
gebraucht werden.
-
Beispiel 2 Bei der Polymerisation von ganzen Zellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität
mit Blutserum oder Blutplasma wird wie im Beispiel 1 verfahren. Nach dem Pressen
wird das hergestellte Produkt nicht eingefroren, sondern direkt einer Granulation
unterzogen, wonach es, wie im Beispiel 1 angegeben, getrock-
net
wird.
-
Beispiel 3 Die Polymerisation von Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisenden
Zellen wird unter Verwendung von mittels Zerstäubung getrocknetem oder lyophilisiertem
Blutserum oder Blutplasma durchgeführt. Das Blutserum oder Blutplasma wird vorher
in Wasser gelöst, bis der Trockensubstanzgehalt auf 8 bis 12 % eingestellt ist.
Die nachtolgenden Arbeitsgänge werden wie in den Beispielen 1 und 2 durchgeführt.
-
Beispiel 4 Bei der Polymerisierung von Glucose-Isomerase-Aktivität
aufweisenden ganzen Mikrobenzellen wird wie in den Beispielen 1, 2 und 3 verfahren
mit der Ausnahme, daß man eingefrorenes Blutplasma oder Blutserum benutzt. In diesem
Fall werden die eingefrorenen Blutserum- oder Blutplasma-Blöcke bei einer Temperatur
nicht höher als 550C entfrostet. Danach wird die Trockensubstanz bestimmt, die entsprechende
Korrektur vorgenommen und wie in den Beispielen 1 und 2 verfahren.
-
Beispiel 5 Das hergestellte Trockenpräparat wird während 12 Stunden
in einem eine Konzentration von 2 bis 3 M aufweisenden Glucose-Sirup eingeweicht,
welcher die für das gegebene Enzym optimale Konzentration an Cobalt- und Magneisumionen
enthält, oder in Wasser in einem Verhältnis von 1:10 Gewicht/Volumen.
-
Mit dem gequollenen Präparat wird eine Kolonne oder eine Kolonnenbatterie
gefüllt, wobei zu beachten ist, daß die letzteren richtig und gleichmäßig gefüllt
werden, ohne daß Luft mit eingeschlossen wird. Die Menge des enzymatischen Präparats,
das für die Durchführung der Reaktion erforderlich ist, wird nach der Formel I bestimmt.
-
Durch die Kolonne passiert ununterbrochen ein Glucose-Sirup mit einer
Konzentration von 2 bis 3 M. Die Fructose-Konzen-
tration am Ausgang
der Kolonne wird kolorimetrisch oder polarimetrisch bestimmt. Die Umwandlung des
Glucose-Sirups wird auf dem Niveau von 40 bis 50 % mittels einer Kolonnenbatterie
aufrechterhalten, wobei die Kolonne, deren Aktivität unter 20 % fällt, ausgewechselt
wird. Um eine Mikrobenverschmutzung der Kolonne zu vermeiden, ist es empfehlenswert,
die Temperatur der Isomerisation von 60 bis 650C aufrechtzuerhalten und ebenso soll
der Sirup bis auf die Arbeitstemperatur vorgewärmt sein. Die Strömungsgeschwindigkeit
durch die Kolonne oder durch die Kolonnenbatterie wird mittels einer geeigneten
Pumpe gesteuert und hängt von der Menge und der Aktivität des benutzten Präparats
gemäß Formel I für A ab.
-
Die Arbeitszeit einer einzelnen Kolonne (d.h. einer Kolonne, die nicht
in einer Batterie eingeschlossen ist) hängt von der Anfangsaktivität des immobilisierten
Präparats und der Wärmestandfestigkeit des benutzten Enzyms sowie von der Stromungsgeschwindigkeit
des Substrats ab.