DE2911557A1 - Verfahren zur herstellung von aggregaten von bakterienzellen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von aggregaten von bakterienzellenInfo
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Description
PATEN TANWÄLTE
"WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHRENS - GOETZ
professional representatives before the european patent office agrees pres l'office european des brevets
»R. PHIL. FREDA ^UESTHOFF (1Q27-IQJ6)
D-8000 MÜNCHEN SCHWEIGERSTRASSE
telefon: (089) 6610 $τ telegramm! protectpatent
telex: j24 070
1A-52 025
Patentanmeldung
Anmelder: MILES LABORATORIES, INC. 1127 Myrtle Street Elkhart, Indiana 46515
USA
Titel:
Verfahren zur Herstellung von Aggregaten von Bakterienzellen
90984ö707i0
PATENTANWÄLTE
WUESTHOFF - ν. PECHMANi J - BEHRENS - GOETZ
professional representatives before the european patent office agrees pres l'office europeen des brevets
D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2
telefon: (089) 6620 ji
telex: j24070
Anm.: Miles Lab. Unser Zeichen: 1A-52 025
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Bakterienzell -Aggregats mit einer größeren Härte
der Teilchen, wobei eine Masse derartiger Bakterienzellen zusammengebracht wird mit dem Produkt der Vernetzungsreaktion
zwischen 1. Glutaraldehyd, Cyanursäurehalogenid oder einer Kombination davon und 2. einem spezifischen kationischen
Polymer, das erhalten worden ist durch Polymerisation eines Epihalogenhydrins und eines Alkylenpolyamins, und die
entstehenden Aggregate gewonnen und getrocknet werden.
Glucose-isomerase ist ein Enzym das angewandt werden kann, um die Umwandlung von Glucose (Dextrose) in Fructose
(Lävulose) zu katalysieren. Es ist bekannt, dai3 Glucoseisomerase gebildet werden kann durch Fermentation bzw.
Züchtung bestimmter Organismen wie Streptomyces flavovirens, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces
albus, Streptomyces olivaceus, Bacillus coagulans und ähnlichen in geeigneten Nährmedien. Die Glucose-isomerase
wird innerhalb der Bakterienzellen gebildet, die während ihrer Bildung wachsen. Die Zellen können von der Fermentations-
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brühe abfiltriert und direkt als Quelle für Glucose-isomerase angewandt werden. Die direkte technische Anwendung derartiger
enzymhaltiger Bakterienzellen verbietet sich jedoch aufgrund eines erheblichen Nachteils. Die Enzymaktivität geht
während der Anwendung aus den Bakterienzellen verloren und dadurch ist die Lebensdauer der Zellen gering. Dieser Nachteil
wurde überwunden durch Behandlung der Bakterienzellen mit Glutaraldehyd, wie in der US-PS 3 779 869 beschrieben.
Weitere Techniken zur Immobilisierung der Enzymaktivität in Bakterienzellen sowie zur Herstellung von Aggregaten derartiger
enzymhaltiger Bakterienzellen sind z.B. in der US-PS 3 821 086 und der Reissue-PS 29 130 und 29 136, sowie in der
ZA-PS 73/5917 beschrieben. Die oben angegebenen US-PS betreffen die Anwendung bestimmter anionischer und kationischer
polyelektrolytischer Flockungsmittel. Die ZA-PS beschreibt verschiedene Kombinationen von Bindemitteln, Verstärkungsmitteln und Vernetzungsmitteln. V/ährend bei dem oben angegebenen
Verfahren Bakterien-Zell-aggregate entstehen die im allgemeinen ihre Enzymaktivität während ihrer Anwendung beibehalten,
es ist jedoch nach wie vor wünschenswert, die Härte der Aggregate weiter zu erhöhen, so daß sie kommerziell
bzw. technisch in Reaktorbetten zunehmender Tiefe angewandt werden können. In der US-PS 3 935 069 ist die Zugabe bestimmter
Metallverbindung zusammen mit polyelektrolytischen Flokkungsmitteln
angegeben um die Härte zu verbessern. Dieses Verfahren besitzt jedoch ebenfalls nur eine begrenzte Anwendbarkeit.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Aggregats aus B kterienzellen mit einer verbesserten
Härte. Bei diesem Verfahren wird ein Vernetzungs- Reaktionsprodukt aus Glutaraldehyd und/oder Cyanursäurehalogenid und
einem speziellen Epihalogenhydrin- Polyamin-Polymer angewandt.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
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Herstellung eines Aggregats von Bakterienzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Masse von Bakterienzellen
mit einem Vsrnetzungs-. Reaktionsprodukt zusammenbringt, aus
1. einer Substanz aus der Gruppe von Glutaraldehyd, Cyanursäurehalogenid
und deren Kombinationen und 2. einem wasserlöslichen kationischen Polymer, das erhalten worden ist durch
Polymerisation eines Epihaolgenhydrins mit einem Alkylenpolyamin
der Formel R1R2KRWH2 in der R eine niedere Alkylengruppe
mit 2 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen und R^ und R2 ,jeweils
eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, wobei das Molverhältnis von Epihalogenhydrin zu
Polyamin ungefähr 0,60:1 bis ungefähr 2,7:1 beträgt und bei der Polymerisation das Alkylenpolyamin mit ungefähr 50 bis ungefähr
90 % der Menge an Epihalogenhydrin, die polymerisiert werden soll, umgesetzt wird, wobei die Reaktion ablaufen kann
bis das Reaktionsmedium eine im wesentlichen gleichmäßige Viskosität erhält und der verbleibende Teil des Epihalogenhydrins
in einzelnen Teilen umgesetzt wird, un das kationische Polymer zu erhalten, wobei die Polymerisationstemperatur ungefähr
60 bis ungefähr 1200C beträgt und man anschließend das
entstehende Aggregat gewinnt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet, wenn das entstehende Aggregat getrocknet
und bei der späteren Verwendung wieder hydratisiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann für verschiedene
enzymhaltige Bakterienzellen angewandt werden. Die Erfindung wird im folgenden näher beschrieben in Beziehung auf Bakterienzellen,
die Glucose-isomerase-Aktivität enthalten.
Die Bakterienzellen, die Glucose-isomerase-Aktivität besitzen
und für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind,
können nach bekannten Verfahren erhalten werden. Die bevorzugten enzymhaltigen Zellen werden gebildet durch Züchtung
von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 oder dessen Mutanten unter submersen aeroben Bedingungen in einem Medium, das entsprechende
Hährstoffe enthält. Diese Züchtung ist in der US-PS 3 625 828 beschrieben. Die entstehenden Bakterienzel-
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len werden von der Fermentationsbrühe durch Abfiltrieren
oder Zentrifugieren abgetrennt.
Die bei dem Verfahren angewandten Substanzen sind leicht
zugänglich. Glutaraldehyd und Cyanursäurehalogenid wie Cyanur-
säuretrichlorid, Cyanursäurebromid, Cyanursäurejodid und ähnliche
sind im Handel erhältlich oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Das spezielle Epihalogenhydrin-Polyamin-Polymer,
das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt wird, ist unter der Bezeichnung BETZ 1180 (Betz Laboratiries,
Inc. Trevose, Pennsylvania) im Handel erhältlich. BETZ 1180 besitzt ein Molekulargewicht von weniger als 1 Million,
enthält ungefähr 0,288 mMol Aminogruppen pro Gramm der
Lösung (bezogen auf die Ninhydrin-Bestimmung) und wird in form einer Lösung, enthaltend ^O Gew.-% Feststoffe , bezogen
auf das Gesamtgewicht der Lösung, in den Handel gebracht. Diese Verbindung ist in der US-PS 3 915 904 beschrieben. Die
Verbindung wird dort als wasserlösliches "kationisches Polymer beschrieben, das erhalten worden ist durch Polymerisation
eines Epihalogenhydrins mit einem Alkylenpolyamin der Formel
R,,RoNRMIp in der R eine niedere Alkylengruppe mit ungefähr
2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und R1 und R2 jeweils eine niedere
Alkylgruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen bedeuten und das Molverhältnis von Epihalogenhydrin
zu Polyamin ungefähr 0,60:1 bis ungefähr 2,7:1 beträgt. Bei der Polymerisation werden mit dem Alkylenpolyamin ungefähr
50 bis ungefähr 90 % der zu polimerisierenden Menge an Epihalogenhydrin umgesetzt, wobei man die Reaktion ablaufen
läßt bis das Reaktionsmedium eine im wesentlichen gleichmäßige Viskosität besitzt und das restliche Epihalogenhydrin
in einzelnen Teilen umsetzt (zugibt) um das kationische Polymer zu erhalten. Die Polymerisationstemperatur beträgt ungefähr
60 bis ungefähr 120°C. Dieses Produkt wird im folgenden
als das "Polyamin-Polymer" bezeichnet.
* (Cyanurchlorid)
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Das Vernetzungs-Reaktionsprodukt, das erfindungsgemäß
zur Herstellung der Bakterien-Zell-aggregate angewandt
wird, kann*entweder Glutaraldehyd oder Cyanursäurehalogenid oder Glutaraldehyd und Cyanursäurehalogenid sein.
Das Glutaraldehyd und/oder Cyanursäurehalogenid das im folgenden allgemein als Komponente 1 bezeichnet wird,
wird mit dem Polyamin-Polymer, das als Komponente 2 "bezeichnet wird bei einem pH-Wert von ungefähr 6- bis TO und einer
Temperatur von ungefähr 0 bis 300C ungefähr 0,5 bis 2,5 h
lang umgesetzt. Das gesamte Reaktionsprodukt der ■Vernetzungsreaktion enthält ungefähr 12 bis ungefähr 77 Gew.-^ Komponente
1 und ungefähr 23 bis ungefähr 88 Gew.-?6 Komponente·^, bezogen
auf das Gesamtgewicht der wirksamen Bestandteile in den Komponenten 1 und 2. Der Glutaraldehyd-Gehalt des Reaktionsproduktes beträgt ungefähr 0 bis ungefähr 77 Gew.-% und der
Cyanursäurehalogenid-Gehalt ungefähr 0 bis ungefähr 22 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der v/irksamen Bestandteile in
den Komponenten 1 und 2. ■
Die Reaktion zwischen Glutaraldehyd und dem Polyamin-Polymer wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8 bis 9 und
einer Temperatur von ungefähr 18 bis 25°C innerhalb von ungefähr 0,5 h durchgeführt. Der Glutaraldehyd sollte in einem
Molverhältnis von mindestens 1 Mol pro Mol Aminogruppen in dem Polyamin-Polymer vorhanden sein, um unerwünschte Vernetzungen
des Polyamin-Polymers mit Glutaraldehyd zu vermeiden.
Die Reaktion zwischen Cyanursäurehalogenid allein und dem Polyamin-Polymer wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von
8 bis 9 und einer Temperatur von 0 bis 10°C innerhalb von ungefähr
1 bis 2 h durchgeführt. Das Gyanursäurehalogenid sollte
in einem Mol-Verhältnis von mindestens 1 Mol pro Mol Aminogruppen in den Polyamin-Polymer angewandt werden, um eine un-
* das Umsetzungsprodukt von Polyamin -Polymer mit _ fi -
909840/0740 .
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wünschte Vernetzung des Polyamin-Polymers mit Cyanursäurehalogenid
zu vermeiden. Cyanursäurehalogenid wie Cyanur-
säuretrichlorid besitzt drei reaktionsfähige Halogenatome.
Eines dieser Atome reagiert bei 0 C oder darüber. Nach Reaktion des ersten Halogenatoms bzw. der ersten reaktionsfähigen
Stelle reagiert das zweite Halogenatom bei 30 bis 500C und das letzte bei 90 bis 1000C. Es ist günstig, zunächst
nur die ersten Halogenatome in de Cyanurhalo genid mit dem Polyamin-Polymer zur Reaktion zu bringen.
Wenn das entstehende Vernetzungprodukt anschließend mit den Bakterienzellen umgesetzt umd beim Trocknen auf höhere
Temperaturen erhitzt wird, reagieren die verbliebenen . .eaktionsfähigen
Halogenatome des Cyanursaurehalogenids mit dem Polyamin-Polymer und liefern weitere Vernetzungen für
das Bakterienzeil -Aggregate/Die Reaktion zwischen dem Polyamin-Polymer
und der Kombination von Glutaraldehyd und Cyanursäurehalogenid wird in einzelnen Stufen durchgeführt. Zunächst
wird das Cyanursäurehalogenid mit dem Polyamin-Polymer bei einem pH-Wert von 8 bis 9 und einer Temperatur von
0 bis 100C ungefähr 1 bis 2 h umgesetzt. Vorzugsweise liegen
die Reaktionsteilnehmer in diesem Stadium in einem Mol-Verhältnis von 1 Mol Cyanursäurehalogenid zu 2 Mol Aminogruppen
in dem Polyamin-Polymer vor. Ein Überschuß von Glutaraldehyd wird dann zugegeben und die Reaktion bei dem
gleichen pH-Wert und der gleichen Temperatur ungefähr 0,5 hfortgesetzt.
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendete Reaktionsprodukt der Vernetzungsreaktion ist kein kationischer
Polyelektrolyt, da die Aminogruppen eines Polyamin-Polymer die dem Polymer zu Anfang den kationischen verliehen
haben, mit dem Glutaraldehyd und/Cyanursäurehalogenid reagiert haben und nicht weiter frei verfügbar sind.
Bakterien-Zell-aggregate werden hergestellt, indem man
eine Masse von Bakterienzellen mit dem Vernetzungsreaktions-
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- 7 χ
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- Sf -
produkt das wie oben hergestellt worden ist bei einem pH-Wert von ungefähr 8 bis 9 und bei einer Temperatur von ungefähr
0 bis 300C, ungefähr 0,5 bis 1,5 h zusammenbringt. Das Vernetzungsreaktionsprodukt wird in einer solchen Menge
und Konzentration angewandt, daß die Bakterienzellen mit ungefähr 4,5 bis ungefähr 60 Gew.-% der wirksamen Bestandteile
des Vernetzungsreaktionsproduktes, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen zusammengebracht v/erden.
Nachdem die oben angegebene Reaktion stattgefunden hat, wird das Bekterien-zell-Aggregat Vorzugsweise extrudiert
oder auf andere Weise in die gewünschte Form gebracht und bei ungefähr 65°C einige Stunden getrocknet. Die entstehenden
getrockenten Aggregate können aufbewahrt werden, bis sie später für ein enzymatriscb.es Verfahren angewandt
werden. Bei der Anwendung werden die getrockneten Aggregate rehydratisiert und für die Anwendung vorbereitet. Ein beispielhaftes
Vorbereitungsverfahren ist in der US-PS 3 974 036
beschrieben.
Ein prinzipieller Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Erhöhung der Härte der Bakterien-Zellaggregate
nach der Rehydratisierung, verglichen mit bekannten Bakterien-zell-Aggregaten. Die Härte wird ausgedrückt
als Beständigkeit der Bakterien-zell-Aggregatteilchen gegenüber
Druck. Zur Bestimmung dieser Härte wurde ein Instron Tensile Tester mit einer Compression Load Cell Nr. (Druck-
-Last ' -Zelle) CCT (Instron Corporation, Canton, Massachusetts) angewandt, wie in der US-PS 3 935 069 beschrieben
ist.
Die Rehydratisierungshärte wurde folgendermaßen bestimmt :
es wurde eine Rehydratisierungslösung hergestellt durch vermischen
von 9,68 g CoCl2 χ 6H2O, 28,0 g Mg (oh)? und 56,0 g
wasserfreier Zitronensäure in 600 ml destilliertem Wasser
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~* O ■"·
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bei 450C. Das Gemisch wurde unter Rühren auf 6O0C erhitzt f
um alle Salze zu lösen. Es wurde dann auf 25°C gekühlt und mit NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt. Anschließend
wurde es filtriert und mit destilliertem Wasser auf 1,0 1 aufgefüllt. 2,5 ml dieser Lösung wurden mit 130 ml Wasser,
70,3 g Dextrose, 24,228 Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
vermischt und bei 25°C mit NaOH auf einen pH-Wert von 8,55 gebracht. Das Gemisch wurde dann mit Wasser aus 200 ml aufgefüllt.
5 Teilchen der getrockneten Bakterien-zell-Aggregate
wurden in einer Petrischale mit 2,5 ml der oben angegebenen Rehydratisierungslösung bedeckt und 1 h im Wasserbad auf
60 C erhitzt und dann bis zum Abkühlen bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Teilchen wurden aus der Lösung entfernt,
überschüssige Flüssigkeit von der Oberfläche entfernt und dann in dem Instron-Gerät untersucht. Das Gerät
wird mindestens 30 Minuten vor Durchführung der Messungen aufgewärmt, wobei die Kraftmeßzelle (load cell) daran befestigt
ist. Die Geschwindigkeit des Preßstempels (crosshead) wird auf 5,1 mm/min eingestellt und die Papiergeschwindigkeit
des Aufzeichnungsgerätes auf 51 mm/min. Der "Rücklauf" wird auf 0,965 mm in Bezug auf die Oberfläche der Kraftmeßzelle
eingestellt. Die "Meßlänge" wird so eingestellt, daß der Rand des Probenbehälters ausreichend Abstand hat.
Die Aufzeichnungsvorrichtung wird auf den vollen Bereich eingestellt. Das sind üblicherweise 4,54 kg. Die Aufzeichnungsvorrichtung
wird so geeicht, daß sie 0 kg anzeigt, wenn sich der Probenbehälter auf der Kraftmeßzelle befindet und
0,454 kg wenn sich der Probenbehälter und 0,454 kg Standardgewicht auf der Kraftmeßzelle befinden. Ein einzelnes
rehydratisiertes Teilchen auf dem Probenbehälter wird mit dem Prüfstempel zentriert. Der Preßstempel wird von Hand"
auf die Oberfäche des Teilchens geführt und der "Ein" Knopf
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gedrückt. Auf dem Aufzeichnungsgerät wird die Kraft in kg in einem Abstand von 0,762 mm von dem Punkt an abgelesen, an dem
der
dem/Preßstempel das Teilchen berührt. Die Härte wird so ausgedrückt
als Kraft (kg) die erforderlich ist, um das Teilchen um 0,762 mm zusammenzupressen. Der Versuch wird an mehreren
Teilchen wiederholt und die Ergebnisse gemittelt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert :
"Beispiel 1
Ein Reaktionsprodukt einer Vernetzungsreaktion wurde erhalten durch Zugabe von 2,25 g BETZ 1180 Lösung, enthaltend
0,675 g aktive Substanz und 0,648 mMol Aminogruppen, zu 100 ml
einer 1,25 $&igen (Gewicht/Vol) Glutaraldehydlosung, enthaltend
13,24 mMol aktive Substanz,bei einem pH-Wert von 9. Das
Gemisch wurde ungefähr 30 Min gerührt, wobei eine dunkelgelbe Lösung entstand. Das gewünschte Produkt wurde erhalten aus
einem Reaktionsgemisch, enthaltend 64,9 Gew.-^>
Glutaraldehyd und 35,1 Gew.-% Polyamin-Polymer, bezogen auf das Gesamtgewicht
von Glutaraldehyd (Komponente 1)/Polyamin-Polymer (Komponente
2).
Eine Kultur einer Mutante von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 wurde in einem bewegten, belüfteten Fermentor, enthaltend
ein geeignetes Nährmedium, wie in der US-PS 3 625 beschrieben, gezüchtet. Die entstehende Fermentationsbrühe,
die eine Masse von Bakterienzellen enthielt, wurde durch Zugabe entsprechender Puffersubstanzen auf einen pH-Wert von
8,2 eingestellt. Ein Teil der wie oben hergestellten Lösung wurde zu einem Teil der Fermentationsbrühe in einer solchen
Menge gegeben, daß man 14 Gew.-^ Glutaraldehyd (21,6 Gew.-%
gesamtes Reaktionsprodukt) bezogen auf das Trockengewicht der Bakterienzellen erhielt. Nach 30minüter Reaktionszeit
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xr-
bei 25 C und einem pH-Wert von 8,2 wurde die behandelte Fermentationsbrühe
filtriert. Der Filterkuchen wurde dann durch eine Spritzenöffnung von 2,2 mm gepreßt. Die entstehenden
Stränge wurden in einzelne Stücke mit einer Länge von 30 mm geschnitten und über Wacht bei 65°C in einem Ofen in einem
Luftstrom getrocknet. Ein ähnlicher Anteil Fermentationsbrühe
wurde mit Glutaraldehyd in einer Konzentration von 14 Gew.-%,
bezogen auf das Trockengewicht der Bakterienzellen, behandelt. Die behandelten Zellen wurden auf· die gleiche Weise filtriert,
extrudiert und getrocknet um Vergleichsteilchen zu erhalten. "Die Vergleichsteilchen und die mit dem Vernetzungsreaktionsprodukt
behandelten Teilchen wurden auf ihre Härte untersucht. Die Vergleichs/probe besaß eine Härte von 0,364 kg, während das
erfindungsgemäß'hergestellte Produkte eine Harte von 1,27 kg
besaß.
Anteile einer Fermentationsbrühe von Streptomyces olivaceus,
entsprechend Beispiel 1, wurden nur mit Glutaraldehyd (Vergleich) und mit verschiedenen Kombinationen des Vernetzungsreaktionsproduktes
bei einem pH-Wert von 9 und 29°C behandelt. Die verschiedenen Vernetzungsprodukte wurden wie in Beispiel 1 hergestellt,
wobei verschiedene Mengen Glutaraldehyd und Polyamin-Polymer angewandt wurden. Die behandelten Bakterienzellen wurden abfiltriert,
extrudiert, getrocknet und auf ihre Härte untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben.
- 11 -
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Reaktionsgemisch zur Herstellung des Vernetzungsproduktes (Gew.-?u)
Polyamin- | zugesetzte | Härte (kg) | |
Glutar- | Polymer | Menge | 0,82 |
aldehyd | (Gew.-%) | 1,23 | |
100 (Vergleich) | 23,3 | 13,9 | 1,23 |
76,7 | 60,0 | 13, | 1,5 |
40,0 | 55,6 | 34,7 | 1,64 |
44,4 | 34,9 | 18,7 | |
65,1 | 29,8 | ||
Daraus geht hervor, daß die Anwendung des Vernetzungsraktionsproduktes
eine gleichmäßige Erhöhung der Härte ermöglicht, verglichen mit der bekannten Anwendung von Glutaraldehyd.
Ein Vernetzungsreaktionsprodukt wurde erhalten durch Lösen
von 0,188 g Cyanursäure-trichlorid (0,64 mMol) in 10 ml Aceton
und Zugabe dieser Lösung unter Rühren zu 70 ml eiskaltem Wasser, wobei ein feinteiliger Niederschlag entstand. 2,25 g BETZ 1180-Lösung
(enthaltend 0,675gaktive Substanzen und 0,648 mMol Aminogruppen)
wurden mit 20 ml Wasser verdünnt und zu der Cyanursäuretrichlorid-Suspension
gegeben.. Das entstehende Gemisch wurde unter Rühren 1 bis 2 h auf einem pH-Wert von 9 und einer Temperatur
von 0 bis 5°C gehalten und dann auf 100 ml verdünnt. Das
Cyanursäure-Trichlorid löste sich und zeigte damit eine Reaktion mit dem Polyamin an. Dieses Reaktionsprodukt entstand durch
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- 12 -
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Umsetzung eines Gemisches, enthaltend 21,8 Gew.-% Cyanursäuretrichlorid
als Komponente 1 und 78,2 Gew.-% Polyamin-Polymer als Komponente 2. Ein Anteil einer Streptomyces olivaceus Fermentations
brühe, entsprechend Beispiel 1, wurde mit einem Anteil des oben angegebenen Reaktionsproduktes vermischt, so daß
eine Konzentration von 32,0 Gev/.~% Reaktionsprodukte bezogen
auf das Trockengewicht der Bakterienzellen, entstand. 0,2 ?oige
(Gew./-Vol.) wässrige Natriumbicarbonatlösung wurde zugegeben,
um den pH-Wert auf 9 zu halten. Nach 1,5 h bei einem pH-Wert von 9 und 250C wurde die behandelte Fermentationsbrühe filtriert,
-extrudiert und getrocknet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ein anderer Anteil der Fermentationsbrühe wurde wie oben 0,5 h behandelt.
Es wurde zunächst kein Natriumbicarbonat zugegeben, aber die abfiltrierten Zellen mit einer 1 %xgen Natriumbicarbonatlösung
bei einem pH-Wert von 9 vor dem Exdrudieren und Trocknen gewaschen. Zum Vergleich wurde zu einem getrennten
Anteil der Fermentationsbrühe Glutaraldehyd in einer Konzentration von 14 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der Bakterienzellen,
zugegeben. Die Zellen wurden 50' min mit Glutaraldehyd bei einem pH-Wert von 8,2 und einer Temperatur von 25°C
vor dem Filtrieren, Extrudieren und Trocknen behandelt. Die Vergleichsprobe ergab eine Härte von 1 kg, während das Produkt,
das 0,5 h reagiert hatte eine Härte von 1,73 kg ergab und das Produkt, das 1,5 h reagiert hatte, eine Härte von 1 £2 kg.
Ein Vernetzungsprodukt wurde erhalten durch Zugabe von 4,5 g BETZ 1180-Lösung (enthaltend 1,35 g wirksame Substanzen
und 1,296 ml-lol Aminogruppen) zu 0,118 g (0,64 mMol) feinteiligen
Cyanursäure-trichlorid in eiskaltem Wasser. Der pH-Wert wurde auf 9 eingestellt und 2 h im Eisbad (O0C) auf einem
Wert von 9 gehalten. Dann wurden 1,25 g (13,24 mMol) GlutaraIdhyd
bei pH 9 zugegeben und die niedrige Temperatur ungefähr
- 13 9 0 9 8 k 0 / 0 7 k 0
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0,5 h aufrechterhalten. Es "bildete sich eine dunkelgelbe Färbung.
Das Reaktionsprodukt entstand aus einem Reaktionsgemisch, enthaltend 4,3 Gew.-'/i Cyanursäure-trichlorid, 46,0 Gev/.-% GIutaraldehyd
(insgesamt 50,3 Gew.-l;i Komponente 1) und 49,7 Ge\j.-%
Polyamin-Polymer als Komponente 2. Ein Anteil einer Streptomyces
olivaceus Fermentationsbrühe, entsprechend Beispiel 1; wurde mit
einem Anteil des oben angegebenen Reaktionsproduktes vermischt, um eine Konzentration von 30,4 Ge\i.-% Reaktionsprodukt, bezogen
auf das Trockengewicht der Bakterienzellen zu erreichen. Nach 0,5 stündiger Reaktion bei 250C und einem pH-Wert von 9 wurde die
■behandelte Fermentationsbrühe filtriert, mit einer 5 ?oigen (Ge-
\7icht) wässrigen Natriumbicarbonatlösung bei pH-9 gewaschen,
exdrudiert und getrocknet. Eine Vergleichsprobe wurde wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Vergleichsprobe ergab
eine Härte von 0,364 kg, während das vernetzte Reaktionsprodukt eine Karte von 1,73 kg ergab.
Anteile von Streptomyces olivaceus Fermentationsbrühe, entsprechend
Beispiel 1, wurden mit Glutaraldehyd allein (Vergleich) und mit verschiedenen Kombinationen von Reaktionsprodulcten bei
25 und 5°C und einem pH-Wert von 9 behandelt. Die Vernetzungsreaktionsprodukte enthielten jeweils 1 Mol Cyanursäure- trichlorid
auf 2 Hol Aminogruppen in den Polyamin-Polymer. Die Gesamtmengen des Glutaraldehyds und Polyamin-Polymers wurden so
eingestellt um die in Tabelle 2 angegebenen Kombinationen zu erhalten. Die behandelten Bakterienzellen wurden filtriert, extrudiert,
getrocknet und auf ihre Härte untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben:
- 14 -
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co
co OO -F-
Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für das Vernetzungsprodukt (Gew.-%)
Cyanursäure- | Polyamin- | zugegebene | Karte (kg) | |
Glutaraldehvd | trichlorid | Polymer | Menge (Ge\<r.-%) | 0,55 |
100 (Vergl.) | 7 | 1,05 | ||
30,6 | 5,1 | 64,3 | 6,5 | 0,96 |
18,2 | 6,0 | 75,8 | 38,4 | 1,41 |
47,4 | 3,8 | 48,8 | 29,5 | 1,50 |
_ | 12,8 | 87,2 | 55,0 | |
A)
I | 100 | (Vergl.) | |
VJl I |
52, | 0 | |
18, | 8 | ||
COP | |||
44,5 75,3
13,5
15,9
15,9
0,55
2,0
2,6
I | |
CD | ΓΟ |
—i | O |
—k | ro |
VJl | |
in | |
1Λ-52 025
Es ist zu bemerken, daß bei den oben angegebenen Beispielen die mit dem Vernetzungsreaktionsprodukt behandelten
Bakterienzellen alle deutlich erhöhte Härtewerte besaßen, verglichen mit den nur mit Glutaraldehyd behandelten Bakterienzellen.
Wenn ein Vernetzungsreaktionsprodukt, das erhalten worden
ist aus Glutaraldehyd und Polyamin-Polymer angewandt wird, wird das bevorzugte Mittel erhalten aus einem Gemisch von
57,1 Gew.-?S Glutaraldehyd als Komponente 1 und 42,9 Gew.-%
Polyamin-Polymer als Komponente 2, bezogen auf das Gesamt- . · gewicht der wirksamen Substanzen in den Komponenten 1 und 2.
Dieses Mittel wird vorzugsweise in Mengen von 17,5 Ge\t.-%, bezogen
auf das Trockengewicht der Bakterienzellen angewandt. "Wenn ein Vernetzungsreaktionsprodukt aus Glutaraldehyd,
Cyanursäure-trichlorid und Polyamin-Polymer angewandt wird, wird das bevorzugte Mittel hergestellt aus einem Gemisch von
54,9 Gew.-% Glutaraldehyd .und 3,6 Gew.-Ji Cyanursäure-trichlorid
als Komponente 1 und 41,5 Gew.-% Polyamin-Polymer als Komponente
2, bezogen auf das Gesamtgewicht der wirksamen Substanzen in den Komponenten 1 und 2. Dieses Mittel wird vorzugsweise in
einer Menge von 18,2 Ge\r.-%, bezogen auf das Trockengewicht
der Bakterienzellen angewandt.
Die auf die oben angegebene Weise erhaltenen Aggregate von Bakterienzellen waren alle imstande, Glucose in Fructose
umzuwandeln. Die Glucose-isomerase-Aktivität wurde durch die
Anwendung . , des neuen Verfahrens nicht verschlechtert.
909840/0740
COPY
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung von Aggregaten von Bakterienzellen,
dadurch gekennze ichnet , daß man Bakterienzellen zusammenbringt mit einem Vernetzungsreaktionsprodukt
aus 1. einer Substanz aus der Gruppe von Glutaraldehyd, Cyanursäurehalogenid und deren Kombinationen
und 2. einem wasserlöslichen kationischen Polymer, das erhalten worden ist durch Polymerisation eines Epihalogenhydrine
mit einem Alkylenpolyamin der Formel 11..R2NRNHp in
der R eine niedere Alkylengruppe mit 2 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen
und R1 und R2 jeweils eine niedere Alkylgruppe
mit 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen bedeuten und das Holverhältnis von Epihalogenhydrin zu Polyamin ungefähr
0,60 : 1 bis ungefähr 2,7 : 1 beträgt und die Polymerisation durchgeführt wird durch Umsetzung von ungefähr 50 bis ungefähr
90 % der zu polymerisierenden Menge an Epihalogenhydrin
mit dem Alkylenpolyamin, Durchführung der Reaktion bis das Reaktionsmedium eine ■ im wesentlichen gleichmäßige Viskosität
erreicht hat und Umsetzung des restlichen Anteils an Epihalogenhydrin in einzelnen Anteilen, um das kationische
Polymer zu erhalten, wobei die Polymerisationstemperatur ungefähr 60 bis ungefähr 120°C beträgt und die entstehenden
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1A-52 025
— 2 —
Aggregate gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterienzellen mit dem
Vernetzungsreaktionsprodukt bei einem pH-Wert von ungefähr 8 bis 9 und einer Temperatur von u]
fähr 0,5 bis 1,5 h zusammenbringt.
8 bis 9 und einer Temperatur von ungefähr 0 bis 30 C unge-
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die Bakterienzellen
mit ungefähr 4,5 bis ungefähr 60 Gew.-% Vernetzungsreaktionsprodukte,
bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, zusammenbringt
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Vernetzungsreaktionsprodukt
verwendet, das aus der Umsetzung von ungefähr 12 bis ungefähr 77 Ge\r.-% Komponente 1 und ungefähr
23 bis ungefähr 83 Gew.-?o Komponente 2, bezogen auf das Gesamtgewicht der wirksamen Bestandteile in den Komponenten
1 und 2, erhalten worden ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente 1 des Vernetzungsreaktionsproduktes
ungefähr 0 bis ungefähr 77 Gew.-% Glutaraldehyd und ungefähr 0 bis ungefähr 22 Gew.-%
Cyanursäurehalogenid enthält und die Gesamtmenge an Glutaraldehyd und/oder Cyanursäurehalogenid ungefähr 12
bis ungefähr 77 Gew.-% beträgt, bezogen auf das Gesamtgewicht
der v/irksamen Substanzen in den Komponenten 1 und 2.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man von Bakterienzeilen
von Streptömyces olivaceus ausgeht.
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1A-52 025
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet
, daß man/Cyanursäurehalogenid Cyanursäure-trichlorid verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch "1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Vernetzungsprodukt
verwendet, das erhalten worden ist durch Umsetzung von 57,1 Ge\i.-% Glutaraldehyd als Komponente 1 und 42,9
Gew.-So Komponente 2, bezogen auf das Gesamtgewicht der
wirksamen Substanzen in Komponenten 1 und 2{und dieses ·
Reaktionsprodukt in einer Menge von 17,5 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der Bakterienzellen verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Vernetzungsreaktionsprodukt
verwendet, das erhalten worden ist durch Umsetzung von 54,9 Gew.-% Glutaraldehyd und 3,6 Gew.-%
Cyanursäure-trichlorid als Komponente 1 und 41,5 Gew.-%
. Komponente 2, bezogen auf das Gesamtgewicht der wirksamen
Bestandteile in den Komponenten 1 und 2 und dieses Reaktionsprodukt in einer Menge von 18,2 Gew.-%, bezogen
auf das Trockengewicht der Bakterienzellen verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Vernetzungsreaktionsprodukt
verwendet, das erhalten worden ist durch Umsetzung der Komponenten 1 und 2 und einem pH-Wert von ungefähr
6 bis 10 und einer Temperatur von ungefähr 0 bis 300C innerhalb von ungefähr 0,5 bis 2,5 h.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,' daß man das Aggregat anschliessend
trocknet.
909840/0740
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