SU929014A3

SU929014A3 - Способ получени агрегата бактериальных клеток SтRертомусеS oLIVaceUS

Info

Publication number: SU929014A3
Application number: SU792745296A
Authority: SU
Inventors: Бальтзер Борглум Джеральд
Original assignee: Майлз Лабораториз Инк (Фирма)
Priority date: 1978-03-27
Filing date: 1979-03-26
Publication date: 1982-05-15
Also published as: JPS5715879B2; IL56732A; SE7902150L; AU512660B2; CA1110185A; ES478940A1; DE2911557C3; DE2911557B2; AR222482A1; GB2033396B; NL188359B; NL7902083A; RO78777A; FR2421213A1; YU41859B; NO790984L; PL214277A1; BE875032A; DE2911557A1; US4212943A

Description

39

термальных клеток Streptom)ces olivaceus , заключающемус в том, что массу указанных бактериальных клеток выдерживают в контакте с поперечносшивающим агентом в щелочной среде в течение 0, ч,причем в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействи 12-65 1 вес.% соединени , выбранного из группы,включающей глутаровый альдегид, трихлорангидрид циануровой кислоты и их сочетание, и; 88-3,9 весД водорастворимого катионоактивного полимера - продукта полимеризации эпихлоргидрина с алкиленполиамином формулы (2NRH,2,

где R - низший Сп-Сл - алкилен, а R и RQ- низшие , - алкилы,

указанный поперечносшивающий агент используют в количестве 6,5 55 вес.% от сухого веса клеток, и процесс ведут при рН 8-9 и температуре с последующим выделением целевого продукта.

После выделени агрегат сушат.

В качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействи вес.% глутарового альдегида и +2,9 вес. водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 17,5 вес. в пересчете на сухой вес клеток.

В качестве поперечносшивающего агента используют также продукт взаимодействи ,9 вес. глутарового альдегида и 3,6 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты, вз тых в качестве глутарового альдегида, и 1,5 вес.% водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 18,2 вес.% в пересчете на сухой вес

клеток.

I

Бактериальные клетки, содержащие активную глюкозизомеразу, которые могут быть использованы при осуществлении предлагаемого способа, можно получать в соответствии с известной технологией. Ферментсодержащие. клетки получают выращиванием в погруженном состо нии в аэробных уелоВИЯХ культуры Streptomyces olivaceus (обычно - штамм 3583) или их мутантов в среде, содержащей соответствующие питательные вещества известным способом. Полученные бактериальные клетки отдел ют от ферментативной среды путем фильтровани и центрифугировани -. Компоненты ,которые используют при осуществлении такого способа, вл ютс легко доступными . Особый эпигалоидгидринполиаминовый полимер, который используют при осуществлении предлагаемого способа, представл ет собой технически доступный продукт, выпускаемый с товарным знаком БЕТЦ 1180 фирмой Бетц лабораториз, инк.Тревоз, шт.Пенсильвани . Молекул рный вес продукта БЕТЦ 1180 менее 1 000 000, его молекулы содержат приблизительно 0,288 ммоль, аминогрупп на грамм раствора (согласно данным нингидринового испытани ), а сам продукт поступает в продажу в виде раствора содержащее 30 вес. сухого вещества в пересчете на общий вес раствора. Этот продукт вл етс известным и охарактеризован как водорастворимый катионоактивный полимер, полученный полимеризацией хлоргидрина с алкиленполиамином , отвечающим общей формуле Rj RqNRNHn ,где R - низший алкилен , содержащий от 2 до 6 углеродных атомов, а каждым из символов R и R обозначен низший алкил, содержащий от 1 до 6 углеродных атомов, причем молекул рное соотношение между хлоргидрином и полиамином находитс в интервале от 0,60:1 до 2,7:1) в процессе указанной полимеризации предусматриваютс осуществление реакции алкиленполи амина с 50-90 эпихлоргидрина от тог количества, которое должно быть полимеризовано , продолжение этой реакции до момента достижени практически однородной в зкости реакционной среды и проведение реакции оставшейс части эпихлоргидрина в постепенно увеличивающихс количествах, в резултате чего образуетс катионоактивный полимер, температура полимеризации находитс в пределах от 60 до 120-С. В дальнейшей части данного .описани этот материал носит название полиаминового полимера.

В качестве поперечносшивающего реакционного продукта, необходимого дл практического осуществлени предлагаемого изобретени , в процессе получени агрегата бактериальных клеток можно использовать одну из трех .возможных композиций.Можно провести реакцию полиаминового полимера с глутаровым альдегидом или ангидридом циануровой кислоты, или же как с глутаровым альдегидом, так и с трихлорангидридом циануровой кислоты одновременно. Глутаровый альдегид трихлорангидрид циануровой кислоты, и их сочетание , объединенные под обобщающи названием глутарового альдегида, используют дл реакции с полиаминовым полимером. При величине рН в интервале от 6 до 10 и температуре от О до ЗО-С в течение от 0,5 до 2,5 ч. В целом поперечносшивающий реакционный продукт содержит от 12 до б5,1 вес.. глутарового альдегида и примерно от 3,9 до 88 вес. полиаминового полимера в пересчете на общий вес активнодействующих ком понентов. Предпочтительно сшивающий агент, получаемый в результате реакции между глутаровым альдегидом и полиаминовым полимером, получают при величинах рН от 8 до 9, температуре 18 и в течение примерно 0,3 ч. Глутаровый альдегид должен присутствовать в мол рном соотношении по меньшей мере 1:1 аминогрупп в молекулах полиаминового полимера, что преп тствует нежелательному попереч ному сшиванию полиаминового полимера глутаровым альдегидом. Реакцию между только одним трихлорангидридом циануровой кислоты и полиаминовым полимером по предпоч тительному варианту провод т при величинах рН среды от 8 до 9 и температуре от О до в течение от 1 до 2 ч. Трихлорангидрид цианурово кислоты должен присутствовать в мол ном соотношении, равном по меньшей мере 1:1 аминогрупп в молекулах полиаминового полимера, что позвол ет предотвратить нежелательное попе речное, сшивание молекул полиаминово го полимера галоидангидридом циануровой кислоты. В молекуле трихлорангидрида циануровой кислоты, имеют с три галогеновых реакционноспособ ных участка. Один из этих участков вступает в реакцию при температуре 0°С или выше. После завершени реак ции на этом первом участке при температуре от 30 до 50°С вступает в реакцию второй участок, а третий участок вступает в реакцию при температуре от 90 до . Желательно первоначально использовать дл реакций с полиаминовым полимером только первые участки молекул трихлорангидрида циануровой кислоты. Образовав6 шийс поперечносшивающий реакционный продукт используют в реакции с бактериальными клетками, после чего нагревают в процессе сушки до повышенной температуры, оставшиес активные участки галоидангидрида циануровой кислоты вступают в реакцию с молекулами полиаминового полимера с обеспечением дополнительного поперечного сшивани бактериального клетч чного агрегата. Реакцию между полиаминовым полимером и сочетанием глутарового альдегида с трихлорангидридом циануровой кислоты провод т в несколько стадий. Сначала провод т реакцию трихлорангидрида циануровой кислоты с полиаминовым полимером при величине рН от 8 до 9 и температуре от О до IDС в течение от 1 до 2 ч. По предпочтительному варианту исходные реагенты дл осуществлени такой стадии следует использовать в молекул рном соотношении 1 моль трихлорангидрида циануровой кислоты на 2 моль аминогрупп в молекулах полиаминового полимера. Затем добавл ют избыточное количество глутарового альдегида и реакцию провод т в тех же самых услови х рН и температуры в течение 0,5 ч. Используемый поперечносшивающий реакционный продукт не вл етс катионоактивным полиэлектролитом, поскольку аминогруппы в молекулах полиаминового полимера, которые первоначально сообщали этому последнему катионоактивные характеристики, к этому времени уже прореагировали с глутаровым альдегидом и/или трихлорангидридом циануровой кислоты,, вследствие чего свободные группы уже отсутствуют. Бактериальные клеточные агрегаты получают путем введени массы бактериальных клеток в контакт с поперечносшивающим реакционным агентом, полученным в соответствии с предлагаемым , при величине рН от 8 до 9 и температуре от 5 ДО ЗО-С в течение от 0,5 до 1,5 ч. Поперечносшивающий реакционный агент используют в таких количествах и концентрации, что бактериальные клетки вступают в контакт приблизительно с 6,555 вес. активнодействующих компонентов поперечносшивающего реакционного продукта в пересчете на сухой вес клеток.

После завершени указанной реакции полученный бактериальный клеточный агрегат по предпочтительному варианту обычно экструдируют или подвергают формованию с сообщением продукту желаемой формы и сушат при температуре приблизительно в течение нескольких часов. Полученный сухой агрегат можно хранить до тех пор, пока он не понадобитс дл проведени ферментативного процесса . При этом высушенный агрегат Повторно гидратируют и готов т к использованию.

Полученные образцы подвергают испытанию на твердость с целью оценки их пригодности дл использовани в реакторах. Эта твердость выражаетс в стойкости к сжатию частиц бактериального клеточного агрегата. Испытани провод т с использованием разрывной машины Инстрон в сочетании с блоком сжимающей нагрузки NO.CCI в соответствии с ранее описанной методикой. Этот прибор выпускаетс фирмой Инстрон корпорейшн Кантон, штат Массачусетс.

Ниже приводитс процедура испытаний по определению твердости после повторной гидратации.

Раствор дл повторной гидратации готов т путем смешени 9,68 г гексагидрата хлйристого кобальта, 28,0 г гидрата окиси магни и 5б,0 г безводной лимонной кислоты в 600 мл дистиллированной воды при °С. Эту смесь далее перемешивают и нагревают до 60°С с растворением всех солей. Затем смесь охлаждают до 25°С и довод т величину рН до 8,5 добавлением гидрата окиси натри . Далее раствор фильтруют и довод т его объем до 1,0 л добавлением дистиллированной воды. Порцию в 2,5 м указанного раст вора смешивают с 130 мл воды, 70,3 г декстрозы, 2,228 г трис-(оксиметил )-аминометана и довод т величину рН до 8,55 добавлением гидрата окиси натри при 25С. Затем объем довод т до 200 мл добавлением дистил лированной воды.

Провод т конверсию 5 частиц высушенного бактериального клеточного агрегата с использованием 2,5 мл указанного раствора дл повторной гидратации в чашке Петри и выдерживают при 60°С в вод ной бане в течение 1 ч, а затем оставл ют сто ть при комнатной температуре до охлаж290U8

дени . После этого частицы удал ют из раствора, удал ют также из него избыток поверхностной жидкости и провод т испытани с применением

5 разрывной машины Инстрон. Перед применением данного прибора дл проведени измерений его подогревают в течение по меньшей мере 30 мин совместно со смонтированным на нем

10 блоком сжимающей нагрузки. Устанавливают скорость движени ползунка на уровне 5.1 мм/мин и скорость движени диаграммы 51 мм/мин. Перевод т ручку Возврат до половины

15 хода, довод ее до уровн 0,9б5 мм дл поверхности блока нагрузки. Устанавливают ручку Длина испытываемой части образца таким образом, чтобы очистить кромку чашки дл образца. Задают на самопишущем приборе диапазон всей шкалы. Это обычно составл ет ,5 кг. Стандартизируют самопишущий прибор таким образом, чтобы считывать нулевое число с чашкой дл образца на блоке нагрузки и 1 фунтом (0,5 кг), с чашкой и 1 фунтом (0,45 кг) стандартного веса на блоке нагрузки. Помещают единственную частицу после повторной

30 гидратации на чашку дл образца,котора сцентрирована с ползунком. Вручную опускают ползунок на верхнюю часть частицы и нажимают кнопку Ход На самопишущем приборе считывают уси , лие в фунтах (килограммах) на рассто нии 0,03 дюйма 0,7б2 мм от точки,в которой ползунок касаетс частицы. .Таким образом твердость выражаетс в усилии (в фунтах или килограммах.) ,

4Q необходимом дл сжати частицы на 0,03 дюйма (0,762 мм). Этот эксперимент повтор ют на нескольких частицах , а полученные результаты усредн ют .

Д5 Пример 1. Поперечносшивающий реакционный продукт получают добавлением 2,25 г раствора БЕТЦ 1180, содержащего 0,675 г активнодействующего материала и 0, ммоль аминогрупп, в 100 мл 1,25%-ного

(вес на объем) раствора глутарового альдегида, содержащего 13,2А ммоль активнодействующего материала, при величине рН, равной 9. Эту смесь перемешивают в течение 30 мин, в результате чего получают раствор глубокой желтой окраски. Конечный продукт получают из реакционной смеси, котора содержит 64,9 вес.% глутарового альдегида и 35 1 весД полиаминового полимера в пересчете на общий вес глутарового альдегида и полиаминовый полимер.

Культуру мутанта Streptomyces olivaceus NRRh 3583 выращивают в ферментере с перемешиванием и аэрацией , в котором содержалась соответствующа питательна среда. Величину рН питательной среды ферментора, содержащую массу бактериальных клеток , довод т до 8,2 добавлением соответствующих, буферных материалов. Часть приготовленного раствора добавл ют в порцию питательной среды ферментора в таком количестве, которое необходимо дл достижени эквивалента k вес.% глутарового альдегида (21,6 вес.% от всего количества реакционного продукта) в пересчете на сухой вес бактериальных клеток. По истечении 30-минутного промежутка времени реакции при 25С и величине рН, равной 8,2, обработанню среду отфильтровывают. Затем фильтровальный пирог подвергают экструдированию через шприц с диаметром отверсти 2,2 мм. Отформованные таким образом экструдированные нити разрезают на отрезки длиной 30 мм и высушивают в течение ночи при 65°С в печи с принудительной циркул цией гор чего воздушного потока. Аналогичную порци питательной среды ферментора обрабатывают только одним глутаровым альдегидом при концентрации 14 вес.%

290Н10

в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. Затем обработанные клетки отфильтровывают, экструдируют и высушивают таким же 5 образом с получением контрольных частиц. Как контрольный продукт,так и продукт, получаемый по предлагаемому изобретению подвергают испытани м на определение твердости. Твердость контрольного образца 0,36 кг,

10 тогда как продукт, обработанный в соответствии с предлагаемым изобретением , обладает повышенной твердостью , равной 1,27 кг.

Пример 2. Порции питатель15 ной среды ферментера с микроорганизмом Streptamyces olivaceus, аналогичной упом нутой в примере 1, подвергают обработке только одним 20 глутаровым альдегидом (контрольный эксперимент) и различными сочетани ми поперечносшйвающих агентов при величине рН, равной 9. и температуре . Различные поперечносшивающие агенты получают в соответствии с из25 ложенным в приведенном примере 1 с использованием различных количеств глутарового альдегида и полиаминового полимера. Затем обработанные бактериальные клетки отфильтровы30 вают, экструдируют, высушивают и подвергают испытанию на определение твердости.

В табл.1 показана реакционна смесь дл приготовлени композиции,

35 из которой получают поперечносшивающий реакционный продукт.

Т а б л и ц а 1

Использование поперечносшивающего агента на основе глутарового альдегида и полиаминового полимера позвол ет существенно повысить твердость в сравнении с той твердостью, котора достигаетс с использовани11 ем в соответствии с известным способом только одного глутарового альдегида . Пример 3- Поперечносшивающий реакционный агент получают растворением 0,188 г трихлорангидрида циануровой кислоты (0, ммоль) в 10 мл ацетона, а затем этот раствор при перемешивании добавл ют к 70 мл водой, охлаждаемой льдом, с получением тонкодисперсного осадка.Порцию в количестве 2,25 г раствора БЕТЦ 1180 (содержащего 0,675 г активнодействующего материала и 0,6А8 ммоль аминогрупп) разбавл ют добавлением 20 мл воды и добавл ют смесь в суспенз.1Ю трихлорангидрида циануровой кислоты. Конечную смесь подвергают перемешиванию и выдерживают при величине рН 9 и температуре 0-5°С в течение 1-2 ч, после чего разбавл ют до объема 100 мл. Трихлорангидрид циануровой кислоты рас вор етс , указыва на реакцию с полиамином . Этот реакционный продукт получают из реакционной смеси, кото ра содержит 21,8 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты в качест полиаминового колимера. Часть питательной среды, аналогичной указанно в примере 1, из ферментера с микро .организмом Streptomyces olivaceus смешивают с частью указанного реакционного продукта с достижением кон центрации 32,0 вес. реакционного продукта в пересчете на сухой вес бактериальных клеток.О,2 (вес на объем) водного раствора бикарбоната натри добавл ют дл поддержани величины рН на уровне 9- По истечен 1 ,5 ч при величине рН 9 и температу ре 25 С обработанную питательную ср ду фильтруют, экструдируют и высуши вают. Другую часть питательной сред ферментера обрабатывают согласно из ложенному в течение 0,5 ч. В началь ной стадии не добавл ют бикарбоната натри , но отфильтрованные клетки промывают раствором бикарбоната нат ри концентрацией 1 вес. при велич не рН 9 перед экструдированием и вы сушивают. Дл получени контрольног продукта в отдельную порцию питател ной среды из ферментера добавл ют глутаровый альдегид при концентрации 1А вес. в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. Полученную массу обрабатывают глутаровым альдегидом в течение 30 мин 12 при величине рН 8,2 и температуре с последующим фильтрованием, экструдированием и сушкой. Твердость контрольного продукта 1 кг, тогда как в результате обработки указанным поперечносшивающим продуктом в течение 0,5 ч получают продукт с твердостью 1,73 кг, а в результате обработки им же в течение 1,5 ч достигают твердости 1,82 кг. Пример 4. Поперечносшивающий реакционный продукт получают добавлением ,5 г раствора БЕТЦ 1180 (содержащего 1,35 г активнодействуюЩего материала и 1,29б ммоль аминогрупп ) в 0,118 г (0, ммоль) тонкоизмельченного трихлорангидрида циануровой кислоты в воду, охлаждаемую льдом. Величину рН довод т до 9 и поддерживают на этом уровне в лед ной бане (при 0°С) в течение 2 ч. Затем добавл ют 1,25 г (13, ммоль) глутарового альдегида при величине рН 9 и низкую температуру поддерживают в течение приблизительно 0,5 ч.Смесь приобретает темно-желтую окраску. Реакционный продукт получают из реакционной смеси котора содержит ,3 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты, А6,0 вес.% глутарового альдегида (всего 50,3 вес. глутарового альдегида) и 49,7 вес. полиаминового полимера в виде глутарового альдегида . Порцию питательной среды, аналогичной питательной среде примера 1, из ферментера с культурой микроорганизма Streptomyces olivaceus смешивают с порцией указанного поперечносшивающего продукта с достижением концентрации 30,4 вес.% реакционного продукта в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. После истечени 0,5-часового реакционного периода при величине рН 9 и температуре 25°С обработанную питательную среду фильтруют, промывают водным раствором бикарбоната натри концентрацией 5 вес. при величине рН 9 экструдируют и высушивают. Контрольный образец получают таким образом, как это описано в примере 3. Твердость контрольного продукта 0,36 кг, тогда как твердость, достигнута с использованием указанного поперечносшивающего продукта достигает 1,73. кг. Пример 5- Порции питательной среды из ферментера с культурой микроорганизма Streptomyces otivaceus , аналогичной упом нутой в примере 1, обрабатывают только одним глутаровым альдегидом (контрольный эксперимент) и различными сочетани ми поперечносшивающих продук .тов при величине рН 9 и температурах 25 и 5 С. Во всех случа х поперечносшивающие реакционные продукты,которые используютс , включают в себ 1 моль трихлорангидрида циануровой кислоты на 2 моль аминогрупп в поли25°С 100 КонтрольКак видно из приведенных данных, бактериальные клетки, обработанные поперечносшивающими реакционными продуктами согласно предлагаемому изобретению , обладают заметно повышенной твердостью в сравнении с бактериальными клетками, которые были обработаны в соответствии с известным способом только одним глутаровым альдегидом .

В случае использовани поперечносшивающего реакционного продукта,полученного из глутарового альдегида и полиаминового полимера, предпочтительную композицию готов т из смеси вес.% глутарового альдегида и 2,9 вес.% полиаминового полимера 9290 5 10

в пересчете на общий вес активнодействующих ингредиентов. По предпочтительному варианту эту композицию следует также примен ть в количестве 17,5 вес.% в пересчете на сухой вес бактериальных клеток. В том случае, когда используют поперечносшивающий реакционный продукт, полученный из глутарового альдегида, трихлорангидрида циануровой кислоты и полиаминового полимера, в соответствии с предварительным, вариантом, композицию следует получать из смеси 5,9 вес.% глутарового альдегида и 3,6 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты и 41,5 вес.% полиамино вого полимера в пересчете на общий U аминовом полимере. Затем готов т сочетани , которые указаны а табл.2. Затем обработанные бактериальные клетки фильтруют, экструдируют, высушивают и подвергают испытани м на определение их твердости. В табл.2 показана композици реакционной смеси дл получени поперечносшиващего реакционного проду.ста. Таблица 2 15 вес активнодействующих ингредиентов. По предпочтительному варианту эту композицию следует Также примен ть в количестве 18,2 весД в пересчете на сухой вес бактериальных клеток. Все бактериальные агрегаты, полученные в соответствии с изложенным, про вл ют способность к конверсии глюкозы во фруктозу. Практическое осуществление предлагаемого способа не ухудшает глюкозизомеразной активности . Основное преимущество и техникоэкономическа эффективность данного изобретени состоит в достижении твердости бактериального клеточного агрегата после повторной гидратации в сравнении с бактериальными клеточными агрегатами, получаемыми по ранее известным способам. ФормуТ1а изобретени 1. Способ полумени агрегата бактериальных клеток Streptomyces oliva ceus, предусматривающий выдерживани массы бактериальных клеток в контак те с поперечносшивающим агентом в щелочной среде в течение 0,,5 ч, отличающийс тем, что, с целью повышени твердости получае мого продукта, в качестве поперечно сшивающего агента используют продук взаимодействи 12-65,1 вес.% соединени , выбранного из группы,включающей глутаровый альдегид, трихлор ангидрид циануровой кислоты и их сочетание , и 88-3,9 вес.% водорастворимого катионоактивного полимера продукта полимеризации эпихлоргидрина с алкиленполиамином формулы , где К - низший алкилен, а Rq - низшие - алкилы, причем указанный поперечносшивающий агент используют в количестве 6,5-55 вес.% от сухого веса клеток, и процесс ведут при рН 8-9 и температуре 5-30°С с последующим выделением целевого продукта. 2.Способ по П.1, о тли ч а ющ и и с тем, что после выделени агрегат сушат. 3.Способ по п.1, о т л и ч а ющ и и с тем, что в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействи 57,1 весД глутарового альдегида и А2,9 вес. водорастворимого катионоактиеного полимера в количестве 17,5 вес. в пересчете на сухой вес клеток. . Способ по П.1, отличающийс тем, что в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействи ,9 вес. глутарового альдегида и 3,6 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты, вз тых в качестве глутарового альдегида и 41,5 вес.% водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 18,2 вес. в пересчете на сухой вес клеток.

Claims

Формула изобретения

1. Способ получения агрегата бактериальных клеток Streptomyces olivaceus, предусматривающий выдерживание массы бактериальных клеток в контакте с поперечносшивающим агентом в щелочной среде в течение 0,5-1,5 ч, отличающийся тем, что, с целью повышения твердости получаемого продукта, в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия 12-65,1 вес.% соединения, выбранного чающей глутаровый из группы,вклюальдегид, трихлор35

п.1, отличаючто в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия 57,1 вес.% глутарового альдегида и 42,9 вес.% водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 17,5 вес.% в пересчете на сухой вес клеток.

отличаюв качестве

4. Способ по п.1, щ и й с я тем, что поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия

54,9 вес.% глутарового альдегида и
3,6 вес.% трихлорангидрида циануровой кислоты, взятых в качестве глутарового альдегида и 41,5 вес.% водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 18,2 вес.% ?в пересчете на сухой вес клеток.