SU1344247A3 - Способ получени термически устойчивой бактериальной @ -амилазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к спосо- , бам получени  ферментных препаратов «(-амилазы и может быть использовано в химической, ферментной или пищевой промьшшенности. Цель и обретени  - повышение активности ai -амилазы.Сущность изобретени  заключаетс  в том, что в качестве продуцента термоста- , бильной J, -амилазы используют штамм Bacillus licheniformis АТСС 39326, который культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода , азота, минеральные компоненты и воду при рН 5,5-8,0, причем в качестве источника углерода предпочтительно используют лактозу в концентрации 5-15 мас.%. Изобретение позвол ет получить -амилазу с активностью 1500-2000 ликфон-мл или 10000 SKB единиц/мл после 72 ч культивировани  продуцента. 1 з.п. ф-лы. Ct (О О) 4: 4 Ю iU 1 СМ

Description

1

Изобретение относитс  к способам получени  ферментного препарата |,-амила зы иможет быть использовано в промьшшенностй моющих средств и при конверсии крахмала в водорастворимые углеводы в химической, ферментной или пищевой промьшшенностй.

Цель изобретени  - повьш1ение активности it-амилазы,

Способ заключаетс  в том,-что в качестве продуцента термостабильной 0 -амилазы используют штамм Bacillus licheniformis АТСС 39326, который культивируют в питательной ер де, содержащей в качестве источника углерода предпочтительно лактозу в услови х рН среды 5,5-8,0 при аэрировании и перемешивании. Целевой пр . дукт выдел ют известными методами.

Штамм Bacillus licheniformis хранитс  в Американской коллекции типовых культур микроорганизмов под номром AT СС 39326,

Испытываемые природные источники

ttf.-амилазы высевают на среду, содержащую крахмал, цитрат, фосфат аммони 

и Mg

fi

и небольшие количества Са и выращивают при 41 С, Культуры исследуют на .наличие осветленных зон вокруг колоний на агаре. Культуры, характеризующиес  большими зонами, распыл ют на большие пластины с крах мало-агаровой средой, содержащей агаровую среду с 0,5% гелеобразного крахмала Линтнера, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,2% цитрата натри , 0,5% фосфата аммони , 0,5% сульфата магни  и 0,008% Н,,0, 1,5% агара при рН 7, и выращивают при 40 С в течение 24-48 ч. Снова собирают культуры, продуцирующие большие осветленные зоны и сравнива от с контрольной культурой Б,licheniformis,

Культуры, выращенные в шейкерах в течение 5-8 сут, испытывают на аль фа-эмилазную активность в диапазоне 150 разжижений/мл. Затем культуры, про вл ющие адекватную активность, отбирают дл  проверки амилазной активности при 87 с,

Полученный , штамм имеет типичные характеристики-В,licheniformis, т,е  вл етс  грамположительным, спорооб- разующим микроорганизмом, способным к анаэробному росту и использующим пропинат аэробно. Особенностью этого организма  вл етс  то, что его et.-амилаза не требует экзогенного

ь

3442472

Са дл  активности при 87 С, а также его необычайно высокий уровень активности фермента при этой температуре .

Сравнение коммерческого фермента.

Клинтона и предлагаемого при 80 и 95 С показывает, что дл  «получени 

5

0

5

желаемого уровн  декстринизации за определенное врем  требуетс  меньшее количество фермента.

Ферментацию обычно осуществл ют в течение 2-6 дней при 25 - 55 С, с использованием обычных усво емых источников углерода, азота и других питательных веществ. Подход щими источниками углерода  вл ютс  углеводы (лактоза, глюкоза и крахмал) или ве-. щества, содержащие углеводы, такие как со , кукурузна  мука и т,п, и их смеси. Количество углевода можно значительно измен ть 1 - 25 мас,%/об, предпочтительно от 5 - 15 мас ,%/об. Наиболее предпочтительным источником углерода  вл етс  лактоза, поскольку в этом случае достигаютс  наилучшие показатели ферментной активности . Содержание лактозы в питательной среде 1 - 20 мае,7,/об, лред0 почтителен диапазон 5-15 мас,%/об. Лактозу можно использовать либо в качестве единственного источника углерода , либо в комплексе с другими источниками , такими как сыворотка и

5 соева  мука, при этом концентраци  последних должна составл ть не менее 5 мас,%/об.

Источник азота может быть органическим или неорганическим, например

0 растворимые нитраты или соли аммони . Источниками органического азота могут быть дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, мука земл ного ореха и т,п,

5 Микроорганизм выращивают в питательной среде в аэробных услови х, которые обеспечивают путем аэрировани  бродильных сосудов, обычно при скорости один объем воздуха на объем

0 среды.

Фермент выдел ют из реакционной среды после достижени  требуемых уровней ферментной активности изве- стньми способами, например осаждени5 ем фермента с использованием известных осадителей, таких как сульфат натри  или несмешиваемые с водой органические растворители ацетон или этанол, В результате центрифугирова313А4247

ни  или фильтровани  осадка с последующей его сушкой получают очищенный твердый фермент.

Способ осуществл ют следующим образом .

Bacillus licheniformis АТСС 39326 сеют штрихом на пластинку крахмального агара Difco и выращивают при 40 С в течение 18 ч,

Суспензией клеток инокулируют бульон следующего состава, %: дрожжевой экстракт 0,5; триптон 0,5; , 0,1; D-глюкоза 0,1. 350 мл на колбу емкостью I л. Культивируют при 40 с в течение 1-2 дней при скорости вращени  200 об/мин, на встр - хивателе Брансвик G-50 (2 -орбита).

Все содержимое колбы используют в качестве прививочного материала в объеме 3150 мл среды, имеющей сле. дующий состав, %: лактоза 10; 1,4 (лактозу и обрабатывают в автоклаве отдельно от других компонентов ) ; 0,6; (NH) SO 0,6; цитрат натри  0,3; соева  мука 3,0; CaCL 0,05; 1 ,0 мл МАгиДР бООО - пеногаситель. Исходное значение рН 6,8 - 7,0.

Среду стерилизуют в автоклаве в течение 60 мин при 121 С, общее количество 6,8 кг.

Дл  оптимального получени  . -амилазы рН культуральной среды должен быть ниже 8,0, но не ниже 5,5.

Дл  контрол  за возможным вспениванием при размножении предусмотрен противовспениватель МагиДР 6000.

25 зы).Встр хивают содержимое, выливают его в калиброванную квадратную трубку (13 мм) и-сравнивают со стандартным окрашенным диском в компараторе Гел- лиже. 1 мл внос т в йодный раствор

Услови  ферментации: скорость пе 40 дл  того, чтобы можно было более точремешивани  600 об/мин, температура культивировани  40 С, аэраци  среды 1 л об/об, воздуха, рН через 72 ч 6,5 - 7,0.

Измерение активности фермента -амилазы осуществл ют с помощью . стандартной технологии. Один из таких методов представл ет собой видоизмененный метод Вохлегермута, при котором активность определ ют во времени вываривани , необходимого дл  изменени  окраски, характеризующего определенную стадию декстринизации крахмала . Метод тарируют так, что концентрацию амилазы можно рассчитать непосредственно в ликфонах на грамм.

Аналитическое определение содержани  «(.-амилазы в ликфонах производ т следующим образом.

но определить точку кипени . При приблизительном достижении времени точки кипени  пробы необходимо извлекать через интервалы времени, равные 45 0,1 мин (6-12 с) .

Фиксируют, врем  и разбавление по завершении реакции и рассчитывают активность в ликфонах на грамм или 50 1 мл.

Расчет ферментативной активности производитс  по следующей формуле:

55

Ликфоны (или мл)

X растворение

Фактический вес (или объем в мл) пробы, X - врем  докстринизации, мин.

Готов т пробу раствора с использованием в качестве растворител  и разбавител  0,025 М раствора CaCl. так, что дл  5 мл готового разбавленного раствора врем  декстринизации составл ет 10 мин. Если приблизительна  активность ферментного препарата не известна, надлежащий размер пробы

0 и/или степень разбавлени  необходимо определить экспериментальньм путем. Внос т 5,0 мл разбавленного йодного раствора в пробирки диаметром 13 мм и высотой 200 мм, которые помё-

5 щают в вод ную баню с температурой

Q

30 с. Ввод т 10 мл крахмала Линтнера в пробирку диаметром 23 мм и высотой 200 мм и помещают ее в вод ную баню с температурой 30 С.

0 25 мл разбавленного раствора о -амилазы внос т в пробирки 23 х X 200 мм и став т их в вод ную баню с температурой 30 С. 5 мл разбавленной пробы неизвестного фермента до5 бавл ют в 10 мл раствора крахмала и после добавлени  половины неизвестного раствора ai -амилазы пускают се - кундомер и затем вливают оставшуюс  половину раствора из пипетки.

0 В соответствующие интервалы времени в пробирку, в которой находитс  отрегулированный разбавленный йодный раствор, добавл ют 1 мл гидролизую- ций смеси (крахмал, раствор о -амила5 зы).Встр хивают содержимое, выливают его в калиброванную квадратную трубку (13 мм) и-сравнивают со стандартным окрашенным диском в компараторе Гел- лиже. 1 мл внос т в йодный раствор

0 дл  того, чтобы можно было более точно определить точку кипени . При приблизительном достижении времени точки кипени  пробы необходимо извлекать через интервалы времени, равные 45 0,1 мин (6-12 с) .

Фиксируют, врем  и разбавление по завершении реакции и рассчитывают активность в ликфонах на грамм или 50 1 мл.

Расчет ферментативной активности производитс  по следующей формуле:

Ликфоны (или мл)

X растворение

Фактический вес (или объем в мл) пробы, X - врем  докстринизации, мин.

Растворы, используемые при описанном анализе, получают следующим образом ,

Раствор крахмала. Растворимый крахмал Линтнера (Юг) смешивают с 35 мл дистиллированной воды в колбе, которую затем нагревают до кипени  и выдерживают в течение 5 мин при температуре кипени  с посто нным перемешиванием . После этого раствор охлаждают до комнатной температуры и добавл ют 125 мл ацетатного буферного раствора и достаточное количество воды, довод т общий объем колбы до 500 мл. Добавл ют 1 мл толуола. Стабильность этого раствора провер ют с помощью стандартной пробы с. -амилазы известной концентрации.

Ацетатный буферный раствор. Взвешивают I моль ацетата натри  (82,Ог) и раствор ют его в 800 мл воды. Довод т рН до 6,2-0, с помощь уксусной кислоты и разбавл ют содержимое до 1 л. При приготовлении I л крахмального субстрата требуетс  20 мл раствора.

Разбавительный раствор хлористого кальци  0,025 М - раствор ют 11,1 г химически чистого безводного хлористого кальци  в 4 л воды.

Буферный раствор. Раствор ют 25,3 г гранул гидроокиси натри  и 340 г первичного кислого фосфата кали  в дистиллированной воде и довод т содержимое в мерной колбе до 2 л При достижении буферным раствором комнатной температуры довод т содержимое до объема (рН 6,2+0,1).

Основной йодный раствор. Раствор ют 5,50 г химически чистых кристаллов йода и 11,0 -г KI в и,0 и разбавл ют содержимое до 250 мл. Хран т раствор в темной бутыли.

Разбавленный йодный раствор, Раст- 45 пользуют лактозу в концентрации 5 - вор ют 20,0 г KI в Н20, добавл ют 15 мас,%,

ор Н.Гунько 4840/59

Составитель Е.Воробьева Техред А.Кравчук

Корре Подпи

Тираж 499 ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб,, д.4/5

.Производственно-полиграфическое предпри тие, г.Ужгород, ул.Проектна , 4

2,00 мл основного йодного раствора

и разбавл ют до 500 мл,

1

С помощью описанной методики активность полученной о(.-амилазы превышает 1500 - 2000 ликфон/мл против культуры В. licheniformis, 125 лик- фон/мл, полученных в ферментативной среде дл  известного продуцента в то врем , как те же культуры демонстрируют даже более низкие активности, а именно ниже 50 ликфон/мл, в известной среде.

Другим методом измерени  активности oL-амилазы  вл етс  видоизмененна  SKB технологи . В этих единицах известные культуры продуцируют менее 500 SKB единиц/мл, в то врем  как активность Bacillus licheniformis АТСС 39326 10000 SKB ед./мл.

Claims (2)

1. Формула изобретени 

   1,Способ получени  термически устойчивой бактериальной о(. -амилазы, предусматривающий культивирование продуцента бактерий Bacillus licheniformis в питательной среде, содержаей источники углерода, азота, минеральные компоненты и воду, в услови х аэрации и перемешивани  с послеующим вьщелением целевого продукта, отлич ающийс  тем, что,

   с целью повышени  активности лазы, в качестве продуцента из вида Bacillus licheniformis используют штамм бактерий Bacillus licheniforis АТСС 39326, а культивирование

   осуществл ют в услови х рН среды 5,5 - 8,0.
2. 2.Способ поп,1, отличающий с   тем, что в качестве источника углерода в питательной среде исКорректор А.Зимокосов Подписное