SU591154A3

SU591154A3 - Способ получени белка

Info

Publication number: SU591154A3
Application number: SU731915570A
Authority: SU
Inventors: Дазек Ярослав; Руд Траелнес Кнут
Original assignee: Сосьете Де Продюи Нестле С.А. (Фирма)
Priority date: 1972-05-03
Filing date: 1973-04-28
Publication date: 1978-01-30
Also published as: BE798386A; NL7305779A; FR2183129A1; DK132184B; DK132184C; US3933591A; NL156442B; SE393993B; JPS4941587A; GB1389789A; CH544809A; DE2321983A1; IT1048895B; FR2183129B1

Description

1

Изобретение относитс к области микробиологии и может быть использовано дл получени внутриклеточных веществ микробиологического происхождени : белков, ферментов, нуклеиновых кислот или пигментов.

Известен способ получени белка, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в присутствии антибиотика с последуюп1им выделением белка 1.

Однако по известному способу в питательную среду, содержащую микроорганизмы, добавл ют антибиотик с повышенной концентрацией , что вызывает нарущение кинетики роста микроорганизмов.

Целью изобретени вл етс повышение выхода целевого продукта.

Дл достижени поставленной цели перед введением антибиотика в ку.льтуральную среду определ ют его концентрацию в культуральной среде, нри которой приостанавливаетс рост микроорганизмов, а затем в питательную среду внос т антибиотик в количестве 5% от этой концентрации.

Способ заключаетс в следующе.м.

Питательна среда дл выращивани микроорганизмов содержит вещества, необходимые дл размножени клеток этих микроорганизмов , т. е. источники углерода и азота, например , углеводы и/или углеводороды, азотсодержащие вещества, минеральные соли. Она может содержать стимул торы роста, например витамины, а также кислород, если микроорганизм живет и размножаетс в аэробных услови х .

Микроорганизмы выращивают в ферментере , заполненном питательной средой, в услови х аэрации кислородом при температуре 20-50°С и рН 3,0-8,0. В питательную среду, желательно в показательной фазе роста .микроорганизмов , добавл ют антибиотик или смесь нескольких антибиотиков в таком количестве, чтобы рост не приостанавливалс и чтобы протеины , содержащиес в клетках, не выходили в питательную среду.

Согласно способу опреде.т ют р д концентраций , соответствующих системе «микроорганизм- антибиотик. Верхний предел этого р да может быть определен дл рассматриваемой системы путем измерени концентрации антибиотика питательной среды, начина от которой рост микроорганизма останавливаетс . Остановка роста происходит обычно некоторое врем после добавлени антибиотика в питательную среду. Дл бактерии Sarcina lutea

концентрации антибиотика в питательной ереде , при которых происходит остановка роста, составл ют 0,05 международной единицы (ME) дл пенициллина G, 100 мг/мл дл Д-циклосерина и 30 мг/мл - дл бактитрацина. Нижний предел этого р да концентраций составл ет как правило 5% значени верхнего предела р да. Это означает, что при более низких концентраци х ослабление клеточных перегородок становитс незначительным и не оказывает существенного вли ни на эффективность делени клеток в ходе последующего процесса разрыва.

Концентрацию антибиотиков в питательной среде дл рассматриваемой системы выбирают между двум крайними значени ми в зависимости от требований, предъ вл емых к способу . Концентраци антибиотиков, выбранна в верхнем пределе, вызывает некоторое уменьшение степени роста микроорганизма, сопровождающеес большим увеличением числа раздробленных клеток дл данного уровн энергии дроблени (например дл какого-то рабочего давлени гомогенизатора). Если изменение кинетики роста нежелательно, целесообразнее примен ть более слабые концентрации антибиотиков , что предполагает использование более мощной энергии дроблени (по сравнению с предыдущим случаем) дл получени той же эффективности дроблени .

Культуру микроорганизмов выдерживают в ферментере в течение нескольких часов, затем биомассу отдел ют от питательной среды, например центрифугированием, декантированием или фильтрацией, клетки промывают и перевод т в водную суспензию. Суспензию подвергают механической обработке гомогенизатором или соответствующей мельницей, вызывающих разрыв клеточных перегородок.

Пример 1. Бактерии Sarcina tea выращивают в 1,5 л стерилизованной водной нитательной среды, рН 6,5 которой устанавливают до стерилизации. Состав этой среды следующий,°/о;

NH4Ce0,100

М§5Од-7НгО0,050

К2НРО40,100

Ре5О4-7НгО0,001

CaCej1,010

Пептон1,000

Дрожжевой экстракт0,500

Сахароза0,500

ВодаДо 100Выращивание продолжают 24 ч при 25°С в аэробных услови х в колбе, взбалтываемой путем вращени . Затем полученную культуру В8ОДЯТ в 9 л водной питательной среды, наход щейс в 14-литровом ферментере. Эта питательна среда имеет тот же состав, что и вышеописанна , но содержит 1% дрожжевого экстракта и 2% сахарозы.

Бактерии выращивают в ферментере при 25°С, перемешива питательную среду мещалкой , вращающейс со скоростью 250 об/мин; вентил ци обеспечиваетс путем подачи 7 л воздуха в минуту прИ атмосферном давлении.

В показательной фазе роста в питательную среду добавл ют пенициллин G с таким расчетом , чтобы получить концентрацию пенициллина , равную 0,04 Международной единицы (ME) на I мл питательного бульона. Культуру бактерий выдерживают 9 ч, а затем отдел ют бактерийные клетки от питательной среды путем центрифугировани .

Полученные клетки про.мывают и помещают во взвешенном состо нии в воду из расчета 30 г сухого вещества на 1 л воды. Затем водную суспензию обрабатывают .механическим путем в дробильной установке R1B1 при давлеНИИ 700-1000 атм.

Количество разорванных клеток, определенное путем дозировани освобождающегос азота , составл ет 20°/о от общего числа клеток. Аналогична механическа обработка, проведенна с клетками Sarcina uiea, выращенными при тех же услови х, но при отсутствии антибиотиков, вызывает разрыв только 4% клеток .

в то же врем добавление 0,04 ME пенициллина G на 1 мл питательной среды увеличивает лищь на 10% врем димеризации микроорганизма , т. е. оказывает очень незначительное вли ние на кинетику воспроизводства микроорганизма .

Пример 2. Бактерии Bacillus megaterium выращивают в 0,5 л питательной водной среды, рН которой устанавливают 6,5 до стерилизации. Состав среды, %:

(NH4)2HPO41,000

К2НР040,500

-.NaaSOi0,500

MgS04-7H200,400

FeSO4-7H2O0,002

NaCe0,002

Дрожжевой экстракт0,025

Жидкость мацерации кукурузы0,025

Сахароза2,000

Вода.До 100,

Выращивание продолжают 24 ч при 30°С в аэробных услови х и при помешивании путем встр хивани . Затем 5% полученной культуры ввод т в 9 л водной питательной среды, наход щейс в 14-литровом ферментере и имеющей тот же химический состав, что и инкубационна среда. Бактерии выращивают при 30°С, пере.мещивании со скоростью 250 об/мин, расходе воздуха 7 л в 1 мин, при атмосферном давлении. В показательной фазе роста в питательную среду добавл ют 4 мг/мл бактитрацина . После 9 ч роста в этих услови х бактерийные клетки отдел ют от питательной среды путем центрифугировани .

Собранные, промытые и помещенные в водную суспензию клетки подвергают механической обработке аналогично примеру 1.

Количество разорванных клеток, определенных по способу, описанному в примере 1, составл ют 61% от общего, числа клеток. Аналогична механическа обработка клеток Bacillus megaterium, выращенных в тех же услови х , но без добавки антибиотиков, вызывает разрыв 26% клеток.