DE2321983A1

DE2321983A1 - Verfahren zur gewinnung von intrazellularen stoffen von mikroben

Info

Publication number: DE2321983A1
Application number: DE2321983A
Authority: DE
Inventors: Jaroslav Dasek; Knut Rude Traelnes
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1972-05-03
Filing date: 1973-05-02
Publication date: 1973-11-15
Also published as: DK132184B; GB1389789A; BE798386A; NL7305779A; SE393993B; SU591154A3; FR2183129B1; NL156442B; JPS4941587A; CH544809A; IT1048895B; DK132184C; US3933591A; FR2183129A1

Description

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Wltf cftniayartirala 41 Tel £06196

Societe des Produits Nestle 5 A* in Vevey / Schweiz

Yerfahreii zur Gewinnung von intrazellularen Stoffen von Mikroben

Die Erfindung bezieht sich auf die Gewinnung von intrazellularen Stoffen von Mikroben, wie z.B. Proteine, Enzyme, Nukleinsäuren oder Pigmente.

Bei der industriellen Gewinnung dieser intrazellularen Stoffe, insbesondere der Proteine von Mikroben, ist im allgemeinen eine Extraktion dieser Stoffe aus den Zellen der Mikroorganismen erforderlich. Bei dieser Extraktion müssen die in den Mikrobenzellen enthaltenen Stoffe die Sperrschicht durchdringen, welche durch die Wand der Zellenhülle gebildet wird, und es ist dabei häufig nötig, diese Zellenwand anzugreifen, um eine ausreichende Extraktionsausbeute zu erzielen.

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Dies kann durch eine chemische oder enzymatisch^ Hydrolyse der Stoffe, welche die Zellenwand bilden, geschehen. Die chemische Hydrolyse, welche im allgemeinen in einer energischen Weise ausgeführt wird, ruft häufig eine Verringerung des !Nährwerts der Proteine hervor, die in Freiheit gesetzt werden sollen. Außerdem müssen bei e;Lner solchen chemischen Hydrolyse Hydrolysemittel zugesetzt werden, die später wieder vom Produkt abgetrennt werden müssen. Die enzymatische Hydrolyse erweist sich dagegen im allgemeinen als zu teuer, als daß sie im Rahmen eines industriellen Verfahrens verwendet werden könnte.

Ein anderes bekanntes Verfahren besteht darin, daß man zum Kulturmedium der Mikroorganismen ein Antibiotikum in einer erhöhten Konzentration zugibt, um die Abgabe der intrazellularen Stoffe, insbesondere der Proteine, direkt in das Kulturmedium zu fördern. Dieses Verfahren, bei welchem beträchtliche Mengen Antibiotika verwendet werden müssen, ist aus wirtschaftlichen Gründen verhältnismäßig uninteressant und weist.außerdem den Nachteil auf, daß die Wachstumskinetik des Mikroorganismus stark beeinträchtigt wird. Schließlich müssen bei diesem Verfahren die abgegebenen Stoffe und das Kulturmedium getrennt werden, wobei letzteres beträchtliche Mengen Ausgangsstoffe im Verhältnis zu den" Mengen der extrahierten Stoffe enthält.

Ein anderes bekanntes Verfahren besteht darin, daß man die Zellenwände zerbricht, indem man die Zellen mechanischen Krafteinwirkungen mit Hilfe von Zerkleinerungseinrichtungen unterwirft, wie z.B. mit speziellen Mühlen, Homogenisatoren oder Ultraschalleinrichtungen. Die

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mechanische Widerstandsfähigkeit der Zellenwände ist aber derart groß, daß das Zerbrechen dieser Wände im allgemeinen nur bei einem verhältnismäßig kleinen Teil der Zellen stattfindet. Dabei wird häufig im Rahmen eines industriellen Verfahrens nur eine unzureichende Extraktionsausbeute erhalten.

Das vorliegende l/erfahren bezieht sich nunmehr auf ein Verfahren zur Gewinnung von intrazellularen Stoffen von Mikroben, das besonders einfach ist und das die Erzielung zufriedenstellender Ausbeuten gestattet. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einem geeigneten Nährmedium einen Mikroorganismus kultiviert, und zwar in Gegenwart mindestens eines Antibiotikums in einer Menge, die ausreicht, die Zellenwände der Mikroorganismen zu schwächen, die aber nicht ausreicht, das Wachsen des Mikroorganismus zu verhindern oder eine Abgabe von intrazellularen Stoffen in das Kulturmedium hervorzurufen, daß man hierauf die Wände mindestens eines Teils der Zellen der Mikroorganismen zerbricht und daß man schließlich mindestens einen Teil der intrazellularen Stoffe gewinnt.

Der Ausdruck "geeignetes Nährmedium" wird in dieser Beschreibung für ein Medium verwendet, welches die zum Leben und zur Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus nötigen Stoffe enthält. Beispiele für solche Stoffe sind Quellen für.Kohlenstoff und Stickstoff, wie z.B. Kohlehydrate und/oder Kohlenwasserstoffe, und stickstoffhaltige Stoffe, wie auch die Mineralsalze. Das Nährmedium kann auch Wachstumsfaktoren enthalten, wie z.B. Vitamine, und auch Sauerstoff, sofern der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen lebt und sich vermehrt .

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Weiterhin bedeutet der Ausdruck "um die Wände der Zellen des Mikroorganismus zu schwächen" in dieser Beschreibung, daß in der Struktur und/oder der Geometrie der Wände Fehler hervorgerufen werden, die nicht in den Wänden von Zellen existieren, welche in einem kein Antibiotikum enthaltendem Medium kultiviert worden sind, wobei diese Fehler eine Verringerung der mechanischen Widerstandsfähigkeit der Zellen hervorrufen, ohne daß die Zellen-, hülle aufgebrochen oder geöffnet wird.

Die auf diese Weise erhaltenen Mikrobenzellen werden dann einer mechanischen Behandlung unterworfen, welche ein Zerbrechen der Zellenwände und eine Infreiheitsetzung der in diesen Zellen enthaltenen Stoffe zur Folge hat. Es ist zwar nicht unbedingt erforderlich, aber es wird bevorzugt, die Biomasse vom Kulturmedium vor der mechanischen Zerbrechungsbehandlung abzutrennen. Dieser Vorgang, der in irgendeiner geeigneten Maßnahme bestehen kann, wie z.B. Dekantation, Filtration oder Zentrifugation, gestattet eine beträchtliche Verringerung der im Verlaufe der Zerbrechungsbehandlung zu behandelnden Materialmengen.

Die auf diese Weise behandelte Zellenmasse, d.h. nach dem mechanischen Zerbrechen der Zellenwände, kann für die Fabrikation einer Reihe von Produkten verwendet werden, die sich von Klebstoffen und Harzen bis zu proteinhaltigen Nahrungsmitteln erstrecken. Beispielsweise kann man die Bruchstücke der Zellenwände vom Protein durch Zentrifugation abtrennen, nachdem letzteres nötigenfalls löslich gemacht worden ist, worauf· man dann das ■^rotein ausfällt, beispielsweise durch Ansäuern. Gemäß einer Variante kann das Protein einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen werden, welche die Herstellung von Peptiden gestattet, die dann mit einer geeigneten Technik (Aus-

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fällung, Abtrennung, Waschung usw.) gewönneη werden. Die Masse der zerkleinerten Zellen kann auch direkt verwendet werden, beispielsweise um durch Spinnen oder Extrusion Formgegenstände herzustellen, wobei der pH entsprechend eingestellt wird, um das Protein löslich zu machen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat sich bei Bakterien als besonders wirksam erwiesen. Beispielsweise hat sich gezeigt, daß man eine einer Zerbrechungsbehandlung unterworfene bakterielle Biomasse, die durch dieses Verfahren erhalten worden ist, ohne Schwierigkeiten durch Spinnen in Proteinfasern überführen kann.

Eine zweckmäßige Konzentration an Antibiotikum im Kulturmedium, welche die Erzielung des gewünschten Effekts gestattet, d.h. die Schwächung der Zellenwände des Mikroorganismus, ist eine Funktion der Natur'des Mikroorganismus und der Natur des Antibiotikums. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfordert also die Bestimmung des Bereichs der Konzentrationen, welche bei dem verwendeten Mikroorganismus/Antibiotikum-System zweckmäßig ist. Der obere Grenzwert dieses Bereichs kann für das in Betracht gezogene System dadurch bestimmt werden, daß man die Konzentration des Antibiotikums im Kulturmedium mißt, bei der das Wachstum des Mikroorganismus verhindert wird. Diese Verhinderung des Wachstums dauert im allgemeinen nach der Zugabe des Antibiotikums zum Kulturmedium noch eine gewisse Zeit. Beispielsweise sind die Antibiotikumkonzentrationen im Kulturmedium, bei denen das Wachstum aufhört, für das Bakterium Sarcina lutea 0,05 internationale Einheiten für Penicillin G, 100 Jig/m.1 für D-Gycloserin und 30^gAiI für Bacitracin, Die untere Grenze dieses

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Konzentrationsbereichs liegt im allgemeinen in der Größenordnung von 5% des Werts für die obere Grenze dieses Bereichs. Bei Konzentrationen unter diesem Grenzwert . ist die Schwächung der Zellenwände unzureichend und ergibt keinen wesentlichen Einfluß auf das Ausmaß der Zerbrechung der Zellen im Verlauf der anschließenden Zerbrechungsbehandlung. Die Wahl der Konzentration'an Antibiotikum im Kulturmedium kann bei einem in Betracht gezogenen Systems zwischen diesen beiden Grenzwerten erfolgen, und zwar entsprechend den speziellen Forderungen des verwendeten Verfahrens. So kann man beispielsweise eine Antibiotikumkonzentrationeauswählen, die im oberen Teil des brauchbaren Bereichs liegt, was eine gewisse Verringerung der Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus mit sich bringt, wobei gleichzeitig eine beträchtliche Zunahme der Anzahl der zöücleinerten Zellen bei einer bestimmten Zerkleinerungsenergie stattfindet (beispielsweise für einen gewissen Arbeitsdruck bei einem Homogenisator). Wenn es dagegen erwünscht ist, die Wachstumskinetik des Mikroorganismus nicht wesentlich zu beeinflussen, dann kann man schwächere Antibiotikumkonzentrationen verwenden, was bedeutet, daß man eine höhere Zerbrechungsenergie als im vorhergehenden Fall verwenden muß, um eine Zerbrechungsquote in der gleichen Größenordnung zu erzielen.

Gemäß einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium kultiviert, worauf dann die erhaltene Kultur in ein Nährmedium, das sich in einem Fermentator befindet, eingebrächt wird. Das Wachstums des Mikroorganismus wird dadurch unterhalten, daß man - im Medium insbesondere- eine richtige Sauerstoffzufuhr sicherstellt und daß man das

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Medium auf eine geeignete Temperatur (im allgemeinen in der Größenordnung von 2C bis 50⁰G) und auf einen geeigneten pH-Wert (im allgemeinen zwischen 3»0 und 8,0) hält.

Hierauf wird dem Kulturmedium ein Antibiotikum zugesetzt, vorzugsweise während der Phase des exponentiellen Wachstums des Mikroorganismus, und zwar in einer Menge, daß das Wachstum nicht gestoppt wird und daß die in den Zellen enthaltenen Proteine nicht in das Kulturmedium abgegeben werden. In den meisten Fällen beeinflußt dieser Zusatz die Kinetik der "Vermehrung des Mikroorganismus nur ganz leicht, und außerdem wird die daraus resultierende Wachstumsgeschwindigkeit um höchstens 20% herabgesetzt. Die Kultivierung des Mikroorganismus unter diesen Bedingungen wird mehrere Stunden fortgesetzt, worauf dann die Biomasse vom Kulturmedium, beispielsweise durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtration, abgetrennt, dann gewaschen und in eine wässrige Suspension gebrachtwird. Diese Suspension wird dann einer mechanischen Behandlung unterworfen, beispielsweise durch Ultraschall oder mit Hilfe eines Homogenisators oder_ einer geeigneten Mühle, wodurch die Zellenwände zerkleinert werden.

Gemäß einer Variante dieser ersten Ausführungsform kann man dem Kulturmedium ein Gemisch von mehreren Antiobiotika in solchen Mengen zusetzen, daß die Vermehrung der Zellen nicht beeinträchtigt wird und daß die Zellenproteine nicht' in das Kulturmedium abgegeben werden.

Gemäß einer zweiten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens wird die Kultivierung des Mikroorganismus durchgehend in einem Fermentator durchgeführt. Hierzu wird

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der Fermentator kontinuierlich mit einem geeigneten Nährmedium beschickt, das ein oder mehrere Antibiotika enthält. Der Gehalt an Nährstoffen und die Beschickung mit Nährstoffen dieses Mediums werden so eingestellt, daß das Wachstum des Mikroorganismus nicht unterbrochen wird und daß die Zellenproteine nicht in das Kulturmedium abgegeben werden. Die Biomasse, die durch Zentrifugierung des Abflusses des Fermentators abgetrennt wird, wird, vorzugsweise nach einer Waschung, in eine wässrige Suspension gebracht, und nach einer bekannten Technik mechanisch behandelt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, welches nicht auf die dort beschriebenen Bedingungen beschränkt ist.

In diesen Beispielen sind die Mengen und Prozentangaben in Gewicht ausgedrückt.

Beispiel 1

Man kultiviert das Bakterium Sarcina lutea in 1,5 1 eines sterilisierten wässrigen Nährmediums, dessen pH vor der Sterilisierung auf 6,5 eingestellt wird. Die Zusammensetzung des Mediums ist wie folgt:

NH₄Cl	0,1
MgSO₄.7H₂O	0,05.
K\|HE0₄	0,1
FeSO,.. 7H_o0	0,001
CaCl₂	0,001
Pepton	1,0
Hefeextrakt	0,5
Saccharose	0.^

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destilliertes Wasser ad 100 %

Man führt diese Kultivierung 24 st bei 25°C unter aeroben Bedingungen in einer durch Rotation geschüttelten Flasche durch. Hierauf impft man mit der erhaltenen Kultur 9 eines wässrigen Kulturmediums, das sich in einem 14 1 fassenden Fermentator befindet. Dieses Kulturmedium besitzt die gleiche Zusammensetzung wie das oben beschriebene Medium, außer daß die Gehalte an Hefeextrakt und an Saccharose auf 1% bzw. 2% erhöht sind.

Das Wachstum der Bakterien im Fermentator wird bei einer Temperatur von 25°C unter Rühren des Kulturmediums

mit
mit einem Rührer, der sich/250 U/min dreht, durchgeführt, wobei eine Belüftung mit 7^/min bei atmosphärem Druck durchgeführt wird.

Während der Phase des exponentieIlen Wachstums fügt man dem Kulturmedium Penicillin G in einer Menge zu, daß die Konzentration an Penicillin 0,04- internationale Einheiten je ml Kulturmedium beträgt.

Die Kultivierung der Bakterien führt man 9 st lang durch, worauf man die Bakterienzellen vom Kulturmedium durch Zentrifugieren abtrennt. Die gewonnenen Zellen werden gewaschen und in Wasser suspendiert, und zwar in einer Menge von 80 g Trockenstoffe/1 Wasser. Diese wässrige Suspension wird hierauf mechanisch in einem RIBI-Zerkleinerungsapparat (hergestellt durch Ivan Sorvall Inc., Norwalk, Conn.) behandelt, und zwar bei einem Druck zwischen 700 und 1000 at.

Die Menge der zerbrochenen Zellen, bestimmt durch Messung des in Freiheit gesetzten Stickstoffs, macht ungefähr 20% der gesamten Anzahl der Zellen aus.

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Eine identische mechanische Behandlung, die mit Zellen von Sarcina lutea, die unter den gleichen Bedingungen kultiviert* worden sind, durchgeführt wird, aber unter Abwesenheit von Antibiotikum ergibt nur ein Zerbrechen von 4% der Zellen.

Dagegen ergibt der Zusatz von Penicillin G zum Kulturmedium in einer Menge von 0,04 internationalen Einheiten je ml Kulturmedium nur eine Zunahme der 'Verdoppelungszeit der Mikroorganismen um 10%. Es ist also ersichtlich, daß dieser Zusatz auf die Kinetik der Vermehrung des Mikroorganismus nur einen geringen Einfluß ausübt.

Beispiel 2

Man kultiviert das Bakterium Bacillus megaterium in 0,5 1 eines wässrigen Nährmediums, dessen pH vor der Sterilisation auf 6,5 eingestellt worden ist. Die -Zusammensetzung des Mediums ist wie folgt:

JKH₄O₂HPO₄	1 %
K₂HPO₄	0,5 %
Na₂SO₄	0,5 %
MgSO₄.7H₂O	0,4 %
PeSO₄.TH₂O NaGl	0,002% 0,002%
Hefeextrakt	0,025%
durch Macerierüng von Mais erhaltene !Flüssigkeit	0,025%
Sacöharose	2,0 %
destilliertes Wasser ad	100 %
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Man führt die Incubation während 24 st bei 3O⁰O unter aeroben Bedingungen mittels eiaes'Schüttlers durch. Hierauf impft man mit 5% des erhaltenen Mediums 9 1 eines wässrigen Kulturmediums, das sich in einem 14 1 fassenden Fermentator befindet und die gleiche chemische Zusammensetzung wie das Incubati onsme dium aufweist.

Das Wachsen der Bakterien wird bei einer Temperatur von 30⁰G unter Rühren mit 250 U/minjunter einem Luftzusatz von 7 Vmin und unter atmosphärischem Druck ausgeführt.

Während des exponent ie Ilen Wachstums fügt man dem Kulturmedium 4 yttg/ml Bacitracin zu.

"Nach einer 9 st dauernden Kultivierung unter diesen Bedingungen trennt man die Bakterienzellen vom Kulturmedium durch Zentri£ugierung ab» Die gewonnenen Zellen» welche gewaschen und in eine wässrige Suspension gebracht worden sind, werden wie in Beispiel 1 einer mechanischen Behandlung unterworfen.

Die Menge der gebrochenen Zellen, die wie in Beispiel 1 bestimmt worden ist, beträgt 61% der Gesamtzahl der Zellen. Eine identische mechanische Behandlung, die mit den Z§llen von Bazillus »egaterium durchgeführt wird, welche unter den gleichen Bedingungen aber ohne Antibiotikum kultiviert worden sind, ergibt ein Zerbrechen von 26% der Zellen..

.Beispiel 3

Man kultiviert ein Bakterium Micrococcus cerificans in einem wässrigen Nährmedium, dessen Zusammensetzung wie folgt ist:

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0,5 %

1\T_ QO ■ Γ\ ΓΙ θ/

JMa₂b0₄ 0,5 /o

MgSO₄.7H₂O 0,4 %

FeSO₄.7H₂O 0,002 %

NaCl 0,002 %

Hefeextrakt 0,025 %

durch Macerierung von

Mais erhaltene Flüssigkeit 0,025 %

Gemisch von linearen

^C12~^C20~^{Paraffinen 2}'° ^0//°

destilliertes Wasser ad 100 %

Man führt die Kultivierung in einem Fermentator bei 30⁰C unter aeroben Bedingungen durch und fügt dann während der Phase des exponentiellen Wachstums der Mikroorganismen Cycloserin in einer Menge von 100 JJU& Cycloserin/ml Nährmedium hinzu.

Nach einer 9-stündigen Kultivierung unter diesen Bedingungen' werden die Zellen isoliert und mechanisch wie in Beispiel 1 behandelt. Die Mengen der zerbrochenen Zellen sind bei einer in Gegenwart von Antibiotikum durchgeführten Kultivierung und bei einer ohne Antibiotikum durchgeführten Kultivierung 75% bzw . 57%·

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Beispiel 4-

Man führt eine kontinuierliche Kultivierung des Bakteriums Bacillus megaterium durch. Hierzu führt man in einen Fermentator ein Medium ein, das durch Kultivierung des Bakteriums in dem in Beispiel 2 beschriebenen Medium und unter den gleichen Bedingungen (ohne Zusatz von Antibiotikum) erhalten worden ist. Der Fermentator wird kontinuierlich mit Nährstoffen beschickt, die sich in einem Nährmedium befinden, das mit dem vorhergehenden identisch ist, dem aber Penicillin G in einer Menge von 1,5 internationalen Einheiten/ml zugesetzt worden ist.

Die durch Zentrifugierung des Abflusses des Fermentators abgetrennte Biomasse wird gewaschen, in eine wässrige Suspension gebracht und mit Hilfe eines Manton-Gaulin-Homogenisators unter einem Druck von 700 at behandelt.

Die mechanische Behandlung ergibt ein Zerbrechen von 65% der kultivierten Zellen, wogegen eine Behandlung von Zellen des gleichen Organismus, die unter Abwesenheit eines Antibiotikums unter den gleichen Bedingungen kultiviert worden sind, nur ein Zerbrechen von 20% der Zellen.ergibt.

Beispiel 5

Man führt eine kontinuierliche Kultivierung des Bakteriums Sarcina lutea in dem in Beispiel 1 beschriebenen Kulturmedium durch. Das Kulturmedium, welches kontinuierlich in den Fermentator eingeführt wird, enthält einen Gehalt an Penicillin G von 0,04 internationalen Einheiten/ml.

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Die vom Abfluß des Reaktors abgetrennten Zellen, welche gewaschen und in eine wässrige Suspension gebracht worden sind, werden wie in Beispiel 4- behandelt. 25% der Zellen werden zerbrochen, wogegen nur 5% der Zellen zerbrochen werden, die unter den gleichen Bedingungen behandelt aber in Abwesenheit eines Antibiotikums kultiviert worden sind.

Beispiel 6

Man kultiviert das Bakterium Lactobacillus helveticus ATGC Ur. I58O7 unter anaeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches aus einer Lösung von 6 Gew.-% der Feststoffe von Magermilch und 0,1 Gew.-% der Macerierungsflüssigkeit von Mais in entsalztem Wasser besteht, wobei diese Lösung 30 min durch Erhitzen auf 120⁰G sterilisiert worden ist. Die Kultivierung wird in einem 14 1 fassenden Fermentator bei einer Temperatur von 42°C ausgeführt, wobei das Mischen durch langsamen Drehen des Eührers mit I5 U/min durchgeführt wird und der pH-Wert des Mediums durch Zusatz einer verdünnten wässrigen Lösung von Kaliumhydroxid auf 5>5 gehalten wird. 5 st nach der Beimpfung des Kulturmediums mit dem Bakterium fügt man eine sterile Lösung von Penicillin G in einer Menge zu, daß das Medium eine Konzentration von 0,03 internationalen Einheiten/ml enthält. Hierauf führt man die Kultivierung 15 st- unter diesen Bedingungen durch und entnimmt 9 1 von dem erhaltenen Kulturmedium. Hierauf trennt man die Zellen von dem Kulturmedium durch Zentrifugation ab, wäscht diese dann und bringt sie in eine wässrige Suspension. Diese wässrige Suspension wird mechanisch in einem Manton-Gaulin-Homogenisator unter einem Druck von 700 at behandelt, wobei ein

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einziger Homogenisieriingsvorgang durchgeführt wird. Diese mechanische Behandlung ergibt ein Zerbrechen von 90% der Zellen. Wenn die gleiche Behandlung auf 9 1 einer Suspension von Zellen des gleichen Mikroorganismus angewendet wird, die durch Kultivierung in dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen aber ohne Zusatz von Antibiotikum im Kulturmedium erhalten worden sind, dann zerbrechen nur 55% der Zellen.

Beispiel 7

Man kultiviert kontinuierlich das Bakterium Sarcina lutea in einem wässrigen Mhrmadium, dessen Zusammensetzung wie folgt ist:

HH₄Cl	0,1
MgSO₄.7H₂O	0,05
K₂HPO₄	0,1
FeSO₄.7H₂O	0,001
CaCl₂	0,001
Pepton	1,0
Hefeextrakt	0,5
Saccharose	1,5
destilliertes Wasser ad-	100

Dieses Nährmedium, welches in den Fermentator kontinuierlich eingeführt wird, besitzt einen Gehalt an Penicillin G von 0,04 internationalen Einheiten/ml. Die Kultivierung wird bei einer Temperatur von 2£°C unter aeroben Bedingungen und unter Rühren mit 400 U/min durchgeführt.

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Die vom Abstrom des Reaktors abgetrennten Zellen, welche gewaschen und in eine wässrige Suspension gebracht worden sind, werden mechanisch mit Hilfe eines Dyno-Mill-Homogenisators in einer Menge von 5 l/st behandelt, wobei die Vorrichtung mit Glaskugeln eines Durchmessers von 0,2 mm ausgerüstet ist. 85% dieser Zellen werden zerbrochen. Wird die gleiche mechanische Behandlung auf eine Suspension von Zellen angewendet, die unter den gleichen Bedingungen aber ohne Antibiotikum kultiviert worden sind, dann zerbrechen nur 65% der Zellen.

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Claims

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Patentansprüche

("f) Verfahren zur Herstellung von intrazellularen Stoffen von Mikroben, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium in Gegenwart mindestens eines Antibiotikums kultiviert, dessen Ilenge ausreicht, die Zellenwände des Mikroorganismus zu schwächen, die aber nicht ausreicht, das Wachstum des Mikroorganismus zu unterbrechen und eine Abgabe von intrazellularen Stoffen in das Nährmedium, hervorzurufen, daß man hierauf die Wände mindestens eines Teils der Zellen des Mikroorganismus zerbricht und daß man schließlich mindestens einen Teil der intrazellularen Stoffe gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen des Mikroorganismus "vom Nährmedium abtrennt, bevor man die Wände mindestens eines Teils der Zellen zerbricht.

3· - Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum dem Kulturmedium während der Phase des exponentieIlen Wachstums des Mikroorganismus zugibt.

¹Vm Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß man als Antibiotikum Penicillin G verwendet.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 "bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antibiotikum Bacitracin verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum Cycloserin verwendet.

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