NO167304B - Fremgangsmaate for fremstilling av eksocellulaere biopolymerer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av eksocellulære biopolymerer i faststoffutbytte på minst 5 vekt-% i et kulturmedium ved aerob dyrking av mikroorganismene i en oljefase av en vann/oljeemulsjon.

Gjenstand for europeisk søknad 0 058 364 er en fremgangsmåte for fremstilling av Xanthomonas-biopolymere ved aerob dyrking av mikroorganismer av slekten Xanthomonas i et vandig næringsmedium, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at mikroorganismene dyrkes i en under fermenteringsbetingelser stabil vann-i-olje-emulsjon (W/O-emulsjon). Man kan da gå fram således at man begynnelsesdyrker mikroorganismen i første rekke i olje-fritt, vandig næringsmedium, deretter under tilsetning av oljefasen danner en W/O-emulsjon og viderefører fermenteringen under opprettholdelse av W/O-emulsjonen. Fortrinnsvis arbeides i nærvær av W/O-emulgatorer, idet hensiktsmessig i første rekke oppløses W/O-emulgatoren i oljefasen og denne oppløsning blandes deretter med den vandige fase.

Gjenstand for den europeiske patentsøknad 0 098 473 er en videreutvikling av denne fremgangsmåte dithen at i slike W/O-emulsjoner dyrkes mikroorganismestammer som danner generelt eksocellulære biopolymere med fortykningsvirkning for det vandige næringsmedium, som ikke tilhører slekten Xanthomonas. Eksempelvis er det nevnt gram-positive eller gram-negative bakteriestammer, gjær, sopp eller alger. En tilsvarende lære gis i US-patent 4 352 882, idet også der er dyrkingen av Xanthomonasstammer gitt spesiell betydning.

Ved anvendelsen av slike W/O-emulsjoner ved den aerobe dyrking av eksempelvis xanthandannende Xanthomonasstammer, kan det på flere måter oppnås viktige fordeler. Utgangspunkt for undersøkelsene var ved valg av W/O-emulsjonsteknikk å mildne resp. å fjerne vanskelighetene som inntrer i den vandige fermentasjonsfase for fremgangsforløpet ved den økende for-tykning som utløses ved som fermenteringsprodukt dannede polysakkarid. Ved arbeider med rene vandige næringsmedier er utbytter på 2 til 3-vekt-% xanthan (tørrstoff) allerede å vurdere som godt resultat, som bare kan fåes under anvendelse av spesialforholdsregler som krever sterk energi. Ved overgang til dyrking av de polysakkariddannende mikroorganismestammer i den vandige disperse fase av W/O-emulsjoner lykkes i første rekke en senking av væskefasens viskositet i fermentorer under fermenteringsbetingelser, da viskositeten av det samlede system i første rekke bestemmes ved den homogene oljefase. Det er også allerede blitt fastslått at ved overgangen til slike W/O-emulsjonssystemer kan det fåes forbedrede xanthanutbytter i den disperse vandige fase sammenlignet til arbeidet med et rent vandig dyrkingsmedium.

Den europeiske patentsøknad 0 135 123 vedrører en fremgangsmåte til nedsettelse av viskositeten av fermenteringsvæsker ved tilsetning av et halogenert hydrokarbon og dannelse av tilsvarende W/O-emulsjoner. Derved anvendes som halogenerte hydrokarbonfaser ugiftige, under fermenteringsbetingelsene flytende, høyt halogenerte alifater, som spesielt er per-halogenert. Det sees bort fra anvendelsen av emulgatorer. Denne lære går ut fra erkjennelser ifølge hvilke de tidligere omtalte fremgangsmåter til xanthandannelse i W/O-emulsjoner fører til at viskositeten av det samlede medium eventuelt ikke bare nedsettes, men sogar økes. Denne fare skal spesielt bestå ved anvendelse av emulgatorer.

Ytterligere undersøkelser har ikke kunnet bekrefte

disse vanskeligheter. Det dukker derimot ved forsøk av optimering av fremgangsmåtebetingelsene opp en motsatt rettet problematikk: To for den økonomiske gjennomføring av en slik mikroorganisme-dyrkings-fremgangsmåte i W/O-emulsjoner vesentlige fremgangs-

måteparametere kompletterer seg ved deres optimering således på uønsket måte at W/O-emulsjonene tenderer til å bryte og dermed til faseadskillelse, idet det vanskelig eller umulig ved enkle midler, spesielt ved røring, igjen å opprettholde den ønskede tilstand av den findisperse W/O-emulsjon. De to frem-gangsmåteparametere som det her dreier seg om, er for det første mengden av oljefase og for det annet en økende anrikning av faststoff-fasen med det ekstracellulære polysakkarid, dvs. utbyttet i den disperse vandige fase.

Det er ønskelig å arbeide med minst mulige mengder av oljefaser for å holde omkostningene av den samlede fremgangsmåte så lavt som mulig. For det annet er det selvsagt at høyest mulige utbytter av ekstracellulært polysakkarid med fortykningsvirkning tilstrebes i den disperse vandige fase. Det viser seg nå at den nevnte ustabilitet av W/O-emulsjonene er å frykte, når mengden av oljefasen senkes så meget som mulig og samtidig drives utbyttet av ekstracellulært polysakkarid i den disperse vandige fase så høyt som mulig. I denne for fremgangsmåtens økonomi spesielt gunstige kombi-nasjon av de to parametere er det å regne med alvorlige fremgangsmåteforstyrrelser ved uønsket og irreversibel faseadskillelse, således at dermed er uunngåelig et for tidlig avbrudd av dyrkingsfremgangsmåten.

Oppfinnelsens oppgave var å imøtegå disse vanskeligheter.

Den tekniske løsning av oppgaven ifølge oppfinnelsen ligger i fastslåingen av en spesielt utvalgt emulgatorklasse fra flertallet av i og for seg kjente W/O-emulgatorer er egnet til å skaffe hjelp her og dermed samtidig gir den mulighet å redusere mengden av oljefasen således at den vandige fase, vekt og volummessig i den samlede blanding overveier sterkt og allikevel foreligger stabile W/O-emulsjoner selv når faststoffutbyttene i den disperse vandige fase drives opp til optimale verdier.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av eksocellulære biopolymerer i faststoffutbytte på minst 5 vekt-% i et kulturmedium ved aerob dyrking av mikroorganismene i en oljefase av en vann/oljeemulsjon, idet fremgangsmåten er kjennetegnet ved at oljefasen bestående av isoparaffinhydrokarboner, anvendes i mengder under 40 volum-% basert på kulturmediet, og at det er tilsatt fra 0,5 til 2 vekt-% av minst ett fettsyredialkanol-amid, med monokarboksylsyrer av naturlig opprinnelse fortrinnsvis C12~20~sYrer som emulgator. De foretrukne fettsyredialkanolamider er et mono- eller polyolefinisk umettet fettsyredietanolamid. Begrepet fettsyrene omfatter derved på kjent måte monokarboksylsyrene, spesielt av naturlig opprinnelse, av fortrinnsvis C-tallområdet på 12 til 20, spesielt 14 til 18.

Kjente enkel eller flereganger olefinisk umettede naturlige fettsyrer er oljesyre, linolsyre og linolensyre.

Det har vist seg at allerede meget små mengder av de ifølge oppfinnelsen utvalgte emulgatorer er i stand til å sikre stabile W/O-emulsjoner, selv når det arbeides med et minimum av oljefåsene og samtidig maksimale faststoffutbytter i den vandige fase. Fortrinnsvis ligger den anvendte emulgator-mengde i området på 0,5 til 2 vekt-%, respektivt referert til den samlede blanding.

Oljefasen anvendes i den foretrukne utførelsesform i mengder under 40 volum-%, referert til blandingen av vann og olje, idet mengden av oljefasen i området på 30 til 40 volum-% kan være egnet. 35 volum-% tilsvarer da ca. 25 vekt-%, respektivt igjen beregnet til den samlede blanding. Med disse små olje-mengder kan det fåes stabile sammenligningsvis lett bevegelige W/O-emulsjoner, selv når man anvender de ifølge oppfinnelsen utvalgte emulgatorer og driver den aerobe dyrking av de eksocellulære polysakkarider til faststoffutbytter over 5 vekt-% og spesielt over 7 vekt-%, også her respektivt referert til den samlede blanding. Handlingen ifølge oppfinnelsen muliggjør dermed å kombinere fordelene av emulsjonsteknikk som bl.a. ligger i den økede bevegelighet av reaksjonsblandingen med fordelen av spesiell økonomi.

Til enkelthetene av fremgangsmåteføringen gjelder angivelsen av den innledningsvis siterte teknikkens stand. Spesielt egnede oljefaser er følgelig isoparafinhydrokarboner, som er flytende under fremgangsmåtetemperaturen (30 + 5°C). Den under handelsnavnet "Isopar M" solgte isoparafinblandingen kan med fordel anvendes under betingelsene ifølge oppfinnelsen. For fremstillingen av fortykkende polysakkarider med nærings-middelkvalitet kan anvendelsen av fysiologisk ufarlige oljefaser, spesielt av planteoljefaser, være spesielt egnet. Å nevne her er de kjente flytende triglycerider som betegnes som matoljer.

En spesiell fordel ved læren ifølge oppfinenlsen ligger deri at ikke bare under de tilstrebede ekstrembetingelser fåes tilstrekkelig stabile W/O-emulsjoner, som under økonimisk spesielt gunstige betingelser muliggjør dyrking av polysakkariddannende organismestammer, men at dessuten på tross av den tilstrebede emulsjonsstabilitet ved fremgangsmåteavslut-ning er det mulig med en enkel adskillelse mellom oljefase og med vandig fase oppladet fermenteringsprodukt.

Forøvrig gjelder for gjennomføringen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen de fra den innledningsvis nevnte teknikkens stand kjente forholdregler.

Det vandige fermenteringsmedium kan velges blant de som

er beskrevet i litteraturen for den respektive mikroorganisme. Egnede vandige fermenteringsmedier er eksempelvis beskrevet hos: J.R. Norris, D.W. Ribbons (Utgiver): Methods in Micro-

biology, bind 3 A, Academic Press London (1970) eller hos R.L. Whistler B. N. Bemiller (Utgiver): Industrial Gums, Polysaccharids and Derivativs (1973) på samme forlag.

Typiske vandige næringsoppløsninger inneholder eksempelvis en kilde for organisk nitrogen som maissvellevann og/eller soyamel, fosfatsalter som dialkalihydrogenfosfat og/eller diammoniumhydrogenfosfat ved siden av egnede sporelementer, spesielt magnesium og eventuelt mangan, molybden, jern og kalsium ved en pH-verdi over 6, fortrinnsvis over fra 6,5 til ca. 7. Næringsoppløsningen inneholder i tillegg et egnet karbohydrat oppløst hensiktsmessig i den vandige fase. Egnede karbohydrater er eksempelvis glukose, sakka-rose, maltose, fruktose, laktose, bearbeidet, invertert sukkerroer-molasser, invertsukker, filtrert fortynnet kvalitetsstivelse eller blandinger av disse karbohydrater. Glukose er en foretrukket kilde av assimillerbart karbon. Konsentrasjonen av den assimillerbare karbohydratforbind-else ligger vanligvis i området på 0,5 til 5 vekt-%, referert til den vandige fase. Anvendelsen av høyere konsen-trasjoner av assimillerbare karbohydratforbindelser kan føre til ansamling av toksiske biprodukter og dermed til en hemming av veksten av mikroorganismene. Også kan det oppstå for mange anvendelsesformål ikke egnede stoffskifteprodukter. I mange tilfeller utløses sågar en for tidlig avslutning av fermenteringen.

Mulig er imidlertid tilsetningen av den assimilerbare karbohydratforbindelsen porsjonsvis eller kontinuerlig under fermenteringsforløpet, således at det til slutt kan omsettes betraktelig høyere glukosekonsentrasjoner. N-parafiner med mer enn 10 C-atomer kan anvendes som oljefase og samtidig dyrke mikroorganismer som kan utnytte disse som kilde av assimilerbart karbon. Slike mikroorganismer er kjente fra slektene Corynebacterium, Brevibacterium og Mycobacterium, eksempelvis C. viscosum eller M.Lacticolum.

I alle tilfeller ligger inkubasjonstemperaturen hensiktsmessig i området på 30°C, eksempelvis ved 30 ± 10 °C. Fermenteringen kan gjennomføres inntil et tidsrom på 100 timer eller også lengere.

Egnede xanthomonasstammer, som kan danne eksocellulære heteropolysakkarider, avleder seg eksempelvis fra følgende Xanthomonas-artier: Xanthomonas campestris, Xanthomonas phaseoli, Xanthomonas malvacearum, Xanthomonas translucens, Xanthomonas carotae, Xanthomonas hederae, Xanthomonas papavericolå, Xanthomonas begoniae, Xanthomonas incanae, Xanthomonas vasculorum og Xanthomonas vesicatoria.

Egnet er spesielt stammer av Xanthomonas campestris, men også slike av Xanthomonas fragaria, Xanthomonas gummisudans, Xanthomonas manihotis og Xanthomonas vasculorum. Ytterligere egnede mikroorganismestammer, som kan danne eksocellulære heteropolysakkarider, imidlertid ikke er tilordnet slekten Xanthomonas, er i detalj oppført i den innledningsvis siterte europeiske patentsøknad 0 098 473.

For dannelse av W/O-emulsjonen blandes den begynnelsesdyrkede næringsoppløsning og oljefasen, hvori det hensiktsmessig på forhånd er blitt oppløst den eventuelt medanvendte emulgator med hverandre, og blandingen beveges respektivt gjennom-arbeides tilstrekkelig intenst mekanisk. Dyrkingen foregår også innen W/O-emulsjonen i fermentereren som er utrustet med intenst arbeidende blandeelementer. Den intense gjennom-blandingsvirkningen av slike røreelementer kan ifølge oppfinnelsen utnyttes til i fermentereren å opprettholde og sikre tilstanden av W/O-emulsjonen, og nemlig selv i slike tilfeller hvori det ved roligstilling av fermentererinnholdet inntrer en relativt enkel faseadskillelse.

Det bevegede fermentererinnhold gassbehandles på vanlig måte med oksygen respektivt med en oksygenholdig gass, spesielt lukt. Oksygenoverføringen foregår over oljefasen til hver enkelt i dispers fase emulgerte partikler av den vandige, mikroorganismeholdige næringsoppløsning og er følgelig også

i senere stadier av fremgangsmåten mye mindre ødelagt enn ved den hittil vanlige fremgangsmåteteknikk.

Hvis nødvendig, kan vekstbefordrende bestanddeler etter-leveres porsjonsvis eller kontinuerlig til næringsoppløs-ningen. Således er det f.eks. mulig å tilsette de assimillerbare karbonholdige forbindelser som glukose etterhvert til reaksjonsblandingen.

En jevn fordeling kan sikres ved at disse næringsstoffer tilsettes umiddelbart til den intenst gjennomarbeidede fermenterer. Tilsvarende gjelder for andre bestanddeler av den vandige næringsoppløsning, eksempelvis for sporelementer eller også for tilsetningen av andre nødvendige reaksjons-deltagere, eksempelvis baser, til regulering av den disperse vandige fases pH-verdi.

Siktingen fortsettes da så lenge inntil det er innstilt det ønskede utbyttet respektivt biopolymerdannelsen synker eller sågar stopper. I porsjonsvise fremgangsmåter foregår da etter produktets tilsiktede anvendelsesformål vanligvis en adskillelse mellom oljefase og biopolymerholdig dispers fase, hvorpå polysakkaridet på vanlig måte kan adskilles fra den vandige fase og renses. Til bryting av W/O-emulsjonene kan det anvendes de i den kjemiske fremgangsmåtepraksis vanlige forholdsregler, sammenlign hertil eksempelvis Ullmann Enzyklo-padie der technischen Chemie 1975, bind IV, side 453 og ff., samt Houben-Weyl, Methoden der Organisschen Chemie 1958,

bind 1/1, sidene 219/220. Emulsjonsskillingen kan følgelig foregå ved tilsetning av emulsjonsbrytende stoffer, eventuelt ved innvirkning av mekaniske krefter, som rysting, slåing eller trykkinnvirkning, ved temperaturøkning, ved fortynning eller inndampning av den ytre fase og andre kjente forholdsregler. Spesielt ødeleggelsen av emulsjoner ved

tilsetning av egnede kjemiske stoffer, de såkalte desemulga-torer, er kjent i fremgangsmåteteknikken. Handelen har ut-viklet et flertall av emulsjonsspaltere, se hertil eksempelvis Houben-Weyl, se ovenfor. Vanlige rensningstrinn, eksempelvis utvasking av den biopolymerholdige vandige fase med egnede oppløsningsmidler kan slutte seg til.

En delstrøm av fermentererinnholdet kan avgrenses prosjonsvis eller kontinuerlig, opparbeides og hvis ønsket, i det minste delvis igjen tilbakeføres. Over den avgrenede delstrøm kan det eksempelvis foregå tilsetning av reaksjonshjelpemidler eller også tilsetning av friske mikroorganismedeler. Samtidig kan det over en slik avgrenet delstrøm foregå en porsjonsvis eller kontinuerlig utslusing av fremgangsmåteprodukt fra fermentereren. For oppfinnelsen åpner det seg herved den mulighet for kontinuerlig fremgangsmåteføring, idet spesielt ved regelmessig kontroll av den som biopolymer inneholdte vandige fase er styringen av fremgangsmåteforløpet mulig i ønsket retning. I forhold til den i praksis hittil vanlige fremgangsmåtetype med porsjonsvis arbeidende entrinnet fremgangmsåte, slutter det seg her nye teknisk fremskrittlige muligheter.

Isoleringen av polysakkarider fra den vandige fase foregår på i og for seg kjent måte, eksempelvis ved utfelling og tørking. I første rekke kan den vandige fase oppvarmes tilstrekkelig, eksempelvis til temperaturer over 100"C, og med en gang igjen avkjøles for å avlive de tilstedeværende mikroorganismer og eventuelt å forbedre biopolymerens viskositet. Biopolymeren utvinnes deretter ved felling, eksempelvis med alkoholer, etterfølgende filtrering og tørking. Vaksetrinn til rensing av produktet kan innesluttes på i og for seg kjent måte.

Eksempler

<Eksempe>l_1

Xanthomonas campestris NRRL-B-1459-A ble dyrket aerobt i 15 liters fermenterer (10 1 fyllvolum) ved 28°C: Fermenteren ble podet med en 24 timers gammel forkultur:

Hovedkulturens næringsmedium:

Etter ansetting av kulturoppløsningen ble reaktoren sterili-sert og podet. Glukosen ble stadig tildosert under fermenteringen, således at konsentrasjonen stadig lå ved ca. 10 g/l. pH-verdien ble holdt konstant med kalilut ved pH 7,0. Etter 3 0 timers fermenteringsvarighet ble røreren stoppet kort og den eksternt steriliserte olje med emulgatoren tilsatt. Etter oljetilsetningen ble fermenteringen videreført som tidligere.

Etter en kulturvarighet på ca. 160 timer utgjorde xanthan-konsentrasjonen 61 g/l.

Eksemgel_2

I et annet forsøk ble det på samme måte arbeidet med stammen ATCC 31 602. Som emulgator ble det i dette forsøk imidlertid anvendt handelsproduktet "Comperlan VOD". Det dreier seg herved om et produkt fra søkeren og består av fettsyredietanolamid på basis av planteolje.

Etter fermentasjonens avbrudd, i den 110. timen, ble xanthankonsentrasjonen med 65 g/l bestemt.

Sammenligningsek<se>mpel

En sammenligningsfermentering med en annen emulgator ble gjennomført under ellers like betingelser. I stedet for linolsyredietanolamid ble det i dette tilfellet anvendt den av søkeren under handelsnavnet "Dehymuls F" førte emulgator, som er en blanding av høyeremolekylære fettsyreestere.

Etter opprettelse av emulsjonen måtte fermenteringen avbrytes, da emulsjonen ikke forble stabil og dermed var det ikke mulig med noen xanthandannelse. Xanthankonsentrasjonen utgjorde etter avbrudd 20 g/l.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av eksocellulære biopolymerer i faststoffutbytte på minst 5 vekt-% i et kulturmedium ved aerob dyrking av mikroorganismene i en oljefase av en vann/oljeemulsjon, karakterisert ved at oljefasen bestående av isoparaffinhydrokarboner, anvendes i mengder under 40 volum-% basert på kulturmediet, og at det er tilsatt fra 0,5 til 2 vekt-% av minst ett fettsyredialkanol-amid, med monokarboksylsyrer av naturlig opprinnelse, fortrinnsvis C12~20~svrer/ SOItl emulgator.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes fettsyredialkanolamider som er et mono- eller polyolefinisk umettet fettsyredietanolamid.

3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 2, karakterisert ved at oljefasen som anvendes er en flytende triglyseridmatolj e.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 3, karakterisert ved at oljefasen anvendes fra 30 til 40 volum-%<.>

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 4, karakterisert ved at mikroorganismen som anvendes er fra slekten Xanthomonas.

6. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 5, karakterisert ved at en polysakkarid biopolymer fremstilles.