JPS62163696A - 細胞外生体高分子の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、水性培地中で増粘作用を有する細胞外生体高
分子の製法に関する。

［従来技術］ 欧州特許出願公開第００５８３６４号は、キサントモナ
ス属微生物を水性栄養培地中で好気的培養することによ
って、キサントモナス生体高分子を製造する方法であっ
て、発酵条件下に安定な油中水型乳澗液（Ｗ／Ｏ乳濁液
）中で微生物を生育することを特徴とする方法に関する
。該方法においては、最初に浦を含有しない水性栄養培
地中で微生物を生育し、次いで油相の添加によってＷ／
Ｏ乳濁液を形成し、Ｗ／Ｏ乳濁液とした状態で発酵を続
ける。該方法は、Ｗ／Ｏ乳化剤の存在下に行うことが好
ましく、Ｗ／Ｏ乳化剤は、まず油相に溶解し、次いで水
相と混合することが最もよい。

欧州特許出願公開第００９８４７３号は、通例水性栄養
培地において増粘作用を有する細胞外生体高分子を生成
する、キサントモナス属には属していない微生物を、前
記のようなＷ／Ｏ乳濁液中で生育する、前記方法を拡大
した変法に関する。

前記微生物株には、例えば、ダラム陽性またはダラム陰
性の菌株が含まれる。相当する開示が米国特許第４３５
２８８２号にあり、それによると、やはりキサントモナ
ス株の培養が重要である。

例えばキサンタン（ｘａｎｔｈａｎ）形成キサントモナ
ス株の好気的培養に、前記のようなＷ／Ｏ乳罰液を使用
することは、幾つかの点て存ｆすである。該研究の目的
は、発酵生成物として蓄積する多糖類によって粘度が高
まるという、発酵水相の難点を、Ｗ／Ｏ乳蜀液法を採用
することによって除去または軽誠ずろことてあった。純
粋に水性の栄養培地を使用する場合、キサンタン収率（
乾燥品として）がわずか２〜３重Ｍ％でも良好な結果で
あるとみなされるが、このような結果は、高エネルギー
を消費して特殊な手段を用いた場合にしか達成されない
。多糖類生成微生物株の培養をＷ／Ｏ乳劇液の分散水相
において行うと、系全体の粘度は主に均質油相によって
決定されるので、とりわけ、発酵条件において発酵槽内
の液体相の粘度を低下することが可能である。このよう
なＷ／Ｏ乳澗液系を用いると、純粋な水性培地を用いる
場合と比較して、分散水相におけるキサンタン収率を改
良することが可能であることも見出された。

欧州特許出願公開第０１３５１２３号は、ハロゲン化炭
化水素を添加してＷ／Ｏ乳濁液を形成することによって
、発酵液の粘度を低下する方法に関する。該方法におい
て、発酵条件下に液体である、ハロゲン化度の高い（と
りわけ過ハロゲン化された）無毒性脂肪族炭化水素をハ
ロゲン化炭化水素相として使用する。乳化剤は使用しな
い。この開示は、Ｗ／Ｏ乳濁液中でキサンタンを生成す
る前記方法においては、系全体の粘度が低下しないばか
りか、むしろ上昇するという発見に基づいている。とり
わけ乳化剤を使用する場合にこのような恐れがあると記
載されている。

更に研究がなされたが、この難点を克服することはでき
なかった。それどころか、工程の条件の最適化において
、完全に異なる一連の問題が生じろ。Ｗ／Ｏ乳濁液中で
微生物を培養するこのような方法を経済的に行うために
本質的な２種のパラメータは、それを最適化すると互い
に望ましくないように補い合う。すなわち、Ｗ／Ｏ乳副
液が破壊し、それ成用分離を起こしやすくなり、微細に
分散した所望の状態のＷ／Ｏ乳蜀液を簡単な手段（持に
撹ｒ１りによって再形成ずろことは困難または不可能で
ある。このような２種のパラメータとは、一つには油相
の量、も〜）一つは細胞外多糖類によって固体相蟲度（
すなわち分散水相における収率）を高めることである。

工程全体のコストをできるだけ低く保つという点では、
油相の量を可能な限り低くすることが好ましいことが理
解される。他方では、分散水相において増粘作用を有す
る細胞外多糖類収率を高めたいことは明白である。Ｗ／
Ｏ乳罰液の首記不安定性は、とりわけ油相猾を可能な限
り減らし、かつ分散水相内の細胞外多糖類収率を可能な
限り高めろ場合に起こりやすいことがわかった。特に経
済的な２種のパラメータを組み合わ仕ると、望ましくな
い不可逆的相分離によって工程が損なわれやすく、それ
故培養の早期の停止は避けられない。

［発明の目的コ 本発明が解決しようとする問題は、前記のような困難を
克服することである。本発明によるこの問題の技術的な
解決法は、既知の多数のＷ／Ｏ乳化剤から特に選択され
た乳化剤によって状況を改善することが可能であり、そ
れ故、同時に、分散水相中の固体収率を最適なレベルま
で上げた場合にも、Ｗ／Ｏ乳澗液を安定に保ちながら、
混合物全体に対して水相が明らかに優勢（重量および容
量）となる程度まで油相の量を低下し得るという発見に
基づいている。

［発明の構成］ 本発明は、乳濁液形成および安定化のためにＷ／Ｏ乳化
剤を使用して、発酵条件下に安定なＷ／Ｏ乳局液中で分
散水相として存在する水性栄養培地中で、生体高分子生
成微生物株を好気的に培養することによって、水性培地
において増粘作用を有する細胞外生体高分子を製造する
方法であって、油相を混合物全量に対して５０容量％を
越えない量で使用し、Ｗ／Ｏ乳化剤として脂肪酸ジアル
カノールアミドを用いることを特徴とする方法に関する
。好ましい脂肪酸ジアルカノールアミドは、脂肪酸残基
がモノ−またはポリ−オレフィン性不飽和基であってよ
いりエタノールアミドである。

本発明において、脂肪酸は、通例、好ましくけ炭素原子
を１２〜２０例、より好ましくは１４〜１８個有すると
リイっけ天然物由来のモノカルボン酸を含むと理解され
ろ。既知のモノ−またはポリ−オレフィン性不飽和天然
脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸およびリルン酸であ
る。

油相徂を最少にし、かつ水相における固体収率を最大に
した場合にも、本発明に従って選択された乳化剤をごく
少量使用するだけで、Ｗ／Ｏ乳濁液の安定性を確保し得
ることがわかっている。使用する乳化剤のｍは、いずれ
の場合にも、混合物全量に対して、好ましくは約０．５
〜２重量％、より好ましくは約０．７〜！、２重量ｍ％
である。

好ましい態様において、油相を、水および油の混合物に
対して４０容量％を越えないｍで使用する。油相世約３
０〜４０容量％が適当である。３５容量％とは、やはり
混合物量１に対して約２５重量％に相当する。細胞外多
糖類の固体収率が混合物全量に対して５重量％を越える
、とりわけ７重量％を越えるように好気的培養を行う場
合、本発明に従って選択された乳化剤を使用すれば、前
記のように油が少量であっても、安定で、比較的易流動
性のＷ／Ｏ乳濁液が得られる。従って、本発明の方法に
より、とりわけ反応混合物の流動性を高めろという乳濁
液法の利点と、特に経済的であるという利点とを組み合
わせることができる。

実際の適用に関する、本発明の方法の詳細な点は、前記
の従来技術と同様である。従って、特に適当な油相は、
工程の温度（３０±５℃）を越えない温度で液体である
、イソパラフィン炭化水素である。商品名［イソパー（
Ｉｓｏｐａｒ）ＭＪのイソパラフィン混合物を、本発明
の条件下に有利に使用し得る。生理学的に安全な油相、
特に植物性油相が、増粘作用を存する食品性の多糖類の
製造に適当である。食用油としても既知の液体トリグリ
セリドが例として挙げられる。

本発明の開示の特に有利な点は、前記のような（覗端な
条件下にも十分に安定なＷ／Ｏ乳濁液が得られ、多糖類
生成微生物株を経済的に特に好ましい条件下で培養でき
ることだけでなく、乳濁液が所望の安定性を有するにも
かかわらず、工程の終了時に油相と、発酵生成物を含有
する水相とを簡単に分離し得ろことである。

他の点に関しては、本発明の方法は、前記従来技術に従
って行なってよい。

水性発酵培地を、文献に記載の特定の微生物に適する培
地から選択し得る。適当な水性発酵培地は、例えば、ジ
ェイ・アール・ノリス（Ｊ、ｒｔ、Ｎｏｒｒｉｓ）、デ
ィー・ダブり二−毎すボンズＣＤ。

Ｗ　、　Ｒｉｂｂｏｎｓ）編：メソッズ・イン・マイク
ロバイオロノー０１ｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ）、第３Ａ巻、アカデミツク・プレス、
ロンドン（ＡｃａｄｅｍｉｃＰ　ｒｅｓｓ　　Ｌ　ｏｎ
ｄｏｎ）出版（１９７０年）、またはアール・エル・ホ
イスラー（Ｒ，Ｌ、〜Ｖｈｉｓｔｌｅｒ）、ビー・エヌ
・ベミラー（Ｂ、　Ｎ、　＋３ｃｍ１ｌｌｃｒ）ｌ：イ
ンダストリアル・ガムズ・ポリサッカライズ・アンド・
デリヴアティブズ（［ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　Ｇ　ｕｍ
ｓ。

Ｐｏ１ｙｓａｃｃａｒｉｄｅｓ　　ａｎｄ　　Ｄｅｒｉ
ｖａｔｉｖｅｓ）（Ｉ　９７３年）、同社出版に記１或
されている。

典型的な栄養水溶液は、ｐ　ｔ−を値が６を越え、好ま
しくは６５〜約７であり、適当な微量成分、特にマグネ
シウムおよび要すればマンガン、モリブデン、鉄および
カルノウムに加えて、例えば、存機窒素源（例えばトウ
モロコシ浸漬液および／または大豆粉）、リン酸塩（例
えばリン酸水素２アルカリおよび／またはリン酸水素２
アンモニウム）を含有する。栄養溶液は、水相に溶解し
易い適当な炭水化物を更に含有する。適当な炭水化物は
、例えばグルコース、シュークロース、マルトース、フ
ルクトース、ラクトース、加工・転化テンサイシロップ
、転化糖、濾過・希釈デンプンまたはこれらの炭水化物
の混合物である。グルコースは同化し得る好ましい炭素
源である。同化し得る炭水化物化合物の濃度は、水相に
対して通例０．５〜５重量％である。同化し得る炭水化
物化合物を比較的高ａ度で使用すると、毒性のある副生
成物が蓄積し、それ故、微生物の生育が阻害される。多
くの用途に不適当な低分子量の代謝産物も生成し得る。

発酵が早期に停止することらある。

しかし、同化し得る炭水化物化合物を、発酵工程の間に
、少しずつ、または連続的に加えて、最終的にグルコー
ス濃度が非常に高くなるようにすることがてきる。本発
明の好ましい一態様においては、炭素原子数かＩＯを越
えるｎ−パラフィンを油相として使用し、同時に、それ
を同化し得る炭素としてｆｌＩ用し得る微生物を培養す
る。このような微生物は、クリネバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム属およびミコバクテリウム属から既知で
あり、例えばコリネバクテリウム・ビスコサム（ｖｉｓ
ｃｏｓｕｍ）またはミコバクテリウム・ラクチコラム（
ｆａｃｔ　ｉｃｏｌｕｍ）である。

いずれの場合にも、インキュベーション温度は、約３０
℃、例えば３０±／Ｏ℃であることが最も良い。発酵は
、約／Ｏ０時間まで、またはそれより長時間行ってよい
。

細胞外へテロ多糖類を生成し得る適当なキサントモナス
属微生物は、例えば以下のキサントモナス種から誘導さ
れる：キサントモナス・カンペストリス（ｃａｍｐｅｓ
ｔｒｉｓ）、キサントモナス・ファセオり（ｐｈａｓｅ
ｏｌ　ｉ）、キサントモナス・マルバセアラム（ｍａｌ
ｖａｃｅａｒｕａ＋）、キサントモナス・トランスルセ
ンス（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）、キサントモナス・カ
ロテ（ｃａｒｏｔａｅ）、キサントモナス・ヘデレ（ｈ
ｅｄｅｒａｅ）、キサントモナス・パパベリコラ（ｐａ
ｐａｖｅｒｉｃｏｌａ）、キサントモナス・ベゴニエ（
ｂｅｇｏｎｉａｅ）、キサントモナス・インカネ（ｉｎ
ｃａｎａｅ）、キサントモナス・パスクロラム（ｖａｓ
ｃｕｌｏｒｕｍ）およびキサントモナス・ベンカドリア
（ｖｅｓｉｃａＬｏｒｉａ）、キサントモナス・カンペ
ストリス、キサントモナス・フラガリア（ｒｒａｇａｒ
ｉａ）、キサントモナス・グミスダンス（ｇｕｍｍｉｓ
ｕｄａｎｓ）、キサントモナス・マニホヂス（ｍａｎｉ
ｈｏｔｉｓ）およびキサントモナス・パスクロラムが特
に適当である。キサントモナス属に属さない細胞外へテ
ロ多糖類を生成し得る他の適当な微生物株は、詳細には
、前記欧州特許出願公開第００９８１１７３号に記載さ
れている。

Ｗ／Ｏ乳局液を形成するために、微生物を培養した栄養
溶液および油相（乳化剤を用いる場合、前辺て油相に乳
化剤を溶解することか最らよい、）を混合し、得られた
混合物を十分な強さで機械的に撹拌または混合した。本
発明の方法の好ましい態様においては、強力な混合装置
付きの発酵槽内で、実際のＷ／Ｏ乳濁液中で微生物を培
養する。

本発明によると、このような装置の強力な混合作用は、
発酵槽の内容物が停止して比較的単純な相分離が起こっ
た場合にら、発酵槽内のＷ／Ｏ乳洞液状態を保持および
保証するために用いる。

発酵槽の撹拌した内容物に、通常の方法で酸素または酸
素含有気体、特に空気を通す。分散相として乳化された
微生物含有栄養水溶液の個々の滴に、油相を経由して酸
素を通す。工程の末期においてら、従来の工程を行う場
合よりは、はるかに気体の輸送が妨害されにくい。

要すれば、栄養溶液の生育促進成分を、少しずつ、また
は連続的に補充する。すなわち、例えば同化し得る炭素
を含有する化合物、例えばグルコースを反応混合物に徐
々に加えることが可能である。

このような栄養物を、強力に撹拌された発酵槽に直接導
入することによって、均質に分散させることができる。

栄養水溶液の池の成分（例えば微ｍ成分）または分散水
相のｐＨを調節するために必要な他の反応物質（例えば
塩基）の添加にも同じことが当てはまる。

所望の収率が得られるか、または生体高分子生成が低下
もしくは停止するまで培谷を続ける。バッチ法において
は、油相および生体高分子含有分散相を、通例、生成物
の所望の用途に応じて分離し、その後、通常の方法で多
糖類を水相から分離し、精製し得る。化学工程において
通例用いられる方法によって、Ｗ／Ｏ乳尚液を破壊する
ことができる（例えば、ウルマン・エンチクロペディー
・デア・テヒニツシエン・ヘミ−（Ｕ　ｌｌｍａｎｎＥ
ｎｚｙｋｌｏｐａｅｄｉｅ　　ｄｅｒ　　ｔｅｃｈｉｎ
ｉｓｃｈｅｎ　　Ｃｈｅｍｉｅ）１９７５年、第■巻、
４５３頁以下、およびホウベンーヴエイル（Ｈｏｕｂｅ
ｎ　−Ｗ　ｅｙ　１）、メトーデン・デア・オルガニッ
シエン・ヘミ−（Ｍｅｔｈｏｄｅｎｄｅｒ　　Ｏｒｇａ
ｎｉｓｃｈｅｎ　　Ｃｈｅｍｉｅ）１９５８年、第１／
１巻、２１９〜２２０頁参照）。従って、乳濁液の分離
は、乳濁液破壊物質の添加により、要すれば機緘的に力
（例えば振動、衝撃または圧力）を加えることにより、
加温により、希釈により、または蒸発および他の手段で
外側の相を濃縮することによって行なうことができろ。

適当な化学化合物の添加による乳濁液の破壊（いわゆる
解乳化）は、特に良く知られている。幾つかの乳濁液破
壊剤が市販されている（前記ホウベンーヴエイル参照）
。

分離の後に、標準的な精製（例えば適当な溶媒で、生体
高分子含有水相を洗い流すこと）を行ない得ろ。

本発明の特に好ましい一態様において、発酵槽内容物の
部分流を、バッチ式に、または連続的に分取し、処理し
、所望により少なくとも部分的に系に戻す。分取した部
分流を、例えば反応助剤の添加または微生物の補充に使
用し得る。同時に、このような側流を経て、最終生成物
を、バッチ式または連続的に発酵槽から除去し得る。こ
れにより、本発明の方法を連続的に行なうことができ、
とりわけ生体高分子含有水相の定期的な調節により、工
程の進行を所望のように調節し得る。これにより、従来
実際に適用されてきた単一工程バッチ法を凌ぐ、技術的
に改良された方法が新しく開発される。

多糖類は、既知の方法、例えば沈澱および乾燥によって
水相から単離される。水相を最初に例えば／Ｏ０℃を越
える温度に十分加熱し、直ちに冷却して、存在する微生
物を殺し、要すれば生体高分子の粘度を改良する。次い
で、生体高分子を、例えばアルコールによる沈澱によっ
て得、その後、濾過および乾燥する。生成物を精製する
洗浄工程は、既知の方法に含まれる。

［実施例コ 実施例１ キザントモナス・カンペストリスＮＲｎＬ　　Ｂ−１４
５９−Ａを、１５ｇ発酵ｈツ（内容物体積＋００、）内
で２８℃で好気的に培養した。２４時間予備培養したし
のを発酵槽に接種した。

本培養の栄養培地： トウモロコシ浸漬液　　　　　　／Ｏｇ、Ｑ大豆粉　　
　　　　　　　　　　　Ｂｇ／ＱＮａｔ夏（ＰＯ４・１
２ＨｔＯ０，９ｇ／１２（ＮＨ４）ｔｌ−ＴＰＯ４０，
Ｊ／Ｑ ＭｇＳＯ４・７　Ｈｚ　Ｏ０、２ｇ／　Ｑ油：イソパー
Ｍ＊　　　　　　　２５０ｇ／Ｑ乳化剤：リノール酸ジ
ェタノールアミド８ｇ／１２ 回転速度　　　　　　　　　２２００　ｍ１ｎ−’空気
　　　　　　　　　　　　　　ＩＶＶＭ＊　２００〜２
５０℃で沸騰するイソパラフィン混合物；エッソｅヘミ
−（Ｅｓｓｏ　　Ｃｈｅｍｉｅ）社、商標 培養溶液調製後、反応器を滅菌し、接種した。

発酵の間、グルコースを、濃度が約／Ｏｇ／Ｑに保たれ
るように連続的に導入した。水酸化カリウムで、ｐＨを
７０に一定に保った。３０時間発酵後、撹拌を一時的に
止め、別に滅菌した浦を乳化剤と共に加えた。油の添加
後、前と同様に発酵を続けた。

約１６０時間培養後、キサンタン濃度は６１ｇ／Ｑであ
った。

実施例２ 第２の試験は、ＡＴＣＣ３１６０２株を使用して同様に
行った。しかし、この場合には、乳化剤として市販品「
コンバーラン（Ｃｏｍｐｅｒｌａｎ）Ｖ　ＯＤ　Ｊを使
用した。この製品は、本出願人が製造したもので、植物
油由来の脂肪酸ジェタノールアミドから成る。

１／Ｏ時間後に発酵を止めた時、キサンタン濃度は８５
ｇ／Ｑであった。

比較例 同様の条件下に、他の乳化剤を用いて比較発酵を行った
。この場合、リノール酸ジェタノールアミドの代わりに
、本山願人製の市販乳化剤「デヒムルス（Ｄｅｈｙｍｕ
ｌｓ）ＦＪ（比較的分子量の高い脂肪酸エステルの混合
物）を使用した。

乳創液調製後、乳蜀液が安定ではなかったので、発酵を
中止しなければならず、それ故、更にキサンタンを生成
することは不可能であった。停止後のキサンタン濃度は
２０ｇ／ＱでありＬ０特許出願人　ヘンケル・コマンデ
ィットゲゼルシャフト・アウフ・アクチェン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、乳濁液形成および安定化のためにＷ／Ｏ乳化剤を使
   用して、発酵条件下に安定なＷ／Ｏ乳濁液中で分散水相
   として存在する水性栄養培地中で、生体高分子生成微生
   物株を好気的に培養することによって、水性培地におい
   て増粘作用を有する細胞外生体高分子を製造する方法で
   あって、油相を混合物全量に対して５０容量％を越えな
   い量で使用し、Ｗ／Ｏ乳化剤として脂肪酸ジアルカノー
   ルアミドを用いることを特徴とする方法。 ２、脂肪酸残基がモノ−またはポリ−オレフィン性不飽
   和基であってよい脂肪酸ジエタノールアミドを使用する
   第１項記載の方法。 ３、乳化剤を、混合物全量に対して０．５〜２重量％、
   好ましくは０．７〜１．２重量％の量で使用する第１項
   または第２項記載の方法。 ４、３０±５℃の温度で液体のイソパラフィン炭化水素
   または液体トリグリセリド、特に食用油を均質相として
   使用する第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、油相を、混合物全量に対して３０〜４０容量％の量
   で使用する第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、最終生成物を生体高分子分離工程に付す前に、分散
   水相中、生体高分子収率を混合物全量に対して少なくと
   も５重量％とする第１〜５項のいずれかに記載の方法。 ７、とりわけキサントモナス属の多糖類生体高分子の製
   造のために用いる第１〜６項のいずれかに記載の方法。