JPH04131088A - ６−ヒドロキシニコチン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１］ 本発明は、ニコチン酸を酵素ヒドロキシル化して６−ヒ
ドロキシニコチン酸ヲ製造する方法に関する。 ［０００２］ 周知のように、６−ヒドロキシニコチン酸は、シュード
モナス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）またはアクロモバクタ−（Ａ　ｃｈｒｏ
ｍｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物を用いて製造することが
できる（スイス特許第６５８８６６号、同６５８８６７
号）。　これらの方法は、対応する微生物のバイオマス
・サスペンションを用いて、分離段階で個々に接種菌を
増殖させる方法である。 ［０００３］ このヒドロキシ化は、ニコチン酸をそのナトリウム塩と
して１回添加して断続的に行なう　（回分式方法、スイ
ス特許第６５８８６６号）か、またはニコチン酸を（易
溶性の）マグネシウムまたはバリウム塩として添加して
連続的に行ない、６−ヒドロキシニコチン酸を難溶性の
マグネシウムまたはバリウム塩として分離する方法（ス
イス特許第６５８８６７号）である。　これら二つの方
法による微生物の増殖では、ニコチン酸濃度が制限され
るので、活性バイオマスの全量を予備処理工程で調製し
ておく必要がある。　このほかに、既知の酵素による６
−ヒドロキシニコチン酸の製造方法には、次のような欠
点がある。　すなわち、スイス特許第６５８８６７号に
記載の連続的製造方法では、マグネシウムまたはバリウ
ム塩が生成するので、６−ヒドロキシニコチン酸を酸の
添加により遊離させる。　従って、加えた酸のマグネシ
ウム塩またはバリウム塩が生成するから、これを沈澱除
去しなければならない。　とくに可溶性バリウム塩は微
生物に対し強い毒性をもつ。　また、長期連続運転に際
し、結晶化により結癒（Ｖ　ｅｒｋｒｕｓｔｕｎｇｅｎ
）または異常伝染（Ｆ　ｒｅｍｄｉｎｆｅｋｔｉｏｎｅ
ｎ）を起しやすい。 ［０００４］ 本発明の課題は、上記のような欠点がなく、６−ヒドロ
キシニコチン酸を高濃度および高収率で製造することが
できる方法を提供することにある。 ［０００５］ 上記の課題は、請求項１に記載の方法により解決される
。 ［０００６］ 驚くべきことに、既知の方法で得られた出発培地に対し
て、ニコチン酸を、微生物懸濁物中のニコチン酸濃度が
実質的に所定の濃度よりも低く、かつ微生物の増殖が抑
制される濃度よりも高くなるように添加することにより
、バイオマスを分取する必要がなくなることが見出され
た。　ここで、「実質的に」とは、濃度が瞬間的および
（または）局部的に、とくに完全な混合が行なわれる前
に、その添加部位で超過することを意味する。　このよ
うな条件下でバイオマスが形成され、驚くべきことであ
るカミこの成長相に６−ヒドロキシニコチン酸が生成し
、それ以上に物質代謝が進行しないので、ニコチン酸添
加の条件により、ニコチン酸が完全に消費され、６−ヒ
ドロキシニコチン酸が定量的収率で得られ、これを既知
の方法により分離することができる。　ニコチン酸添加
中、６−ヒドロキシニコチン酸の濃度が上昇して細胞生
成を抑制する。　この生成は、６−ヒドロキシニコチン
酸が比較的高濃度になると完全に停止する。用いた微生
物種は５０ｇ／ｌ程度になる。　さらに驚くべきことに
は、６−ヒドロキシニコチン酸の解構（Ａ　ｂｂａｕ　
）は起らない。　　しかし高濃度ではニコチン酸−ヒド
ロキシラーゼの抑制が観察され、生成物濃度は１００％
収率に達する。　本発明の方法において重要なことば、
細胞生成中のニコチン酸濃度はけしてゼロにはならず、
さもなければいったん生成した６−ヒドロキシニコチン
酸が分解する。　最初に６−ヒドロキシニコチン酸の濃
度が最高値に達すると、それ以上の解構が抑制され、ニ
コチン酸添加後はそれが完全に消費され、収率低下のお
それがない。　ニコチン酸をヒドロキシル化する微生物
として、シュードモナス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
）　　バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはアクロモ
バクタ−（Ａ　ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　）が用いら
れる。　好ましいのは、シュードモナス・プチダ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）およびアクロモバ
クター・キシロソキシダンス（Ａ　ｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ　）種であり、とくに
アクロモバクター・キシロソキシダンス種ＤＳＭ２７８
３が好ましい。　これらの微生物については、スイス連
邦特許第６５８８６６号に記載されている。　微生物懸
濁液中のニコチン酸濃度は、その添加期間中１０ｇ／ｌ
よりも低くすることが好ましい。

【０００７】 ニコチン酸の添加は少量ずつ、または連続的に行うこと
ができるが、連続添加が好ましい。 ［０００８］ ニコチン酸は、固体または溶液として添加することがで
きるカミ実際には遊離酸または水溶性塩として添加する
。　好ましくは水溶液、とくにそのナトリウムまたはカ
リウム塩の水溶液として添加する。 ［０００９］ 微生物の懸濁液は、通気をよくして撹拌するのがよく、
空気を吹き込んで撹拌することも可能である。　溶存酸
素分圧（ｐ０２）は１〜２００ミリバール、好ましくは
４０〜８０ミリバールとする。　撹拌は撹拌機を用いて
行なうことが好ましい。　微生物の増殖および６−ヒド
ロキシニコチン酸の生成は、温度２０〜４０℃、ｐＨ５
，５〜９の条件で行なわれる。 ［００１０］ バイオマスの生成には、ニコチン酸とともに他の栄養剤
を用いるのが有利である。　たとえば、グリセリン、グ
ルコースなどの炭素源、アンモニウム塩、グルタミン酸
などの窒素源のほか、ミネラル塩、各種添加剤、ビタミ
ンが挙げられる。　これらの栄養剤は、微生物の懸濁液
の濃度が所定の範囲を越えないように添加するが、その
添加方法は当業者には既知のことである。　栄養剤は、
天然または合成品を単独または組み合わせて用いること
ができ、とくに好ましい複合栄養剤は酵母エキスである
。 ［００１１］ 本発明の方法は連続的に実施することができ、６−ヒド
ロキシニコチン酸の濃度が十分高くなったときには、他
の生成物への解構を防止するため、生成物を分離すると
同時に、細胞分裂を避けるようにする。　この製造方法
の実施に好適な装置は、たとえばスイス特許第６６４３
７４号に記載されている。　ニコチン酸の供給速度を生
成物の抜出し速度と等しくすることにより、生成物濃度
を一定にすることができる。 ［００１２］ 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 ［００１３］ 実施例 ａ）　出発培地の調製 リン酸水素ナトリウム・二水和物５．１９ｇ、リン酸二
水素カリウム２．００ｇ、酵母エキス０．２５ｇ、ニコ
チン酸１．ＯＯｇおよび水５００ｍ１から栄養剤をつく
り、２０分間、１２０℃で殺菌した。　　３０℃に冷却
後、殺菌した高濃度のトレーサー元素溶液を加えて、次
のような濃度の培養培地を調製しな。 ［００１４］ 塩化コバルト・二水和物　　　　　　　　　　　２０ｍ
ｇ／ｌ硫酸マンガン（ＩＩ）　　　　　　　　　　　　
　　　１０　　　り硫酸鉄（■王）・七水和物　　　　
　　　　　　　　５　　／／硫酸コバルト・六水和物　
　　　　　　　　　　ｏ、１　／／硫酸銅・五水和物　
　　　　　　　　　　　　　０．１　　／／硫酸亜鉛・
五水和物　　　　　　　　　　　　　０．１　　／／モ
リブデン酸ナトリウム・二水和物　　　　　　０．１　
　ｌ／この培地にアクロモバクター・キシロソキシダン
スＤＳＭ２７８３を接種し、２４時間、３０℃、ｐＨ７
で培養した。 ［００１５］ ｂ）　　６−ヒドロキシニコチン酸の製造撹拌機、通気
装置およびｐＦ（調節機を備えた２０１の培養槽に水１
２１を入れ、ニコチン酸９０ｇ、水酸化ナトリウム１９
゜４４ｇ、酵母エキス９０ｇ、硫酸カリウム１２ｇ、塩
化マグネシウム穴水和物９．６ｇ、塩化カルシウム１．
９２ｇ２．４ｍｌのポリプロピレングルコース−２００
０，Ｌ−グルタミン酸１８０ｇおよびグルコース３００
ｇを溶解し、３０分間、１２１℃で殺菌した。 ［００１６］ ３０℃に冷却後、出発培地を加えて通気しながら撹拌し
、ｐＨ７で培養しな。 この間にニコチン酸の濃度は７．５ｇ／ｌがら２ｇ／ｌ
に下り（ＨＰ　Ｌ　Ｃ−測定［特許］平０２−４０２８
０７ ）　バイオマス濃度は１０ｇ／ｌ（乾燥重量）に上昇し
た。　この時点で、水３００１にニコチン酸１．１３ｋ
ｇおよび水酸化ナトリウム０．３６５ｋｇを溶解して１
２１℃で２０分間殺菌した溶液の添加を開始し、培養液
中のニコチン酸濃度が１ｇ／ｌ〜９ｇ／ｌとなるように
した。　　１１時間後に添加が終り、グルタミン酸とグ
ルコースは完全に消費され、バイオマス濃度は１５ｇ／
ｌ（乾燥重量）に上昇した。　さらに４時間後、すなわ
ち接種後２５時間で培養を停止した。　　６−ヒドロキ
シニコチン酸の最終濃度は７４ｇ／ｌに達した。　これ
は、ニコチン酸が６−ヒドロキシニコチン酸に定量的に
変換されたことに相当する。 諸操作はスイス特許第６５８８６６号（実施例１．３）
に記載の方法に従って行った。 −５２７＝

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】好気性雰囲気下に微生物を用いてニコチン
   酸をヒドロキシル化することにより、６−ヒドロキシニ
   コチン酸を製造する方法において、ニコチン酸またはニ
   コチン酸の可溶性塩もしくはニコチン酸含有溶液を微生
   物の出発培地に連続的または断続的に添加し、培養液中
   のニコチン酸濃度が、その添加期間中ゼロよりは大であ
   るが、少なくとも、微生物の生長抑制が起る濃度よりは
   実質的に低く、生成した６−ヒドロキシニコチン酸がそ
   れ以上の生長を妨げる濃度よりは高くして、それにより
   微生物の増殖と６−ヒドロキシニコチン酸の生成が各段
   階で継続して行なわれるようにしたことを特徴とする製
   造方法。
2. 【請求項２】微生物として、シュードモナス（Ｐｓｅｕ
   ｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）また
   はアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属
   から選ばれたものを用いる請求項１の製造方法。
3. 【請求項３】シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
   ｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）およびアクロモバクター・キシ
   ロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏ
   ｓｏｘｙｄａｎｓ）種から選ばれた微生物を用いる請求
   項２の製造方法。
4. 【請求項４】アクロモバクター・キシロソキシダンスと
   してＤＳＭ２７８３種を用いる請求項３の製造方法。
5. 【請求項５】培養液中のニコチン酸濃度を添加期間中１
   ０ｇ／ｌよりも低く保持して実施する請求項１ないし４
   のいずれかの製造方法。
6. 【請求項６】ニコチン酸を溶液として、微生物の懸濁液
   に通気撹拌しながら連続的に添加する請求項１ないし５
   のいずれかの製造方法。
7. 【請求項７】微生物の増殖および６−ヒドロキシニコチ
   ン酸の生成を、温度２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜９の下
   で行なう請求項１ないし６のいずれかの製造方法。
8. 【請求項８】ニコチン酸をナトリウム塩の水溶液として
   補助栄養剤とともに添加する請求項１ないし７のいずれ
   かの製造方法。