DE112005002781T5

DE112005002781T5 - Verfahren zur Herstellung eines Xanthan-Biopolymers

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Publication number: DE112005002781T5
Application number: DE112005002781T
Authority: DE
Inventors: Claire Trondo Vendruscolo; Angelita Da Silveira Moreira
Original assignee: Fed Pelotas, University of; UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS; Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Current assignee: Fed Pelotas, University of; UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS; Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria EMBRAPA
Priority date: 2004-11-05
Filing date: 2005-11-01
Publication date: 2007-09-27
Also published as: US20080064073A1; BRPI0406309F1; BRPI0406309E2; WO2006047845A1; CN101061230A; GB2433744A; BRPI0406309A; GB0708060D0

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Xanthan-Biopolymers, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellen von isolierten Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni, die zuvor in einem Festmedium angezogen wurden oder, alternativ dazu, lyophilisiert waren;
b) Herstellung des ursprünglichen Prä-Inokulums durch Zugabe der Kolonien zu einem geeigneten Zell-Wuchsmedium enthaltend 13 bis 55 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 1,0 bis 37 g × L^–1 Pepton, 10 bis 20 g × L^–1 Agar, 0,03 bis 0,90 g × L^–1 K₂HPO₄ und 0,001 bis 2,5 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitamine des B Komplexes, wobei die Kolonien 24 bis 48 Stunden unter Schütteln bei 100 bis 250 UpM bei einer Temperatur von 20°C bis 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 inkubiert werden (Schritt 110);
c) Überführen des ursprünglichen Prä-Inokulums in ein Flüssigmedium enthaltend 13 bis 55 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 1,0 bis 37...

Description

Die Erfindung betrifft das Feld der Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung Xanthan-ähnlicher, aus Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pruni Bakterienstämmen erhaltener mikrobieller Biopolymere.
Hintergrundinformation
Mikrobielle Biopolymere sind Polysaccharide, die mit Hilfe biotechnologischer Prozesse unter Verwendung von Pilzen, Hefen oder Bakterien erhalten werden. Die Relevanz und die potentielle Verwendung von Biopolymeren in weiten industriellen Feldern wie Verdickungsmitteln, Stabilisatoren, gellierenden Wirkstoffen und Emulgatoren in Futtermitteln, Arzneimittelprodukten, Farben, Pestiziden, der Mineralölindustrie und ähnlichem ist allgemein bekannt. Zur Zeit werden immer mehr übliche Polysaccharide durch mikrobiell-gestützte Produkte ersetzt. Dies ist hauptsächlich auf die Möglichkeit zur Modifizierung der rheologischen Merkmale dieser Produkte über die Kontrolle der Fermentationsparameter und darüber hinaus, neben anderen Vorteilen, auf die Unabhängigkeit von Klima und Batch-Qualitätskontrolle zurückzuführen.
Xanthan ist ein extrazelluläres anionisches Polysaccharid mit einem hohen Molekulargewicht von 2 × 10⁶ bis 12 × 10⁶ g × Mol^–1, das aus 2000 bis 6000 Repeats von Pentasaccharid-Untereinheiten gebildet wird. Xanthan wird durch aerobe Fermentation von Xanthomonas campestris erhalten, wobei kommerziell der campestris Pathovar verwendet wird. Es wird aus den Monosacchariden D-Mannose, D-Glucose und D-Glukuronsäure sowie Pyruvat- und essigartigen/Essigsäure-Resten gebildet.
Das Hauptmerkmal von Xanthan ist seine Fähigkeit, die Rheologie oder das Fliessverhalten von Lösungen zu verändern. Seine Eigenschaften werden durch seine chemische Zusammensetzung, Struktur und molekularen Bindungen bestimmt. Trotz der Tatsache, dass es sich um Importware handelt, folgt Brasilien dem weltweiten Trend eines erhöhten Xanthanverbrauchs. Bis heute und trotz der Verfügbarkeit einer Reihe Biopolymere produzierender Bakterien und der Tatsache, dass das Land die weltweite Hauptquelle für Rohmaterialien (Saccharose und Alkohol) zur Herstellung dieser Biopolymere ist, stellt Brasilien kein Xanthangummi her.
Bakterielle Polysaccharide bieten die Vorteile regelmäßiger chemischer Struktur, reproduzierbarer chemischer und physikalischer Eigenschaften und einer konstanten Vorratsquelle, da sie für Ihre Herstellung nicht von klimatischen Bedingungen abhängig sind.
Die Entdeckung der Xanthan-Biopolymere fand in den 50er Jahren in den USA statt und hatte ihren Grund in dem Interesse an wasserlöslichen, von Mikroorganismen bereit gestellten Gummis, als beobachtet werden konnte, dass der Xanthomonas campestris pv campestris NRRL B 1459 Stamm extrem gummiartige, visköse Kolonien bildete.
Das erste, mit der Xanthan-Herstellung durch Xanthomonas campestris pv campestris befasste Patentdokument ist das US-Patent 3,000,790. Viele andere folgten, eingereicht durch die US Secretary of Agriculture und Firmen wie Esso Research, Jersey Production Research Co., Kelco Co., Rhone Poulenc Industries, Pfizer Inc., Standard Oil Co., Sanofi Societe Nationale Elf Aquitaine auf Fermentationsverfahren, wie US 3,020,206 , US 3;251,749 , US 3,328,262 , US 3,391,060 , US 3,391,061 , US 3,485,719 , FR 2 342 339 , FR 2 414 555 , US 4,282,321 , EP 66 961 , EP 66 377 , US 4,352,882 , US 4,328,310 , US 4,400,467 , US 4,407,950 , US 4,407,951 , FR 2 671 097 , alle befasst mit der Verwendung von Xanthomonas campestris; sowie mit Verfahren, wobei ein Inoculum in einem Medium hergestellt wird, das 3 g × L^–1 Hefeextrakt, 3 g × L^–1 Malzextrakt, 5 g × L^–1 Pepton, 10 g × L^–1 Glukose und 20 g × L^–1 Agar enthält, wobei die Inkubation zwischen 24 Stunden und 72 Stunden bei Temperaturen zwischen 25°C und 30°C erfolgt.
Als Fermentationsmedien werden Medien verwendet, die von 0,01 bis 0,5% (Masse/Volumen) Mineralsalze wie K₂HPO₄ und MgSO₄, von 0,1 bis 0,5% (Masse/Volumen) organische Säuren wie Bernsteinsäure und 0,01% bis 1% (Masse/Volumen) organische Substanzen wie Sojakleie, Harnstoff und Nitrate enthalten.
Nützliche Kohlenstoffquellen schließen Saccharose, Zuckerrohrmelassen, landwirtschaftliche Kaffee- und Kartoffelprodukte, Milchserum und andere ein.
Andere Patente, wie US 3,119,812 und US 3,773,752 betreffen Verfahren zur Gewinnung von Polymeren durch Alkohole, mit oder ohne Salzzusatz.
Die genannten Patentdokumente verweisen auf die Tatsache, dass die Xanthan-Herstellung auf Xanthomonas campestris fußt. Die erhaltenen Polymere weisen die folgende Zusammensetzung auf: Mannose, Glukose und Glukuronsäure sowie Pyruvat- und essigartige/Essigsäure- Reste.
Ein Nachteil der käuflich erwerbbaren Xanthangummis ist die Tatsache, dass sie trotz ihrer hervorragenden Eigenschaften keine echten Gele liefern, wenn allein eingesetzt. Diese Eigenschaft zeigt sich erst dann, wenn diese Produkte Galaktomannanen und Glukomannanen beigemischt werden. Überraschenderweise weisen die mit dem vorliegenden Verfahren erhaltenen Biopolymere diese Eigenschaft auf: sie liefern echte Gele, wenn sie allein eingesetzt werden.
Darüber hinaus steigt die Viskosität der Biopolymere aus dem Stand der Technik nicht mit der Temperatur, was für verschiedene Verwendungen wünschenswert ist. Allgemein gefasst ist die Viskosität aller von Xanthomonas campestris produzierten Polymere als Folge von Temperaturerhöhung vermindert. Demgegenüber ergeben einige Stämme von Xanthomonas arboricola pseudoplastische Biopolymere, was ein sehr wichtiges technisches Merkmal darstellt.
Ferner zeigen kommerziell erhältliche Xanthan-Biopolymere gegenüber Salzzugabe eine niedrige Toleranz, selbst gegenüber derart niedrigen Werten wie 0,001 bis 1 (Masse/Volumen, M/V), wobei sie üblicherweise eine verminderte Viskosität gegenüber Salzzugaben über 1% (M/V) aufweisen. Dies bedeutet niedrigere Profite hauptsächlich dann, wenn das Xanthanpolymer in der Mineralölindustrie oder der Nahrungsmittelherstellung eingesetzt wird.
Somit bedarf es trotz der bekannten Entwicklungen noch eines Verfahrens zur Herstellung Xanthan-ähnlicher mikrobieller Biopolymere auf der Basis von Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pruni Bakterienstämmen in Fermentationsmedien unter Verwendung von Restwasser und ähnlicher Produkte aus der industriellen Verwertung von Reis bzw. dem Ankochen von Reis („parboiled" Reis), wobei das Inokulum in einem Medium hergestellt wird, das eine niedrige Saccharose- oder Glukosekonzentration aufweist, das ferner ausgerichtet ist auf ein flüssiges Fermentationsmedium, das Makro- oder Mikronährstoffe und andere Inhaltsstoffe enthält, wobei die Fermentation unter bestimmten Verfahrensbedingungen durchgeführt wird, wonach die erhaltenen Biopolymere unlöslich gemacht und isoliert werden. Ein derartiges Verfahren, die erhaltenen Biopolymere, das Kuturmedium und die Verwendungen des Biopolymers werden in der vorliegenden Anmeldung beschrieben und beansprucht.
Zusammenfassung der Erfindung
Allgemein umfasst das vorliegende Verfahren zur Herstellung von Xanthan-ähnlichen Biopolymeren die Schritte:

a) Herstellung des ursprünglichen Prä-Inokulums durch Zugabe isolierter Kolonien von in einem festem Medium gewachsenen oder gefriergetrockneten Kolonien von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni zu einem spezifischen Zell-Wuchsmedium;
b) Übertragen der Kolonien dieses ursprünglichen Prä-Inokulums in ein Flüssigmedium und Inkubation desselben für 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur zwischen 20°C und 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 unter Schütteln bei 100 bis 250 UpM, wodurch das endgültige Prä-Inokulum erhalten wird; das endgültige Prä-Inokulum kann zur weiteren Verwendung gefriergetrocknet werden oder es kann unmittelbar in einen Fermenter überführt werden;
c) Aseptische Überführung des so erhaltenen endgültigen Prä-Inokulums in einen ersten sterilen Fermenter unter Schütteln und Belüftung, der Flüssigmedium und Saccharose oder Glukose bis zu 10% (Masse/Volumen), basierend auf dem Medium enthält und Inkubation für 24 bis 48 Stunden bei Temperaturen zwischen 20°C und 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 unter Schütteln bei 50 bis 1.200 UpM, vorzugsweise 100 bis 800 UpM und unter Belüftung durch Sauerstoffzufuhr zwischen 0,5 und 4 Volumina pro Volumen Luft pro Minute (VVM), vorzugsweise zwischen 0,5 und 3 VVM, wodurch das Inokulum erhalten wird; das endgültige Prä-Inokulum, wenn gefriergetrocknet, sollte durch Resuspendieren und weitere Inkubation unter den vorgenannten Bedingungen reaktiviert werden, bevor es in den ersten Fermenter überführt wird, wohingegen das gerade erst hergestellte endgültige Prä-Inokulum direkt in den ersten Fermenter überführt wird:
d) Überführen des so erhaltenen Inokulums in einen zweiten sterilen Fermenter, enthaltend das Flüssigmedium zur Herstellung des Biopolymers durch submerse Fermentation oder durch Zugabe des sterilen Mediums zu dem das Inokulum enthaltenden Fermenter, Fermentation des Inokulums unter Schütteln zwischen 50 und 1.200 UpM, vorzugsweise zwischen 100 und 800 UpM und unter Belüftung durch Sauerstoffzufuhr zwischen 0,5 und 4 Volumina pro Volumen Luft pro Minute (VVM), vorzugsweise zwischen 0,5 und 3 VVM, bei einer Temperatur zwischen 22°C und 35°C und einem pH-Wert zwischen 4,5 und 9,0 für eine Dauer von 24 bis 120 Stunden, vorzugsweise 48 bis 72 Stunden, wobei das Fermentationsmedium aus dem Einweich- oder Kochwasser von Hülsentragendem Reis oder aus Wasser das, in einer anderen Ausführungsform, aus dem Ankochen von Reis stammt, darüber hinaus aus Cellulose, Reis- und/oder Weizenkleie und/oder Stickstoff-, Phosphor- und Kalium-Makronährstoffen zwischen 0,1 und 4,2 g × L^–1 sowie Magnesium- und Eisen-Mikronährstoffen von 0,01 bis 1,7 g × L^–1 und Vitaminen des B-Komplexes, Vitamin E, Saccharose bis zu 25% (Masse/Volumen) sowie 50 bis 200 ppm Silikonöl oder Reisöl besteht;
e) Filtrierung der Fermentationsbrühe zur Abtrennung der Zellen nach dem Ende der Fermentation;
f) Inaktivierung der Zellen der Fermentationsbrühe durch Hitzesterilisierung oder chemische Sterilisierung mit chlorierten Stoffen im zweiten Fermenter selbst, wodurch das gewünschte Biopolymer erhalten wird;
g) Unlöslich machen des erhaltenen Biopolymers, gegebenenfalls nach Zentrifugation, durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels, vorzugsweise eines Alkohols, zu der Brühe, die zentrifugiert oder nicht zentrifugiert worden ist und zu der entweder 0,2 bis 10% (M/V) mono- und/oder divalente Salze zugegeben worden sind oder nicht zugegeben worden sind;
h) Gewinnung des alkoholischen Lösungsmittels durch Destillation;
i) Abtrennung des Biopolymer-Produktes durch Entwässerung in einem Förderband, wobei dieses einer Trocknung zugeführt wird;
j) Mahlen und Zerdrücken des Biopolymers in einer üblichen Mühle; und
k) Gewinnung des gebrauchsfertigen Xanthan-Biopolymers.

Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Xanthan-ähnlichen Biopolymers aus Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni bereit, wobei das Verfahren die Herstellung eines Inokulums in Nährmedien unter Verwendung von Restwasser und aus der industriellen Reisverarbeitung und angekochtem Reis stammenden Produkten einschließt.
Die Erfindung stellt ferner die aus dem Verfahren erhaltenen Xanthan-ähnlichen Biopolymere bereit.
Darüber hinaus stellt die Erfindung verschiedene Verwendungen des so erhaltenen Biopolymers bereit.
Die Erfindung stellt ferner das Fermentationsmedium für Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni bereit, das für das Verfahren eingesetzt wird.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung einer Kultur von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni für die Durchführung des Verfahrens.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 und 2 stellen Flussdiagramme dar, die das Herstellungsverfahren für das Biopolymer erläutern. 1 erläutert das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart von Zellen, wohin gegen 2 ein Herstellungsverfahren für ein Biopolymer erläutert, aus dem die Zellen entfernt wurden. Daraufhin wird das Biopolymer getrocknet und gemahlen.
3 ist eine graphische Darstellung, die Viskositätswerte von Fermentationsbrühen zweier Xanthomonas arboricola Stämme erläutert.
Die 4 und 5 sind graphische Darstellungen, die Viskositätswerte erläutern, die mit wässrigen Biopolymerlösungen bei 25°C erhalten wurden, Viskositätswerte, die mit demselben Stamm zu verschiedenen Zeiten (24, 48 und 72 Stunden) bei einer 1%igen Konzentration (M/V) erhalten wurden sowie solche, die mit verschiedenen Xanthomonas arboricola Stämmen bei einer 3%igen Konzentration (M/V) erhalten wurden. Die Figuren erläutern ferner das pseudoplastische Verhalten dieser Biopolymerlösungen.
6 ist eine graphische Darstellung, die das Viskositätsverhalten vor einer Temperaturerhöhung erläutern und zwar von Biopolymeren aus verschiedenen Xanthomonas arboricola Stämmen.
7 ist ein Blockdiagramm, das das Produktionsintervall des erfindungsgemäßen Biopolymers durch verschiedene Gruppen von Stämmen erläutert und zwar nach einer Fermentation für 72 Stunden.
8 zeigt den Einfluss oder die Abhängigkeit von der Belüftungsbedingung auf die Biopolymerherstellung. Die Verfahrenbedingungen für Xanthan (g × L^–1) unter Verwendung von dem X. arboricola pv pruni Stamm 06 in einem Fermenter mit einer Kapazität von 3L sind die Behandlungen A (250 UpM und 1,5 Volumina pro Volumen Luft pro Minute – VVM) und B (350 UpM und 2,0 Volumina pro Volumen Luft pro Minute – VVM) für Schütteln bzw. Belüftung.
9 zeigt den Einfluss der Fermentationsdauer auf die scheinbare Viskosität eines Biopolymers, erhalten mit dem Stamm X. arboricola pv pruni 06 bei 6 UpM, für Konzentrationen von 1% (M/V) und 2% (M/V).
In 10 erläutert ein Satz an graphischen Darstellungen die Änderung der Viskosität abhängig von der Scherrate für Xanthan-ähnliche Biopolymere, die mit dem Xanthomonas arboricola Stamm 101 in 3% (M/V) wässrigen Lösungen erhalten wurden, wobei 1% (M/V) Salze zugegeben wurden oder nicht zugegeben wurden, im Vergleich mit käuflich erhältlichen Xanthanpolymeren. Die graphischen Darstellungen von 10 erläutern die Kompatibilität der erfindungsgemäßen Biopolymere mit Salzzugaben.
11 ist ein Satz an graphischen Darstellungen, die die Änderung der Viskosität abhängig von der Scherrate für den Stamm 106 oder für Xanthan-ähnliche Biopolymere erläutern, die mit Xanthomonas arboricola in 1% (M/V) wässrigen Lösungen ohne Salzzugabe oder mit Salzzugabe zu 0,1%, 1,0% und 3% (M/V) Salz erhalten wurden, im Vergleich mit käuflich erhältlichen Xanthanpolymeren ohne Salzzugabe.
12 ist ein Satz an graphischen Darstellungen, die die Änderung der Viskosität abhängig von der Scherrate für den Stamm 106 oder für Xanthan-ähnliche Biopolymere erläutern, die mit Xanthomonas arboricola in 1% (M/V) wässrigen Lösungen ohne Salzzugabe oder mit Salzzugabe zu 0,1%, 1,0% und 3% (M/V) Salz erhalten wurden, im Vergleich mit zwei käuflich erhältlichen Xanthanpolymeren, denen Salze in Mengen zwischen 1% (M/V) und 3% (M/V) zugegeben wurden.
13 ist ein Satz an graphischen Darstellungen, die die Änderung der Viskosität abhängig von der Scherrate für die Stämme Xanthomonas arboricola 06, 101 und 106 erläutern, die unter freiem und kontrolliertem pH-Wert hergestellt wurden, im Vergleich mit käuflich erhältlichem Xanthangummi.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Xanthan-ähnlichen mikrobiellen Biopolymeren aus Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni Bakterienstämmen, in Fermentationsmedien enthaltend Restwasser und Produkte aus der Reisverarbeitung und angekochtem Reis.
Die Xanthomonas Bakterien, welche zur Familie Pseudomoniaceae gehören, sind Gram-negativ, mobil vermittels einer einzigen Flagelle, strikt aerob, resistent gegenüber Streptomycin und im wesentlichen phytopathogen, wobei Xanthomonas maltophilia eine Ausnahme darstellt. Sie sind weit verbreitet und infizieren mehr als 240 mono- und dikotyledone Pflanzengattungen. Xanthomonas campestris kommt am häufigsten und zahlreichsten vor und hat sich in etwa 125 Pathovare entwickelt, die verschiedene Pflanzen infizieren und in denen die Ursache von Krankheiten sind.
Xanthomonas arboricola pv pruni
Traditionell haben Xanthanhersteller den campestris Pathovar verwendet und insbesondere den Stamm NRRL B-1459 und verwandte Stämme. Angesichts der gewaltigen industriellen Anwendungen dieses Biopolymers werden jedoch andere möglicherweise Xanthan produzierende Mikroorganismen untersucht. Darüber hinaus wird die Optimierung des Zellwachstums, die Herstellung, die Gewinnung und Aufreinigung der erhaltenen EPS (Exopolysaccharide) untersucht.
Der pruni Pathovar ist die Ursache bakterieller Flecken in Arten der Gattung Prunus (Prunus bakterielle Flecken, PBF), wie beim Pfirsichbaum, dem Mandelbaum und dem Pflaumenbaum. Diese Krankheit tritt in allen Kontinenten auf und ist ernster in Bereichen mit heißem, feuchtem Klima. Davon unterschieden zeigt Xanthomonas campestris eine systemische Aktivität: Es wirkt auf die gesamte Pflanze, wohin gegen X. pv pruni eine lokal begrenzte Wirkung zeigt. Im Staate Rio Grande do Sul im äußersten Süden von Brasilien infiziert dieses Bakterium natürlicherweise alle kultivierten Prunusarten und ist Gegenstand phytopathologischer Untersuchungen gewesen, die von der Brasilianischen Staatlichen Landwirtschaftlichen Forschungsgesellschaft („Brazilian State Agricultural Research Company"), EMBRAPA-CPACT durchgeführt wurden. Zu diesem Zweck wurden bereits mehr als einhundert Stämme isoliert und identifiziert. Jedoch wurden erst vor kurzem Studien zum Erhalt von Xanthangummi aus diesem Pathovar gestartet.
Seit kurzem gibt es eine neue Klassifikation der Gattung Xanthomonas, die auf einer vergleichenden Studie von Oligonukleotidsequenzen der ribosomalen Nukleinsäure (rRNA) oder von Sequenzen der entsprechenden Gene und der quantitativen DNA-Homologie, dargestellt in Hybridisierungswerten der zellulären Gesamt-DNA beruht. Entsprechend dieser neuen Klassifizierung wurde Xanthomonas pruni neu als Xanthomonas arboricola klassifiziert.
Die Anmelderin vermerkt, dass alle in der Entwicklung der Erfindung verwendeten Stämme zur EMBRAPA Sammlung von Xanthomonas arboricola- und Xanthomonas arboricola pv pruni Stämmen gehören.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Xanthan-ähnlichen Biopolymeren aus gefriergetrockneten Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pruni Bakterienstämmen.
Erfindungsgemäß werden für die Umsetzung des vorliegenden Verfahrens gefriergetrocknete Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pruni Bakterienstämmen aus nekrotisierten Geweben von Arten der Gattung Prunus, nekrotisisierten Geweben von Wirten mit hohem Zellulosegehalt, Früchten und Blättern von Pfirsichbäumen und Pflaumenbäumen isoliert und in Submersfermentationsmedien fermentiert und zwar unter geeigneten Verfahrensbedingungen, die nachfolgend in der Anmeldung genauer dargestellt sind. Der Ausdruck „hoher Zellulosegehalt" bezeichnet einen Zellulosegehalt im Bereich von 38% bis 56%, auf der Basis der Gesamtzusammensetzung.
Als äußerst bemerkenswertes Ergebnis der Verwendung von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pruni bleibt festzuhalten, dass die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Xanthan-Biopolymere sich von den momentan kommerziell erhältlichen Xanthan-Biopolymeren dahingehend unterscheiden, dass die Gegenwart von Rhamnose diesen Produkten die Fähigkeit zur Bildung echter Gele verleiht, wenn sie allein verwendet werden. Wie vorstehend bemerkt, haben die Xanthan-Biopolymere aus dem Stand der Technik diese Eigenschaft nicht.
Ein weitere Vorteil liegt in den niedrigeren Herstellungskosten angesichts der Verwendung von Restwasser aus der Reisverwertung, wie vorstehend erwähnt.
Der Hauptvorteil bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Biopolymers liegt in der Mineralölerforschung, in der Polymere mit hoher Viskosität und Temperaturresistenz erforderlich sind.
Die Verwendung in Nahrungsmitteln wird ebenfalls als vorteilhaft in Erwägung gezogen, da die erforderliche Menge im Vergleich zu der konventioneller Xanthan-Biopolymere vermindert ist, da die bloße Gegenwart von bereits in Produktformulierungen vorliegenden Salzen ausreicht, eine Erhöhung der Viskosität zu bewirken.
Andere Verwendungen schließen die als Farbenverdickungsmittel, als Pestizide in solchen Fällen, in denen es hilfreich ist, die Anheftung der Pestizide an die Pflanzenblätter zu verbessern, wodurch Produktverluste an die Erde vermieden werden und in Veterinärprodukten als Imstoffstabilisator ein.
Für ein besseres Verständnis des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Verfahrensschritte nachstehend genau dargestellt.
Gemäß der Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens, das im Fließdiagramm von 1 dargestellt ist, allgemein dargestellt durch die Nummer (100), wobei die zweite Fermentation in einem Flüssigmedium mit einer Zuckerkonzentration bis zu 25% (Masse/Volumen; oder 250 g × L^–1) des Fermentationsmediums stattfindet, umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen von isolierten Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni, die zuvor in einem Festmedium angezogen wurden oder, alternativ dazu, lyophilisiert waren;
b) Herstellung des ursprünglichen Prä-Inokulums durch Zugabe der Kolonien zu einem geeigneten Zell-Wuchsmedium enthaltend 13 bis 55 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 1,0 bis 37 g × L^–1 Pepton, 10 bis 20 g × L^–1 Agar, 0,03 bis 0,90 g × L^–1 K₂HPO₄ und 0,001 bis 2,5 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitamine des B Komplexes, wobei die Kolonien 24 bis 48 Stunden unter Schütteln bei 100 bis 250 UpM bei einer Temperatur von 20°C bis 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 inkubiert werden (Schritt 110); vorzugsweise enthält das Zell-Wuchsmedium 10 bis 30 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 3 bis 15 g × L^–1 Pepton, 10 bis 20 g × L^–1 Agar, 0,09 bis 0,7 g × L^–1 KH₂PO₄ und 0,01 bis 1,0 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitamine des B Komplexes. Der bevorzugte Bereich für den pH-Wert liegt zwischen 5,5 und 7,5.
c) Überführen des ursprünglichen Prä-Inkokulums in ein Flüssigmedium enthaltend 13 bis 55 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 1,0 bis 37 g × L^–1 Pepton, 0,03 bis 0,90 g × L^–1 K₂HPO₄ und 0,001 bis 2,5 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitamine des B Komplexes, wobei die Kolonien 24 bis 48 Stunden unter Schütteln bei 100 bis 250 UpM bei einer Temperatur von 20°C bis 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 inkubiert werden, wonach das endgültige flüssige Prä-Inokulum erhalten wird (Schritt 120); vorzugsweise enthält das Zell-Wuchsmedium 10 bis 30 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 3 bis 15 g × L^–1 Pepton, 0,09 bis 0,7 g × L^–1 KH₂PO₄ und 0,01 bis 1,0 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitamine des B Komplexes. Der bevorzugte Bereich für den pH-Wert liegt zwischen 5,5 und 7,5.

Das endgültige flüssige Prä-Inokulum kann für die weitere Verwendung gefriergetrocknet oder direkt in den ersten Fermenter überführt werden.

d) Asepische Überführung des endgültigen Prä-Inokulums in einen ersten sterilen Fermenter unter Schütteln bei 50 bis 1.200 UpM und Belüftung durch Sauerstoffinjektion von 0,5 bis 4 Volumina pro Volumen Luft pro Minute, vorzugsweise von 0,5 bis 3 Volumina pro Volumen Luft pro Minute, wobei der erste Fermenter ein Flüssigmedium enthält, bestehend aus 100 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 1,0 bis 37 g × L^–1 Pepton, 0,03 bis 0,90 g × L^–1 K₂HPO₄ und 0,001 bis 2,5 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitaminen des B Komplexes, wobei für 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 20°C bis 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 inkubiert wird, wonach am Ende der Fermentationsdauer das Inokulum erhalten wird (Schritt 130); die bevorzugten Mengen entsprechen denen des ursprünglichen und endgültigen Prä-Inokulums. Wann immer das endgültige Prä-Inokulum gefriergetrocknet wird, sollte es durch Resuspendieren und Überführen in eine frische Inkubation unter den vorgenannten Bedingungen vor der Überführung in den ersten Fermenter reaktiviert werden. Alternativ dazu wird das frisch hergestellte Prä-Inokulum direkt in einen Fermenter überführt.
e) Überführen des Inokulums in einen zweiten sterilen Fermenter, enthaltend das flüssige Fermentationsmedium zur Herstellung des Biopolymers durch Submersfermentation oder, in einer anderen Ausführungsform, durch Zugabe des sterilen Mediums zu dem das Inokulum enthaltenden Fermenter, unter Schütteln zwischen 50 und 1.200 UpM, vorzugsweise zwischen 100 und 800 UpM und unter Belüftung durch Sauerstoffinjektion zwischen 0,5 und 4 Volumina pro Volumen Luft pro Minute, vorzugsweise zwischen 0,5 und 3 Volumina pro Volumen Luft pro Minute, bei einer Temperatur zwischen 22°C und 35°C, vorzugsweise zwischen 22°C und 32°C und einem pH-Wert zwischen 4,5 und 9,0, entsprechend der gewünschten Endverwendung für das Biopolymer, wobei die Fermentation für eine Dauer von 24 bis 120 Stunden, vorzugsweise 48 bis 72 Stunden durchgeführt wird, wobei das Medium aus dem Einweich- oder Kochwasser von Hülsen-tragendem Reis oder aus Wasser, das aus dem Ankochen von Reis stammt, besteht, das darüber hinaus Gellulose, Reis- und/oder Weizenkleie und/oder Stickstoff-, Phosphor- und Kalium-Makronährstoffe zwischen 0,1 und 7,2 g × L^–1 sowie Magnesium- und Eisen-Mikronährstoffe von 0,01 bis 1,7 g × L^–1 und Vitamine des B-Komplexes, Vitamin E, Saccharose bis zu 25% (Masse/Volumen; oder 250 g × L^–1) sowie 50 bis 200 ppm Silikonöl oder Gemüseöl enthält (Schritt 140); vorzugsweise enthält das Medium neben dem Reiswasser Makronährstoffe wie Stickstoff, Phosphor und Kalium zwischen 1,2 und 4,0 g × L^–1 sowie Mikronährstoffe wie Magnesium und Eisen von 0,1 bis 1,0 g × L^–1 und Vitamine des B-Komplexes zwischen 0,06 bis 2 mg × L^–1, Vitamin E von 10 bis 30 μg × L^–1, Saccharose bis zu 25% (Masse/Volumen) sowie 50 bis 200 ppm Silikonöl oder Reisöl.
e) Nach dem Ende der Fermentation, Filtrierung der Fermentationsbrühe zum Zwecke der Zellabtrennung; Schritt (150)
f) Inaktivierung der Zellen der Fermentationsbrühe durch Hitzesterilisierung unter Dampfdruck bei 121°C oder chemische Inaktivierung mit chlorierten Stoffen im Fermenter selbst, Schritt 150 ;

Die Hitzesterilisierung wird unter Dampfdruck bewirkt, dessen Temperatur sich um Bereich von 121°C bewegt.
Geeignete chlorierte Stoffe für die chemische Inaktivierung der Brühe schließen anorganische Substanzen wie Natriumhypochlorid und Salzsäure ein, eingesetzt in einer Konzentration zwischen 100 und 200 ppm Chlor. Einsetzbare organische Substanzen schließen Chlorhexidin, 0,01 bis 0,1% (M/V) ein.
Wann immer die Abtrennung von Zellen erforderlich ist, wird das Unlöslichmachen des erhaltenen Biopolymers nach Zentrifugation erreicht (vgl. 2).
Wenn die Zellen nicht abgetrennt werden, wird das Unlöslichmachen des Polymers nach der Zellinaktivierung durchgeführt.

g) Umsetzung des Unlöslichmachens, Schritt (170), durch Zugabe von polarem organischem Lösungsmittel zur inaktivierten Brühe, wobei mono- und/oder divalente Salze, ausgewählt aus NaCl, KCl und CaCO₃, in Konzentrationen zwischen 0,2 und 10% Masse/Volumen vom zugegebenen Lösungsmittel zugegeben werden;

Die Polymerfällung findet statt, wenn die Lösungsmittelkonzentration zwischen 50% und 80% des Gesamtvolumens erreicht. Das erforderliche Volumen an Lösungsmittel hängt ab von dem Prozentsatz zugegebenen Salzes.
Einsetzbare Lösungsmittel für die Zwecke der Erfindung umfassen polare organische Lösungsmittel, insbesondere C₂- und C₃-Alkohole, in reiner Form oder als Beimischung in irgendeiner Menge.

h) Gewinnung des polaren Lösungsmittels, wie einem Alkohol, durch Destillieren und Wiedereinführen in das Verfahren, Schritt (170a);
i) Trocknung des Biopolymerproduktes durch anfängliche Entwässerung desselben in einem Förderband, anschließende Überführung des abgetrennten Produktes auf Oberflächentrockner oder ähnliche Vorrichtungen, Schritt (180), gefolgt von Mahlen oder Zerquetschen in irgendeiner üblichen Vorrichtung für diesen Zweck, Schritt (180a); und
j) Gewinnen des Xanthan-ähnlichen Biopolymers, einsatzbereit für die gewünschte Verwendung, Schritt (190). Gegebenenfalls kann die Fermentationsbrühe direkt getrocknet werden, wobei ein Spraytrockner oder ein Oberflächentrockner eingesetzt wird. Anschließend wird auf die gewünschte Teilchengrößenverteilung in einer Kugelmühle oder einer üblichen Mühle zerkleinert.

In einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren ohne pH-Wert Kontrolle ausgeführt (oder unter freien pH-Wert Bedingungen), indem man bei einem beinahe neutralen pH-Wert startet und das Reaktionssystem auf niedrigere pH-Werte abfallen lässt.
Wann immer die Viskosität der Fermentationsbrühe über 250 mPa × s bei 10s-1 liegt, wird diese mit Wasser oder mit einem Gemisch von Wasser und polaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise C₁- bis C₃-Alkoholen verdünnt, wie Ethylalkohol und Isopropylalkohol, bis die Viskosität auf Werte unterhalb von 250 mPa × s bei 10s^–1 fällt. Dies ist ein wesentliches Merkmal des Verfahrens, da zu visköse Brühen einen Produktverlust im Gewinnungsschritt bedeuten, was vermieden werden muss.
Eine andere Art, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, ist im Fließdiagramm der 2 dargestellt, allgemein dargestellt durch die Zahl (200). Gemäß dieser Art und Weise werden ein Zentrifugationsschritt (250) für die Abtrennung von Zellen und ein weiterer Schritt für die Entfernung von Zellen oder deren Zerstörung (260a) eingeführt.
Gemäß 2 stellt Schritt (210) die Herstellung des ursprünglichen Prä-Inokulums aus der Zugabe von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni Kolonien in Festmedium oder von Kolonielyophilisaten zu einem Fermentationsmedium dar. Die Schritte (220) und (230) haben dieselbe Bedeutung wie die entsprechenden Zahlen (120) und (130) in 1.
Schritt (240) ist der zweite Fermentationsschritt in einem Flüssigmedium mit bis zu 500 g × L^–1 Zucker (Saccharose oder Glukose).
Der Zell-Inaktivierungsschritt ist durch Schritt (240a) dargestellt.
Dem zweiten Fermentationsschritt folgt ein Schritt, bei dem die Zellen zerstört werden (240b).
Schritt (250) stellt einen Zentrifugationsschritt für die Abtrennung der Zellen dar. Die Zentrifugation wird bei 10.000 bis 15.000 g bewirkt.
Die Zentrifugationsbrühe wird anschließend mit Alkohol (maximal 40 Vol.-% Alkohol) verdünnt und die Gewinnung des Biopolymers wird durch Unlöslichmachen erreicht, Schritt (260).
Schritt (260a) stellt die Gewinnung des Alkohols durch Destillation dar, der als Lösungmittel wieder verwendet wird.
Nachdem es unlöslich gemacht wurde, wird das Biopolymerprodukt den Schritten der Trocknung (270), des Mahlens oder Zerquetschens (280) und der Gewinnung des Biopolymer-Endproduktes (290) zugeführt.
Die Produktivität der im vorliegenden Verfahren eingesetzten Bakterienstämme, hinsichtlich der Ausbeute an g × L^–1 erhaltenem Biopolymer erreicht 5,7 bis 26,4, bei einem Durchschnittswert zwischen 15 und 22.
Eine zweite Ausführungsform der Erfindung betrifft das Fermentationsmedium, welches für die Durchführung des zweiten Fermentationsschrittes des Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Xanthan-ähnlichen Biopolymers eingesetzt wird.
Bevorzugte Fermentationsmedien werden nachfolgend aufgeführt und schließen die mit A bis J bezeichneten Medien ein.
MEDIUM A
Dieses Fermentationsmedium umfasst:

a) Das Koch- oder Einweichwasser von Hülsen-enthaltendem Reis, ferner das Restwasser aus der Verarbeitung von angekochtem Reis (Reisankochen)(auch als Einweichwasser bekannt);

Die Zusammensetzung derartigen Reiswassers oder Reiseinweichwassers schließt etwa 20 mg × L^–1 bis 80 mg × L^–1 Gesamtstickstoff, hauptsächlich als organischer Stickstoff ein, der ein ausgezeichnetes Substrat für die Xanthomonas pv pruni Bakterien darstellt. Darüber hinaus enthält derartiges Wasser 10 mg × L^–1 bis 50 mg × L^–1 Phosphationen und 2 bis 20 mg × L^–1 Sulfationen.

b) kommerziell erhältliche Reiskleie, enthalten in einer Menge von 0,2 mg bis 40 g pro Liter;
c) kommerziell erhältliche Weizenkleie, enthalten in einer Menge zwischen 0,3 g × L^–1 und 10 g × L^–1;
d) Stickstoff-, Phosphor- und Kalium-Makronährstoffe von 0,1 bis 7,2 g × L^–1 sowie Magnesium- und Eisen-Mikronährstoffe in einer Menge zwischen 0,01 und 1,7 g × L^–1;
e) Vitamine des B-Komplexes, einschließlich der Vitamine B1, B2 und Niacin (Vitamin B3) in käuflich erhältlicher, aufgereinigter Form, in Konzentrationen zwischen 0,02 mg × L^–1 und 3 mg × L^–1 oder, in einer anderen Ausführungsform, natürliche Substrate, die reich an Vitaminen des B-Komplexes sind. Substrate, die reich an Vitaminen des B-Komplexes sind, sind solche, bei denen die Summe dieser Vitamine höher ist als 10% Masse/Masse, wie Brauereihefe, Hefeextrakt, dehydrierte Hefen und Malz;
g) Vitamin E, enthalten in einer Menge von 10 bis 30 μg/L oder als Mittel gegen die Schaumbildung im Laufe des Verfahrens, durch die Verwendung von an diesem Vitamin reichen Gemüseölen wie Sonnenblumenöl, Baumwollöl oder Sojaöl;
h) Zucker wie Saccharose oder Glukose in einer Konzentration bis zu 250 g × L^–1 oder, in einer anderen Ausführungsform, bis zu 500 g × L^–1.

Alternativ dazu können andere Medien im erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren eingesetzt werden. In einigen Fällen erhöht der Einsatz derartiger alternativer Medien den Ertrag des Verfahrens um bis zu 50%.
MEDIUM B
Die Zusammensetzung von Medium B schließt (in g × L^–1) 0,15 bis 5,0 KH₂PO₄, 0,01 bis 0,6 MgSO₄ × 7 H₂O, 10 bis 250 Saccharose und 0,2 bis 6 Reiskleie ein.
MEDIUM C
Die Zusammensetzung von Medium C schließt (in g × L^–1) 0,2 bis 1,5 NH₄H₂PO₄, 1 bis 5 K₂HPO₄, 0,1 bis 0,6 MgSO₄ × 7 H₂O, 0,2 bis 2,0 Zitronensäure, 2 bis 5,0 KH₂PO₄, 0,006 H₃BO₃, 2,0 (NH₄)₂SO₄, 0,0024 FeCl₃, 0,002 CaCl₂ × 2 H₂O, 0,002 ZnSO₄, 10 bis 250 Saccharose und 0,2 bis 6 Reiskleie ein.
MEDIEN D bis J
Andere nützliche Fermentationsmedien sind nachfolgend in Tabelle 1 dargestellt, wobei die Zusammensetzung verschiedener Fermentationsmedien verschiedene Salzkonzentrationen aufweist, dargestellt in g × L^–1. Tabelle 1
Die Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben.
3 ist eine graphische Darstellung von Beispielen der Viskositätswerte von Fermentationsmedien zweier Xanthomonas arboricola Stämme, gegen die Scherrate aufgetragen. Die Kurve von Medium 1 betrifft den Stamm 82, wohingegen die Kurve von Medium 2 Stamm 87 betrifft.
Die 4 ist eine graphische Darstellung, die die Viskositätswerte erläutert, die mit 1% (M/V) wässrigen Biopolymerlösungen bei 25°C erhalten wurden, erzeugt von einem einzelnen Stamm zu verschiedenen Zeiten (24, 48 und 72 Stunden). Die Kurve 1 bezieht sich dabei auf das nach 24 Stunden erhaltene Biopolymer, wohingegen die überlappenden Kurven 2 und 3 sich auf die nach 48 bzw. 72 Stunden erhaltenen Biopolymere beziehen.
Die 5 ist eine graphische Darstellung, die die Viskositätswerte erläutert, die mit 3% (M/V) wässrigen Biopolymerlösungen erhalten wurden, erzeugt von verschiedenen Xanthomonas arboricola Stämmen. Die Kurven 1, 2, 3, 4, 5 und 6 stellen die verschiedenen Viskositätswerte der Biopolymere dar, die mit den Stämmen 101, 108, 113, 30, 25 und 83 erzeugt wurden.
Die 4 und 5 erläutern ferner das pseudoplastische Verhalten der getesteten Biopolymerlösungen.
6 ist ein Blockdiagramm, das das Viskositätsverhalten vor der Temperaturerhöhung erläutert und zwar von Biopolymeren aus verschiedenen Xanthomonas arboricola Stämmen. In dieser Figur bezeichnet ein ausgefüllter Block Viskositätswerte bei 25°C, wohingegen ein leerer Block Viskositätswerte bei 65°C bezeichnet.
7 ist ein Blockdiagramm, das das Produktionsintervall des erfindungsgemäßen Biopolymers durch verschiedene Gruppen von Stämmen erläutert und zwar nach einer Fermentation für 72 Stunden. Weiße Blöcke stellen das Produktionsintervall, umfassend 10 bis 14 g × L^–1 dar, das von den Stämmen 06, 106, 46, 101, 37 und 20 gezeigt wird. Leicht graue Blöcke stellen das Produktionsintervall, umfassend 15 bis 18 g × L^–1 dar, das von den Stämmen 18, 07, 39, 36 und 15 gezeigt wird. Dunkelgraue Blöcke stellen das Produktionsintervall, umfassend 20 bis 26 g × L^–1 dar, das von den Stämmen 24, 58, 40 und 31 gezeigt wird, erhalten in Fermentern mit einer Kapazität von 10L.
8 ist ein Blockdiagramm, das den Einfluss oder die Abhängigkeit von der Belüftungsbedingung auf die Xanthan-Biopolymerproduktivität in g × L^–1 unter Verwendung von Xanthomonas arboricola pv pruni Stamm 06 in einem Fermenter mit einer Kapazität von 3L zeigt. Die mit A bezeichneten Bedingungen (250 UpM und 1,5 VVM) für Schütteln bzw. Belüftung ist durch ausgefüllte Blöcke angezeigt, wohingegen die mit B bezeichneten Bedingungen (350 UpM und 2,0 VVM) durch weiße Blöcke dargestellt ist.
Die graphische Darstellung 9 zeigt den Einfluss der Fermentationsdauer, der Konzentration des Biopolymers und der Testtemperatur auf die scheinbare Viskosität von Biopolymeren, erhalten mit dem Stamm Xanthomonas arboricola pv pruni 06.
Die Kurven 1, 2 und 3 bezeichnen Viskositätswerte wässriger Lösungen (2% Masse/Volumen) von Biopolymeren, die zu verschiedenen Zeiten erhalten wurden, gemessen bei 65°C, 45°C und 25°C. Die Kurven 4, 5 und 6 bezeichnen Viskositätswerte wässriger Lösungen (1% Masse/Volumen) derselben Biopolymere, die in den Kurven 1, 2 und 3 dargestellt sind, gemessen bei denselben Temperaturen.
In 10 erläutert ein Satz an graphischen Darstellungen die Änderung der Viskosität abhängig von der Scherrate für Xanthan-ähnliche Biopolymere, die mit dem Xanthomonas arboricola Stamm 101 in 1% (M/N) wässrigen Lösungen erhalten wurden. Dabei wurden den Lösungen gegebenenfalls 1% oder 3% (M/V) Salze zugegeben, im Vergleich mit käuflich erhältlichen Xanthanpolymeren. Die graphischen Darstellungen erläutern die Kompatibilität der erfindungsgemäßen Biopolymere mit Salzzugaben. Die Kurve 1 bezeichnet die Viskosität eines kommerziell erhältlichen Xanthan-Biopolymers, dem 1% (M/V) Salze zugesetzt worden sind. Die Kurve 2 bezeichnet die Viskosität desselben kommerziell erhältlichen Biopolymers, dem 3% (M/V) Salze zugesetzt worden sind. Die Kurve 3 betrifft das Biopolymer aus dem Stamm 101, dem 3% (M/V) Salze zugesetzt worden sind und die Kurve 4 bezeichnet die Viskosität desselben Biopolymers aus dem Stamm 101, dem 1% (M/V) Salze zugesetzt worden sind. Die Kurve 5 bezeichnet die Viskosität des Biopolymers aus dem Stamm 101, ohne dass Salze zugesetzt worden wären. Es ist zu beachten, dass die Kurve 3 eine zehnfach erhöhte Viskosität des Biopolymers aus dem Stamm 101 zeigt, wenn 3% (M/V) Salze zugesetzt wurden, verglichen mit der Kurve 5, die dasselbe Biopolymer ohne den Salzzusatz zeigt.
11 ist ein Satz an graphischen Darstellungen, die die Änderung der Viskosität abhängig von der Scherrate für Xanthan-ähnliche Biopolymere in 1% (M/V) wässrigen Lösungen erläutern, die mit Xanthomonas arboricola Stamm 106 mit oder ohne Hitzinaktivierung, mit oder Salzaddition erhalten wurden, im Vergleich mit käuflich erhältlichen Xanthangummis, denen keine Salze zugegeben wurden. Die Kurve 1 bezeichnet das durch Hitzinaktivierung erhaltene Biopolymer, zu dem 1% (M/V) Salze zugegeben wurden. Die Kurven 2, 3 und 4 bezeichnen das ohne Hitzinaktivierung erhaltene Biopolymer, zu dem 0,1, 1 und 3% (M/V) Salze zugegeben wurden. Die Kurve 5 stellt die Viskosität eines käuflich erwerbbaren Xanthan-Polymers in wässriger Lösung dar, der keine Salze zugesetzt wurden.
12 ist ein Satz an graphischen Darstellungen, die die Änderung der Viskosität abhängig von der Scherrate für den Stamm 106 oder für Xanthan-ähnliche Biopolymere erläutern, die mit Xanthomonas arboricola in 1% (M/V) wässrigen Lösungen, mit Salzaddition zu 0,1%, 1,0% und 3% (M/V) erhalten wurden, im Vergleich mit zwei käuflich erhältlichen Xanthanpolymeren, denen Salze in Mengen von 1% (M/V) und 3% (M/V) zugegeben wurden. Die Kurven 1, 2 und 3 betreffen die Viskosität von Stamm 106, wohingegen die Kurven 4 und 5 die Viskosität eines kommerziell erhältlichen Xanthan-Polymers und die Kurven 6 und 7 die eines weiteren kommerziell erhältlichen Xanthan-Polymers bezeichnen.
13 ist ein Satz an graphischen Darstellungen, die die Änderung der Viskosität abhängig von der Scherrate für Xanthan-ähnliche Biopolymere der Stämme Xanthomonas arboricola 06, 106 und 101 erläutern, die unter freiem und kontrolliertem pH-Wert hergestellt wurden, im Vergleich mit käuflich erhältlichem Xanthangummi. Die Kurve 1 stellt die Viskosität einer 1% (M/V) wässrigen Lösung des Biopolymers aus Stamm 106 bei einem kontrollierten pH-Wert von 7 in einem 10L Fermenter dar, die Kurve 2 stellt die Viskosität einer 1% (M/V) wässrigen Lösung des Biopolymers aus Stamm 06 bei einem kontrollierten pH-Wert von 7 und 0,1 (M/V) Salzzusatz dar, die Kurve 3 stellt die Viskosität einer 1% (M/V) wässrigen Lösung des Biopolymers aus Stamm 101 bei einem kontrollierten pH-Wert von 7 und einem Salzzusatz zu 3% (M/V) dar und die Kurve 4 stellt die 1% (M/V) Viskosität eines käuflich erhältlichen Xanthan-Biopolymers bei Zugabe von Salzen zu 1% (M/V) dar.
In der vorliegenden Anmeldung wird der Begriff Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni verwendet, was bedeutet, dass Kombinationen von Stämmen ebenfalls in des erfindungsgemäße Konzept passen. Die einzige Beschränkung für die Mischung von Stämmen liegt darin, dass beide Fermentationsbedingungen für das Verfahren benötigen, die ähnliche pH-Bereiche und Belüftungsbedingungen einschließen. Nützliche Kombinationen sind beispielsweise solche, bei denen ein Stamm eine relativ niedrige Produktivität und eine hohe Viskosität aufweist und ein anderer Stamm eine höhere Produktivität und eine nicht so hohe Viskosität aufweist. Die Kombination wird einen höheren Ertrag und eine höhere Viskosität ergeben, verglichen mit dem Durchschnitt beider Parameter für die beiden Stämme selbst.
Eine dritte Ausführungsform der Erfindung betrifft die mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen Biopolymere.
Die Merkmale der erfindungsgemäßen, mit dem Verfahren erhaltenen Biopolymere aus Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni umfassen:

a) Zusammensetzung; Heteroexopolysaccharid, hauptsächlich gebildet aus Monosacchariden wie Glukose, Mannose, Glukuronsäure, Brenztraubensäure, Essigsäure und, im Unterschied zu Xanthomonas campestris pv campestris und manhiotis, aus Rhamnose;
b) Hohes Molekulargewicht, zwischen 4 × 10⁶ und 12 × 10⁶ g × Mol^–1;
c) Erscheinungsform; besonders nützlich als Pulver, mit oder ohne Salzzusatz, wobei das Biopolymer leicht in kaltem oder heißem Wasser oder in schwach ionischen Lösungen gelöst werden kann. In einer anderen Ausführungsform wird das Biopolymer als wässrige konzentrierte Lösungen (2 bis 6 M/V Biopolymer) zur Verfügung gestellt und kann damit bei Bedarf in gebrauchsfertiger Form zu den Produkten zugegeben werden;
d) Farbe; als Pulver oder auch in konzentrierten Lösungen variiert die Farbe zwischen hellgrau und hellgelb und erreicht selten ein dunkles Braun, wobei die gezeigte Farbe eine Funktion der Verfahrensbedingungen darstellt. Nach Aufreinigung ist das Biopolymer ein weißes oder sehr hellgelbes Produkt, das selbst bei so hohen Konzentrationen von 3% M/V oder 6% M/V klare Lösungen ergibt.

Die neue Verwendung von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni, kombiniert mit den neuen Fermentationsmedien auf der Grundlage von Restwasser aus der Reis verarbeitenden Industrie, wie Ankochen von Reis, der Zugabe von ähnlichen Produkten und Nebenprodukten wie Reiskleie und ferner von anderen Medien, wie vorstehend erwähnt, unter Bedingungen aerober Fermentation, wie in der vorliegenden Anmeldung vorgeschlagen ermöglicht den Erhalt eines neuen Xanthan-Biopolymers.
Die chemische Zusammensetzung der von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni hergestellten Biopolymere ist wie folgt: D-Mannose, D-Glukose, D-Glukuronsäure und Rhamnose in den Mengen von 3:3:1:1 und ferner Acetyl- und Pyruvatgruppen im Bereich von 1,1 bis 5,5% bzw. 0,3 bis 0,9%.
Eine Verbesserung stellt die höhere Temperaturresistenz der erfindungsgemäßen Biopolymere im Vergleich zu derjenigen der kommerziell erhältlichen Xanthangummis dar.
Die Viskositätswerte dieser Biopolymere sind höher als diejenigen der kommerziell erhältlichen analogen Polymere.
Darüber hinaus sind die neuen Biopolymere äußerst effizient, was ihre Kompatibilität mit Salzen angeht. Damit ist es möglich, durch die Zugabe von 0,2 bis 10% (M/V) an Salzen die Viskositätswerte von 1% M/V bis 3% M/V wässrigen Biopolymerlösungen zu verdoppeln.
Die Eigenschaften, welche die erfindungsgemäßen Biopolymere von den kommerziell erhältlichen Xanthan-Polymeren unterscheiden, sind in den folgenden Tabellen dargestellt.
So führt die nachstehende Tabelle 2 Werte für die scheinbare Viskosität vis-a-vis der Temperaturresistenz einer wässrigen 3% M/V Lösung von Biopolymeren aus Xanthomonas arboricola pv pruni Stämmen bei 6 UpM, 25°C und 65°C auf. Als Kontrolle diente ein kommerziell erhältliches Xanthanpolymer unter denselben Bedingungen. Tabelle 2
Mit den erweiterten Experimenten, die mit verschiedenen Stämmen von Xanthomonas arboricola und Xanthomonas arboricola pv pruni durchgeführt wurden, konnte bewiesen werden, dass die Qualität und das rheologische Verhalten des erhaltenen Biopolymers eine Funktion des spezifischen Stammes ist, wie vorstehend in Tabelle 2 dargestellt. So ist die Viskosität wässriger Biopolymerlösungen, erhalten mit den Stämmen 24, 87 und 46 als Ergebnis eines Temperaturanstieges vermindert, was ein übliches Merkmal von Biopolymerlösungen darstellt.
Die Viskositätswerte der Stämme 20 und 31 ändern sich mit steigender Temperatur nicht, während diejenigen der Produkte der Stämme 15, 82, 06 und 75 einen starken Anstieg der Viskosität als Ergebnis eines Temperaturanstieges verzeichnen.
Die nachfolgende Tabelle 3 veranschaulicht den Einfluss des bestimmten Stammes auf das rheologische Verhalten des Biopolymers in wässriger Lösung. Wie aus den aufgelisteten Daten entnommen werden kann, ist die Pseudoplastizität vom von Stamm 24 produzierten Biopolymer niedriger als die eines kommerziell erhältlichen Xanthan-Biopolymers und sie ist ebenfalls niedriger als die des Produktes von Stamm 06. Eine stärkere Verminderung der Viskosität bedeutet höhere Pseudoplastizität. Üblicherweise ist eine höhere Pseudoplastizität für Produkte erforderlich, die Pumpen während der Verarbeitung erfordern.
Die Versuchsbedingungen der in Tabelle 2 aufgeführten Tests sind: 3% M/V wässrige Biopolymerlösungen, bei 25°C und verschiedenen Scherraten, für ein käuflich erhältliches Kelco^TM Produkt sowie die Stämme 06 und 24 von Xanthomonas arboricola pv pruni. Tabelle 3
Die Daten aus der Tabelle 3 belegen unzweideutig die enorme Vielseitigkeit der erfindungsgemäßen Biopolymere. So macht die Eigenschaft von Stamm 06, der eine deutliche Verminderung der Viskosität abhängig von der Scherrate zeigt, diesen geeigneter bei Anwendungen in der Mineralölindustrie, wohingegen Stamm 24, bei dem der Abfall der Viskosität als Folge der Scherkräfte nicht so deutlich ausfällt, diesen als geeigneter beim Einsatz bei Futter-/Nahrungsmitteln und in der Kosmetik erscheinen lässt.
Die nachfolgende Tabelle 4 zeigt, dass die Viskosität und das rheologische Verhalten eine Funktion des spezifischen Stammes darstellt, der in dem Verfahren eingesetzt wird. Dies geht aus einem Vergleich der Viskosität eines aus Xanthomonas arboricola pv pruni erhaltenen Biopolymers mit einem kommerziell erhältlichen Xanthan hervor. Die verwendeten Bedingungen waren: scheinbare Viskosität in mPa × s bei 25°C einer wässrigen 3% M/V Xanthan-Biopolymerlösung, synthetisiert von 15 Stämmen von Xanthomonas arboricola pv pruni und vom dialysierten Xanthan-Biopolymer, hergestellt von Kelco, Tabelle 4

Kontrolle: dialysiertes kommerziell erhältliches Xantangummi, vertrieben von Kelko

Die nachfolgende Tabelle 5 veranschaulicht den Einfluss der Mediumzusammensetzung und der Fermentationsreaktionszeit auf die Viskosität des erhaltenen Biopolymers, gemessen bei zwei Scherraten. Die Zusammensetzung enthaltend Medien B + C steht für ein Medium, das gleiche Mengen beider Medien enthält. Tabelle 5

* Scherrate 0,5 s^–1
** Scherrate 500s^–1

Die Daten aus Tabelle 5 zeigen, dass ein Gemisch von Medien, B + C, eine signifikante Verbesserung der Produktivität für beide Fermentationsperioden mit sich bringt. Wenn jedoch lediglich auf die Viskosität geachtet wird, ist Medium C alleine besser.
Die nachstehende Tabelle 6 führt Werte für die scheinbare Viskosität von wässrigen 1% M/V Lösungen bei 25°C und einer Scherrate von 10 s^–1 in mPa × s auf, wie auch pH-Werte für Xanthan-Polymere, die sich aus der Aktivität von verschiedenen Xanthomonas arboricola pv pruni Stämmen ergeben und zwar in Medien, die gemäß Tabelle 1 formuliert sind. Tabelle 6
Tabelle 7
„Freier pH-Wert" bedeutet, dass die Fermentationsreaktion bei einem pH-Wert über der Neutralität startet, wobei dieser fallen gelassen wird ohne den Zusatz basischer Stoffe, um ihn bei Werten höher als 7,0 zu halten.
Die nachfolgende Tabelle 8 zeigt für den Stamm 106, dass die Viskosität eines Biopolymers eine Funktion der Schüttelbedingungen ist, die während des Verfahrens eingesetzt werden, um es zu erhalten. Tabelle 8
Die nachfolgende Tabelle 9 führt die Produktivität für eine inaktivierte Brühe für Stamm 106 in g × L^–1 auf und zeigt, dass das die Produktion an Biopolymers vom Schütteln und der Fermentationsreaktionszeit abhängt. Tabelle 9
Die nachfolgende Tabelle 10 veranschaulicht den Einfluss des pH-Wertes des Fermentationsmediums für den Stamm 106 auf die Viskosität des Biopolymerproduktes. Tabelle 10

* freier pH-Wert = wie vorstehend definiert

Die nachfolgende Tabelle 11 zeigt den Einfluss der Reaktionszeit und der Belüftungsbedingungen des Fermentationsmediums auf die scheinbare Viskosität der von Stamm 106 produzierten Biopolymere bei verschiedenen Fermentationszeiten, für zwei verschiedene Belüftungsbedingungen, getestet bei drei verschiedenen Scherraten. Tabelle 11

Bedingungen: A 250 UpM 1,5 VVM B 350 UpM 2,0 VVM

Die in den verschiedenen Tabellen der vorliegenden Beschreibung bereitgestellten Daten wie auch die begleitenden Figuren zeigen die Vorteile der vorgeschlagenen Verwendung der Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni Bakterien in der Herstellung hoch visköser wässriger Biopolymerlösungen, wobei die Biopolymere als solche, isoliert oder in Kombination mit anderen Biopolymeren oder auch nach Salzzugabe verwendet werden.
Darüber hinaus ist die Viskosität der wässrigen, erfindungsgemäßen Biopolymerlösungen höher als die ähnlicher kommerziell erhältlicher Xanthanpolymere. Vorteilhafterweise steigt die Viskosität der vorliegenden Biopolymere als Ergebnis von Salzzugabe, sogar von monovalenten Salzen, bei Konzentrationen von 0,2 bis 10% M/V, vorzugsweise von 0,5 bis 6% M/V, wie dargestellt in den graphischen Darstellungen der 10, 11 und 12.
Neben der Tatsache, dass sie Produkte darstellen, die Salze tolerieren, können die Xanthan-Biopolymere zu antimikrobiellen Wirkstoffen, wie Natriumazid, Glutaraldehyd und Formaldehyd und anderen zugegeben werden, um die Lagerzeit-Stabilität der Biopolymerlösungen zu verbessern.
Einige dieser Biopolymere, erhalten mit bestimmten Stämmen wie Stamm 82, 15, 06 und 75, weisen die ungewöhnliche Fähigkeit einer erhöhten Viskosität als Ergebnis von Temperaturerhöhung auf. Dieses Verhalten ist in der 4, 5 und 6 dargestellt.
Auch sind die erfindungsgemäßen Biopolymere in der Lage, echte Gele zu bilden, wenn sie allein oder zusammen mit anderen Biopolymeren eingesetzt werden, wobei die Gelstärke verbessert wird, wenn dem Biopolymer divalente Salze wie CaCl₂ oder CaCO₃ zugegeben werden.
In einer wässrigen 1% M/V Biopolymerlösung variiert die Viskosität üblicherweise zwischen 1.000 und 5.000 mPa × s bei 10 S^–1 und 25°C. Es sind jedoch Werte im Bereich von 100 mPa × s bei 10 S^–1 und 25°C möglich, was nicht bedeutet, das es sich um ein Produkt mit niedrigerem Wert handelt, sondern lediglich um ein Produkt mit einer anderen Anwendungsmöglichkeit als als Verdickungsmittel.
Die Viskositätswerte der wässrigen 3% M/V Biopolymerlösungen variieren zwischen 4.000 und 28.000 mPa × s bei 10 S^–1 und bei 25°C.
Ein vierter Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des erhaltenen Polymers. Das rheologische Verhalten von mit dem erfindungsgemäßen Biopolymer erhaltenen Lösungen ist von besonderer Wichtigkeit bei der Bestimmung ihrer Verwendung. Die hohe, in den 3 und 4 gezeigte Pseudoplastizität ist ein erforderlicher Parameter für das Biopolymer, wenn es in Aktivitäten zur Erforschung von Mineralöl eingesetzt werden soll.
So wird Xanthangummi oder Biopolymer in verschiedenen Bereichen der Mineralölproduktion eingesetzt, einschließlich der Bohrung von Ölquellen, bei der Formulierung von Bohrflüssigkeiten mit oder ohne zugesetzte Feststoffe, dem hydraulischen Aufbrechen, in der Wartung und zwar in Fluiden für die Wartung, in Formulierungen für die Fertigstellung von Öl- bzw. Gasquellen, in der Pipeline-Reinigung und als verbesserte Fluide zum Binden bzw. Rückgewinnen von Öl.
Das vorliegende Biopolymer modifiziert die rheologischen Eigenschaften von wässrigen Lösungen. Es stellt gewünschte Eigenschaften wie Stabilität, verbesserte Beschaffenheit und kontrollierte Abgabe aktiver Inhaltsstoffe bereit, wobei es immer noch in der Lage ist, die Eisbildung wie auch die Entfernung der Synärese bei Zusammensetzungen zum Glühen, Härten bzw. Tempern zu vermindern. Biopolymerfilme finden ferner Anwendung in der Verpackung von Lebensmitteln.
Es ist ferner nützlich in der Verarbeitung von Nahrungsmitteln, die einen Pumpschritt erfordern wie auch in anderen industriellen Aktivitäten, die das Pumpen von Lösungen erfordern.
Die rasche Solubilisierung in kaltem oder heißem Wasser oder auch in Salzlösungen oder schwach sauren Lösungen wie auch ihre Kompatibilität mit Salzen ist ebenfalls wichtig für ihre Verwendung in Lebensmitteln oder in anderen Verwendungen, die von diesem Merkmal abhängen.
Weitere Verwendungen der Polymers schließen pharmakologische und kosmetische Zusammensetzungen, neben Farben, Pestizidzusammensetzungen und Veterinärprodukten ein.
Zusammenfassung
Verfahren zum Erhalt eines Xanthan-ähnlichen Biopolymers aus Bakterienstämmen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni Kolonien, die zu Fermentationsmedien gegeben werden, welche Restwasser und Produkte, die im Zusammenhang stehen mit der Verarbeitung von Hülsen enthaltendem Reis und angekochtem Reis sowie weitere Nährstoffe enthalten, wobei das Verfahren von einem ursprünglichen Prä-Inokulum ausgeht (Schritt 110), ein endgültiges Prä-Inokulum ergibt (Schritte 120, 220) und dann ein Inokulum, wobei das Inokulum in einem ersten Fermenter unter Verfahrensbedingungen (Schritte 130 und 230) und anschließend in einem zweiten Fermenter (Schritte 140, 250) fermentiert wird. Anschließend wird die Fermentationsbrühe inaktiviert und unlöslich gemacht, wodurch das Biopolymerprodukt erhalten wird (Schritt 150). Das Biopolymer wird getrocknet (Schritt 160) und gemahlen oder zerquetscht, wodurch die gewünschte Teilchengrößenverteilung erhalten wird (Schritt 170) und das Biopolymer wird als Pulver oder wässrige Lösung gewonnen (Schritt 180). Gegebenenfalls wird die Fermentationsbrühe nach der zweiten Fermentation (Schritt 240) zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert (Schritt 250) und die abgetrennten Zellen werden entfernt oder zerstört (Schritt 260a).

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Xanthan-Biopolymers, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen von isolierten Kulturen von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricola pv pruni, die zuvor in einem Festmedium angezogen wurden oder, alternativ dazu, lyophilisiert waren; b) Herstellung des ursprünglichen Prä-Inokulums durch Zugabe der Kolonien zu einem geeigneten Zell-Wuchsmedium enthaltend 13 bis 55 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 1,0 bis 37 g × L^–1 Pepton, 10 bis 20 g × L^–1 Agar, 0,03 bis 0,90 g × L^–1 K₂HPO₄ und 0,001 bis 2,5 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitamine des B Komplexes, wobei die Kolonien 24 bis 48 Stunden unter Schütteln bei 100 bis 250 UpM bei einer Temperatur von 20°C bis 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 inkubiert werden (Schritt 110); c) Überführen des ursprünglichen Prä-Inokulums in ein Flüssigmedium enthaltend 13 bis 55 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 1,0 bis 37 g × L^–1 Pepton, 0,03 bis 0,90 g × L^–1 K₂HPO₄ und 0,001 bis 2,5 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitamine des B Komplexes, wobei die Kolonien 24 bis 48 Stunden unter Schütteln bei 100 bis 250 UpM bei einer Temperatur von 20°C bis 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 inkubiert werden, wonach das endgültige flüssige Prä-Inokulum erhalten wird (Schritt 120); d) Asepische Überführung des endgültigen Prä-Inokulums in einen ersten sterilen Fermenter zur Durchführung der Fermentation unter Schütteln bei 50 bis 1.200 UpM, vorzugsweise 100 bis 800 UpM und Belüftung durch Sauerstoffinjektion von 0,5 bis 4 Volumina pro Volumen Luft pro Minute, vorzugsweise von 0,5 bis 3 Volumina pro Volumen Luft pro Minute, wobei der erste Fermenter ein Flüssigfermentationsmedium enthält, mit einer Zusammensetzung aus Saccharose oder Glukose, die bei 100 g × L^–1 gehalten wird, 1,0 bis 37 g × L^–1 Pepton, 0,03 bis 0,90 g × L^–1 K₂HPO₄ und 0,001 bis 2,5 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitaminen des B Komplexes, wobei für 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 20°C bis 35°C und einem pH-Wert von 4,5 bis 9,0 inkubiert wird, wonach am Ende der Fermentationsdauer das Inokulum erhalten wird (Schritt 130); e) Überführen des Inokulums in einen zweiten sterilen Fermenter, enthaltend das flüssige Fermentationsmedium zur Herstellung des Biopolymers durch Submersfermentation oder, in einer anderen Ausführungsform, durch Zugabe des sterilen Mediums zu dem das Inokulum enthaltenden Fermenter, unter Schütteln zwischen 50 und 1.200 UpM, vorzugsweise zwischen 100 und 800 UpM und unter Belüftung durch Sauerstoffinjektion zwischen 0,5 und 4 Volumina pro Volumen Luft pro Minute, vorzugsweise zwischen 0,5 und 3 Volumina pro Volumen Luft pro Minute, bei einer Temperatur zwischen 22°C und 35°C, vorzugsweise zwischen 22°C und 32°C und einem pH-Wert zwischen 4,5 und 9,0, alternativ ohne pH-Wert Kontrolle (freier pH-Wert) entsprechend der gewünschten Endverwendung für das Biopolymer, wobei die Fermentation für eine Dauer von 24 bis 120 Stunden, vorzugsweise 48 bis 72 Stunden durchgeführt wird, wobei das Medium aus dem Einweich- oder Kochwasser von Hülsen-tragendem Reis oder aus Wasser, das aus dem Ankochen von Reis stammt, das darüber hinaus Cellulose, Reis- und/oder Weizenkleie und/oder Stickstoff-, Phosphor- und Kalium-Makronährstoffe zwischen 0,1 und 7,2 g × L^–1 sowie Magnesium- und Eisen-Mikronährstoffe von 0,01 bis 1,7 g × L^–1 und Vitamine des B-Komplexes, Vitamin E und/oder Nikotinamid, Saccharose bis zu 250 g × L^–1 sowie 50 bis 200 ppm Silikonöl oder Gemüseöl enthält (Schritt 140); f) Nach dem Ende der Fermentation, Filtrierung der Fermentationsbrühe zum Zwecke der Zellabtrennung; Schritt (150) g) Nach dem Ende der Fermentation, Inaktivierung der Zellen der Fermentationsbrühe durch Hitzesterilisierung mit Dampfdruck bei 121°C oder chemische Inaktivierung mit chlorierten Stoffen im Fermenter selbst, Schritt (160); h) Unlöslichmachen, Schritt (170), durch Zugabe von polarem organischem Lösungsmittel zur inaktivierten Brühe, wobei mono- und/oder divalente Salze, ausgewählt aus NaCl, KCl und CaCO₃, in Konzentrationen zwischen 0,2 und 10% Masse/Volumen zugegeben werden oder nicht zugegeben werden; i) Gewinnung des polaren Lösungsmittels durch Destillieren und Wiedereinführen in das Verfahren, Schritt (170a, 260a); j) Trocknung des Biopolymerproduktes durch anfängliche Entwässerung desselben in einem Förderband, anschließende Überführung des abgetrennten Produktes auf Oberflächentrockner oder ähnliche Vorrichtungen, Schritt (180), gefolgt von Mahlen oder Zerquetschen in irgendeiner üblichen Vorrichtung für diesen Zweck, Schritt (180a); und k) Gewinnen des Xanthan-ähnlichen Biopolymers, einsatzbereit für die gewünschte Verwendung, Schritt (190).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zellwuchsmedium in den Schritten b), c) und d) vorzugsweise 10 bis 30 g × L^–1 Saccharose oder Glukose, 3 bis 15 g × L^–1 Pepton, 10 bis 20 g × L^–1 Agar, 0,09 bis 0,7 g × L^–1 KH₂PO₄ und 0,01 bis 1,0 g × L^–1 MgSO₄ und/oder Vitamine des B Komplexes enthält, wobei der bevorzugte Bereich für den pH-Wert zwischen 5,5 und 7,5 liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das endgültige flüssige Prä-Inokulum für die weitere Verwendung gefriergetrocknet oder alternativ dazu direkt in den ersten Fermenter überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das gefriergetrocknete endgültige Prä-Inokulum vor der Verwendung durch Resuspendieren und Überführen in eine frische Inkubation unter den vorgenannten Bedingungen vor der Überführung in den Fermenter reaktiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren alternativ ohne pH-Wert Kontrolle ausgeführt wird (oder unter freien pH-Wert Bedingungen), wobei man nahe einem neutralen pH-Wert startet und im Reaktionssystem den pH-Wert auf niedrigere Werte abfallen lässt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Verbesserung der Produktausbeute die Viskosität der Fermentationsbrühe, sofern sie über 250 mPa × s bei 10 S^–1 liegt, diese mit Wasser oder einem Gemisch von Wasser und polaren organischen Lösungsmitteln, ausgewählt aus C₁- bis C₃-Alkoholen wie Ethylalkohol und Isopropylalkohol verdünnt wird, bis die Viskosität auf Werte unterhalb von 250 mPa × s bei 10 S^–1 abfällt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt g) die chlorierten Stoffe zur chemischen Inaktivierung der Brühe anorganische Stoffe umfassen wie Natriumhypochlorid und Salzsäure, verwendet in einer Konzentration zwischen 100 und 200 ppm Chlor, während die organischen Stoffe Chlorhexidin von 0,01 bis 0,1 M/V einschließen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei alternativ ein Zentrifugationsschritt (250) bei 10.000 bis 15.000 × g zur Abtrennung der Zellen und ein weiterer Schritt zur Entfernung der Zellen oder deren Zerstörung (240b) nach der zweiten Fermentation ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei alternativ der zweite Fermentationsschritt (240) in einem flüssigen Fermentationsmedium enthaltend Saccharose oder Glukose in Mengen bis zu 500 g × L^–1 im Medium durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Produktivität der Bakterienstämme bezüglich erhaltenem Biopolymer in g × L^–1 5,7 bis 26,4, bei einem Mittelwert zwischen 15 und 22 erreicht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die dem Verfahren zugeführten Kolonien Kombinationen von Stämmen umfassen, die synergistische Effekte erzielen, unter der Voraussetzung, dass diese Stämme ähnliche Fermentationsbedingungen bezüglich pH-Wert und Belüftungsbedingungen erfordern.
Fermentationsmedium, hergerichtet zur Verwendung im zweiten Fermentationsschritt des Verfahrens nach Anspruch 1, wobei das Medium enthält: a) Das Koch- oder Einweichwasser von Hülsen-enthaltendem Reis, ferner das Restwasser aus der Verarbeitung von angekochtem Reis; b) Reiskleie, enthalten in einer Menge von 0,2 mg bis 40 g pro Liter; c) Weizenkleie, enthalten in einer Menge zwischen 0,3 g × L^–1 und 10 g × L^–1; d) Stickstoff-, Phosphor- und Kalium-Makronährstoffe von 0,1 bis 7,2 g × L^–1 sowie Magnesium- und Eisen-Mikronährstoffe in einer Menge zwischen 0,01 und 1,7 g × L^–1; e) Vitamine des B-Komplexes, einschließlich der Vitamine B1, B2 und Niacin (Vitamin B3) in aufgereinigter Form, in Konzentrationen zwischen 0,02 mg × L^–1 und 3 mg × L^–1 oder, in einer anderen Ausführungsform, natürliche Substrate, die reich an Vitaminen des B-Komplexes sind; f) Vitamin E, enthalten in einer Menge von 10 bis 30 μg/L aus Gemüseölen; g) Zucker wie Saccharose oder Glukose in einer Konzentration bis zu 250 g × L^–1 oder, in einer anderen Ausführungsform, bis zu 500 g × L^–1.
Medium nach Anspruch 12, wobei die Zusammensetzung derartigen Reiswassers oder Reiseinweichwassers etwa 20 mg × L^–1 bis 80 mg × L^–1 Gesamtstickstoff, hauptsächlich als organischen Stickstoff einschließt, der ein ausgezeichnetes Substrat für die Xanthomonas pv pruni Bakterien darstellt. Darüber hinaus enthält derartiges Wasser 10 mg × L^–1 bis 50 mg × L^–1 Phosphationen und 2 bis 20 mg × L^–1 Sulfationen.
Fermentationsmedium, hergerichtet zur Verwendung im zweiten Fermentationsschritt des Verfahrens nach Anspruch 1 wobei die Zusammensetzung des Mediums in g × L^–1 von 0,15 bis 5,0 KH₂PO₄, von 0,01 bis 0,6 MgSO₄ × 7 H₂O, von 10 bis 250 Saccharose und von 0,2 bis 6 Reiskleie enthält.
Fermentationsmedium nach Anspruch 14, wobei alternativ dazu die Reiskleie nicht vorhanden ist.
Fermentationsmedium, hergerichtet zur Verwendung im zweiten Fermentationsschritt des Verfahrens nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung des Mediums umfasst (in g × L^–1) 0,2 bis 1,5 NH₄H₂PO₄, 1 bis 5 K₂HPO₄, 0,1 bis 0,6 MgSO₄ × 7 H₂O, 0,2 bis 2,0 Zitronensäure, 2 bis 5,0 KH₂PO₄, 0,006 H₃BO₃, 2,0 (NH₄)₂SO₄, 0,0024 FeCl₃, 0,002 CaCl₂ × 2 H₂O, 0,002 ZnSO₄, 10 bis 250 Saccharose und 0,2 bis 6 Reiskleie.
Fermentationsmedium nach Anspruch 16, wobei alternativ dazu die Reiskleie in Medien nicht vorhanden ist.
Xanthan-Biopolymere, hergestellt von Xanthomonas arboricola und/oder Xanthomonas arboricula pv pruni, wobei die chemische Zusammensetzung davon D-Mannose, D-Glukose, D-Glukuronsäure und Rhamnose in den Mengen 3:3:1:1 umfasst und darüber hinaus Acetyl- und Brenztraubensäuregruppen in Mengen zwischen 1,1 und 5,5% bzw. 0,3 bis 0,9%.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei das Molekulargewicht davon zwischen 4 × 10⁶ und 12 × 10⁶ g × Mol^–1 liegt.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere als Pulver einsetzbar sind.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere als klare wässrige Lösungen (2% bis 6% Masse/Volumen) einsetzbar sind.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere Salz tolerieren, wobei die Viskositätswerte von wässrigen 1% M/V und 3% M/V Biopolymerlösungen sich nach der Zugabe von 0,2 bis 10% M/V Salzen erhöhen.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere ein pseudoplastisches Verfahren zeigen, wenn sie von bestimmten Stämmen stammen.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Viskosität von wässrigen 1% M/V Biopolymerlösungen zwischen 1.000 und 5.000 mPa × s bei 10 S^–1 und 25°C variiert.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 24, wobei alternativ dazu die Viskosität der Lösung im Bereich von 100 mPa × s bei 10 S^–1 bei 25°C liegt.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere echte Gele auch dann ausbilden, wenn sie allein eingesetzt werden
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere einsetzbar sind für Aktivitäten zur Erforschung von Mineralöl.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 27, wobei die Verwendungen die Bohrung von Ölquellen durch die Formulierung von Bohrflüssigkeiten mit oder ohne zugesetzte Feststoffe, das hydraulische Aufbrechen, die Wartung und zwar in Fluiden für die Wartung, bei Formulierungen für die Fertigstellung von Öl- bzw. Gasquellen, die Pipeline-Reinigung und die Verwendung als verbesserte Fluide zum Binden bzw. Rückgewinnen von Öl einschließen.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere in der Nahrungsmittelindustrie einsetzbar sind.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 29, wobei die Biopolymere zu Nahrungsmittelzusammensetzungen gegeben oder bei der Verpackung von Lebensmitteln eingesetzt werden.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere zu pharmazeutischen Zusammensetzungen gegeben werden.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere zu kosmetischen Zusammensetzungen gegeben werden.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere zu Farben-Zusammensetzungen gegeben werden.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere zu Pestizidzusammensetzungen gegeben werden.
Xanthan-Biopolymere nach Anspruch 18, wobei die Biopolymere zu Veterinärzusammensetzungen, vorzugsweise zu Veterinärimpfstoffen gegeben werden.