DE60006552T2

DE60006552T2 - Verfahren zur herstellung von exopolysaccharide

Info

Publication number: DE60006552T2
Application number: DE60006552T
Authority: DE
Inventors: Olivier Nore; Jean-Luc Simon
Original assignee: Rhodia Chimie SAS; Rhone Poulenc Chimie SA
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1999-09-07
Filing date: 2000-09-06
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2020-09-07
Also published as: AU7298600A; ES2211600T3; FR2798141A1; CA2384097A1; US20050136517A1; BR0013857A; ATE254183T1; CA2384097C; DK1212448T3; US6855524B1; JP2003508077A; CN1376205A; RU2246540C2; EP1212448B1; CN1175112C; JP4044336B2; EP1212448A1; DE60006552D1; BR0013857B1; PT1212448E

Description

Die vorliegende Erfindung hat ein Verfahren zur Herstellung von Exopolysacchariden durch Fermentation mittels Mikroorganismen zum Gegenstand. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Exopolysacchariden durch Fermentation von Mikroorganismen in einem Nährmedium, das wenigstens eine durch die Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoffquelle und wenigstens eine organische Stickstoffquelle umfasst, die aus einer Hülsenfrucht mit hohem Proteingehalt stammt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung steht der Ausdruck Exopolysaccharid für Polysaccharide, die durch Mikroorganismen hergestellt worden sind.
Exopolysaccharide mit hohem Molekulargewicht werden aufgrund ihrer eindickenden, verdickenden, emulgierenden und stabilisierenden Eigenschaften insbesondere in wässrigen Medien zunehmend in zahlreichen industriellen Anwendungsbereichen eingesetzt. Daher wird Xanthangummi aufgrund seiner überragenden Theologischen Eigenschaften in ganz unterschiedlichen Bereichen wie Bauwesen, Farben, Papier, Textil, Kosmetika, Nahrungsmitteln, Landwirtschaft, Wasserbehandlung, Bohrungen, Erdölgewinnung und weiteres eingesetzt.
Diese Exopolysaccharide weisen hohe Molekulargewichte auf, häufig über 1·10⁶ g/mol (gemessen mittels Gelpermeation), und sind aus Einheiten von Glucose, Mannose, Galactose, Rhamnose, Glucuronsäure, Mannuronsäure, Guluronsäure, gegebenenfalls mit Acetat- und Pyruvatderivaten, aufgebaut. Ihre besondere Struktur und ihre Eigenschaften sind beispielsweise in der Veröffentlichung Industrial Gums – Whistler – 2^nd Edition – Chapters XXI-XXIII (1973) beschrieben.
Die Exopolysaccharide werden vorzugsweise durch aerobe Kultur von Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium hergestellt.
Xanthangummi wird von Bakterien der Gattung Xanthomonas hergestellt (genre Xanthomonas). Exopolysaccharide vom gleichen Typ können von einer breiten Vielfalt von Mikroorganismen hergestellt werden, zu den bekanntesten zählen jene der Gattung Agrobacterium, Arthrobacter, Alcaligenes (Succinoglycane), Pseudomonas (Levan), Rhizobium, Sclerotium (Sclerogluccane).
Das wässrige Nährmedium umfasst üblicherweise außer verschiedenen Wachstumselementen eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle. Bei den industriellen Fermentationen beruht die Wahl der Kohlenstoffquelle und/oder der Stickstoffquelle zugleich auf der Verfügbarkeit, dem Preis und der Eignung, hohe Produktivitäten zu ermöglichen.
Aus dem Dokument "Evaluation of carob pod as a substrate for Pullulan production by Aureobasidium pullulans"; Triantafyllos R. et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 55, Nr. 1, 1995, S. 27-44 ist insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Pullulan in einem Nährmedium bekannt, das aus einem zuckerreichen Johannisbrotextrakt, aus der Fruchthülse stammt. Aus dem Dokument "Batch and fedbatch culivation of Xanthomonas campestris in carob extracts", Roseiro J. C. et al., Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie, Vol. 25, Nr. 3, 1992, S. 289-293 ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Xanthangummi in einem Nährmedium bekannt, das von einem zuckerreichen Johannisbrotextrakt aus der Fruchthülse stammt.
In einigen Industriezweigen wie z. B. der Nahrungsmittelindustrie oder der Kosmetikindustrie treten zusätzliche Beschränkungen auf. In diesen Bereichen müssen die Kohlenstoffquellen und die Stickstoffquellen ferner derart ausgesucht werden, dass Exopolysaccharide erhalten werden, die den gewünschten organoleptischen, sensorischen und visuellen Anforderungen entsprechen.
Es ist nicht einfach, unter den üblicherweise verwendeten Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen solche Quellen zu finden, die zugleich allen vorstehend angegebenen Anforderungen entsprechen.
In den Fällen, bei denen der Mikroorganismus nicht fähig ist, die gesamte Stickstoffquelle zu verbrauchen, bleiben beispielsweise am Ende der Fermentation unlösliche Restprodukte übrig, die einerseits das Medium gegenüber der Vermehrung von kontaminierenden Stämmen, die den Fermentationsmost (moût) vor der Abtrennung des Polysaccharids abbauen können, anfällig machen, und andererseits die Gefahr mit sich bringen, dass das Exopolysaccharid bei den gegebenenfalls vorgenommenen thermischen Behandlungen zur Sterilisierung und Klärung verfärbt wird. Um diesen Nachteil zu beheben, wird bei gewissen Fermentationsverfahren der Einsatz von Enzymen vorgeschlagen. Andere führen Filtrationsschritte und/oder Zentrifugationsschritte durch. Unabhängig von dem Verfahren zur Entfernung der unlöslichen Restprodukte am Ende der Fermentation ergeben sich erhöhte Produktionskosten.
Gewisse Kohlenstoffquellen und/oder Stickstoffquellen weisen den Nachteil auf, den Fermentationscyclus deutlich zu verlängern, was insbesondere die Kontaminierung und folglich den Abbau des Fermentationsmost vor der Abtrennung des Exopolysaccharids und einen Produktionsverlust mit sich führt.
Die Natur der Stickstoffquelle ist von besonderer Bedeutung, wenn ein Exopolysaccharid erhalten werden soll, das gute organoleptische, sensorische und visuelle Eigenschaften aufweist. Sie ist auch für die hohe Produktivität des Exopolysaccharids verantwortlich.
Es wurde festgestellt, dass gewisse Quellen, die von einer Fraktion von Samen von bestimmten Hülsenfrüchten wie z. B. Johannisbrot stammen, besonders interessante organische Stickstoffquellen im Rahmen der Fermentation von Mikroorganismen darstellten. Bezüglich dieser Fraktionen stellte sich heraus, dass sie die Gesamtheit der vorstehend genannten Anforderungen erfüllen.
Unter den Fraktionen, die von Johannisbrotsamen stammen, führen jene, die vorzugsweise einen hohen Proteingehalt aufweisen, zu besonders interessanten Ergebnissen, insbesondere im Hinblick auf die Produktivität. Auf sogenannten Standardmedien wie den z. B. in der Veröffentlichung Industrial Gums – Whistler – 2^nd Edition – Chapters XXI-XXIII (1973) genannten liegen bei Vergleichsfermentationen die Produktivitäten in der Größenordnung von 0,3 bis 0,4 g/(kg·h); bei Fraktionen, die von Johannisbrotsamen stammen, liegt diese Produktivität über 0,4 g/(kg·h).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Exopolysacchariden durch Fermentation von Mikroorganismen, das einfach und kostengünstig durchgeführt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Exopolysacchariden durch Fermentation von Mikroorganismen, das die vorstehend aufgeführten Probleme der Kontaminierung vermeidet.
Gegenstand der Erfindung ist folglich ein Verfahren zur Herstellung von Exopolysacchariden durch Fermentation von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation in einem Nährmedium durchgeführt wird, das wenigstens eine durch die Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoffquelle und wenigstens eine or ganische Stickstoffquelle umfasst, wobei diese Quelle von einer Fraktion von Johannisbrotsamen stammt.
Weitere Vorteile, die sich insbesondere in Verbindung mit der Auswahl der Stickstoffquelle ergeben, sind die Verkürzung der Dauer der Fermentationen, die Unterdrückung von unlöslichen Restprodukten am Fermentationsende und eine verbesserte Produktivität.
Ferner ermöglicht es dieses Verfahren, ein Exopolysaccharid mit guten organoleptischen, sensorischen und visuellen Eigenschaften zu erhalten.
Des weiteren werden die Theologischen Eigenschaften des nach diesem Verfahren erhaltenen Exopolysaccharids beibehalten und in gewissen Fällen sogar verbessert.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann zur Produktion von allen Exopolysacchariden durch Fermentation mittels Mikroorganismen angewendet werden. Eine Vielzahl von Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilze, Algen weisen die Fähigkeit auf, Exopolysaccharide herzustellen. Es können unter anderem aufgeführt werden:

– Bakterien, die zur Gattung Xanthomonasgehören und insbesondere zu den Spezies gehören, die im Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. Ausgabe – 1974 – Williams N. Wilkins Co. Baltimore) beschrieben sind, wie z. B. Xanthomonas begoniae, Xanthomonas campestris, Xanthomonas carotae, Xanthomonas hederae, Xanthomonas incanae, Xanthomonas malvacearum, Xanthomonas papavericola, Xanthomonas phaseoli Xanthomonas pisi, Xanthomonas vasculorum, Xanthomonas vesicatoria, Xanthomonas vitians, Xanthomonas pelargonii;
– Bakterien, die der Gattung Arthrobacter angehören und insbesondere die Spezies Arthrobacter stabilis, Arthrobacter viscosus;
– Bakterien, die der Gattung Erwinina angehören;
– Bakterien, die der Gattung Azotobacter angehören und insbesondere die Spezies Azotobacter indices,
– Bakterien, die der Gattung Agrobacterium angehören und insbesondere die Spezies Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens;
– Bakterien, die der Gattung Alcaligenes angehören und insbesondere Alcaligenes faecalis;
– Bakterien, die der Gattung Pseudomonas angehören und insbesondere Pseudomonas methanica;
– Bakterien, die der Gattung Corynebacterium angehören;
– Bakterien, die der Gattung Bacillusangehören und insbesondere Bacillus polymyxa;
– Pilze, die der Gattung Sclerotium angehören und insbesondere den Spezies Sclerotium glucanicum, Sclerotium rolfsii oder Plectania occidentalis,
– Pilze, die der Gattung Aspergillus angehören und insbesondere den Spezies Aspergillus itaconicus, Aspergillus terreus;
– Hefen, die der Gattung Hansenula angehören wie z. B. die Spezies Hansenula capsulata.

Der Mikroorganismus ist bevorzugt ein Bakterium der Gattung Xanthomonas und insbesondere der Spezies Xanthomonas campestris Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Exopolysacchariden durch Fermentation von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation in einem Nährmedium durchgeführt wird, das wenigstens eine durch die Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoffquelle und wenigstens eine organische Stickstoffquelle umfasst, wobei diese Quelle von einer Fraktion von Johannisbrotsamen stammt.
Der Johannisbrotbaum erzeugt eine Frucht, die aus zwei Teilen besteht, die Hülse und der Samen. Der Johannisbrotsamen und insbesondere die Endospermfraktion dieses Samens wird bereits in hohem Maße unter der Bezeichnung „Johannisbrotgummi" verwertet. Benachtbart zu dieser Endospermfraktion befindet sich der Keim, der ein Nebenprodukt darstellt, das in bedeutenden Mengen bei der Isolierung von Johannisbrotgummi erhalten wird.
Es konnte nachgewiesen werden, dass unter den verschiedenen Fraktionen von Johannisbrotsamen jene mit einem hohen Proteingehalt für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung besonders geeignet waren.
Folglich weist die Fraktion von Johannisbrotsamen vorzugsweise einen Proteingehalt von wenigstens 45 %, bevorzugt von wenigstens 50 % und noch bevorzugter von wenigstens 60 Gew.-% auf, bezogen auf das Trockengewicht des Trockenmaterials.
Der Proteingehalt wird ausgehend von durch Verbrennung bei 950 °C unter Sauerstoff freigesetztem Stickstoff berechnet und mittels der Leitfähigkeit in einem Heliumfluss gemessen. Das verwendete Gerät ist ein LECO FP 428.
Diese Proteine bestehen sowohl aus essentiellen Aminosäuren wie auch aus nicht-essentiellen Aminosäuren.
Eine besondere Ausführungsform der Endung besteht aus dem Einsatz von Fraktionen von Johannisbrotsamen, deren Proteine vorzugsweise einen hohen Gehalt an Arginin, Glutamin und/oder Glutaminsäure und Lysin aufweisen.
Bei dieser besonderen Ausführungsform liegt der Arginingehalt vorzugsweise zwischen 9 und 20 % und bevorzugt zwischen 12 und 14 %, Gewicht/Gewicht bezogen auf die Gesamtheit der Aminosäuren.
Gleichermaßen liegt der Gehalt an Glutamin und/oder Glutaminsäure vorzugsweise zwischen 18 und 30 %, bevorzugt zwischen 22 und 27 %, Gewicht/Gewicht bezogen auf die Gesamtheit der Aminosäuren.
Der Gehalt an Lysin liegt vorzugsweise zwischen 18 und 30 %, bevorzugt zwischen 12 und 14 %, Gewicht/Gewicht bezogen auf die Gesamtheit der Aminosäuren.
Der Aminosäuregehalt wird nach klassischen, dem Fachmann bekannten Methoden bestimmt.
Neben den Proteinen können die Fraktionen auch Lipide umfassen. Die Exopolysaccharide, die durch Fermentation von Mikroorganismen in einem Nährmedium hergestellt werden, das wenigstens eine organische Stickstoffquelle umfasst, die von einer lipidhaltigen Fraktion von Johannisbrotsamen stammt, weisen insbesondere merklich verbesserte organoleptische, visuelle und sensorische Eigenschaften auf. Diese Lipide verhindern ferner das Aufschäumen in den Vorkulturphasen.
Vorzugsweise liegt der Lipidgehalt in den Fraktionen bei wenigstens 4 %, vorzugsweise wenigstens 5 % und noch bevorzugter zwischen 7 und 15 Gew.-%, bezogen auf das Trockenmaterial.
Der Lipidgehalt wird auf jenen des Gesamtfetts zurückgeführt. Er wird durch Extraktion mit Hexan in einem Soxhlet-Extraktionsapparat bestimmt. Die Vorgehensweise ist wie folgt:

– in der Extraktorhülse werden ungefähr genau 10 g Johannisbrotkeimmehl abgewogen, E Gramm, mit einem Stopfen aus hydrophiler Baumwolle verschlossen;
– in einen 250 ml Kolben, der vorher tariert worden war (PO Gramm), werden 150 ml Hexan gegeben; man extrahiert während ungefähr 6 Stunden;
– das Lösungsmittel wird mittels einem Rotationsverdampfer verdampft und die Trocknung des Rückstands wird in einem Trockenofen bei 105 °C während einer Stunde vorgenommen;
– nach Abkühlen in einem Exsikkator wird der Kolben, der den Rückstand enthält, gewogen, P1 Gramm.

Der Fettgehalt und folglich der Lipidgehalt wird nach der folgenden Formel bestimmt:

Fettgehalt (%) = 100 × (P1 – P0)/E
Unter den charakteristischen Bestandteilen, die in diesen Lipiden vorliegen, können insbesondere Palmitinsäure, Stearinsäure, Oleinsäure und Linoleinsäure genannt werden.
Außer den Proteinen und den Lipiden können die Fraktionen von Johannisbrotsamen auch Kohlenhydrate enthalten.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Fraktion um den Keim von Johannisbrotsamen.
Bei dieser Ausführungsform wird die Fraktion zuvor von ihren Endospermfraktionen nach bekannten klassischen Verfahren befreit.
Die verwendete Fraktion von Johannisbrotsamen kann bevorzugt in Form eines Mehls vorliegen. Das Mehl wird mittels klassischen Mahlverfahren erhalten, beispielsweise durch Mahlen in folgenden Mühletypen:

– Walzenmühlen für Mehle mit einer mittleren Granulometrie Typ Mesh 100, d. h. ein Mehl, das höchstens 1 Gew.-% Teilchen größer als 80 Mesh und höchstens 10 Gew.-% Teilchen kleiner als 200 Mesh aufweist;
– Stiftmühlen (pin mills) für Mehle mit einer feineren Granulometrie:
– Typ Mesh 200, d. h. ein Mehl, das keine Teilchen größer als 80 Mesh aufweist und höchstens 60 Gew.-% Teilchen kleiner als 200 Mesh aufweist, und
– Typ Mesh 175, d. h. ein Mehl, das höchstens 1 Gew.-% Teilchen größer als 80 Mesh und höchstens 75 Gew.-% Teilchen kleiner als 200 Mesh aufweist.

Das Mehl kann wie erhalten oder nach einer Behandlung mittels geeigneten Enzymen wie z. B. alkalischen, sauren und/oder neutralen Proteasen, Lipasen, Phytasen, alkalischen, sauren und/oder neutralen Phosphatasen, und Amylasen eingesetzt werden. Die Behandlung mittels der Enzyme wird nach klassischen und bekannten Verfahren durchgeführt.
Die Granulometrie des Mehls kann zwischen 10 und 150 Mikrometer liegen. Im Fall von behandelten Mehlen liegt die Granulometrie insbesondere zwischen 20 und 60 Mikrometer, bevorzugt zwischen 30 und 50 Mikrometer.
Die Granulometriemessungen können mittels der Granulometrielasertechnik durchgeführt werden, mit Hilfe eines MALVERN Granulometers, vertrieben von der Firma Malvern Instruments S.A.
Man kann auch die Fraktion von Johannisbrotsamen „teile quelle" einsetzen, d. h. nach Abtrennung des Endosperms in Form von Plättchen oder auch in Form einer wässrigen Vor-Dispersion oder Vor-Suspension.
Auch wenn die Erfindung im Hinblick auf Johannisbrotsamen beschrieben worden ist, kann sie auch auf weitere Hülsenfrüchte wie z. B. Guar, Johannisbeeren und Tara angewendet werden. Diese Hülsenfrüchte werden als Beispiele und nichtbeschränkend angegeben.
Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform der Erfindung findet die Fermentation mit einer Mischung von organischen und anorganischen Stickstoffquellen statt.
In diesem Fall kann die anorganische Stickstoffquelle aus Ammonium- oder Natriumnitraten, Ammoniumphosphaten oder -sulfaten, Magnesiumsulfat, Kaliumsulfat oder Natriumsulfat ausgewählt werden, einzeln oder als Mischung.
Die Konzentration an organischen Stickstoffquellen und gegebenenfalls an anorganischen Stickstoffquellen im Fermentationsmedium liegt zwischen 1 und 80 g/l, bevorzugt zwischen 3 und 50 g/l, und noch bevorzugter zwischen 5 und 30 g/l.
Das Fermentationsmedium umfasst ferner auch eine Kohlenstoffquelle, die durch die Mikroorganismen assimiliert werden kann.
Als Beispiele für die Kohlenstoffquelle, die Bestandteil des Fermentationsmediums ist, können Glucose, Saccharose, Fructose, Galactose, Trehalose, Mannose, Melobiose, Raffinose, Maltotriose, Maltose, Lactose, Lactulose, Methyl-β-galactopyranosid, Methyl-α-galactopyranosid, Cellobiose, Gentobiose, Methyl-β-D-glucopyranosid, Methylα-D-glucopyranosid, Esculin, Ribose, Arabinose, Xylose, Palatinose, Rhamnose, Fucose, Melezitose, D-(+)-Arabitol, L-(–)-Arabitol, Xylitol, Dulcitol, Tagatose, Glycerol, Myo-innositol, Mannitol, Maltitol, Turanose, Sorbitol, Adonitol, Lyxose, Erythritol, vorzugsweise hydrolysiertes Amidon, Amidonhydrolysate, Mischungen dieser Zucker und Mischungen, die wenigstens einen dieser Zucker enthalten, genannt werden. Glucose und Saccharose stellen die bevorzugten Zucker dar.
Die Konzentration an assimilierbarer Kohlenstoffquelle liegt zwischen 1 und 100 g/l, und bevorzugt zwischen 15 und 80 g/l.
Das Fermentationsmedium kann ferner Oligo-Elemente wie z. B. Spuren von anorganischen Salzen wie Sulfate, Eisenchlorid, Calciumchlorid, Manganchlorid, Magnesiumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Nickelchlorid, Kobaltchlorid, Kupferchlorid, Zinkchlorid oder deren Mischungen, wie auch Vitamine, Nukleotide und/oder weitere konventionelle Additive wie z. B. Mittel zur pH-Kontrolle und Antischaummittel enthalten.
Das Verfahren zur Herstellung von Exopolysacchariden gemäß der vorliegenden Erfindung durch Fermentation von Mikroorganismen kann gegebenenfalls in Anwesenheit von Enzymen) wie alkalischen, sauren und/oder neutralen Proteasen, Polysaccharasen, Amidasen, Peptidasen, Amyloglucosidasen, Phosphatasen und Phytasen durchgeführt werden.
Jedoch liegt einer der wichtigen Vorteile des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung darin, dass die Fermentation der Mikroorganismen in Abwesenheit von Enzymen durchgeführt werden kann. Es wurde ganz überraschend festgestellt, dass sich die Abwesenheit von Enzym weder auf die Dauer noch auf die Produktivität des Fermentationsverfahrens auswirkte. Ferner hat das Weglassen von Enzym nicht zu einer Anreicherung von unlöslichen und nicht aufgelösten Rückstandsprodukten am Fermentationsende geführt, die das Medium gegenüber der Vermehrung von kontaminierenden Stämmen, die den Fermentationsmost (moût) vor der Abtrennung des Exopolysaccharids abbauen können, anfällig machen können.
Die Reinkultur der Mikroorganismen kann auf klassische Art und Weise durchgeführt werden. Der Fachmann wird in der Lage sein, in Abhängigkeit des Mikroorganismus die geeigneten Bedingungen, insbesondere die Inkubationstemperaturen und -zeiten und die Beschaffenheit des Kulturmediums (milieu d'entretien) des Mikroorganismus auszuwählen.
Im Hinblick auf die Aufbewahrung des Mikroorganismus ist es bevorzugt, wenigstens einen Vorkulturschritt vorzusehen. Unter Vorkultur wird ein Schritt verstanden, der darin besteht, den Bakterienstamm wachsen und vermehren zu lassen, ohne die Produktion von Exopolysaccharid.
Der Mikroorganismus wird in das Fermentationsmedium mit Hilfe von Inokulums oder intermediären Kulturen auf an sich bekannter Art und Weise eingeführt.
Die Fermentation kann bei Drücken zwischen 0 und 4 bar durchgeführt werden.
Man kann die Fermentation bei einer Temperatur zwischen 15 und 100 °C, bevorzugt zwischen 25 und 80 °C und insbesondere zwischen 25 und 35 °C ausführen.
Der pH des Fermentationsmediums kann zwischen 5 und 9 liegen, und bevorzugt zwischen 6 und 8. Je nach Bedarf kann der pH mit einer Base wie z. B. Soda, Kali oder Ammoniak oder mit einer Säure wie z. B. Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salzsäure oder Salpetersäure eingestellt werden.
Das Fermentationsmedium, das in einen Fermentationsbottich oder Fermentationsbehälter gefüllt wird, kann vorzugsweise einer Bewegung (agitation) und Belüftung unterworfen werden. Diese Bewegung kann beispielsweise mittels einem Reziprok-Schüttelapparat, einem Dreh-Schüttelapparat, einem oder mehreren Bewegungsmobilen) (mobile(s) d'agitation) oder einer Blasensäule (colonne a bulles) vorgenommen werden. Die Fermentationsdauer beträgt üblicherweise mehr als 30 Stunden, und liegt im Allgemeinen zwischen 40 und 100 Stunden.
Die Produktivität wird in Abhängigkeit der produzierten Exopolysaccharidmenge gemessen, ausgedrückt als Gramm, bezogen auf 1 kg Most (moût), pro Fermentationsstunde. Mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung konnte eine Steigerung der Produktivität von 3 bis 15 %, und bevorzugt von 5 bis 10 % beobachtet werden.
Nach Beendigung der Fermentation kann das Exopolysaccharid aus dem Fermentationsmost (moût) gewonnen werden und nach bekannten Verfahren wie beispielsweise Filtration, Konzentrierung, Kristallisation oder Lösungsmittelextraktion gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Exopolysaccharide, die nach diesem Verfahren erhalten werden oder erhalten werden können. Sie umfasst insbesondere Xanthangummi, das nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt worden ist.
Das nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellte Xanthangummi zeigt als wässrige Lösung von 1 % in destilliertem Wasser eine erhöhte Transparenz, d. h. in der Größenordnung von 70 bis 95 % oder auch in der Größenordnung von 80 bis 95 %. Die Transmission der wässrigen Lösung wird mittels Spektrophotometrie bei 600 nm gemessen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Vorkulturphasen 1 und 2 für Xanthomonas campestris.
Vorkultur 1
Zusammensetzung des Vorkulturmediums:
Alle Bestandteile werden in 1 Liter Trinkwasser in Lösung gebracht, mittels einem Magnetrührer homogenisiert und in 500 ml Erlenmeyern in Fraktionen von 112 ml aufgeteilt.
Der Ansatz wird für 30 Minuten bei 120 °C autoklaviert.
Der Stamm wird anfangs in Form von tiefgefrorenen Röhrchen bei –196 °C nach dem Gefrierverfahren in flüssigem Stickstoff konserviert.
Für ein Gefrieren in flüssigem Stickstoff wird eine Vorkultur auf einem bestimmten Medium mit der folgenden Zusammensetzung vorgenommen:
Für die Herstellung des Mediums werden alle Bestandteile in Quellwasser dispergiert. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 6,5 eingestellt. Das Medium wird für 20 Minuten bei 120 °C in einem Autoklaven sterilisiert.
Nach 24 Stunden Inkubation bei 28 °C auf einem Dreh-Schüttelapparat bei 220 UpM und einer Amplitude = 50 mm werden 10 Vol.-% reines steriles Glycerol zur Kultur hinzugegeben. Die Kultur wird anschließend in Kryoröhrchen aufgeteilt, jeweils zwischen 1 ml und 10 ml, bevorzugt zwischen 2 ml und 4 ml.
Diese Röhrchen werden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Die Vorkultur 1 wird mittels einem zuvor auf Raumtemperatur aufgetauten Kryoröhrchen angeimpft. Der gesamte Inhalt oder 50 % des Kryoröhrchens wird steril in die 500 ml Erlenmeyer eingeführt, deren Medium wie zuvor beschrieben autoklaviert und folglich sterilisiert worden ist.
Das derart geimpfte Medium wird während 24 Stunden bei 28 °C auf einem Dreh-Schüttelapparat bei 220 UpM und einer Amplitude von 50 mm inkubiert.
Nach 24 Stunden Inkubation erhielten wir eine Vorkultur mit einem pH zwischen 7 und 7,5, deren Viskosität zwischen 50 und 500 mPa·s lag und deren Bakterienpopulation an Xanthomonas campestris über 10¹⁰/ml lag.
Vorkultur 2
Die Vorkultur 1 dient zur Impfung der Vorkultur 2.
Zusammensetzung des Vorkulturmediums 2:
Alle Bestandteile werden in 1 Liter Trinkwasser in Suspension gebracht und der pH wird auf 6,5 eingestellt. Das Medium wird während 30 Minuten bei 120 °C autoklaviert, nachdem das Medium in 500 ml Erlenmeyer in Fraktionen von 112 ml aufgeteilt worden war.
Diese Erlenmeyer werden anschließend mit 0,1 bis 0,2 ml Vorkultur 1 angeimpft. Diese Erlenmeyer werden für 24 bis 30 Stunden bei 28 °C auf einem Dreh-Schüttelapparat bei 220 UpM und einer Amplitude von 50 mm inkubiert.
Nach 24 bis 30 Stunden Inkubation erhielten wir eine Vorkultur mit einem pH zwischen 5,8 und 7,1, deren Viskosität zwischen 100 und 1000 mPa·s lag und deren Bakterienpopulation an Xanthomonas campestris größer als 10⁹/ml war.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und den Erhalt von Exopolysaccharid gemäß zwei Fermentationsverfahren, eines mit einer organischen Stickstoffquelle und das andere mit einer gemischten organischen und anorganischen Stickstoffquelle.
In diesem Beispiel werden zwei „Vorkultur"-Stufen durchgeführt. Diese Stufen finden in 500 ml Erlenmeyern statt, was 100 ml Medium entspricht (siehe die Beispiele 1 und 2).
Die Herstellungsstufe, die der Stufe entspricht, während der der Bakterienstamm das Polysaccharid produziert, findet in 20 Liter-Fermentern statt, mit 15 verwendbaren Litern.
Stufen der Vorkultur 1 und 2
Die Stufen der Vorkultur 1 und 2 werden wie in den Beispielen 1 und 2 angegeben durchgeführt.
Herstellungsstufe
Medium 1
Die letzte Stufe ist die Herstellungsstufe des Exopolysaccharids.
Das Medium des Fermenters 1 weist die folgende Zusammensetzung auf:
Die Herstellung der Stickstoffquellen und der Kohlenstoffquellen wird getrennt durchgeführt.
Saccharose ⇨ qsp Gramm Glucose werden in qsp 3 Liter enthärtetem Wasser oder Trinkwasser in einer Mariotte-Flasche gelöst. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 5,2 abgesenkt. Die Lösung wird in der Mariotte-Flasche für 45 Minuten bei 120 °C in einem Autoklaven sterilisiert.
Johannisbrotsamenmehl + Salze ⇨ qsp Gramm Johannisbrotkeimmehl, 30 g Na₂HPO₄, 3,75 g MgSO₄·7N₂O und 7,5 ml Antischaummittel werden in qsp 7 Liter enthärtetem Wasser gelöst. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 6 eingestellt. Diese Mischung wird in situ für 45 Minuten bei 120 °C sterilisiert.
Soda 1N ⇨ 40 g NaOH-Plättchen werden in qsp 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird in einer Mariotte-Flasche für 30 Minuten bei 120 °C in einem Autoklaven sterilisiert.
Wenn alle Bestandteile bei 28 °C sind, werden sie im Fermenter vermischt. Der Fermenter wird anschließend mit qsp Vorkultur 2 angeimpft.
Die Fermentationsbedingungen in dem Fermenter sind wie folgt:
Bewegung (Rühren) ⇨ 200 UpM von 0 bis 20 Stunden, anschließend 400 UpM bis zum Ende der Fermentation.
Belüftung ⇨ 400 l/Std. von 0 bis 18 Stunden, anschließend 825 l/Std. von 24 Stunden bis zum Ende der Fermentation.
Die Temperatur wird auf 28 °C eingestellt.
Der pH wird mit 1 N NaOH auf 6,8 eingestellt.
Der Druck ist atmosphärischer Druck.
Medium 2
Das Medium 2, das eine Alternative zum Medium 1 darstellen kann, weist die folgende Zusammensetzung auf:
Saccharose ⇨ qsp Gramm Glucose werden in qsp 3 l enthärtetem Wasser gelöst. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 5 eingestellt. Die Lösung wird in einer Mariotte-Flasche für 30 Minuten bei 120 °C in einem Autoklaven sterilisiert.
Stickstoff + Salze ⇨ 17,25 g NH₄NO₃, 3,75 MgSO₄·7H₂O, 3,22 g (NH₄)₂HPO₄, 525 g Lösliches von Johannisbrotsamenmehl und 3 ml Antischaummittel werden in qsp 7 Liter enthärtetem Wasser gelöst. Der pH dieser Lösung wird mit H₂SO₄ 10 % auf 6 eingestellt. Die Mischung wird in situ für 45 Minuten bei 120 °C sterilisiert.
Soda 1N ⇨ 40 g NaOH-Plättchen werden in qsp 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird in einer Mariotte-Flasche für 30 Minuten bei 120 °C in einem Autoklaven sterilisiert.
Die Lösung von Johannisbrotkeimmehl (soluble de farine de germe de caroube) wird durch Verdünnung des Mehls auf 6 bis 15 % in enthärtetem Wasser hergestellt. Diese Lösung kann, muss aber nicht, mit Enzymen vom Typ alkalische, saure und/oder neutrale Proteasen, Lipasen, Phytasen, alkalische, saure und/oder neutrale Phosphatasen, und Amylasen behandelt werden, bevor sie gegebenenfalls auf einen horizontalen Rotationsdekantor dekantiert werden, um die Verunreinigungen, die der Qualität des Endproduktes schaden könnten, zu entfernen.
Wenn alle Bestandteile bei 28 °C sind, werden sie im Fermenter vermischt. Der Fermenter wird anschließend mit qsp Vorkultur 2 angeimpft.
Die Fermentationsbedingungen in dem Fermenter 2 sind wie folgt:
Bewegung (Rühren) ⇨ 200 UpM von 0 bis 20 Stunden, anschließend 400 UpM bis zum Ende der Fermentation.
Belüftung ⇨ 400 l/Std von 0 bis 24 Stunden, anschließend 825 l/Std von 24 Stunden bis zum Ende der Fermentation.
Die Temperatur wird auf 28 °C eingestellt.
Der pH wird mit 1 N NaOH auf 6,8 eingestellt.
Der Druck ist atmosphärischer Druck oder ein Druck von 0,5 bis 4 bar.
Ergebnisse der Fermentation
Je nach untersuchtem Kulturmedium liegen die Fermentationsdauern zwischen 45 und 65 Stunden, die mit Isopropanol fällbaren Trockenmaterialien liegen zwischen 20 und 30 g/kg und die Gewichtsausbeute, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle, liegt zwischen 50 und 70 %. Der erhaltene Fermentationsmost (moût de fermentation) weist eine Helligkeit und Brillanz auf, wie sie zuvor mit keiner anderen Stickstoffquelle beobachtet worden waren.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Exopolysacchariden durch Fermentation von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation in einem Nährmedium durchgeführt wird, das wenigens eine durch die Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoffquelle und wenigstens eine organische Stickstoffquelle umfasst, wobei diese Quelle von einer Fraktion von Johannisbrotsamen, Guarkern, Johannisbeerensamen oder Tara-Samen stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Stickstoffquelle von der Fraktion von Johannisbrotsamen stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion von Johannisbrotsamen einen Proteingehalt von wenigstens 45 Gew.-%, bevorzugt wenigstens 50 Gew.-%, und besonders bevorzugt wenigstens 60 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht des Trockenmaterials, besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine bevorzugt einen erhöhten Prozentsatz an Arginin, an Glutamin und/oder Glutaminsäure und an Lysin aufweisen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion von Johannisbrotsamen einen Lipidgehalt von wenigstens 4 Gew.-%, vorteilhafterweise von wenigstens 5 Gew.-%, und noch vorteilhafterweise zwischen 7 und 15 Gew.-% enthält, bezogen auf das Trockenmaterial.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion der Keim von Johannisbrotsamen ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion von Johannisbrotsamen in Form von einem Mehl vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Granulometrie des Mehls zwischen 10 und 150 Mikrometer liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation in einem Nährmedium durchgeführt wird, das wenigstens eine anorganische Stickstoffquelle umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganische Stickstoffquelle aus Ammonium- oder Natriumnitraten, Ammoniumphosphaten oder -sulfaten, Magnesiumsulfat, Kaliumsulfat oder Natriumsulfat, einzeln oder als Mischung, ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an organischen und gegebenenfalls anorganischen Stickstoffquellen im Fermentationsmedium zwischen 1 und 80 g/l liegt, bevorzugt zwischen 3 und 50 g/l, und noch bevorzugter zwischen 5 und 30 g/l.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die assimilierbare Kohlenstoffquelle aus Glukose oder Saccharose ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an assimilierbarer Kohlenstoffquelle zwischen 1 und 100 g/l, und bevorzugt zwischen 15 und 80 g/l liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation der Mikroorganismen in Abwesenheit von Enzymen durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einer Temperatur durchgeführt wird, die zwischen 15 und 100°C, bevorzugt zwischen 25 und 80°C, und insbesondere zwischen 25 und 35°C liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus aus der Gruppe der Bakterien der Gattung Xanthomonas, der Gattung Alcaligenes, der Gattung Agrobacterium, der Gattung Arthrobacter, der Gattung Azotobacter, der Gattung Pseudomonas, der Gattung Corynebacterium, der Pilze der Gattung Sclerotium, der Gattung Aspergillus und der Hefen der Gattung Hansenula ausgewählt wird.
Exopolysaccharid, erhalten nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.