DE3784742T2

DE3784742T2 - Saeurefeste heteropolysaccharide s-421.

Info

Publication number: DE3784742T2
Application number: DE8787300077T
Authority: DE
Inventors: Glen H Best; Suzanne M Steenbergen
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1986-01-16
Filing date: 1987-01-07
Publication date: 1993-09-09
Anticipated expiration: 2007-01-08
Also published as: US4689160A; JPS62184001A; EP0230346A2; EP0230346A3; CA1289495C; EP0230346B1; DE3784742D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet von mikrobiellen Polysacchariden. Auf diesem Gebiet ist es bekannt, daß ein allgemeines Merkmal bestimmter Mikroorganismen die Bildung von exozellulären Heteropolysacchariden ist. Heteropolysaccharide sind hoch molekulare, im allgemeinen lineare Kohlenhydratpolymere, enthaltend zwei oder mehr Arten von Monosacchariden, die eine wiederkehrende Einheit bilden, die polymerisiert ist.
Heteropolysaccharide werden verbreitet angewandt in Nahrungsmitteln, beim Bohrlochbohren, in der Landwirtschaft und einer Vielzahl von anderen industriellen Anwendungsgebieten. Der kommerzielle Bedarf an diesen wasserlöslichen Gummen hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen. Darüberhinaus führen neue industrielle Techniken zu einem Bedarf an Heteropolysacchariden mit neuen physikalischen Eigenschaften. Folglich hat der Bedarf an Heteropolysacchariden mit unterschiedlichen Funktionalitäten, verbunden mit dem kommerziellen Bedarf, deutlich die Notwendigkeit der Entwicklung von neuen Heteropolysacchariden mit neuen und unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften aufgezeigt.
Säurestabile Heteropolysaccharide sind von Interesse für Anwendungen bei der Erdölgewinnung, insbesondere bei Arbeiten zur Erhöhung der Förderung. Die Erhöhung der Förderung von Öl und Gas aus unterirdischen Lagerstätten kann durch verschiedene Stimulationsverfahren erreicht werden. Ein solches Verfahren, das verbreitet angewandt wird, ist als "Ansäuern" ("acidizing") bekannt. Dieses Verfahren umfaßt die Zuführung einer Säure, vorzugswiese einer nicht oxidierenden Säure, in das Bohrloch unter ausreichendem Druck, um die Säure in die unterirdische Formation zu pressen, wo sie mit den säurelöslichen Bestandteilen der Formation, wie beispielsweise Kalkstein, Dolomit und Sandstein, die Carbonatstreifen enthalten, reagiert. Während des Ansäuerns entstehen Flüssigkeitswege in der Formation oder bestehende Wege werden vergrößert, wodurch die Porosität und Durchlässigkeit der Formation erhöht wird und dadurch die Öl- und Gasförderung aus der unterirdischen Lagerstätte erhöht werden.
Das von Xanthomonas campestris gebildete Heteropolysaccharid (Xanthangummi), das Glucose, Mannose und Glucoronsäure enthält, hat verbreitete Anwendung gefunden bei der sekundären Ölförderung. In der US-PS 3 236 305 ist ein Verfahren zum Ansäuern von Bohrlöchern unter Anwendung von Xanthangummi angegeben. In der US-PS 4 244 826 wird Xanthangummi auch in gelierten sauren Mitteln zur Bohrlochbehandlung verwendet.
Organismen, die als Agrobacterium radiobacter IFO (Institute of Fermentation, Osaka) 12607, IFO 12664, IFO 12665, IFO 13127, IFO 13256, IFO 13532 und IFO 13533 klassifiziert sind, wurden angewandt zur Bildung von exozellulären Polysacchariden (Hiramatsu et al., "Acidic Polysaccharides Containing Succinic Acid in Various Strains of Agrobacterium", Carbohydrate Research, (1978) 61, 96-98. Diese Organismen wurden in einem synthetischen Medium gezüchtet, wie beschrieben in Amemura et al., Hakko Kogaku Zasshi; (1971) 49, 559-564, Chem. Abst. 75, 1971, 74882j.
Ein Exopolysaccharid, enthaltend D-Glucose, D-Galactose, Pyruvinsäure und O-Acetylgruppen in dem ungefähren Verhältnis 6:1:1:1,5, wird beschrieben von L. Zevenhuizen "Methylation Analysis of Acidic Exopolysaccharides of Rhizobium and Agrobacterium", Carbohydrate Research (1973) 26, 409-419. Die von Zevenhuizen verwendeten Organismen werden beschrieben als Agrobacterium tumefaciens A-8 und A-10.
Der Organismus Agrobacterium radiobacter (IFO 12665) wurde verwendet zur Erzeugung von Polysacchariden mit einer ähnlichen Struktur wie diejenige, die angegeben ist von Zevenhuizen (T. Harada et al., "Comparative Studies of Polysaccharides Elaborated by Rhizobium Alcaligenes and Agrobacterium", Carbohydrate Research, (1979) 77, 285-288). Außerdem besitzt das Polysaccharid, das isoliert worden ist von einem Pseudomonas-Organismus, wie berichtet von A.G. Williams et al., in "Preliminary Studies on the Composition and Rheological Properties of the Extracellular Polysaccharide Synthesized by Pseudomonas PB1 (NCIB 11264)", Biochem. Biophys. Acta, 585 (4) 611-619 (1979), eine ähnliche Struktur.
Die US-PS 4 259 451, 4 269 939 und 4 339 239 beschreiben ein Heteropolysaccharid zur Verwendung bei der Kontrolle der Farbwanderung während des Färbens von Stoffen, das eine ähnliche Zusammensetzung besitzt wie die oben angegebenen.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes säurestabiles Heteropolysaccharid zu entwickeln, das erzeugt wird durch eine nicht identifizierte Agrobacterium-Spezies. Es ist auch ein Ziel dieser Erfindung, ein Heteropolysaccharid zur Verfügung zu stellen, das Säurelösungen, insbesondere Salzsäurelösungen, mit hohen Säurekonzentrationen andickt. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Ansäuerungsfluid zu entwickeln, mit erhöhter Säurestabilität. Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung dieses säurestabilen Heteropolysaccharids zu liefern. Ein weiteres Ziel ist es, Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen zur Herstellung des verbesserten Heteropolysaccharids. Diese und andere Ziele der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Es hat sich jetzt gezeigt, daß eine nicht identifizierte Agrobacterium-Spezies ein säurestabiles Heteropolysaccharid erzeugt, wenn sie in einem ausgewählten Nährmedium inkubiert wird. Eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag einer biologisch reinen Kultur dieses Organismus wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 19. Dezember 1985 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53378 vorgenommen. Das säurestabile Heteropolysaccharid S-421 wird hergestellt durch Züchten der Agrobacterium-Spezies ATCC 53378 in einem wässrigen Nährmedium durch aerobe Fermentation einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und anschließende Gewinnung des Heteropolysaccharids S-421.
Die assimilierbare Kohlenstoffquelle ist ein Kohlenhydrat, insbesondere Glucose.
Dieses Heteropolysaccharid besitzt erwünschte Eigenschaften in wässrigen sauren Systemen und ist besonders geeignet zur Herstellung von wässrigen Ansäuerungsfluids. Derartige wässrige Ansäuerungsfluids enthalten etwa 6 bis etwa 35 Gew.% Säure und etwa 0,1 bis 2,0 Gew.% Heteropolysaccharid, wobei das Heteropolysaccharid hauptsächlich Kohlenhydrat, etwa 12 Gew.% Protein, etwa 4 Gew.% Acylgruppen hauptsächlich als O-Succinylgruppen, und etwa 4 Gew.% Pyruvat enthält, wobei der Kohlenhydratanteil die neutralen Zucker Glucose und Galactose in einem ungefähren Molverhältnis von 6:1 enthält. Die zur Verwendung in den Ansäuerungsfluids bevorzugten Säuren sind nicht oxidierende Säuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chlorwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure, Essigsäure oder Ameisensäure oder Kombinationen davon.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der bei der vorliegenden Erfindung angewandte Organismus wurde isoliert aus einer Wasserprobe, die aus dem Douglas-See östlich von Knoxville, Tennesee, entnommen wurde. Der Organismus wurde als gummiartige Kolonie von einer Agar-Platte mit 1% Glucose (Difco) nach 4-tägiger Inkubation bei 30ºC gewonnen. Das Isolat wurde dann auf Nähragar rein gezüchtet. Eine Kolben-Saat wurde gestartet von einer Nähragarkultur des Isolats. Diese Saat wurde dann verwendet, um einen anderen Kolben, enthaltend ein Nährmedium mit hydrolysierter Stärke als Kohlenstoffquelle, zu beimpfen. Nach der Inkubation wurde festgestellt, daß dieser Kolben eine viskose Brühe enthielt und nach Zugabe von Isopropylalkohol fiel ein faseriges Material aus. Eine andere Kolbensaat wurde gestartet und angewandt, um die Wirkung verschiedener Nährmedium auf die Gummibildung zu bestimmen und das beste Nährmedium und die Fermentationsbedingungen für diesen Mikroorganismus zu bestimmen.

Fermentationsbedingungen

Das Heteropolysaccharid S-421 wird während der aeroben Fermentation von geeignetem wässrigem Nährmedium unter kontrollierten Bedingungen gebildet durch Beimpfen mit einer Kultur des Organismus ATCC 53378, hier auch als S-421 bezeichnet. Die Medien enthalten Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze.
Allgemein können Kohlenhydrate (zum Beispiel Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Lactose und ähnliches) entweder allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der Kohlenhydratquelle oder -quellen, die in dem Medium angewandt wird/werden, hängt teilweise ab von den anderen Bestandteilen des Mediums; im allgemeinen variiert die Menge an Kohlenhydrat jedoch üblicherweise zwischen etwa 2 und 5 Gew.% des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln oder kombiniert in dem Medium angewandt werden.
Allgemein können viele Proteinsubstanzen als Stickstoffquellen für das Fermentationsverfahren angewandt werden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen zum Beispiel Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Leinsamenmehl, Hydrolysate von Kasein, Maisquellwasser, lösliche Brennereirückstände oder Tomatenpaste und ähnliches. Die Quellen für Stickstoff entweder allein oder in Kombination werden in Mengen vorzugsweise im Bereich von etwa 0,05 bis 0,2 Gew.% des wässrigen Mediums angewandt.
Zu den anorganischen Nährsalzen, die in den Kulturmedien angewandt werden können, gehören die üblichen Salze, die in der Lage sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbona- und ähnliche Ionen zu bilden. Ebenfalls umfaßt werden die Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium.
Es ist zu bemerken, daß die hier beschriebenen Nährmedien nur illustrativ sind für die Vielfalt an Medien, die angewandt werden können und nicht als begrenzend anzusehen sind.
Als alternatives Medium kann S-421 unter Bedingungen eines geringen Calciumgehalts, das heißt in entionisiertem Wasser oder einigen anderen wässrigen Systemen, die im wesentlichen frei sind von Calciumionen (das heißt weniger als etwa 4 ppm Ca&spplus;&spplus; pro 1% Gummi in der Endfermentationsbrühe), gezüchtet werden.
Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von 25ºC bis 35ºC durchgeführt; für optimale Ergebnisse ist es jedoch bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 28ºC bis 32ºC durchzuführen. Der pH-Wert der Nährmedien zur Züchtung der ATCC-53378-Kultur und Erzeugung von Heteropolysaccharid S-421 kann von etwa 6 bis 8 variieren.
Obwohl S-421 sowohl durch Oberflächen- als auch durch Submerskultur gebildet wird, ist es bevorzugt, die Fermentation als Submerskultur durchzuführen.
Eine Fermentation im kleinen Maßstab wird bequemerweise durchgeführt durch Beimpfen eines geeigneten Nährmediums mit der Kultur und, nach der Übertragung auf ein Produktionsmedium, Fortschreitenlassen der Fermentation bei einer konstanten Temperatur von etwa 30ºC auf einer Schüttelvorrichtung während einiger Tage.
Die Fermentation wird eingeleitet in einem sterilen Kolben mit Medium über eine oder mehrere Stufen der Saatentwicklung. Das Nährmedium für die Saatstufe kann eine beliebige Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein. Der Saatkolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur bei etwa 30ºC 1 bis 2 Tage oder bis das Wachstum ausreichend ist, geschüttelt und etwas des aufgetretenen Wachstums wird verwendet, um entweder eine zweite Saatstufe oder das Produktionsmedium zu beimpfen. Zwischenstufen-Saatkolben werden, soweit sie angewandt werden, im wesentlichen auf die gleiche Weise entwickelt, das heißt ein Teil des Inhalts des Kolbens aus der letzten Saatstufe wird verwendet, um das Produktionsmedium zu beimpfen. Die beimpften Kolben werden bei einer konstanten Temperatur einige Tage geschüttelt und am Ende der Inkubationszeit wird der Inhalt der Kolben durch Ausfällen mit einem geeigneten Alkohol, wie Isopropanol, gewonnen.
Beim Arbeiten im großen Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einem Rührer und Mitteln zur Belüftung des Fermentationsmediums versehen sind. Nach diesem Verfahren wird das Nährmedium in dem Tank zubereitet und sterilisiert durch Erhitzen auf Temperaturen von bis zu etwa 121ºC. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einer vorher gezüchteten Saat der Produktionskultur beimpft und die Fermentation kann während eines Zeitraums, wie zum Beispiel 2 bis 4 Tage, unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Einstellung der Temperatur auf etwa 30ºC fortschreiten. Dieses Verfahren zur Erzeugung von S-421 ist besonders geeignet zur Herstellung großer Mengen.

Heteropolysaccharid S-421

Das von ATCC 53378 gebildete Heteropolysaccharid besteht hauptsächlich aus Kohlenhydrat, etwa 12 Gew.% Protein, etwa 4 Gew.% (berechnet als Essigsäure) Acylgruppen, hauptsächlich in Form von O-Succinylgruppen und etwa 4 Gew.% Pyruvat. Der Kohlenhydratanteil von S-421 enthält die natürliche Zucker Glucose (84-92%; im Mittel 85%) und Galactose (8-16%; im Mittel 15%) in einem ungefähren Molverhältnis von 6:1.
Der Acylgehalt von etwa 4% wurde bestimmt durch zwei getrennte Verfahren. Eine 0,2%ige wässrige Lösung von S-421-Gummi wurde mit einem alkalischen Hydroxylaminreagens behandelt und anschließend mit einem sauren Eisen-III-chlorid-Reagens und durch colorimetrische Analyse untersucht. (Siehe S. Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180, 249-261). Die O-Acylgruppen wurden auch durch Flüssigkeitschromatographie quantitativ bestimmt und als O-Succinyl identifiziert.
Die neutralen Zucker von S-421 wurden ebenfalls nach verschiedenen Verfahren bestimmt. Ein Verfahren umfaßt das Hydrolysieren von 50 mg S-421 in 1 ml 1M H&sub2;SO&sub4; während 4 Stunden bei 100ºC. Bei dem zweiten Verfahren wurde die Probe in 72%iger H&sub2;SO&sub4; während einer Stunde bei 0ºC abgebaut und dann in 1 M H&sub2;SO&sub4; 4 Stunden bei 100ºC hydrolysiert. Die Zucker wurden durch Gasflüssigkeitschromatographie ihrer Aldonitrilacetatderivat getrennt und identifiziert und quantifiziert durch Vergleich mit authentischen Standards (J. K. Baird, M. J. Holroyde und D. C. Ellwood (1973) Carbohydr. Res. 27, 464-467).
Pyruvat wurde bestimmt nach dem Verfahren von Duckworth und Yaphe Chem. & Ind. (1970) S. 747.
Der Proteingehalt wurde bestimmt nach dem Verfahren von Lowry et al., (J. Biol. Chem., (1951), 193, S. 256) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard.
Selbstverständlich können, obwohl die hier beschriebenen Analyseverfahren für das Heteropolysaccharid die tatsächlich angewandten Verfahren waren, um das oben beschriebene Mittel zu erhalten, andere Analyseverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, angewandt werden. Die Anwendung von anderen Analyseverfahren sollte zu der gleichen Charakterisierung des Heteropolysaccharids führen, obwohl leicht unterschiedliche quantitative Ergebnisse angegeben sein können.
Es hat sich gezeigt, daß das Heteropolysaccharid S-421 außergewöhnliche Eigenschaften in wässriger Lösung besitzt, insbesondere indem es eine sehr hohe Viskosität bei sehr geringen Konzentrationen und eine ausgezeichnete Stabilität in stark sauren wässrigen Lösungen besitzt. Aufgrund dieser Tatsache ist es geeignet als Verdickungs-, suspendier-, Emulgier-, Stabilier-, Schmier-, filmbildendes Mittel oder Bindemittel für verschiedene Anwendungen.
Eine besonders wertvolle Anwendung liegt auf dem Gebiet der Behandlungsflüssigkeiten für Bohrlöcher. Es hat sich gezeigt, daß das Heteropolysaccharid S-421 besonders geeignet ist in wässrigen Medien, besonders solchen, die zur Verwendung als Ansäuerungsfluid hergestellt werden.
Der Ausdruck "Ansäuerungsfluid" umfaßt zum Beispiel Anregungsfluids (hydraulische Frakturierung, Ansäuern der Matrix und Säurefrakturierung) und andere Fluids zur verstärkten Ölförderung. Substanzen, die in solchen Fluids vorhanden sein können, umfassen hauptsächlich das Heteropolysaccharid, eine Säure, vorzugsweise eine nicht oxidierende Säure, und Wasser. Angewandte Säuren umfassen Chlorwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure, Essigsäure, Ameisensäure und Kombinationen davon. Es ist zu bemerken, daß die Bestandteile und Konzentrationen jedes speziellen Fluids von dem Fachmann an der Bohrstelle in der erforderlichen Menge für die spezielle zu lösende Aufgabe ausgewählt werden; Chlorwasserstoffsäure (Salzsäure) ist die vorwiegend angewandte Säure. Ansäuerungsfluids werden hergestellt zum Beispiel durch Verdünnen von konzentrierter Salzsäure (28 bis 35%) mit Wasser auf die gewünschte Konzentration. Das Heteropolysaccharid wird entweder in verdünnter Säure oder vorzugsweise in Wasser hydratisiert und dann mit der Säure vermischt.
Selbstverständlich können die Ansäuerungsfluids nach der vorliegenden Erfindung zusätzlich Korrosionshemmer, Entemulgiermittel, Trennmittel, grenzflächenaktive Mittel, Reibungsverringerer usw., wie sie bekannt sind, enthalten. Stützmittel können ebenfalls in den erfindungsgemäßen Fluids enthalten sein, wenn dies erwünscht ist. Stützmittel, die angewandt werden können, umfassen beliebige bekannte, zum Beispiel Sandkörner, gesinterten Bauxit und ähnliche Materialien.
Das Heteropolysaccharid S-421 wird üblicherweise in den erfindungsgemäßen Ansäuerungsfluids in einer Menge im Bereich von 0,01 Gew.% bis 2,0 Gew.% Heteropolysaccharid angewandt. Die Säure ist in den Ansäuerungsfluids nach der Erfindung üblicherweise im Bereich von etwa 6 bis etwa 35 Gew.%, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 28 Gew.%, vorhanden.

Beschreibung des Stammes

Das Heteropolysaccharid S-421 kann gebildet werden durch Fermentation eines geeigneten Nährmediums mit einem Mikroorganismus, der eine nicht identifizierte Agrobacterium-Spezies ist. Eine Hinterlegung einer biologisch reinen Kultur des zur Herstellung dieses Heteropolysaccharids verwendeten Mikroorganismus nach dem Budapester Vertrag wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland am 19. Dezember 1985 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53378 vorgenommen.

A. Charakteristika der Koloniemorphologie

Auf Nähragar tritt eine durchscheinende Kolonie in 72 Stunden bei 30ºC mit einem Durchmesser, der etwa 2,0 mm erreicht, auf. Die Kolonie war rund, glatt, konvex, glänzend und weiß.

B. Charakteristika der Zellmorphologie

Auf Nähragar bei 30ºC schien der Organismus Vakuolen zu enthalten (appeared vacuolated). Er war ein pleomorphes, gram-negatives Stäbchen mit Dimensionen von etwa 0,5 · 10 um. Die Flagella waren ein Gemisch von peritrich und polar.
C. Physiologische und biochemische Charakteristika Dieser Organismus wuchs bei 30, 37 und 40ºC. Er wuchs nicht bei 43ºC und auch nicht bei 4-5ºC. Auf Dreifach-Zucker-Eisen-Agar zeigte die Schräge eine alkalische Reaktion, es trat jedoch keine Veränderung in dem Stoß (butt) auf. Es wurde kein H&sub2;S oder Gas gebildet.
Der Organismus war cytochrom Oxidase-positiv und der O/F-Test zeigte, daß er oxidierend war. Er wuchs nicht anaerob. Mit diesem Organismus trat keine Veränderung von Lackmusmilch auf. Er war Indol-, Methylrot- und Voges-Proskauer-negativ. Er konnte Citrat als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle verwerten. Er reduzierte Nitrate nicht. Er verwertete Ammoniak als einzige Stickstoffquelle. Er erzeugte H&sub2;S und war Urease-positiv. Er konnte in 3% NaCl wachsen, aber nicht in 6% NaCl. Wie es für Agrobacterium radiobacter und Agrobacterium tumefaciens typisch ist, produzierte das Isolat 3-Ketolactose. Er hydrolysierte Gelatine partiell, aber nicht Stärke, Casein, Esculin oder Tween 80 (oberflächenaktives Mittel, geliefert von ICI United Stats, Inc., Wilmington, Delaware).
Es trat Säurebildung auf, ausgehend von den folgenden Kohlenhydraten:
Adonit, Lactose, Raffinose,
Arabinose, Levulose, Rhamnose,
Dextrose, Maltose, Salicin,
Dulcit, Mannit, Sucrose,
Galactose, Mannose, Sorbit,
Inosit, Melibiose, Trehalose,
Xylose.
Es wurde keine Säure aus Inulin gebildet.

D. Identifizierung

Bestimmte Agrobacterium-Arten können Pflanzen infizieren und zu Kronengallentumoren führen, die undifferenziert an der Infektionsstelle wachsen. Tatsächlich unterschieden R. E. Buchanan und N. E. Gibbons, Hrsg. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Williams & Wilkins, Baltimore (1974), S. 265 die Art Agrobacterium tumefaciens von Agrobacterium radiobacter aufgrund der tumorerzeugenden Aktivität. In letzter Zeit wurde festgestellt, daß das tumorerzeugende Agens ein Plasmid (das Ti-Plasmid) ist, das einen Teil seiner DNA in das Chromosom der Wirtszelle der infizierten Pflanze einbaut. Agrobakterien, die das Ti-Plasmid nicht enthalten, führen nicht zur Kronengallenerkrankung und, außer dieser tumorerzeugenden Fähigkeit, bestehen keine bekannten morphologischen, physiologischen oder genotypischen Unterschiede zwischen Agrobacterium radiobacter und Agrobacterium tumefaciens.
Um ein Schema zur Identifizierung und Differenzierung von Agrobakterien zu entwickeln, wurde vorgeschlagen, daß tumorerzeugende Stämme nicht als unterschiedliche Arten betrachtet werden sollen, sondern als unterschiedliche Erscheinungsformen, da diese Ti-Plasmide teilweise leicht bei dem Mikroorganismus in der Natur oder im Labor verlorengehen können. Siehe B. Holmes und P. Roberts, J. Appl. Bacteriol., 50 (3) (1981) S. 443-468. Folglich wurde S-421, ATCC 53378 nicht auf tumorerzeugende Aktivität untersucht und klassifiziert als eine nicht identifizierte Agrobacterium-Art aufgrund seiner morphologischen, physiologischen und biochemischen Charakteristika und aufgrund der Erzeugung des säurestabilen Heteropolysaccharids S-421. N. R. Krieg, Hrsg. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Williams & Wilkins, Baltimore (1984), S. 249, klassifiziert Agrobakterien jedoch noch auf der Basis ihrer tumorerzeugenden Aktivität.
Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehen für den Fachmann aus einer Betrachtung dieser Beschreibung hervor. Die Beschreibung und die Beispiele sollen daher nur beispielhaft angesehen werden, wobei der echte Umfang und Geist der Erfindung durch die folgenden Ansprüche angegeben ist.

Beispiel 1

Wirkung von Medien auf die Gummiproduktion

Eine YM-Kolbensaat wurde von einer 48 Stunden-Nähragarkultur auf einem Gyrotar-Schüttler bei 30ºC gestartet. Etwa 24 Stunden später wurde diese Saatkultur verwendet, um einen Kolben, enthaltend E&sub1;-Medium, mit 3% hydrolysierter Stärke als Kohlenstoffquelle, zu beimpfen. Dieses Medium wurde ebenfalls auf einen Gyrötar-Schüttler bei 30ºC gestellt. Etwa 72 Stunden später wurde festgestellt, daß in diesem Kolben eine viskose Brühe enthalten war und nach Zugabe von 2 Volumina 99%igern Isopropylalkohol wurde ein faseriger Niederschlag beobachtet.
Das E&sub1;-Medium enthält 5 g Dikaliumphosphat, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,9 g Ammoniumnitrat, 0,5 g Promosoy 100 (ein enzymatisch abgebautes Sojabohnenmehl, verkauft von Central Soya Chemurgy Division), 30 g Dextrose und 1 l Leitungswasser. Der pH-Wert des E&sub1;-Mediums beträgt etwa 7,6 bis 7,8.
Ein anderer YM-Saatkolben wurde auf die oben angegebene Weise hergestellt und nach 24 Stunden verwendet, um 5 Kolben, enthaltend unterschiedliche Medien, zu beimpfen und diese Kolben wurden etwa 72 Stunden auf einem Gyrotar-Schüttler bei 30ºC inkubiert und nach dieser Zeit wurde-der pH-Wert, die Viskosität, die Gummiausbeute und die Viskosität des Produktes gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Medium Kohlenstoffquelle Viskosität der Brühe (cP) % Gummiausbeute 3% hydrolysierte Stärke (enthaltend 0,2% Promosoy 100) 3% Glucose Salze ¹ HoLe-Salze: Wässrige Lösung (verwendet in einer Menge von 1 ml/l Medium) enthaltend:

Konz. in dem End-Medium (ppm)

H&sub3;BO&sub3; 0,05 B&spplus;³
MnCl&sub2;·4H&sub2;O 0,5 Mn&spplus;²
FeSO&sub4; 0,5 Fe&spplus;²
CuCl&sub2; 0,01 Cu&spplus;²
ZnCl&sub2; 0,02 Zn&spplus;²
CoCl&sub2;·6H&sub2;O 0,01 Co&spplus;²
Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2;O 0,01 Mo&spplus;&sup6;
Natriumtartrat 1,8

Beispiel 2

Zusätzliche Untersuchung der Wirkung der Medien auf die Gummiproduktion

Aufgrund der Ergebnisse des Beispiels 1 wurde ein weiterer YM-Saatkolben auf die oben beschriebene Weise hergestellt und verwendet, um 5 Kolben, enthaltend unterschiedliche Medien, zu beimpfen, wobei jedoch 3% Glucose die Kohlenstoffquelle war, die in der Mehrzahl der Kolben verwendet wurde. Diese Kolben wurden auf einem Schüttler 72 Stunden bei 30ºC inkubiert und zu diesem Zeitpunkt der pH-Wert, die Viskosität, die Gummiausbeute und die Viskosität des Produktes gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3 Medium Kohlenstoffquelle Viskosität der Brühe (cP) % Gummiausbeute 3% Glucose Promosoy 3% hydrolysierte Stärke
Die Ergebnisse zeigten, daß E&sub1;, enthaltend 0,2% Promosoy und 3% Glucose, das beste Wachstumsmedium war.

Beispiel 3

Optimales Medium für S-421

Die Ergebnisse eines S-421 Medienauswahlversuchs zeigen, daß die Zugabe von Mangan die Fermentation stimuliert, aber die besten Ergebnisse werden bei Zugabe von HoLe-Salzen erzielt. Ergebnisse des Versuchs (geernt nach 120 Stunden) Medien pH Visk. (cP) restliche Kohlenstoffquelle (%) Ausbeute % Synthetisches Leitungswasser 1% Visk. (cP) 0,1% Salze Tartrat * sehr schaumig
Es wurden zwei Versuche in 14 l-Fermentationsgefäßen in dem folgenden Medium durchgeführt:
3% Glucose
0,05% Promosoy 100
0,01% MgSO&sub4;·7H&sub2;O
0,09% NH&sub4;NO&sub3;
0,005% SAG 5693 (Antischaummittel von Union Carbide)
1 ppm Fe&spplus;&spplus; (zugegeben als FeSO&sub4;·7H&sub2;O)
8 ppm Mn&spplus;&spplus; (zugegeben als MnCl&sub2;.4H&sub2;O) Leitungswasser.
Die K&sub2;HPO&sub4;-Konzentration wurde in dem ersten Versuch von 0,05 bis 0,50% und in dem zweiten Versuch von 0,25 bis 0,35% variiert. Eine Viskosität von 0,1% Produkt von ≥ 40 cP war erforderlich, um eine Verbesserung in dem Wachstumsmedium anzuzeigen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Phosphatkonzentration die Viskosität des Endproduktes beeinflußt und daß eine K&sub2;HPO&sub4;- Konzentration von 0,25% in dem Medium Produkte mit Viskositäten ≥ 40 cP ergibt. Versuch K&sub2;HPO&sub4; Konz. (%) Fermentationszeit (h) Gummiausbeute (%) Viskosität bei 0,1%

Beispiel 4

Fermentationsverfahren zur Erzeugung großer Mengen an Heteropolysaccharid S-421

Ein 500 ml-Kolben, enthaltend 100 ml YM- (Difco) Brühe wurde mit einer Schleife voll Agrobacterium sp.-Kultur, ATCC 53378 von einer 48-Stunden Nähragarplatte beimpft. Nach 24-stündiger Inkubation unter Schütteln bei 30ºC wurden 5% dieser YM-Saat in 200 ml E&sub1;-Medium mit HoLe-Salzen und 3% Glucose übertragen. Nach einer ähnlichen Inkubationszeit wurde diese Saat verwendet, um einen 5 l-Fermentor zu beimpfen, enthaltend 2,8 l des folgenden Mediums:
3% Glucose
0,5% K&sub2;HPO&sub4;
0,05% Prompsop® 100
0,01% MgSO&sub4;·7H&sub2;O
0,09% NH&sub4;NO&sub3;
0,005% SAG 5693 (Antischaummittel von Union Carbide)
1 ml/l HoLe-Salze
1 ppm Fe&spplus;&spplus; (zugegeben als FeSO&sub4;·7H&sub2;O) Leitungswasser.
Die Temperatur wurde auf 30ºC gehalten und die Belüftung auf 1 1/min. Das Rühren wurde mit 400 Upm gestartet und die Geschwindigkeit anschließend erhöht, um ein gutes Mischen sicherzustellen. Nach 24 Stunden wurden etwa 2,5 l dieser Saat angewandt, um einen 70 l-Fermenter, enthaltend ein Endmedium in einer Menge von 50 l, zu beimpfen. Das Medium war wie folgt:
3% Glucose
0,25% K&sub2;HPO&sub4;
0,05% Promosoy 100
0,01% MgSO&sub4;·7H&sub2;O
0,09% NH&sub4;NO&sub3;
0,005% SAG 5693
1 ml/l HoLe-Salze
1 ppm Fe&spplus;&spplus; (zugegeben als FeSO&sub4;·7H&sub2;O) Leitungswasser.
Die Temperatur wurde während der Fermentation auf 30ºC gehalten. Die Fermentation wurde mit 10 l/min Luft und 300 Upm Rühren gestartet. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 40% KOH nach Bedarf unter Verwendung eines automatischen pH-Kontrollsystems auf 6,8 eingestellt. Die Rührgeschwindigkeit wurde nach Bedarf erhöht, um ein gutes Vermischen sicherzustellen. Die Belüftung wurde nach 24 Stunden auf 20 l/min erhöht und blieb für den Rest der Fermentation auf diesem Wert. Die Ergebnisse der Fermentation sind unten angegeben: Alter (h) pH Viskosität der Brühe (cP) Gummiausbeute restliche Kohlenstoffquelle (%)
Die Fermentationsbrühe wurde 15 Minuten auf etwa 75ºC erwärmt und dann auf 30ºC abgekühlt. Die Fermentationsbrühe wurde dann zu etwa 2 Volumina 99%igem Isopropanol gegeben. Das Heteropolysaccharid fiel als faseriges Material aus, das leicht mit einem Sieb gewonnen werden konnte. Die Fasern wurden in einem Umlufttrockner bei 55ºC etwa 45 Minuten getrocknet, bevor sie zu einem Pulver vermahlen wurden. Bei Rekonstitutieren in synthetischem Leitungswasser in einer Konzentration von 0,1% betrug die Viskosität 52 cP (UL Adapter, Brookfield LVF Viskometer, 6 Upm).

Beispiel 5

Anfangsviskosität des Heteropolysaccharids S-421

Die Anfangsviskosität von S-421 wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt. Das Polymer wurde zunächst mit Leitungswasser in einer Konzentration von 2% (6 g in 300 ml) hydratisiert durch 30 Minuten langes Vermischen auf einem Hamilton-Beach- Mixer (Modell 936) mit 100% Geschwindigkeit. In ein geeignetes Becherglas wurden 0,2 ml Korrosionshemmer, eine geeignete Menge Polymerkonzentrat, zusätzliches Wasser, um die gewünschte Polymerkonzentration in dem sauren Frakturierungsmittel zu erzielen, und schließlich konzentrierte Salzsäure gegeben. Das Fluid wurde 2 Minuten unter angemessen langsamem Rühren vermischt, um Homogenität sicherzustellen. Als Beispiel wurde ein Fluid, bestehend aus 15% HCl und 1,25 pounds Polymer/Barrel hergestellt aus 54 g des Polymerkonzentrats, 136 ml Wasser und 110 ml konzentrierter Salzsäure. Ein Fann 35-Viskosimeter wurde dann angewandt, um die Viskosität der Probe bei 3 Upm zu bestimmen; die Ergebnisse sind unten angegeben. Anfangsviskosität Polymer Polymerkonz. (%) % HCl Viskosität (cP)

Beispiel 6

Viskositätshalbwertszeit des Heteropolysaccharids S-421

Die Viskositätshalbwertszeit, definiert als die Zeit, bei der die Hälfte der Anfangsviskosität auf einem Fann 35-Viskosimeter bei 3 Upm verlorengeht, wurde für das Heteropolysaccharid S-421 gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß mit Heteropolysaccharid S-421 angedickte saure Lösungen eine lange Viskositätshalbwertszeit selbst bei hohen Temperaturen besitzen. Längere Viskositätshalbwertszeiten gehen über in längere HCl-Verbrauchsraten. Die Ergebnisse sind unten angegeben. Viskositätshalbwertszeiten¹ von Heteropolysaccharid S-421 Lagerungstemperatur (ºF)¹ Viskositätshalbwertszeiten wurden nicht über 2 Stunden hinaus bestimmt, da längere Halbwertszeiten für Säurefrakturierungsanwendungen nicht erforderlich sind.
N.D. = nicht bestimmt
# = Anfangsviskosität war zu gering, um Viskositätshalbwertszeiten zu bestimmen.

Beispiel 7

HCl-Verbrauchsraten von Heteropolysaccharid S-421

Während der Säurefrakturierung ist es erwünscht, das Neutralisationsverfahren zu verzögern, bis die saure Lösung tief in die unterirdische Formation eingedrungen ist. So wurde eine Untersuchung durchgeführt bezüglich der Wirkung des Heteropolysaccharids S-421 auf die Verbrauchsrate von HCl (Neutralisationsrate bzw.-geschwindigkeit) in Gegenwart von CaCO&sub3;-Marmorchips.
Bei dem Testverfahren wurden 80 g Marmorchips zu 200 ml einer 15%igen HCl-Lösung zugegeben, enthaltend (a) kein Polysaccharid und (b) 1,25 ppb Heteropolysaccharid S-421. Die saure Lösung wurde bei 75ºF gehalten und in Zeitintervallen von 0, 3, 6, 12, 24 und 48 Minuten wurde eine Probe entnommen und gegen 0,1 N NaOH-Lösung titriert. Der Versuch wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die saure Lösung bei 125ºF gehalten wurde. Die Ergebnisse sind unten angegeben: % HCl Zeit (Minuten) kein Polymer
Die Ergebnisse zeigen, daß die sauren Lösungen, die Heteropolysaccharid S-421 enthalten, deutlich längere Verbrauchszeiten (langsamere Geschwindigkeiten der Säureneutralisation) aufweisen als saure Lösungen, die kein Polymer enthalten.

Claims

1. Wäßriges Ansäuerungs-Fluid, umfassend etwa 6 bis etwa 35 Gew.-% Säure und etwa 0,1 bis etwa 2 Gew.-% Heteropolysaccharid S-421, gebildet von Agrobacterium Art ATCC 53378, wobei das Heteropolysaccharid hauptsächlich Kohlenhydrate, etwa 12 Gew.-% Protein, etwa 4 Gew.-% Acyl-Gruppen, hauptsächlich als O-Succinyl-Gruppen, und etwa 4 Gew.-% Pyruvat enthält und wobei der Kohlenhydrat-Anteil die neutralen Zucker Glukose und Galactose in einem Mol-Verhältnis von ungefähr 6 : 1 enthält.

2. Fluid nach Anspruch 1, wobei die Säure eine nichtoxidierende Säure ist.

3. Fluid nach Anspruch 2, wobei die Säure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chlorwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure, Essigsäure und Ameisensäure.

4. Fluid nach Anspruch 3, wobei die Säure Chlorwasserstoffsäure ist.

5. Fluid nach Anspruch 4, umfassend etwa 10 bis etwa 28 Gew. -% Chlorwasserstoffsäure.

6. Verfahren zur Herstellung des Heteropolysaccharids S-421, umfassend das Züchten des Agrobacteriums Art ATCC 53378 in einem wäßrigen Nährmedium durch aerobe Fermentation einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und Gewinnung des Heteropolysaccharids S-421.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die assimilierbare Kohlenstoffquelle ein Kohlenhydrat ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Kohlenhydrat Glukose ist.

9. Produkt, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 8.