JPS62184001A - 酸に安定なヘテロ多糖類ｓ−４２１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物多糖類に関する。特定の微生物の一般的
な特徴として、細胞外にヘテロ多糖類を生産せしめるこ
とが、この分野で知られている。

ヘテロ多＄７’ｉ類は高分子量で、２種以上の単糖類を
含む、一般的に直鎖状の炭水化物重合体であり、その単
Ｉ！類は重合されるくり返し単位を形成するものである
。

ヘテロ多糖類は食品、油井掘削、農業及び他の広範な工
業の分野で広く用いられている。これら水溶性ゴムにつ
いての商業上の需要が、過去数十年にわたって、非常に
増加して来た。更に、新しい産業技術においては、新し
い物理的性質を有するヘテロ多糖類を必要としている。

それ故、商業需要に結びついた、異った機能を持つヘテ
ロ多糖類の必要性が、新しく、しかも異った物理的性質
を有する新複合多糖類の開発の必要性を生じた事は明ら
かである。

酸に安定なヘテロ多糖類は油田での適用、特に生産増強
作業において興味が持たれる。地下貯蔵から、石油及び
ガスの回収を増やすために、種々の刺激法を用いる事が
できる。広く用いられている方法の１つは、“酸処理″
　（ａｃｉｄｉｚｉｎｇ　）法として知られている。本
方法は酸、好ましくは非酸化性酸を油井中に十分な圧力
下で導入しその酸を地下形成層中へ押し出し、そこで地
下層中の酸可溶性成分、例えば、石灰石、ドロマイト、
及び一連の炭酸塩を含有する砂岩、と反応せしめる方法
である。酸処理の間、地層内に流体流の通路が形成され
たり、又は現存する通路が大きくなり、したがって地層
の多孔性及び透過性が増加し、それによって、地下貯蔵
から、石油及びガス生産が増加する。

土主ｌ上至±ス　カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
ａｓ態肚叩豆ｎ）により生産される、グルコース、マン
ノース及びグルクロン酸を含むヘテロ多ｔＩＮ類（キサ
ンタンゴム）は、第２次オイル回収作業に広く適用され
る事が判明した。米国特許第３，２３６．３０５号にお
いて、キサンタンゴムを利用した、油井の酸処理法が記
載されている。米国特許第４．２４４．８２６号におい
て、キサンタンゴムをゲル化した酸性の油井処理組成物
に用いる事が記載されている。

アゲロバクー１ウム　−１２オヱε漏運火（Ａ　ｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ　）　　
Ｉ　Ｆ　Ｏ（大阪発酵研究所）　１２６０７　、ＩＦＯ
１２６６４、ＩＦＯ１２６６５、ＩＰＯ１３１２７、Ｉ
ＦＯ１３２５６、ＩＦＯ１３５３２及び夏ＦＯ１３５３
３として分類される微生物が細胞外多ｔｌ！類を生産せ
しめるのに用いられてきた（ヒラマツ等、“アグロバク
テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　）の種々の
株におけるサクシン酸を含有する酸性多糖類”カーボハ
イドレート・リサーチ（ＣｏｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅ
ｓ＠ａｒｃｈ）、（１９７８）６上、９６−９８）、。

これらの微生物は、アメムラ等により報告の合成培地中
（醗酵工学雑誌、（１９７１）４９．５５９−５６４、
ケミカル・アブストラクト（Ｃｈｅｓｓ。

Ａｂｓｔ、）　７５．１９７１．７４８８２ｊ）で増殖
した。

Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、ピルビン醇、及び
Ｏ−アセチル基を、約６：１：１：１，５の比で含有す
るエキソ多１ｇ！４類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒ
ｉｄｅ）が、エル、ゼベンフィゼン（Ｌ、Ｚｅｖｅｎｈ
ｕｉｚｅｎ　）により報告された。（“リゾビウム（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ）及びアグロバクテリウム（＾ｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）における酸性エキソ多糖類のメ
チル化分析”、カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（１９７３）
、２工、４０９−４１９）。ゼベンフイゼン（Ｚｅｖｅ
ｎｈｕｉｚｅｎ　）により用いられた微生物はアゲロバ
クー１ウム　ス１ヱエ之工之ス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）　Ａ　−８及び
Ａ−１０である。

微生物１ノ〕ムパｊｊ−匹グＪ、ラジオバクチル（Ａ　
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ　
）　　（Ｉ　Ｆ　０１２６６５）はゼベンフイゼン（Ｚ
ｅｖｅｎｈｕｉｚｅｎ　）の報告によるものと類似した
構造を有する多糖類を生産するのに用いられてきたくテ
ィー、ハラダ、（Ｔ、ｌ１ａｒａｄａ）等、”　％　（
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）　、アルカリジエ主ス（紅粉旦
り匹針、及びアグロバクテリウム（シ匡妙μｍ犯ユ叩−
）により生産される多糖類、の比較検討”、カーボハイ
ドレイト・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　）、（１９７９）、ユニ、２８５−２８
８）。更に、ニー、ジー、ウィリアムス（Ａ、Ｇ、Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ）等の報告（“シュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　）　Ｐ　Ｂ　ｌ　　（ＮＣＩＢ　１１
２６４）により生合尿される細胞外多糖類の組成及びレ
オロジー特性に関する予備研究”　Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　　５８５　（４１，６１１−６１９（１９
７９））によるシュードモナス（ハ旦ｇｄｏｍｏｎａｓ
　）菌から単離された多Ｉ！類は類似の構造を有する。

米国特許第４．２５９．４５１号、　４，２６９，９３
９号及び４．３３９．２３９号には、織物の染色中にお
ける色移動の制御に用いられる、上述のものと類似した
組成を有するヘテロ多糖類について記載されている。

本発明の目的は、未確認アゲロバクチ１ウム（Ａ　ｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）種により生産される、改良型で
酸に安定なヘテロ多Ｉ！類を提供する事にある。

更に、高濃度の酸を含む酸溶液、特に塩酸溶液を濃厚化
するヘテロ多ｔａ類を提供する事も本発明の目的である
。又、酸安定性を増強した改良型、酸処理流体組成物を
提供する事も本発明の目的である。更に、本発明の他の
目的は、この酸安定性へテロ多糖類の製造法を提供する
事であり、更に、又、改良型へテロ多Ｉ！類を生産する
微生物を提供する事も本発明の他の目的である。これら
本発明の目的及び他の目的は以下の記載から明らかとな
ろう。

今日、未確認アゲロバクー１ウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　）種を、選出した栄養培地中でインキュベー
トすると、酸に安定なヘテロ多Ｉ！類を生産する事が判
明した。本微生物の生物学的に純粋な培養物のプダベス
）　（［Ｉｕｄａｐｅｓｔ）条約にもとずく寄託が、米
国メリーランド州ロックビルのＡ　Ｔ　ＣＣ（Ａ＋ｎｅ
ｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ　）により、１９８５年１２月１９日に、受託番
号ＡＴＣＣ５３３７８のもとでなされた。酸安定性のへ
テロ多￥ｆＳ頻５−４２１は、アグロバクーリウム（ん
匡妙主１犯ユｕｍ　）種ＡＴＣＣ５３３７８を、栄養培
養液中で同化し得る炭素源の好気的発酵により増殖せし
め、上述のヘテロ多糖類Ｓ−４２１を回収する事により
製造される。同化し得る炭素源は炭水化物、特にグルコ
ースである。

本ヘテロ多糖類は、酸水溶液系で所望な特性を有し、特
に酸処理水性液を作るのにを益である。

このような酸処理水性液は、約６〜約３５重量パーセン
トの酸、及び約０．１〜２．０重量パーセントのへテロ
多Ｉ！類を含有する。そのヘテロ多糖類は主として炭水
化物を含み、さらに約１２重量％のタンパク質、約４重
量％の、主に０−サクシニル基の如きアシル基及び約４
重量％のピルビン酸化合物を含む。また、炭水化物部分
はモル比約６＝１で中性糖グルコース及びガラクトース
を含有する。上述酸処理液に用いるのに好適な酸は、塩
酸、フッ化水素酸、酢酸、ギ酸又はそれらの組合せから
なる群より選出した、非酸化性酸である。

本発明に用いられた微生物は米国テネシー州、ノンクス
ビルのダグラス湖東畔で採取した水試料から単離した。

微生物は、１％グルコース（Ｄｉｒｃｏ）寒天培地で、
３０℃、４日間の培養後に見られるゴム状コロニーとし
て採取した。単離菌を、栄養寒天培地で、純培養した。

単離菌の栄養寒天培地培養物をフラスコ中で培養して種
とし、次に、この種を、炭素源として、加水分解したデ
ンプンを含む栄養培地の入った他の栄養培地に接種する
ために用いた。インキュベーションの後、このフラスコ
には、粘性液（ｖｉｓｃｏｕｓ　ｂｅｅｒ）が含まれて
おり、これに、イゾプロビルアルコールを加えると、繊
維状物質が沈澱した。他のフラスコで種培養し、これを
、ゴム生成に対する種々の栄養培地の効果を決定し、本
微生物のための最良の増殖培地及び最良の培養条件を決
定するために用いた。

豊五条作 ヘテロ多Ｉｉ類Ｓ−４２１は、Ｓ−４２１とここで称す
る微生物ＡＴＣＣ５３３７８の培養物の接種により、制
御された条件下での適切な水性栄養培地中での好気的発
酵の間に生産される。培地には同化しうる炭素、窒素及
び無機塩の源が含まれる。

一般に、炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース
、マルトース、シュークロース、キシロース、ラクトー
ス等）を同化し得る炭素源として、単独で又は、それら
を組合せて栄養培地中で用いる事ができる。培地中で用
いる炭水化物源の正確な量は、培地の他の成分に一部は
存在するが、一般には炭水化物の量は通常、培地の約２
重量％と約５重量％の間で変化する。これら炭素源は培
地中で別個に又は併用して用いる事ができる。

一般には、発酵過程において、窒素源として、多くのタ
ンパク質物質を用いる事ができる。望ましい窒素源は、
例えば、イースト加水分解物、原発性イースト、大豆粉
、綿実粉、カゼイン加水分解物、トウモロコシ浸潤液、
醸造室の可溶性成分、トマトペーストなどである。窒素
源は単独でもしくは、併用して、水性培地の約０．０５
〜約０．２重量％の範囲で用いるのが望ましい。

培地に加える事のできる栄養無機塩は、ナトリウム、カ
リウム、アンモニウム、カルシウム、ホスフェート、サ
ルフェート、クロライド、カルボネート等のイオンを生
ずる事のできる通常の塩である。また、コバルト、マン
ガン、鉄及びマグネシウムの如き微量金属も含有する。

ここに記載の栄養培地は、用いる事のできる広範な種類
の培地を単に例示するものであってこれに限定するもの
ではない事に注意されたい。

他の培地として、低カルシウムイオンの条件下で、すな
わち脱イオン水又は、実質的にカルシウムイオンのない
他の水性系（すなわち、最終培養液中の１％ゴムあたり
約４　ｐｐｍ以下のＣａ＋″　）中でＳ−４２１を増殖
できる。

発酵は、約２５℃〜３５℃の温度範囲で行うが、最適な
結果を得るためには発酵は、約２８℃〜３２℃で行うの
が望ましい。Ａ　Ｔ　ＣＣ５３３７８培ｉ菌を増殖せし
め、ヘテロ多ｔＩＭ類Ｓ−４２１を生産するための栄養
培地のｐＨは約６〜８の範囲で変化できる。

Ｓ−４２１は表面培養及び深部培養の両者で生産される
が、深部培養での発酵で行うのが望ましい。

少量の発酵は、適当な栄養培地に、培養菌を接種して培
養し、これを生産培地に移した後、約３０℃の一定温度
で数日間振とう機上で発酵する事により都合よく行う事
ができる。

発酵は、無菌フラスコ中の培地で、１回以上の種培養か
ら開始する。種培養の栄養培地は炭素及び窒素源からな
る、いずれの適当な組合せであってもよい。種培養のフ
ラスコは、約３０℃の一定温度の部屋で１〜２日、ある
いは、増殖が満足に進むまで振とうして培養し、出来た
増殖菌の一部を、第２段階の種培養又は、生産培地中に
入れる。

中間段階での種培養を行う場合、本質的に同じ方法を用
いる。すなわち、最終の種培養段階からのフラスコの内
容物の１部を生産培地に接種するのに用いる。接種した
フラスコを一定温度で数日間振とうして培養し、インキ
ュベーションの終りに、イソプロパツールの如き、適当
なアルコールを加えて沈澱させフラスコ中の内容物を回
収する。

多量の培養のためには、攪拌機及び発酵培地に通気する
装置を付けた適当なタンク中で発酵を行うのが望ましい
。本方法に従い、栄養培地をタンクの中で調製し、約１
２１℃までの温度に加熱して殺菌する。冷却後、無菌培
地に、あらかじめ種培養しておいた生産培養用様を接種
する。発酵は所定の期間、例えば２〜４日間、攪拌及び
／又は栄養培地への通気を行い、温度を約３０℃に保ち
ながら行う。Ｓ−４２１を生産せしめる本方法は特に、
多量の製造に好適である。

ヘーロ　　　Ｓ−４２１ Ａ　Ｔ　ＣＣ５３３７８が生産するヘテロ多糖類は、主
として炭水化物、約１２重量％のタンパク質、４重量％
（酢酸として計算）の主としてＯ−サクシニル基の如き
アシル基及び約４重量％のピルベート（ｐｙｒｕｖａｔ
ｅ）で構成される。Ｓ−４２１の炭水化物部分は、中性
糖グルコース（８４−９２％；平均８５％）及びガラク
トース（８−１６％；平均１５％）を、約６：１のモル
比で含有する。

２種の別個の方法で、約４％のアシル含量を決定した。

Ｓ−４２１ゴムの０．２％水溶液をアルカリ性のヒドロ
キシルアミン試薬で処理し、つづいて酸性塩化第二鉄試
薬で処理して比色分析した（ニス、ヘストリン（Ｓ、　
１ｌｅｓｔｒｉｎ）　　（１９４９）、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ、）　　１８０．２４９−２６１）。

０−アシル基は又、液体クロマトグラフィーで定量し、
０−スクシニルとして同定した。

Ｓ−４２１の中性糖は又、種々の方法で決定した。第１
の方法は、５０■のＳ−４２１をＩＭ−■１□ＳＯ４１
ｍｊ！中で１００℃、４時間加水分解するものである。

第２の方法は、試料を７２％Ｈｚｓ０４中で０℃で１時
間、消化させ、次にＩＭ−Ｈ２ＳＯ，中で１００℃で４
時間加水分解するものである。糖は、それらのアルドノ
ニトリルアセテート誘導体をガスー液体クロマトグラフ
ィーによって分離した。そして、認定された基準との比
較により、同定、定量した（ジェー、ケー。

ペイヤード（Ｊ、　Ｋ、　Ｂａ１ｒｄ　）　、エム、ジ
ェー、ホルロイド（Ｍ、　Ｊ、　Ｈｏ１ｒｏｙｄｅ）　
、及びディー、シー。

エルウッド（Ｄ、　Ｃ，Ｅｌｌｗｏｏｄ　）　　（１９
７３）　、カーボハイドレート・リサーチ（農慰庶■敗
エ　Ｒｅｓ　、　）１１．４６４−４６７）。

ピルヴエートはダックワース（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ　）
及びヤソペ（Ｙａｐｈｅ　）によるケミストリー・アン
ド・インダストリー（Ｃｈｅ＋ａ、　＆　Ｉｎｄ、）　
　（１９７０）、ｐ、７４７の方法で決定した。

タンパク質含量はローリ−（Ｌａｗｒｙ　）等の方法（
ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、（１９５１）　、１９
３、ｐ　２５６）により、基準としてウシ血清アルブミ
ンを用いて決定した。

ここに記載のへテロ多＄７！類の分析法は上述の組成を
知るのに用いた実際の方法であるが、他の分析法が、当
業者間で利用できる事は理解されよう。

他の分析法を用いるとベテロ多ｔｉ類の同じ特性を得る
事ができるが、わずかに異る定量結果が報告されるかも
しれない。

ヘテロ多糖類Ｓ−４２１は水溶液中で、顕著な性質を有
する事が判明した。特に、非常に低い濃度で非常に高い
粘性を有し、高い酸性度の水溶液中で優秀な安定性を有
する。それ故濃厚化剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤、潤
滑剤、フィルム形成剤又は結合剤として有益で種々適用
できる。

特に価値ある利用性は、油井処理液の分野に存する。ヘ
テロ多糖類Ｓ−４２１は特に酸処理液（ａｃｉｄｉｚｉ
ｎｇ　ｆｌｕｉｄ　）として用いるために調製した水溶
液中で有益である事が判明した。

「酸処理液」とは、例えば、刺激液（水圧破砕、脈石酸
処理及び酸破砕）及び他の増強させた石油回収液である
。このような液に存することのできる物質は主として、
ヘテロ多糖類、酸（非酸化性の酸が望ましい）及び水で
ある。用いられる酸は塩酸、フッ化水素酸、酢酸、ギ酸
又はそれらの混合物である。どの特殊な液の成分と濃度
は、行うべき特殊な作業に必要な量を、油井作業者が選
択するであろうが、塩酸がすぐれた酸として用いられる
事は認識されよう。酸処理液は、例えば、濃塩酸（２Ｂ
−３５％）を水で希釈し、所望な濃度にする事により調
製する。ヘテロ多糖類は希釈酸中で水和するか、又はも
っと好ましくは水中で水和した後、酸と混合する。

本発明の酸処理液には当業者間で知られた、腐食阻害剤
、脱乳化剤、金属イオン封鎖側、界面活性剤、摩擦軽減
剤等を更に加える事ができる事が認識される。必要なら
、本発明の液に、プロップ剤も加える事ができる。用い
る事のできるプロップ剤は、例えば、砂粒、焼結ボーキ
サイト、及び類偵物の如き、当業者間で知られた多くの
ものである。

ヘテロ多糖類Ｓ−４２１は、本発明の酸処理液中に、０
．０１〜２．０重量％へテロ多ＩＩＮ類の範囲で用いる
事ができる。酸は、本発明の酸処理液中、約６〜３５重
量％の範囲で用いる事ができるが、約１０〜２８重量％
が望ましい。

銖■皿里 ヘテロ多ＩＩ類Ｓ−４２１は、未１１ＬＥアグロバク孟
ユ皇人（」Ｌ匝叩肛ｉｕｍ　）種である微生物を適当な
栄養培地中培養して発酵される事により製造できる。こ
のヘテロ多Ｐｉ類を製造するのに用いられる微生物の生
物学的に純粋な培養物についてのプダペス）　（Ｂｕｄ
ａｐｅｓｔ）条約にもとずく寄託が、米国メリーランド
州ロックビルのＡＴＣＣ（＾ｓ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）により−
１９８５年１２月１９日に受託番号Ａ　Ｔ　ＣＣ５３３
７８のもとでなされた。

Ａ、コロニーンＥの 栄養寒天培地上、３０℃で、７２時間培養すると、直径
約２．０１■の半透明コロニーが発現する。

コロニーは円形で、なめらかで、凸状、光沢があり、白
色であった。

Ｂ、　　包５Ｅの 栄養寒天培地上３０℃で微生物は液胞化した。

大きさ約０．５Ｘ１０μｍの多形性、ダラム陰性杆菌で
あった。鞭毛は周毛及び掻体の混合物であった。

Ｃ・　　　　　　・　　び　　　　　、本微生物は３０
°、３７°及び４０”ｅで増殖した。４３℃では増殖せ
ず、４°〜５℃でも増殖しなかった。三糖類鉄寒天培地
で、スラントはアルカリ反応を有するが、隣接部（ｂｕ
　ｔ　ｔ）には変化がなかった。Ｈ２Ｓ又はガスは発生
しなかった。

微生物はチトクロームオキシダーゼ陽性で、０／Ｆ検定
では、酸化力がある事を示した。嫌気的には増殖せず、
本微生物により、リドマスミルクに変化がなかった。イ
ンドール、メチルレッド及びホゲスプロスカウェル反応
に陰性であった。

炭素及びエネルギーの唯一の源としてクエン酸塩または
エステルを用いる事ができた。唯一の窒素源としてアン
モニアを用いた。Ｈ２Ｓを発生し、ウレアーゼ陽性であ
った。３％ＮａＣ１中で増殖できたが、６％ＮａＣ１中
では増殖できなかった。ヱ特性と同様単離物は３−ケト
ラクトースを生成した。一部ゼラチンを加水分解したが
、デンプン、カゼイン、エスクリン又はツイーン（Ｔｗ
ｅｅｎ　）　８０（米国、プラウエア州つィルミントン
のＩＣＩ合衆国社から提供された界面活性剤）を加水分
解しなかった。

酸生成が以下の炭水化物から行われた。

アドニトール、　ラクトース、　ラフフィノースアラビ
ノース、　レブロース、　ラムノースデキストロース、
マルトース、　サリチン、ダルシトール、　マンニトー
ル、シュークロース、−ガラクトース、　マンノース、
　ソルズトール、イノシノール、　メリビオース、トレ
ハロース、キシロース イヌリンからは酸が生成しなかった。

旦−Ｕ！ 特定のアグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）は植物は感染し、感染部位で増殖分化しない樹上腫
瘤（ｃｒｏｗｎ　ｇａｌｌ　ｔｕｍｏｒ）を発生させる
。実際に、アール、イー、ブカナン（Ｒ，Ｅ、　Ｂｕｃ
ｈａｎａｎ）及びエフ。イー、ギボンス（Ｎ、Ｅ、　Ｇ
ｉｂｂｏｎｓ　）編集の限定的細菌学についてのバージ
エイのマニュアル（Ｂｅｒ　ｅ　’ｓ　ＭａｌｌｔＬＬ
ｔ　　ｏｆ　ＤｅｔｅｒＩＩＩｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏ　　）　、ウィリアムス及びウィルキンス
（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ）　、バルチ
モア（１９７４）　ｐ。

２６５において腫瘤発生活性の効力により、ヱｌしてい
る。最近、腫府誘発物は、感染植物の宿主細胞のクロモ
シーム中にいくつかのＤＮＡを４１させるプラスミド（
Ｔｉ−プラスミド）である事が発見された。Ｔｉ−プラ
スミドの無いアゲロバクチ刃ケム（しｒ可＋ａｃｅｒｉ
ｕ色）は１．樹上腫瘤を誘発せず、この腫瘤発生能力以
外には１久アバ久テ♂ノ立寿　ラジオハク−１−）Ｌｔ
（７凰匹旺ｊｌｌｆｆｌ−阻１１！坤す匹多虹）−と１
３６ジ籐３仁を辺ゴしム　ｙＪ仁ｚ１ヨ乙工」６乙（Ａ
　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　　、ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ　）の形態的、生理的又は遺伝子型における差異は
認められない。

アグロバクテリウム（韮匹勤旦肛ｎ畦の同定及び区別の
方法を創案するために、腫瘤発生株が異る種であると考
えるべきで１ｔ７Ｊ−（、むしろ異ったパソバー（ｐａ
ｔｈｏｖｔｒ）と考えるべきである事が提唱された。こ
れは部分的に、これらのＴｉ−プラスミドが微生物によ
って、天然でも、実験室でも容易に失われるためである
。ポルメス。ビー、　（ＨｏｌｓｅｓＢ、）及びロバー
ト、ピー、　　（Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ｐ、）　、によるＪ
、　Ａｐｐｌ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　５０（３）
　（１９８１）、ρｐ４４３−４６８参照。したがって
Ｓ−４２１、ＡＴＣＣ５３３７８は腫瘤発生活性につい
て検定せず、その形態的、生理的及び生化学的特性に基
ずき、また酸に安定なヘテロ多糖類Ｓ−４２１の生産に
基ゼき、未確認アゲロバクー１ウム（ｈμｓｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）として分類した。しかしながらエフ。アール
、クリーブ（Ｎ、　Ｒ，Ｋｒｉｅｇ　）　ｍ集の体系的
細菌学についてのバージエイのマニュアル（Ｂｅｒ　ｅ
　　’ｓ　　ｔｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓ　ｓｔｅｍａｔｉｃ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ　　　）、ウィリアム及びウィ
ルキンス゛（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ）
、バルチモア（１９８４）　、ｐ２４９によれば腫瘤発
生能力に基ゴいて、アゲロバター！ウム（ん「司Ｖ劇工
わ１リ−を、いぜんとして、分類している。

当業者にとって、本発明の他の具体例は本明細書の考察
から明らかであろう。したがって、本明細書及び実施例
は例示するのみであると考えるべきであって、本発明の
真の態様とその精神は、特許請求の範囲で示される。

４８時間栄養寒天培地で培養した培養物を用い、３０℃
にて、回転振とう機上、ＹＭフラスコ種培養を開始した
。約２４時間後、この種を用い、炭素源として３％加水
分解ゲンプンを用いたＥ１培地の入ったフラスコに接種
した。これを回転振とう機上、３０℃で培養した。７２
時間後、フラスコ中では粘性液の存在を認めた。これに
２容量の９９％イソプロピルアルコールを加えると、繊
維状沈澱が認められた。

Ｅ、培地は、５ｇのリン酸二カリウム、０．１ｇの硫酸
マグネシウム、０．９ｇの硝酸アンモニウム、０．５ｇ
のブロモソイ　（Ｐｒｏｍｏｓｏｙ）　　１００　（セ
ントラル・ツイヤ・ケマージー・デヴイジョンで売られ
ている大豆粉の酵素消化物）、３０ｇのデキストロース
及び１１の水道水から成る。Ｅｌ培地のｐｌ＋は約７．
６−７．８である。

他のＹＭ種スラスコを上述の方法で作り、２４時間培養
後、種々の培地を入れた５個のフラスコに接種した。こ
れらのフラスコを３０℃で、回転振とう機上、約７２時
間インキュベートした。この間、ｐＨ１粘性、ゴム収率
、生成物粘度を測定した。結果を表２に示す。

一１ Ｅ、　　　　　　　　　　３χ加水分解　　７．４　　
１０　　　０．００デンプン Ｅ＋　（−ＮＩＩＪＯａ　＋　　　　　３χ加水分解　
　？、９　　２５　　　０．６００．１９χＮａＮ０ｓ
）　　　　　　　７’　７７’　７Ｅ、　　　　　　　
　　　　３χグルコース　？、６　　２３０　　　０．
７０１ホール（ｌｌｏＬｅ）塩：以下に示す成分を含む
水溶液（培地１１あたり１　ｖａｔ＞ 匁ｌ立量にお番る゛　（ＩＩｌ） ＨＪＯｓ　　　　　　　　　０．０５　Ｂ＋３ＭｎＣｌ
　ｚ　・４１１ｚ０　　　　０．５　　Ｍｎ”Ｐｅ５Ｏ
ａ　　　　　　　　　Ｏ，５Ｆｅ″２ＣｕＣｊ！　！　
　　　　　　　　０．０１　Ｃｕ”ＺｎＣ１ｚ　　　　
　　　　　Ｏ，０２Ｚｎ＋２ＣｏＣｆ　ｚ　・６Ｌ０　
　　　０．０１　Ｃｏ”Ｎａ！Ｍｏ０４４８ｇ０　　　
　０．０１　Ｍｏ”酒石酸ナトリウム　　　１．８ 実施例１の結果に基ずき、そこで記述した方法により他
のＹＭ種培養フラスコを培養した。これを用い種々の培
地を含む５個のフラスコに接種した。たソ′シこの場合
、３％グルコースは大半のフラスコに用いた炭素源であ
った。これらのフラスコを振とう機を石い、３０℃で７
２時間インキュベートした。この間、ｐＨ、粘性、ゴム
収率、及び生成物粘度をチェックした。結果を表３に示
す。

Ｅ、　　　　　　　　　　　３χグルコース　？、４　
　２４５　　　０．７０場 この結果は、０．２％ブロモソイ及び３％グルコースを
含むＥ、が最良の増殖培地である事を示した。

Ｓ−４２１培地スクリーニング実験の結果は、マンガン
の添加により発酵が促進されるが、ホール（ｌｌｏｌｅ
）塩の添加により最良の結果が得られた事を示している
。

１．１１　　　　　７．２　８１０　０．９５　　０．
７８２、　Ｌ＋ホール　　？、２　３０００　　０．０
２　　１．４７　１５４０　５６（ｌｌｏｌｅ）塩 ３．１＋８”　　　　　　　　７．２　　　１２７０　
　　　０．４７　　　　　１．０８　　　１２２０傘　
　２６４．１＋Ｍｎ”　　　　？、２　２３００　０．
０２　　・１．２３　１３８０　５１５、１　＋　Ｆｅ
”　　　　７．４　８２０　０．４８　　０．８５６、
１　＋　Ｃｕ”　　　　７．４　８２０　　Ｇ、９２　
　０．７９７、１　＋　Ｚｎ”　　　　７．４　７８０
　０．９４　　０．８６８．１十Ｃｏ”　　　　７．４
　５３０　０．９７　　０．６７９、１　＋　Ｍｏ”　
　　　７．４　７００　０．９５　　０．７６１０．１
．÷酒石酸塩　７．４　　８６０　　０．９２　　０．
８９本非常な泡立ち 以下に示す培地で、１４１ファーメンタ−容器により２
種の実験を行った。

３％　グルコース ０．０５％　ブロモソイ１００ ０．０１％　Ｍｇ５Ｏａ・　７Ｈ，０ ０，０９％　Ｎ　Ｈ４Ｎ　Ｏｘ Ｏ，００５％　５ＡＧ５６９３　　（ユニオンカーバイ
ト製消泡剤） １　ｐｐｍ　Ｆ　ｅ　”　（ＦｅＳＯ４Ｈ７Ｈ，０とし
て加える）８　ｐｐｍ　Ｍ　ｎ　”　（ＭｎＣｌ　ｔ　
・４ＨｚＯとして加える）水道水 に、１ＩＰＯ，濃度は、第１実験では０．０５−０．５
０％、第２実験では０．２５−０．３５％の範囲で変化
させた。増殖培地中、改良を行うために、４０ｃＰ以上
の０．１％生生成物塵が必要であった。得られた結果は
、リン酸濃度が最終生成物粘度に影響し、培地中のＫ　
Ｚ　ＥＩ　Ｐ　Ｏａｔｍ度０．２５％で４０ｃＰ以上の
粘度を有する性成物が得られる事を示している。

１　　　　　０．０５　　　　１９０　　　　１．３８
　　　　３４０゜２０　　　　　２１１　　　　　１．
５１　　　　　５Ｂ０．３５　　　　　１３９　　　　
　１．５５　　　　　５３０．５０　　　　　１３９　
　　　　１．９７　　　　　３２２　　　　　０．２５
　　　　　６４　　　　１．４２　　　　４１０．３５
　　　　　１１３　　　　　１．２９　　　　　３５４
８時間培養した栄養寒天培地から、１００ｍ１のＹＭ（
ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）　）培養液の入った５００＋ｎ
ｊ！フラスコ中に、白金耳量のアグロバクテリウム（Ａ
　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　Ｓｐ、、　Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ５３３７８を接種した。振とうして、３０℃、２４時
間インキュベートした後、２００ｍ１＠量の、ホール（
Ｈｏｌｅ）塩と３％グルコースを含むＥ、培地に、ＹＭ
種を５％入れた。同様にインキュベート後、この種を２
．８１の、以下に示す培地を入れた５リットルファーメ
ンタ−に接種した。

３．０％　グルコース ０．５％　Ｋ　２　ＨＰ　Ｏａ ｏ、０５％　ブロモソイ１１００ ０．０１％　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・　７Ｈ２００，０９％
　ＮＨａ　Ｎ　Ｏｓ Ｏ，００５％　５ＡＧ５６９３　　（ユニオンカーバイ
トより発売の消泡剤） ＩＩｌ１１／ｌ　　ホール（Ｈｏｌｅ）塩１　ｐｐｍ　
Ｆ　ｅ　”　（ＦｅＳＯａ　　・７１１．０として加え
た）水道水 温度は３０℃に保ち、通気はｌＩｌ／Ｍとした。

攪拌は、４００ＰＰＭで出発し、その後、よく混合され
るように増大させた。２４時間後、最終培地容量５０１
を含む７０１ファーメンタ−に、この種培養物を接種し
た。培地の組成は以下に示すとおりである。

３．０％　グルコース ０．２５％　　Ｋ２ＨＰＯ４ ０，０５％　ブロモソイ１００ ０．０】％　Ｍｇ５Ｏｎ・　７Ｈ２０ ０，０９％　Ｎ　Ｈａ　Ｎ　Ｏ！ ｏ、　ｏ　ｏ　ｓ％　５ＡＧ５６９３　（ユニオン・カ
ーハ゛４島九製消泡剤） ＩＩＩｌｌ／１　　ホール（ｌｌｏｌｅ）塩１　ｐｐｍ
　Ｆ　ｅ　”　（ＦｅＳＯａ　　・７１１．０として加
えた）水道水 発酵中温度を３０℃に保った。１（１／Ｍの通気、３０
０ＰＰＭの攪拌で発酵を始めた。自動ｐＨ制御装置を用
い、４０％ＫＯＨを必要量加えて、ｐＨを６．８に保っ
た。攪拌は、良く混合できるように、必要だけ増加させ
た。通気は、２４時間で、２（１／Ｍに増加させ、残り
の発酵期間中、この割合を保った０発酵の結果を以下に
示す。

−０−７，３３３，０ １８−１／２　　　　６．９ ４４−１／２　　　　６．７　　　　８４０６６−１／
２　　　６．５　　　１４２０　　　１．１６７　　　
０．５４７９０　　　　　　６．４　　　１６７０　　
　１．４０　　　　０．２０発酵液を約７５℃、１５分
間加熱し、次に３０℃に冷却した。発酵液を、次に、約
２容量の９９％イソプロパツールに加え入れた。ヘテロ
多Ｐｉ類が繊維物質として沈澱し、これは濾過して容易
に回収した。！ｆｉ！ｌｉ維は、送風乾燥話中、５５℃
で約４５分間乾燥後、製粉した。合成水道水中に０．１
％濃度で溶かした場合、粘度は５２ｃＰであった（ＵＬ
アダプター、ブルックフィールドＬＶＦ粘度計、６ＰＰ
Ｍ）。

以下に示す方法で、Ｓ−４２１の初期粘度を測定した。

初めに、ハミルトン　ビーチ　ミキサー（Ｈａｍｉｌｔ
ｏｎ　Ｂｅａｃｈ　ｍ１ｘｅｒ）　　（モデル９３６）
を用い、１００％速度で３０分間、重合体を水道水中２
％濃度（３００＋ｏｆ中６ｇ）で混合して水和した。適
当なジャーの中に、０．２＋＋１１の腐食防止剤、適切
な量の重合体濃縮物、さらに水を入れ、酸破砕液中の所
望な重合体濃度を調製し、最後に濃塩酸を加えた。低速
度で、２分間、液を混合し、均一にした。−例として、
１５％ＨＣｌ及び１．２５１！ｂ重合体／バレルからな
る液を５４ｇのポリマー埠縮物、１３６ｍ１の水、１　
］　Ｏｖａｎ　（１）ｔｊｊｉ塩Ｍから製造した。ファ
ン（Ｆａｎｎ）　３５粘度計を用いて、試料粘度を３　
ｒｐｍで測定した。この結果を以下に示す。

初−１コし一度 Ｓ−４２１０，３６−０，６０１５５９０−１４６０〃
　　　　０，３６−０．６０　　　　２０　　　５５０
−１４８０〃　　　　０．４３−０．６０　　　　２２
　　　５００−１７６０〃　　　　０．４３−０．６０
　　　　２４　　　４００−１６４０＃　　　　０．４
３−０．６０　　　　２６　　　４００−１５９０〃　
　　　０．４７−０．６０　　　　２８　　　２４０−
９６０フアン（Ｆａｎｎ）　３５粘度計を用い３ＲＰＭ
にて測定した初期粘度が半減する時間としての粘度半減
期をヘテロ多Ｉｉ類Ｓ−４２１について測定した。

結果は、ヘテロ多ｔＩＩ！Ｓ−４２１で濃厚化した酸溶
液が、高温でさえも長い粘度半減期を有する事を示して
いる。長い粘度半減期は、長いＨＣ１消費度につながる
。結果を以下に示す。

ス１１丸工 酸破砕中、酸溶液が地下層に深く浸透するまで、中和過
程を後らせる事が望ま゛しい。それ故、ＣａＣＯ３大理
石片の存在下でＨＣｌの消費速度（中和速度）に関する
ヘテロ多Ｉ！類Ｓ−４２１の効果について検討した。

検定法は、（ａｌ多糖類を含まず、（ｂ）　１．２５　
ｐｐｂのへテロ多＃ｆＮ頻Ｓ−４２１を含有する１５％
ＨＣＩ溶液２０Ｏｎ＋り！に、８０ｇの大理石片を入れ
た。

酸溶液を約２４℃（７５＠Ｆ）に保ち、０．３．６．１
２．２４及び４８分の時間間晴で、試料を取りＯ，ｌＮ
−ＮａＯＨで滴定した。酸溶液を約５２℃（１２５°Ｆ
）に保つことを除いては、同じ検定をくり返した。結果
を以下に示す。

％　　ＨＣＩ ０１４，９１４，８ ３１０，１８，２ ６７，６５，Ｂ １２　　　　　　６．９　　　　　５．９２４　　　　
　　　６．３　　　　　４．４４Ｂ　　　　　　　　５
．３　　　　　３．２１ｊ」１１し ０　　　　　　１４．７　　　　　１４．８３　　　　
　　　２．８　　　　　２．９６　　　　　　　０．４
　　　　　０．３結果は、ヘテロ多１！頻５−４２１を
含む酸溶液が、重合体を含まない酸溶液に比べて、十分
に長い酸消費速度（酸中和速度が遅い）を有する事を示
している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、約６〜約３５重量％の酸及び約０．１〜約２．０重
   量％のヘテロ多糖類を含有する酸処理水性液であって、
   該ヘテロ多糖類が主として炭水化物を含み、さらに約１
   ２重量％のタンパク質、約４重量％の、主としてＯ−サ
   クシニル基としてのアシル基及び約４重量％のピルベー
   トを含み、該炭水化物部分がモル比約６：１で中性糖グ
   ルコース及びガラクトースを含むことを特徴とする酸処
   理水性液。 ２、酸が非酸化性酸である特許請求の範囲第１項に記載
   の液。 ３、酸が、塩酸、フッ化水素酸、酢酸及びギ酸から成る
   群から選択される特許請求の範囲第２項に記載の液。 ４、酸が塩酸である特許請求の範囲第３項に記載の液。 ５、約１０〜約２８重量％の塩酸を含有する特許請求の
   範囲第４項に記載の液。 ６、ヘテロ多糖類がヘテロ多糖類Ｓ−４２１である特許
   請求の範囲第１項に記載の液。 ７、同化できる炭素源の好気的発酵により、水性栄養培
   養液中で￥アグロバクテリウム￥（￥Ａｇｒｏｂａｃｔ
   ｅｒｉｕｍ）￥種ＡＴＣＣ５３３７８を増殖せしめ、ヘ
   テロ多糖類Ｓ−４２１を回収することを特徴とするヘテ
   ロ多糖類Ｓ−４２１の製造方法。 ８、同化できる炭素源が、炭水化物である特許請求の範
   囲第７項に記載の方法。 ９、炭水化物がグルコースである特許請求の範囲第８項
   に記載の方法。 １０、特許請求の範囲第７項の方法により得られた生成
   物。