DE69219264T2

DE69219264T2 - Polysaccharid, seine Verwendungen, der Fermentationsprozess und der Stamm von Pseudomonas zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE69219264T2
Application number: DE69219264T
Authority: DE
Inventors: Thierry Fontaine; Bernard Fournet; Marie-France Planard
Original assignee: Systems Bio Industries
Current assignee: Degussa Health and Nutrition Holding France SAS
Priority date: 1991-09-25
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 1997-08-07
Anticipated expiration: 2012-09-25
Also published as: FR2681601A1; ATE152131T1; EP0534855A1; EP0534855B1; DE69219264D1; CA2079018A1; JPH05227902A; US5455343A; FR2681601B1; CA2079018C; JP2856992B2; ES2101819T3

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues Polysaccharid, sein Herstellungsverfahren durch Kultivieren von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas ebenso wie diesen Mikroorganismus und die Anwendungen dieses Polysaccharids als Viskositäts-, Verdickungs-, Gelierungs- oder Stabilisierungsmittel für Suspensionen.
Verschiedene Arten von polysaccharidproduzierenden Mikroorganismen sind bekannt, deren rheologische Eigenschaften insbesondere die Verwendung als Suspensionshilfsmittel oder als Verdickungsmittel oder Gelierungsmittel in wäßrigem Milieu erlauben; beispielsweise das Xanthan in Tinten, Farben, Lebensmitteln oder Medikamenten; das Skleroglucan wird bei Ölbohrungen verwendet.
Es wurde nun ein Mikroorganismenstamm der Gattung Pseudomonas isoliert aus einer Entnahme normannischer Erde, die durch Kultivieren auf einem klassischen Nährmedium, das Kohlenstoff- und organische Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, ein neues Polysaccharid absondert, dessen rheologische Eigenschaften im wäßrigen Milieu interessanterweise vom selben Typ sind wie die des Xanthans, sich aber in einer viel geringeren Konzentration zeigen.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung den mit PS-5T1 bezeichneten bakteriellen Stamm, von dem eine Probe gemäß dem Budapester Vertrag am 24. September 1991 unter der Bezeichnung 1-1145 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes - Paris, France (CNCM) hinterlegt worden ist.
Die TS-5T1 Bakterien sind gramnegativ; sie haben die Form eines Stabs mittlerer Größe von 0,7 bis 8,0 µm auf 1,1 bis 1,45 µm.
Auf einem Nähragargel Plate Count, vertrieben von DIFCO bildet der Stamm runde, gewölbte, gelbe, deutliche Kollonien, die einen Durchmesser von 2 mm nach 48 Stunden bei 28ºC erreichen. Auf einem MY-Gel (DIFCO) ist das Aussehen der Kollonien identisch und ihr Durchmesser nimmt zu, wenn die Inkubation verlängert wird.
Die entsprechend den in Bergey's Manual, Noel R. KRIEG und al., 1974 und The Prokaryotes, Mortimer P. STARR, 1981, bestimmten physiologischen und biochemischen Eigenschaften der Bakterien PS5T&sub1; sind in der Tabelle I wiedergegeben. Tabelle I
In der Tabelle II sind die Ergebnisse klassischer Enzymtests genannt, die unter Verwendung der Gesamtheit der von der Societe API System, la Balme-les-Grottes 38390 Montalieu Vercieu (FR) vertriebenen Reagenzien. Tabelle II
Das erfindungsgemäße Polysaachand kann durch Fermentierung dieser Bakterien in einem herkömmlichen Kulturmedium, Rühren und Belüften nach klassischen Verfahren erhalten werden.
Die Bakterien PS-5T1 entwickeln sich nicht auf einem Medium, welches als einzige Stickstoffcuelle ein Ammoniumsalz enthält, jedoch kann die im Fermentat ionsmedium vorliegende Stickstoffquelle verschiedener Proteinherkunft sein, wie beispielsweise Hefeextrakte, Sojamehl, Maischewasser von Mais, Gelatine, Destillationstrester, Pepton. Diese Proteine werden eingesetzt in einem Verhältnis von 0,1 bis 1 % (G/V) des wäßrigen Mediums, was einem Gewichtsequivalent an Gesamtstickstoff von etwa 0,16 bis 1,6 g/l entspricht.
Die Bakterien können eine große Anzahl von Kohlenhydraten als Kohlenstoffquelle verwenden, beispielsweise Galactose, Glucose, Mannose, Amygdalin, Cellobiose, Maltose, Stärke, Glycogen und Lactose und das Nährmedium kann eine einzige dieser Verbindungen oder ein Gemisch dieser enthalten. Im allgemeinen setzt man 2 bis 6 % (G/V) im wäßrigen Fermentationsmedium ein.
Die Mineralsalze als Wachstumsfaktoren, die zur Kultivierung der Bakterien PS-5T1 verwendbar sind, werden ausgewählt aus Salzen, die die Ionen Na, K, NH&sub4;, Ca, Mg, PO&sub4;, SO&sub4;, Cl, CO&sub3; enthalten. Nach klassischer Verfahrensweise setzt man dem Nährmedium vorzugsweise mehrwertige Elemente, wie Cu, Mn, Fe, Zn, in einigen ppm zu.
Die Fermentierung, die die Herstellung des erfindungsgemäßen Polymeren erlaubt, kann durchgeführt werden in einem gerührten und belüfteten Medium bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 32ºC, vorzugsweise bei 28ºC; der pH-Wert des Mediums liegt zwischen 6,5 und 9,0, vorzugsweise um 7,0, und wird, sofern erforderlich, während der Fermentierung eingestellt. Die Fermentierung dauert 30 bis 80 Stunden bevor das Medium zu dick wird.
Das Polysaccharid wird am Ende der Kultivierung aus dem Fermentationsmedium isoliert, vorzugsweise durch Präzipitation; dafür setzt man dem Medium nach Sterilisation ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel zu, in welchem das Polymer unlöslich ist, beispielsweise ein Alkohol wie Ethanol, Methanol und vorzugsweise Isopropanol&sub1; oder ein Keton wie das Aceton; derart wird das rohe Polysaccharid isoliert, mit dem Zellkörper und den Salzen gemeinsam prazipitiert; das Polysaccharid ist dann in seiner nativen Form.
Es kann so wie es ist verwendet werden oder nach Reinigung, nämlich durch Dialyse zur Entfernung der Salze und durch Umfällung, ausgehend von einer wäßrigen Lösung geringer Konzentration, 1 bis 5 g/l oder vorzugsweise 2 bis 3 g/l, durch Hinzufügen eines der zuvor genannten Lösungsmittel, im allgemeinen durch Zugabe von Isopropanol.
Zur Verbesserung der Dispersionsfähigkeit im wäßrigen Medium wird man, wie im Fall anderer Polysaccharide, dem Xanthan, das erfindungsgemäße Polymer mit einem aliphatischen Dialdehyd wie dem Glutaraldehyd behandeln.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das mit 5T1 bezeichnete Polysaccharid in seinen verschiedenen Formen, die durch Kultivierung der PS-5T&sub1; Bakterien erhalten werden können und dadurch gekennzeichnet ist, daß es gebildet ist aus sich wiederholenden Saccharideinheiten&sub1; von denen jedes Skelett 2 D-Mannose-, 2 D-Glucose-, 1 D-Galactose-, 1 D-Glucuronsäure-, 1 D-Xylose-, 1 L-Lyxose- und 1 L-Fucoserest enthält und in denen einige Saccharidhyroxylgruppen gegebenenfalls verestert sind, insbesondere als Acetat.
Gemäß den Kultivierungs- und Isolierungsbedingungen kann das Polysaccharid verschiedene Formen vorweisen, d. h. mehr oder weniger Acetat- und Pyruvat-Gruppen auf dem Skelett.
Die Struktur und die Verkettung jeder Einheit des Polysaccharids wurde bestimmt mit einer merklich homogenen Massenprobe durch klassische Analysetechniken und insbesondere ist eine Form des Polysaccharids 5T&sub1; gebildet durch eine Aufeinanderfolge von sich wiederholenden Einheiten, auf deren Skelett eine Pyruvat- Gruppe aufgepfropft und wiedergegeben ist durch die folgende Formel I, in der R gegebenenfalls an der Lyxose vorliegt und eine C&sub1; bis C&sub6;-Gruppe bedeutet:
In dieser besonderen Form ist das Polysaccharid 5T&sub1; gebildet aus dem Produkt des Formel I, auf der drei Acetat-Gruppen gebunden sind.
Die rheologischen Eigenschaften dieses neuen erfindungsgemäßen Polymers sind insbesondere vorteilhaft:
- Löslichkeit bei Umgebungstemperatur, vernachlässigbar
- Verträglichkeit mit Milch,
- zeigt eine Ausströmschwelle
- in Lösung besitzt das erfindungsgemäße Polymer eine größere Viskosität als Xanthan. Die Viskosität einer 1 %igen Losung ist stabil auch in saurem Medium, wie dem bei 20 % Essigsäure oder in Gegenwart eines Salzes wie NaCl, Na&sub2;SO&sub4;, CaCl&sub2; und schwankt auch nicht bei der Erhöhung der Temperatur der Lösung von 20ºC auf 90ºC, verschwindet aber bei einem pH-Wert von > 10,
- in Gegenwart eines dreiwertigen Kations, wie Al³&spplus;, Fe³&spplus;, Cr³&spplus;, geliert das Polysaccharid 5T&sub1; in wäßrigem Milieu; auf diese Weise erhält man ein kohärentes Gel mit einer wäßrigen Lösung von 0,5 % des Polymeren, das 50 ppm Al³&spplus;, 100 ppm Fe³&spplus; oder 200 ppm Cr³&spplus; enthält.
Es kann allein oder im Gemisch mit anderen bekannten Verdickungs- und Gelierungsmitteln, wie Carraghenan, Xanthan, Guar, Carube, Alginat, Pectin oder Gelatine verwendet werden für Lebensmittelanwendungen und technische Anwendungen. Insbesondere kann man es in kosmetischen, pharmazeutischen oder phytosanitären Zusammensetzungen, in Werbemitteln zum Bedrucken von Textilien, in Drucktinten, Farben, Zementen und in Lebensmittelzubereitungen, wie Soßen, Dessertcremes, gezuckerten Früchten, insbesondere in Verbindung mit dem Pektin, oder in Milchprodukten in Verbindung mit dem Carraghenan einsetzen.
Anschließend wird ein Beispiel für die Herstellung des erfindungsgemäßen Polysaccharids, die Verfahren zur Bestimmung seiner Struktur und seine rheologischen Eigenschaften sowie Anwendungsbeispiele beschrieben.

BEISPIEL 1

Pseudomonasbakterien des Stamms I-1145 wurden auf einem gelierten MY-Medium ausgesät. Nach 48 Stunden Inkubation bei 28ºC wurde die erhaltene Kultur verwendet, um 100 ml MY-Bouillon in einem kleinen Fläschen zu beimpfen und nach 24-stündiger Inkubation bei 28ºC wurden 1000 ml desselben Bouillon beimpft; nach 12 Stunden Kultivierung wurden die schließlich erhaltenen Bakterien in 10 l eines Nährmediums gegeben, das zur Herstellung des Polysaccharids 5T&sub1; geeignet und gebildet ist aus Glucose (35 g/l), Sojamehl (5 g/l), K&sub2;HPO&sub4; (3 g/l), MgSO&sub4; (1 g/l), MnSO&sub4; (50 µg/l), FeSO&sub4; (50 mg/l), ZnSO&sub4; (50 µg/l), CuSO&sub4; (50 µg/l) und die Fermentation bei 28ºC in einem gerührten und belüfteten Medium durchgeführt, während der pH-Wert des Mediums auf 7 gehalten wurde. Nach etwa 50 Stunden wurde das Milieu 15 Minuten lang auf 80ºC für eine sogenannte Sterilisierungsbehandlung gebracht. Nach Rückkehr zur Umgebungstemperatur wurden 2,5 Volumen Isopropanol in das Medium eingebracht, um das Polysaccharid 5T&sub1; zu fällen.
Nach dem Trocknen bei 55ºC wurden 20 g des gesuchten nativen Polymers isoliert.
Dem so erhaltenen Polysaccharid kann man etwa 10 l destilliertes Wasser zusetzen und die Suspension durch eine Diatomeenerde-Schicht filtrieren; durch Zugabe von 3 bis 5 Volumen Isopropanol zum Filtrat wird das Polysaccharid in reiner Form gefällt.

Eigenschaften des Polysaccharids 5T&sub1;

Viskosimetrische Messungen bei 20ºC wurden für ein gängiges Xanthan und für das gemäß dem oben genannten Beispiel erhaltene Polysaccharid in wäßriger Lösung in Gegenwart von Kaliumchlorid (10 g/l) mit einem Rheomat LS 30 Viskosimeter durchgeführt, das von der Gesellschaft Contraves (FR) vertrieben wird, entweder bei verschiedenen Schergeschwindigkeiten mit Lösungen von 10 g/l oder mit einer Schergeschwindigkeit von 0,01 Sekunden&supmin;¹ bei den geringen Konzentrationen. Die erhaltenen Kurven sind in den Figuren 1 und 2 im Anhang wiedergegeben.
Die Ergebnisse weiterer mit einem Brookfield- Viskosimeter, Modell LVF, duchgeführten Messungen weisen den Verlauf der Abbildungen 2 oder 3 auf, und die Ergebnisse bei 30 Umdrehungen je Minute bei allen Lösungen verschiedener Konzentrationen, die gegebenenfalls 10 gil Kaliumchlorid enthalten, sind in der Tabelle III wiedergegeben: TABELLE III

Untersuchung der Struktur

Saccharidfragmente wurden entweder erhalten durch Spaltung des gegebenenfalls vorbehandelten und acetylierten Polymers mit CH&sub3;OH/HCl bei 80ºC oder nach Hydrolyse durch Trifloressigsäure bei 100ºC, gefolgt von einer Reduktion und einer anschließenden Acetylierung; sie wurden im allgemeinen mit einem Verfahren untersucht, bei dem ein gaschromatograf isches Verfahren mit einem massenspektrometrischen Verfahren gekoppelt war.
Das gereinigte Polysaccharid ST,, das unter den Bedingungen des vorherigen Beispiels erhalten wurde, wurde vorbehandelt:
- mit Lithium in Ethylendiamin, um die Uronsäuren zu zersetzen,
- mit Natriummetaperiodat vor und nach der Verseifung, wodurch nur xylose, Lyxose und Manose gespalten werden,
- durch CrO&sub3; in Essigsäure, was die peracetylierten Saccharide in anomerer und äquatorialer Konfiguration zerstört,
- durch eine starke Base in wasserfreiem Milieu (LiCH&sub3;SC in Dimethylsulfoxid), was durch β- Eliminierung die Uronsäuren der permethylierten Polysaccharide zersetzt.
Die Gegenwart von Acetylsubstituenten wird durch eine Flüssigkeit schromatograf ie über eine Ionenausschlußsäule nach der Hydrolyse des Polysaccharids 5T, nachgewiesen. Die Pyruvat-Gruppe, wahrscheinlich an die Galaktose über eine Acetalbindung an den Hydroxy-Gruppen 4 und 6 gebunden, wird nach Methanolyse des Polysaccharids und seinem permethylierten Derivat nachgewiesen. Die Gruppe R an der Lyxose wurde nicht charakterisiert.

BEISPIEL 2

Stabilisierung künstlicher Zemente:
Nach achttägiger Konservierung bei Umgebungstemperatur oder 4 Tagen bei 50ºC blieb eine wäßrige Zusammensetzung, die 50 Gew. % Portlandzement und 1 % des Polysaccharids PS-5T&sub1;, homogen, nachgiebig, und zeigte nur an der Oberfläche eine leichte Verhärtung.

BEISPIEL 3

Dessertcreme:
Cremes wurden hergestellt, die die folgende Zusammensetzung enthielten:
* zusammengesetzt aus 65 % (G/G) Carraghenan und 35 % PS-5T1.
Die im Trockenen vorgemischten Bestandteile werden in kalter Milch dispergiert. Nach 15 minütiger Hydratisierung wird das Gemisch über einen Plattentauscher gegeben und der folgenden Behandlung unterzogen:
- Pasteurisation bei 90ºC
- Homogenisation bei 50 kg/cm²
- Sterilisation bei 130ºC
- Abkühlung auf 65ºC.
Anschließend wird konditioniert.
In beiden Fällen ist die endgültige Textur der Cremes dickflüssig, glatt, glänzend und ohne Luftblasen.
Die als Stabilisator einzig Carraghenan oder Xanthan enthaltenden Vergleichcremes zeigten eine unter einem Aspekt weniger homogene Textur auf und besaßen Bläschen; darüber hinaus strömten die erfindungsgemäßen Cremes besser in den Apparaten.

BEISPIEL 4

Salatsoßen:
Es werden Salatsoßen mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
- Stadtwasser 25,05 Gew. %
- weißer Essig 8º 15,90 Gew. %
- Tomatenkonzentrat (28%) 3,60 Gew. %
- Salz 4,20 Gew. %
- Pfeffer 0,60 Gew. %
- Zucker 10,40 Gew. %
- Sojaöl 40,00 Gew. %
-. Stabilisator * 0,25 Gew. %
* Stabilisator : Xanthan oder Polysaccharid PS-5T1.
Unter Rühren wird der Stabilisator im Öl dispergiert (Mischung 1). Unter Rühren werden im Wasser die anderen trockenen Bestandteile dispergiert (Mischung 2). Der Essig wird mit dem Tomatenkonzentrat vermischt (Mischung 3).
Nacheinander werden die Mischungen 1, 2, dann 3 in einen Herbort-Homogenisator gegeben, dann wird 3 Minuten lang im Vakuum emulgiert, bevor konditioniert und bei Umgebungs temperatur gelagert wird.
Die Viskositäten der Soßen sind vor der Konditionierung gemessen worden:
Man stellt fest, daß die erfindungsgemäß Soße während der Konservierung stabiler ist.

BEISPIEL 5

Zahnpasten :

Es werden Zahnpasten der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
- Natriumsaccharinat 0,2 Gew. %
- Natriumbenzoat 0,5 Gew. %
- Stabilisator * 1 Gew. %
- Natriumpyrophosphat 0,25 Gew. %
- Glycerin 22 Gew. %
- Calciumphosphat 53 Gew. %
- Natriumlaurylsulfat 1,5 Gew. %
- Aroma q.s.
- Wasser g.s. 100
* Stabilisator : Polysaccharid PS-5T1 oder Xanthan.
Es werden zuerst das Saccharinat, das Benzoat, das PS-5T1 und das Pyrophosphat in Glycerin dispergiert; Wasser wird nach 5 minütigem Rühren hinzugefügt, dann die Lösung im Wassserbad auf 75ºC während 15 Minuten gebracht. Sie wird dann über das Calciumphosphat unter Rühren gegossen; nach 10 Minuten wird das Laurylsulfat und das Aroma hinzugegeben.
Die erfindungsgemäßen Zahnpasten hatten eine schöne Textur mit einer gewissen Glätte und sie besitzen eine stabile Viskosität, die um etwa 30 % größer als diejenige ist, welche die Vergleichszubereitung aufwies, die mit Xanthan stabilisiert war.

Claims

1. Polysaccharid, dadurch gekennzeichnet, daß es gebildet ist aus sich wiederholenden Saccharideinheiten, welche ein Skelett aufweisen, das 2 D-Manose-, 2 D-Glucose-, 1 D-Galactose-, 1 D-Glucuronsäure-, 1 D-xylose-, 1 L-Lyxose- und 1 L-Fucosereste enthält.

2. Polysaccharid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid wenigstens einen über eine Nonasaccharideinheit aufgepfropften Brenztraubensäurerest enthält.

3. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Saccharidhydroxylgruppen als Acetat verestert sind.

4. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid gebildet ist durch eine Aufeinanderfolge von sich wiederholenden Einheiten, auf deren Skelett eine Pyruvatgruppe der Formel I

aufgepropft ist, in der das gegebenenfalls vorkommende R eine C&sub1; bis C&sub6;-Gruppe ist.

5. Polysaccharid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß drei der Saccharidhydroxylgruppen je Einheit als Acetat vorliegen.

6. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren aus dem Kultivieren von Bakterien des Stamms CNCM Nr. I-1145 in einem Nährmedium und aus dem Isolieren des während der Fermentierung erzeugten Polysaccharids besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das belüftete Fermentationsmilieu eine Temperatur zwischen 20ºC und 32ºC, einen pH-Wert zwischen 6,5 und 9 aufweist und daß es eine Kohlenstoffquelle, eine organische Stickstoffquelle und Wachstumfaktoren enthält.

8. Polysaccharid, erhalten nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 und 7 im nativen Zustand.

9. Bakterienstamm Pseudomonas, hinterlegt als CNCM unter Nr. I-1145.

10. Verwendung eines Polysaccharids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 8 zur Herstellung eines wäßrigen Gels in Gegenwart von dreiwertigen Kationen.

11. Verwendung eines Polysaccharids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 8 als Viskositäts-, Verdickungsoder Stabilisierungsmittel für Suspensionen.