DE69333221T2

DE69333221T2 - Verfahren für den Abbau von Polysacchariden und Abbauprodukten

Info

Publication number: DE69333221T2
Application number: DE69333221T
Authority: DE
Inventors: Linda P. Thorne; Richard W. Armentrout; Thomas J. Pollock; Marcia J. Mikolajczak
Original assignee: Shin Etsu Chemical Co Ltd; Shin Etsu Bio Inc
Current assignee: Shin Etsu Chemical Co Ltd; Shin Etsu Bio Inc
Priority date: 1992-02-18
Filing date: 1993-02-18
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2013-02-19
Also published as: EP0561504A3; AU674662B2; US5401659A; EP0561504A2; DE69333221D1; JPH0686671A; AU3311193A; JP3390480B2; EP0561504B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Welan oder S-130 ist ein Kohlenhydratpolymer, das von einer Spezies gram-negativer Bakterien mit Namen Alcaligenes (siehe U.S. Patent 4,342,866) in das Nährmedium abgesondert wird. Es ist ein Mitglied einer Polysaccharidfamilie mit der Untereinheitsgerüststruktur gemäß der allgemeinen Struktur I:
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X hin liegt. Diese Struktur (I) wird hier manchmal als das „Rückgrat" bezeichnet. Verschiedene Seitenketten können mit dem Rückgrat verknüpft sein.
Typische Mitglieder dieser Polysaccharidfamilie weisen die allgemeine Wiederholungsstruktur II auf:
worin Glc Glucose ist; GlcA Glucuronsäure ist; Rha Rhamnose ist; Man Mannose ist; X Rha oder Man sein kann; Z α-L-Rha-(1→6)-α-L-Rha, α-L-Man, α-L-Rha oder Glc sein kann; W β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc oder α-L-Rha sein kann, die Indizes v und y entweder 0, 0,5 oder 1 sein können, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Rückgrat" auf denjenigen Teil der Struktur I, welcher die Ketten W und Z ausschließt, d. h., wenn v und y gleich 0 sind.
Einige Mitglieder dieser Familie von Polysacchariden sind an verschiedenen Stellen acetyliert. Die Polysaccharide können jedoch einer chemischen Deacylierung in einer üblichen Weise unterworfen werden, um die Acylgruppen zu entfernen. Beispielsweise ist Gellan ein Kohlenhydratpolymer, das von Pseudomonas elodea (ATCC 31461) in das Nährmedium abgesondert wird. Gellan hat dasselbe Kohlenhydratrückgrat wie Welan (d. h. X = Rha), aber es fehlt die Zuckerseitenkette (d. h. v = 0 und y = 0) und der Glucoserest 1 ist vollständig mit Glycerat substituiert. Die Gellan-Untereinheitsstruktur ist auch an unbekannten Positionen acyliert. Chemische Deacylierung von Gellan ergibt ein Polymer, welches in der Gegenwart von Kationen ein klares Gel bildet. In dieser verarbeiteten Form ist Gellan unter dem Namen Gelrite^TM kommerziell erhältlich und wird als ein Agarersatz für die Züchtung von Mikroorganismen und Pflanzen verwendet. Ein Mikroorganismus, der in der Lage war, auf deacetyliertem Gellan zu wachsen, ist in Proc. 4^m European Biotechnology (1987)2: 176 erwähnt.
Die Gellan-Familie der mikrobiellen Polysaccharide beinhaltet mindestens sieben verschiedene Polymere, die sehr ähnliche oder identische Rückgratstrukturen aufweisen (in Tabelle 5 in abgekürzter Form gezeigt). Die bekannten Mitglieder dieser Familie beinhalten: Gellan (ebenso Polysaccharid S-60 genannt), Welan (S-130), S-88, Rhamsan (S-194), S-657, S-198, und NW11. Alle haben entweder gelbildende Eigenschaften oder bilden hochviskose wässrige Lösungen, die sie zu Kandidaten für kommerzielle Anwendungen machen. Es ist jedoch schwierig und zeitraubend, neu isolierte Polysaccharide zu bewerten und zu bestimmen, ob das neue Polymer ein Mitglied der Gellan-Familie der Polysaccharide ist oder nicht.
Welan hat die folgende Wiederholungsstruktur III(Jansen, P.-E., Lindberg, B., Widmalm, G. und Sandford, P. A., 1985; Carbohydrate Research 139: 217–223):
worin Glc Glucose ist; GlcA Glucuronsäure ist; Rha Rhamnose ist und Man Mannose ist.
Wie oben gezeigt, ist eine Seitenkette, die entweder aus einem einzigen Mannose- oder Rhamnosezucker besteht, mit der Rückgratuntereinheit des Tetra-Saccharids über den Glucoserest "2" verknüpft. Obwohl dieses Polymer aufgrund der Glucuronsäurereste im Polymerrückgrat negativ geladen ist, ist das Polymer mit Portland Zement kompatibel. Welan wurde wegen seiner stark suspendierenden Eigenschaften als Zementzusatzstoff vorgeschlagen, sowie wegen seiner Fähigkeit, die mitgerissene Luft im Zement zu verringern und den Wasserverlust zu kontrollieren. Siehe U.S. Patente 4,963,668 und 5,004,506. Für einige Anwendung trägt das native Polymer jedoch eine ungewünscht hohe Viskosität in den Zement ein.
Verfahren für die chemische Spaltung von Welan, um seine Viskosität zu verringern, sind in den U.S. Patenten 4,963,668 und 5,004,506 offenbart. Die durch dieses Verfahren bewirkte Spaltung führt jedoch zu einem zufälligen Abbau der Polymerkette und ihrer Zuckerbausteine, welches in einer uneinheitlichen chemischen Zusammensetzung resultiert. Dieses Verfahren verwendet eine unspezifische Oxidationsreaktion unter Benutzung von Fentons Reagenz. Um die Menge an notwendigen Chemikalien zu verringern (insbesondere Wasserstoffperoxid), wird im Patent vorgeschlagen, dass die Brühe zuerst mit Protease behandelt wird. Zusätzlich muss die Fermentationsbrühe auf ungefähr 60°C erhitzt werden (ausgehend von der Fermentationstemperatur von ungefähr 30°C). Eisensulfat (0,05%) und EDTA (ein chelatbildendes Mittel, 0,1%) werden zuerst als essentielle Katalysatoren zugefügt. Dann wird Wasserstoffperoxid über einen Zeitraum von 1 bis 3 Stunden bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,15 bis 0,25% zugegeben. Wenn sich die Viskosität der Brühe auf ungefähr 80 bis 100 cp verringert hat, wird die Brühe auf ungefähr 27°C abgekühlt und mit KOH neutralisiert. Welan wird durch Ausfällen mit Isopropylalkohol gewonnen.
Viskose Lösungen von Welan sind in hohen Salzkonzentrationen und bei hohen Temperaturen stabil. Aufgrund dieser Stabilität könnte Welan ein Kandidat für Ölfeldanwendungen sein, da Fluide mit hoher Viskosität als suspendierende Mittel für das hydraulische Brechen in der Bohrlochvorbereitung verwendet werden. Siehe Baird, J. K., P. A. Sandford und I. W. Cotrell, 1983, Bio/technolopy: 778–783. Nach der Bohrlochvorbereitung ist es jedoch notwendig, die Viskosität der Fluide zu verringern, um den stimulierten Fluss von Öl oder Gas zu erlauben. Die oben beschriebenen Verfahren des Standes der Technik machen es schwierig und/oder teuer, dies mit Welan zu erreichen.
Hashimoto et al. (1996) Applied and Environmental Microbiology, 62(4); 1475–7 berichtet, dass Gellan-Lyase aus dem Kulturfluid von Bodenproben aufgereinigt wurde, welche in einem Medium, das Gellan als einzige Kohlenstoftquelle enthielt, inkubiert worden waren. Das Enzym war ein Monomer mit einer molekularen Masse von 140 kDa und war bei pH 7,5 und 45°C am stärksten aktiv. Das Enzym war hochspezifisch bezüglich Gellan und minderte die Viskosität des Polymers.
Kennedy und Sutherland (1994) Microbiology, 140: 3007–13 berichten, dass eine Anzahl von Bakterienstämmen, die in der Lage sind, das bakterielle Exopolysaccharid Gellan abzubauen, mittels Standardvertahren zur Anreicherung isoliert wurden. Die Enzyme sind hochspezifisch und lösen keinen signifikanten Abbau von den meisten der anderen bakteriellen Exopolysaccharide aus, von denen gezeigt wurde, dass sie strukturell mit Gellan verwandt sind.
Die Verwendung von Xanthangummi in Fluiden zum hydraulischen Brechen ist bekannt. Spezifische Enzyme zur Reduzierung der Viskosität von Xanthangummi sind erhältlich, und es wurde vorgeschlagen, diese Enzyme zu verwenden, um die Viskosität von Xanthangummi-enthaltenden Fluiden zur Brechung zu reduzieren (Cadmus, M. C. und M. E. Slodki, 1985; Developments in Industrial Microbiology 26: 281–289).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben eine neue Verbindung entdeckt, die Enzymaktivität aufweist und die spezifisch die Rückgratstruktur von Mitgliedern der Gellan-Familie der Polysaccharide gemäß Struktur 1 schneidet sowie ein Verfahren zur Herstellung und Konzentrierung der Verbindung in eine brauchbare Form. Wir haben weiterhin ein Verfahren zur Verringerung der Viskosität von Lösungen dieser Polysaccharide gefunden, das die Verbindung sowie die dabei entstehenden Abbauprodukte mit verringerter Viskosität verwendet. Diese niedrigmolekularen Zusammensetzungen sind beispielsweise in Ölfeldanwendungen, als Zementzusatzstoffe und ähnliches nützlich. Die Art ihrer Verwendung ist dieselbe wie für die oben beschriebenen Polysaccharide, z. B. Xanthan.
Die Verbindung wird unter Verwendung einer Auswahlmethode hergestellt, um einen biologisch reinen Stamm der Bacillus-Spezies zu erhalten, bei welcher die Verbindung unter Submerskulturbedingungen und in der Gegenwart von Polysacchariden gemäß Struktur I hergestellt und dann das Produkt aus der Fermentationsbrühe entfernt wird.
Zusätzlich haben wir ein Verfahren für den schnellen und spezifischen Nachweis von Polysacchariden der Struktur I unter Verwendung der Verbindung gefunden. Die enzymatische Spaltung, die durch diese Verbindung hervorgerufen wird, ist für bestimmte Kohlenhydratbindungen höchst selektiv. Der Spaltprozess vermeidet die Komplexität und die Notwendigkeit, umweltschädigende und/oder schwierig zu handhabende oder gefährliche Chemikalien einzusetzen, wie sie in den chemischen Behandlungen des Standes der Technik erforderlich sind. Zusätzlich können Rückstände dieser Chemikalien im Produkt vermieden werden und das Verfahren kann bei relativ niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, z. B. bei Temperaturen ungefähr im Bereich der Fermentation. Auch kann die Polymergröße leicht kontrolliert werden, indem das Ausmaß der Verdauung eingeschränkt wird.
Demnach stellt ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Verbindung zur Verfügung, die eine endolytische enzymatische Aktivität gegen Polysaccharide mit der Untereinheitsrückgratstruktur aufweist:
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt, worin die Verbindung aus dem Bazillus-Stamm B29, Hinterlegungsnummer ATCC 55294, erhältlich ist und worin die Verbindung ein Molekulargewicht von 110000 ± 10000 Dalton aufweist.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Verbindung mit einer endolytischen Aktivität gegenüber einem Polysaccharid mit der Wiederholungsuntereinheitsstruktur II zur Verfügung:
worin Glc Glucose ist; GlcA Glucuronsäure ist; Rha Rhamnose ist; Man Mannose ist; X Rha oder Man sein kann; Z α-L-Rha-(1→6)-α-L-Rha, α-L-Man, α-L-Rha oder Glc sein kann; W β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc oder α-L-Rha sein kann, die Indizes v und y entweder 0, 0,5 oder 1 sein können, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt, und worin die Verbindung aus dem Bazillus-Stamm B29, Hinterlegungsnummer ATCC 55294, erhältlich ist und worin die Verbindung ein Molekulargewicht von 110000 ± 10000 Dalton aufweist.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Verfügung, oder ein Verfahren zur Herstellung eines Stammes, der eine Verbindung gemäß des ersten oder zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung produziert, worin das Verfahren umfasst:

a) Unterwerfen einer natürlich vorkommenden Kollektion von Bakterienstämmen unter Wachstumsbedingungen in einem Medium, worin die vorherrschende oder einzige Kohlenstoffquelle ein Polysaccharid ist, das die folgende Untereinheitsrückgratstruktur aufweist:
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt, so dass das Vorhandensein von Bakterien, die ein Polysaccharid der obigen Struktur nutzen können, verstärkt wird;
b) Kultivieren der angereicherten Bakterien in einem Gelmedium, das als vofierrschende Kohlenstoffquelle im wesentlichen nicht-kontaminiertes Polysaccharid der obigen Untereinheitstruktur enthält; und
c) Selektieren einer Kolonie aus Stufe b), die eine sichtbare nachweisbare Senke oder Vertiefung im Gel erzeugt.

Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß des ersten oder zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung zur Verfügung, oder ein Verfahren zur Herstellung eines Stammes, der eine Verbindung gemäß des ersten oder zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung produziert, worin das Verfahren umfasst:

i) Unterwerfen von Bakterien unter Wachstumsbedingungen auf Medien, die ein Polysaccharid enthalten, das die Untereinheitrückgratstruktur I aufweist:
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt und worin das Polymer keine Seitenketten aufweist; und
ii) Unterwerfen von Bakterien einem Wachstum auf Medien, die ein Polysaccharid enthalten, das die Sruktur I, worin Seitenketten vorhanden sind, aufweist.

Ein fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine biologisch reine Kultur eines Stammes zur Verfügung, der ein Enzym dazu befähigt, ein Polysaccharid mit der Untereinheitrückgratstruktur
zu verdauen;
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt und worin das Enzym aus dem Bazillenstamm B29, Hinterlegungsnummer ATCC 55294, erhältlich ist, und worin die Verbindung ein Molekulargewicht von 110000 ± 10000 Dalton aufweist.
Ein sechster Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt den Stamm ATCC 55294 zur Verfügung.
Ein siebter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung eines Polysaccharids mit der Untereinheitrückgratstruktur
zur Verfügung,
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt, um die Viskosität einer wässrigen Lösung daraus zu verringern, umfassend das Unterwerfen des Polysaccharids unter Verdauungsbedingungen in der Gegenwart einer enzymatisch wirksamen Menge der Verbindung gemäß des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung.
Ein achter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Polysaccharid die Untereinheitsstruktur
aufweist, zur Verfügung,
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und worin das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt, umfassend die Schritte:

a) Unterwerfen des Polysaccharids unter Verdauungsbedinungen in Gegenwart einer enzymatsch wirksamen Menge der Verbindung aus dem ersten Aspekt der volriegenden Erfindung; und
b) Überwachen der Verdauung, um eine Abnahme in der Viskosität zu erfassen.

DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der erfinderischen Auswahlmethode wird eine natürlich vorkommende Quelle einer Kollektion von Bakterien, z. B. Erde, Blätter, Rinde, Pflanzenleben usw. behandelt, um das Vorhandensein von Bakterien, die fähig sind, Polysaccharide der Struktur I zu nutzen, anzureichern. Dies wird durch Kultivieren einer solchen Kollektion, z. B. in einer Bodenprobe, in einem Medium erreicht, worin das Polysaccharid der Struktur I die vorherrschende oder einzige Kohlenstoffquelle ist. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „vorherrschende Kohlenstoffquelle", dass das betreffende Polysaccharid vorliegt mit im Wesentlichen Ausschluss von anderen Kohlenstoffquellen, welche die Bakterien unfähig machen könnten, die Polysaccharide mit dem Rückgrat der Struktur I zu verwenden.
In der Praxis sind kommerziell erhältliche Polysaccharidquellen oft dahingehend nicht rein, dass sie Kontaminanten, z. B. Bakterienabfall, enthalten, welche ebenfalls als Kohlenstoffquelle genutzt werden können. Als Ergebnis wird nach dem Anreicherungsschritt die Kollektion der angreicherten Bakterien weiter aufgereinigt, indem sie in einem Medium (Gel), das als vorherrschende Kohlenstoffquelle im Wesentlichen nichtkontaminiertes Polysaccharid der Struktur I enhält, kultiviert werden. Es ist bevorzugt, dass die Kohlenstoftquelle nicht nur frei von zellulärem Abfall ist, sondern auch von Seitenketten, d. h. Kohlenhydratketten, die an das Rückgrat gebunden sind. Da es gewünscht ist, das Wachstum von Bakterien, die endolytisch wirken, d. h. das Rückgrat des Polymers angreifen, zu kultvieren, ist es am besten, Seitengruppen, die nichtendolytische Bakterien unterstützen können, zu vermeiden. Typisch für solche Materialien ist Gelrite^TM, das keine Seitenketten aufweist, aber das Rückgrat gemäß Struktur I besitzt.
Typischerweise wird die angereicherte Bakterienkollektion auf einem Gelmedium kultiviert, das ein Polysaccharid mit der Struktur I enthält, bevorzugt ohne die Seitenkette, d. h. worin y = 0 und v = 0. Kolonien, die unter diesen Bedingungen wachsen und die eine sichtbare, nachweisbare Senke oder Vertiefung im Gel erzeugen, werden für die weitere Aufreinigung ausgewählt, d. h. zur wiederholten Kultivierung, oder sie werden so verwendet, wie sie sind. Es ist wichtig, dass die Vertiefungen beobachtet werden, da dies ein Hinweis darauf ist, dass die Bakterien das Gel auflösen oder in Fragmente schneiden, welches ein Zeichen von endolytischer Verdauung ist.
Ist es gewünscht, dass eine Verbindung mit der Struktur I, worin Seitenketten vorhanden sind, zu verdauen, dann wird ein zusätzlicher Screeningschritt angewandt. In diesem Schritt wird der ausgewählte Bakterienstamm einer flüssigen Submerskultur in Gegenwart des bestimmten Polysaccharids unterworfen, welches die vorherrschende Kohlenstoffquelle im Medium repräsentieren soll. Mittels Überwachung der Viskosität des Produkts kann bestimmt werden, dass der Organismus ein Produkt mit den gewünschten endolytischen Eigenschaften herstellt. Wenn daher eine relativ grosse und schnelle Abnahme in der Viskosität beobachtet wird, ist es sinnvoll, daraus zu folgern, dass eine endolytische Spaltung stattfindet. Auf der anderen Seite weist eine relativ stufenlose Abnahme der Viskosität über einen längeren Zeitraum darauf hin, dass eine exolytische Spaltung an den Enden des Rückgrats auftritt.
Folglich stellt die erfindungsgemäße Verbindung ein einfaches Mittel für das Screening von Polysacchariden dar, um festzustellen, ob diese strukturellen Bestimmungsgrößen vorhanden sind. Dies wird einfach dadurch erreicht, dass die Polysaccharide zusammen mit der erfindungsgemäßen Verbindung Verdauungsbedingungen unterworfen werden und die Produktmischung auf eine Abnahme der Viskosität geprüft wird.
Genauer gesagt wird eine viskose, wässrige Lösung des zu untersuchenden Polymers hergestellt. Die Konzentration des Polymers wird eingestellt, um eine Viskosität zu ergeben, die hoch im Vergleich zu Wasser ist, aber die bequemerweise in einem Viskosimeter gemessen werden kann, z. B. ungefähr 100 cp unter Verwendung des Nr. 18 Spindelaufsatzes in einem LVTDV-II Brookfield Viskosimeter. Die wässrige Lösung kann mit einem geeigneten Puffer (beispielsweise 0,01 bis 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH ungefähr 7) gepuffert werden. Die Polymerlösung muss nicht rein sein, d. h. sie kann bakteriellen Abfall und sogar andere, kleinere Polymerstrukturen zusätzlich zu dem zu analysierenden Polymer enthalten, was nicht viel zur Viskosität beitragen sollte. Die Lösung kann auch Chemikalien enthalten, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern, d. h. 0,01% Natriumazid.
Eine Lösung der erfindungsgemäßen Verbindung in Wasser wird zugefügt und mit der Polymerlösung gemischt, wobei ein Volumen der Lösung der Verbindung verwendet wird, das die Viskosität der Lösung nicht wesentlich reduziert (zum Beispiel ein Zehntel Volumen). Üblicherweise kann die Verdauung bei 20°C bis 30°C durchgeführt werden. Welanlösungen dienen als geeignete Positivkontrolle und Xanthanlösungen als Negativkontrolle. Die Verdauung des unbekannten Polymers durch die erfindungsgemäße Verbindung deutet darauf hin, dass das Polymer eine Rückgratstruktur aufweist, die ähnlich der von Gellan ist. Natürlich kann das unbekannte Polymer eine Seitenkettensubstitution an dem Glucose-2-Rest des Rückgrats haben oder auch nicht und kann entweder Rhamnose oder Mannose an der vierten Position der Rückgratuntereinheitstruktur aufweisen (Rest X in Struktur I). Das Verfahren stellt ein schnelles, einfaches und kostengünstiges Screening mit einer kleinen Menge (weniger als ein Gramm) des unreinen Probenmaterials zur Verfügung.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
BEISPIEL 1: Verfahren zur Auswahl des reinen Stammes B29
EXPERIMENT 1A: Anreicherung
Feuchte Erde wurde vom Palomargebirge, San Diego County, CA an einer Stelle innerhalb von einem Yard von dem Ausfluß von Wäscheabwasser aus Haushalten gesammelt. Ein Volumen einer Welanlösung (0,2% w/v) wurde zu ungefähr zehn Volumenanteilen der angefeuchteten Erde zugefügt. Nach 4 Tagen bei 20–24°C wurden ungefähr 5 g der Erde in 25 ml deionisiertem Wasser (DI) resuspendiert und die Feststoffe mittels Zentrifugation bei 1000 × G für 3 Minuten entfernt. Der Überstand wurde dann bei 7000 × G für 8 Minuten zentrifugiert, um die Mikroorganismen in einem Pellet zu konzentrieren, und das Pellet wurde in 1 ml DI resuspendiert. Proben von 0,01 ml dieser Mikrobenlösung wurden auf Agarplatten, die Welan als Hauptkohlenstoffquelle und P2-Salze(NH4)₂SO₄ und plus 1000x Spurenmineralien (unten beschrieben) enthielten, ausplattiert. Zusätzlich wurden ungefähr 20 ml eines welanhaltigen P2-Salzmediums in die Bakteriensuspension geimpft und in einen 125 ml Schüttelkolben gegeben.
Kommerzielles Welan enthält einigen Abfall aus den produzierenden Bakterien, welcher ebenso als Nährstoffquelle dienen kann, und der Agar ist eine zusätzliche Kohlenstoftquelle in den Platten.
ZUSAMMENSETZUNG DER P2-SALZE

1 g (NH₄)₂HPO₄
2 g K₂HPO₄
0,5 g NaCl
0,05 g MgSO₄-7H₂O
DI auf 1 Liter
pH wurde auf 7,6 eingestellt

1000x Spurenmineralien:

0,5 g ZnSO₄-7H₂O
0,5 g FeSO₄-7H₂O
0,02 g CuSO₄-5H₂O
0,02 g NaMoO₄-2H₂O
DI auf 100 ml

Welan/P2-Medium:

2,5 g Welan
1,0 g (NH₄)₂SO₄
1 ml 1000x Spurenmineralien
P2-Salze auf 1 Liter
(Füge 15 g Agar für Platten zu)

Nach 3 Tagen Inkubation bei 28°C wurden mehrere Typen von Kolonien auf den Welan/P2-Platten beobachtet, was darauf hinweist, dass einige Bakterien Welan als Kohlenstoftquelle nutzen könnten. Repräsentative Kolonien wurden auf frischen Welanplatten gesammelt und sie wuchsen wieder.
Nach 6 Tagen Schütteln bei 28°C in einem Welan/P2-Medium ohne Agar wurden die Viskositäten der erneut gewachsenen Welan/P2-Flüssigkulturen bei ungefähr 25°C mit 6 Upm mit einem Brookfield LVTDV-11 Viskosimeter und einer Spindel Nr. 18 gemessen, und die Ergebnisse waren wie folgt:
Diese Ergebnisse zeigen, dass in der Bodenprobe Mikroorganismen vorhanden waren, die in der Lage sind, Welan abzubauen.
EXPERIMENT 1B: Gelrite^TM Screening
Um Mikroorganismen zu überprüfen, die in der Lage sind, Welan endolytisch zu verdauen, wurden individuelle Kolonien von Welan/P2-Platten und Proben aus Welan/P2-Flüssigkulturen auf Platten ausplattiert, die eine chemisch verarbeitete Form von Gellan enthielten. Diesem verarbeiteten Gellan, in der Form des kommerziellen „Gelrite^TM" (von Schweizerhall, Inc., 3001 Hadley Rd., South Plainfield, NJ), fehlen die Glycerat- und Acetylsubstituenten, es bildet in der Gegenwart von Kationen Gele und es ist in festen mikrobiologischen Medien ein Ersatz für Agar. Gelrite^TM bildet ein transparentes Gel und enthält im Vergleich zu Welan wenige kontaminierende Kohlenstoff- und Stickstoffmaterialen. Daher kann Gelrite^TM nicht nur als einzige Kohlenstoffquelle genutzt werden, sondern auch als vertestigendes Mittel für das Plattierungsmedium in Abwesenheit von Agar oder kontaminierenden Kohlenstoffquellen, die in kommerziellen Welan vorhanden sind. Gelrite^TM und Gelrite^TM/Welan als feste Medien werden unten beschrieben.
Die Mikroorganismen wurden bezüglich ihrer Fähigkeit zum Wachstum in Lösung mit Welan als die Hauptkohlenstoffquelle ausgesucht sowie bezüglich ihrer Fähigkeit, sichtbare Vertiefungen auf Gelrite^TM-Platten zu schaffen. Ein mikrobisches Isolat, das auf welanenthaltenden Platten gewachsen war, wurde auf Gelrite^TM- und auf Gelrite^TM/Welan-Platten aufgereinigt. Dieses Isolat war fähig, die Oberfläche von sowohl Gelrite^TM- als auch von Gelrite^TM/Welan-Platten einzudrücken.
Dieses mikrobische Isolat verringerte die Viskosität von Welan in Lösung als eine Reinkultur, wie durch das folgende Verfahren demonstriert wird:

In diesem Experiment wurden 20 ml eines Welanmediums mit einer einzigen Mikrobenkolonie, die auf einer Gelrite^TM-Platte gewachsen war, beimpft. Nach 6 Tagen Inkubation bei 28°C in Welan/P2-Medium ohne Agar und mit Schütteln (250 Upm) nahm die Viskosität der Lösung um ungefähr 80% ab und die Masse des Welans, das sich mit Alkohol ausfällen ließ, nahm um 80% ab. Aufgrund dieses Resultats wurde dieser reine Mikrobenstamm für die weitere Charakterisierung ausgewählt und als Bakterienstamm B29 bezeichnet. Dieser Stamm wurde im Namen von Shin-Etsu Bio, Inc. am 4. Februar 1992 bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, hinterlegt und die Hinterlegungsnummer ATCC 55294 zugeordnet. Diese Hinterlegung wurde in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren gemacht und alle Einschränkungen bezüglich der Zugänglichkeit der Öffentlichkeit an das so hinterlegte Material werden unwiderruflich zum Zeitpunkt der Patenterteilung beseitigt.

Gelrite^TM-Platten:	10 g Gelrite^TM 1 g MgSO₄-7H₂O 2 g(NH₄)₂SO₄ 1 g NaCl 0,02 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 1 ml 1000x Spurenmineralien DI auf 1 Liter
Gelrite^TM/Welan-Platten:	1 l Gelrite^TM-Platten plus 1 g Welan

BEISPIEL 2: Identifizierung der mikrobisch reinen Stammkultur B29

Die Standardtests für die Identifikation und die erhaltenen Resultate sind unten tabellarisch zusammengefaßt. Die Standardtests wurden wie in Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, E. M. Koneman et al. Herausgeber, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, 1988; Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, N. R. Krieg, Herausgeber, Williams und Wilkens, Baltimore, 1984 beschrieben, durchgeführt.

Morphologie der Kolonie:	Luriabrühe-Platte: 2–3 mm rund; erhöhtes pinkfarbenes Zentrum haftet an Agar; klebrig. Gelrite^TM-Platte: wie oben, aber erzeugt Vertiefungen; mit anhaftender, klebriger Konsistenz.
Mikroskopie:	Zellen: in Luriabrühe (Länge = 3 × Breite); einzeln oder durchgehende Paare; stabförmig. Sporen: oval; aufgeblähtes Sporangium; subterminal.
Kligler Eisenagar:	saurer Schrägagar; keine Änderung in Verdickung, kein Gas, kein H₂S aus Thiosulfat; Glucose und Lactose verwendet auf Schrägagar; nur aerobes Wachstum.

Andere Tests:
Verwendung von Kohlenstoffquellen:
Die Ergebnisse dieser Testreihen zeigen, dass das biologisch reine Kulturisolat B29 ein gram-positiver, aerober Sporenbildner war, und somit eine Bazillenart. Unter den Bazillen-arten, die in dem 1984 Bergey's Manual aufgelistet sind, entspricht das Isolat B29 sehr eng dem B. brevis. Die einzigen Unterschiede bestanden darin, dass B. brevis für gewöhnlich keine Säure aus Arabinose herstellt und dass es katalasepositiv ist. Wir beziehen uns daher auf B29 als eine Bazillenspezies.
BEISPIEL 3: Stimulation einer Akkumulation einer extrazellulären. welanabbauenden Aktivität
Um zu überprüfen, ob Welan als eine Verbindung dienen kann oder nicht, die spezifisch die Synthese und Sekretion einer welanabbauenden Aktivität induziert, wurden zwei verschiedene flüssige Medien mit B29 Bakterien geimpft: eines enthielt Welan und das zweite enthielt Xanthan. Xanthan ist wie Welan ein negativ geladenes, hochviskoses Kohlenhydratpolymer, aber Xanthan enthält nicht wie Welan Zuckerbindungen. Die zwei Medien beinhalteten 0,4% (w/v) Ammoniumsulfat, 0,2% (w/v) Natriumchlorid, 0,2% (w/v) Magensiumchlorid, 1x Spurenmineralien wie oben beschrieben und 0,25% (w/v) entweder Welan oder Xanthan. Nach 4 Tagen Inkubation bei 28°C mit Schütteln zeigten beide Medien eine verringerte Viskosität, was man beobachten werden konnte, wenn die Kolben herumgeschwenkt und der Flusswiderstand beobachtet wurde. Die Kulturen wurden zentrifugiert, um die Bakterien zu entfernen, und Natriumazid wurde zugegeben, so dass die Endkonzentration 0,01% (w/v) betrug, um den Metabolismus durch übrig gebliebenen Bakterien zu unterbinden. Die geklärten Überstände wurden dann mit einer sterilen Lösung von autoklavierten Welan inkubiert, um die welanabbauende Verbindung ausfindig zu machen.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wies der Überstand der B29 Bakterienkultur auf Welan eine enzymatische Aktivität auf, die eine schnelle Abnahme der Viskosität von Welan veranlasste. Die B29 Bakterien wuchsen auch in einem Medium, das Xanthan als die Hauptkohlenstoffquelle enthielt, aber der Überstand der Kultur baute Welan nicht ab. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass die welanabbauende Verbindung, die von den B29 Bakterien hergestellt wurde, durch das Welan speziell induziert wurde.
TABELLE 1
BEISPIEL 4: Aufreinigen und Konzentrieren der welanabbauenden Verbindung
Die welanabbauende Verbindung wurde nach Verfahren aufgereinigt und aufkonzentriert, die allgemein verwendet werden, um Proteine aufzureinigen und aufzukonzentrieren. Der reine B29 Stamm wurde in 200 ml M9 Minimalsalzmedium inokuliert, das 0,125% (w/v) Welan enthielt, und wurde für 4 Tage mit Schütteln (200 Upm) in einem Kolben mit Schikanen bei 28°C wachsen gelassen. M9 Minimalsalzmedium setzt sich zusammen aus (pro Liter):
6 g Na₂HPO₄,
3 g KH₂PO₄,
0,5 g NaCl,
1 g NH₄Cl,
und beinhaltet 10 ml einer 0,01 M Lösung aus CaCl₂ und 1 ml einer 1 M Lösung aus MgSO₄-7H₂O, die nach dem Autoklavieren zugefügt werden.
Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert (11000 × G für 10 min) und durch ein Whatman Nr. 1 Papier filtriert, um Zellen und Abfall zu entfernen. Unterschiedliche Mengen an Ammoniumsulfat wurden zu jeder der fünf Proben (20 ml) aus zellfreiem Extrakt zugefügt, um die Verbindung auszufällen. Das Ammoniumsulfat wurde langsam über einen Zeitraum von 30 Minuten Bereich von 0 bis 86% der Sättigung bei Raumtemperatur zugegeben und jede Probe wurde für 10 Minuten auf Raumtemperatur gehalten, bevor weitergemacht wurde. Die Lösungen wurde bei 11000 × G für 10 Minuten zentrifugiert, um die unlöslichen Proteine im Niederschlag von den löslichen Proteinen im Überstand abzutrennen. Die ausgefällten Proteine wurden in 5 ml DI resuspendiert, dann wurden die Niederschläge und die Überstände getrennt in poröse Dialyseschläuche aus Celluloseester gegeben, die eine Molekulargewichtsausschlussgrenze (MWCO) von 6000 bis 8000 Dalton hatten und es wurde gegen DI dialysiert.
Die enzymatische Aktivität wurde bestimmt, indem die Viskosität nach der Verdauung einer Welanlösung (0,625 mg/ml in 20 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7) gemessen wurde. Die Viskosität wurde als eine Funktion der Zeit aufgetragen und dann die relative Enzymaktivität als Absolutwert aus der Steigung berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
TABELLE 2
Diese Ergebnisse zeigen, dass der grösste Teil der Verbindung in Ammoniumsulfat bei ungefähr 61% Sättigung ausgefällt wurde und in Ammoniumsulfat bei 34% Sättigung löslich war. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Verbindung aus der zellfreien Kulturbrühe aufgereinigt und aufkonzentriert, indem zuerst Ammoniumsulfat bis zu 34% Sättigung zugegeben wurde und anschliessend das ausgefällte Material mittels Zentrifugation entfernt und verworfen wurde. Die überstehende Fraktion wurde dann auf 55% Sättigung an Ammoniumsulfat gebracht und der resultierende Niederschlag mittels Zentrifugation gewonnen. Der zweite Niederschlag wurde erneut gelöst, dialysiert und als aufgereinigte, aufkonzentrierte Verbindung z. B. in Beispiel 6 eingesetzt. Der erste Niederschlag in Ammoniumsulfat bei 34% Sättigung enthielt eine kleinere Fraktion der Gesamtmenge der Verbindung, während der zweite Niederschlag mit 55% Sättigung an Ammoniumsulfat den größeren Anteil der Verbindung enthielt.
BEISPIEL 5: Die erfindungsgemäße Verbindung ist eine Endoglyanase.
Es wurde ein Experiment durchgeführt, worin Welan unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung verdaut wurde und Proben der Verdauungsmischung in periodischen Abständen gemessen wurden, um die Viskosität und die Menge an vorhandenen, reduzierenden Zuckern zu bestimmen. Im Experiment wurde die aufgereinigte und aufkonzentrierte Verbindung aus Beispiel 4 verwendet, um das Welan in Lösung zu verdauen. Die Verdauungsmischung enthielt Welan (0,06% w/v, Endkonzentration), eine Lösung der erfindungsgemäßen Verbindung (25% des End volumens) und 0,013 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7. Es wurden periodisch Proben (0,5 ml) entnommen und Welan mit hohem Molekulargewicht wurde mittels Ausfällen entfernt, indem schrittweise Isopropylalkohol (IPA) zur Probe zugegeben wurde bis eine Endkonzentration an IPA von ungefähr 66% (v/v) erreicht worden war, gefolgt von Zentrifugation. Das nicht ausgefällte Material mit niedrigem Molekulargewicht, das während der Verdauung freigesetzt worden war, wurde aus dem IPA mittels Verdampfen zurückgewonnen. Die Menge an reduzierenden Zuckern in den Proben wurde unter Verwendung eines Assays gemessen, der in Starch and its Derivatives, 1968, J. A. Radley, S. 432–433 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Wie gezeigt, wurde keine nachweisbare Freisetzung von reduzierenden Zuckern bis spät in der Verdauungsperiode beobachtet. Jedoch nahm die Viskosität des Welans innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums nach Beginn der Verdauung ab. Dieser schnelle Verlust an Viskosität und die begleitende, langsame Freisetzung von reduzierenden Zuckern weist darauf hin, dass die erfindungsgemäße Verbindung eine Endoglycanase ist, da ein exolytisches Enzym die reduzierende Zucker zu einem früheren Stadium der Verdauung freigesetzt haben würde.
TABELLE 3
BEISPIEL 6: Enzymtätigkeit auf Gelrite^TM-Gelen.
Die aufgereinigte Verbindung aus Beispiel 4 war in der Lage, die Gelrite^TM-Gele schnell zu verdauen. Ein Tropfen (ungefähr 8 mm Durchmesser und 0,01 ml enthaltend) der aufgereinigten Verbindung wurde auf die Oberfläche eines Gelrite^TM-Gels, das in einer Plastikschale verfestigt wurde, aufgebracht. Innerhalb von 30 Minuten bei 28°C bildete sich ein Loch auf der Geloberfläche mit ungefähr 8 mm Durchmesser und 0,5 mm Tiefe. Die Verdauung wurde für 24 Stunden fortgesetzt und die Tiefe und Breite des Loches im Gel vergrösserte sich um ungefähr 12 mm im Durchmesser und auf 3–4 mm Tiefe.
BEISPIEL 7: Herstellung von Welan mit niedriger Viskosität unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms.
Ein rohes, zellfreies Produkt wurde hergestellt, indem eine flüssige Kultur der B29 Bakterien (wie in Beispiel 4 hergestellt) mit einem gleichen Volumen an DI verdünnt wurde und rohes, käufliches Welan (trockenes Pulver) in dieser Enzymlösung bis zu 5% (w/v) hydratisiert wurde, wobei Natriumazid zugegeben wurde, um mikrobielles Wachstum zu unterbinden. Die Lösung war hochviskos mit einer halbfesten, puddingartigen Konsistenz und liess sich nicht aus dem Becherglas ausgiessen. Die Verdauung wurde bei 28°C fortgesetzt. Als die Verdauung beendet wurde, enthielt die Welanlösung weniger als 400 brauchbare Zellen pro ml. In Intervallen wurden Proben der Verdauungslösung (2 g) entnommen, mit DI zehnfach verdünnt (auf ein Endgewicht von 20 g) und die Viskosität gemessen. Das Welan wurde dann aus diesen Proben durch Zugabe von IPA, wie in Beispiel 5 beschrieben, ausgefällt. Der Niederschlag wurde mittels Zentrifugation gewonnen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet, um die Menge an Welan zu bestimmen, die im Laufe der Verdauung ausfällbar bleibt. Wie in Tabelle 4 gezeigt, nimmt die Viskosität der Welanlösung über einen Zeitraum von Tagen ab, um eine Lösung mit Material von niedriger Viskosität zu ergeben. Diese Ergebnisse zeigen, dass die rohe Verbindung in der Lage war, eine konzentrierte Welanlösung zu verdauen und unter diesen Bedinungen während mindestens 7 Tagen Inkubation aktiv zu bleiben.
Zusätzlich bestätigen diese Werte die endolytische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung. Dennoch nahm die Masse des Welans mit hohem Molekulargewicht im Laufe der Verdauung langsam ab. Es gab einen raschen Rückgang der Viskosität. Diese Ergebnisse weisen auf eine endolytische Verdauung hin im Vergleich zur exolytischen Verdauung, wo der Viskositätsverlust sehr viel langsamer ablaufen würde und parallel die Masse an mit IPA ausfällbaren Polymer abnehmen würde.
TABELLE 4
BEISPIEL 8: Enzymaktivität der erfindungsgemäßen Verbindung auf verschiedene Polysaccharide mit einer gemeinsamen Rückgratstruktur.
Lösungen aus Polysacchariden mit verschiedenen Primärstrukturen wurden hergestellt. Diese beinhalten strukturell verwandte Polymer der „Gellan-Familie" (Gellan, Gelrite^TM, Welan, Rhamsan, S-88 und S-198) und Polymere mit nicht verwandten Strukturen (B-1973, K-54 und Xanthan). Zusätzlich wurde ein Polysaccharid (S-7) hergestellt.
Rohe Polysaccharide (Gellan, Rhamsan, S-88, S-7, S-198, B-1973, K-54) wurden hergestellt, indem man den geeigneten produzierenden Stamm wachsen liess. Alle Bakterienstämme wurden in flüssigen Kulturen (ungefähr 50 ml in 250 ml Kolben mit Schikanen) mit Schütteln (200 Upm) bei Raumtemperatur für 3 bis 7 Tage gezüchtet, abhängig von der Rate der Polymeranhäufung. Die Kulturen wurden mit drei Volumenteilen an IPA ausgefällt, die Niederschläge gewonnen (manuell mittels Abspulen oder mittels Zentrifugieren), das überschüssige IPA aus dem Niederschlag gepresst und das Polymer wurde in DI gelöst.
Proben von Gelrite^TM wurden von Schweizerhall erhalten und Welan und Xanthangummi wurden von Kelco bezogen. Die anfänglichen Viskositäten der Polysaccharidlösungen wurden bei 6 Upm mit einer Spindel Nr. 18 auf einem Brookfield LVTDV-11 Viskosimeter bei Raumtemperatur gemessen. Es wurde ausreichend Polymer zu den Testlösungen zugegeben, so dass die anfänglichen Viskositäten im Bereich von 70 cp (für K-54) bis 14 cp (für S-198) lagen. Die aufgereinigte Verbindung wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und 0,2 ml der Verbindung wurden mit 8 ml von jedem Polysaccharid gemischt.
CM-MEDIUM

1% Tryptone
0,2% Hefeextract
0,2% Casamino Acids
0,5% Glucose
P2-Salze

Sowohl das erste als auch das zweite Probenset wurden für vier Tage bzw. 24 Stunden bei 22–24°C verdaut, danach wurden die Viskositäten jeder Probe unter Verwendung des oben erläuterten Verfahrens gemessen. Die Ergebnisse der zwei Verdauungen sind in Tabelle 5 dargestellt.
Zusammengefasst verdaute das Enzym Gelrite^TM, Welan, S-198 und S-88 aus der Gellan-Familie von verwandten Polymeren und es verdaute B-1973, K-54 oder Xanthan nicht.
Wie in Beispiel 6 gezeigt, verdaute die erfindungsgemäße Verbindung die Gelrite^TM-Form des Gellans, was aus der Verflüssigung der Gelrite^TM-Gele ersichtlich war. Jedoch widersteht die native Form von Gellan, das von den produzierenden Bakterien sekretiert wird, der Verdauung. Gelrite^TM wird über eine chemische Behandlung von Gellan hergestellt, welche das Glycerat, das an die Glucose 1 von jeder Untereinheit gebunden ist, enfernt (Kuo, M. -S. und A. J. Mort, 1986, Carbohydrate Research 156, 173–187). Die erfindungsgemäße Verbindung schneidet endolytisch diejenigen Polysaccharide, die eine Gellanuntereinheitstruktur aufweisen, worin der Glucose-1-Rest nicht substituiert ist. Daher ist natives Gellan gegenüber einer Verdauung mit der Verbindung resistent, während das chemisch verarbeitete Gelrite^TM verdaut wird. In ähnlicher Weise ist Rhamsan gegenüber der Verbindung aufgrund der Substitution des Glucose-1-Restes mit einer Seitenkette, bestehend aus zwei Glucoseresten, resistent.
TABELLE 5
Abkürzungen:

Glc

Glucose

Gla

Glucuronsäure

Rha

Rhamnose

Gly

Glycerat

Man

Mannose

Mna

Mannuronsäure

Gal

Galactose

Anmerkungen zu Tabelle 5:

(1) Verflüssigung des Gelrite^TM-Gels. Siehe Beispiel 6 oben.
(2) Hypothetische Struktur basierend auf einer angenäherten Zuckerzusammensetzung (siehe U.S. Patent 3,960,832), Spezifität des Welanaseenzyms und Analogie zur S-194 Struktur.

Eine mittlere Verdauungsrate wurde für das Polysaccharid S-198 beobachtet. Die berichtete Struktur des S-198 (Chowdhury, T. A., B. Lindberg, U. Lindquist, und J. Baird, 1987, Carbohydrate Research 161, 127–132) weist darauf hin, dass im Durchschnitt der Glucose 1 Rest der Untereinheitsstruktur zur Hälfte mit Rhamnose substituiert ist. Daher kann S-198 eine einzelne Polysaccharidstruktur aufweisen mit Seitenketten an jeder zweiten Rückgratuntereinheit oder es kann alternativ eine Mischung aus zwei unterschiedlichen Strukturen sein: einem unverzweigten, gelritähnlichen Polysaccharid und einem komplett substituierten Polymer mit der für S-198 berichteten Struktur. Die letztere Möglichkeit wurde jedoch aufgrund der Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung ausgeschlossen. Wenn S-198 mit der Verbindung für einen genügend langen Zeitraum verdaut wurde, ging im Wesentlichen die gesamte Viskosität der S-198 Lösung verloren, was darauf hinweist, dass alle Polymerketten für eine Verdauung durch die Verbindung anfällig waren. Die langsame Verdauungsrate des S-198 scheint auf der teilweisen Substitution des Glucose-1-Restes der Untereinheitenstruktur eines Polymers bestehend aus nur einem Typ zu beruhen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verbindung dazu verwendet kann, zwischen zwei alternativen Polysaccharidstrukturen, d.h einer Mischung aus zwei Polymerstrukturen und einem teilweise substituierten, einzigen Polymertyp, zu unterscheiden.
Die Zusammensetzung des S-7 wird im U.S. Patent 3,960,832 als Glucose (73%), Rhamnose (16%) und Glucuronsäure (11%) beschrieben. Diese Zuckerzusammensetzung ist der Zusammensetzung wie sie für Rhamsan berichtet wird ähnlich (U.S. Patent 4,401,760), welche Glucose (73–77%), Rhamnose (20–21%) und Glucuronsäure (9%) enthält. Das Polysaccharid S-7 wurde von der Verbindung verdaut, was darauf hinweist, dass es ein Mitglied der Gellan-Familie ist. Innerhalb dieser Familie gibt es Paare von Polysacchariden, die sich nur in der Stellung der Seitenkette unter-scheiden. Zum Beispiel weist S-88 eine Monosaccharid-Rhamnose-Seitenkette an der Glucose 2 der Untereinheitsstruktur auf, während S-198 ein Monosaccharid Rhamnose an der Glucose 1 hängen hat. Ausserdem scheinen S-7 und S-194 ein solches strukturell verwandtes Paar zu repräsentieren: S-194 hat eine Seitenkette aus zwei Glucoseresten, die an der Glucose 1 der Untereinheitstruktur hängen und S-7 scheint dieselbe Seitenkette an der Glucose 2 befestigt zu haben.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Enzymaktivität der erfindungsgemäßen Verbindung für eine Untermenge von Polysacchariden innerhalb der Gellan-Familie spezifisch ist.
BEISPIEL 9
Bodenproben wurden von der Stelle aus Beispiel 1 entnommen, aber ungefähr 6 Monate nach den ersten Proben. Drei Bodenproben (ungefähr 25 g) wurde mit 5 ml einer 0,25%igen wässrigen Lösung, die Welan, Xanthangummi oder keine Polysaccharide zum Zwecke der Anreicherung enthielt, inkubiert. Die Proben wurde bei Raumtemperatur für 5 Tage inkubiert. Aliquots von ungefähr 10 ml Volumen wurden aus jeder Probe entnommen, 20 ml DI zugefügt und die Suspension für 2 Stunden bei 28°C mit Schütteln inkubiert. Diese Proben wurden anschliessend zentrifugiert, um die Erde-partikel zu entfernen und der Überstand wurde durch einen Whatman Papierfilter filtriert. Der geklärte Überstand wurde dann verdünnt und auf einem reichhaltigen Medium (YM-Medium) ausplattiert, um die ungefähre Gesamtzahl an Bakterien abzuschätzen sowie auf Gelrite^TM-Platten, um die Anzahl der Bakterien abzuschätzen, die in der Lage sind, auf Gelrite^TM zu wachsen. Die Anzahl der „vertiefungsbildenden" Kolonien auf Gelrite^TM-Platten weist auf die Zahl der Bakterien hin, die zur endolytischen Verdauung von Gelrite^TM fähig sind und die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.
Die Anreicherung der Bodenproben mit Welan ergibt zahlreiche Kolonien, die auf Gelrite^TM wachsen. Ungefähr 7% der Gesamtzahl an Bakterien, die aus dem Boden gewonnen werden können, sind Gelrite^TM-Verdauer in den Welan-angereicherten Proben, dagegen weist eine von 20000 (0,005%) der gesamten Bakterien diese Aktivität in mit Xanthangummi, einem nichtverwandten Polysaccharid, angereicherten Bodenproben auf. Es wurde beobachtet, dass während die meisten BakterienKolonien, die auf Gelrite^TM-Platten wuchsen, Vertiefungen in der Geloberfläche bildeten, ungefähr 30% der gesamten Kolonien, die auf Oberfläche wuchsen, keine Vertiefungen bilden. Wahrscheinlich stellen diese Kolonien Bakterien dar, die in der Lage sind, Zucker aus Gelrite^TM mittels eines exo-Verdauungsverfahrens zu erhalten, aber eine beschränkte oder gar keine endolytische Aktivität aufweisen.
TABELLE 6
BEISPIEL 10:
Es wurde ein zusätzliches Experiment zur Herstellung und Aufreinigung der extrazellulären, welanabbauenden, erfindungsgemäßen Verbindung ausgeführt. Zu diesem Zwecke wurde der Stamm B29 bei 30°C für 120 Stunden unter Schütteln in Erlenmeyerkolben gezüchtet, die P2-Salze und 0,25% Welan enthielten. Die Kulturbrühe (1875 ml) wurde zentrifugiert (10000 × G für 15 Minuten), um die Zellen daraus zu entfernen und dann wurde Natriumazid in einer Konzentration von 0,01% zugegeben.
Festes Ammoniumsulfat wurde bis zu einer 34%igen Sättigung zugegeben und die Mischung liess man für 30 Minuten bei 4°C ruhen. Der Niederschlag wurde mittels Zentrifugation für 15 Minuten bei 10000 × G entfernt. Festes Ammoniumsulfat wurde dem Überstand bis zu einer 64%igen Sättigung zugefügt.
Die Verbindung im Überstand wurde anschliessend ausgefällt, indem bei 4°C für 30 Minuten inkubiert und dann bei 10000 × G für 15 Minuten zentrifugiert wurde. Der so erhaltene aktive Niederschlag wurde in deionisiertem Wasser erneut suspendiert und über Nacht bei 4°C gegen Wasser dialysiert. Einiges unlösliches Material wurde mittels Zentrifugation bei 10000 × G für 15 Minuten entfernt. Danach wurde die lösliche Fraktion weiter aufgereinigt, indem sie mit NaCl auf 25 mM gebracht und anschliessend auf eine Chromatographiesäule zum Anionenaustausch aufgebracht wurde, die DEAE-Sepharose CL-6B von Sigma enthielt. Die Säule wurde auf Raumtemperatur gehalten.
Die Proteine wurden zuerst eluiert, indem mit 50 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl bei pH 7,6 und danach mit einem Gradienten aus gepufferten NaCl bis zu 500 mM gewaschen wurde.
Eine separate Probe wurde zur Chromatographie, basierend auf hydrophoben Wechselwirkungen, verwendet, indem sie auf eine Säule aus Octyl-Sepharose (Sigma) in 1 M NaCl und 20 mM Tris-HCl bei pH 7,6 aufgebracht wurde und danach die Proteine mit einem Gradienten aus gepufferten NaCl bis zu 0 M eluiert wurden.
Eine andere Probe wurde der Gelfiltrationschromatographie unterworten, indem eine aufkonzentrierte Probe auf eine Säule aus Sephacryl 400-HR (Sigma) in 150 mM NaCl und 20 mM Tris HCl bei pH 7,6 aufgebracht wurde. Die Proteine wurden dann mit derselben Flüssigkeit eluiert. Die Elution der Enzyme, wie sie über das Auftragen von Proben jeder Fraktion auf Gelrite^TM-Platten überwacht wurde, und die aktiven Fraktionen wurden zusammgengestellt. Die Enzymverbindung wurde auch von anderen Proteinen mittels Elektrophorese durch nicht-denaturierende, eingetauchte 1,4%ige Agarosegele mit einer konstanten Zurückführung des Puffers, 50 mM MOPS, pH 7,5, abgetrennt. Die Migrationsrate des erfindungsgemäßen Enzyms zur Anode war beinahe so schnell wie für das Rinderserum Albumin. Dagegen wanderte das Eiweiß-Lysozym zur Kathode. Teile des Gels wurden ausgeschnitten und die Proteine mittels Diffusion in 50 mM MOPS-Puffer bei pH 7,5 eluiert.
Die Zugabe von Welan zum Medium, um die Synthese des erfindungsgemäßen Enzyms zu stimulieren, fügt auch bakterielles Protein und Zellabfall aus den polysaccharidproduzierenden Mikroorganismen zu. Als Ergebnis wurde das Enzym mit kontaminierenden Proteinen gemischt, obwohl es in das Medium sekretiert wurde. Es wurden die Eigenschaften des Enzyms vor und nach der Aufreinigung charakterisiert und es wurde gefunden, dass sie dennoch gleich waren. Tabelle 7 fasst die Aufreinigungsergebnisse zusammen. Es wird angemerkt, dass der Anfangsschritt eine Konzentrierung des Enzyms um das ungefähr 100-fache aus der Kulturbrühe durch Ausfällen mit hohen Konzentrationen an Ammoniumsulfat ist. Dies entfernt ungefähr eine Hälfte des Proteins und ungefähr eine Hälfte der Enzymaktivität wird zurückgewonnen.
TABELLE 7
Wir haben gefunden, dass die Enzymaktivität sich wie ein saures Protein bei neutralem pH verhält, da seine elektrophoretische Mobilität in nicht-denaturierendem Agarosegel ähnlich der von Rinderserum Albumin ist, welches einen isoelektrischen Punkt von 4,8 aufweist.
Aufgrund dieser Eigenschaft wurde ein zweiter Aufreinigungsschritt mit einer Eisenaustauschchromatographie durch DEAE-Sepharose mit größer werdenden Mengen an NaCl zur Eluierung ausgeführt. Ungefähr eine Hälfte des Materials, das bei 280 nm absorbiert, band nicht an die Matrix und ein Viertel eluierte über 500 mM NaCl. Das eine Viertel-Eluat beinhaltete geladene Polysaccharide, höchstwahrscheinlich übriges Welan aus dem Medium. Die Enzymaktivität wurde als ein einzelner Peak mit 200 bis 300 mM NaCl eluiert. Der Vorrat an aktiven Fraktionen enthielt ungefähr ein Viertel des aufgetragenen Proteins und ungefähr drei Viertel der Enzymaktivität. Nach der Auftrennung der Proteine durch Elektrophorese über denaturierenden SDS-Polyacrylamidgele und Anfärben mit Coomassie Brilliant Blue R250, war ein Polypeptid mit ungefähr 110000 ± 10000 Dalton herausragend mit ungefähr sechs weiteren, schwachen Bändern.
Die Gelfiltration durch Sephacryl 400HR oder eine Chromatographie basierend auf hydrophoben Wechselwirkungen entfernten einige der schwächeren Polypeptidspezies. Während die Gewinnung der erfindungsgemäßen Enzymaktivität niedrig war, besonders von Octyl-Sepharose, wurden nach der Elektrophorese eine Probe des DEAE-Pools durch ein Agarosegel mit pH 7,5 sowie Schneiden und Eluieren des Proteins mit 50 mM MOPS bei pH 7,5 die aktiven Fraktionen bestimmt, indem sie auf ein Gelrite-Gel aufgebracht und mit einem SDS_Polyacrylamidgel analysiert wurden. Das aktive Polypeptid entsprach der Spezies mit 110000 Dalton. Eine zusätzliche Elektrophorese eines Teils des DEAE-Pools und des Agarosegels zeigte, dass ein einzelnes Polypeptid von 110000 ± 10000 Dalton die erfindungsgemäße Enzymaktivität aufwies.
Eine Serie von Tests wurde durchgeführt, um den optimalen pH-Bereich oder Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms unter Verwendung verschiedener Puffer zu bestimmen. Zusätzlich wurden auch die Temperatur, bei der das erfindungsgemäße Enzym inaktiv wird, und die optimale Reaktionstemperatur für das Enzym bestimmt. Basierend auf dieser Analyse liegt der am besten geeignete pH-Bereich für das erfindungsgemäße Enzym bei ungefähr 4,5 bis 9, bevorzugt ungefähr 6,5 bis 8 und besonders bevorzugt bei 7,2 bis 7,8. Das erfindungsgemäße Enzym wird in besonders wünschenswerter Weise bei Temperaturen zwischen 10 und 60°C verwendet, da es in diesem Bereich am stärksten aktiv ist. Bevorzugt wird das Enyzm im Bereich von ungefähr 30 bis 50°C verwendet. Bei Temperaturen unterhalb 30°C wird die Aktivität träger und bei Temperaturen über 50°C wird das Enzym aufgrund der Hitze inaktiv.
Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, in welchem eine Auswahl an Puffern verwendet wurde, um den optimalen pH-Wert des erfindungsgemäßen Enzyms für die Hydrolyse von Welan zu bestimmen. Diese Experimente wurden durchgeführt, indem eine Lösung aus 0,1% Welan und das erfindungsgemäße Enyzm aus dem DEAE-Fraktionenvorrat verwendet wurde. Die verwendeten Puffer waren Acetat, Citrat, Phosphat, MOPS und Tris. Die Puffer wurde in einer Endkonzentration von 50 mM eingesetzt. Die Aktivität wurde gemessen, indem die Viskosität unter Verwendung einer temperaturummantelten Spindel Nr. 18 und einem Brookfield LVTDV-11 Viskosimeter bestimmt wurde.
TABELLE 8
Die Ergebnisse der Anfangsreaktionsrate des erfindungsgemäßen Enzyms nach der Behandlung bei einer gegebenen Temperatur wurde bestimmt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt.
TABELLE 9
Es wurde auch die optimale Reaktionstemperatur für das erfindungsgemäße Enzym gemessen und diese Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Bei den Ergebnissen in den letzten zwei Tabellen war der Puffer 50 mM MOPS bei pH 7,5 und das verwendete Substrat war 0,1%iges Welan.
TABELLE 10
Es wurde auch ein Test durchgeführt, um die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Enzyms bezüglich der Verdauung von verschiedenen Polysacchariden zu bestimmen. Lösungen von mit Gellan verwandten Polymeren wurden hergestellt und die anfängliche Viskosität gemessen. Danach wurden 0,05 bis 0,2 ml des erfindungsgemäßen Enzyms (die DEAE Fraktion) mit 8 ml der Polysaccharidlösung gemischt. Die verwendeten Polysaccharide waren Gellan, deacetyliertes Gellan, Welan, Rhamsan, deacetyliertes Rhamsan, S-88, S-198, deacetyliertes S-198, NW-11 und S-7. Polysaccharide mit nichtverwandten Strukturen wurden ebenfalls getestet, nämlich B-1973, K-54 und Xanthan (Keltrol). Nach Equilibrieren der Temperatur wurden die anfänglichen Viskositäten gemessen und das erfindungsgemäße Enzym wurde mit der Polysaccharidlösung gemischt. Die Änderung in der Viskosität wurde als eine Funktion der Zeit bei 40°C aufgenommen. Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse.
TABELLE 11
Wie man sieht, weist das erfindungsgemäße Enzym eine Aktivität gegenüber Welan, Gellan, S-198, S-7 und S-88 auf. Es zeigt im Wesentlichen keine Aktivität gegenüber Rhamsan, NW-11, B-1973, K-54 und Xanthan. Das erfindungsgemäße Enzym war auch gegenüber den chemisch deactylierten Formen von Gellan, Rhamsan und S-198 aktiv, im Wesentlichen zum gleichen Grade wie bei den nativen Polysacchariden, auch wenn diese Werte nicht in der Tabelle gezeigt werden.

Claims

Verbindung mit endolytischer enzymatischer Aktivität gegenüber Polysacchariden mit der Untereinheitsgerüststruktur:
worin GlcA Glucose ist, GcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und wobei das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Rückgrats hin liegt, wobei die Verbindung aus dem Bazillus-Stamm B29, Hinterlegungsnummer ATCC 55294 erhältlich ist und wobei die Verbindung ein Molekulargewicht von 110000 ± 10000 Dalton aufweist.
Verbindung mit endolytischer Aktivität gegenüber einem Polysaccharid mit der Wiederholungsuntereinheitsstruktur II:
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, Z α-L-Rha-(1→6)-α-L-Rha, α-L-Man, α-L-Rha oder Glc sein kann, W β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc oder α-L-Rha sein kann, die tiefergestellten Indizes v und y entweder 0, 0,5 oder 1 sein können, und wobei das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Gerüsts hin liegt, und wobei die Verbindung aus dem Bacillus-Stamm B29, Hinterlegungsnummer ATCC 55294 erhältlich ist und wobei die Verbindung ein Molekulargewicht von 110000 ± 10000 Dalton aufweist.
Verbindung nach Anspruch 1 mit endolytischer Aktivität gegenüber einem Polysaccharid, das aus der aus Gellan, Welan, S-198, S-7 und S-88, deacetyliertem Gellan, deacetyliertem Rhamsan und deacetyliertem S-198 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 2 mit endolytischer Aktivität gegenüber einem Polysaccharid, das aus der aus Gellan, Welan, S-198, S-7 und S-88, deacetyliertem Gellan und deacetyliertem S-198 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 mit endolytischer Aktivität gegenüber deacetyliertem Gellan und einem oder mehreren der folgenden Polysaccharide: Gellan, Welan, S-198, S-7, S-88, deacetyliertes Rhamsan oder deacetyliertes S198.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 mit endolytischer Aktivität gegenüber zwei oder mehr der folgenden Polysaccharide: Gellan, Welan, S-198, S-7, S-88, deacetyliertes Rhamsan oder deacetyliertes S-198.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei v 0,5 oder 1 ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei y 0,5 oder 1 ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder Verfahren zur Herstellung eines Stamms, der eine Verbindung nach einem der An sprüche 1 bis 8 bildet, wobei das Verfahren umfasst: a) Unterwerfen einer natürlich vorkommenden Kollektion von Bakterienstämmen unter Wachstumsbedingungen in einem Medium, wobei die vorherrschende oder einzige Kohlenstoffquelle ein Polysaccharid ist, das die folgende Untereinheitsgerüststruktur aufweist:
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und wobei das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Gerüsts hin liegt, so dass das Vorhandensein von Bakterien, die ein Polysaccharid der obigen Struktur nutzen können, verstärkt wird; b) Kultivieren der angereicherten Bakterien in einem Gelmedium, das als vorherrschende Kohlenstoffquelle im wesentlichen nicht-kontaminiertes Polysaccharid der obigen Untereinheitstruktur enthält; und c) Selektieren einer Kolonie von Stufe b), die eine sichtbare nachweisbare Senke oder Vertiefung im Gel erzeugt.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder Verfahren zur Herstellung eines Stamms, der eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bildet, wobei das Verfahren umfasst: i) Unterwerfen von Bakterien unter Wachstumsbedingungen auf Medien, die ein Polysaccharid enthalten, das die Untereinheitsgerüststruktur I aufweist:
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und wobei das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Gerüsts hin liegt, und wobei das Polymer keine Seitenketten aufweist; und ii) Unterwerfen von Bakterien einem Wachstum auf Medien, die ein Polysaccharid enthalten, das die Struktur I, worin Seitenketten vorhanden sind, aufweist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Verfahren umfasst: a) Unterwerfen einer natürlich vorkommenden Kollektion von Bakterienstämmen unter Wachstumsbedingungen in einem Medium, das ein Polysaccharid mit der Untereinheitsgerüststruktur
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und wobei das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Gerüsts hin liegt, als vorherrschende Kohlenstoffquelle enthält; b) Selektieren einer Kolonie von Zellen, die unter den Bedingungen von Stufe a) wachsen; c) Unterwerfen der selektierten Kolonie unter Plattenwachstumsbedingungen in einem Gelmedium, das das Polysaccharid mit Struktur I als vorherrschende Kohlenstoffquelle enthält; d) Selektieren eines Stamms von Stufe c), der ein Eintiefen des Gels bewirkt; und e) Unterwerfen des selektierten Stamms von Stufe d) unter Kulturbedingungen in einem Wachstumsmedium, das derart ausreichende Mengen des Polysaccharids enthält, dass die Bildung der Verbindung nach Anspruch 1 durch den Stamm bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, das ferner das Gewinnen des Kulturbrühenüberstands, der die Verbindung von Stufe e) enthält, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Kulturbrühenüberstand mit Ammoniumsulfat behandelt wird, wobei die Verbindung konzentriert und gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Kulturbrühenüberstand mit Ammoniumsulfat behandelt wird, wobei ein Niederschlag des erfindungsgemäßen Enzyms gebildet wird, und der Niederschlag zur Reinigung desselben einem Anionenaustausch unterzogen wird.
Biologisch reine Kultur eines Stamms, der ein Enzym bildet, das ein Polysaccharid mit der Untereinheitsgerüststruktur
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und wobei das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Gerüsts hin liegt, verdauen kann, und wobei das Enzym aus dem Bacillus-Stamm B29, Hin terlegungsnummer ATCC 55294 erhältlich ist und wobei die Verbindung ein Molekulargewicht von 110000 ± 10000 Dalton aufweist.
Kultur nach Anspruch 15, die ein Polysaccharid, das aus der aus Gellan, Welan, S-198, S-7 und S-88, deacetyliertem Gellan und deacetyliertem S-198 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, als Kohlenstoffquelle nutzen kann.
Kultur nach Anspruch 15, die ein Enzym bildet, das deacetyliertes Gellan und eines oder mehr der folgenden Polysaccharide: Gellan, Welan, S-198, S-7, S-88, deacetyliertes Rhamsan oder deacetyliertes S-198 verdauen kann.
Kultur nach Anspruch 15, die ein Enzym bildet, das zwei oder mehr der folgenden Polysaccharide: Gellan, Welan, S-198, S-7, S-88, deacetyliertes Rhamsan oder deacetyliertes S-198 verdauen kann.
Biologisch reine Kultur eines Stamms nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die Kultur erhalten wird durch: a) Unterwerfen einer natürlich vorkommenden Kollektion von Bakterienstämmen unter Wachstumsbedingungen in einem Medium, das ein Polysaccharid mit der Untereinheitsgerüststruktur
wobei das Reduktionsende des Polymers zum Rha-Rest des Gerüsts hin liegt, als vorherrschende Kohlenstoffquelle enthält; b) Selektieren einer Kolonie von Zellen, die unter den Bedingungen von Stufe a) wachsen; c) Unterwerfen der selektierten Kolonie von Stufe b) unter Plattenwachstumsbedingungen in einem Gelmedium, das das Polysaccharid mit Struktur I als vorherrschende Kohlenstoffquelle enthält; und d) Selektieren eines Stamms von Stufe c), der ein Eintiefen des Gels bewirkt.
Kultur nach Anspruch 19, wobei das Polysaccharid mit der Struktur (I) deacetyliertes Gellan ist.
Kultur nach Anspruch 19, wobei das Polysaccharid mit der Struktur (I) Welan ist.
Kultur nach Anspruch 21, wobei das Verfahren zur Gewinnung der Kultur ferner das Ausplattieren einer individuellen Kolonie von Stufe d) auf deacetyliertes Gellan und das anschließende Selektieren auf die Fähigkeit zum Bewirken sichtbarer Senken auf einer Platte von deacetyliertem Gellan umfasst.
Stamm ATCC 55294.
Verfahren zur Behandlung eines Polysaccharids mit der Untereinheitsgerüststruktur
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und wobei das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Gerüsts hin liegt, zur Verringerung der Viskosität einer wässrigen Lösung des selben, das das Unterwerfen des Polysaccharids unter Verdauungsbedingungen in Gegenwart einer enzymatisch wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Verdauungstemperatur im Bereich von etwa 25°C bis 30°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Verdauung über einen Zeitraum von etwa 30 min bis 14 Tagen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Viskosität in einem Ausmaß von etwa 50% bis 99,5% der ursprünglichen Viskosität verringert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, 11 oder 24, wobei das Polysaccharid aus der aus Gellan, Welan, S-198, S-7 und S-88, deacetyliertem Gellan und deacetyliertem S-198 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Polysaccharid Welan ist.
Verfahren nach Anspruch 28 bei Abhängigkeit von Anspruch 9, und wobei das Polysaccharid Welan ist, und wobei das Verfahren ferner das Ausplattieren einer individuellen Kolonie von Stufe c) auf deacetyliertes Gellan und das anschließende Selektieren auf die Fähigkeit zum Bewirken sichtbarer Senken auf einer Platte von deacetyliertem Gellan umfasst.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Polysaccharid die folgende Untereinheitsstruktur aufweist:
worin Glc Glucose ist, GlcA Glucuronsäure ist, Rha Rhamnose ist, Man Mannose ist, X Rha oder Man sein kann, und wobei das Reduktionsende des Polymers in Richtung zum Rest X des Gerüsts hin liegt, das die Stufen: a) Unterwerfen des Polysaccharids unter Verdauungsbedingungen in Gegenwart einer enzymatisch wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 1; und b) Überwachen der Verdauung zum Erfassen einer Abnahme der Viskosität umfasst.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, Stamm nach Anspruch 15, Verfahren nach Anspruch 24 oder 31 oder Kultur nach Anspruch 19, wobei X Mannose ist.