DE69308320T2 - Aus Agrobacterium species ATCC 55341 erhaltenes Heteropolysaccharid 35-80 - Google Patents
Aus Agrobacterium species ATCC 55341 erhaltenes Heteropolysaccharid 35-80Info
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Description
- Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrobiellen Polysaccharide. Im besonderen kommen diese Polysaccharide in Form von exozellularen Heteropolysacchariden vor, welche Kohlehydrate enthalten die ein hohes Molekulargewicht besitzen, im allgemeinen linear oder verzweigt sind, wobei 2 oder mehr verschiedene Arten von Monosacchariden, die wiederkehrende Einheiten bilden, miteinander polymerisiert sind.
- Diese Heteropolysaccharide werden in verschiedenen Anwendungen in größerem Umfang benutzt, einschließlich von industriellen Nahrungsmitteln, Brunnenbohren, Landwirtschaft, Farben etc. Die wirtschaftliche Nachfrage nach diesen Heteropolysacchariden steigt laufend.
- Eins der am häufigsten verwendeten Polysaccharide ist Xanthan oder Xanthan- Gummi, welches während der Fermentation von Bakterien der Art Xanthomonas, insbesondere Xanthomonas campestris, hergestellt wird. Dieses Xanthan-Heteropolysaccharid enthält Glucose, Mannose und Glucuronsäure. Verschiedene industrielle Anwendungen von Xanthan-Gummi sind bekannt, siehe z.B. US-P Nr. 3,326,305 und 4,244,826.
- Eine andere, häufig benutzte Klasse von Heteropolysacchariden sind die Succinoglucane, eine Klasse von exozellularen Heteropolysacchariden, welche von den Bakterien der Art Alcaligenes, Agrobacterium und Pseudomonas gebildet werden. Diese Succinoglucane enthalten Galactose, Glucose und verschiedene Anteile von sauren Gruppen wie Pyruvate, Succinate und Acetate. Industrielle Verwendungen für diese Succinoglucane sind ebenfalls bekannt, siehe beispielsweise Europäisches Patent Nr.040 445 und US-P Nr.4,339,239, 4,347,289 und 4,298,795.
- In einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein Heteropolysaccharid gerichtet, welches die Bezeichnung 35-80 hat, und hergestellt wird durch Vermehren von Agrobakterium Spezies ATCC 55341 in einem wäßrigen Medium unter aerober Fermentation einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle, wobei dieses Heteropolysaccharid die neutralen Zucker Glucose und Galactose in dem ungefähren molaren Verhältnis von 7:1 enthält, wobei das Heteropolysaccharid frei von Uronsäurederivaten ist.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Heteropolysaccharid charakterisiert durch eine Stabilität über einen pH-Bereich von ca. 2 bis ca. 12.
- Vorzugsweise ist das Heteropolysaccharid stabil gegen Basen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und kaustischen Lösungen dieser Basen.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Heteropolysaccharide imstande Gele zu bilden durch Quervernetzung mit einem polyvalenten Metallkation. Bevorzugte polyvalente Metallkationen, die imstande sind, die Heteropolysaccharide quer zu vernetzen, sind Titan(IV), Aluminium(III) und Chrom(III).
- Bevorzugte industrielle Anwendungen der Heteropolysaccharide sind diejenigen als Verdicker von sauren und kaustischen Reinigungslösungen.
- Figur 1 zeigt die pH-Stabilität des Heteropolysaccharids 35-80 Figur 2 zeigt die kaustische Stabilität von Heteropolysaccharid 35-80.
- Die Agrobakterium-Spezies, welche das Heteropolysaccharid 35-80 erzeugt, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche in El Coego, Honduras, gefunden wurde.
- Das Heteropolysaccharid, welches durch Agrobakterium Spezies ATCC 55341 gebildet wird, besteht im Prinzip aus einem Kohlehydrat mit ca. 5,9 % substituierenden Pyruvatgruppen, 8,4 % Succinatgruppen und 0,32 % Acetatgruppen. Der Kohlenwasserstoffteil besteht aus Glucose und Galactose im ungefähren Verhältnis von 7:1. Diese Mischung ist charakteristisch für Succinoglucane.
- Um die Mischung zu bestimmen, wird das gereinigte Polymer hergestellt durch 20faches Verdünnen einer Brühe mit destilliertem Wasser, Entfernen der Zellen durch Zentrifugieren bei 18000 x g während 30 Minuten, Zufügen von 0,1 % Natriumchorid und Präzipitieren des Polymers durch Zufügen von 3 Volumenteilen Isopropanol bezogen auf das Volumen der verdünnten Polymerlösung. Das Polymerpräzipitat wird durch Filtration abgetrennt, über ein 149 µm (100 Mesh) Sieb und Waschen durch Umpumpen in 100 ml eines 70 %igen Isopropanols gefolgt durch Filtern über ein 149 µm (100 Mesh) Sieb. Das Material wird gesammelt und durch Lyophilisieren getrocknet, bis zu einem konstanten Gewicht (ca. 48 Stunden). Das Polymer wird mit 2 M Trifluoressigsäure (TFA) hydrolysiert durch Auflösen von 10 mg des gereinigten Polymers in 2 ml destilliertem Wasser, Zufügen von 2 ml von 4 M TFA und Erhitzen der Lösung in einer versiegelten Glasampulle während 4 Stunden bei 120 ºC. Das TFA wird durch Verdampfen unter Vakuum bei Raumtemperatur über Natriumhydroxid über Nacht entfernt. Spuren von TFA werden durch zweimaliges Auflösen des Rückstandes in destilliertem Wasser und erneutem Eintrocknen unter Vakuum entfernt. Neutrale Zucker und Uronsäure werden versuchsweise durch absteigende Papierchromatograhie auf Whatman 3MM Papier identifiziert. Das Chromatogramm wird entwickelt unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, welches aus Butanol, Eisessig und Wasser in den Volumenverhältnissen von 6:4:3 besteht. Die Chromatogramme werden luftgetrocknet und mit einer Lösung behandelt, die hergestellt wird durch Vermischen von 0,1 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Silbernitrat mit 20 ml Aceton. Zucker und Uronsäure reagieren mit Silbernitrat und ergeben grau bis schwarze Flecken, abhängig von der Konzentration. Die Flecken werden identifiziert durch Chromatographie von Zucker und Uronsäure als Standard. Die Lage der Flecken ist in Übereinstimmung mit einer Mischung aus Glucose und Galactose. Es waren keine Flecken von Uronsäure vorhanden. Zucker in dem Hydrolysat werden weiterhin identifiziert und quantifiziert durch Gasflüssigkeitschromatographie der Alditolacetatderivate (Hisamatsu et al., Carbohydr. Res., 61, 89 (1978)). Das Verhältnis von Glucose zu Galactose wird im ungefähren Verhältnis von 7:1 erhalten. Organische Säuresubstituenten des Polymers 35-80 werden bestimmt nach ihrer Abspaltung durch milde saure Hydrolyse (2N Schwefelsäure, 100 ºC, 60 Minuten) gemäß dem Verfahren von Hisamatsu et al., 1978, Sudra. Die Trennung wird durchgeführt durch isokratische Kationenchromatographie (Biorad Aminex HPX- 87H) unter Verwendung einer mobilen Phase von 0,01 3N Schwefelsäure mit UV Detektion bei 206 nm. In zwei getrennten Analysen war Pyruvat in 5,9 %, Succinat in ca. 8,4 % und Acetat in ca. 0,32 % enthalten.
- Das Polymer 35-80 ist ein viskositätsbildendes Mittel für wäßrige Medien über einen weiten pH-Bereich von 0 bis 12. Dieses läßt eine Nutzung als Verdickungsmittel vermuten in einer Vielzahl von sauren und kaustischen Medien, insbesondere kaustischen Reinigern. Weiterhin bildete es starke Gele mit einer Anzahl von multivalenten Metallkationen einschließlich Aluminium, Chrom und insbesondere Titan, welche es nützlich machen für Anwendungen in Luftreinigern, als Gelierungsmittel für Öl-Feld-Anwendungen und für persönliche Körperpflegeprodukte wie Deodorantien.
- Fermentationsverfahren zur Herstellung von Heteropolysaccharid 35-80
- Agrobakterium Spezies ATCC 55341 wächst gut in einem Medium wie es in Tabelle 1 beschrieben ist. Das selbe Medium mit geringen Varianten, wie beschrieben, wird zur Stammkulturherstellung für die Fermentation und für das Endstadium des Fermentationsmediums verwendet. Tabelle 1
- Die Inhaltsstoffe werden in destilliertem Wasser gelöst oder suspendiert und durch Autoklavieren für 30 Minuten bei 121 ºC sterilisiert. Nach dem Abkühlen auf 50 ºC wird das Agarmedium in Petrischalen verteilt. Kolonien von Agrobakterium Spezies ATCC 55341 werden nach einem Wachstum von 3 Tagen bei 30 ºC weiß, erhaben und mukoid.
- Das Medium ist das gleiche, wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, mit der Ausnahme, daß Agar weggelassen wird. Das Medium wird hergestellt und verteilt (100 ml Medium in jeweils 300 ml Flaschen). Die Flaschen werden sterilisiert durch Autoklavieren für 30 Minuten bei 121 ºC. Nach dem Kühlen werden die Flaschen mit einer Schlinge voll einer 3 Tage alten Kultur der Agarplatte inokuliert. Die Flaschen werden bei 30 ºC unter Schütteln bei 200 Upm während 24 Stunden inkubiert und 1 ml in jede neue Saatflasche überführt ((2. Inokulationsstadium) in identischen Mischungen und Volumen) welches unter Schütteln bei 30 ºC für 48 Stunden inkubiert wird.
- Das Medium war das gleiche, wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, außer daß Agar weggelassen wird und CaCO&sub3; auf 0,5 % aufgestockt war. Das Medium wird hergestellt wie unten beschrieben und in einen 15 l New-Brunswick-Fermenter überführt. Inhaltsstoffe für 10 l des Mediums (mit Ausnahme von Glucose) werden in 8,5 l destilliertem Wasser hergestellt. Der Fermenter-Inhalt wird sterilisiert durch Autoklavieren bei 121 ºC für 1 Stunde. 11 einer 40 %igen Glucoselösung wird getrennt sterilisiert bei 121 ºC für 1 Stunde und aseptisch dem Fermenter zugefügt. Der Fermenter wird mit 0,5 l Inokulum des 2. Stadiums inokuliert. Die Fermentationstemperatur wird auf 30 ºC gehalten und die Luftzufuhr bei 3 l/min. Der pH wird bei 7,5 während der Fermentation gehalten durch Zufügen von Natriumhydroxid unter Verwendung einer pH-Kontrolle. Die ursprüngliche Bewegungsgeschwindigkeit war 300 Upm, was erhöht wurde auf 400 Umdrehungen pro Minute und 500 Upm nach 24 bzw. 48 Stunden. Die Fermentation wird nach 72 bis 96 Stunden beendet. Die Brühenviskosität wird mit einem Brookfield-Modell LVT-Viskosimeter unter Verwendung einer Nr.4 Spindel bei 6 Upm gemessen und lag zwischen 25 und 35 Pa.s (25.000 bis 35.000 Centipoise). Die Fermenterbrühe wird konserviert durch Zufügen von 3000 ppm Formaldehyd. Die Polymerkonzentration wird zu 2 % bestimmt mittels Isopropanolfällung aus einem Präparat, welches zur Entfernung von Zellen geklärt ist. Die Viskosität einer 2850 ppm Lösung der Brühe in 500 ppm NaCl beträgt 0,410 Pa.s (410 Centipoise) bei 5,1 sec&supmin;¹ unter Verwendung eines Fann Model 35A Viskosimeters und eines B-1 Schwimmers mit einem R-1 Rotor.
- Das Isolat wird als Agrobakterium radiobacter, Biovariation I identifiziert.
- Morphologie: Die Zeilen sind Gram-negativ, aerob, nicht sporenbildend, mit beweglichen Auswüchsen, haarförmigen Geißeln. Die Kolonien sind vollständig, glatt, glänzend, durchscheinend und cremefarben. Physiologie und Biochemie (Fortsetzung) Physiologie und Biochemie Fermentative Oxidation zur Reaktion in Hugh & Leifson's Medium: Einzige Kohlenstoffquelle in Stanier's Mineralbasis
- Phytopathogenitätsteste werden durchgeführt auf Scheiben von frischen Karotten. Tumore oder haarige Wurzeln wurden nicht gebildet. Dies ist typisch für Agrobakterium radiobacter, Biovariation I.
- Das Biopolymer 35-80 zeigt ein relativ flaches Viskositätsprofil über einen weiten pH-Bereich von 2 bis 12 (Figur 1). Dieses deutet darauf hin, daß das Biopolymer 35-80 geeignet ist zum Verdicken einer Vielzahl von sauren und kaustischen Medien. Ein besonders wichtiges Beispiel, welches eine ausgezeichnete Stabilität in 1 %iger kaustischer (NaOH) zeigt ist in Figur 2 wiedergegeben. In jedem der obigen Fälle werden die Lösungen hergestellt in einem Waring -Mischer durch langsame Zufügung des Biopolymers in einen Wirbel (aufrechterhalten durch kontinuierliche Anpassung der Mischspannung mit einem Rheostat) von Verdünnungswasser (enthalten den entsprechenden pH-Puffer bzw. Natriumhydroxid) gefolgt durch 2 Minuten zerteilen bei 50 Volt. Die Viskosität der erhaltenen Lösungen wird mit einem Brookfield LVTD-Viskosimeter gemessen, unter Verwendung eines Kleinmengenadapters (SSA) und einer Nr.18 Spindel bei 6 Upm.
- Von dem Biopolymer 35-80 wurde ebenfalls gezeigt, daß es ausgezeichnete, starke Gele mit einer Anzahl von multivalenten Metallkationen als Quervernetzer bildet, welche Aluminium, Chrom und Titan umfassen. Besonders gute Gele werden hergestellt mit Titanquervernetzern, wie es in Tabelle 2 beschrieben ist. In jedem Fall werden die Gele gebildet durch schnelles Verbinden des Biopolymers 35-80 und Quervernetzerlösungen.
- Die Biopolymerlösung wird hergestellt durch Auflösen einer entsprechenden Menge in Wasser, welches 500 ppm gesamt gelöste Feststoffe (TDS) enthält (salzhaltige Lösung). Eine Standard Waring -Mischer Lösungsmethode erfordert eine langsame Biopolymer Zugabe in einen Lösungswasserwirbel (aufrechterhalten durch kontinuierliche Anpassung der Mischerspannung mit einem Rheostat) gefolgt durch 2 minütiges Zerteilen bei 50 Volt. Fabrikmäßig hergestellte Versuchsvernetzerlösungen, welche ca. 10 % aktive Kationen enthalten, werden entweder direkt (bespielsweise Ti&spplus;&sup4;-Gele) verwendet oder verdünnt mit einem Gelatisierungsmittel, um die Gelbildungsrate und Synerese (beispielsweise 0,3 bis 1 Mol Citrat pro Mol Al&spplus;³) zu kontrollieren. Quervernetzer werden schnell zugefügt (5 Sekunden mit Zerteilungen bei 70 Volt) zu der Biopolymerlösung und 40 g Anteile werden unmittelbar in 60 ml Nalgene -Tassen gegossen. Nach 24 und 48 Stunden Beruhigungszeit werden die Gelstärken mit einem modifizierten Bloom- Gelometer gemessen. Dieser Test besteht darin, die Gelproben auf einer geteerten Digitalwaage zu plazieren und das flache Ende eines Präzisionsstempels aus Edelstahl, mit Standard-Durchmesser (1,3 cm), in das Zentrum der Geloberfläche mit einer konstanten Rate (2 mm/min.) einzupressen und den Gelwiderstand gegenüber der angewendeten Kraft (als Änderung des Gelgewichts auf der Digitalwaage) zu messen, bis die Geloberfläche bricht. Die Modifikation gegenüber dem Standard Bloom-Gelometer liegt in der Verwendung einer Sage Modell 355 Spritzpumpe, um den Stempel hydraulisch, mit einer sehr sorgfältig kontrollierten Geschwindigkeit anzutreiben, und um einen höheren Durchbruchsdruck (200 g/cm²) aufzubauen, welcher durch diese ungewöhnlich starken Gele erforderlich ist. Tabelle 2
Claims (8)
1. Heteropolysaccharid, bezeichnet als Biopolymer 35-80, hergestellt durch das
Verfahren, Agrobacterium Spezies ATCC 55341 in einem wäßrigen Medium
durch aerobe Fermentation einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle zu züchten,
wobei die Heteropolysaccharide die neutralen Zucker Glucose und Galactose in
einem ungefähren molaren Verhältnis von 7:1 enthalten und die
Heteropolysaccharide frei sind von Uronsäurederivaten.
2. Heteropolysaccharide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Lösungsviskosität in einem pH-Bereich von ungefähr 0 bis ungefähr 12 stabil
ist.
3. Heteropolysaccharide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie
stabil sind gegenüber Basen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid.
4. Polysaccharid gemäß Anspruch 1, welches in der Lage ist, Gele zu bilden
durch Quervernetzung mit polyvalenten Metallkationen, ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Ti (IV), Al (III) oder Cr (III).
5. Eine alkalische Reinigungslösung, weiche eine für das Verdicken ausreichende
Menge des Biopolymers 35-80 gemäß Anspruch 1 enthält.
6. Eine saure Reinigungslösung, weiche eine verdickende Menge des
Biopolymers 35-80 gemäß Anspruch 1 enthält.
7. Ein Verfahren zur Herstellung eines Heteropolysaccharids bezeichnet als
Biopolymer 35-80, enthaltend die neutralen Zucker Glucose und Galactose im
ungefähren molaren Verhältnis von 7:1, wobei das genannte
Heteropolysaccharid frei von Uronsäure-Derivaten ist, dadurch gekennzeichnet, daß das
Agrobakterium, Spezies ATCC 55341, in einem wässrigen Medium unter
aerober Fermentation einer assimilierbaren Kohlenstoff Quelle wächst.
8. Einen Mikroorganismus, der die das Agrobakterium ATCC 55431
kennzeichnenden Merkmale aufweist.
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