DE60006511T2

DE60006511T2 - Durch pseudomonas sp hergestellte heteropolysaccharide

Info

Publication number: DE60006511T2
Application number: DE60006511T
Authority: DE
Inventors: Sophie Vaslin; Alain Senechal; Paule Chevallereau; Jean-Luc Simon; Robert Cantiani
Original assignee: Rhodia Chimie SAS; Rhone Poulenc Chimie SA
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2020-04-11
Also published as: US7078198B1; CA2370194A1; EP1173601B1; AU3827000A; FR2792337B1; ATE254182T1; WO2000063412A1; JP2002542385A; ES2211525T3; EP1173601A1; BR0009789A; JP3734711B2; PT1173601E; CA2370194C; DE60006511D1; CN1353766A; FR2792337A1; CN1238517C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Heteropolysaccharid (HP), dessen Herstellungsverfahren durch Fermentation eines Stamms Pseudomonas sp I-2054 (oder OSM 12295, diesen Stamm, und die Anwendungen dieses Heteropolysaccharids als Verdickungsmittel und/oder Geliermittel.
In zahlreichen industriellen Bereichen wird unentwegt nach neuen Verbindungen geforscht, die folgendes aufweisen:

verbesserte Theologische Eigenschaften und die fähig sind, Gele zu bilden,
verstärkte Kompatibilität mit den Medien, in denen sie inkorporiert sind,
eine gute Stabilität in einem breiten Temperatur- und pH-Bereich.

Im Fall von Verbindungen, die aus einer bakteriellen Fermentation erhalten werden, ist es gleichfalls von Bedeutung, dass die Verbindung eine gute Produktivität aufweist.
Die Gelierfähigkeit ist von besonderem Interesse, da es sich aufgrund der Vielfalt von Bereichen, in denen sie angewendet werden können, um besonders ansprechende Systeme handelt: bestimmte Anwendungen erfordern den Einsatz eines Gels.
Die Lebensmittelindustrie beispielsweise stellt ein breites Angebot von gelierten Produkten bereit (Cremes, Joghurt, diverse Gele, Eis), die pharmazeutische Industrie setzt Gele als Träger für Wirkstoffe oder als Verdickungsmittel ein.
In einem ganz anderen Bereich gibt es Anstriche, die nicht tropfen, da sie im Ruhezustand Gelcharakteristiken aufweisen, während sie unter der Einwirkung des Pinsels leicht aufgetragen werden können (rheofluidisierendes Profil).
Wässrige Gele werden auch als Chromatographieträger oder des weiteren zur Herstellung von Kontaktlinsen eingesetzt.
Heteropolysaccharide bakteriellen Ursprungs wie z. B. Xanthangummi sind bereits beschrieben worden und aufgrund ihren rheologischen Eigenschaften, die sie unter extremen Temperatur- und pH-Bedingungen aufweisen, verwendet worden.
Ferner können die Heteropolysaccharide genannt werden, die in der EP 410 604 und der EP 534 855 beschrieben sind, die aus der Fermentation von zwei unterschiedlichen pseudomonas sp-Stämmen extrahiert sind und die als Viskositätsmittel und Verdickungsmittel beschrieben wurden.
Jedoch führen diese Heteropolysaccharide, die sich für Anwendungen in Lösung eignen, nicht immer zu Gelen.
Es ist bekannt, dass die Gelierung eines Mediums stattfindet, wenn sich ein dreidimensionales Netz nach Vernetzung der Komponenten des Mediums bildet.
Üblicherweise wird diese Gelierung durch Zusatz von zusätzlichen Kationen zum Medium durchgeführt, insbesondere vom Typ Alkali oder Erdalkali (z. B. Calcium und/oder Magnesium), durch pH-Schwankung in Richtung saure oder basische pH-Werte, durch Zusatz einer weiteren Verbindung, insbesondere eines weiteren Polysaccharids (z. B. die Verbindung von Xanthan und Johannisbrot), oder durch Modifikation der Temperatur.
Die vorgenannten Gelbildungsbedingungen können unabhängig von der geplanten Anwendung:

– der Stabilität und der Kompatibilität des finalen Gels schaden, aufgrund von Wechselwirkungen zwischen den zusätzlichen Kationen oder des Coadditivs, das eingeführt werden muss, um das Gel zu erhalten und den weiteren Bestandteilen, die in den Zusammensetzungen vorliegen, oder
– das Heteropolysaccharid und/oder die weiteren Bestandteile, die in den Zusammensetzungen vorliegen, aufgrund der erhöhten Temperaturen und/oder der pH-Änderungen denaturieren.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet man als "Gel" einen Pseudofeststoff (Verhalten nahe zu einem Feststoff), was sich aus der zumindest teilweisen Assoziation der Heteropolysaccharidketten ergibt, die in einer Flüssigkeit dispergiert sind. In einem Bereich von Spannungsfrequenzen ω werden die pseudo-festen Gele üblicherweise im Hinblick auf ihren Feststoffbestandteil über ein Elastizitätsmodul G'(ω), auch als Erhaltungsmodul bezeichnet, und im Hinblick auf ihren flüssigen oder viskosen Bestandteil über ein Viskositätsmodul G"(ω) gekennzeichnet, auch als Verlustmodul bezeichnet.
Die mechanischen Größen G'(ω) und G"(ω) können mittels einem Rheometer mit angelegter Deformation, der im Oszillationsmodus arbeitet, gemessen werden. Als nicht beschränkendes Beispiel kann z. B. ein Rheometer Rheo-Fluid Spectrometer^® genannt werden.
G' und G" können auch mittels einem Rheometer mit angelegtere Spannung, der im Oszillationsmodus arbeitet, gemessen werden. Als Beispiel kann beispielsweise ein Rheometer CARRIMED^® genannt werden.
Das Prinzip der Messung besteht darin, in einem ersten Schritt den Bereich der reversiblen mechanischen Deformation zu bestimmen, in welchem die Reaktion des Gels auf mechanische Spannung in Funktion zur Deformation linear ist. In einem zweiten Schritt wird das Gel einem festen Wert der mechanischen Verformung unterworfen, der in dem vorherbestimmten linearen Bereich liegt. Anschließend nimmt der Rheometer eine Frequenzabtastung (ω) vor.
Die Reaktion des Gels auf Spannung, in Phase mit der Deformation, eröffnet den Zugang zum Elastizitätsmodul G'(ω). G'(ω) entspricht der durch das Gel in elastischer Form gespeicherten Energie und ist wiedergewinnbar.
Die Reaktion des Gels auf Spannung in Phasenverschiebung mit der Deformation um einen Winkel 90° eröffnet den Zugang zum Viskositätsmodul G"(ω). G"(ω) entspricht der Energie, die durch das viskose Fließverhalten abgeführt wird und ist nicht wiedergewinnbar.
Ein Gel wird als stark oder wirklich bezeichnet, wenn im gesamten Bereich der abgetasteten Spannungsfrequenz (ω) das Verhältnis G'/G" größer oder gleich 10 ist, d. h. wenn die Elastizität des Gels stark bleibt und wenn der Wert von G'(ω) größer oder gleich 10 Pa ist.
Die vorliegende Erfindung hat gerade die Aufgabe, Heteropolysaccharide bereitzustellen, die sehr gute rheologische Eigenschaften aufweisen, insbesondere im Hinblick auf die Verdickungseigenschaften und pseudoplastischen Eigenschaften (rheofluidisierende Eigenschaften) wie auch die Fähigkeit, zu wirklichen Gelen zu führen, ohne den Zusatz von zusätzlichen Kationen zum Medium, ohne pH-Schwankungen und bei Temperaturen unterhalb oder gleich 40°C.
Des weiteren hat die vorliegende Erfindung die Aufgabe, ein Heteropolysaccharid bereitzustellen, das bei niedrigen Konzentrationen sehr gute rheologische Eigenschaften aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Heteropolysaccharid (HP), dadurch gekennzeichnet, dass es durch Fermentation eines Mediums erhalten werden kann, welches wenigstens einen Stamm Pseudomonas sp I-2054 (oder DSM 12295), eine der Rekombinanten davon oder der Mutanten davon und eine Kohlenstoffquelle, die durch den Stamm, einer der Rekombinanten davon oder einer der Mutanten davon assimiliert werden kann, umfasst.
Der Stamm Pseudomonas sp wurde in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag hinterlegt, bei der "Collection Nationale de Culture des Micro-organismes (CNCM), am 22. Juli 1998, wo er unter der Nr. I-2054 öffentlich zugänglich ist. Er wurde gleichfalls bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) hinterlegt, am 13. Juli 1998, wo er unter der Nr. DSM 12295 öffentlich zugänglich ist. Dieser Stamm stellt einen der Gegenstände der Erfindung dar.
Die Reinkultur von Pseudomonas sp I-2054 (oder DSM 12295, die einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellt, kann in Petrischalen durchgeführt und bei einer Temperatur inkubiert werden, die zwischen 25°C und 30°C liegt, und die insbesondere zwischen 25°C und 28°C liegt, während ungefähr 24 Stunden.
Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die durch Pseudomonas sp I-2054 (oder DSM 12295 assimiliert werden, können ausgewählt werden aus Glukose, Fructose, Galactose, Trehalose, Mannose, Melobiose, Saccharose, Raffinose, Maltotriose, Maltose, Lactose, Lactulose, Methyl-β-galactopyranosid, Methyl-α-galactopyranosid, Cellobiose, Gentobiose, Methyl-β-D-glucopyranosid, Methyl-α-D-glucopyranosid, Esculin, Ribose, Arabinose, Xylose, Palatinose, Rhamnose, Fucose, Melezitose, D(+)-Arabitol, L(–)-Arabitol, Sylitol, Dulcitol, Tagatose, Glycerol, Myo-Inositol, Mannitol, Maltitol, Turanose, Sorbitol, Adonitol, Lyxose, Erythritol, D(–)-Tartrat, D(+)-Malat, L(–)Malat, cis-Aconitat, trans-Aconitat, 2-Keto-D-gluconat, N-Acetyl-glucosamin, Quinat, Betain, Succinat, Fumarat, Glycerat und Glucosamin.
Unter den möglichen Haltungsmedien des Stamms wird das Haltungsmedium vom Typ MY Agar von Difco (Referenz 0712-01-8) als besonders geeignet angesehen. Dieses Medium MY Agar von Difco weist die folgende Zusammensetzung auf:
Für die Konservierung des Stamms ist es vorteilhaft, wenigstens einen Vorkulturschritt vorzusehen. Unter dem Schritt der Vorkultur versteht man einen Schritt, der darin besteht, den Bakterienstamm zu entwickeln und zu multiplizieren, ohne Produktion von Polysaccharid.
Es konnte gezeigt werden, dass allgemein das Heteropolysaccharid (HP) Motive von Glukose und/oder deren Derivate, Galactose und/oder deren Derivate, Mannuronsäure und/oder deren Salze, Essigsäure und/oder deren Salze umfasst.
Die Motivbestandteile des Heteropolysaccharids (HP) liegen üblicherweise in den folgenden Molverhältnissen vor, wobei als Referenz Galactose gleich 1 verwendet wird:

– Glukose und/oder deren Derivate 0,2 – 5,
– Mannuronsäure und/oder deren Salze 0,2 – 5,
– Essigsäure und/oder deren Salze 0 – 10.

Die Motive sind insbesondere in den folgenden Molverhältnissen vorliegend, wobei als Referenz Galactose gleich 1 verwendet wird:

– Glukose und/oder deren Derivate 0,5 – 4, und bevorzugt 0,8 – 2,
– Mannuronsäure und/oder deren Salze 0,5 – 4, und bevorzugt 0,8 – 2,
– Essigsäure und/oder deren Salze 0 – 8, und bevorzugt 0 – 6.

Die Mannuronsäure und die Essigsäure können in Form von Salzen vorliegen. Als Salze können Natriumsalze, Kaliumsalze, Calcium- oder Ammoniumsalze aufgeführt werden.
Die Analysemethoden des Heteropolysaccharids (HP), die die Bestimmung der wie vorstehend definierten Formel ermöglicht haben, weisen als Prinzip die Bestimmung der konstituierenden Elemente (Monosaccharide und Säuren) nach Hydrolyse des Heteropolysaccharids (HP) und chromatographische quantitative Analyse durch interne oder externe Eichung auf.
Die quantitative Analyse der Monosaccharide wurde somit auf folgende Art und Weise durchgeführt: 100 mg Heteropolysaccharid (HP) werden in dicht verschlossenen Röhrchen mittels 5 ml molarer Trifluoressigsäure bei 105°C während 3 bis 6 Stunden hydrolysiert.
Dieser Vorgang wird von einer Eindampfung bis zur Trockene und der Wiederaufnahme des trockenen Rückstands in 5 ml Pyridin, das 15 mg Sorbitol als internen Standard enthält, gefolgt, anschließend erfolgt eine Silylierung von 1 ml der Pyridinlösung durch 0,9 ml Hexamethyldisilazan. Die Silylierung wird durch 0,1 ml Trifluoressigsäure katalysiert.
Die quantitative Analyse der Monosaccharide wird anschließend durch Gasphasenchromatographie mit F.I.D.-Detektion durchgeführt (Flame Ionisation Detection), auf einer Glaskapillarsäule mit einer Länge von 25 m und einem Durchmesser von 0,25 mm, die mit einer Methylsilicon-Phase beladen ist, mit einer Filmdicke von 0,14 μm. Das verwendete Trägergas ist Wasserstoff, mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/Minute.
Die quantitative Analyse von Essigsäure findet nach der Hydrolyse von 100 mg Heteropolysaccharid (HP) durch 5 ml Chlorwasserstoffsäure 2N bei 105°C während 1 Stunde statt. Anschließend werden 5 ml einer Propionsäurelösung mit 5 mg/ml als internen Standard zugefügt und es wird mit 15 ml deionisiertem Wasser aufgefüllt. Die quantitative Analyse wird durch HPLC auf einer Säule von Graft-Silica C-18 von 5 Mikrometer mit einer Länge von 250 cm und einem Durchmesser von 4,6 mm durchgeführt. Das Elutionsmittel ist eine wässrige Lösung von Phosphorsäure 0,02 Mol/l mit einer Geschwindigkeit von 1,2 ml/Minute. Die Detektion wird refraktometrisch durchgeführt.
Die Mannuronsäure wird über das Zwischenprodukt CO₂ quantitativ analysiert, das bei der Decarboxylierung freigesetzt wird, infolge einer Wärmebehandlung des Gummis mit Chlorwasserstoffsäure gemäß der im Food Chemical Codex, 4. Ausgabe, Seite 768 beschriebenen Methode.
Die Gewichts-Molekülmasse wird mittels Ausschlusschromatographie auf den Säulen TSK PW 4000 und 6000 in Serie durchgeführt (Säulen mit einer Länge von 30 cm und einem Durchmesser von 7 mm), mit refraktometrischer Detektion. Das Elutionsmittel ist eine Lösung von Natriumnitrat 0,1 Mol/l. Das Heteropolysaccharid liegt in ungefähr 0,015 Gew.-% im Elutionsmittel vor. Die Eichung erfolgt mit Pullulanen, das sind monodisperse Polysaccharide mit Molekülmassen, die zwischen 5·10³ und 1,6·10⁶ g/Mol liegen, extrapoliert bis 10⁷ g/Mol.
Die Gewichtsmittel-Molekülmasse (Mw) wird ausgehend von der Massenverteilungskurve erhalten, die aus dem Chromatogramm hervorgeht; sie liegt üblicherweise zwischen 1·10⁵ und 8·10⁶ g/Mol, bevorzugt zwischen etwa 8·10⁵ und 5·10⁶ g/Mol.
(HP) weist insbesondere eine Gewichtsmittel-Molekülmasse (Mw) auf, die zwischen 2,5·10⁶ und 4·10⁶ g/Mol liegt, wobei die Grenzen eingeschlossen sind.
Wie bereits angegeben, weist (HP) sehr gute rheologische Eigenschaften in Lösung auf, insbesondere in destilliertem Wasser oder Leitungswasser.
So konnte festgestellt werden, dass beispielsweise Lösungen mit 0,5 % Gewicht/Gewicht (HP) in destilliertem Wasser bei 23°C und bei einer Frequenz von 1 Hz zu G'-Werten, die zwischen 0,1 und 200 Pa liegen, und zu G"-Werten, die zwischen 0,1 und 20 Pa liegen, führen.
(HP) führt zu starken und wirklichen Gelen, wenn die Werte von G' und G" vorzugsweise zwischen 20 und 200 Pa für G' und zwischen 0,5 und 15 Pa für G" liegen. Noch bevorzugter liegt G' zwischen 20 und 150 Pa und G" zwischen 0,5 und 10 Pa. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der G'-Wert ungefähr 100 Pa und der G"-Wert ungefähr 5 Pa (in destilliertem Wasser).
Das (HP) verleiht dem wässrigen Medium eine Viskosität, die durch die Fließrheologie bestimmt wird. Die rheologischen Messungen der Fließviskosität werden mittels einem Rheometer mit angelegter Spannung oder einem angelegten Schergradienten durchgeführt, wie z. B. mittels einem Viskosimeter vom Typ RHEOMAT^® oder CARRIMED^®.
In beiden Fällen misst die Vorrichtung die Spannung beim Fließen der Mischung HP + Wasser, wenn die Mischung irreversibel deformiert wird. Ausgehend von der Spannung wird die Fließviskosität berechnet.
Diese Vorrichtung ermöglicht folglich die Quantifizierung des Viskositätsniveaus bei einem gegebenen Schergradienten.
Die Fließviskosität kann noch einfacher mit Hilfe eines Viskosimeters BROOKFIELD^® bestimmt werden.
Diese rheologischen Messungen der Fließviskosität von (HP) ermöglichen ferner die Bestimmung der Fließgrenze der Lösung von (HP) und/oder der dieses enthaltenden Formulierung. Diese Schwelle stellt die Kraft dar, die zum Zerstören der Struktur des Mediums und zum Fließen des Mediums erforderlich ist.
Die Fließrheologie ermöglicht des weiteren die Quantifizierung der Neigung zum Fließen einer Lösung von (HP) und/oder einer HP-enthaltenden Formulierung, wenn die angelegte Scherkraft ansteigt (pseudoplastisches oder rheofluidisierendes Verhalten).
Es wurde beispielsweise festgestellt, dass 1%ige Lösungen in Gewicht/Gewicht HP in destilliertem Wasser, das 0,5 Gew.-%/Gewicht NaCl enthält, bei 23°C zu Fließviskositäts-Werten bei einem Schergradienten von 0,1 s^–1 führen, die zwischen 100 und 5000 Pa·s liegen, und insbesondere zwischen 200 und 2000 Pa·s.
Unter ähnlichen Bedingungen lagen die Werte bei einem Schergradienten von 10 s^–1 zwischen 0,5 und 300 Pa·s, und insbesondere zwischen 5 und 150 Pa·s.
Diese Angaben zur Fließrheologie sind für das Verhalten der Formulierung während der Mastikation, dem Umfüllen, der Quellung etc. repräsentativ.
Die durch Einbau von (HP) in das Medium erhaltenen Gele sind heilende Gele Igels cicatrisants), d. h. dass selbst nach einer starken Scherung die "frakturierten" Gele die Fähigkeit aufweisen, sich zurückzubilden und zu ihren Ausgangseigenschaften zurückzufinden.
Die Heilungsfähigkeit der ausgehend von (HP) erhaltenen Gele wird mittels Kompressometrie-Messungen bestimmt, die beispielsweise auf einem Texturant ETIA T2 durchgeführt werden, aufgebaut aus einem Körper mit zylindrischer Form mit einem Durchmesser von 12,7 mm, einer Penetrationsgeschwindigkeit von 0,05 mm/s und einer Eindringtiefe von 15 mm. Der Kolben wird mehrere Male an der gleichen Stelle in das Gel eingetaucht, in unterschiedlichen Zeitintervallen, und man registriert die Kompressionskraft. Der Anfangsverlust wird bestimmt, ausgedrückt als mN/mm, repräsentativ für die Elastizität des Gels.
Beispielsweise wird ein Gel mit 0,5 % Gewicht/Gewicht (HP) in destilliertem Wasser hergestellt. Dieses Gel wird anschließend 24 Stunden gelagert, bevor die Kompressometrie-Messungen durchgeführt werden, sowohl bei Raumtemperatur (ungefähr 25°C) als auch im Kalten bei ungefähr 6°C.
Die Kompressometrie-Messungen werden in unterschiedlichen Zeitintervallen durchgeführt: 0, 5, 15 Minuten und 24 Stunden, mit einer Wartezeit von 5 Minuten zwischen jeder Messung.
So liegt der konstante Dauerverlust (pente demeure) bei ungefähr 45 ± 1 mN/mm, unabhängig von der Zeitmessung (t = 0, 5, 15 Minuten und 24 Stunden).
Dies bedeutet, dass die Elastizität des Gels stabil ist und dass das Gel die Fähigkeit aufweist, sich mehrmals hintereinander im Laufe der Zeit zu heilen, wobei die gleiche Gelstärke beibehalten wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Herstellung des wie vorstehend definierten Heteropolysaccharids (HP).
Das Verfahren zur Herstellung besteht zunächst aus der Fermentation eines Mediums, das wenigstens eine Kohlenstoffquelle enthält, die durch einen Stamm Pseudomonas sp I-2054 (oder DMS 12295), einer der Rekombinanten davon oder einer der Mutanten davon assimiliert werden kann.
Neben der assimilierbaren Kohlenstoffquelle kann das Fermentationsmedium ferner wenigstens eine organische oder anorganische Stickstoffquelle und gegebenenfalls ein oder mehrere anorganische Salze enthalten.
Das Medium wird auf klassische Art und Weise mit dem Stamm Pseudomonas sp I-2054 (oder DMS 12295) inokuliert.
Als Beispiele für organische Kohlenstoffquellen, die Bestandteil des Fermentationsmediums sind, können zusätzlich zu den vorstehend genannten Zuckern auch Zucker wie Amidon, vorzugsweise hydrolysiert, Amidonhydrolysate, Mischungen dieser Zucker und Mischungen, die wenigstens einen dieser Zucker enthalten, genannt werden.
Insbesondere kann Glukose, Saccharose, vorzugsweise hydrolysiertes Amidon, Amidonhydrolysate, Lactose, Mischungen dieser Zucker, und Mischungen, die wenigstens einen dieser Zucker enthalten, genannt werden. Glukose und Saccharose stellen noch bevorzugtere Zucker dar.
Die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Fermentationsmedium kann zwischen 1 und 100 g/l liegen, bevorzugt zwischen 15 und 60 g/l.
Als Beispiele für die organische Stickstoffquelle kann Casein und Caseinate, Fischhydrolysate, Weizenmehl, Maismehl oder Sojamehl, Hefeextrakte (Backhefe, Bierhefe, Milchhefe etc.), corn steap liquor (CSL), Harnstoff und Kartoffel-Proteine genannt werden.
Als Beispiele für anorganische Stickstoffquellen können Ammoniumnitrate oder Natriumnitrate, Ammoniumphosphate oder Ammoniumsulfate genannt werden.
Die Fermentation kann auch mit einer Mischung von organischen und anorganischen Stickstoffquellen stattfinden.
Die Konzentration der Stickstoffquelle (organisch, anorganisch, oder eine Mischung der beiden) in Fermentationsmedium kann zwischen 1 und 80 g/l liegen, und bevorzugt zwischen 3 und 50 g/l.
Vorzugsweise enthält das Fermentationsmedium Calcium, einzeln oder gegebenenfalls in Mischung mit weiteren Oligo-Elementen wie Eisen, Mangan und/oder Magnesium, wie auch Vitamine und Nukleotide.
Calcium kann in das Medium in Form einer anorganischen oder organischen Zusammensetzung oder Verbindung eingeführt werden, wie z. B. CSL, Sojamehl, Phosphat-, Nitrat-, Carbonat-, Sulfatsalze.
Die Fermentation kann bei Drücken, die zwischen 1 und 4 bar liegen, bei einer Temperatur, die zwischen 25°C und 35°C liegt, bevorzugt zwischen 25°C und 30°C, unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden.
Der pH des Fermentationsmediums kann zwischen 5 und 9 liegen, und bevorzugt zwischen 6 und 8. Der pH-Wert kann je nachdem mit einer Base wie Soda, Kalilauge oder Ammoniak oder mit einer Säure wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure oder Salpetersäure eingestellt werden.
Das Fermentationsmedium, das in einen Bottich oder einen Fermentationsbehälter eingeführt wird, kann vorzugsweise einem Schüttelvorgang (agitation) unterworfen werden. Dieses Schütteln kann beispielsweise mittels einem Reziprok-Schüttler, einem Drehschüttler, einem Rührmobil oder einer Blasensäule durchgeführt werden. Die Fermentationszeit liegt üblicherweise über 30 Stunden und allgemein zwischen 40 und 100 Stunden.
Die Ausbeuten der Fermentation sind im Allgemeinen über 40 %, insbesondere liegen sie zwischen 55 und 75 %, und ganz besonders zwischen 60 und 75 Gew.-% Heteropolysaccharid (HP)-Produkt, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle.
Nach der Fermentation kann das Heteropolysaccharid (HP) vom Fermentationsmost nach den folgenden Schritten entfernt werden:
i – man unterwirft den Endfermentationsmost einer thermischen Behandlung zwischen 80°C und 120°C während ungefähr 10 bis 60 Minuten,
ii – man fällt das Heteropolysaccharid (HP) mittels einer organischen Flüssigkeit, die wenigstens teilweise mit Wasser mischbar ist,
iii – man trennt das Heteropolysaccharid (HP) von der organischen Flüssigkeit.
Im Schritt (i) wird der Fermentationsmost, der das Heteropolysaccharid (HP) enthält, vorzugsweise auf Temperaturen erhitzt, die zwischen 80°C und 120°C liegen, während 10 bis 60 Minuten, und bevorzugt während 15 bis 45 Minuten.
Der der vorstehend angegebenen thermischen Behandlung unterworfene Most weist vorzugsweise einen pH auf, der zwischen 6 und 8 liegt.
Jedoch kann der pH gegebenenfalls je nachdem mit einer Base oder einer Säure eingestellt werden.
Diese können aus den Basen und Säuren ausgewählt werden, die wie vorstehend angegeben für die Einstellung des pH-Wertes des Fermentationsmediums eingesetzt werden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Most, der aus dem Schritt (i) erhalten wird, bei der gleichen Temperatur wie die Temperatur der thermischen Behandlung gehalten.
Im Schritt (ii) wird das Heteropolysaccharid (HP) aus dem Most, der aus dem Schritt (i) erhalten wird, vorzugsweise durch Ausfällung mittels einer organischen Flüssigkeit, die wenigstens teilweise mit Wasser mischbar ist, und in der das Heteropolysaccharid (HP) unlöslich oder praktisch unlöslich ist, wiedergewonnen.
Als Beispiele für geeignete Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung können Aceton oder Alkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, tert-Butanol oder deren Mischungen genannt werden.
Die Fällung des Heteropolysaccharids (HP) wird insbesondere mit Isopropanol vorgenommen.
Das Volumen der eingesetzten organischen Flüssigkeit beträgt üblicherweise wenigstens das Doppelte des Volumens des zu behandelnden Mostes.
Die Fällung des Heteropolysaccharids (HP) mittels einer organischen Flüssigkeit kann auch in Gegenwart von Salzen durchgeführt werden, wie Natrium-, Kalium- oder Calciumsulfate, -chloride oder -phosphate.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die Fällung bei einer Temperatur, die zwischen 40 und 60°C liegt, stattfinden.
Das einmal gefällte Heteropolysaccharid (HP) kann anschließend im Schritt (iii) von der organischen Flüssigkeit abgetrennt werden.
Die Trennungsmethode selbst ist nicht entscheidend und kann gleichweise zwischen den üblichen bekannten Trennmethoden ausgewählt werden, wie beispielsweise Filtration, Zentrifugation oder Schleudern.
Die erhaltenen Fasern können gegebenenfalls mit Aceton oder einem Alkohol wie Ethanol, Propanol oder Isopropanol entwässert werden.
Die Alkoholmenge, die benötigt wird, um diesen Entwässerungsvorgang vorzunehmen, liegt üblicherweise bei 1- bis 10-mal der Menge der zu behandelnden Fasern.
Die entwässerten Fasern können neuerlichen Filtrationsvorgängen, Zentrifugationsvorgängen oder Schleudervorgängen unterworfen werden.
Anderenfalls können die Fasern getrocknet, gemahlen und/oder gesiebt werden, um ein Heteropolysaccharid-(HP)-Pulver zu erhalten.
Wenn ein reineres Pulver erhalten werden soll, ist es möglich, entweder den Fermentationsmost oder eine wässrige Lösung, die ausgehend von dem nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen Pulver hergestellt wurde, mittels eines oder mehrerer Enzyme zu behandeln.
Als Beispiele für Enzyme, die sich für diesen Zweck eignen, können Proteasen, Mutanasen, Lipoproteasen, Cellulasen und Chitinasen genannt werden.
Die enzymatische Reinigung kann mit physikalischen Reinigungsverfahren verbunden oder durch diese ersetzt werden, wie verschiedene Arten der Filtration, Zentrifugation, Dialyse oder mittels unterschiedlicher chromatograpischer Techniken.
Die Fermentationsmoste und die aus Heteropolysaccharid (HP) gewonnenen Lösungen, die gegebenenfalls eine Reinigungsbehandlung erhalten haben, können konzentriert werden.
Die Konzentrierung kann in gewissen Fällen von Vorteil sein, insbesondere wenn die Transportkosten auf diese Weise vermindert werden können. Zudem können konzentrierte Lösungen rascher angewendet werden als Heteropolysaccharidpulver (HP).
Die Konzentrierung kann mittels aller dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt werden, insbesondere Verdampfung, Ultrafiltration oder Diafiltration.
Gemäß der vorliegenden Erfindung liegt das Heteropolysaccharid (HP) vorzugsweise in Form eines Feststoffs vom Typ Faser oder Pulver vor.
Wie bereits angegeben, weist (HP) sehr gute rheologische Eigenschaften auf und insbesondere die Fähigkeit, wirkliche Gele zu bilden. In Abhängigkeit der Fermentationsbedingungen, insbesondere in Abhängigkeit der Bestandteile und deren Konzentrationen in dem Kulturmedium, und/oder der Fällungsbedingungen im Schritt (ii) des Verfahrens (insbesondere, ob die Fällung in Gegenwart von Salzen vorgenommen wird oder nicht) weist (HP) den Vorteil auf, sowohl als Verdickungsmittel als auch als Geliermittel oder als beides verwendet werden zu können.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Heteropolysaccharids (HP), wie vorstehend beschrieben oder nach dem wie vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten, als Verdickungsmittel und/oder Geliermittel.
(HP) kann als Verdickungsmittel und/oder Geliermittel beispielsweise in der Erdölindustrie, der agrochemischen Industrie, der Nahrungsmittelindustrie, der chemischen Industrie, der Papierindustrie, der Textilindustrie wie auch in Anstrichen, Kontaktlinsen, Klebstoffen, Tinten und Haushalts- oder Industriereinigungsmitteln eingesetzt werden.
Die Menge an Heteropolysaccharid (HP) gemäß der Erfindung, die in kosmetischen Zusammensetzungen eingesetzt werden kann, ist eine Funktion des zu verdickenden und/oder zu gelierenden wässrigen Mediums. Diese kann von 0,01% bis ungefähr 5%, bevorzugt in der Größenordnung von 0,1% bis 0,3 Gew.-% des verdickten oder gelierten wässrigen Mediums betragen.
Unter dem Ausdruck kosmetische Zusammensetzung oder kosmetische Formulierung werden alle kosmetischen Produkte oder Präparationen vom Typ des oder derjenigen im Annex I ("Illustrative list by category of cosmetic products") der europäischen Richtlinie Nr. 76/768/CEE vom 27. Juli 1976, als Kosmetik-Richtlinie bezeichnet, beschriebenen verstanden.
Die kosmetischen Zusammensetzungen können in einer großen Vielzahl von Produkttypen für die Haut und/oder die Haare formuliert werden, wie Schäume, Gele (insbesondere zum Frisieren), Konditionierer, Formulierungen zum Frisieren oder zum Ermöglichen von Haartönungen, Pflegespülungen, Lotionen für die Hände und den Körper, Produkte, die die Feuchtigkeit der Haut regulieren, Toilettenmilch, Zusammensetzungen zum Abschminken, Cremes oder Lotionen zum Schutz gegen Sonne und Ultraviolettstrahlung, Pflegecremes, Anti-Aknepräparationen, lokale Analgetika, Wimperntuschen, Produkte, die auf die Lippen oder weitere Schleimhäute aufgetragen werden sollen, Sticks und weitere Zusammensetzungen vom gleichen Typ.
Diese kosmetischen Zusammensetzungen verwenden ein Vehikel, oder eine Mischung von mehreren Vehikeln, die in den Zusammensetzungen in Konzentrationen vorliegen, die ungefähr zwischen 0,5 % und 99,5 % liegen, üblicherweise zwischen etwa 5 und 90 %.
Die Wahl des geeigneten Vehikels hängt von der Beschaffenheit der verwendeten Bestandteile und der Bestimmung der Zusammensetzungen ab, je nachdem, ob das formulierte Produkt auf der Oberfläche bleiben soll, auf der es aufgetragen wurde (z. B. Sprays, Schäume, Toniclotion oder Gele) oder ob es im Gegenteil nach der Verwendung ausgespült werden soll (z. B. Shampoo, Konditioner, Lotionspülungen).
Die wässrigen Vehikel, die in den kosmetischen Zusammensetzungen vorliegen, können des weiteren C₁-C₆-Alkohole umfassen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol. Sie können ferner ein weiteres Lösungsmittel enthalten, das es ermöglicht, die unterschiedlichen, in den Zusammensetzungen eingesetzten Bestandteile in dem wässrigen Medium zu solubilisieren oder zu dispergieren.
Die Vehikel können ferner eine große Vielfalt weiterer Lösungsmittel enthalten, wie Aceton, Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Linalol, Ester und flüchtige Silicone. Die verschiedenen Lösungsmittel, die in den wässrigen Vehikeln eingesetzt werden können, können untereinander mischbar oder nicht mischbar sein.
Wenn die kosmetischen Zusammensetzungen in Form von Sprays, Toniclotionen, Gelen oder Schäumen vorliegen, weisen die bevorzugten Vehikel neben Wasser Ethanol, flüchtige Siliconderivate und deren Mischungen auf.
Die Formulierungen für Schäume und Aerosolsprays können auch ein Treibgas enthalten, das in der Lage ist, Produkte in Form von feinen, gleichmäßige Schäumen oder Sprays zu erzeugen. Als Beispiele können Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Difluorethan, Dimethylether, Propan, n-Butan oder Isobutan genannt werden.
Die wässrigen Vehikel können eine breite Vielfalt von Formen annehmen, insbesondere jene von Emulsionen, einschließlich Wasser-in-Öl-Emulsionen, Öl-in-Wasser-Emulsionen und Mehrfachemulsionen, deren gewünschte Viskosität bis zu 2000000 mPa·s betragen kann.
Neben dem wässrigen Vehikel können die kosmetischen Zusammensetzungen oberflächenaktive Mittel enthalten, die eingesetzt werden, um verschiedene Bestandteile zu dispergieren, emulgieren, solubilisieren, stabilisieren, wobei diese insbesondere aufgrund ihrer weichmachenden oder befeuchtenden Eigenschaften angewendet werden. Sie können vom Typ anionisch, nichtionisch, kationisch, zwitterionisch oder amphoter sein; als Beispiele können genannt werden:

– anionische oberflächenaktive Mittel in Mengen von 3% bis 50%, bevorzugt von 5% bis 20%, Mittel wie · Alkylsulfonate · Alkylsulfate · Alkylamidsulfate · gesättigte oder ungesättigte Fettsäuresalze
– nichtionische oberflächenaktive Mittel in Mengen von 0,1% bis 30%, bevorzugt von 2% bis 10%, Mittel wie · polyoxyalkylierte Alkylphenole · Glucosamide, Glucamide · von N-Alkylaminen abgeleitete Glycerolamide · polyoxyalkylierte aliphatische Alkohole mit C₈-C₂₂ · Produkte, die aus der Kondensation von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Verbindung, die aus der Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol stammt, hervorgegangen sind, · Aminoxide · Alkylpolyglycoside und deren polyoxyalkylierte Derivate · Fettsäureamide mit C₈-C₂₀ · ethoxylierte Fettsäuren · ethoxylierte Amide, Amine, Amidoamine
– amphotere und zwitterionische oberflächenaktive Mittel in Mengen von 0,1% bis 30%, bevorzugt von 1% bis 30%, Mittel wie * jene vom Betain-Typ wie * Betaine * Sulfobetaine * Amidoalkylbetaine * Sulfobetaine * Alkylsultaine * Kondensationsprodukte von Fettsäuren und Proteinhydrolysaten * Cocoamphoacetate und Cocoamphodiacetate * Alkylamphopropionate oder -dipropionate * amphotere Derivate von Alkylpolyamiden

Es können auch Konditioniermittel vorliegen, in Mengen von 0,05% bis 5%, bevorzugt von 0,1% bis 1%. Als Beispiele dafür können jene synthetischen Ursprungs genannt werden, besser bekannt unter der Bezeichnung Polyquaternium wie die Polyquaternium –2, –7 und –10, kationische Derivate von Polysacchariden, wie Cocodimoniumhydroxyethylcellulose, Guarhydroxypropyl-Trimoniumchlorid, Hydroxypropylguar, Hydroxypropyl-Trimoniumchlorid, die nicht flüchtigen Derivate von Siliconen wie Amodimethicon, Cyclomethicon, nicht wasserlösliche und nicht flüchtige Organopolysiloxane wie Öle, Harze oder Gummis wie Diphenyldimethicon-Gummi.
Die kosmetischen Zusammensetzungen können des weiteren Polymere enthalten, die filmbildende Eigenschaften aufweisen, die eingesetzt werden können, um eine Fixierfunktion zuzuführen. Diese Polymeren liegen üblicherweise in Konzentrationen vor, die zwischen 0,01 und 10 % liegen, bevorzugt zwischen 0,5 und 5 %. Sie sind bevorzugt vom Typ Polyvinylpyrrolidon, Copolymere von Polyvinylpyrrolidon und Methylmethacrylat, Copolymere von Polyvinylpyrrolidon und Vinylacetat, Copolymere von Polyterephthalatethylenglycol/Polyethylenglycol, sulfonierte Terephthalsäurecopolyester-Polymere.
Die kosmetischen Zusammensetzungen können ferner polymere Derivate enthalten, die eine Schutzfunktion ausüben, in Mengen in der Größenordnung von 0,01 bis 10%, bevorzugt ungefähr 0,1 bis 5 Gew.-%, Derivate wie

· Cellulosederivate
· auf Polyalkylene gepfropfte Polyvinylester
· Polyvinylalkohole
· sulfonierte Terephthalsäurecopolyester-Polymere
· ethoxylierte Monoamine oder Polyamine, ethoxylierte Aminpolymere.

Die Performance der kosmetischen Zusammensetzungen kann des weiteren durch Verwendung von Plastifizierungsmitteln verbessert werden, Mengen von 0,1 bis 20 % der Formulierung, bevorzugt von 1 bis 15 %. Als Beispiele für diese Mittel können Adipate, Phthalate, Isophthalate, Azelate, Stearate, Copolyolsilicone, Glycole, Rizinusöl oder deren Mischungen aufgezählt werden.
Vorzugsweise können ferner den Zusammensetzungen Mittel zugefügt werden, die als Metall-Komplexbildner agieren, insbesondere jene, die Calcium komplexieren wie Citrationen, oder polymere Dispergiermittel in Mengen in der Größenordnung von 0,1 bis 7 Gew.-%, um die Calcium- und Magnesiumhärte zu steuern, Mittel wie

· wasserlösliche Polycarbonsäuresalze
· Polyethylenglycole mit einer Molekülmasse in der Größenordnung von 1000 bis 50000.

Des weiteren können in die kosmetischen Zusammensetzungen feuchtigkeitsspendende Mittel eingeführt werden, es können Glycerol, Sorbitol, Harnstoff, Collagen, Gelatine und Weichmacher genannt werden, welche üblicherweise ausgewählt werden aus Alkylmonoglyceriden, Alkyldiglyceriden, Triglyceride wie aus Pflanzen und Gemüse extrahierte Öle oder Öle tierischen Ursprungs oder deren hydrierte Derivate, anorganische Öle oder Paraffinöle, Diole, Fettsäureester, Silicone.
Zu diesen Bestandteilen können in Verbindung Pulver oder anorganische Teilchen zugefügt werden wie Calciumcarbonat, organische Oxide in Form von Pulver oder in Form von Kolloiden wie Titandioxid, Siliziumdioxid, Aluminiumsalze, Kaolin, Talk, Tone und deren Derivate.
Zu diesen Bestandteilen wird üblicherweise ein oder mehrere Parfume, Farbstoffe und/oder deckende Mittel wie Pigmente zugefügt.
Um die Haut und/oder die Haare vor Angriffen durch die Sonne oder UV-Strahlen zu schützen, können zu den Formulierungen Sonnenfilter zugesetzt werden, welche chemische Verbindungen sind, die die UV-Strahlung stark absorbieren oder anorganische Teilchen wie Zinkoxid, Titandioxid oder Ceroxide.
Konservierungsmittel wie p-Hydroxybenzoesäureester, Natriumbenzoat oder jedes chemische Mittel, das das Wachstum von Bakterien oder Schimmelpilzen verhindert, und die traditionell in kosmetischen Zusammensetzungen angewendet werden, werden üblicherweise in diesen Zusammensetzungen in 0,01 bis 3 Gew.-% eingesetzt.
Zum Teil können Mittel verwendet werden, die die Aktivität von Wasser verändern und den osmotischen Druck stark erhöhen, wie Kohlenhydrate oder Salze.
Die kosmetische Zusammensetzung kann ferner weitere verdickende und/oder gelierende Polymere enthalten, wie vernetzte Polyacrylate, Hydrokolloide, die durch Fermentation von Xanthangummi und Rheozan^® erhalten werden, Cellulosederivate wie Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, Guare und deren Derivate, ... einzeln oder als Mischung eingesetzt.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung des Heteropolysaccharids als Verdickungsmittel und/oder Geliermittel in Nahrungsmittelformulierungen.
Nahrungsmittelformulierungen, die mit dem Heteropolysaccharid (HP) versetzt werden, sind klassischerweise Einfachemulsionen oder Mehrfachemulsionen von Flüssigkeiten, komplexe Emulsionen von Gas und Flüssigkeiten (aufgequellte Systeme), Suspensionen von Flüssigkeiten und Feststoffen, und alle weiteren Systeme, die diese Möglichkeiten kombinieren.
In diesen Formulierungen ist die Flüssigkeit vorzugsweise Wasser oder eine Flüssigkeit, die wenigstens teilweise Wasser enthält.
Die Nahrungsmittelformulierungen werden erhalten, indem die klassischen Methoden zur Herstellung von Nahrungsmittelformulierungen je nach Art angewendet werden. So wird das (HP) vorzugsweise in Form eines Feststoffs vom Fasertyp oder Pulvertyp mit den weiteren für die Formulierung benötigten Bestandteilen gemischt. Die Mischung kann anderenfalls homogenisiert werden.
Die Temperatur, bei der die Formulierung hergestellt wird, ist an sich nicht kritisch. Die (HP)-enthaltenden Formulierungen können ohne jeden Nachteil in Bezug auf ihre Anwendungseigenschaften sterilisiert werden. Ein weiterer Vorteil von (HP) liegt darin, dass es möglich ist, Nahrungsmittelformulierungen herzustellen, ohne zuvor die Bestandteile erhitzen zu müssen.
(HP) bleibt trotz der Verschiedenheit der Nahrungsmittelformulierungen (pH, Innenstärke, Zusammensetzung) kompatibel, und konserviert im wesentlichen seine Eigenschaften.
Die interessanten rheologischen Eigenschaften, die mit dem Heteropolysaccharid (HP) als Gegenstand der Erfindung verbunden sind, wie auch dessen Fähigkeit, bei Temperaturen unterhalb oder gleich 40°C und in einem breiten pH-Bereich zu wirklichen Gelen zu führen, ermöglicht es u. a., den Formulierungen, in denen (HP) einzeln oder in Mischung mit weiteren Additiven eingesetzt wird, eine Textur zu verleihen, die ähnlich ist zu jenen von Formulierungen, die ausschließlich diese Additive umfassen.
Die messbaren Parameter zur Charakterisierung der Textur von Nahrungsmittelformulierungen sind rheologischer Natur, und bestehen im wesentlichen aus der Messung des Elastizitätsmoduls (G') und Viskositätsmodul (G"), und die Fließviskosität bei einem gegebenen Schergradienten. G' und G" wie auch die Viskosität wurden vorstehend definiert.
Diese rheologischen Charakteristiken haben das Ziel, das visko-elastische und/oder pseudo-plastische Verhalten der Formulierungen darzustellen, um sie miteinander vergleichen zu können.
(HP), vorzugsweise in Form eines Feststoffs vom Typ Faser oder Pulver, weist die Fähigkeit auf, der Formulierung, die es umfasst, ein rheofluidisierendes Profil zu verleihen.
(HP) weist des weiteren die Fähigkeit auf, zu wirklichen Gelen zu führen, die sich nach Anlegung einer mechanischen Spannung heilen können.
Es ist festzustellen, dass die Module G' und G" wie auch die Viskosität, die für eine Formulierung gemessen wurden, sich von den für (HP) in destilliertem Wasser gemessenen Werten unterscheiden können.
In milchartigen gelierten Desserts wie beispielsweise Pudding kann vorzugsweise wenigstens ein Teil der üblichen Geliermittel, insbesondere Gelatine, durch (HP) ersetzt werden.
In salzig-sauren Medien wie Vinaigrettes kann das enthaltene wässrige Medium durch Zusatz von geringen Mengen (HP) strukturiert werden.
Im Bereich der Süßwaren, insbesondere in gelierten Bonbons vom Typ HARIBO^® kann vorzugsweise wenigstens ein Teil der Geliermittel wie z. B. Gelatine durch (HP) ersetzt werden.
In Medien mit hoher Ionenstärke, insbesondere bei Fleisch- und Wurstwaren, kann (HP) zu den Carraghenanen zugefügt werden, um beispielsweise die Textur und insbesondere den Elastizitätsaspekt der Würste zu verstärken.
In Formulierungen, die zum Aufquellen vorgesehen sind, wie Chantilly-Cremes, Kuchenüberzüge (nappages), Eiscremes kann (HP) als Verdickungsmittel und/oder Geliermittel verwendet werden.
Des weiteren kann (HP) in Formulierungen wie Mayonnaise, Gemüse-Mousses, Proteinenthaltende Mousse, wie Fleisch-Mousse, Fisch-Mousse, Albumin-enthaltende Mousse wie Meringen eingesetzt werden.
Als Verdickungsmittel und/oder Geliermittel kann (HP) auch in die Yoghurt-Zusammensetzung eingeführt werden.
In den vorstehend genannten Nahrungsmittelanwendungen verwendet man üblicherweise von 0,01 bis 5 Gew.-% und bevorzugt zwischen 0,05 bis 2 Gew.-% Heteropolysaccharid (HP), bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung oder Formulierung, worin es enthalten ist. Noch bevorzugter verwendet man 0,1 bis 1 Gew.-% Heteropolysaccharid (HP), bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung oder Formulierung.
Es ist festzustellen, dass das Heteropolysaccharid (HP) nicht den Geschmack der Nahrungsmittel, in welche es eingeführt wird, verändert.
Die Erfindung betrifft schließlich die Nahrungsmittelzusammensetzungen und die Nahrungsmittelformulierungen, die das wie vorstehend definierte Heteropolysaccharid (HP) enthalten.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Reinkultur vom Pseudomonas sp I-2054 (oder DSM 12295) und die Aufbewahrungsbedingungen des Stamms.
Reinkultur von Pseudomonas sp I 2054 (oder DSM 12295)
Das Haltungsmedium des Stamms Pseudomonas sp I-2054 (oder DSM 12295) ist das Medium MY-Agar von Difco (Referenz 0712-01-8). Die Zusammensetzung dieses bereits fertigen Mediums ist:
Man verdünnt 21 g dieses Mediums in 1 l destilliertem Wasser. Nach der Auflösung wird das Medium in einem Autoklaven während 15 Minuten bei 121°C sterilisiert. Anschließend wird das Medium in Petrischalen verteilt.
Die Kultur wird auf Petrischalen durchgeführt, inkubiert zwischen 25°C und 30°C, bevorzugt zwischen 25°C und 28°C, während mindestens 24 Stunden.
Vorkultur-Aufbewahrung
Der Stamm wird nun in Form von bei –196°C tiefgefrorenen Röhrchen nach dem Gefrierverfahren mit flüssigem Stickstoff (congelation azote liquide (CAL)) konserviert.
Für das Gefrieren mit flüssigem Stickstoff (CAL) wird eine Vorkultur auf dem Medium PJG 10 durchgeführt, das die folgende Zusammensetzung aufweist:
Für die Herstellung des Mediums werden alle Bestandteile im Quellwasser dispergiert. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 6,5 eingestellt. Das Medium wird 20 Minuten lang bei 120°C in einem Autoklaven sterilisiert.
Nach 24-stündiger Inkubation bei 28°C auf einem Drehschüttler mit 220 UpM und einer Amplitude = 50 mm, werden 10 Volumen-% steriles reines Glycerol zu der Kultur gegeben. Die Kultur wird anschließend in Kryoröhrchen verteilt, in Mengen variierend zwischen 1 ml bis 10 ml, bevorzugt 2 ml bis 4 ml.
Diese Röhrchen werden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und den Erhalt des Heteropolysaccharids gemäß zwei Fermentationsverfahren, eines mit einer organischen Stickstoffquelle und das andere mit einer anorganischen Stickstoffquelle.
In diesem Beispiel werden zwei "Vorkultur"-Schritte durchgeführt. Diese Schritte finden in 500 ml-Erlenmeyerkolben statt, was 100 ml Medium entspricht.
Der Produktionsschritt, der dem Schritt entspricht, in welchem der Bakterienstamm das Polysaccharid produziert, findet in einem Fermenter mit 20 l statt, wovon 15 l verwendet werden.
Die Rührbedingungen des Drehschüttlers sind: Geschwindigkeit = 220 UpM und Amplitude = 50 mm.
Vorkulturschritt 1
Der Vorkulturschritt 1 wird in einem Medium PJG 10 der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:
Alle Bestandteile werden in 1 l destilliertes Wasser qsp dispergiert. Der pH wird vor der Sterilisation mit H₂SO₄ 10 % auf 6,5 eingestellt. Das Medium wird während 20 Minuten bei 120°C in einem Autoklaven sterilisiert.
Nach der Sterilisation und vor der Inokulation mittels dem Kryoröhrchen (qsp) liegt der pH bei 7,33.
Jeder Erlenmeyer wird mit der Menge qsp der CAL geimpft.
Nach 24-stündiger Inkubation bei 28°C auf einem Drehschüttler (220 UpM, A = 50 mm) weist das Medium die folgenden Charakteristiken auf:
pH = 6,5
Viskosität < 10 mPa·s
ausgezählte Population auf MJ-Agar (Medium Difco, Referenz 0712-01-8) nach 72 Stunden bei 28°C = 1,7·10⁵ Ufc/ml.
Nach 24 Stunden Inkubation wird die Vorkultur 1 verwendet, um die Vorkultur 2 anzuimpfen.
Vorkulturschritt 2
Der Vorkulturschritt 2 wird in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:
Eine Glukoselösung mit 100 g/l wird in destilliertem Wasser hergestellt, anschließend bei natürlichem pH für 15 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Der Rest der Bestandteile wird in 900 ml enthärtetem Wasser qsp dispergiert, anschließend wird vor der Sterilisation von 15 Minuten bei 121°C der pH auf 6,8 eingestellt.
Nach der Sterilisation werden in jeden Erlenmeyer 10 ml der Glukoselösung zugegeben.
Nach der Sterilisation und vor der Inokulierung beträgt der pH 6,88.
Jeder Erlenmeyer wird mit einer ausreichenden Menge der Vorkultur 1 inokuliert.
Nach 24-stündiger Inkubation bei 28°C auf einem Drehschüttler (220 UpM, A = 50 mm) weist das Medium die folgenden Charakteristiken auf:
– pH = 6,82
– Viskosität = 50 – 100 mPa·s
– ausgezählte Population auf dem MJ-Agar (Medium Difco, Referenz 0712-01-8) nach 72 Stunden bei 28°C = 1,6·10⁹ Ufc/ml.
Nach 24 Stunden Inkubation wird die Vorkultur 2 verwendet, um die beiden Fermentationsmedien (Fermenter 1 und 2) im Produktionsschritt anzuimpfen.
Produktionsschritt:
Der letzte Schritt ist der Produktionsschritt des Heteropolysaccharids (HP).
Das Medium des Fermenters 1 weist die folgende Zusammensetzung auf:
Glukose ⇒ Qsp Gramm von Glukose werden in qsp 3 l enthärtetem Wasser gelöst. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 5 erniedrigt. Die Lösung wird in einer Mariotte-Flasche 30 Minuten bei 120°C in einem Autoklaven sterilisiert.
Stickstoff + Salze ⇒ Qsp Gramm von corn-steep liquor (CSL), 15 g K₂HPO₄, 12 g MgSO₄, 7H₂O, 23 ml einer Lösung von MnSO₄, H₂O mit 10 g/l und 3 ml Antischaummittel werden in qsp 7 l enthärtetem Wasser gelöst. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 6,5 eingestellt. Die Mischung wird in situ für 30 Minuten bei 120°C sterilisiert.
Natronlauge 1N ⇒ 40 g NaOH-Plättchen werden in 1 l destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird in einer Mariotte-Flasche für 30 Minuten bei 120°C in einem Autoklaven sterilisiert.
Wenn alle Bestandteile 28°C betragen, werden sie in dem Fermenter gemischt. Der Fermenter wird anschließend mit qsp der Vorkultur 2 inokuliert.
Die Fermentationsbedingungen im Fermenter 1 sind wie folgt:
Rühren ⇒ 200 UpM von 0 bis 20 Stunden; anschließend 400 UpM bis zum Ende der Fermentation
Belüftung ⇒ 400 l/h von 0 bis 18 Stunden, anschließend 825 l/h von 24 Stunden bis zum Ende der Fermentation
Die Temperatur wird auf 28°C eingestellt. Der pH wird mit NaOH 1N auf 6,8 eingestellt. Der Druck ist atmosphärischer Druck.
Das Medium des Fermenters 2 weist die folgende Zusammensetzung auf:
Glukose ⇒ Qsp Gramm von Glukose werden in qsp 3 l enthärtetem Wasser gelöst. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 5 erniedrigt. Die Lösung wird in einer Mariotte-Flasche 30 Minuten bei 120°C in einem Autoklaven sterilisiert.
Stickstoff + Salze ⇒ 18 g NaNO₃, 3,75 g NH₄NO₃, 4,5 g CaSO₄, 2H₂O, 23 ml einer Lösung von MnSO₄, H₂O mit 10 g/l, 12 g MgSO₄, 7H₂O, 75 ml einer Lösung von Fe-SO₄, 7H₂O mit 2 g/l, 4,5 g Na₂HPO₄ und 3 ml Antischaummittel werden in qsp 7 l enthärtetem Wasser gelöst. Der pH wird mit H₂SO₄ 10 % auf 6,5 eingestellt. Die Mischung wird in situ für 30 Minuten bei 120°C sterilisiert.
Natronlauge 1N ⇒ 40 g NaOH-Plättchen werden in 1 l destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird in einer Mariotte-Flasche für 30 Minuten bei 120°C in einem Autoklaven sterilisiert.
Wenn alle Bestandteile 28°C betragen, werden sie in dem Fermenter gemischt. Der Fermenter wird anschließend mit qsp der Vorkultur 2 inokuliert.
Die Fermentationsbedingungen im Fermenter 2 sind wie folgt:
Rühren ⇒ 200 UpM von 0 bis 20 Stunden, anschließend 400 UpM bis zum Ende der Fermentation
Belüftung ⇒ 400 l/h von 0 bis 24 Stunden, anschließend 825 l/h von 24 Stunden bis zum Ende der Fermentation
Die Temperatur wird auf 28°C eingestellt.
Der pH wird mit NaOH 1N auf 6,8 eingestellt.
Der Druck ist atmosphärischer Druck.
Fermentationsergebnisse
Je nach dem untersuchten Kulturmedium schwanken die Fermentationsdauern zwischen 60 und 115 Stunden, die mit Isopropanol ausfällbaren Trockensubstanzen variieren zwischen 10 bis 18 g/kg, und die Massenausbeute, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle, variiert zwischen 44 bis 70 %.
Extraktion und Reinigung
Der Endfermentationsmost wird mit 10 % reinem IPA (Gewicht/Gewicht) stabilisiert. Er wird anschließend während 20 Minuten bei 100–110°C bei einem pH von 7 thermisch behandelt. Der pH ändert sich während der thermischen Behandlung nicht.
Nach Verlassen der thermischen Behandlung wird der Most wärmeextrahiert (Temperatur > 70°C).
Die Fällungsbedingungen sind:
– 1,7 kg heißer Most in 4,5 kg reinem IPA (bei ungefähr 50°C).
Nach der Fällung werden die Fasern zerhackt, anschließend gewaschen und entwässert mit IPA, mit einem Titer von 78 %.
Die Fasern werden anschließend in einem Ventilationsofen bei ungefähr 85°C getrocknet, bis ein Produkt erhalten wird, das eine Feuchtigkeit von ungefähr 10 Gew.-% aufweist.
Die Fasern werden anschließend vermahlen und gesiebt.
Die Analyse der Motive des im Medium des Fermenters 1 (organisches Medium) erhaltenen Heteropolysaccharids ist in Molverhältnissen (Massenprozentsatz) wie folgt:
Die Analyse der Motive des im Medium des Fermenters 2 (anorganisches Medium) erhaltenen Heteropolysaccharids ist wie folgt (Massenprozentsatz):
Beispiel 3
Gegenstand dieses Beispiels ist die Verwendung von (HP), erhalten nach dem Beispiel 2, in einer Kuchenüberzug-Nahrungsmittelformulierung (formulation alimentaire de nappage).
In den folgenden Beispielen wurden die Fließviskositäten, ausgedrückt als mPa·s, mittels einem Viskosimeter BROOKFIELD RVT 20-2 bei Raumtemperatur gemessen.
Die Werte der Elastizitätsmodule, ausgedrückt als Pa, wurden mittels einem Rheometer CARRIMED CSL 100 bei angelegter Spannung durchgeführt. Sie wurden in einem Oszillation/Frequenz-System von 0,01 bis 10 Hz gemessen.
Die Messungen des Quellfaktors, ausgedrückt in Prozent, wurden wie folgt durchgeführt:
* In ein Becherglas mit bekanntem Volumen (V) und bekannter Masse wird der Schaum eingeführt, man gibt drei kurze Schläge und streicht glatt;
* das Becherglas wird gewogen, um die Masse (M) des Schaums im Becherglas zu bestimmen;
* Quellfaktor = [M(g)/V (ml)] × 100,
Es werden zwei Formulierungen hergestellt:
Formulierung 3.1: umfassend das Heteropolysaccharid (HP) gemäß der Erfindung,
Formulierung 3.2 (Vergleichsbeispiel): umfassend Natriumcaseinat und Natriumalginat.
Die Zusammensetzungen der Formulierungen sind in Tabelle I zusammengefasst.
Das Ganze wird anschließend in einem Ultra-Turrax während 2 Minuten bei 20000 UpM homogenisiert.
Die Mischung wird auf eine Temperatur unterhalb 10°C gekühlt, bevor das Aufquellen durchgeführt wird. Dieses findet mittels einem Labormischer vom Typ KENNWOOD CHEF bei Maximalgeschwindigkeit während 3 Minuten bei einer Temperatur nahe von 5°C statt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst. Tabelle II
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Formulierung 3.1, bei der das (HP) gemäß der Erfindung eingesetzt wurde, eine schwächere Viskosität als die Vergleichsformulierung 3.2 aufweist, und dass sie folglich leichter zum Quellen zu bringen ist.
Des weiteren ist die Formulierung 3.1 (gemäß der Erfindung) zum einen stärker geliert (G' ist höher bei hoher Frequenz) und weist einen verbesserten Quellfaktor auf.
Tabelle I
Wässrige Phase
In ein mit einem Rührstab (pale défloculeuse) versehenes Becherglas wird die benötigte Wassermenge eingewogen, und die in der vorstehenden Tabelle angegebene Mischung von Pulvern wird dispergiert (500 UpM).
Nach der Einführung der Pulver wird das Rühren für 5 Minuten weitergeführt.
Ölphase
In einem Becherglas werden die Fette und die Emulgiermittel in einem Wasserbad bei 70°C erwärmt.
Anschließend wird die Ölphase unter Rühren bei 1000 UpM zur wässrigen Phase gegeben.
Nach Einführung der Ölphase wird das Rühren für 5 Minuten weitergeführt. Während diesem Vorgang wird die Wasserverdampfung ausgeglichen.

Claims

Heteropolysaccharid (HP), dadurch gekennzeichnet, dass es durch Fermentation eines Mediums erhalten werden kann, welches wenigstens einen Stamm Pseudomonas sp I-2054 (oder OSM 12295), eine der Rekombinanten davon oder der Mutanten davon und eine Kohlenstoffquelle, die durch den Stamm, einer der Rekombinanten davon oder einer der Mutanten davon assimiliert werden kann, umfasst.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Motive von Glukose, Galactose und/oder deren Derivate, Mannuronsäure und/oder deren Salze umfasst, und wobei gewisse saccharidische Hydroxylgruppen davon in Form von Acetaten verestert sein können.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es die Motive in den folgenden Molverhältnissen umfasst, wobei als Referenz Galactose gleich 1 verwendet wird: – Glukose und/oder dessen Derivate 0,2–5, – Mannuronsäure und/oder dessen Salze 0,2–5, – saccharidische Hydroxylgruppen, die mit Acetat verestert sind, 0–10.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es die Motive in den folgenden Molverhältnissen umfasst, wobei als Referenz Galactose gleich 1 verwendet wird: – Glukose und/oder dessen Derivate 0,5–4, und bevorzugt 0,8–2, – Mannuronsäure und/oder dessen Salze 0,5–4, und bevorzugt 0,8–2, – saccharidische Hydroxylgruppen, die mit Acetat verestert sind, 0–8, und bevorzugt 0–6.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mannuronsäure in Form von Salzen vorliegt.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Gewichtsmittel-Molekülmasse (Mw) aufweist, die zwischen 1·10⁵ und 8·10⁶ g/Mol liegt, bevorzugt zwischen ungefähr 8·10⁵ und 5·10⁶ g/Mol.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Gewichtsmittel-Molekülmasse (Mw) aufweist, die ungefähr zwischen 2,5·10⁶ und 4·10⁶ g/Mol liegt, einschließlich der Grenzen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass 0,5%-ige Lösungen in Gewicht/Gewicht des Heteropolysaccharids (HP) in destilliertem Wasser bei 23°C, und bei einer Frequenz von 1 Hz, zu Werten des Elastizitätsmoduls G', die zwischen 0,1 und 200 Pa liegen, und des Verlustmoduls G", die zwischen 0,1 und 20 Pa liegen, führen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass 0,5%-ige Lösungen in Gewicht/Gewicht des Heteropolysaccharids (HP) in destilliertem Wasser bei 23°C, und bei einer Frequenz von 1 Hz, zu G'-Werten, die zwischen 20 und 200 Pa liegen, und zu G"-Werten, die zwischen 0,5 und 15 Pa liegen, führen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass 1%-ige Lösungen in Gewicht/Gewicht des HP in destilliertem Wasser, das 0,5 % Gewicht/Gewicht NaCl enthält, bei 23°C, zu Werten der Fließviskosität bei einem Schergradienten von 0,1 s^–1 führen, die zwischen 100 und 5000 Pa·s liegen, und insbesondere zwischen 200 und 2000 Pa·s.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1–10, dadurch gekennzeichnet, dass 1 %-ige Lösungen in Gewicht/Gewicht des HP in destilliertem Wasser, das 0,5 % Gewicht/Gewicht NaCl enthält, bei 23°C, zu Werten der Fließviskosität bei einem Schergradienten von 10 s^–1 führen, die zwischen 0,1 und 300 Pa·s liegen, und insbesondere zwischen 5 und 150 Pa·s.
Verfahren zur Herstellung des Heteropolysaccharids (HP) wie in einem der Ansprüche 1–11 definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Heteropolysaccharid (HP) vom Fermentationsmost gemäß den folgenden Schritten getrennt wird: i – man unterwirft den Endfermentationsmost einer thermischen Behandlung zwischen 80°C und 120°C während ungefähr 10–60 Minuten, ii – man fällt das Heteropolysaccharid (HP) mittels einer organischen Flüssigkeit, die wenigstens teilweise mit Wasser mischbar ist, iii – man trennt das Heteropolysaccharid (HP) von der organischen Flüssigkeit.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (i) der einer thermischen Behandlung unterworfene Most einen pH aufweist, der zwischen 6 und 8 liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Most, der aus dem Schritt (i) stammt, bei der gleichen Temperatur wie die Temperatur der thermischen Behandlung gehalten wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12–14, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (ii) die Fällung des Heteropolysaccharids (HP) durch eine organische Flüssigkeit in Gegenwart von Salzen, wie Sulfaten, Chloriden oder Phosphaten von Natrium, Kalium oder Calcium durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12–15, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b) die Fällung bei einer Temperatur stattfindet, die zwischen 40 und 60°C liegt.
Pseudomonas stp-Stamm, hinterlegt bei CNCM, unter der Nr. I-2054 und gleichfalls bei DSMZ, unter der Nr. DSM 12295.
Reinkultur von Pseudomonas Sp I-2054 (oder DSM 12295).
Verwendung des Heteropolysaccharids (HP) wie vorstehend in einem der Ansprüche 1–11 beschrieben als Verdickungsmittel und/oder Geliermittel.
Verwendung des Heteropolysaccharids (HP) wie in einem der Ansprüche 1–11 beschrieben als Verdickungsmittel und/oder Geliermittel in Nahrungsmittelformulierungen in Mengen zwischen 0,01–5 Gew.-%, und bevorzugt zwischen 0,05–2 Gew.-% Heteropolysaccharid (HP), bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung oder Formulierung.
Verwendung des Heteropolysaccharids (HP) wie in einem der Ansprüche 1–11 beschrieben zum Erhalten von Gelen ohne Zugabe von zusätzlichen Kationen zum Medium.
Zusammensetzung oder Formulierung, die ein Heteropolysaccharid (HP), wie in einem der Ansprüche 1–11 beschrieben, umfasst.