CN1353766A - 由假单胞菌属产生的杂多糖 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂多糖(HP),其特征在于其可由一种培养液发酵而获得,所述培养液包含至少一种假单胞菌属1－2054(或DSM12295)的菌株、其重组子或其突变体,以及一种可被该菌株、其重组子或其突变体的一种同化的碳源。本发明还涉及一种用于制备该杂多糖的方法以及和该杂多糖作为增稠剂和/或胶凝剂的用途。

Description

由假单胞菌属产生的杂多糖

本发明涉及一种新杂多糖(HP)，一种通过发酵假单胞菌(Pseudomonas sp.)I-2054(或DSM 12295)的菌株制备其的方法，涉及该菌株，以及杂多糖作为增稠剂和/或胶凝剂的用途。

在许多工业领域，始终需要具有如下特点的新化合物：

-改进的流变学性质且能形成凝胶；

-与其所掺入的介质具有提高的相容性，

-在宽温度和pH范围中的高稳定性。

在细菌发酵产物中获得的化合物的情况中，化合物具有高生产率也很重要。

最感兴趣的是胶凝的能力，因为由于该体系在多种多样的领域可应用，其中有些用途需要使用凝胶，所以这样的体系十分吸引人。

因此，例如，农业产品提供了大范围的凝胶产品(奶油甜点、酸奶、多种果冻、冰霜等)，且制药工业使用凝胶作为载体用作活性成分或作为增稠剂。

在其它差别较大的领域，某些颜料静置时由于具有凝胶性质而不会滴溅，相反，在刷子的作用下容易分散(剪切稀释行为)。

水性凝胶也用作层析支持物或者用于开发隐形眼镜。

细菌来源的杂多糖(如黄原胶)已经被描述，并利用了其在极端温度和pH条件下的流变学性质。但是，适于在溶液中应用的这些杂多糖并不总产生凝胶。

已知介质的胶凝在当该介质的成分交联后形成三维网络时发生。

常规地，此胶凝是通过如下方法得到：向介质中加入额外的阳离子，尤其是碱金属或碱土金属型阳离子(例如钙和/或镁)，通过将pH向酸性或碱性转换，通过加入其它化合物，特别是其它多糖(例如黄原胶和carob的组合)，或通过改变温度。

无论何种构思的应用，上述胶凝条件可：

-由于额外的阳离子或共同添加剂(其为获得凝胶必须加入的)与在该组合物中存在的其它组分之间的相互作用，损害最终凝胶的稳定性和相容性，或者

-由于高温和/或pH改变，使杂多糖和/或在该组合物中存在的其它成分变性。

在本发明中，“凝胶”是指一种由于分散在液体中的杂多糖链至少部分缔合而形成的假固体(pseudo-solid)(行为非常类似于固体)。在应力频率范围ω中，假固体凝胶一般就其固体成分而言由弹性模量G′(ω)，也称为储能模量来表征，而就其液体或粘性成分而言，由粘性模量G″(ω)，也称为损耗模量来表征。

G′(ω)和G″(ω)的机械值可利用以振动模式操作的受控应变(strain)流变仪测定。以非限制性表述的方式可提及例如Rheo-FluidSpectrometer流变仪。

G′和G″也可利用以振动模式操作的受控应力(stress)流变仪测定。以非限制性表述的方式可提及例如CARRIMED流变仪。

测量的原理是首先确定可逆机械应变的范围，其中凝胶对机械应力的响应作为该应变的函数是线性的。其次凝胶经历的是一系列包含在事先确定的线性范围内的机械应变值。流变仪进行一个扫频ω。

与应变同相的凝胶之应力响应接近弹性模量G′(ω)。G′(ω)相应于凝胶以弹性形式储存的能量，且是可回复的。

与应变异相、具有90℃相差的凝胶之应力响应接近粘性模量G″(ω)。G″(ω)相应于凝胶以粘性流动耗散的能量，且是不可回复的。

当在整个应力频率范围(ω)扫描内，G′/G″比大于或等于10，即当凝胶的弹性保持较高，且当G′(ω)值大于或等于10Pa时，称凝胶是强的或真的。

本发明的一个特定目标是提供具有如下性质的杂多糖：其具有非常良好的流变学性质，尤其是就增稠和假塑性(剪切稀释)而言的性质，以及无需向介质加入额外的阳离子并无需pH转换、且在低于或等于40℃的温度下良好的产生真凝胶的能力。

本发明的另一个目标是提供在低浓度下具有非常良好流变学性质的杂多糖。

本发明首先提供一种杂多糖(HP)，其特征在于其可由一种培养液发酵而获得，所述培养液包含至少一种假单胞菌属I-2054(或DSM 12295)的菌株、其重组子或其突变体，以及一种可被该菌株、其重组子或其突变体中的一种同化的碳源。

假单胞菌属的菌株根据布达佩斯条约于1998年7月22日保藏于国立微生物保藏中心(CNCM)，其公众可得的保藏号I-2054。其还在德意志微生物保藏中心(DSMZ)于1998年7月13日加以保藏，其公众可得号DSM12295。此菌株构成了本发明的一个主题。

构成本发明另一个主题的假单胞菌属的菌株I-2054(或DSM12295)之纯培养的进行可在培养皿中于25-30℃温度下培养，更特别的在25-28℃温度下培养大约24小时。

可被假单胞菌I-2054(或DSM12295)同化的氮源和碳源可选自葡萄糖，果糖，半乳糖，海藻糖，甘露糖，麦芽二糖，蔗糖，棉子糖，麦芽三糖，麦芽糖，乳糖，乳果糖，甲基-β-吡喃型半乳糖苷，甲基-α-吡喃型半乳糖苷，纤维二糖，龙胆二糖，甲基-β-D-吡喃型葡萄糖苷，甲基-α-D-吡喃型半乳糖苷，七叶苷，核糖，阿拉伯糖，木糖，palatinose，鼠李糖，岩藻糖，松三糖，D(+)-阿糖醇，L(-)-阿糖醇，木糖醇，卫矛醇，塔格糖，甘油，肌醇，甘露醇，麦芽糖醇，松二糖，山梨糖醇，核糖醇，来苏糖，赤藓糖，D(-)-酒石酸，D(+)-苹果酸，L(-)-苹果酸，顺式乌头酸，反式乌头酸，2-酮-D-葡萄糖酸，N-乙酰葡糖胺，奎宁酸，甜菜碱，琥珀酸，富马酸，甘油酸和葡糖胺。

在对该菌株可用的维持培养基中，Difco MY琼脂型维持培养基(称为0712-01-8)认为特别有利。所述Difco MY琼脂型培养基具有如下组成：

bacto-酵母提取物    3g

麦芽提取物        3g

bacto-蛋白胨      5g

bacto-右旋糖      10g

bacto-琼脂        20g

为保存菌株，优选提供至少一种预培养步骤。所谓预培养步骤是指包含培养并增殖细菌菌株而不产生多糖的步骤。

可以证实，一般地杂多糖(HP)包含葡萄糖和/或其衍生物、半乳糖和/或其衍生物，甘露糖醛酸和/或其盐、醋酸和/或其盐的单元。

杂多糖(HP)的组成单元一般以如下摩尔比例存在(以相当于1的半乳糖为参照)：

-葡萄糖和/或其衍生物：0.2-5，

-甘露糖醛酸和/或其盐：0.2-5，

-醋酸和/或其盐：0-10。

更特别的，所述单元以相当于1的半乳糖为参照的如下摩尔比例存在：

-葡萄糖和/或其衍生物：0.5-4，优选0.8-2，

-甘露糖醛酸和/或其盐：0.5-4，优选0.8-2，

-醋酸和/或其盐：0-8，优选0-6。

甘露糖醛酸和醋酸均可以盐形式存在。对于所述盐，可提到的有钠盐，钾盐，钙盐或铵盐。

用于分析杂多糖(HP)从而确定如上述经验性分子式的方法之关键是在水解该杂多糖(HP)后组成元素的确定和带有内标或外标的色谱分析。

为此，如下进行单糖分析：

在带有5ml摩尔浓度三氟乙酸的密封管中于105℃水解100mg杂多糖(HP)3-6小时。

此后蒸发干燥，取干残留物置于含有15mg山梨糖醇的5ml吡啶中作为内标，用0.9ml六甲基二硅烷在1ml吡啶溶液中硅烷化。硅烷化由0.1毫升三氟乙酸催化。

利用带有F.I.D.(火焰离子检测器)的气相色谱在长25米直径0.25毫米的玻璃毛细柱(填充具有膜厚度为0.14微米的甲基硅烷相)上分析单糖。载体气体为氢气，流速为2ml/分。

在用5毫升2N盐酸于105℃水解100mg杂多糖(HP)1小时后检测乙酸。加入5ml 5mg/ml的丙酸溶液作为内标，混合物用15毫升去离子水制备。利用5微米C-18接枝硅柱(长250cm，直径4.6mm)进行HPLC分析。用0.02mol/l水性磷酸溶液以1.2ml/分的流速洗脱。折光计检测。

按照食品科学手册(Food Chemical Codex，4^th edition，768)的方法，利用盐酸热处理胶(gum)后脱羧，通过检测CO₂的释放检测甘露糖醛酸。

利用系列TSK PW 4000和6000柱(长30cm，直径7mm)排阻层析以折光计检测确定重均分子量。洗脱液为0.1mol/l硝酸钠溶液。洗脱液中杂多糖的浓度约为0.015％(重量)。利用支链淀粉进行校正，其为单分散性多糖，具有5×10³-1.6×10⁶g/mol的分子量，外推至高达10⁷g/mol。

从获自色谱的质量分布曲线可得到重均分子量(Mw)；一般在1×10⁵-8×10⁶g/mol之间，优选约8×10⁵-5×10⁶g/mol之间。

更具体的，HP具有包含两个端点在内的2.5×10⁶-4×10⁶g/mol之间的重均分子量(Mw)。

如上述，HP在溶液中具有良好的流变学特性，尤其是在蒸馏水或自来水中。

由此，发现例如该杂多糖(HP)在0.5％重量百分比的蒸馏水溶液中在23℃且在1Hz频率下产生0.1-200Pa的G′值，和0.1-20Pa的G″值。

当G′和G″值有利地在G′为20-200Pa和G″为0.5-15Pa之间时，HP产生强的或真凝胶。更有利的，G′为20-150Pa而G″为0.5-10Pa之间。在一个优选的实施方案中，G′值为大约100Pa，而G″为大约5Pa(在蒸馏水中)。

HP可产生水性介质粘度，其可通过流体流变学评估。流动粘度的流变学测量利用受控应力流变仪或受控剪切率流变仪进行，诸如，利用RHEOMAT或CARRIMED型粘度计分别进行。

在两种情形中，仪器测量当HP+水混合物被不可逆应变时该混合物流动下的应力。流动粘度由该应力计算。

因此该仪器可定量给定剪切率下的粘度水平。

流动粘度可更简单地借助于BROOKFIELD粘度计评估。

这些HP流动粘度的流变学测量可用于评估HP溶液和/或含有其的制剂的流动阈。所述阈值代表了为破坏介质结构并迫使其流动所必须提供的力。

流动流变学还可用于定量当受控剪切增加时HP溶液和/或含有其的制剂的难易(ease)，即假塑性或剪切稀释行为。

已发现，例如，1％重量百分比的杂多糖(HP)之蒸馏水溶液(含有0.5％重量百分比NaCl)于23℃在0.1S^-1剪切速率下产生100-5000Pa.s之间的流动粘度，特别是200-2000Pa.s之间的流动粘度。

在类似条件下，在10S^-1剪切速率下产生0.5-300Pa.s之间的流动粘度，特别是5-150Pa.s之间的流动粘度。

这些流动流变学数据是当其被粉碎、被从一个容器转移入另一个容器、当其膨胀(expand)时该制剂行为的代表。

通过将HP掺入介质获得的凝胶是自复原型凝胶，换言之，当剪切甚至是强剪切后，“破碎”的凝胶具有重新形成且复原其初始性质的能力。

由HP获得的凝胶之自复原性质利用挤压测量(compressionmeasurement)进行评估，所述挤压测量例如在ETIA T2 texturizer上进行，所述仪器由直径12.7mm、穿透率0.05mm/s和穿透高度15mm的圆柱形测量体组成。以不同间隔在同一位置将活塞推入凝胶数次，记录挤压力。测定由原点处的斜率构成，表达为mN/mm，其代表凝胶的弹性。

例如，用0.5％重量百分比的HP蒸馏水溶液制备凝胶。然后将该凝胶储存24小时后，在室温下(约25℃)或在较冷的温度下(约6℃)进行挤压测量。

以多种时间点进行挤压测量：0，5，15分钟和24小时，在每次测量之间有5分钟间隙。

由此，斜率保持不变，大约等于45±1mN/mm，无论测量时间(t＝0.5，15分钟和24小时)。

这表明凝胶的弹性稳定，且其具有在持续一段的时间内多次自复原的能力，同时保持相同的凝胶强度。

本发明还提供了一种制备上述杂多糖(HP)的方法。

制备方法首先包括发酵一种培养液，所述培养液包含至少一种可被假单胞菌属I-2054(或DSM12295)的菌株、其重组子或其突变体中的一种同化的碳源。

除了可同化的碳源，发酵培养液也可包括至少一种有机或无机氮源，以及，如适当的一种或多种矿物盐。

常规地该培养液用假单胞菌属I-2054(或DSM12295)的菌株接种。

至于作为发酵培养液的成分之有机碳源，除了上述糖类外，还可提及如下糖类，诸如淀粉(优选水解的)、淀粉水解物、这些糖类的混合物和包含至少一种这些糖类的混合物。

更特别的，可提及的糖类包括葡萄糖、蔗糖、淀粉(优选水解的)、淀粉水解物、乳糖、这些糖类混合物和含有至少一种这些糖的混合物。其中更优选的是葡萄糖和蔗糖。

发酵培养液中碳源的浓度可在1-100g/l，优选15-60g/l之间。

至于有机氮源，可提及酪蛋白和酪蛋白酸盐、鱼水解物、小麦粉、玉米粉或大豆粉、酵母提取物(贝克酵母、酿酒酵母、乳酸酵母等)、玉米浆(CSL)、尿素和马铃薯蛋白质。

至于无机氮源，可提及硝酸铵或硝酸钠，和磷酸铵或硫酸铵。

发酵也可用有机和无机氮源混合物进行。

发酵培养液中氮源浓度(有机、无机或其混合物)可在1-80g/l，优选3-50g/l之间。

发酵培养液有利地包含单独或如适当地与其它微量元素(如铁、锰和/或镁)混合的钙盐，还有维生素和核苷酸。

钙盐可以以组合物或无机化合物或有机化合物的形式导入培养液中，如CSL、大豆粉，或者例如硝酸盐、碳酸盐或硫酸盐的形式。

发酵可在1-4bar压力，温度25-35℃，优选25-30℃，有氧条件下进行。

发酵培养液的pH值可在5-9之间，优选6-8之间。如需要，可用碱(如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水)或酸(如硫酸、磷酸、盐酸或硝酸)调节pH。

置于发酵罐或容器中的发酵培养液可有利地加以搅拌。搅拌可例如利用往复式摇床、旋转式摇床、搅拌浆或鼓泡柱进行。发酵时间一般地长于30小时，但一般在40-100小时之间。

发酵产率就所用碳源产生的杂多糖(HP)而言一般高于40％(重量)，更特别地在55-75％(重量)，最特别地在60-75％(重量)之间。

发酵后，杂多糖(HP)按照如下步骤从发酵液中分离：

i)在发酵终点发酵液经过在80℃-120℃之间大约10-60分钟的热处理，

ii)通过至少部分水可混溶的有机液方法沉淀该杂多糖(HP)，

iii)从有机液中分离该杂多糖(HP)。

在步骤i)中，含有杂多糖的发酵液有利地被在80-120℃之间加热10-60分钟，优选15-45分钟。

经历热处理的发酵液有利地具有6-8之间的pH值。

但是，如需要可用碱或酸调节pH。

用于调节发酵培养液的碱或酸可选自上述酸或碱。

根据本发明的一个优选变化，从步骤i)中获得的发酵液应当保持在与热处理相同的温度。

在步骤(ii)中，通过利用一种有机液进行沉淀，从获自步骤(i)的发酵液中回收杂多糖(HP)，其中该有机液至少部分与水可混合，且其中杂多糖(HP)不溶或基本上不溶。

对于适于本发明的液体，可提及丙酮或含有1-6个碳源子的醇类，如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇或其混合物。

更特别的，HP的沉淀用异丙醇进行。

所用有机液的体积一般至少为待处理的发酵液体积的两倍。

用有机液沉淀杂多糖(HP)还可在盐类存在下进行，如硫酸根、氯离子或磷酸根的钠盐、钾盐或钙盐。

根据一个特定实施方案，沉淀可在40-60摄氏度之间进行。

一旦沉淀，杂多糖(HP)可在步骤(iii)中从有机液中分离。

分离的方法本身并不关键，可任意从常用分离方法中选择，例如过滤、离心或抽滤。

所得的残渣可任选的利用丙酮或一种醇(如乙醇、丙醇或异丙醇)脱水。

进行这种脱水操作所需的醇类重量一般为待处理的残渣之重量的1-10倍。

脱水的残渣可进一步经历过滤、离心或抽滤操作。

如适当，残渣可被干燥、磨碎和/或过筛以得到杂多糖(HP)粉末。

如需要获得更纯的粉末，可利用一种或多种酶处理发酵液或处理从如上述方法获得到粉末之水性重构物。

对于适合用于此目的之酶，可提及蛋白酶、mutanase、脂蛋白酶、纤维素酶和壳多糖酶。

酶法纯化可与物理纯化结合或由物理纯化方法如多种过滤、离心或透析方法，或多种色谱技术替代。

无论是否已经历了纯化处理，发酵液和杂多糖的重构溶液可被浓缩。

在某些情况中浓缩是有利的，特别是当由此可降低运输成本时。此外，浓缩的溶液可比杂多糖(HP)更快地被使用。

可通过本领域已知的所有技术进行浓缩，特别是蒸发、超滤或diafiltration。

在本发明中，杂多糖(HP)有利地以残渣固体或粉末形式存在。

如前述，HP具有良好的流变学性质，特别是形成真凝胶的能力。取决于发酵的条件，特别是取决于培养液中的成分和浓度，和/或沉淀条件(更特别地，沉淀是否在盐存在下进行)，HP具有能被用作增稠剂或胶凝剂(或二者)的优点。

因此，本发明提供了如上述杂多糖(HP)或如上述方法获得的杂多糖作为增稠剂和/或胶凝剂的用途。

HP可在例如石油、农用化学、食品、化妆品、造纸和纺织工业，以及在颜料、隐形眼睛、胶水、墨水和家用及工业用清洁剂中被用作增稠剂和/或胶凝剂。

在化妆品组合物中使用的本发明之杂多糖(HP)的量取决于待增稠和/或待胶凝的水性介质。该量可为约0.01％-5％，优选0.1％-0.3％增稠和/或胶凝的水性介质的重量。

术语“化妆品组合物或制剂”是指所有在称为化妆品指令的1976年7月27日EEC之第76/768号欧洲指令之附件I中所述的所有类型的化妆品产品或制品(化妆品项目的例示性目录)。

化妆品组合物可被配制成多种类型的用于皮肤和/或头发的产品，诸如摩丝、发胶(特别是定型胶)、调理剂、用于发型或用于帮助头发梳理的制剂、清洗制剂、手和身体洗液、调节皮肤湿度的产品、清洁乳、卸妆组合物、防晒和抵抗紫外线照射的乳膏或乳液、美容膏、抗痤疮制品、局部止痛剂、睫毛油、旨在用于唇或其它粘膜上的产品、棒、以及同样类型的其它组合物。

这些化妆品组合物中使用以约0.5％-99.5％之间，一般约5-90％之间的浓度在所述组合物中存在的载体，或两种或多种载体的混合物。

适当载体的选择取决于所用成分的性质、该组合物的最终用途、取决于是否该配制的产品要留在其施用的表面(例如，喷雾剂、摩丝、营养露、发胶等)或是使用后清洗掉(例如，香波、整理剂、漂洗露等)。

化妆品组合物中存在的水性载体也可包含C₁-C₆的醇，尤其是甲醇、乙醇和异丙醇。其中也可包含使在该组合物中使用的多种成分能够在水性介质中溶解或分散的另一种溶剂。

这类载体可因此还包含多种其它溶剂，如丙酮、烃类、卤代烃类、里哪醇、挥发性硅氧烷类和酯类。可用在水性载体中的多种溶剂可以彼此互混或者不互混。

当化妆品组合物呈喷雾剂、营养露、凝胶或摩丝形式时，优选的载体除了水之外包括醇类、挥发性硅氧烷衍生物和其混合物。

用于气溶胶喷雾和摩丝的制剂还可包括能使产品呈摩丝或精细、均一喷雾形式的推进剂。以举例的方式，可提及三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氟乙烷，二甲醚，丙烷，正丁烷或异丙烷。

所述水性载体可采取多种形式，特别是那些乳液，包括油包水型乳液，水包油型乳液，和多重乳液，其希望的粘度可高达2000000m Pa.s。

除了水性载体，化妆品组合物还可包含表面活性剂，用于分散、乳化、溶解和稳定所用的多种性质(特别是软化或湿润性质)的化合物。所用表面活性剂可为阴离子型、阳离子型、非离子型、兼性离子型或两亲型的；以举例的方式，可提及：

-阴离子型表面活性剂，其量在3-50％，优选在5-20％之间，诸如：

·烷基磺酸酯类表面活性剂

·烷基硫酸酯类

·烷基酰胺硫酸酯

·饱和或不饱和脂肪酸的盐类

-非离子型表面活性剂，其量在0.1-30％，优选在2-10％之间，诸如：

·聚氧亚烷基化(polyoxyalkylenated)烷基酚

·glucosamides，葡糖酰胺

·来自N-烷基胺的甘油酰胺(glycerolamides)

·聚氧亚烷基化的C₈-C₂₂脂肪醇

·得自环氧乙烷与疏水性化合物缩合的产物，其中该疏水性化合物得自环氧丙烷与丙二醇的缩合

·氧化胺

·烷基聚糖苷和其聚氧亚烷基化衍生物

·C₈-C₂₀脂肪酸的酰胺

·乙氧基化脂肪酸

·乙氧基化氨基胺(amidoamines)、胺、酰胺

两亲性和兼性表面活性剂，其量在0.1-30％，优选在1-10％之间，诸如：

甜菜碱类型的那些包括：

·甜菜碱

·磺基甜菜碱

·酰胺烷基甜菜碱

·和磺基甜菜碱

·alkylsultaines

·脂肪酸和蛋白质水解物的缩合产物

·椰油两亲乙酸酯(cocoamphoacetates)和椰油两亲二乙酸酯(cocoamphodiacetates)

·烷基两亲丙酸酯或二丙酸酯

·烷基聚胺的两亲衍生物

调理剂也可以在0.05-5％，优选在0.1-1％之间的范围内存在。

其中，可提及合成的以季化羟乙基纤维素著称的那些，如季化羟乙基纤维素-2，-7和-10，多糖的阳离子衍生物，如羟乙基cocodimonium纤维素，瓜耳羟丙基trimonium氯化物，羟丙基瓜耳羟丙基trimonium氯化物，硅氧烷类的非挥发性衍生物，如氨基(二)甲基硅酮(amodimethicone)，环(二)甲基硅酮，非水溶性和非挥发性有机多分子硅醚，如油类，树脂类或树胶类，如二苯基二甲硅酮树胶。

化妆品组合物还可包含具有薄膜形成性质的聚合物，其可用于提供固定性功能。这些聚合物一般以0.01-10％的浓度，优选0.5-5％的浓度存在。他们优选为聚乙烯吡咯烷酮型、聚乙烯吡咯烷酮和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮和乙酸乙烯酯共聚物、对苯二甲酸聚乙二醇酯/聚乙二醇共聚物和磺化对苯二甲酸共聚酯聚合物。

化妆品组合物也可包含产生保护功能的聚合性衍生物，其量在0.01-10％，优选约0.1-5％(重量)之间；衍生物诸如：

·纤维素衍生物

·接枝到聚亚烷基骨架上的聚乙烯基酯

·聚乙烯醇

·磺化对苯二甲酸共聚酯聚合物。

·乙氧基化单胺或聚胺，乙氧基化胺的聚合物

化妆品组合物的性质还可利用增塑剂改进，其量为制剂的0.1-20％之间，优选1-15％。可提及的这类制剂有己二酸酯、对苯二甲酸酯、间苯二甲酸酯、壬二酸酯、硬脂酸酯、硅氧烷共聚醇类(silicone copolyols)、乙二醇类、蓖麻油或其混合物。

为控制钙和镁离子硬度，还可以有利地向这类组合物加入金属鳌合剂(更特别的是那些鳌合钙离子)，如柠檬酸根离子；或者加入聚合性分散剂，其量为0.1-7％(重量)；诸如

·聚羧酸的水溶性盐类

·具有1000-50000分子量范围的聚乙二醇

还可向化妆品组合物中掺入湿润剂；可提及的有甘油、山梨糖醇、尿素、胶原、明胶和润滑剂，其一般选自烷基单甘油酯和烷基二甘油酯，三甘油酯，如从植物和从蔬菜中提取的油，和从动物来源的油，或其氢化衍生物，矿物油或液体石蜡，二醇类，脂肪酯和硅氧烷类。

向这些化合物中可一起加入无机颗粒或粉末，如碳酸钙，呈粉末或胶体形式的无机氧化物，如二氧化钛、硅、铝盐类、高岭土、滑石粉、粘土和其衍生物。

一般向这些组分中加入一种或多种香味剂、颜料和/或遮光剂，如色素。

为了保护皮肤和/或头发免受阳光和紫外线的攻击，可向这些配方中加入防晒物，其可为化学性强烈吸收紫外线的化合物，或无机颗粒，如氧化锌，二氧化钛或氧化铈。

防腐剂，如对羟基苯甲酸酯、苯甲酸钠或可防止细菌繁殖或霉菌增殖的且其常规用于化妆品组合物任何化学药剂，一般以0.01％-3％(重量)的水平被加入到这类组合物中。

有时可使用改变水活度且一般增加渗透压的药剂，如糖类或盐类。

化妆品组合物也可包含其它粘度调节和/或胶凝组合物，如交联的聚丙烯酸酯，由发酵获得的水胶体，如黄原胶和Rheozan、纤维素衍生物如羟丙基纤维素或羧甲基纤维素、瓜尔胶及其衍生物等，其可单独或组合使用。

本发明更特别的提供了杂多糖(HP)作为增稠剂和/或胶凝剂在食品制剂中的用途。

向其中加入杂多糖(HP)的食品制剂一般是简单或多重液体乳液，复合气体和液体乳液(扩展的体系)，液体和固体的悬浮液，或任一其它与这些可能性组合的体系。

在这些制剂中，液体有利的是水，或者至少包含部分水的液体。

根据其类型，通过实施制备食品制剂的常规方法可制备食品制剂。因此，HP(有利地呈残渣的固体或粉末型)与其它制剂需要的组分混合。如需要，可将整个混合物匀浆。

制备制剂的温度本身并不关键。包含HP的制剂可被消毒而不对其饲服性质有任何破坏。HP的另一个优点是可制备食物制剂而无需事先加热组分。

无论食物制剂的性质如何多样(pH、离子强度、组分)，HP保持与之相容，且基本上保持自身性质。

与本发明主题杂多糖(HP)相关的有利的流变学性质，以及杂多糖在低于或等于40℃下产生真正凝胶的能力(且所有这些均在宽范围)还使得杂多糖能赋予(单独或与其它添加剂一起)使用了该杂多糖的制剂接近于不(exclusively)包含该添加剂之制剂的质地。

表征食品制剂质地的可测量参数为流变学性质，且基本上是测量弹性模量(G′)和粘性模量(G″)，以及在给定剪切速率下的流动粘度。G′和G″以及粘度均在前面定义。

这些流变学特征的目的是为了证明制剂的粘弹性和/或假塑性行为，从而将它们彼此进行比较。

有利的呈残渣固体或粉末之HP具有赋予含有HP之制剂剪切稀释性质的能力。

类似的，HP具有产生真正凝胶的能力，所述凝胶在施加机械压力后能自复原。

应当注意，对于制剂所测得的G′和G″模量以及粘度可能与那些在蒸馏水中HP所测得的不同。

在乳基和甜点中，例如带果馅的饼中，能有利的用HP替代常用的明胶，至少是替代部分明胶。

在盐和酸的介质，如酸酱油中，通过加入小量HP可赋予所存在的水性介质一定的结构。

在糖果领域，特别是HARIBO型果冻糖果中，能有利地用HP替代胶凝剂，如明胶。

在具有高离子强度的介质特别是猪肉产品中，HP可被加入角叉菜胶从而强化质地，特别是例如腊肠的弹性外观。

在旨在膨化的制剂，如Chantilly奶油、糕点表面装饰物或冰激凌中，可使用HP作为增稠剂和/或胶凝剂。

类似的，HP可用在诸如蛋黄酱，蔬菜性木斯(mousse)或含有蛋白质的木斯，例如肉或鱼，或含有清蛋白的木斯，如糖霜等的制剂中。

作为增稠剂和/或胶凝剂，HP还可是酸奶组分的一部分。

在上述食品应用中，一般使用相对于组分(或含有其的制剂)而言0.01-5％(重量)，优选0.05％-2％(重量)的杂多糖(HP)。更优选地，以相对于组分或者制剂重量的0.1-1％(重量)的量使用杂多糖(HP)。

应当注意，杂多糖(HP)不改变其所加入的食品的口味。

本发明最后提供了含有如上述杂多糖(HP)的食品组分或制剂。

下面的实施例不旨在限制的阐明本发明。

实施例

实施例1

本实施例描述了假单胞菌I-2054(或DSM 12295)的纯培养，和保藏该菌株的条件假单胞菌I-2054(或DSM 12295)的纯培养：

用于维持假单胞菌I-2054(或DSM 12295)菌株的培养基是Difco MY琼脂培养基(参考号0712-01-8)。预制的该培养基组分如下：

bacto-酵母提取物        3g

麦芽提取物              3g

bacto-蛋白胨            5g

bacto-右旋糖            10g

bacto-琼脂              20g

21g该培养基稀释至1升蒸馏水中。溶解后，在高压蒸汽灭菌器中于121℃ 15分钟将培养基灭菌。然后将培养基分装入培养皿。

在25-30℃之间，优选25-28℃之间温育的培养皿上进行培养，最少24小时。预培养-保藏：

然后，通过进行液氮冷冻(LNF)方法将该菌株以试管的形式冷冻于-196℃下保藏。

为了液氮冷冻(LNF)，在具有如下成分的PYG10培养基上制备预培养物：

麦芽提取物            3g(获自Oxoid)

酵母提取物            3g(Oxoid)

大豆蛋白胨            5g(Oxoid)

葡萄糖                10g(获自Prolabo)

矿物质水适量          加至1升

为制备培养基，所有成分均分散于矿物质水中。用10％硫酸调节pH至6.5。在高压蒸汽灭菌锅中于120℃将培养基灭菌20分钟。

在旋转摇床(220转/分，振幅＝50mm)上于28℃培养24小时，向培养物加10％(体积)的纯无菌甘油。然后将培养物分配入具有容积为1-10ml，优选2-4ml的冷冻管中。

将这些管在液氮中保藏。

实施例2

本实施例描述了根据两种发酵方法的杂多糖的制备和生产，一种用有机氮源，另一种用无机氮源。

在本实施例中，包括两个“预培养”步骤。这些步骤在500ml锥形瓶中相应于100ml培养基内进行。

相应于细菌菌株产生杂多糖的生产步骤在具有使用体积为15升的20升发酵罐中进行。

振荡摇床的搅拌条件为：速度＝220转/分，振幅＝50mm。

预培养步骤1：

用如下组成的PYG10培养基进行预培养步骤1：

麦芽提取物            3g(Oxoid)

酵母提取物            3g(Oxoid)

bacto蛋白胨           5g(Oxoid)

葡萄糖                10g(获自Prolabo)

蒸馏水适量            加至1升

所有成分均分散入足以配成1升的蒸馏水中。用10％硫酸于灭菌前将培养基pH调节至6.5。在高压蒸汽灭菌锅中于120℃将培养基灭菌20分钟。

灭菌后且用足量冷冻管接种前，pH为7.33。

用足量LNF接种每一锥形瓶。

于28℃在振荡摇床(220转/分，振幅＝50mm)上培养24小时，培养物具有如下特征：

pH＝6.50

粘度＜10mPa.s

28℃培养72小时后MY琼脂培养基(Difco培养基，参考号0712-01-8)上可见菌落＝1.7×10⁵cfu/ml。

培养24小时后，预培养物1用于接种预培养物2

预培养步骤2

用具有如下组成的培养基进行预培养步骤2：

酵母提取物           4g(Oxoid)

MgSO₄.7H₂O         0.8g(Prolabo)

FeSO₄.7H₂O         0.01g(Prolabo)

MnSO₄.H₂O          5ppm Mn²⁺(Prolabo)

K₂HPO₄             4g(Prolabo)

或Na₂HPO₄          3g(Prolabo)

葡萄糖               10g(Prolabo)

去离子水适量         加至1升

在1升蒸馏水中制备100g/l葡萄糖溶液，在121℃下于自然pH灭菌15分钟。

其余成分分散到足以补加为900ml的去离子水中，灭菌前调节pH为6.8，121℃灭菌15分钟。

灭菌后，每一锥形瓶中加入10ml葡萄糖溶液。

灭菌后且接种前的pH为6.88。

用足量预培养物1接种每一锥形瓶。

于28℃在振荡摇床(220转/分，振幅＝50mm)上培养24小时，培养物具有如下特征：

pH＝6.82

粘度＝50-100mPa.s

28℃培养72小时后MY琼脂培养基(Difco培养基，参考号0712-01-8)上可见菌落＝1.6×10⁹cfu/ml。

培养24小时后，预培养物2用于在生产步骤中接种两种发酵培养基(发酵罐1和2)。生产步骤：

最后的步骤是杂多糖(HP)的生产步骤。

发酵罐1中的培养基具有如下组分：

葡萄糖               20g(Prolabo)

CSL(玉米浆)          6g(Prolabo)

MgSO₄.7H₂O        0.8g(Prolabo)

MnSO₄.H₂O         5ppm Mn²⁺(Prolabo)

K₂HPO₄            1g(Prolabo)

消泡剂              0.2ml

去离子水适量        加至1升

葡萄糖足量克数的葡萄糖溶解在补加成3升的去离子水中。用10％硫酸将pH值调节到5以下。在高压蒸汽灭菌锅中121℃于Mariotte瓶中灭菌30分钟。

氮源+盐类足量克数的玉米浆(CSL)，K₂HPO₄ 15g，MgSO₄.7H₂O12g，23ml 10g/l的MnSO₄.H₂O和3ml消泡剂溶解在补加到7升的去离子水中。用10％硫酸调节pH至6.5。在120℃下原位将此混合物灭菌30分钟。

1N氢氧化钠40克氢氧化钠固体溶解于补加到1升的蒸馏水中。溶液在高压蒸汽灭菌锅中120℃于Mariotte瓶中灭菌30分钟。

当所有组分均为28℃时，将其在发酵罐中混合。然后用适量预培养物2接种发酵罐。

发酵罐1的发酵条件如下：

搅拌0-20小时200转/分，然后为400转/分直到发酵终点。

通气0-18小时400l/h，然后从24小时直到发酵终点为825l/h。

调节温度为28℃。

用1N氢氧化钠调节pH为6.8。

压力为大气压。

发酵罐2的培养基具有如下组成：

NaNO₃              12g(Prolabo)

NH₄NO₃            0.25g(Prolabo)

CaSO₄.2H₂O        0.3g(Prolabo)

MgSO₄.7H₂O        0.8g(Prolabo)

MnSO₄.H₂O         5ppm Mn²⁺(Prolabo)

FeSO₄.7H₂O        0.01g(Prolabo)

Na₂HPO₄            3g(Prolabo)

葡萄糖               45g(Prolabo)

消泡剂               0.2ml

去离子水适量         加至1升

葡萄糖足量克数的葡萄糖溶解在补加成3升的去离子水中。用10％硫酸将pH值调节到5以下。溶液在高压蒸汽灭菌锅中120℃于Mariotte瓶中灭菌30分钟。

  氮源+盐类足量克数的NaNO₃ 18g，NH₄NO₃ 3.75g，CaSO₄.2H₂O4.5g，MgSO₄.7H₂O 12g，23ml 10g/l的MnSO₄.H₂O，75ml 2g/l的FeSO₄.7H₂O，Na₂HPO₄ 4.5g和3ml消泡剂溶解在补加到7升的去离子水中。用10％硫酸调节此溶液pH至6。在120℃下原位将此混合物灭菌30分钟。

1N氢氧化钠40克氢氧化钠固体溶解于补加到1升的蒸馏水中。溶液在高压蒸汽灭菌锅中120℃于Mariotte瓶中灭菌30分钟。

当所有组分均为28℃时，将其在发酵罐中混合。然后用足量的预培养物2接种发酵罐。

发酵罐2的发酵条件如下：

搅拌0-20小时200转/分，然后为400转/分直到发酵终点。

通气0-24小时400l/h，然后从24小时直到发酵终点为825l/h。

调节温度为28℃。

用1N氢氧化钠调节pH为6.8。

压力为大气压。发酵结果：

取决于所研究的培养基，发酵时间为60-115小时，可用异丙醇沉淀的固体量为10-18g/kg，就所用碳源而言的重量产率为44-70％。提取和纯化：

用10％(重量/重量)纯IPA稳定终发酵液。然后于pH7在100-110℃下热处理20分钟。在热处理过程中pH不变。

热处理后将发酵液趁热(温度大于70℃)提取。

沉淀条件为：1.7kg热发酵液在4.5kg纯IPA(大约50℃)中。

沉淀后，挑出残渣，然后洗涤并用具有浓度为78％的IPA脱水。

然后在大约85℃的通风炉中干燥残渣直到所得产物的湿含量为大约10％(重量)。

然后研磨残渣并过筛。

在培养基1(有机培养基)中获得的杂多糖之单元分析如下：摩尔比例(质量百分比)

半乳糖      1(13％)

葡萄糖      1.08(14％)

甘露糖醛酸  1.1(17％)

乙酸        4.3(18.6％)

在培养基2(无机培养基)中获得的杂多糖之单元分析如下：质量百分比

半乳糖      (22.5％)

葡萄糖      (21.7％)

甘露糖醛酸  (26％)

乙酸        (31％)

实施例3

本实施例的主题是获自实施例2的HP在食品制剂中用作蛋糕表面的装饰(topping)中的用途。

在下面的实施例中，利用BROOKFIELD RVT 20-2粘度计室温下测定流动粘度(以mPa.s表示)。

弹性模量的值(以Pa表示)是利用CARRIMED CSL 100受控应力流变仪产生的。在频率从0.01-10Hz的振荡系统中测量。膨胀度(以％表示)的测量如下进行：

-将木斯加入已知质量和体积(V)的烧杯中，迅速搅三下，然后将木斯抹平；

-为确定其中所含木斯的质量(M)，将烧杯称重；

-膨胀度＝[M(g)/V(ml)]×100

制备了如下两个制剂：

制剂3.1：包含根据本发明的杂多糖(HP)；

制剂3.2：(比较性)：包含酪蛋白酸钠和藻酸钠。

制剂的组成概述于表1。

表1

成分	制剂3.1(％重量)	制剂3.2(％重量)
			油性相
氢化棕榈油	7.6	7.6
			单二甘油酸乙酸酯	0.76	0.76
单二甘油酸乳酸酯	0.76	0.76
水性相
			糖	8.35	8.35
脱脂奶粉	7.44	7.44
			麦芽糊精(Glucidex19)	4.6	4.6
酪蛋白酸钠	-	1.5
			藻酸钠	-	0.02
杂多糖(HP)	0.5	-
			水(适量)	加至100	加至100

水性相：

在装有去絮凝物浆叶的烧杯中，称出所需的水量，用剧烈搅拌将上述表中所述粉末混合物分散(500转/分)。

在加入所述粉末后搅拌持续5分钟。

油性相：

在烧杯中，在70℃的水浴中加热脂肪类物质和乳化剂。

然后向水性相中在1000转/分搅拌下加入油性相。

在加入油性相后持续搅拌5分钟。在此操作期间，补偿水分蒸发。

然后利用Ultra-Turrax将全部混合物以20000转/分匀浆2分钟。

使混合物冷却到低于10℃的温度，然后进行膨胀。在接近5℃下以最大速度利用KENWOOD CHEF型实验室混合仪进行3分钟。

结果见表2。

表2                   制剂3.1     制剂3.2

膨胀前粘度(mPa.s)     1500        1500

膨胀度(％)            350         250

1Hz下测得的G′(Pa)    1800        1600

1Hz下测得的G″(Pa)    300         400

结果显示，利用本发明HP的制剂3.1具有低于对照性制剂3.2的粘度，因此易于膨胀。

此外，本发明的制剂3.1首先更为凝胶化(在高频下具有较高的G′)，且具有改善的膨胀度。

Claims (22)

1.一种杂多糖(HP)，其特征在于其可由一种培养液发酵而获得，所述培养液包含至少一种假单胞菌属I-2054(或DSM12295)的菌株、其重组体或其突变体，以及一种可被该菌株、其重组体或其突变体中的一种同化的碳源。

2.权利要求1的杂多糖(HP)，其特征在于其包含葡萄糖、半乳糖和/或它们的衍生物，甘露糖醛酸、醋酸和/或其盐的单元。

3.前述权利要求的杂多糖(HP)，其特征在于其包含以相当于1的半乳糖为参照的如下摩尔比例的单元：

-葡萄糖和/或其衍生物：0.2-5，

-甘露糖醛酸和/或其盐：0.2-5，

-乙酸和/或其盐：0-10。

4.前述任一项权利要求的杂多糖(HP)，其特征在于其包含以相当于1的半乳糖为参照的如下摩尔比例的单元：

-葡萄糖和/或其衍生物：0.5-4，优选0.8-2，

-甘露糖醛酸和/或其盐：0.5-4，优选0.8-2，

-乙酸和/或其盐：0-8，优选0-6。

5.权利要求1-4中任一项的杂多糖(HP)，其特征在于甘露糖醛酸和乙酸均以盐形式存在。

6.权利要求1-5中任一项的杂多糖(HP)，其特征在于其具有1×10⁵-8×10⁶g/mol之间的重均分子量(Mw)，优选约8×10⁵-5×10⁶g/mol之间。

7.权利要求1-6中任一项的杂多糖(HP)，其特征在于其具有包含两个端点在内的2.5×10⁶-4×10⁶g/mol之间的重均分子量(Mw)。

8.权利要求1-7中任一项的杂多糖(HP)，其特征在于0.5％重量/重量的该杂多糖(HP)蒸馏水溶液在23℃且在1Hz频率下产生0.1-200Pa之间的G′值，和0.1-20Pa之间的G″值。

9.前述任一项权利要求中的杂多糖(HP)，其特征在于0.5％重量/重量的该杂多糖(HP)蒸馏水溶液在23℃、1Hz频率下产生20-200Pa之间的G′值，和0.5-15Pa之间的G″值。

10.权利要求1-9中任一项的杂多糖(HP)，其特征在于1％重量/重量的该杂多糖(HP)在含有0.5％重量/重量NaCl之蒸馏水溶液中于23℃在0.1S^-1剪切速率下产生100-5000Pa.s之间的流动粘度，特别是200-2000Pa.s之间的流动粘度。

11.权利要求1-10中任一项的杂多糖(HP)，其特征在于1％重量/重量的该HP在含有0.5％重量/重量NaCl之蒸馏水溶液中于23℃在10S^-1剪切速率下产生0.5-300Pa.s之间的流动粘度，特别是5-150Pa.s之间的流动粘度。

12.一种制备权利要求1-11中任一项的杂多糖(HP)的方法，其特征在于按照如下步骤从发酵液中分离杂多糖(HP)：

i)在发酵终点发酵液经过在80℃-120℃之间大约10-60分钟的热处理，

ii)通过一种至少部分水可混溶的有机液沉淀该杂多糖(HP)，

iii)从有机液中分离该杂多糖(HP)。

13.权利要求12的方法，其特征在于在步骤i)中经历热处理的发酵液具有6-8之间的pH值。

14.权利要求12或13中任一项的方法，其特征在于从步骤i)中获得的发酵液应当保持与热处理温度相同的温度。

15.权利要求12-14中任一项的方法，其特征在于在步骤ii)中杂多糖(HP)用一种有机液的沉淀在盐存在下进行，如硫酸根、氯离子或磷酸根的钠盐、钾盐或钙盐。

16.权利要求12-15中任一项的方法，其特征在于在步骤ii)中沉淀在40-60℃之间的温度进行。

17.保藏于CNCM中保藏号为I-2054和也保藏于DSMZ中保藏号为DSM 12295的假单胞菌属的菌株。

18.一种假单胞菌I-2054(或DSM 12295)的纯培养物。

19.权利要求1-11中任一项所述杂多糖(HP)作为增稠剂和/或胶凝剂的用途。

20.权利要求1-11中任一项所述杂多糖(HP)作为增稠剂和/或胶凝剂的在食品制剂中的用途，其中相对于组合物或制剂的重量而言杂多糖(HP)的量在0.01-5％(重量)之间，优选在0.05-2％(重量)之间。

21.权利要求1-11中任一项所述杂多糖(HP)获得凝胶而无需向培养液中加入额外阳离子的用途。

22.一种含有如权利要求1-11中任一项所述杂多糖(HP)的组合物或制剂。