CN1190992A - 重组己糖氧化酶和其产生方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了通过重组DNA技术产生己糖氧化酶的方法、重组己糖氧化酶和这种酶的用途,特别是在生产食品(如生面团、奶制品、动物饲料、药物、化妆品、牙齿保健品用)和生产内酯方面的用途。编码这种酶的DNA的合适来源是海藻,包括Chondrus crispus、Iridophycus paccidum和Euthoracristata。在有用的实施方案中,通过巴斯德毕赤酵母(PichiPastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或大肠杆菌(E.Coli)产生重组己糖氧化酶。

Description

重组已糖氧化酶和其产生方法及用途
                      发明所属技术领域
本文提供了通过重组DNA技术产生己糖氧化酶的方法、这种方法产生的酶和其在食品工业及其它领域的用途。
                      技术背景和现有技术
己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)是一种在氧存在下能够将D-葡萄糖和几种其它的还原糖(包括麦芽糖、乳糖和纤维二糖)氧化成它们相应的内酯的酶，随后这种内酯水解成各自的二糖醛酸。因此己糖氧化酶与另一种氧化还原酶(只能转化D-葡萄糖的葡糖氧化酶)的不同点在于此酶能使用更广泛的糖底物。例如，由己糖氧化酶催化的氧化反应可以表述如下：
或
迄今为止，通过从几种红藻物种(如Iridophycus flaccidum(Bean和Hassid，1956)和Chondrus crispus(Sullivan等1973))中分离己糖氧化酶(下文也称为HOX)，已经提供了此酶。此外，Euthora cristata藻类物种表现出能够产生己糖氧化酶。
据报道，从这些天然来源中分离的己糖氧化酶在生产某些食品中可能具有潜在的用途。这样，从Iridophycus flaccidum中分离的己糖氧化酶表现出能够转化牛奶中的内酯，产生相应的二糖醛酸，另外在牛奶中表现出作为酸化剂的潜在的用途，例如代替用于此目的酸化微生物培养物(Rand，1972)。在这方面，和葡萄糖氧化酶相比，己糖激酶被报道为另一种更令人感兴趣的酶，因为葡萄糖氧化酶只能在不含葡萄糖及伴随加入的葡萄糖或将内酯降解为葡萄糖和半乳糖的内酯降解酶——乳糖酶(在奶制品中)的奶制品和食品中使用。即使这种方式的葡萄糖可以成为葡糖氧化酶的底物，但是，很明显这种葡萄糖氧化酶只能使用50％的乳糖酶的最终产物作为其底物，因此在天然牛奶和奶制品中，葡萄糖氧化酶不是有效的酸化剂。
已经使用了具有抗微生物作用的氧化还原酶的能力(包括己糖氧化酶产生过氧化氢的能力)改进某些食品(包括乳酪、黄油和果汁)的贮存稳定性，这一点已经在JP-B-73/016612上公开。已经表明，氧化还原酶在作为食品的氧净化剂或抗氧化剂方面具有潜在的用途。
在面包店和制粉工业中，已知使用氧化剂(例如碘酸盐、过氧化物、抗坏血酸、K-溴酸盐或偶氮二甲酰胺)来提高面粉的烘烤品质以便使生面团具有改进的伸展性，这样就可以得到所需要的拉力和稳定性。
氧化剂作用之后的机制是面粉蛋白(如小麦面粉中的谷蛋白)含有氧化时形成二硫键的巯基基团，这样所说的蛋白质就形成了更稳定的基质，产生更好的生面团品质及烘烤产品的体积与团粒状结构的改进。
然而，消费者反对几种目前使用的抗氧化剂的这种用途或者调节机构也不同意这种用途，因此，已经试图寻找这些常规的面粉和生面团添加剂的替代品，现有技术建议使用葡萄糖氧化酶用于上述目的。因此，美国2,783,150公开了向面粉中加入葡糖氧化酶以便提高生面团的流变特征。CA 2,012,723公开了改进面包的试剂(包括纤维素分解酶和葡糖化酶)，并且JP-A-084848建议使用包括葡糖氧化酶和脂酶的面包改进组合物。
然而，葡萄糖氧化酶作为改进生面团和面包的添加剂的用途有一定限制，即为了使此酶在生面团体系中有效地发挥作用，其需要葡萄糖作为底物，而通常谷物面粉的葡萄糖含量很低。这样，小麦面粉中葡萄糖以0-0.4％w/w的量存在，即面粉中根本不含有任何葡萄糖。因此生面团中葡萄糖的缺乏或者含量低是使用葡萄糖氧化酶作为生面团改进剂的限制因素。相反，在刚刚制备的生面团中麦芽糖的含量已经很高，并且由于面粉中本来存在的或加入的β-淀粉酶的活性麦芽糖还进一步形成。
己糖氧化酶目前的来源是由上述天然产生的海藻类的提取物中分离出来的粗制或部分纯化的酶制剂。然而，因为在藻类中的已糖氧化酶含量很低，很明显，以这种方式产生此酶十分费力并且很贵，因此不能保证从这些天然来源中进行此酶廉价的商业生产。并且，不能以这种方式进行廉价的足够纯的酶产物的供给。
因此，工业上大量需要提供另外的和更经济的工业上有价值的酶源(而不依靠天然来源)，并且也提供纯化形式的此酶，即不含任何降低酶活性或者其它任何不想要的污染物质，所说的污染物质包括不想要的藻类色素和产生己糖氧化酶的藻类物种生长的海域中的环境污染物。
并且，无可置疑足够量的、价格经济合理、质量上乘的己糖氧化酶在工业上的可获得性使己糖氧化酶不仅在食品工业而且在其它的工业领域将打开新的应用领域，这一点在下文将讨论。重组己糖氧化酶在食品工业的这种新的应用的一个例子是其作为一种生面团改进剂，另外的例子是使用己糖氧化酶活性多肽或产生这种多肽的重组有机体生产内脂。
                          发明概述
通过使用重组DNA技术，本发明首次使以工业上合适的数量、质量和纯度水平(使按照本发明的己糖氧化酶活性多肽高度适合于任何相关的工业目的，其中包括食品和药物的生产)提供已糖氧化酶活性多肽成为可能。
因此，本发明的第一方面是关于生产具有己糖氧化酶活性的多肽的方法，其包括分离或合成编码多肽的DNA片段；把所说的DNA片段引入到适当的宿主有机体，在这种有机体中DNA片段与此DNA片段适当的表达信号相结合；在能够导致己糖氧化酶活性片段表达的条件下培养宿主有机体和从培养基或者从宿主有机体中回收多肽。
在另一方面，本发明涉及到了分离形式的、具有己糖氧化酶活性的多肽和其突变蛋白和变体，所述多肽包括至少一种选自下组的氨基酸序列：
(i)Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro(SEQ ID NO：1)，
(ii)Ala-Ile-Ile-Ash-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO：2)，
(iii)Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe(SEQ ID NO：3)，
(iv)Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr(SEQID NO：4)，
(v)Tyr-Tyr-Phe-Lys(SEQ ID NO：5)，
(vi)Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp(SEQ ID NO：6)，
(vii)Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu- Asp(SEQ ID NO：7)，
(viii)X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met(SEQ ID NO：8)，
其中X代表选自下组的氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
本发明的另一方面还涉及包含编码具有己糖氧化酶活性的DNA片段的重组DNA分子和含有这样一种重组DNA分子的微生物细胞。
在其它方面，本发明适合于使用上述己糖氧化酶活性多肽或者表达这种多肽的微生物细胞生产食品或动物饲料以及生产药物、化妆品或牙齿保健品。
在其它有用的方面，本发明提供了一种减少食品中糖含量的方法，这种方法包括向食品中加入一定量的本文公开的多肽或微生物细胞，所加入的量足以除去至少一部分原来存在于所说的食品中的糖；本发明也提供了由生面团制备烘烤产品的方法，这种方法包括向生面团加入一种己糖氧化酶活性多肽或者表达这样多肽的微生物细胞，本发明也提供了包含按照本发明的多肽或微生物细胞的生面团改进组合物和至少一种常规生面团组分。
在另一方面，本发明涉及使用按照本发明的多肽或微生物细胞作为测定食品中糖含量的分析试剂。
在一个有意义的方面，本发明也提供了按照本发明的多肽或微生物细胞生产内酯的用途，因此将所说的多肽和/或微生物细胞加入到含有可被这种多肽氧化的碳水化合物的反应器中，并在碳水化合物氧化的条件下操作反应器。
                      发明的详尽描述
己糖氧化酶是通过一些海藻类天然产生的。例如在属于大曲菌素目(Gigartinales)的杉海苔科(Gigartinaceae)中发现这样的物种。属于杉海苔科的产生己糖氧化酶的藻类物种的例子是Chondrus crispus和Iridophycus flaccidum。Cryptomeniales目的藻类物种(包括Euthoracristata物种)也是本发明的己糖氧化酶活性多肽的潜在来源。因此，这样的藻类物种是己糖氧化酶活性多肽和编码这种己糖氧化酶活性多肽的DNA的潜在有用的来源。本文使用的术语己糖氧化酶活性多肽是指至少能氧化D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、麦芽糖、乳糖和纤维二糖的酶。
在现有技术中能够做到使用这种天然的资源来分离天然的己糖氧化酶，本发明的目的是鉴定可用于构建cDNA的mRNA的来源和用于构建合成的DNA寡核苷酸之引物的起始点的藻类材料，通常使用水提取物介质通过提取方法从藻类初始材料中分离出所说的酶。
作为这种提取的初始材料，当把藻类从所生长的海域收获后，可以使用藻类的新鲜状态或者例如通过在环境温度下的空气干燥或通过合适的工业干燥法(如循环加热空气干燥或冻结干燥)干燥叶片之后使用。为了使后面的提取步骤变得简便易行，可以将新鲜的或干燥的起始材料捣碎(例如通过研磨或者混和)。
作为水提取介质，具有6-8范围内pH值的缓冲液(如0.1 M磷酸钠缓冲液、20mM三乙醇胺缓冲液或20mM Tris-HCl缓冲液)是适合的。通常通过在缓冲液悬浮初始材料并且在0-20℃(例如大约5℃)保持悬浮1-10天，来从藻类材料中提取己糖氧化酶，优选的是在搅动的条件下进行。
然后通过合适的分离方法(如过滤、筛分或离心)从含水介质中分离悬浮的藻类，接下来从滤液或上清液中回收己糖氧化酶。可有可无的是将藻类物质进行一种或多种另外的分离步骤。
因为这几种海藻中含有色素(如藻蓝蛋白)，因此需要将得到的滤液或上清液进行另外的纯化步骤，这样就除去了这些色素。作为一个例子，可以通过用有机溶剂处理滤液或上清液来除去所说的色素(在所说的有机溶剂中色素是可溶的)，接下来从含水介质中分离含有溶解的色素的溶剂。
可以通过任何合适的使蛋白质从含水介质中分离的常规方法从水提取介质中回收己糖氧化酶。这些方法(其例子将在下文详尽描述)包括如离子交换层析等的方法，可有可无地是然后进行浓缩步骤(如超滤)。通过加入某些物质(如(NH4)2SO4，其能够使所说的蛋白质沉淀)也可能回收所说的酶，然后分离沉淀物，可任选的是将沉淀在允许所说的蛋白质溶解的条件下处理。
本发明的目的是期望以实质上纯化的形式(如实质上不含其它蛋白或没有非蛋白污染物质的制剂)提供所说的酶，因此理想的是将从上述提取和分离步骤获得的相对的粗酶制剂进行另外的纯化步骤(如另外的色谱步骤、凝胶过滤或者是层析聚焦)，这些也将在下文通过实施例进行描述。
如上文所述，通过重组DNA方法获得按照本发明的己糖氧化酶活性多肽，这种方法使得可以通过在培养基中培养含有编码己糖氧化酶之基因的合适的宿主有机体细胞，并从所说的细胞和/或培养基中回收此酶来产生己糖氧化酶活性多肽。
本文提供的产生己糖氧化酶的方法包括分离和构建编码己糖氧化酶的DNA片段(作为第一步骤)。对于提供这种DNA片段，有几种策略是可行的。这样，同样可以从天然产生己糖氧化酶的有机体中分离所说的DNA片段。为了确定编码DNA片段的位置，有必要在合适的条件下处理将与所寻找的DNA片段杂交的RNA或者DNA探针序列，然后分离包含所说的编码序列的DNA片段并将其克隆到合适的克隆载体上。
在下面实施例中详细公开的另一个适合策略是从产生这种己糖氧化酶的有机体中分离mRNA，并将这种mRNA作为构建cDNA文库的起始点，这种cDNA文库然后用于聚合酶链反应(PCR)合成基于寡核苷酸引物的DNA，所说的引物是以己糖氧化酶的氨基酸序列为基础合成的。已发现这种策略对提供编码己糖氧化酶的DNA片段是合适的。这里简要描述了下文通过实施例详细描述的这种策略。
合成寡核苷酸是以HOX-2和HOX-3肽序列为基础制备的，所说的HOX-2和HOX-3肽序列如下文所述是通过对从Chondrus crispus中提取的40 kD己糖氧化酶多肽进行endoLys-C消化而制备的。使用首链cDNA作为模板的PCR及使用有意义的HOX-2引物和反义HOX-3引物产生407 bp的DNA片段。将这片段插入到大肠杆菌载体(pT7 Blue)中，然后进行测序。已经发现除了HOX-2和HOX-3肽序列外，此407 bp片段也包含含有上述得自Chondruscrispus 40 kD己糖氧化酶的HOX-4和HOX-5肽的开放读框，所说的己糖氧化酶片段的分离也在下文描述。
基于407 bp片段合成有意义和反义寡核苷酸，然后可以通过使用cDNA作为模板的PCR分别分离800和1400 bp片段。将这两种片段克隆到pT7 Blue载体中，然后进行测序。5片段的DNA序列显示出含有HOX-6肽的开放读框，所说的HOX-6肽也是从上述的衍生于Chondrus crispus的40 kD己糖氧化酶片段分离到的。同样3片段显示出含有HOX-1(下文公开了HOX-1的分离)和HOX-7与HOX-8(这两种片段是从衍生于Chondrus crispus的29 kD己糖氧化酶多肽中分离的，所说的多肽通过如下文描述endoLys-C消化而获得)的阅读框架。
以上文描述的组合DNA序列为基础，合成相当于假定的hox基因的5端的寡核苷酸和相当于此基因3端的寡核苷酸。这两种寡核苷酸用于使用首链cDNA作为模板的PCR，结果产生了大约1.8 kb的DNA片段。将此片段克隆到上述的大肠杆菌载体中并测序。所说的DNA序列与上述的5端、407bp和3端序列组合而成的序列相同，因此可以得出结论：此大约1.8 kb DNA序列编码衍生于Chondrus crispus的40kD和29kD的己糖氧化酶片段。
技术人员应该清楚，上述的分离编码己糖氧化酶活性多肽的DNA片段的策略(包括分离和定性己糖氧化酶)可以用于构建同样的编码非衍生于Chondrus crispus的任何其它天然来源(包括海藻类)的己糖氧化酶(如来源于其它植物或来源于微生物)的片段。
另外，可以通过已建立的标准方法经合成构建编码己糖氧化酶活性多肽的DNA片段的DNA序列，例如Beaucage和Caruthers描述的phosphoamidite方法(1981)，或者Matthes等描述的方法(1984)。按照phosphoamidite方法，合成(例如在自动DNA合成仪上合成)、纯化、退火、连接寡核苷酸并将其克隆到合适的载体中。
并且，所说的DNA片段可以是混合基因组的和合成的起源的、混合合成的和cDNA起源的或者是混合基因组的和cDNA起源的，这种DNA片段是按照标准技术通过连接合成的、基因组起源的或cDNA起源的亚片段(作为合适的相当于整个DNA片段的各个部分的亚片段)来制备的。
按照本发明，在此方法的下一步骤中，将分离的或者合成的编码己糖氧化酶活性多肽的DNA片段引入到合适的宿主有机体中，在这种有机体中此DNA片段与其适当的表达信号可操作地组合在一起。这种引入可以通过技术人员公知的方法进行，包括构建具有所说的插入片段的载体并用此载体转化所说的宿主细胞。合适的载体包括在所选择的宿主有机体中能够复制的质粒。也可以考虑将所说的DNA片段插入到宿主有机体的染色体中，例如通过将所说的片段插入到一种转座因子(如转座子)中，并将所选择的宿主有机体与转座子的混合物放置在此转座子将插入到所说的宿主有机体的染色体中并与合适的表达信号组合在一起的条件下。
按照本发明，如上述方法或本领域任何已知的其它方法产生的编码己糖氧化酶活性多肽的DNA片段(包含所说的多肽基因)可以通过使用表达载体以酶促活性形式表达。表达载体通常包括典型克隆载体的组件，即使载体在选择的宿主有机体中自主复制的组件和一种或多种用于选择的表型标记。表达载体包括控制序列(包括启动子、操纵子)、核糖体结合位点、翻译起始信号，可以含有也可以不含有阻遏物基因或一种或多种激活物基因。为了使所表达的多肽分泌出来，可以在所说的基因的编码序列的上游插入信号序列。在本文中，术语″表达信号″包括任何上述的控制序列、阻遏物或激活物基因和信号序列。为了在控制序列的直接控制下表达，编码己糖氧化酶的基因以合适的方式可操作地连接到与表达有关的控制序列上。可以渗入到质粒载体中并可以支持己糖氧化酶基因转录的启动子序列包括，但不限于：tac启动子和衍生于噬菌体γ的启动子(包括PL和PR启动子)。
携带本发明的DNA片段的表达载体可以是能够在所选择的宿主有机体中表达己糖氧化酶基因的任何载体，载体的选择依赖于其将要被引入的宿主细胞。这样，所说的载体可以是自主复制的载体，即以染色体外遗传实体存在的载体，这种载体的复制独立于染色体的复制，例如质粒、噬菌体或染色体外遗传因子、微型染色体或人工染色体。另外，所说的载体可以是这样一种载体，当其被引入到宿主细胞时，其插入到宿主细胞基因组中并与染色体一起复制。
在载体中，编码己糖氧化酶活性多肽的DNA片段将可操作地与合适的启动子序列组合在一起。所说的启动子可以是任何赋予所选择的宿主有机体转录活性的DNA序列，可以来源于编码与宿主有机体同源或异源的蛋白质的基因。在细菌宿主中指导本发明的DNA片段转录的合适的启动子的例子是大肠杆菌的lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣型芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因启动子(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amyM)的启动子、液解化淀粉杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子。
对于真菌物种中转录，有用的启动子的例子是那些来源于编码巴斯德毕赤酵母乙醇氧化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲酶碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或者构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。在酵母物种中用于表达的合适的启动子的例子可以提到的是酿酒酵母的Gal 1和Gal 10启动子。当在细菌物种(如大肠杆菌)中表达时，可以从噬菌体启动子(包括T7启动子或者λ噬菌体启动子)中选择合适的启动子。
包含编码己糖氧化酶活性多肽的DNA片段的载体也可以包含选择标记，如一种基因，这种基因的产物在宿主有机体中弥补某种缺陷(例如赋予营养缺陷体表型的突变)，或者所说的标记可以是赋予抗生素抗性或对重金属离子的抗性。
本发明的包含DNA构建体或上文所描述的表达载体的宿主有机体的优点是在重组产生按照本发明的多肽的过程中用作宿主细胞。用包含编码本发明多肽之基因的DNA构建体转化所说的细胞或者更方便地是通过将所说的DNA构建体整合到宿主染色体上来转化所说的细胞。一般认为这种整合是有利的，因为所说的DNA片段更可能在所说的细胞中稳定保持。可以按照常规的方法(如通过同源或异源重组或者通过转座因子的方法)将这种DNA构建体整合到宿主染色体中。另外，可以使用如上所描述的表达载体转化所说的宿主有机体。
按照本发明，所说的宿主有机体可以是高等有机体的细胞，如动物细胞(包括哺乳动物、鸟或者昆虫细胞)或者植物细胞。然而，在优选的实施方案中，所说的宿主有机体是微生物细胞，如细菌或真菌细胞(包括酵母细胞)。
合适的细菌宿主有机体的例子是革兰氏阳性细菌物种，例如芽胞杆菌科(Bacillaceae)(此科的细菌包括枯草芽孢杆菌、地衣型芽胞杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、液解化淀粉杆菌、凝固芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))；链霉菌属(Streptomyces)物种(如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus))；乳酸细菌类，此类包括乳球菌属(Lactococcus)的几个种(如乳乳球菌(Lactococcus lactis))、乳酸杆菌属(lactobacillus)的几个种(包括路氏乳杆菌lactobacillus reuteri)、明串珠菌属(Leuconostoc)的几个种；和链球菌属(Streptococcus)的几个种。另外，可以选择革兰氏阴性细菌物种作为宿主有机体，如属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的物种(包括大肠杆菌)或属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的物种。
从酵母属(Saccharomyces)的物种(包括酿酒酵母)或从属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种中选择酵母宿主有机体是有利的。在丝状真菌中合适的宿主有机体包括曲霉属(Aspergillus)的各物种，如米曲酶、构巢曲霉或黑曲霉。另外，新月孢子菌素(Fusarium)各物种(如尖镰孢(Fusarium oxysporum))的菌株或者Rhizomucor各物种的菌株(如Rhizomucor miehei)的菌株可以作为宿主有机体。在一个优选的实施方案中，巴斯德毕赤酵母类的菌株用作宿主有机体。
可以通过一种方法转化一些上述的有用的宿主有机体(如真菌物种或者是革兰氏阳性细菌物种)，这种方法包括原生质体的形成和原生质体的转化，然后以本来就已知的方式进行细胞壁的再生。
对于己糖氧化酶活性多肽的产生，在使所说的多肽以可回收的形式表达的条件下培养上述的重组宿主有机体细胞。用于培养这种细胞的培养基可以是任何适于所说的宿主细胞生长且适于获得表达的多肽的常规培养基。合适的培养基可以销售商提供，或者可以按照出版的配方制备。
一般是通过常规的方法回收所获得的多肽，这种方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞；如果需要，在细胞破碎后，沉淀上清液或滤液中的蛋白(proteinaceous)组分(例如，通过加入盐(如硫酸铵))；然后进行纯化步骤。
本发明在工业上的一个方便的方面是用于生产食品和饲料产品的微生物培养物(如细菌培养物)可以用作表达编码己糖氧化酶活性多肽之基因的宿主有机体。这样，用于奶制品或其它食品生产的并且，例如包含选自上述的任一之乳酸细菌物种的一种或几种乳酸细菌菌株的乳酸细菌起子培养物可以用作宿主有机体，这样在向其中加入了起子培养物的食品中将直接产生己糖氧化酶。
同样，可以将按照本发明的编码己糖氧化酶的基因引入到用作接种物的乳酸细菌起子培养物中，这种培养物被加入到饲料作物(如草或玉米)或者动物的蛋白废物(如鱼和屠杀场废物)中，以便生产饲喂动物的青贮饲料。为此，经青贮饲料接种物表达己糖氧化酶表明本来存在于保藏于保藏室的作物或废物中的氧没有了，这样将建立抑制耗氧有机体(如革兰氏阴性细菌和酵母)生长的厌氧条件。
也考虑到了将用于酒精饮料(包括葡萄酒和啤酒)生产的酵母培养物(如面包酵母或者是酵母培养物)用作编码本发明的己糖氧化酶活性多肽之基因的宿主有机体。例如，在使用这种重组面包酵母菌株时，所产生的己糖氧化酶将具有生面团改进作用，这一点将在下文描述。
从以上的描述可知，向食品或其它任何需要己糖氧化酶活性的产品中直接加入表达按照本发明的己糖氧化酶的重组微生物培养物可以作为加入分离的酶的替代方法。
在另一个对工业具有重要意义的实施方案中，在产生所说的酶或从上述任意一个被所说的己糖氧化酶活性酶氧化的碳水化合物中产生内脂的生物反应器中使用表达己糖氧化酶活性多肽的重组微生物培养物。在产生内脂方面，将所说的微生物培养物细胞固定在固体支持物(如聚合物材料)上是有利的，其中小颗粒形式的固体支持物是优选的，这样能提供更大的结合细胞的表面积。另外，分离的酶可以用作上述的目的，其结合到固体支持物上也是优选的。在连接过程中，可以通过任何常规的能达到此目的的方法使细胞或所说的酶结合。
在本发明其它有用的实施方案中，具有己糖氧化酶活性的多肽可以是融合产物，即一种除了己糖氧化酶活性氨基酸序列外，还包含具有其它有用活性的氨基酸序列的多肽。这样，除了己糖氧化酶活性外还考虑了具有一种或多种酶活性的融合多肽。可以在能降解碳水化合物的酶中选择这种附加的酶活性，如乳糖酶、淀粉酶(包括葡糖淀粉酶)、葡聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、乳糖酶、以及任何其它的氧化还原酶(如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶或者是吡喃糖氧化酶)，和任何的蛋白酶和肽酶、脂酶或核酸酶。将选择的用于整合到按照本发明的己糖氧化酶多肽上的附加的酶序列依赖于将使用所说的活性融合产物的产品。这样，作为例子，考虑到使用于生产奶制品的己糖氧化酶活性融合多肽包含乳糖酶、蛋白酶或者肽酶，并且作为融合配偶体的用于改进生面团品质的融合多肽可以是任意一种上述的降解碳水化合物的酶是有利的。上述的表达具有附加的酶活性之己糖氧化酶活性融合多肽的按照本发明的微生物细胞可以以如上所述的同样方式用于接种其它的食品和动物饲料。
也考虑了合适的融合配偶体可以是赋予己糖氧化酶别的性质(如溶解性)的序列，或者是能作为标记基团的序列，此序列赋予己糖氧化酶更强烈地或更具选择性地结合到用于己糖氧化酶多肽纯化或固定的特异固体物质上。
并且，提供作为嵌合产物的多肽也在本发明的范围内，所说的嵌和产物包含不同来源的己糖氧化酶活性多肽的部分序列，并由通过将不同来源的编码己糖氧化酶活性多肽的DNA序列组合到一个编码所说的全长嵌和蛋白的DNA片段中而构建的DNA片段编码。
在一个有用的实施方案中，按照本发明的方法是这样一种方法，其中所说的编码己糖氧化酶活性多肽的DNA片段包含至少一种编码选自下组的氨基酸序列和其突变蛋白和变体的DNA序列：
(i)Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro(SEQ ID NO：1)，
(ii)Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO：2)，
(iii)Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe(SEQ ID NO：3)，
(iv)Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr(SEQID NO：4)，
(v)Tyr-Tyr-Phe-Lys(SEQ ID NO：5)，
(vi)Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp(SEQ ID NO：6)，
(vii)Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp(SEQ ID NO：7)，
(viii)X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met(SEQ ID NO：8)，
其中X代表选自下组的氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
在本文中，术语″变体″用于指己糖氧化酶活性多肽序列的任何修饰，这种修饰不会导致己糖氧化酶活性的完全丧失。当所说的多肽来源于天然的来源或为已修饰的多肽序列时，所说的修饰可以包括存在于此多肽中的氨基酸残基的缺失、取代；或者所说的修饰可以是在这种附加的氨基酸残基之多肽中的插入。可以通过修饰或取代编码所说的一个或多个氨基酸的需要取代的一个或多个密码子来完成一个或多个氨基酸残基的取代，例如，使用本来已知的方法通过诱变，特别是定点诱变完成。同样地，可以通过缺失编码按照本发明之多肽的DNA片段的相应的一个或多个密码子来完成一个或多个氨基酸残基的缺失。
如上所述，作为按照本发明的方法的另外一步包括纯化从培养基和/或微生物最初回收的多肽制剂。另加此步的目的是获得其中的己糖氧化酶多肽实质上为纯化形式的酶制剂。术语″实质上纯化的形式″意味着此制剂不含任何不需要的来源于培养基、生产宿主有机体细胞或者这些细胞在培养过程中产生的物质的污染物质。这样，从纯化步骤获得的多肽制剂实质上只含己糖氧化酶酶促活性，这一点在许多应用上是至关重要的。纯化方法依赖于所要求的纯度，但一般是从常规的蛋白质纯化方法中选择，如盐析、亲和或离子交换层析方法(包括疏水作用层析和凝胶过滤方法(如在下文的实施例中描述的方法))。
如上所述，在另一方面本发明涉及分离形式的具有己糖氧化酶活性的多肽，这种多肽包含至少一种上述氨基酸序列，或者如上所说的其突变蛋白(突变蛋白)和变体。优选的是，按照上文描述的方法产生所说的多肽。
依据产生，特别是产生所讨论的宿主有机体的方法，可以将按照本发明的多肽以不同的程度进行糖基化，或者为了某些目的，将其以实质上非糖基化形式表达是有利的。
在本发明的一个优选的实施方案中，所说的多肽可以是这样一种多肽，即其具有与在海藻物种Chondrus crispus之中天然产生的己糖氧化酶相同或部分相同的功能性质，这一点在现有技术中已描述过。已发现这种从海藻中提取的己糖氧化酶，当进行如本文描述的SDS-PAGE时，显示出几条分离的蛋白带，即29、40和/或者60 kD。
为了能广泛地成本合算地使用所说的多肽，理想的是此酶在广泛的pH值范围内都具有高的酶促活性。这样，按照本发明的己糖氧化酶至少在1-9的pH范围内显示出酶活性，如在2-9的pH范围内(包括5-9的pH范围)。在这种前后关系中，通过改变如上所述的酶或通过复制子或者包含编码己糖氧化酶之DNA的宿主有机体的随机诱变，然后选择具有所需要的变化pH性质的突变体，天然来源的己糖氧化酶的活性pH范围或pH最佳值可以以所需要的方向和所需要的程度改变。另外，此酶这种改变的目的是改变己糖氧化酶活性多肽之活性的耐热性和最佳稳定，或者改变此酶的等电点。
另外，按照本发明的多肽理想的是在广泛的温度范围内具有酶促活性，如在10-90℃的范围内(例如15-80℃的范围内(包括20-60℃的范围))。特别是，己糖氧化酶活性多肽在70℃或更高的温度下仍保持重要的残余的酶促活性，对于某些特殊目的这一点是理想的，如当此酶用于生面团时，其在至少部分接下来的烘烤步骤中具有己糖氧化酶活性，这一点可能是有用的。
己糖氧化酶的应用的范围取决于它们用作动物的碳水化合物的范围。尽管，己糖氧化酶看来似乎对己糖(如葡萄糖、半乳糖和甘露糖)具有最高的底物特异性，但是已发现可以用作本发明之多肽的底物的碳水化合物的范围不限于己糖。这样，优选的多肽是这样的一种，即除了对己糖具有高的特异性外，对其它的碳水化合物(包括二糖(如乳糖、麦芽糖和/或纤维二糖))也具有高的特异性，甚至对戊糖也具有实质的特异性，所说的戊糖作为例子包括木糖、或者脱氧戊糖或者脱氧己糖(如鼠李糖或者墨角藻糖)。所有这些表明己糖氧化酶除了对己糖和其它的单糖具有高的特异性外，对二糖也具有实质的特异性，特别是对存在于牛奶中的乳糖和谷物面粉及生面团中不存在的麦芽糖。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽是这样一种多肽，其除了氧化D-葡萄糖外，还氧化至少一种选自由下列各种糖组成的组中的糖：D-半乳糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖、D-甘露糖、0-墨角藻糖和D-木糖。
在另一个优选的实施方案中，己糖氧化酶活性多肽的等电点在4-5范围内。特别是，所说的多肽优选的是具有4.3±0.1的等电点或者4.5±0.1的等电点。
一般来说，按照本发明的多肽一般具有如通过凝胶过滤使用聚丙烯酰胺S-200 Superfine(Pharmacia)确定的100-150 kD范围内的分子量，通过这种或相当的方法确定的分子量也被称为表观分子量。特别是所说的多肽具有110 kD±10kD的表观分子量。
在另一方面，本发明提供了包含编码具有己糖氧化酶活性之多肽的DNA片段的重组DNA分子。可以从天然来源中分离这种DNA片段(这一点已在上文描述过)，或者可以构建这种DNA，例如在下文的实施例中详细描述的。并且，可以基于天然产生的己糖氧化酶的氨基酸序列合成所说的编码片段。可以从任何上述的表达载体类型中选择重组分子。在优选的实施方案中，重组DNA分子包括编码己糖氧化酶多肽或者这种多肽之突变蛋白或衍生物的DNA片段，所说的己糖氧化酶多肽包含上述的氨基酸序列(i)至(viii)的任何一个。在一个特殊的实施方案中，所说的重组DNA分子包含下列DNA序列(SEQ ID NO：30)：TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTCTG GTACCGTGTA TGTCAAAGGT       60TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACGATGGCTA CTCTTCCTCA GAAAGACCCC GGTTATATTG      120TAATTGATGT CAACGCGGGC ACCGCGGACA AGCCGGACCC ACGTCTCCCC TCCATGAAGC      180AGGGCTTCAA CCGCCGCTGG ATTGGAACTA ATATCGATTT CGTTTATGTC GTGTACACTC      240CTCAAGGTGC TTGTACTGCA CTTGACCGTG CTATGGAAAA GTGTTCTCCC GGTACAGTCA      300GGATCGTCTC TGGCGGCCAT TGCTACGAGG ACTTCGTATT TGACGAATGC GTCAAGGCCA      360TCATCAACGT CACTGGTCTC GTTGAGAGTG GTTATGACGA CGATAGGGGT TACTTCGTCA      420GCAGTGGAGA TACAAATTGG GGCTCCTTCA AGACCTTGTT CAGAGACCAC GGAAGAGTTC      480TTCCCGGGGG TTCCTGCTAC TCCGTCGGCC TCGGTGGCCA CATTGTCGGC GGAGGTGACG      540GCATTTTGGC CCGCTTGCAT GGCCTCCCCG TCGATTGGCT CAGCGGCGTG GAGGTCGTCG      600TTAAGCCAGT CCTCACCGAA GACTCGGTAC TCAAGTATGT GCACAAAGAT TCCGAAGGCA      660ACGACGGGGA GCTCTTTTGG GCACACACAG GTGGCGGTGG CGGAAACTTT GGAATCATCA      720CCAAATACTA CTTCAAGGAT TTGCCCATGT CTCCACGGGG CGTCATCGCA TCAAATTTAC      780ACTTCAGCTG GGACGGTTTC ACGAGAGATG CCTTGCAGGA TTTGTTGACA AAGTACTTCA      840AACTTGCCAG ATGTGATTGG AAGAATACGG TTGGCAAGTT TCAAATCTTC CATCAGGCAG      900CGGAAGAGTT TGTCATGTAC TTGTATACAT CCTACTCGAA CGACGCCGAG CGCGAAGTTG      960CCCAAGACCG TCACTATCAT TTGGAGGCTG ACATAGAACA GATCTACAAA ACATGCGAGC     1020CCACCAAAGC GCTTGGCGGG CATGCTGGGT GGGCGCCGTT CCCCGTGCGG CCGCGCAAGA     1080GGCACACATC CAAGACGTCG TATATGCATG ACGAGACGAT GGACTACCCC TTCTACGCGC     1140TCACTGAGAC GATCAACGGC TCCGGGCCGA ATCAGCGCGG CAAGTACAAG TCTGCGTACA     1200TGATCAAGGA TTTCCCGGAT TTCCAGATCG ACGTGATCTG GAAATACCTT ACGGAGGTCC     1260CGGACGGCTT GACTAGTGCC GAAATGAAGG ATGCCTTACT CCAGGTGGAC ATGTTTGGTG     1320GTGAGATTCA CAAGGTGGTC TGGGATGCGA CGGCAGTCGC GCAGCGCGAG TACATCATCA     1380AACTGCAGTA CCAGACATAC TGGCAGGAAG AAGACAAGGA TGCAGTGAAC CTCAAGTGGA     1440TTAGAGACTT TTACGAGGAG ATGTATGAGC CGTATGGCGG GGTTCCAGAC CCCAACACGC     1500AGGTGGAGAG TGGTAAAGGT GTGTTTGAGG GATGCTACTT CAACTACCCG GATGTGGACT     1560TGAACAACTG GAAGAACGGC AAGTATGGTG CCCTCGAACT TTACTTTTTG GGTAACCTGA     1620ACCGCCTCAT CAAGGCCAAA TGGTTGTGGG ATCCCAACGA GATCTTCACA AACAAACAGA     1680GCATCCCTAC TAAACCTCTT AAGGAGCCCA AGCAGACGAA ATAGTAGGTC ACAATTAGTC     1740ATCGACTGAA GTGCAGCACT TGTCGGATAC GGCGTGATGG TTGCTTTTTA TAAACTTGGT     1800A                                                                     1801
并且，在另一方面本发明提供了包含上述重组DNA分子的微生物细胞。上述包含编码按照本发明之多肽的DNA片段的宿主有机体的一般描述是围绕微生物细胞的，因此可以从上述的任何微生物族(科、属和种)中选择这种细胞，即所说的微生物细胞可以从细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞(作为例子，包括大肠杆菌细胞、乳酸细菌细胞、酿酒酵母细胞和巴斯德毕赤酵母细胞)中选择。
如果按照本发明的微生物细胞目的是直接加入到产物(例如在此产物的生产过程中，需要所说的微生物细胞具有己糖氧化酶活性)中，可以以微生物培养物的形式，理想的是浓缩的形式提供本发明的微生物细胞。这样，这种培养物以理想的是每克培养物105到1012范围内的浓度含有按照本发明的微生物细胞是有利的。所说的培养物可以是新鲜的培养物，即位于液体培养基中的没有冷冻悬浮的细胞，或者可以是冷冻或干燥形式的培养物，如冷冻干燥培养物。也用于特殊目的的微生物细胞可以固定在固体底物上。
如上所述，在另一方面本发明涉及按照本发明的己糖氧化酶活性多肽的用途或者食品生产过程中表达这种多肽的微生物细胞的用途。在本文中，术语″生产″应该理解成更广泛的意义，这样其包含在接下来的加工步骤之前、进行之中或之后、包装或储藏成品直到消费的过程中，将己糖氧化酶或者所说的微生物细胞加入到正在讨论的食品的各组分中。这种使用有用的任何食品可以是任何己糖氧化酶的最终产物在所说的食品上产生有利影响的产物。
自然，如果此酶的底物以足够的量存在，将只获得己糖氧化酶的所需的活性。底物碳水化合物可以天然存在于食品中或它的各组分中，或者可以在生产期间加入或产生它们。在生产过程中产生的底物的例子是二糖、寡糖或多糖酶促降解成为能由已糖氧化酶降解的低聚糖，这一过程是天然存在与所说的食品中的或在生产过程中加入的酶的酶促活性结果。并且，可以经如上所述的融合配偶体的酶促活性产生己糖氧化酶活性多肽的底物。
含有所说的酶之底物的成品中的所需要的己糖氧化酶活性包括从糖底物产生接下来能转化成相应的酸的内酯和产生过氧化氢并消耗氧。
其中含有有利的己糖氧化酶活性的食品的典型例子包括奶制品、含有淀粉的食品和不含奶的饮料(作为例子)。这样，在生产一定范围内的奶制品时，降低pH值是必需的。通过将牛奶与产生乳酸的起子培养物一起培养可以方便地达到此要求。如上所述，考虑到了己糖氧化酶或者表达此酶的微生物可以用作酸化牛奶的另一种方法。在生产过程中进行酸化的其它食品(如某些肉制品或蔬菜产品)需要同样的作用，当前通过加入乳酸细菌起子培养物来酸化这些食品。
由于己糖氧化酶的活性而对氧的消耗在食品和药物所生产方面具有积极的意义。通过消耗和除去食品或含有脂类(所说的脂类很容易氧化酸败)的药物中的氧，己糖氧化酶可以充当抗氧剂的作用，另外氧含量的降低可以抑制酸败微生物(这种微生物的生长依赖氧的存在)，因此，己糖氧化酶活性多肽也可以作为抗微生物剂。
可以使用这后一种作用延长包装食品的存放期，在这种食品中通过在食品本身中加入按照本发明己糖氧化酶活性多肽或者通过在包装(但与食品的组分分开)中提供己糖氧化酶与其合适的底物的混合物而阻止酸败。在典型的实施例中，将这种混合物，例如以罐装或瓶装附于食品容器的内侧。因此，按照本发明的己糖氧化酶在食品包装中可以用作去氧剂。
很明显，按照本发明之多肽在生产食品中的上述作用也可以应用在生产动物饲料产品上。特别是，这些作用在生产由草本作物(如草或谷物)、或者屠杀场或来源于鱼加工厂的动物蛋白废物组成的青贮饲料是必要的。目前，通过加入酸或产生酸的细菌(如乳酸细菌)接种物将饲料保藏于保藏室中。为了促进酸化细菌的生长并阻止需氧酸败微生物(如革兰氏阴性细菌和酵母)的生长，青贮饲料材料中具有低的氧浓度是必要的。并且，考虑到按照本发明的己糖氧化酶在储藏的饲料中作为去氧和酸化剂是有用的，其可任意以还包含一种或多种方便的青贮饲料添加剂(如乳酸细菌接种物或产生低分子糖物质的酶)的组合物形式存在。
按照本发明的己糖氧化酶多肽的另一个有用的应用是使用此酶降低食品中的糖含量，这种应用包括向所说的产物中加入一定量的这种多肽或产生这种多肽的微生物细胞，所加入的量足以除去至少原先存在于该食品中的部分糖。例如，这种应用可能对生产需要低糖含量的糖尿病患者食物及生产酒精含量降低的葡萄酒是有用的。在后一种应用中，优选的是在酵母接种前，向鲜葡萄汁中加入所说的己糖氧化酶。
在另一有用的方面，本发明涉及己糖氧化酶活性多肽或者产生按照本发明的酶的微生物在生产药物、化妆品或者牙齿保健品(如牙膏或牙粉)方面的用途。所需要的己糖氧化酶在这些产品中的作用实质上是上文描述的与食品及动物饲料有关的那些作用。
按照本发明的己糖氧化酶的一个特别令人感兴趣的用途是其作为生面团改进剂的用途。已经发现向生面团中加入所说的己糖氧化酶，当将其拉长时，生面团对断裂的抗性增加，即此酶赋予生面团增加的强度，因此其不易发生机械变形。在这一点上以葡糖氧化酶的这种作用为基础，考虑到了加入按照本发明的己糖氧化酶的作用是在面粉蛋白的含硫氨基酸的巯基基团间形成交联，这种交联是在此酶产生的过氧化氢与因此氧化的巯基基团反应时发生的。
因此，本发明也提供了从生面团制备烘烤产品的方法，这种方法包括向生面团中加入有效量的所说的多肽或能够表达这种多肽的按照本发明的微生物、生面团改进组合物，这种组合物包含这种多肽或能够在生面团中表达这种多肽的微生物、至少一种常规的生面团组分。在有用的实施方案中，这种组合物还可以包含至少一种改进生面团或者面包产品的酶，所说的酶选自例如纤维素酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、脂酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖氧化酶和蛋白酶。
在本发明的另一个方面，己糖氧化酶在确定生物和其它样品中可由此酶转化之任何糖的浓度的方法中作为分析试剂。典型地，通过确定由酶促转化存在于待测样品中的底物糖所形成的最终产物的量来测量糖的含量。在这一点上，考虑到了己糖氧化酶在体外分析测定中可以直接作为试剂，或者可以将其加入到传感器中。
在下列实施例和其所附的附图中通过具体说明来描述此发明。
图1以图解形式概述己糖氧化酶(HOX)的纯化和用于获得氨基酸序列信息的两种策略。
图2显示出在不同纯化步骤中，己糖氧化酶未分离的非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(非变性PAGE)的制剂。该样品代表在阴离子交换层析和浓缩之后获得的酶制剂(1道)，凝胶过滤之后获得的酶制剂(2道)，阳离子交换层析获得的酶制剂(3道)或层析聚焦后获得的酶制剂(4道)。快速凝胶(Pharmacia，8-25％梯度凝胶)以银染色。左边表明标准蛋白质的分子量(×10-3)。以箭头表明的相当于己糖氧化酶的带是通过另一个对照凝胶的酶染色来确定的(没有表示出来)。这四个道都是在单独的凝胶上跑出来的。
图3显示出通过如在本文描述的聚丙烯酰胺S-200 HR凝胶过滤纯化己糖氧化酶期得到的UV谱。以填充部分表示包含己糖氧化酶(HOX)活性的组分。
图4显示出从Chondrus crispus通过在DEAE-琼脂糖凝胶Fast Flow的阴离子交换层析、聚丙烯酰胺S-200的凝胶过滤、之后是S-琼脂糖凝胶FastFlow上的阳离子交换层析(1道)或者通过在Mono P柱上层析聚焦(2道)而纯化的已糖氧化酶的SDS-PAGE。左边表示标准蛋白质的分子量(×10-3)。以箭头标记在60 kD、40 kD和29kD的多肽。还原的样品在12％聚丙烯酰胺凝胶上跑胶，以考马斯亮兰R-250染色。这两道在分离的凝胶上跑胶。
图5显示己糖氧化酶的等电聚焦(IEF)。所说的凝胶以考马斯亮兰R-250染色(1道)或者如本文描述对酶活性进行染色(2道)，平行跑胶的等电点标记物显示在左边。这两道在分离的凝胶上跑胶。
图6显示以内蛋白酶Lys-C消化40 kDHOX-多肽所产生的肽的反向HPLC分离。对标记为1，2，3，4和5的峰进行氨基酸测序。
图7显示以内蛋白酶Lys-C消化29 kDHOX-多肽所产生的肽的反向HPLC分离。对标记为1和2的峰进行氨基酸测序。
图8显示从Chondrus crispus提取的RNA的Northern杂交分析。在变性的琼脂糖凝胶上分别装入30μg(1道)和3μg的总RNA。左边的箭头表示己糖氧化酶的特异转录物。右边以kb表示分子量标记物的位置。
图9表示介导重组己糖氧化酶在巴斯德毕赤酵母中表达的质粒pUP0153的构建。小箭头表示PCR引物。灰框部分表示己糖氧化酶基因。
图10显示用HiTrap-Q柱经阴离子交换层从巴斯德毕赤酵母中纯化重组己糖氧化酶(一步)。如本文所述测定收集组分中的乙醇氧化酶(AOX)活性(·)和己糖氧化酶(HOX)活性(o)。
图11用聚丙烯酰胺S-200 HR经凝胶过滤从巴斯德毕赤酵母中纯化重组己糖氧化酶(两步)。如本文所述测定收集组分中的乙醇氧化酶(AOX)活性(·)和己糖氧化酶(HOX)活性(o)。
图12表示介导重组己糖氧化酶在大肠杆菌中表达的质粒pUP0181的构建。小箭头表示PCR引物(灰框部分表示己糖氧化酶基因)。
图13显示大肠杆菌产生的重组己糖氧化酶的SDS-PAGEE。在14％变性凝胶中分析裂解细胞的粗制提取物。左边表示标准蛋白的分子量(×10-3)。以考马斯亮兰R-250染色。1道显示含有pUP0181的大肠杆菌细胞的提取物，2道显示没有质粒的对照。箭头表示己糖氧化酶带。
图14显示出介导重组已糖氧化酶在酿酒酵母中表达的质粒pUP0155的构建。小箭头表示PCR引物。灰框部分表示已糖氧化酶基因。
                          实施例1
              从Chondrus crispus纯化己糖氧化酶
图1以图解形式概述了所说的纯化和用于获得此酶氨基酸序列信息的两种策略。1.1.Chondrus crispus的收集、干燥研磨。
在丹麦Jutland的Grena附近的深为2-5米的海岸上，在四月至九月间收集红海草Chondrus crispus。以冷水冲洗刚刚收集到的海藻叶，并在24小时内保存在冰上运输到实验室。然后将所说的海草立即干燥或在冰中贮存直到进一步加工。用于酶纯化的材料贮存在-18℃，而用于分离mRNA的材料贮存在液氮中。
将Chondrus crispus的叶片在4℃下解冻，在室温(20-25℃)下空气干燥2-3天。在韦林氏商用混合器(34BL97型，Waring，New Harford，康涅狄格，美国)中将干燥的材料研磨成细小的粉末。1.2.酶的抽取
将500克的Chondrus crispus粉沫与2.5升的20mM Tris-Cl(pH 7.0)混合。以Milli-Q UF加实验室水净化系统(Millipore)获得全部提取和纯化方法所用的水。将缓冲液预冷到4℃。将混合物在4℃下保存6-8天。通过几层纱布的过滤收集提取物。
如上描述的第一步将海草材料进行重复提取。一般在提取5-8次后，弃去材料，此时的残留的活性降至几乎没有的水平。
在Sorvall GSA转头(rotor)(Sorvall 仪器)中以10,000×g离心澄清过滤物。将上清液经色谱纸(chr 1)过滤，并用水稀释到7-8m/Scm的传导率。将pH值调至7.5。然后如上所述准备好阴离子交换层析的提取物。1.3.己糖氧化酶的测定
所用的方法实质上如ullivan和Ikawa(1973)描述的一样。此测定方法是以这样一种原理为基础，即在过氧化物酶存在下，所说的糖氧化形成的过氧化氢与生色物质(0-邻联茴香胺)反应生成在402nm下具有吸收率的染料。
测定混合物由1-40(1的酶样品；含有370(10.1 M磷酸钠缓冲液(pH值7.0)的850μl测定溶液；462(1的0.1 M D-葡萄糖的0.1 M磷酸钠缓冲液溶液(pH值7.0)；9(1的辣根过氧化物酶的0.1毫克/毫升的水溶液(Sigma化学公司，产品号P 6782或Boehringer Mannheim，产品号814 393)；9μl O-邻联茴香胺2HCl的3.0毫克/毫升水溶液(3，3’-二甲氧基联苯胺，Sigma化学公司)组成。在室温下温育15或者30分钟后，加入一滴37％HCl(Merck，p.a.)终止测定。将100(1的样品从测定管中转移到微量滴定板(NUNC，丹麦)的孔中，并在Titertek Multiskan II PLUS平板读数仪(Labsystems/Flow实验室，芬兰)上读取410nm的吸收率。为了确保观察到的活性是己糖氧化酶而不是葡糖氧化酶的活性，有时以D-半乳糖作为底物代替D-葡萄糖进行此测定。1.4.阴离子交换层析
在与SuperRac组分收集器(LKB-Produkter，瑞典)连接的BioPilot层析系统(Pharmacia生物技术，瑞典)上进行此步骤。
在室温(20-25℃)下进行此步骤和接下来的纯化步骤，但组分收集器放置在冰箱中以便酶测定前收集到的组分贮存在4℃。记录280nm的吸收率和传导率。将所说的提取物加入到具有500毫升柱床体积的XK50/30柱(Pharmacia，5.0×25cm)上，此柱以DEAE-琼脂糖凝胶Fast Flow(Pharrnacia)填充，并以缓冲液A：20mM Tris-Cl(7.5pH)平衡。在加入样品的过程中流速为5毫升/分钟，在接下来的层析过程中流速为10毫升/分钟。样品加入后，以1200毫升的缓冲液洗涤此柱。以2800毫升的0％至100％梯度的缓冲液B：20mM Tris-Cl，500mM NaCl(7.5pH)洗脱吸附的蛋白。在梯度洗脱过程荷载收集毫升的组分。
在每一次层析之后，以500毫升0.5 M NaOH再生此柱，以500毫升1.0M Tris-Cl(pH 7.5)中和，最后以1200毫升的缓冲液A平衡。如上所述测定收集到的组分的己糖氧化酶活性(40μl样品，温育30分钟)。合并己糖氧化酶活性组分并贮存在4℃。1.5含有己糖氧化酶活性之组分的浓缩
将几个DEAE-琼脂糖凝胶层析的各组分的集合体合并，并在微孔实验室超滤盒式系统(产品号XX420LCSO)上通过超滤浓缩。此系统装有一个30,000标称分子量限度(NMWL)的膜室(产品号PTTROLCP2)，并由蠕动泵驱动。室温下浓缩至50毫升后，4℃下按照厂家的说明在Centriprep浓缩器(Amicon，USA，标称分子量截断30,000)上通过离心超滤将此酶制剂再浓缩至10-20毫升。将浓缩的酶溶液贮存在4℃。
1.6.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
在Pharmacia快速电泳系统上通过非变性PAGE分析由离子交换层析和超滤作用获得的己糖氧化酶制剂组合物，参见图2。进行8-25％的梯度凝胶，按照厂商的说明对蛋白进行银染色。从Pharmacia购买含有下列分子量标记物的试剂盒：Thyreglobulin(669,000)；铁蛋白(440,000)；过氧化氢酶(232,000)；乳酸脱氢酶(140,000)和清蛋白(67,000)。
如Sock和Rohringer(1988)描述的用于葡糖氧化酶的染色方法进行己糖氧化酶活性的染色测定。原则上，葡糖氧化酶或者己糖氧化酶催化的氧化还原反应与四唑氮盐还原成有色不溶的氮蓝四唑(formazan)偶联。
电泳之后，将快速凝胶立即浸没在10毫升刚刚制备的含有0.1M D-葡萄糖(或者D-半乳糖)；85mM柠檬酸/磷酸钠(pH 6.5)；0.2毫克/毫升3-(4，5-二甲噻唑2-基)-2，5-二苯基-氮蓝四唑溴化物(″噻唑基蓝″，MTT，Sigma化学公司，产品号M2128)；0.1毫克/毫升的N-甲基-二苯吡嗪甲基硫酸盐(″吩嗪硫酸甲脂″，PMS，Sigma化学公司，产品号P9625)的染色液中。在蓝紫色带清晰可见之前(通常5-90分钟)，将凝胶在室温下黑暗中温育，然后用10％醋酸，5％甘油冲洗，并空气干燥。
图2的1道显示出银染色的凝胶。如此图所示，在纯化步骤存在多种蛋白。然而，酶染色法只染色了图2中箭头标记的带(结果没有表示出来)。1.7.凝胶过滤
在装备有350毫升柱床体积的XK26/70柱(2.6(66cm，Pharmacia)的FPLC系统(Pharmacia)上进行纯化过程的此步。按照厂商的说明，用聚丙烯酰胺S-200 HR(Pharmacia)填充此柱。缓冲液是20mM Tris-Cl，500mMNaCl(pH 7.5)，流速是0.5毫升/分钟。在280nm下记录紫外吸收率。在FPLC纯化之后，用放置在冰箱(4℃)中的FRAC-100组分收集器(Pharmacia)收集2.5毫升的组分。4℃下在L7超离心机(Beckman)中的SW60吊桶式转头(Beckman)中以30,000rpm离心60分钟来澄清浓缩的己糖氧化酶制剂。把一部分3.0-4.0毫升的上清液与5％甘油(Sigma化学公司，产品号G7757)混合，经0.22μm孔大小的一次性滤器(Millipore，产品号SLGV 025 BS)过滤，并使用与此柱入口连接的SA-5样品敷料器(Pharmacia)将其加入到此柱中。用上文描述的测定方法(10μl样品，温育15分钟)鉴定显示出己糖氧化酶活性的组分并在进一步加工前于-18℃分开保存。图3显示出己糖氧化酶的紫外图谱和洗脱位置。如此图所示，在此步中洗脱出大量的具有紫外吸收的物质。非变性PAGE和银染色的电泳(图2，2道)表明在此步之后，只有少量的几种杂质组分。1.8.经分析型凝胶过滤确定非变性己糖氧化酶的分子量
在聚丙烯酰胺S-200 Superfine(Pharmacia)上经凝胶过滤确定非变性己糖氧化酶的分子量，柱大小、缓冲液、流速和组分收集如前所述。从Pharmacia公司购买用于确定此柱的外水体积(v0)的蓝(blue)葡聚糖和胶准此柱的标准蛋白：卵清蛋白(43,000)，清蛋白(67,000)，过氧化氢酶(158,000)和醛缩酶(252,000)。如上所述通过DEAE-琼脂糖凝胶层析获得含有己糖氧化酶的样品。以标准蛋白和己糖氧化酶的洗脱体积(Ve)的确定为基础，计算相应的Kav值(Ve-Vo/Vt-Vo)。最后，将标准蛋白的Kav值对相应的log(分子量)值作图。己糖氧化酶的Kav值相当于大约110,000的天然分子量。这与Sullivan和Ikawa(1973)的结果完全一致，它们发现分子量为大约130,000。也如通过凝胶过滤确定，Kerschensteiner和Klippenstein(1978)报道了140,000的分子量。1.9.阳离子交换层析
在装备有HR5/5柱(Pharmacia，0.5(5cm，1.0毫升的柱床体积)(以S-琼脂糖凝胶Fast Flow(Pharmacia)填充)的SMART微纯化层析系统(Pharmacia)上进行此步。以缓冲液A平衡此柱：50mM醋酸钠，pH 4.5(通过用NaOH将50mM醋酸的pH值调至4.5来制备)。用于梯度洗脱的缓冲液B包含50mM醋酸钠，500mM NaCl，pH 4.5。在预填充的一次性葡聚糖凝胶G-25柱(PD-10，Pharmacia)上将凝胶过滤中得到的组分脱盐，此柱以25mM醋酸钠(pH值4.5)平衡并洗涤。将从6种高己糖氧化酶活性的凝胶组分中得到的20毫升脱盐样品以250μl/分钟的流速加入到50毫升Superloop(Pharmacia)的柱中。然后用4倍柱床体积的缓冲液A以相同的流速洗涤此柱。用从缓冲液A到缓冲液B的梯度洗脱结合的蛋白，缓冲液的总体积为5毫升。在梯度洗脱过程中收集250μl的组分，如上所述(样品1μl，温育时间15分钟)测定己糖氧化酶活性，在进一步使用前于-18℃保存。
通过非变性PAGE和银染色分析得到的己糖氧化酶制剂(图2，道3)。尽管少量的杂质蛋白也能观察到，但己糖氧化酶带是唯一明显的带。
1.10.分析性的十二烷基硫酸钠PAGE(SDS-PAGE)
按照Laemmli(1970)的方法也通过SDS-PAGE分析显示出己糖氧化酶活性的S-琼脂糖凝胶层析组分。用Mini-Protean II仪(Bio-Rad)上在厚度为0.75毫米的12.5％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺(37.5∶1混合物)的微型凝胶上跑胶。以0.1％考马斯亮兰R-250、10％醋酸和4％乙醇染色，在10％醋酸和30％乙醇中脱色。
图4的1道显示电泳结果。己糖氧化酶的纯化制剂分别显示在40 kD和29 kD相对分子量处，弱带分别显示在60 kD和25 kD处。并且，在55 kD和57 kD处观察到了两个明显的双峰。1.11.SDS-PAGE之后的碳水化合物印迹和染色
以DIG聚糖检测试剂盒(Boehringer曼海姆)检测分离的己糖氧化酶中的碳水化合物的存在，设计此试剂盒是用来检测印迹的复合糖中以微克量存在的糖。原则上，将碳水化合物中的邻近羟基氧化成醛。然后地高辛配基与醛基共价结合，接下来以抗地高辛配基碱性磷酸酶抗体缀合物检测地高辛配基的存在。
阳离子交换层析纯化的己糖氧化酶在12％SDS-PAGE凝胶上如上所述跑胶，按照标准方法与硝酸纤维素杂交，并按照厂商的说明用聚糖检测试剂盒染色其中的碳水化合物。在60 kD、40 kD、29kD和25kD处的己糖氧化酶带都没有染色。仅有在57 kD-55 kD处的明显的双峰带被染色(结果没有表示出来)。后来，用下文描述的与用于残留杂质同样的方法鉴定了57kD-55 kD双峰带。
这样，可以得出结论，即在SDS-PAGE中没有将己糖氧化酶的组分糖基化。1.12.等电聚焦
合并S-琼脂糖凝胶层析的己糖氧化酶组分，并通过在Centricon浓缩器(Amicon)中的离心超滤将其浓缩，按照厂商的说明在Isogel琼脂糖平板(pH3-10)上通过等电聚焦(IEF)分析(FMC Bioproducts，Rockland，ME，USA)。将PI标记混合物(FMC Bioproducts)与己糖氧化酶样品平行跑胶。所说的混合物由细胞色素C(PI＝10.2)、肌红蛋白主/次带(7.4/7.0)、碳酸酐酶(6.1)、β-乳球蛋白A/B(5.4/5.5)、卵清蛋白(4.8)、葡糖氧化酶(4.2)和淀粉葡萄糖甙酶(3.6)。用考马斯亮兰R-250染色所说的凝胶。如图5的1道所示，己糖氧化酶的纯化制剂分别由PI为4.3和4.5的两个变体组成。也在预浇注的聚丙烯酰胺凝胶(pH 3.5-9.5)(Pharmacia，AmpholinePAGplates)上通过等电聚焦分析了纯化的己糖氧化酶。如上所述用于非变性凝胶的方法通过在染色混合物中温育对凝胶上的酶进行染色。如图5的2道斯示，两种PI的变体都具有酶促活性。1.13.层析聚焦
在如最后步骤中的于S-琼脂糖凝胶上纯化的己糖氧化酶的SDS-PAGE上观察到了几条带，使人怀疑所说的一条或几条带可能代表残留的杂质。并且，S-琼脂糖凝胶层析一直回收率很低。因此，引入层析聚焦法作为最后一步代替在S-琼脂糖凝胶上的阳离子交换层析。
在装备有1毫升柱床体积的Mono P HR 5/5柱(0.5(5cm，Pharmacia)和50毫升使样品有用的Superloop的SMART层析系统进行层析聚焦。在pH5.0-3.5间用于分离的起始缓冲液是25mM哌嗪，用HCl将其pH调至5.5。洗脱液是用水稀释10倍的Polybuffer 74(Pharmacia)，并用HCl将其pH调至3.5。将此柱进行预处理，并如厂商建议用起始缓冲液平衡。
以下列方式进行样品制备：
在典型的实验中，将两个凝胶过滤板中得到的最好的组分(2×4个组分，20ml)合并，并通过1毫升苯基琼脂糖凝胶6 Fast Flow(high sub，Pharmacia)柱，已经在一次性Poly-Prep柱(Bio-Rad)上填充了此柱，并在用于凝胶过滤的缓冲液(20mM Tris-Cl，500mM NaCl，pH 7.5)中平衡。此处理几乎完全除去了红色的蛋白(藻红蛋白)和在此离子强度下吸附在凝胶基质上的其它带色物质，因此除去了在其它纯化步骤中只是部分除去的杂质。使用之后，弃掉苯基琼脂糖凝胶柱。在流出物中定量回收己糖氧化酶活性，然后在预填充的一次性葡聚糖凝胶G-25柱(PD-10，Pharmacia)上脱盐，并以起始缓冲液平衡和洗脱。
在加入样品之前，将1毫升的洗脱液倾注到此柱中。流速是0.5毫升/分钟。在加入样品后，经将11毫升的洗脱液通过此柱，形成pH梯度。在pH梯度洗脱过程中，收集到44种250μl的组分。经上述的测定方法(样品1μl，温育时间15分钟)鉴定含有己糖氧化酶的组分，并在进一步使用前保存在-18℃。
通过非变性PAGE和银染色(图2的4道)及通过SDS-PAGE和考马斯亮兰R-250染色(图4的2道)分析经层析聚焦纯化的己糖氧化酶。在非变性PAGE中，己糖氧化酶的带是明显的带，而只观察到了非常少量的杂质带。SDS-PAGE清楚地表明此纯化方法能够除去在57 kD和55 kD处明显的双峰带。S-琼脂糖凝胶层析之后观察到了25kD的带，而在层析聚焦后此带则很微弱。
总之，经DEAE层析、凝胶过滤和层析聚焦获得的己糖氧化酶在非变性PAGE中显示出一条带。在SDS-PAGE中，在40 kD和29kD处观察到明显的带，在60 kD处观察到微弱的带。因为相对于40 kD和29kD组分，60 kD组分的强度在不同的酶制剂中变化，所以可以假设29kD和40 kD多肽可能来源于60 kD前体的蛋白水解过程。此假设与此酶同源二聚结构的天然分子量为110,000-120,000的观点(如上所述此结果实质上在凝胶过滤中发现)一致。并且，此假设与Kerschensteiner和Klippenstein获得的结果(他们发现在凝胶过滤中的天然分子量为140,000，在SDS-PAGE中亚基的分子量为70,800)一致。
                           实施例2
               己糖氧化酶的肽片段的产生及其氨基酸序列分析2.1.以溴化氰消化纯化的己糖氧化酶
使用此方法，而在S-琼脂糖凝胶上的阳离子交换层析仍作为最后的纯化步骤。
将经DEAE琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺S-200和S-琼脂糖凝胶纯化获得的己糖氧化酶通过在含有Sephadex G-25 Superfine的预填充的PC3.2/10快速脱盐柱上(Pharmacia，0.32(10cm，柱床体积0.8毫升，其安装在上述的SMART系统中)进行缓冲液交换转移到挥发性缓冲液中。所说的柱以200mM碳酸氢铵(BDH，AnalaR)平衡和洗脱。为了得到满意的回收，有必要在注射前向己糖氧化酶样品中加入500mM氯化钠。
将洗脱的缓冲液交换的己糖氧化酶分装在1.5毫升的微量离心管中，并在真空离心蒸发浓缩器(Savant仪器)中冷冻干燥。加入200μl溶解在70％v/v甲酸(Promega)中的溴化氰(CNBr，Pierce)(10毫克/毫升)(Promega的试剂是″Probe DesignTM肽分离系统″产品号V6030的组分)。将此管于室温下黑暗中过夜温育。然后将该溶液在真空离心蒸发浓缩器中干燥，悬浮在50μl的水中，再干燥。2.2.通过高分辨率的SDS-PAGE并将其电杂交到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上分离溴化氰片段
安装Schbgger和von Jagow(1987)的方法通过高分辨率的SDS-PAGE分离经溴化氰消化所产生的肽。此系统使低分子量的肽(20-250个氨基酸残基)极好地分离。此凝胶系统由16.5％的分离胶、10％浓缩胶、4％积层胶组成，所有的凝胶都是使用Promega的29∶1的丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合物制备的。
在Mini-Protean II仪(Bio-Rad)中于0.75毫米厚的微型凝胶上跑胶。从Bio-Rad购买过硫酸铵、N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)。SDS是从美国生物化学公司(ultrapure)购买的。Tris是Fluka的(产品号93350)。麦黄酮和thioglycate钠是Promega的。对羟苯甘氨酸(p.a.)，2-巯基乙醇(p.a.)和溴酚蓝是从Merck购买的，甘油是GIBCOBRL(ultrapure)的。恰好在使用之前向阴极缓冲液中加入0.1mM的thioglycolate钠以便阻止在分离过程中此肽氨基末端的化学封阻。在30V下预跑胶60分钟，以便使thioglycolate清除任何与氨基反应的物质。
样品制备：将干燥的溴化氰肽片段悬浮在凝胶填充缓冲液中，所说的缓冲液含有63mM Tris-Cl(pH值6.8)、1％SDS、2.5％2-巯基乙醇、10％甘油和0.0012％溴酚蓝。通过加入1-3μl的1.0 M Tris碱基中和由于存在残留的甲酸而在混合后变黄的样品，直到恢复蓝色为止。样品在加入到凝胶之前，加热到95℃保持5分钟，使之变性。分子量在31,000和2,500之间的低范围蛋白分子量标准物(Promega)的混合物与己糖氧化酶肽样品平行跑胶。在150 V恒定电压下进行电泳。
按照厂商的说明，在小型电转移印迹电泳转移槽(Bio-Rad)完成向PVDF膜的电泳转移。将三个切成凝胶大小的蛋白印迹膜在甲醇中(Merck，p.a)刚刚浸湿，然后浸入到转移缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，pH值8.5，预冷至4℃)中直到装备成印迹夹层。电泳后，4℃下凝胶在转移缓冲液中温育5分钟，然后装备到具有下列各层的转移夹层中：一个Whatman纸(3MMchr)，两个蛋白印迹膜，SDS-PAGE肽分离凝胶，三个蛋白印迹膜，最后一个是Whatman纸。此夹层的方向是两个蛋白印迹膜朝向电极装置的阳性电极。冷却装置在装满预冷的转移缓冲液之前，就安装在缓冲室中，然后在室温和100V恒定的电压下进行60分钟的转移。转移中，电流从大约270mA增加至大约400mA。
转移后，把膜在水中洗涤1分钟，然后在含有0.1％考马斯亮兰R-250(Bio-Rad)、5％醋酸(Merck)、45％甲醇(Merck，p.a)的100毫升新制备的染色液中染色30至45秒。然后用大约80毫升新制备的5％醋酸和45％甲醇脱色三次，每次30-60秒。最后将膜在水中洗涤三次，以便除去残留的甘氨酸，然后置于空气中干燥。分别切下很清楚且较丰富的分子量为大约2.5 kD、9kD和16kD的带，然后进行氨基酸分析和序列分析。2.3.己糖氧化酶的9kD溴化氰片段的氨基酸分析和测序
通过离子交换层析和柱后用邻苯二胺的衍生过程进行氨基酸分析。于110℃下在6MHCl、0.05％酚和0.05％二硫二丙酸中水解20小时(Barkholt和Jensen，1989)。在应用生物系统的自动蛋白质/肽测序仪(装备有联机PHT分析仪的477A型，120A型和数据分析系统)上进行此肽的测序。蛋白测序剂是应用生物系统的。Arne L.Jensen(丹麦，哥本哈根大学，蛋白质化学系)轻松地进行了氨基酸分析和肽序列分析。
表2.1显示经9kD片段的分析鉴定的肽序列。
在一步中乙内酰苯脲-酪氨酸(PHT-Tyr)的最初产量是22pmol。表2.2显示出9kD片段的氨基酸组分。
表2.1.通过己糖氧化酶的9kD溴化氰片段的序列分析获得的肽序列
  所测序肽的来源   序列鉴定   氨基酸序列
HOX，9K CNBr片段     HOX-1肽 Y-E-P-Y-G-G-V-P-
缩写：Y＝Tyr；E＝Glu；P＝Pro；G＝Gly；V＝Val表2.2.己糖氧化酶的9kD溴化氰片段的氨基酸组分
  氨基酸     mol％     N
    Asx     16.4     14
    Thr     4.8     4
    Ser     4.6     4
    Glx     9.9     8
    Pro     8.1     7
    Gly     11.2     9
    Ala     4.3     4
    Cys     0     0
    Val     5.2     5
    Met     0.2     0
    Ile     3.6     3
    Leu     9.3     8
    Tyr     6.1     5
    Phe     4.6     4
    His     1.0     1
    Lys     8.1     7
    Arg     2.7     2
    Trp     ND1)     -
    总共     100.0     85
1)没有确定
2.4.制备性SDS-PAGE和电印迹到PVDF膜上
按下列方法获得氨基酸序列，已知所说的氨基酸序列特异性地来自己糖氧化酶制剂的40 kD或者29kD的多肽。
按照Laenrmli(Laennnli，U.K.，1970)的方法在制备性SDS-PAGE凝胶上跑胶。在Mini-Protean II仪器(Bio-Rad)上于含有12.5％丙烯酰胺/双丙烯酰胺(37.5∶1混合物)厚度为0.75毫米的微型凝胶上跑胶。将丙烯酰胺(BDH，产品号44313)和N，N′-亚甲基-双丙烯酰胺(BDH，产品号44300)的溶液贮存在混合床离子交换树脂(Bio-Rad，产品号142-6425)中。所有其它试剂的来源如上所述。
样品的制备：4℃下在NMWL为10,000和样品容量为400μl的Ultrafree-MC滤器装置(Millipore，产品号UFC3 LGC25)上通过离心超滤浓缩从层析聚焦中获得的组分。将残余物与含有125mM Tris-Cl(pH值6.8)、2％SDS、5％2-巯基乙醇、20％甘油和0.0025％溴酚蓝的1倍体积的凝胶填充2X缓冲液混合。通过加入1-3μl的1.0 M Tris碱基中和由于存在残留的甲酸而在混合后变黄的样品，直到恢复蓝色为止。加热到95℃保持5分钟，使样品变性，并以每道大约30μl的等份加入到所说的凝胶中。
将分子量范围在97,400至14,400之间的分子量标记蛋白混合物与己糖氧化酶样品平行跑胶。为了使样品蛋白的热诱导化学修饰最小，在低电流下(每凝胶10mA)进行电泳。
如上所述把电泳转移到PVDF膜上，只是使用一个Immobilon P膜(Millipore，产品号IPVH 15150)代替三个蛋白印迹膜。夹层的方向是印迹膜朝着电极装置的阳性电极。
转移之后，将Immobilon P膜在水中冲洗10秒，然后在100毫升新制备的含有0.025％考马斯亮兰R-250、5％醋酸和40％甲醇的染色液中染色45-60秒。然后将此膜在250毫升新制备的5％醋酸和30％乙醇(96％v/v，Danisco，丹麦)中脱色2-3分钟。最后将此膜在空气中干燥并保存在4℃。
通过层析聚焦最后纯化后，印迹中的带模式与分析SDS-PAGE中的一致。除了60 kD处的弱带外，在40 kD和29kD处显示出强带。
从印迹中切下40 kD和29kD处的带，如上所述对结合在此膜上的多肽进行氨基酸分析和酶促消化。60K物质的量很少，不能进行此肽的任何分析。2.5己糖氧化酶40 kD和29kD多肽的氨基酸分析
表2.3显示出己糖氧化酶的29 kD和40 kD组分的氨基酸组成。表2.3.己糖氧化酶的29 kD和40 kD多肽的氨基酸组成
  氨基酸     mol％
    40K     29K
    Asx    11.5    12.5
    Thr     5.9     5.2
    Set     6.1     4.7
    Glu     9.7    15.1
    Pro     5.2     5.4
    Gly     13.6     9.7
    Ala     6.6     6.4
    Cys     1.1     0.9
    Val     7.3     5.5
    Met     1.5     2.3
    Ile     3.7     4.4
    Leu     8.5     8.6
    Tyr     4.2     5.3
    Phe     5.5     4.1
    His     2.2     1.4
    Lys     3.9     6.1
    Arg     3.5     2.4
    Trp     ND1)     ND1)
    Total    100.0    100.0
1)没有确定
2.6.结合PVDF的己糖氧化酶多肽的酶促消化
如Fernandez等(1992)和Fernandez等(1994)的描述进行与PVDF结合的己糖氧化酶多肽的消化和所得的蛋白水解肽的提取。
40 kD己糖氧化酶多肽的消化：将11条估计总蛋白含量为大约5μg(相当于大约125脱色)的40K的带从考马斯亮兰PVDF膜上切下，在甲醇中脱色1-2分钟，并在水中冲洗2-3分钟。然后将膜带切成1×1的方块，并转移到微量离心管中。PVDF膜的空白区作为背景对照。将切成方块的膜浸入到50μl含有1％(v/v)氢化Triton X-100(RTX-100，Sigma Chemicals，产品号X-100R-PC，或Calbiochem，蛋白等级，产品号648464)、10％吲哚乙腈(Merck，梯度等级Lichrosolv)和100mM Tris-Cl(pH 8.0)的消化缓冲液中。选择来用于消化的蛋白水解酶是在C-末端的赖氨酸残基处切割肽链的内蛋白酶Lys-C(endoLys-C)。通过加入20μl的水重建5μg的endoLys-C(Boehringer Mannh，测序等级，产品号1047 825)等分试样。加入2μl的酶溶液(相当于0.5μg的酶)，酶和底物的比为1∶10。在37℃下消化22-24小时。
消化后，样品在超声池(Elma接近音速的)中进行超声处理5分钟，并在微型离心机以1700rpm离心5分钟，然后将上清液转移到新管中。连续以50μl的消化缓冲液和100μl的0.1％三氟乙酸(TFA，Pierce，产品号28902)洗涤，如上所述进行超声处理和离心。合并所有的上清液，得到200μl的提取物。在肽纯化前，将提取物保存在-18℃下。
按照用于40 kD组分的描述，消化己糖氧化酶29kD多肽，只是使用了总蛋白量为2.4μg(大约80 pmol)的四条带用于氨基酸分析。2.7.endoLys-C产生的肽的纯化
将从消化己糖氧化酶40 kD和29kD多肽得到的肽片段在SMART层析系统上分离。此系统装备有可变波长的μPeak检测器和60个小瓶的组分收集器。用于分离的反相柱是以硅为基础的μRPC C2/C18 SC2.1/10窄孔柱(Pharmacia，柱大小2.1×100mm，颗粒大小3μm，孔平均大小125□)。缓冲液是A：0.1％TFA(Pierce)的Milli-Q水溶液，缓冲液B：0.1％TFA吲哚乙腈溶液(Merck，梯度等级Lichrosolv)。在0.5μm的fluoropore过滤器(Millipore，产品号FHLP04700))上通过真空过滤来过滤缓冲液并使之脱气。流速是100μl/分钟。在220nm、254nm和280nm下检测流出物的紫外吸收。梯度是0-30％B(0-65分钟)、30-60％B(65-95分钟)和60-80％B(95-105分钟)。
然后用80％的B以100μl/分钟的流速洗涤此柱10分钟，以200μl/分钟的流速在缓冲液A中重新平衡45分钟。在t＝15分钟和t＝105分钟之间收集50μl的组分(3×60组分)，并且在氨基酸序列分析前贮存在-18℃。
图6显示出endoLys-C消化40 kD多肽后得到的肽图谱。如此图所示，此消化和HPLC分离形成了几个有很高信噪比的非常清楚的峰。相应的空白消化混合物的色谱(没有表示出来)表明在t＝83分钟后洗脱下来的峰是不含肽的试剂产生的峰，很可能是氢化的Triton X-100或者考马斯染料的残留杂质的紫外吸收。通过下列标准选择图6标记为1-5的峰用于氨基酸测序1)峰高度；2)表观纯度；3)高A280：A220和/或高A254：A220比，此数值表明芳香族氨基酸残基的存在，由于它们的遗传密码简并性较低，其在选择PCR引物序列上是非常有用的。4)长的洗脱时间，其可以表明相对较长的肽。
图7显示出29kD endoLys-C肽的层析。很明显，此己糖氧化酶组分相对于图6的40 kD组分只产生几条明显的肽片段。当比较这两个层析时，没有迹象表明任何肽片段同时存在于这两种消化物中。此发现表明40K和29K己糖氧化酶组分没有共有的氨基酸序列，假设29 kD链是40 kD多肽的蛋白水解转化而产生的，则存在共有序列的事实成立(和40 kD消化物比较，29 kD消化物只包含少量的在t＝83分钟后洗脱下来的杂质。此原因可能是在29 kD消化中使用了Calbiochem的氢化Triton X-100，而40 kD消化过程中使用的是Sigma化学公司的Triton X-100)。
将相当于29kD肽图谱(图7)中标记为1和2峰的组分进行氨基酸测序。2.8蛋白水解产生的己糖氧化酶肽的氨基酸序列分析
下表2.4列出通过分析相当于图6中峰1-5的组分(HOX-2、HOX-3、HOX-4、HOX-5、HOX-6肽)和图7中峰1-2的组分(HOX-7和HOX-8肽)而确定的肽序列。PTH氨基酸的最初产量从第一步的HOX-5肽的46 pmolPTH-Tyr到第二步的HOX-8肽的6pmol PTH-Ile。由每个所选择的峰在254nm和280nm的吸收率可以推测所有被测序的肽都包含至少一种芳族氨基酸残基。表2.4.通过对来源于己糖氧化酶40 kD和29kD多肽的内蛋白酶Lys-C肽进行序列分析得到的肽序列。测序肽的来序列鉴定              氨基酸序列
源40K，峰1 HOX-2肽A-I-I-N-V-T-G-L-V-E-S-G-Y-D-X1)-X2)-
            X3)-G-Y-X-V-S-S-40K，峰2 HOX-3肽D-L-P-M-S-P-R-G-V-I-A-S-N-L-W-F-40K，峰3 HOX-4肽D-S-E-G-N-D-G-E-L-F-X-A-(H)-T-40K，峰4 HOX-5肽Y-Y-F-K40K，峰5 HOX-6肽D-P-G-Y-I-V-I-D-V-N-A-G-T-P-D-29K，峰1 HOX-7肽L-Q-Y-Q-T-Y-W-Q-(E)-(E)-(D)-29K，峰2 HOX-8肽X-I-(R)-D-F-Y-E-E-M-
括号中表示初步鉴定的残基。
1)残基15鉴定为天冬氨酸或天冬酰胺。
2)残基16鉴定为天冬氨酸或丙氨酸。
3)残基17鉴定为精氨酸或色氨酸。
HOX-2肽＝SEQ ID NO：9
HOX-3肽＝SEQ ID NO：10
HOX-4肽＝SEQ ID NO：11
HOX-5肽＝SEQ ID NO：12
HOX-6肽＝SEQ ID NO：13
HOX-7肽＝SEQ ID NO：14
HOX-8肽＝SEQ ID NO：15
                       实施例3
           从Chondrus crispus分离己糖氧化酶基因3.1.纯化Chondrus crispus的RNA
用冷水冲洗新收集到的Chondrus crispus的叶片，立即贮存在液氮中直到使用前。在研钵中将大约15克冷冻在液氮中的叶状体均匀地研磨成细粉沫。将冷冻的匀质化后的物质转移到含有15毫升的提取缓冲液(8M盐酸胍；20mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH7.0；20mM乙二胺四乙酸(EDTA)；50mM β-巯基乙醇)的50毫升管(Nunc，产品号339497)中。
把试管涡旋并在以后的步骤中进行低温保存，如果不特殊指明其它温度则为0℃。然后在Heraeus Omnifuge 2.0RS中以6000×g离心20分钟，小心收集含有RNA的上清液(大约15ml)并把它转移到预冷的50ml的试管中。把1.5ml 2M醋酸钠、15ml水饱和苯酚(pH值4.5)和3ml三氯甲烷：异戊基乙醇(49∶1)加入到含有RNA提取物的试管中。
其后把试管激烈地涡旋12分钟，在Omnifuge中以6,000×g把试管离心20分钟分离所说的相。把水相(大约17ml)转移到30ml的Corex管(Sorvall，cat no.00156)中，并加入相同体积(即大约17ml)的冷异丙醇。再把试管涡旋并在20℃温育至少1小时。通过Sorvall RC-SB离心机(带有预冷的SS转头)以10,000rpm离心，沉淀出沉淀的RNA。除去上清液，把沉淀的RNA悬浮在4ml 0.3M醋酸钠(pH值5.5)中，并加入12ml 96％的乙醇。
然后把Corex管涡旋，并在20℃再次温育至少1小时，接下来按照以上所述的方法通过离心20分钟进行第二次沉淀。小心地除去上清液，并把RNA悬浮在2ml 0.15M醋酸钠(pH 5.5)中。然后加入8ml 4M醋酸钠(pH 5.5)，把RNA在冰上沉淀30分钟并且如以上所述再进行沉淀。把RNA沉淀在70％乙醇中洗涤并悬浮在500μl的水中。把悬浮的RNA转移到微型离心试管中，在使用之前一直贮存在-20℃。
通过凝胶电泳和Sambrook等(1989)所述的在260nm和280nm吸收测定进行RNA的纯化和浓缩。3.2.Chondrus crispus聚腺苷酸化的RNA的分离
使用含有寡dT(Dynabeads寡(dT)25，在mRNA纯化试剂盒TM中，Dynal)的磁珠从总RNA中分离聚腺苷酸化的RNA。把大约100μg的总RNA和lmg的Dynabeads寡(dT)25混合，并且如在mRNA纯化试剂盒TM方案中所述的方法分离聚腺苷酸化的RNA。用Dynabeads分离的聚腺苷酸化的RNA的产量在1％-3％之间。
用于从Chondrus crispus中分离聚腺苷酸化的RNA的其它方法包括使用以寡-(dT)-纤维素(Clontech，产品号8832-2)填充的柱或mRNA分离试剂盒TM方案所述的预填充柱(mRNA Separator KitTM，Clontech，产品号K1040-1)。寡(dT)柱分离的聚腺苷酸化的RNA的产量为总RNA的0.1％-1％。寡(dT)柱分离的聚腺苷酸化的RNA用于下文3.4所述的cDNA合成反应，但是首链cDNA的产量是非常低的(不到1％)。
和用Dynabeads分离的聚腺苷酸化的RNA相比，寡(dT)柱分离的聚腺苷酸化的RNA产量少和性能不好的原因可能是在总RNA提取物中存在碳水化合物或蛋白多糖。碳水化合物污染总RNA制剂已经表现出妨碍聚腺苷酸化RNA的纯化和抑制cDNA合成，因此发展了没有碳水化合物干扰的纯化RNA的方法(Groppe等，1993；Yeh等)。然而使用这些方法纯化的聚腺苷酸化RNA用于cDNA合成反应时不如使用Dynabeads分离的RNA那样有效。因此，使用Dynabeads纯化的聚腺苷酸化RNA在首链cDNA合成反应中用作模板(下文的cf.3.4)。3.3.己糖氧化酶特异性的寡核苷酸
以来源于己糖氧化酶HOX-2、HOX-3和HOX-4(表2.4)的氨基酸序列为基础，合成合成性的寡核苷酸(DNA技术，ApS，Forskerparken，DK-8000Aarhus C，丹麦)。表3.1显示出所说的寡核苷酸和相应氨基酸序列。用于DNA测序或PCR中的引物的DNA序列也在表中列出。
表3.1.己糖氧化酶特异性的合成性寡核苷酸的核苷酸序列
Hox-肽 Hox-引物
Hox-2Hox-3Hox-4 Hox2-3+Hox3-2-Hox4-1+Hox4-2-Hox5+Hox5-Hox6+Hox7-Hox8-Hox10-Hox11+Hox12-Hox13-Hox5’-1   A    I    I    N    V    T    GL    V    E    S    G    Y    D    X    X    X    G    Y    X    Y    S    S5YTI GTI  GAR  WSI  GGN  TAY  GA3D    L    P    M    S    P    R    GV    I    A    S    N    L    W    F3’CAN  TAD  CGN  AGI  TTR  RAI  ACC  AA5D    S    E    G    N    D    G    E    L    F    X    A    H    T5GAR  GGI  AAY  GAY  GGI  GAR  CTN   TT3 3CTY  CCN  TTR  CTR  CCI  CTY  GAI   AA5 5ATT  GGG  GCT  CCT  TCA  AGA  CCT  T3’ 5TGA  TGA  TTC  CAA  AGT  TTC3’ 5TTG  GAA  GAA  TAC  GGT  TGG3’ 5TAC  TAT  TTC  GTC  TGC  TTG  GG3’ 5GAA  CTC  TTC  CGT  GGT  CTC  CT3’ 5CCA  CCT  GCG  TGT  TGG  GGT  CT3’ 5CAG  ATC  TAC  AAA  ACA  TGC  GAG3’ 5TGT  CGC  AGA  CTG  TAC  TTG3’ 5GAG  TGT  ACA  DGA  CAT  AAA3’ 5ATG  GCT  ACT  CTT  CCC  CAG  AAA  G3’
其中的Y是C或T，R是A或G；其中的W是A或T，S是C或G；其中的D是A、G或T，N是A、C、G或T，并且I＝脱氧肌苷。Hox-2    ＝SEQ ID NO：  9Hox2-3+  ＝SEQ ID NO：  16Hox-3    ＝SEQ ID NO：  10Hox3-2-  ＝SEQ ID NO：17Hox-4    ＝SEQ ID NO：11Hox4-1+  ＝SEQ ID NO：18Hox4-2-  ＝SEQ ID NO：19Hox5+    ＝SEQ ID NO：20Hox5-    ＝SEQ ID NO：21Hox6+    ＝SEQ ID NO：22Hox7-    ＝SEQ ID NO：23Hox8-    ＝SEQ ID NO：24Hox10-   ＝SEQ ID NO：25Hox11+   ＝SEQ ID NO：26Hox12-   ＝SEQ ID NO：27Hox13-   ＝SEQ ID NO：28Hox5′-1 ＝SEQ ID NO：293.4 cDNA合成和聚合酶链式反应(PCR)
在使用商业上得到的试剂盒的首链cDNA合成反应中以聚腺苷酸化的RNA作为模板。MaratonTM cDNA扩增试剂盒(Clontech，产品号H1802-1)的方案中描述的方法将大约1mg聚腺苷酸化的RNA反转录，以Hox3-2-或者Hox4-2-作为引物。在接下来的PCR扩增中，除了使用己糖氧化酶特异引物Hox3-2-或Hox4-2-外，还分别使用了所说的试剂盒的锚定引物和衔接头引物。扩增所用的缓冲液和条件实质上与MaratonTM cDNA扩增试剂盒的方案中描述的一致。使用Perkin-Elmer循环变温加热器480TM设定的30个循环(94℃，1分钟；55℃，2分钟；72℃，2分钟)以AmpliTaq(Perkin-Elmer Cetus)进行PCR扩增。5μl的反应混合物在1％的琼脂糖凝胶(SeaPlaqueGTG，FMC)上的凝胶电泳显示以Hox4-2-为引物的DNA片段大小约为600个碱基(bp)，而以Hox3-2-为引物的DNA片段大小约为700bp。
使用能够买到的试剂盒(QIAEXTM凝胶抽取试剂盒，cat，20020，QIAGEN)从琼脂糖凝胶上纯化这些DNA片段，并如在pT7 Blue T-载体试剂盒(Novagen，产品号69829 1)的方案中描述的方法将大约100μg的片段连接到50μg的质粒pT7 Blue中。用连接混合物转化大肠杆菌DH5α(生命技术公司，产品号530-8258SA)或者大肠杆菌NovaBlue(Novagen)，并进一步分析白色的重组菌落。
使用QIAGEN质粒Midi试剂盒(QIAGEN，产品号12143)纯化这些菌落的质粒DNA，并使用测序酶(Sequenase 2.0型DNA测序试剂盒，USB)对其进行DNA序列分析。将DNA测序反应物进行丙烯酰胺凝胶电泳(测序凝胶-Mix6，生活技术公司)。700bp片段DNA序列分析显示出一个能编码234个氨基酸的开放读框。
下图3.2.显示出所有40 kD多肽的肽序列(即Hox-2、Hox-3、Hox-4、Hox-5、和Hox-6)都在来源于此开放读框的234个氨基酸序列之内。这样，可以得出结论，即700 bp片段编码部分己糖氧化酶基因。又表明所说的600 bp片段的DNA序列与所说的700 bp片段的近接的600 bp相同。
在cDNA合成和PCR扩增实验中类似地使用引物Hox2-3+和Hox3-2-。如在3’-AmplifinderTM RACE试剂盒(Clontech，产品号K1801-1)的方案中描述的方法以Hox3-2-作为引物将大约50μg的聚腺苷酸化的RNA进行反转录。在接下来的PCR扩增反应中，使用引物Hox2-3+和Hox3-2-。扩增所用的缓冲液和条件实质上与在AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)及在3’-AmplifinderTM RACE试剂盒的方案中所描述的一致。5μg的PCR扩增混合物的凝胶电泳显示出一个大小为407 bp的片段。
纯化此片段，将其插入到pT7 Blue中，如以上描述进行测序。此片段的DNA序列显示出与所说的700 bp片段远侧的407 bp相同。
使用AmplifirderTM RACE试剂盒(Clontech)的锚定引物作为3’引物及己糖氧化酶特异性引物Hox5+和Hox4+作为基因特异性5’引物，通过所说的试剂盒扩增所说的700和407 bp下游的DNA序列。扩增所用的缓冲液和条件如上所述。PCR及在琼脂糖凝胶上的反应混合物分析显示出一个大小为大约1.3kb的片段。如上所述分离此片段，并对其进行DNA序列分析。此1.3kb片段的DNA序列显示出一个357个氨基酸的开放读框。此357个氨基酸的开放读框包含肽HOX-1、HOX-3、HOX-4、HOX-5、HOX-7和HOX-8的氨基酸序列。因此可以得出结论，所说的1.3kb DNA片段编码9 kDCNBr片段、己糖氧化酶的29kD多肽。
使用己糖氧化酶5’端的特异引物(Hox5’-1)连同寡(dT)引物，以便扩增假定的(as sumed)全长己糖氧化酶开放读框。使用PCR扩增此基因，将其插入到pT7 Blue中，并如上所述进行测序。此1.8kb片段的DNA序列与上文描述的稍微不同的片段的DNA序列相同。因为所说的差异可能由PCR扩增期间错掺引起的，所以从至少三个独立的PCR扩增中扩增和分离所说的全长己糖氧化酶基因。因此，下表3.2.中的DNA序列由至少三个独立来源的DNA序列组成，以便排出此序列中的PCR错误。
已表明来源于上述1.8kb DNA序列的开放读框的氨基酸序列包含所有上述的HOX肽，即HOX-1和HOX-8。因此，1.8kb DNA序列编码上述来源于Chondrus crispus的9kD、29kD和40 kD的己糖氧化酶片段。所产生的开放读框多肽与下面的假设一致，即此肽是二聚己糖氧化酶酶分子的一个亚基(可能是单体片段)。3.5 Chondrus crispus RNA的Northern印迹分析
将Chondrus crispus分离的总RNA进行印迹分析。如上所述(3.1)纯化RNA，在变性甲醛琼脂糖凝胶上进行分级分离，并如Sambrook(1989)所述，将其印迹到HybondC滤膜(Amersham)中。使用引物Hox2-3+和Hox3-2-，如上所说(3.4)通过PCR合成400 bp的DNA片段。经1.2％琼脂糖凝胶(SeaPlaqueGTG，FMC)纯化此片段，并如Sambrook等(上文)所述用32P标记。使用此放射己糖氧化酶的特异杂交探针检测Northern印迹。杂交的条件是：
3.5.1.预杂交在65℃下进行2小时，所用的缓冲液包含10×Denhard’溶液(0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％牛血清清蛋白)、2×SSC(1×S SC是0.15M氯化钠、0.015 M柠檬酸钠，pH7.0)、0.1％十二烷磺酸钠(SDS)和50μg/ml的变性鲑精DNA。
3.5.2.杂交是在65℃下进行至少14小时，所用的缓冲液包含1×Denhard’溶液、2×SSC、0.1％葡聚糖硫酸盐、50μg变性的鲑精DNA和32P标记的探针(大约106dmp/ml)。在65℃下以2×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜两次，每次10分钟，接下来在65℃下以1×SSC、0.1％SDS洗涤两次，每次10分钟，用Saran包膜包装滤膜，并在-80℃使用Siemens-Titan HS加强屏将其暴露在X-射线胶片(Kodak XAR2)下两天。所得的放射自显影图(图8)显示出一条发亮的大小约为2kb的带。表3.2.1.8 kb DNA序列的核苷酸序列(SEO ID NO：30)和来源于此DNA序列的546个氨基酸的己糖氧化酶氨基酸序列的开放读框(SEO ID NO：31)TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTCTG GTACCGTGTA TGTCAAAGGT       60TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACG ATG GCT ACT CTT CCT CAG AAA GAC CCC           110
                      Met Ala Thr Leu Pro Gln Lys Asp Pro
                        1               5GGT TAT ATT GTA ATT GAT GTC AAC GCG GGC ACC GCG GAC AAG CCG GAC         158Gly Tyr Ile Val Tle Asp Val Asn Ala Gly Thr Ala Asp Lys Pro Asp10                  15                  20                  25CCA CGT CTC CCC TCC ATG AAG CAG GGC TTC AAC CGC CGC TGG ATT GGA         206Pro Arg Leu Pro Ser Met Lys Gln Gly Phe Asn Arg Arg Trp Ile Gly
             30                  35                  40ACT AAT ATC GAT TTC GTT TAT GTC GTG TAC ACT CCT CAA GGT GCT TGT         254Thr Asn Ile Asp Phe Val Tyr Val Val Tyr Thr Pro Gln Gly Ala Cys
         45                  50                  55ACT GCA CTT GAC CGT GCT ATG GAA AAG TGT TCT CCC GGT ACA GTC AGG         302Thr Ala Leu Asp Arg Ala Met Glu Lys Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg
     60                  65                  70ATC GTC TCT GGC GGC CAT TGC TAC GAG GAC TTC GTA TTT GAC GAA TGC         350Ile Val Ser Gly Gly His Cys Tyr Glu Asp Phe Val Phe Asp Glu Cys
 75                  80                  85GTC AAG GCC ATC ATC AAC GTC ACT GGT CTC GTT GAG AGT GGT TAT GAC         398Val Lys Ala Ile Ile Asn Val Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp90                  95                 100                 105GAC GAT AGG GGT TAC TTC GTC AGC AGT GGA GAT ACA AAT TGG GGC TCC         446Asp Asp Arq Gly Tyr Phe Val Ser Ser Gly Asp Thr Asn Trp Gly Ser
            110                 115                 120TTC AAG ACC TTG TTC AGA GAC CAC GGA AGA GTT CTT CCC GGG GGT TCC         494Phe Lys Thr Leu Phe Arg Asp His Gly Arg Val Leu Pro Gly Gly Ser
        125                 130                 135TGC TAC TCC GTC GGC CTC GGT GGC CAC ATT GTC GGC GGA GGT GAC GGC         542Cys Tyr Ser Val Gly Leu Gly Gly His Ile Val Gly Gly Gly Asp Gly
    140                 145                 150ATT TTG GCC CGC TTG CAT GGC CTC CCC GTC GAT TGG CTC AGC GGC GTG         590Ile Leu Ala Arg Leu His Gly Leu Pro Val Asp Trp Leu Ser Gly Val
155                 160                 165GAG GTC GTC GTT AAG CCA GTC CTC ACC GAA GAC TCG GTA CTC AAG TAT         638Glu Val Val Val Lys Pro Val Leu Tnr Glu Asp Ser Val Leu Lys Tyr170                 175                 180                 185GTG CAC AAA GAT TCC GAA GGC AAC GAC GGG GAG CTC TTT TGG GCA CAC         686Val His Lys Asp Ser Glu Gly Asn Asp Gly Glu Leu Phe Trp Ala His
            190                 195                 200ACA GGT GGC GGT GGC GGA AAC TTT GGA ATC ATC ACC AAA TAC TAC TTC         734Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn Phe Gly Ile Ile Thr Lys Tyr Tyr Phe
        205                 210                 215AAG GAT TTG CCC ATG TCT CCA CGG GGC GTC ATC GCA TCA AAT TTA CAC         782Lys Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Gly Val Ile Ala Ser Asn Leu His
    220                 225                 230TTC AGC TGG GAC GGT TTC ACG AGA GAT GCC TTG CAG GAT TTG TTG ACA         830Phe Ser Trp Asp Gly Phe Thr Arg Asp Ala Leu Gln Asp Leu Leu Thr
235                 240                 245AAG TAC TTC AAA CTT GCC AGA TGT GAT TGG AAG AAT ACG GTT GGC AAG         878Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Arg Cys Asp Trp Lys Asn Thr Val Gly Lys250                 255                 260                 265TTT CAA ATC TTC CAT CAG GCA GCG GAA GAG TTT GTC ATG TAC TTG TAT         926Phe Gln Ile Phe His Gln Ala Ala Glu Glu Phe Val Met Tyr Leu Tyr
            270                 275                 280ACA TCC TAC TCG AAC GAC GCC GAG CGC GAA GTT GCC CAA GAC CGT CAC         974Thr Ser Tyr Ser Asn Asp Ala Glu Arg Glu Val Ala Gln Asp Arg His
        285                 290                 295TAT CAT TTG GAG GCT GAC ATA GAA CAG ATC TAC AAA ACA TGC GAG CCC         1022Tyr His Leu Glu Ala Asp Ile Glu Gln Ile Tyr Lys Thr Cys Glu Pro
    300                 305                 310ACC AAA GCG CTT GGC GGG CAT GCT GGG TGG GCG CCG TTC CCC GTG CGG         1070Thr Lys Ala Leu Gly Gly His Ala Gly Trp Ala Pro Phe Pro Val Arg
315                 320                 325CCG CGC AAG AGG CAC ACA TCC AAG ACG TCG TAT ATG CAT GAC GAG ACG         1118Pro Arg Lys Arg His Thr Ser Lys Thr Ser Tyr Met His Asp Glu Thr330                 335                 340                 345ATG GAC TAC CCC TTC TAC GCG CTC ACT GAG ACG ATC AAC GGC TCC GGG         1166Met Asp Tyr Pro Phe Tyr Ala Leu Thr Glu Thr Ile Asn Gly Ser Gly
            350                 355                 360CCG AAT CAG CGC GGC AAG TAC AAG TCT GCG TAC ATG ATC AAG GAT TTC         1214Pro Asn Gln Arg Gly Lys Tyr Lys Ser Ala Tyr Met Ile Lys Asp Phe
        365                 370                 375CCG GAT TTC CAG ATC GAC GTG ATC TGG AAA TAC CTT ACG GAG GTC CCG         1262Pro Asp Phe Gln Ile Asp Val Ile Trp Lys Tyr Leu Thr Glu Val Pro
    380                 385                 390GAC GGC TTG ACT AGT GCC GAA ATG AAG GAT GCC TTA CTC CAG GTG GAC         1310Asp Gly Leu Thr Ser Ala Glu Met Lys Asp Ala Leu Leu Gln Val Asp
395                 400                 405ATG TTT GGT GGT GAG ATT CAC AAG GTG GTC TGG GAT GCG ACG GCA GTC       1358Met Phe Gly Gly Glu Ile His Lys Val Val Trp Asp Ala Thr Ala Val410                 415                 420                 425GCG CAG CGC GAG TAC ATC ATC AAA CTG CAG TAC CAG ACA TAC TGG CAG       1406Ala Gln Arg Glu Tyr Ile Ile Lys Leu Gln Tyr Gln Thr Tyr Trp Gln
            430                 435                 440GAA GAA GAC AAG GAT GCA GTG AAC CTC AAG TGG ATT AGA GAC TTT TAC       1454Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val Asn Leu Lys Trp Ile Arg Asp Phe Tyr
        445                 450                 455GAG GAG ATG TAT GAG CCG TAT GGC GGG GTT CCA GAC CCC AAC ACG CAG       1502Glu Glu Met Tyr Glu Pro Tyr Gly Gly Val Pro Asp Pro Asn Thr Gln
    460                 465                 470GTG GAG AGT GGT AAA GGT GTG TTT GAG GGA TGC TAC TTC AAC TAC CCG       1550Val Glu Ser Gly Lys Gly Val Phe Glu Gly Cys Tyr Phe Asn Tyr Pro
475                 480                 485GAT GTG GAC TTG AAC AAC TGG AAG AAC GGC AAG TAT GGT GCC CTC GAA       1598Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Glu490                 495                 500                 505CTT TAC TTT TTG GGT AAC CTG AAC CGC CTC ATC AAG GCC AAA TGG TTG       1646Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu Asn Arg Leu Ile Lys Ala Lys Trp Leu
            510                 515                 520TGG GAT CCC AAC GAG ATC TTC ACA AAC AAA CAG AGC ATC CCT ACT AAA       1694Trp Asp Pro Asn Glu Ile Phe Thr Asn Lys Gln Ser Ile Pro Thr Lys
        525                 530                 535CCT CTT AAG GAG CCC AAG CAG ACG AAA TAGTAGGTCA CAATTAGTCA             1741Pro Leu Lys Glu Pro Lys Gln Thr Lys
    540                 545TCGACTGAAG TGCAGCACTT GTCGGATACG GCGTGATGGT TGCTTTTTAT AAACTTGGTA     1801
在上表3.2.1中所示的氨基酸序列中，黑体和下划线的密码子表示HOX-1至HOX-8肽。黑体密码子是经此肽的氨基酸测序已经确认的氨基酸残基。下划线的密码子表明来源于此核苷酸序列的氨基酸残基，但经相关HOX肽的测序没有确认这些氨基酸残基。
HOX-1是461-468氨基酸残基，HOX-2是92-114残基，HOX-3是219-234残基，HOX-4是189-202残基，HOX-5是215-218残基，HOX-6是8-22残基，HOX-7是434-444残基，HOX-8是452-460残基。
                       实施例4
            在巴斯德毕赤酵母中产生重组己糖氧化酶4.1.构建在巴斯德毕赤酵母中表达重组己糖氧化酶的载体
将如表3.2所示的编码Chondrus crispus己糖氧化酶的开放读框插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC3(研究合作技术公司，Tucson，Arizona85711-3335)中。所说的质粒包含乙醇氧化酶启动子(aox1启动子)和巴斯德毕赤酵母的转录终止信号(图9，分别是aoxp和aoxt)。此载体中的his4+基因使得能够选择his+重组巴斯德毕赤酵母细胞。将此表达盒转化到巴斯德毕赤酵母中，其整合到染色体DNA中。通过加入aox1启动子的诱导物(甲醇)可以诱导包含插入到aox1启动子下游的Chondrus crispus己糖氧化酶基因的表达盒的巴斯德毕赤酵母细胞产生己糖氧化酶。大部分乙醇氧化酶基因(aox1)缺陷的巴斯德毕赤酵母变体(KM71)可以用作己糖氧化酶基因的受体(Cregg和Madden 1987；Tschopp等，1987)。然而，巴斯德毕赤酵母包含另一种也可以由甲醇诱导的乙醇氧化酶基因(aox2)。这样，己糖表达盒转化的重组巴斯德毕赤酵母，在加入甲醇之后，可以产生两种氧化酶(己糖氧化酶和乙醇氧化酶)。
在将己糖氧化酶基因插入到表达载体pPIC3中之前，修饰所说的开放读框的序列5和3。首链cDNA用作PCR的模板。所说的开放读框5端特异性的合成寡核苷酸Hox5-1(表3.1)连同编码Chondrus crispus己糖氧化酶之序列的3端特异性引物(Hox3-1)一起用作PCR引物。引物Hox3-1具有下列序列：5-ACCAAGTTTATAAAAAGCAACCATCAC-3(SEQ ID NO：32)。使用带有AmpliTaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)的GeneAmpPCR试剂盒进行PCR扩增。PCR程序是30个循环(94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，2分钟)。反应混合物的凝胶电泳显示出一条大小为1.7kb的片段。将此1.7kb片段插入到载体pT7 Blue(Novagen)(质粒pUP0150)中，并对其进行DNA测序。
如图9所示，将编码Chondrus crispus己糖氧化酶的片段进一步亚克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC3(Clare等1991)中。用限制性核酸内切酶NdeI限制切割含有己糖氧化酶基因的的质粒pT7 Blue，并实质上如Sambrook等(1989)所述用Klenow DNA聚合酶将平端补齐。在所说的DNA聚合酶热灭活之后(Sambrook等1989)，进一步用EcoRI将所说的DNA进行限制性酶切，在琼脂糖凝胶上将包含己糖氧化酶基因的DNA片段纯化成平端-EcoRI DNA片段(QIAEXTM，QIAGEN)。
用限制酶SnaBI和EcoRI对巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC3进行限制性酶切，并于琼脂糖凝胶上纯化。连接纯化的载体和编码己糖氧化酶的片段，并实质上如Sambrook等(1989)所述把连接混合物转化到大肠杆菌DB5α(Life Technologies)中。对所得的含有Chondrus crispus的己糖氧化酶基因的表达载体(质粒pUP0153)进行DNA测序，以确保在亚克隆过程中己糖氧化酶基因没有发生突变。
从大肠杆菌DH5α中纯化质粒pUP0153，并使用电穿孔(毕赤酵母属表达系统，Phillips石油公司)或者使用毕赤酵母属原生质球模块(Invitrogen，San Diego，美国，产品号K1720-01)将其引入到巴斯德毕赤酵母中。使用巴斯德毕赤酵母的甲醇使用缺陷型变体KM71(遗传型his4，aox1：：ARG4)(Cregg和Madden1987；Tschopp等，1987)作为受体。使用PCR筛选在没有组氨酸的琼脂平板上选择的重组巴斯德毕赤酵母菌落，看是否存在己糖氧化酶基因。除了使用巴斯德毕赤酵母乙醇氧化酶启动子和转录终止信号的特异性引物(分别为Invitrogen，产品号N710-02和N720-02)外，还使用了己糖氧化酶的特异性引物(表3.1)。
包含pUP0153的巴斯德毕赤酵母KM71样品保藏在德意志微生物保藏中心(DSM)，Mascheroder Weg Ib，D-38124 Braunschweig(德国，1996年5月23日，保藏号DSM 10693)。4.2.重组己糖氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达
在摇瓶中的MD(1.34g/l酵母氮碱(nitrogen base)(Difco，产品号0919-15-3)、0.4mg/l生物素、0.1％精氨酸、20g/l葡萄糖)中培养包含带有插入到aox1启动子和转录终止信号之间的己糖氧化酶基因的表达盒的巴斯德毕赤酵母菌株KM71。30℃下在旋转摇动器中以300rpm培养包含150毫升培养物的体积为1升的摇瓶。当细胞达到OD600＝15-20的密度时，在6,000×g下离心10分钟以便收获这些细胞，并悬浮在相似体积(150毫升)的诱导培养基MM(1.34g/l酵母氮碱、0.4mg/l生物素、0.1％精氨酸、1％甲醇)中。培养2天后，另外加入甲醇(0.5％)，以补充甲醇的消耗和蒸发。
诱导3或4天后，通过离心(6,000×g，10分钟)收获这些细胞，并悬浮在大约1/5生长体积的50mM Tris-Cl(pH 7.5)中。在使用FRENCH压碎器(SLM仪器公司，Rochester，N.Y.)破碎之前，悬浮的细胞一直保存在低温下。
将细胞在20K FRENCH压碎器中以20,000 psi的内压断开。在5℃下通过以10,000×g离心10分钟澄清细胞抽提物。将含有己糖氧化酶的上清液小心地移出，并如上所述进行纯化。4.3.从巴斯德毕赤酵母纯化重组己糖氧化酶4.3.1.第一步，阴离子交换层析
在装备有两个以高性能Q-琼脂糖凝胶(Pharmacia)预填充的5毫升HiTrap-Q柱的FPLC系统中将由弗氏压碎器匀浆过程中产生的澄清的匀浆液(100-150毫升)进行阴离子交换层析。这两个柱以串联方式连接，并在室温下进行层析。此柱以缓冲液A：20mM Tris-Cl(pH 7.5)平衡。加样过程中，流速是1.25毫升，洗涤和洗脱期间流速是2.5毫升。加样后，以30毫升的缓冲液A洗涤此柱。以200毫升的梯度液(缓冲液A到缓冲液B：20mMTris-Cl，750mM NaCl，pH 7.5)洗脱吸附的蛋白。在洗涤和梯度洗脱过程中，收集2毫升的组分。如上面的实施例1.3所述(样品10μl，温育15分钟)测定这些组分中的己糖氧化酶活性。以与己糖氧化酶测定同样的测定方法(只是在此测定中，以0.5％甲醇代替0.05M葡萄糖作为底物)也测定了这些组分中的乙醇氧化酶(AOX)活性。如图10所示，活性图谱显示出在大约400mM NaCl的盐浓度下存在AOX和HOX的共洗脱。将含有己糖氧化酶的组分合并，并贮存在4℃下。4.3.2.第二步，凝胶过滤
4℃下，在centriprep浓缩器(Amicon，美国，标称分子量截断30,000)中通过超速离心将第一步纯化得到的混合液浓缩到大约3.5毫升。通过离心澄清浓缩的己糖氧化酶制剂，将上清液与甘油混合，使之最终浓度为5％。使用连接在此柱入口处的SA-5加样器(Pharmacia)将所说的样品加入到此柱中。4℃下，在350毫升柱床体积的XK26/70柱(2.6(66cm，Pharmacia)上进行凝胶过滤。按照厂商的说明，此柱以聚丙烯酰胺S-200 HR(Pharmacia)填充。缓冲液是20mM Tris-Cl，500 mMNaCl，pH 7.5，以0.5毫升/分钟安装蠕动的P1泵(Pharmacia)。在280nm下记录UV吸收。收集2.5毫升的组分，并如上所述(样品10μl，温育15分钟)测定己糖氧化酶和乙醇氧化酶的活性。活性图谱清楚地表明AOX和HOX活性是分离的(参见图11)。因为从甲基营养酵母(类似于巴斯德毕赤酵母)得到的乙醇氧化酶的天然分子量为大约600,000(Sahm和Wagner，1973)，而HOX的天然分子量为大约110,000-130,000(如1.8部分所述)，所以此结果是预料到的。重组HOX的洗脱体积与早些时候在此柱中观察到的Chondrus crispus的非变性的HOX的洗脱体积(1.7和1.8部分)相同。这样，重组HOX显示出与从Chondruscrispus中直接分离的天然HOX的分子量相同。合并含有己糖氧化酶的组分，并将其保存在4℃下。4.4.3.第三步，在Mono Q柱上的阴离子交换层析
在装备有Mono Q HR 5/5柱(1毫升柱床体积)的FPLC系统上通过阴离子交换层析进一步纯化从上述的第二步中得到的混合液。此柱以缓冲液A：20mM Tris-Cl，pH 7.5平衡。流速是1毫升/分钟。在预填充的葡聚糖凝胶G-25柱(PD-10，Pharmacia)通过凝胶过滤以缓冲液A将第二步中得到的混合液脱盐。将样品加入到柱上后，用30毫升的缓冲液A洗涤此柱。以20毫升的梯度液(0％至100％的缓冲液B：20mM Tris-Cl，500mMNaCl，pH 7.5)洗脱吸附的蛋白。收集0.5毫升的组分，如上所述(样品10μl，温育时间15分钟)测定己糖氧化酶活性。合并含有己糖氧化酶的组分，并保存在4℃。4.3.4.第四步，层析聚焦
如在上文的实施例1.13中所述，在Mono P HR 5/5柱上通过层析聚焦纯化上面第三步中得到的混合液，只是省略了苯基琼脂糖凝胶吸附步骤。比较天然的和重组己糖氧化酶(以层析聚焦为最后纯化步骤获得的这两种形式)，发现巴斯德毕赤酵母的重组己糖氧化酶的特异活性与从Chondruscrispus中分离的天然己糖氧化酶的活性相似。通过SDS-PAGE和如上所述以考马斯亮兰R-250染色来分析含有己糖氧化酶的组分。重组己糖氧化酶的纯化制剂由分别迁移到40 kD和29kD的两条带组成。
总之，可以从宿主有机体巴斯德毕赤酵母中分离和纯化重组己糖氧化酶。在SDS-PAGE中，重组的纯化的酶与Chondrus crispus中相应的天然酶在40 kD和29kD处显示出同样的带。4.4.从巴斯德毕赤酵母中得到的重组己糖氧化酶的性质
重组己糖氧化酶(rHOX)的片段的产生和氨基酸序列分析。
如上文的实施例2.4所述，将纯化的rHOX用于制备性SDS-PAGE和电印迹到PVDF膜中。
如上文的实施例2.5所述，将得到的40 kD和29kD带通过结合到PVDF上的己糖氧化酶多肽进行酶促消化。如上文的实施例2.7所述，通过反相液相色谱分离所说的肽片段。选择完好分开(well-resolved)的和丰富的肽如上文的实施例2.3所述经自动Edman降解(10步)分析氨基酸序列。所得的氨基酸序列如表4.1所示。表4.1.通过对在巴斯德毕赤酵母中表达的重组己糖氧化酶的40 kD和29kD
衍生的内蛋白酶Lys-C肽进行序列分析得到的肽序列
被测序肽的来源 序列鉴定     氨基酸序列
  步骤 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10
    40kD  HOX-9肽 D  P  G  Y  I  V  I  D  V  N
    29kD  HOX-10肽 L和Y  Q和L  Y和T  Q和E  T和V  Y和P  W和D  Q和G  E和L  E和T
重组40 kD多肽的HOX-9肽序列显示出与如表3.2所示的chondruscrispus的己糖氧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)的Aspx8至Asn17相同的序列。从重组29kD多肽获得的肽样品的序列分析在每一步表明两个残基。氨基酸鉴定表明存在于此样品中的两个肽分别相当于Chondrus crispus的已糖氧化酶之氨基酸序列的Leu434至Glu443和Tyr388至Thr397，参见表3.2(SEQ ID NO：30)。
这样，可以得出结论，从重组己糖氧化酶中获得的肽序列与Chondruscrispus的天然己糖氧化酶的相应的氨基酸序列相同。
并且，可以得出结论Chondrus crispus的己糖氧化酶基因转化的巴斯德毕赤酵母能够产生重组己糖氧化酶。4.4.1.底物特异性
在如上所述的测定中使用各种糖(最终浓度为0.1M)比较巴斯德毕赤酵母的重组己糖氧化酶和Chondrus crispus的天然己糖氧化酶的底物特异性。相对速率如表4.2所示。表4.2.巴斯德毕赤酵母的重组己糖氧化酶和Chondrus crispus的天然己
                糖氧化酶的底物特异性
                       相对速率底物    重组酶  天然酶(此项研  天然酶(Sullivan和
              究)             Ikawa，1973)D-葡萄糖    100     100             100D-半乳糖    75      75              82麦芽糖     57      37              40纤维二糖    51      33              32乳糖      38      25              22
如图4.2所示，重组己糖氧化酶的底物特异性几乎与天然酶的底物特异性相同。然而，尽管这两种酶形式对二糖的相对速率以麦芽糖、纤维二糖和乳糖的次序降低，但重组酶在氧化这些二糖的能力方面显示出更低的选择性。有关天然酶的结果几乎与Sullivan等(1973)早期报道的数据相同。4.4.2.经二乙基二硫氨基甲酸钠的抑制
Sullivan和Ikawa(1973)报道二乙基二硫氨基甲酸钠强烈地抑制Chondrus crispus的己糖氧化酶。比较此结合铜的化合物对巴斯德毕赤酵母的重组己糖氧化酶和Chondrus crispus天然酶的抑制作用。如Sullivan和Ikawa(1973)所述，抑制物以两种浓度(0.1mM和0.01mM)被包含在酶测定中。表4.3概括了所得的结果。表4.3.比较二乙基二硫氨基甲酸钠对巴斯德毕赤酵母的重组己糖氧化酶
和Chondrus crispus天然己糖氧化酶的酶活性的抑制作用
    抑制作用(％)
抑制物浓度   重组酶   天然酶
    0.1mM     96     95
   0.01mM     39     41
表4.3显示出重组和天然己糖氧化酶对二乙基二硫氨基甲酸钠的抑制作用具有相等的敏感性。并且，所得的结果与Sullivan和Ikawa(1973)报道的有关天然己糖氧化酶的数据相似。
                           实施例5
                 在大肠杆菌中产生重组己糖氧化酶5.1.构建在大肠杆菌中表达重组己糖氧化酶的载体
将表3.2.所示的编码Chondrus crispus己糖氧化酶的开放读框(SEQ IDNO：30)插入到大肠杆菌表达载体pET17b(Novagen，产品号69726-1)中。此质粒包含强诱导型噬菌体T7启动子和T7转录终止信号。如果此质粒在特异的大肠杆菌宿主细胞(如菌株BL21(DE3))(Novagen，产品号69387-1)中能表达，通过加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)使插入到这些控制元件中的基因表达。
为了将所说的基因插入到表达载体pET17b中，在5′和3′端修饰己糖氧化酶基因。用己糖氧化酶基因的5′和3′端特异引物通过PCR分离己糖氧化酶基因。所说的5′端引物(Hox5′-2)具有下列的DNA序列：5′-ATGAATTCGTGGGTCGAAGAGCCC-3′(SEQ ID NO：33)，3′端的特异引物是Hox3′-1。Chondrus crispus的首链cDNA用作模板。如在实施例4.1所述用AmpliTaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)进行PCR扩增。反应混合物的凝胶电泳显示出一条大小约为1.7 kb的带。将此1.7 kb的片段插入到载体pT7 Blue(Novagen)中，得到质粒pUP0161。
图12显示出己糖氧化酶基因5′端的修饰和此基因进一步亚克隆到大肠杆菌表达载体中。为了在ATG翻译起始密码子的右边插入NdeI位点，通过PCR修饰所说的5′端。使用了具有下列序列(5′-CAGGAATTCATATGGCTACTCTTCCCCAGAAAG-3)的寡核苷酸Hox5′-4(SEQ ID NO：34)及寡核苷酸Hox13-(SEQ ID NO：28)(表3.1)。如在实施例4.1中的描述进行PCR扩增。在2％琼脂糖凝胶上进行反应混合物的分级分离，如在实施例3.4所述进行己糖氧化酶特异性180 bp片段的纯化。用限制性核酸内切酶C1aI和EcoRI对所说的180 bp片段进行限制性酶切，并将其连接到用同样酶切割的pUP0161上，得到质粒pUP0167。
为了构建大肠杆菌的己糖氧化酶表达载体，进一步将质粒pUP0167中的己糖氧化酶基因亚克隆。用NdeI和BamHI及BamHI和SalI将质粒pUP0167进行限制性酶切。第一个反应得到编码5′端和己糖氧化酶中间部分之基因的1.6 kb片段，而使用酶BamHI和SalI的反应得到一个编码己糖氧化酶3′端之基因的200 bp片段。如在实施例3.4所述，在琼脂糖凝胶上纯化这两种己糖氧化酶特异片段，并将其连接到以限制性核酸内切酶NdeI和XhoI限制酶切的质粒pET17b上。包含己糖氧化酶基因的质粒pET17b被命名为pUP0181。DNA测序表明在分离和克隆过程中在己糖氧化酶基因中没有引入突变。5.2.在大肠杆菌中表达重组己糖氧化酶
通过标准的转化方法将质粒pUP0181引入到大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)中(Sambrook等，1989)。使这些细胞在摇瓶中的LB培养基中生长(Sambrook等，见上文)。在细胞密度为OD600＝0.5时，通过加入10-3M IPTG诱导这些细胞表达重组己糖氧化酶。加入IPTG 1小时后，通过离心收获细胞，并将其悬浮在样品缓冲液中，如上文实施例1.10中所述进行SDS-PAGE。
图13显示出电泳结果。大肠杆菌表达的质粒pUP0181的重组己糖氧化酶的粗提物在Mr 62 kD处显示出一条明显的蛋白带。此62 kD带与有所说的开放读框推测的翻译产物具有相同分子量。未转化的大肠杆菌细胞没有显示出这样一种62kD蛋白。
包含pUP0181的大肠杆菌BL21(DE3)样品保藏在德意志微生物保藏中心(DSM)，Mascheroder Weg Ib，D-38124 Braunscbweig(德国，1996年5月23日，保藏号DSM 10692)。
                              实施例6
                 在酿酒酵母中产生重组己糖氧化酶6.1.构建在酿酒酵母中表达己糖氧化酶的载体
将表3.2所示编码Chondrus crispus己糖氧化酶的开放读框(SEQ ID NO：30)插入到酵母表达载体pYES2(Invitrogen，产品号V825-20)中。质粒pYES2为多拷贝的附加型载体，在酿酒酵母中设计用于重组蛋白质的诱导型表达。此载体包含酿酒酵母Gall基因的激活和启动子序列，这些序列与高水平的紧密调节的转录有关。此转录终止信号来自CYCl基因。
为了将Chondrus crispus的己糖氧化酶基因插入到表达载体pYES2中，在5′和3′端修饰此基因。如在实施例4.1中所示从质粒pUP0150中分离己糖氧化酶基因(图9)。如所述以平端EcoRI DNA片段分离己糖氧化酶基因，并将其插入到用酶PvuII和EcoRI限制性切割的质粒pYES2中(图14)。将所得的质粒pUP0155进行DNA测序，结果显示出在克隆过程中没有发生突变。
从大肠杆菌DH5α中纯化质粒pUP0155，并通过电穿孔转化到酿酒酵母中(Grey和Brendel，1992)。将菌株PAP1500(基因型α，urα3-52，trp1：：GAL10-GAL4，lys2-801，leu2 1，his 3 200，pep4：：HIS3，prb11.6R，can1，GAL)(Pedersen等，1996))作为受体。6.2.在酿酒酵母中表达重组己糖氧化酶
使包含质粒pUP0155的酿酒酵母菌株1500生长，并如Pedersen等(1996)的描述用2％半乳糖诱导。诱导3天后，通过离心收获细胞，并如上文实施例4.2的描述进行裂解。使用在上文实施例1.3中描述的O-邻联茴香胺测定法测定粗提物的己糖氧化酶活性。表6.1显示出含有己糖氧化酶基因的酿酒酵母细胞能够表达活性己糖氧化酶。
表6.1.在酿酒酵母中产生重组己糖氧化酶
    酿酒酵母
    底物 +己糖氧化酶基因 非重组对照
  D-葡萄糖     ++     0
  D-半乳糖     +     0
    无底物     0     0
0＝没有检测到活性
包含质粒pUP0155的酿酒酵母菌株1500的样品保藏在德意志微生物保藏吣(DSM)，Mascheroder Weg Ib，D-38124 Braunschweig(德国，1996年5月23日，登记号DSM 10694)。
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                             序列表(1)一般信息：(i)申请人：
(A)姓名：Bioteknologisk Institut
(B)街道：Anker Engelunds Vej 1
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                      Met Ala Thr Leu Pro Gln Lys Asp Pro
                        1               5GGT TAT ATT GTA ATT GAT GTC AAC GCG GGC ACC GCG GAC AAG CCG GAC     158Gly Tyr Ile Val Ile Asp Val Asn Ala Gly Thr Ala Asp Lys Pro Asp10                  15                  20                  25CCA CGT CTC CCC TCC ATG AAG CAG GGC TTC AAC CGC CGC TGG ATT GGA     206Pro Arg Leu Pro Ser Met Lys Gln Gly Phe Asn Arg Arg Trp Ile Gly
             30                  35                  40ACT AAT ATC GAT TTC GTT TAT GTC GTG TAC ACT CCT CAA GGT GCT TGT     254Thr Asn Ile Asp Phe Val Tyr Val Val Tyr Thr Pro Gln Gly Ala Cys
         45                  50                  55ACT GCA CTT GAC CGT GCT ATG GAA AAG TGT TCT CCC GGT ACA GTC AGG     302Thr Ala Leu Asp Arg Ala Met Glu Lys Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg
     60                  65                  70ATC GTC TCT GGC GGC CAT TGC TAC GAG GAC TTC GTA TTT GAC GAA TGC     350Ile Val Ser Gly Gly His Cys Tyr Glu Asp Phe Val Phe Asp Glu Cys
 75                  80                  85GTC AAG GCC ATC ATC AAC GTC ACT GGT CTC GTT GAG AGT GGT TAT GAC     398Val Lys Ala Ile Ile Asn Val Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp90                  95                 100                 105GAC GAT AGG GGT TAC TTC GTC AGC AGT GGA GAT ACA AAT TGG GGC TCC     446Asp Asp Arg Gly Tyr Phe Val Ser Ser Gly Asp Thr Asn Trp Gly Ser
            110                 115                 120TTC AAG ACC TTG TTC AGA GAC CAC GGA AGA GTT CTT CCC GGG GGT TCC     494Phe Lys Thr Leu Phe Arg Asp His Gly Arg Val Leu Pro Gly Gly Ser
        125                 130                 135TGC TAC TCC GTC GGC CTC GGT GGC CAC ATT GTC GGC GGA GGT GAC GGC     542Cys Tyr Ser Val Gly Leu Gly Gly His Ile Val Gly Gly Gly Asp Gly
    140                 145                 150ATT TTG GCC CGC TTG CAT GGC CTC CCC GTC GAT TGG CTC AGC GGC GTG     590Ile Leu Ala Arg Leu His Gly Leu Pro Val Asp Trp Leu Ser Gly Val
155                 160                 165GAG GTC GTC GTT AAG CCA GTC CTC ACC GAA GAC TCG GTA CTC AAG TAT     638Glu Val Val Val Lys Pro Val Leu Thr Glu Asp Ser Val Leu Lys Tyr170                 175                 180                 185GTG CAC AAA GAT TCC GAA GGC AAC GAC GGG GAG CTC TTT TGG GCA CAC     686Val His Lys Asp Ser Glu Gly Asn Asp Gly Glu Leu Phe Trp Ala His
            190                 195                 200ACA GGT GGC GGT GGC GGA AAC TTT GGA ATC ATC ACC AAA TAC TAC TTC     734Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn Phe Gly Ile Ile Thr Lys Tyr Tyr Phe
        205                 210                 215AAG GAT TTG CCC ATG TCT CCA CGG GGC GTC ATC GCA TCA AAT TTA CAC     782Lys Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Gly Val Ile Ala Ser Asn Leu His
    220                 225                 230TTC AGC TGG GAC GGT TTC ACG AGA GAT GCC TTG CAG GAT TTG TTG ACA     830Phe Ser Trp Asp Gly Phe Thr Arg Asp Ala Leu Gln Asp Leu Leu Thr
235                 240                 245AAG TAC TTC AAA CTT GCC AGA TGT GAT TGG AAG AAT ACG GTT GGC AAG   878Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Arg Cys Asp Trp Lys Asn Thr Val Gly Lys250                 255                 260                 265TTT CAA ATC TTC CAT CAG GCA GCG GAA GAG TTT GTC ATG TAC TTG TAT   926Phe Gln Ile Phe His Gln Ala Ala Glu Glu Phe Val Met Tyr Leu Tyr
            270                 275                 280ACA TCC TAC TCG AAC GAC GCC GAG CGC GAA GTT GCC CAA GAC CGT CAC   974Thr Ser Tyr Ser Asn Asp Ala Glu Arg Glu Val Ala Gln Asp Arg His
        285                 290                 295TAT CAT TTG GAG GCT GAC ATA GAA CAG ATC TAC AAA ACA TGC GAG CCC   1022Tyr His Leu Glu Ala Asp Ile Glu Gln Ile Tyr Lys Thr Cys Glu Pro
    300                 305                 310ACC AAA GCG CTT GGC GGG CAT GCT GGG TGG GCG CCG TTC CCC GTG CGG   1070Thr Lys Ala Leu Gly Gly His Ala Gly Trp Ala Pro Phe Pro Val Arg
315                 320                 325CCG CGC AAG AGG CAC ACA TCC AAG ACG TCG TAT ATG CAT GAC GAG ACG   1118Pro Arg Lys Arg His Thr Ser Lys Thr Ser Tyr Met His Asp Glu Thr330                 335                 340                 345ATG GAC TAC CCC TTC TAC GCG CTC ACT GAG ACG ATC AAC GGC TCC GGG   1166Met Asp Tyr Pro Phe Tyr Ala Leu Thr Glu Thr Ile Asn Gly Ser Gly
            350                 355                 360CCG AAT CAG CGC GGC AAG TAC AAG TCT GCG TAC ATG ATC AAG GAT TTC   1214Pro Asn Gln Arg Gly Lys Tyr Lys Ser Ala Tyr Met Ile Lys Asp Phe
        365                 370                 375CCG GAT TTC CAG ATC GAC GTG ATC TGG AAA TAC CTT ACG GAG GTC CCG   1262Pro Asp Phe Gln Ile Asp Val Ile Trp Lys Tyr Leu Thr Glu Val Pro
    380                 385                 390GAC GGC TTG ACT AGT GCC GAA ATG AAG GAT GCC TTA CTC CAG GTG GAC   1310Asp Gly Leu Thr Ser Ala Glu Met Lys Asp Ala Leu Leu Gln Val Asp
395                 400                 405ATG TTT GGT GGT GAG ATT CAT AAG GTG GTC TGG GAT GCG ACG GCA GTC   1358Met Phe Gly Gly Glu Ile His Lys Val Val Trp Asp Ala Thr Ala Val410                 415                 420                 425GCG CAG CGC GAG TAC ATC ATC AAA CTG CAG TAC CAG ACA TAC TGG CAG   1406Ala Gln Arg Glu Tyr Ile Ile Lys Leu Gln Tyr Gln Thr Tyr Trp Gln
            430                 435                 440GAA GAA GAC AAG GAT GCA GTG AAC CTC AAG TGG ATT AGA GAC TTT TAC   1454Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val Asn Leu Lys Trp Ile Arg Asp Phe Tyr
        445                 450                 455GAG GAG ATG TAT GAG CCG TAT GGC GGG GTT CCA GAC CCC AAC ACG CAG   1502Glu Glu Met Tyr Glu Pro Tyr Gly Gly Val Pro Asp Pro Asn Thr Gln
    460                 465                 470GTG GAG AGT GGT AAA GGT GTG TTT GAG GGA TGC TAC TTC AAC TAC CCG   1550Val Glu Ser Gly Lys Gly Val phe Glu Gly Cys Tyr Phe Asn Tyr Pro
475                 480                 485GAT GTG GAC TTG AAC AAC TGG AAG AAC GGC AAG TAT GGT GCC CTC GAA   1598Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Glu490                 495                 500                 505CTT TAC TTT TTG GGT AAC CTG AAC CGC CTC ATC AAG GCC AAA TGG TTG   1646Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu Asn Arg Leu Ile Lys Ala Lys Trp Leu
            510                 515                 520TGG GAT CCC AAC GAG ATC TTC ACA AAC AAA CAG AGC ATC CCT ACT AAA   1694Trp Asp Pro Asn Glu Ile Phe Thr Asn Lys Gln Ser Ile Pro Thr Lys
        525                 530                 535CCT CTT AAG GAG CCC AAG CAG ACG AAA TAGTAGGTCA CAATTAGTCA         1741Pro Leu Lys Glu Pro Lys Gln Thr Lys
    540                 545TCGACTGAAG TGCAGCACTT GTCGGATACG GCGTGATGGT TGCTTTTTAT AAACTTGGTA 1801(2)SEQ ID NO：31信息：(i)序列特征
(A)长度：546个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：Val Val Tyr Thr Pro Gln Gly Ala Cys Thr Ala Leu Asp Arg Ala Met
 50                  55                  60Glu Lys Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg Ile Val Ser Gly Gly His Cys65                  70                  75                  80Tyr Glu Asp Phe Val Phe Asp Glu Cys Val Lys Ala Ile Ile Asn Val
             85                  90                  95Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp Asp Asp Arg Gly Tyr Phe Val
        100                 105                 110Ser Ser Gly Asp Thr Asn Trp Gly Ser Phe Lys Thr Leu Phe Arg Asp
    115                 120                 125His Gly Arg Val Leu Pro Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Val Gly Leu Gly
130                 135                 140Gly His Ile Val Gly Gly Gly Asp Gly Ile Leu Ala Arg Leu His Gly145                 150                 155                 160Leu Pro Val Asp Trp Leu Ser Gly Val Glu Val Val Val Lys Pro Val
            165                 170                 175Leu Thr Glu Asp Ser Val Leu Lys Tyr Val His Lys Asp Ser Glu Gly
        180                 185                 190Asn Asp Gly Glu Leu Phe Trp Ala His Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn
    195                 200                 205Phe Gly Ile Ile Thr Lys Tyr Tyr Phe Lys Asp Leu Pro Met Ser Pro
210                 215                 220Arg Gly Val Ile Ala Ser Asn Leu His Phe Ser Trp Asp Gly Phe Thr225                 230                 235                 240Arg Asp Ala Leu Gln Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Arg
            245                 250                 255Cys Asp Trp Lys Asn Thr Val Gly Lys Phe Gln Ile Phe His Gln Ala
        260                 265                 270Ala Glu Glu Phe Val Met Tyr Leu Tyr Thr Ser Tyr Ser Asn Asp Ala
    275                 280                 285Glu Arg Glu Val Ala Gln Asp Arg His Tyr His Leu Glu Ala Asp Ile
290                 295                 300Glu Gln Ile Tyr Lys Thr Cys Glu Pro Thr Lys Ala Leu Gly Gly His305                 310                 315                 320Ala Gly Trp Ala Pro Phe Pro Val Arg Pro Arg Lys Arg His Thr Ser
            325                 330                 335Lys Thr Ser Tyr Met His Asp Glu Thr Met Asp Tyr Pro Phe Tyr Ala
        340                 345                 350Leu Thr Glu Thr Ile Asn Gly Ser Gly Pro Asn Gln Arg Gly Lys Tyr
            355         360                 365Lys Ser Ala Tyr Met Ile Lys Asp Phe Pro Asp Phe Gln Ile Asp Val
370                 375                 380Ile Trp Lys Tyr Leu Thr Glu Val Pro Asp Gly Leu Thr Ser Ala Glu385                 390                 395                 400Met Lys Asp Ala Leu Leu Gln Val Asp Met Phe Gly Gly Glu Ile His
            405                 410                 415Lys Val Val Trp Asp Ala Thr Ala Val Ala Gln Arg Glu Tyr Ile Ile
        420                 425                 430Lys Leu Gln Tyr Gln Thr Tyr Trp Gln Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val
    435                 440                 445Asn Leu Lys Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Glu Glu Met Tyr Glu Pro Tyr
450                 455                 460Gly Gly Val Pro Asp Pro Asn Thr Gln Val Glu Ser Gly Lys Gly Val465                 470                 475                 480Phe Glu Gly Cys Tyr Phe Asn Tyr Pro Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp
            485                 490                 495Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Glu Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu
        500                 505                 510Asn Arg Leu Ile Lys Ala Lys Trp Leu Trp Asp Pro Asn Glu Ile Phe
    515                 520                 525Thr Asn Lys Gln Ser Ile Pro Thr Lys Pro Leu Lys Glu Pro Lys Gln
530                 535                 540(2)SEQ ID NO：32信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：其它核酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：ACCAAGTTTA TAAAAAGCAA CCATCAC                           27(2)SEQ ID NO：33信息：(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：ATGAATTCGT GGGTCGAAGA GCCC                              24(2)信息SEQ ID NO：34：(i)序列特征
(A)长度：33个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：CAGGAATTCA TATGGCTACT CTTCCCCAGA AAG                    33

Claims (44)

1.一种产生具有己糖氧化酶活性的多肽的方法，这种方法包括分离或合成编码所说多肽的DNA片段；将所说的DNA片段引入到合适的宿主有机体中，在这种有机体中DNA片段与用于此DNA片段的合适的表达信号结合；在使己糖氧化酶活性多肽表达的条件下培养这种宿主有机体；并从培养基或者从宿主有机体中回收所说的多肽。
2.按照权利要求1的方法，其中所说的DNA片段是从海藻类中分离出来的。
3.按照权利要求2的方法，其中所说的海藻类是一种选自由Chondruscrispus、Iridophycus flaccidum和Euthora cristata组成的组中的海藻。
4.按照权利要求1的方法，其中所说的宿主有机体是选自由细菌类、真菌类、酵母类组成的组中的微生物。
5.权利要求4的方法，其中所说的宿主有机体选自由大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母组成的组。
6.按照权利要求1的方法，其中所说的DNA片段包含至少一种编码选自下组的氨基酸序列和其突变蛋白和变体的DNA序列：
(i)Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro(SEQ ID NO：1)，
(ii)Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO：2)，
(iii)Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe(SEQ ID NO：3)，
(iv)Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr(SEQID NO：4)，
(v)Tyr-Tyr-Phe-Lys(SEQ ID NO：5)，
(vi)Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp(SEQ ID NO：6)，
(vii)Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp(SEQ ID NO：7)，
(viii)X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met(SEQ ID NO：8)，
其中X代表选自下组的氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
7.按照权利要求1的方法，这种方法还包括纯化从培养基和/或微生物中最初回收的多肽制剂，以便获得其中的多肽实质上以纯化形式存在的制剂的步骤。
8.按照权利要求1的方法，其中所说的具有己糖氧化酶活性的多肽是一种融合产物。
9.一种分离形式的具有己糖氧化酶活性的多肽，这种多肽包含至少一种选自下组的氨基酸序列和其突变蛋白和变体：
(i)Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro(SEQ ID NO：1)，
(ii)Ala-Ile-Ile-Ash-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO：2)，
(iii)Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe(SEQ ID NO：3)，
(iv)Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr(SEQID NO：4)，
(v)Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEQ ID NO：5)，
(vi)Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp(SEQ ID NO：6)，
(vii)Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp(SEQ ID NO：7)，
(viii)X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met(SEQ ID NO：8)，
其中X代表由选自下组的氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
10.按照权利要求9的多肽，这种多肽是按照权利要求1的方法产生的。
11.按照权利要求9的多肽，这种多肽是通过微生物细胞产生的，所说的微生物细胞选自由细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞组成的组。
12.按照权利要求11的多肽，这种多肽是通过细胞产生的，所说的细胞选自由大肠杆菌细胞、酿酒酵母细胞和巴斯德毕赤酵母细胞组成的组。
13.按照权利要求9的多肽，这种多肽实质上是非糖基化形式的。
14.按照权利要求9的多肽，这种多肽具有与Chondrus crispus天然产生的己糖氧化酶的多肽相同或部分相同的功能特性。
15.按照权利要求14的多肽，这种多肽当进行SDS-PAGE时显示出分离的29、40和/或60 kD的带。
16.按照权利要求9的多肽，这种多肽在5-9的pH范围内显示出酶促活性。
17.按照权利要求9的多肽，这种多肽的最佳酶促活性温度在20-60℃范围内。
18.按照权利要求9的多肽，这种多肽氧化至少一种选自由D-葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖、D-甘露糖、D-墨角藻糖和D-木糖组成的组中的糖。
19.按照权利要求9的多肽，这种多肽的等电点在4-5范围内。
20.按照权利要求19的多肽，这种多肽的等电点为4.3±0.1。
21.按照权利要求19的多肽，这种多肽的等电点为4.5±0.1。
22.按照权利要求9的多肽，这种多肽实质上是纯化的形式的。
23.按照权利要求9的多肽，这种多肽的分子量在使用聚丙烯酰胺S-200Superfine(Pharmacia)通过凝胶过滤测定时在100-150 kD范围内。
24.按照权利要求23的多肽，这种多肽表观分子量为110 kD±10kD。
25.按照权利要求9的多肽，这种多肽是包含附加的酶促活性氨基酸序列的融合产物的一部分。
26.一种重组DNA分子，这种重组DNA分子包含编码具有己糖氧化酶活性之多肽的DNA片段。
27.按照权利要求26的DNA分子，其中所说的DNA片段编码包含至少一种如权利要求9限定的氨基酸序列的多肽或者这种多肽的突变蛋白或衍生物。
28.按照权利要求27的DNA分子，这种DNA分子包含以下DNA序列(SEQID NO：30)：TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTCTG GTACCGTGTA TGTCAAAGGT       60TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACGATGGCTA CTCTTCCTCA GAAAGACCCC GGTTATATTG      120TAATTGATGT CAACGCGGGC ACCGCGGACA AGCCGGACCC ACGTCTCCCC TCCATGAAGC      180AGGGCTTCAA CCGCCGCTGG ATTGGAACTA ATATCGATTT CGTTTATGTC GTGTACACTC      240CTCAAGGTGC TTGTACTGCA CTTGACCGTG CTATGGAAAA GTGTTCTCCC GGTACAGTCA      300GGATCGTCTC TGGCGGCCAT TGCTACGAGG ACTTCGTATT TGACGAATGC GTCAAGGCCA      360TCATCAACGT CACTGGTCTC GTTGAGAGTG GTTATGACGA CGATAGGGGT TACTTCGTCA      420GCAGTGGAGA TACAAATTGG GGCTCCTTCA AGACCTTGTT CAGAGACCAC GGAAGAGTTC      480TTCCCGGGGG TTCCTGCTAC TCCGTCGGCC TCGGTGGCCA CATTGTCGGC GGAGGTGACG      540GCATTTTGGC CCGCTTGCAT GGCCTCCCCG TCGATTGGCT CAGCGGCGTG GAGGTCGTCG      600TTAAGCCAGT CCTCACCGAA GACTCGGTAC TCAAGTATGT GCACAAAGAT TCCGAAGGCA      660ACGACGGGGA GCTCTTTTGG GCACACACAG GTGGCGGTGG CGGAAACTTT GGAATCATCA      720CCAAATACTA CTTCAAGGAT TTGCCCATGT CTCCACGGGG CGTCATCGCA TCAAATTTAC      780ACTTCAGCTG GGACGGTTTC ACGAGAGATG CCTTGCAGGA TTTGTTGACA AAGTACTTCA      840AACTTGCCAG ATGTGATTGG AAGAATACGG TTGGCAAGTT TCAAATCTTC CATCAGGCAG      900CGGAAGAGTT TGTCATGTAC TTGTATACAT CCTACTCGAA CGACGCCGAG CGCGAAGTTG      960CCCAAGACCG TCACTATCAT TTGGAGGCTG ACATAGAACA GATCTACAAA ACATGCGAGC      1020CCACCAAAGC GCTTGGCGGG CATGCTGGGT GGGCGCCGTT CCCCGTGCGG CCGCGCAAGA      1080GGCACACATC CAAGACGTCG TATATGCATG ACGAGACGAT GGACTACCCC TTCTACGCGC      1140TCACTGAGAC GATCAACGGC TCCGGGCCGA ATCAGCGCGG CAAGTACAAG TCTGCGTACA      1200TGATCAAGGA TTTCCCGGAT TTCCAGATCG ACGTGATCTG GAAATACCTT ACGGAGGTCC      1260CGGACGGCTT GACTAGTGCC GAAATGAAGG ATGCCTTACT CCAGGTGGAC ATGTTTGGTG      1320GTGAGATTCA CAAGGTGGTC TGGGATGCGA CGGCAGTCGC GCAGCGCGAG TACATCATCA      1380AACTGCAGTA CCAGACATAC TGGCAGGAAG AAGACAAGGA TGCAGTGAAC CTCAAGTGGA      1440TTAGAGACTT TTACGAGGAG ATGTATGAGC CGTATGGCGG GGTTCCAGAC CCCAACACGC      1500AGGTGGAGAG TGGTAAAGGT GTGTTTGAGG GATGCTACTT CAACTACCCG GATGTGGACT      1560TGAACAACTG GAAGAACGGC AAGTATGGTG CCCTCGAACT TTACTTTTTG GGTAACCTGA      1620ACCGCCTCAT CAAGGCCAAA TGGTTGTGGG ATCCCAACGA GATCTTCACA AACAAACAGA      1680GCATCCCTAC TAAACCTCTT AAGGAGCCCA AGCAGACGAA ATAGTAGGTC ACAATTAGTC      1740ATCGACTGAA GTGCAGCACT TGTCGGATAC GGCGTGATGG TTGCTTTTTA TAAACTTGGT     1800A                                                                     1801
29.一种微生物细胞，这种细胞包含权利要求26的重组DNA分子。
30.按照权利要求29的细胞，这种细胞选自由细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞组成的组。
31.按照权利要求30的细胞，这种细胞选自由大肠杆菌细胞、乳酸细菌细胞、酿酒酵母细胞和巴斯德毕赤酵母细胞组成的组。
32.一种生产食品的方法，其中使用按照权利要求9的多肽或者按照权利要求29的微生物细胞。
33.按照权利要求32的方法，其中所说的食品选自由奶制品、含有淀粉的食品和非奶制品饮料组成的组。
34.按照权利要求32的方法，其中所说的多肽作为抗微生物剂或抗氧化剂起作用。
35.按照权利要求32的方法，其中所说的多肽在食品包装中作为去氧剂起作用。
36.一种产生动物饲料的方法，其中使用按照权利要求9的多肽或按照权利要求29的微生物细胞。
37.按照权利要求36的方法，其中所说的动物饲料是青贮饲料。
38.一种降低食品中糖含量的方法，这种方法包括向所说的产物中加入一定量的按照权利要求9的多肽或权利要求29的微生物细胞，所加入的量足以除去至少部分原来存在于所说的食品中的糖。
39.一种生产选自由药物产品、化妆品和牙齿保健品组成的组中的产品的方法，其中使用了按照权利要求9的多肽或按照权利要求29的微生物细胞。
40.一种由生面团制备烘烤产品的方法，这种方法包括向所说的生面团中加入按照权利要求9的多肽或者能够表达这种多肽的按照权利要求29的微生物。
41.一种改进生面团的组合物，这种组合物包含按照权利要求9的多肽或者能够在生面团中表达这种多肽的按照权利要求29的微生物和至少一种常规的生面团组分。
42.按照权利要求41的组合物，这种组合物还包含至少一种酶，所说的酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、淀粉酶、脂酶和蛋白酶组成的组。
43.一种在样品中分析糖含量的方法，其中使用按照权利要求9的多肽或按照权利要求29的微生物细胞作为分析试剂。
44.一种使用按照权利要求9的多肽或权利要求29的微生物细胞产生内酯的方法，所说的方法包括将所说的多肽和/或所说的细菌细胞加入到含有能被此多肽氧化的碳水化合物的反应器中，并在使所说的碳水化合物氧化成内脂的条件下操作反应器。
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