TW438887B - Recombinant hexose oxidase, a method of producing the same and use of such enzyme - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^388 8 7 A7 _____ B7 五、發明説明（1 ) 發明領域 本發明提供利用重組DNA技術製造六碳糖氧化酶之方 法，利用此法製造之此等酵素和其於食品工業和其他領域 之用途。 技術背景和先前技藝 六碳糖氧化酶（D-六碳糖：〇2—氧化遨原酶，EC： 1.1.3. 5)係一種酵素，其於氧存在下可將D-葡萄糖和幾個其他通 原糖包括麥芽糖、乳糖和纖維二糖氧化成其對應之內酯， 接著水解成各個醛糖二糖酸。因此，六碳糖氧化酶與另一 個僅可轉化D-葡萄糖之氧化堪原酶（葡萄糖氧化酶）之不 同在於此酵素可利用較寬廣範圍之糖受質。由六碳糖氧化 酶催化的氧化反應可例示如下： D-葡萄糖+ 〇2 ——> S葡萄糖酸內酯+ h2〇2，或 D-半乳糖+ 〇2 ---> 7 半乳糖酸内酯+ Hs〇2 迄今，六碳糖氧化酶（下文中亦以Η〇χ稱之）係從幾 種紅藻品種例如£l^_cidum (Bean and Hassid , 1956)和角叉菜cnirpur) (Sullivan et al. 1973)分離其酵素而提供。此外，藤類Euthor^ eri -也被證實可製造六碳糖氧化酶。 據報導，從這些天然來源分離的六碳糖氧化酶於一些 3 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS )八4規格（21〇><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局負工消費合作社印製 438887 A7 ____B7 五、發明説明（2 ) 食品之製造上具有潛在的用途。得自Iridoohy^iif, g-LcLum.之六碳糖氧化酶被證實可將牛乳中的乳糖轉化而製 造對應之醛糖二糖酸且被證實具有作為牛乳酸化劑之潛在 性，例如，去取代欲達到該項目的之酸化用微生物培養液 (Rand，1972)。就該觀點而言，六碳糖氧化酶被認為是 比葡萄糖氧化酶更令人感興趣之酵素，因為後者只可於牛 乳或不含葡萄糖而伴隨加入葡萄糖之食品中被利用，或， 於乳製品之情形下，伴隨加入分解乳糖的酵素乳糖酶，因 而將乳糖分解成葡萄糖和半乳糖。即使Μ此方法使葡萄糖 成為葡萄糖氧化酶可用的受質，也顯然只有50%乳糖酶終 產物可作為葡萄糖氧化酶的受質用，因此葡萄糖氧化酶不 是天然牛乳或乳製品之有效酸化劑。 氧的氧化遨原酶之能力（包括六碳糖氧化酶之產生過 氧化氫，其具有抗微生物效果）已被用於改善一些食品例 如乾賂、奶油和果汁的貯存安定性，如JP-B-73/016612所 揭示。也有業者建議氧化遨原酶作為食品的氧清除劑或抗 氧化劑之潛在用途。 在烘焙和製粉工業上，一般已知道使用氧化劑（例如 碘酸鹽、過氧化物、抗壞血酸、Κ-溴酸鹽或偶氮甲醯胺） 來改善麵粉的烘焙性能而達成具有改良伸張力因而具所需 強度和安定性之麵糰。氧化劑此等效果背後的機制為麵粉 蛋白質（例如小麥麵粉中的麵筋）含有硫醇基，於被氧化 時，產生二硫化物鍵結，使蛋白質形成更穩定的基質，造 成更佳之麵糰品質和烘焙產品容積與麵包心結構之改善。 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4388 8 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______ B7五、發明説明（3 ) 然而，目前可用的幾個氧化劑之此等用途為消費者所 反對或不為管理團體所容許，因此，業者試圖尋找這些習 用麵粉和麵糰添加劑之替代品。先前技藝曾建議使用葡萄 糖氧化酶以達上述目的。US 2,783,150揭示於麵粉中加入 葡萄糖氧化酶以改善麵糰的流變特性。CA 2,012,723揭示 含有纖維分解酵素和葡萄糖氧化酶之麵包改良劑，及JP-A -084848建議使用含有葡萄糖氧化酶和脂肪酶的麵包改良 組成物。 然而，使用葡萄糖氧化酶作為麵糰和麵粉改良添加劑 有其限制，因為此酵素欲於麵糰糸中有效蓮用，需要作為 受質的葡萄糖之存在，而通常穀類麵粉中葡萄糖的含量很 低。例如，小麥麵粉葡萄糖含量在0-0.4%w/w之範圍內， 亦即，麵粉可能不含任何葡萄糖。因此，麵糰中低含量或 不含葡萄糖可能成為使用葡萄糖氧化酶作為麵糰改良劑之 限制因素。對照之下，新鮮製備的麵糰中已有的麥芽糖含 童明顯地高些，而且，由於麵粉中本來就存在或曾加入之 /3 -澱粉酶的活性而於麵糰中產生更多麥芽糖。 六碳糖氧化酶目前的來源為從上述天然存在的海藻品 種萃取分離之部分純化或粗酵素製劑。然而，由於藻類中 六碳糖氧化酶的含量很低，Μ此方法製造酵素，欲保證從 這些天然資源中Μ有效成本來商業製造，顯然太乏味和浪 費。此外，Μ此方法尚無法達到Μ有效成本製備夠純之酵 素產品。 因此對此工業上有價之酵素提供替代品和更有效成本 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐) ~ ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % 、-口

438887 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（々） 之來源而不依賴天然來源，和提供純型之酵素，亦即沒有 任何污染的酵素活性、或任何其他不良的污染物質包括不 良的藻類色素和可能存在於製造六碳糖氧化酶的藻類生長 的海洋區域中之環境污染物，於工業上存在著相當大的需 求。 此外，足夠量食品級六碳糖氧化酶之工業可用性和有 效成本價格，無疑地為該酵素不僅於食品工業上，也於下 文中將討論的其他工業領域中，打開新的用途。於食品工 業上，重組六碳糖氧化酶之新穎用途之一實例為使用其作 為麵糰改良劑，另一實例為具六碳糖氧化酶活性之多肽之 利用，或於製造内酯化合物時產生多肽之重組物之利用。 發明簡要 本發明已，利用重組DNA技術之使用，第一次得以以 工業上適當之量及品質和純度，提供具六碳糖氧化酶活性 之多肽，使根據本發明之具六碳糖氧化酶活性多肽極適合 任何相關之工業目的，包括食品和藥學組成物之製造。 因此，本發明第一個觀點係有關具有六碳糖氧化酶活 性的多肽之製法，其包括分離或合成指令生合成該多肽之 DNA片段，將所述DNA片段引入適當宿主生物中，於其中 DNA Η段與該DNA >={段之適當表琨信號结合，於引導表現 具六碳糖氧化酶活性多肽之條件下培養宿主生物，和從培 養基或宿主生物中回收多肽。 於進一步之觀點中，本發明係有關具六碳糖氧化酶活 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

43 88 8 7 A7 B7 五、發明説明（5 ) 性之分離型多肽，其含有至少一種選自下列之胺基酸序列 ⑴

Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro, (ii) Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser, (iii) Asp-Leu-Pr〇-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe, (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr, (v)

Tyr-Tyr-Phe-Lys, (vi) Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp# (vii) Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp, (viii) X-lie-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met, 賴 —-----------訂-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其中X 代表選自 Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gin、' Glu、 Glx、 Gly、 His、 lie、 Leu、 Lys、 Met、 Phe、 Pro、 Ser、Thr、Trp、Tyr 和 Val 之胺基酸， 及其變異蛋白質和變體。 本發明之又一^觀點係有關重組之DNA分子，其含有指 令生合成具六碳糖氧化酶活性多肽之DNA片段，和有關含 此等重組DNA分子之微生物細胞。 於其他觀點中，本發明係有關使用上面具六碳糖氧化 酶活性多肽或表現此等多肽之微生物細胞製造食品或動物 7

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 438887 A7 _ B7 五、發明説明（6 ) 飼料及製造藥學組成物、化粧品或護牙產品之用途。 於其他有用觀點中，係提供減少食品糖含童之方法， 包括於食品中添加足夠量之如上文所揭示之多肽或微生物 細胞，以除去最初存在所述食品中之至少部分糖；從麵糰 製備烘焙產品之方法，包括於麵糰中加入具六碳糖氧化酶 活性多肽或表現此等多肽之微生物細胞；及麵糰改良組成 物，其包含根據本發明之多肽或微生物細胞及至少一個習 用麵糰成分。 於另一觀點中，本發明係有關使用根據本發明之多肽 或微生物細胞作為分析試劑Μ測定糖含量之用途。 於一有趣觀點中，本發明也提供使用根據本發明之多 肽或微生物細胞製造内酯之用途，其中多肽及/或微生物 細胞係施加於含有可被該多肽氧化的碳水化合物之反應器 中，於使碳水化合物被氧化之條件下操作反應器。 詳細說明 六碳糖氧化酶為幾種海洋藻類品種所天然生產。此等 品種係屬於杉藻目(Gigartixmles)之杉藻科(GiKarfci-naeeae)。屬於杉藻科生產六碳糖氧化酶之海藻品種實例 為角叉菜未□ Tr idophvcus f LsLCC.idum〇 隱鞭藻目(Cr.YPtQ^ men ia les)包括Euthorsi cr_I_siaL±^L品種之藻類也為根據本 發明具六碳糖氧化酶活性多肽之潛在來源。因此，此等藻 類品種為六碳糖氧化酶和指令生合成此等六碳糖氧化酶活 性多肽的DNA之潛在有用來源。本文中所用”六碳糖氧化酶 8 --——__________________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟、部中央榡準局員工消費合作衽印製 438887 A7 B7五、發明説明（7 ) 活性多肽” 一詞代表至少可氧化D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖之酵素。 當使用此等天然來源作天然六碳糖氧化酶之分離時， 如先前技藝和本發明為達鑑定可作為用於構築cDNA的mRNA 來源和作為合成DNA寡核苷酸構築引子之起始位置用之藻 類物質的目的所做，使用水性萃取介質，Μ萃取法從藻類 起始物質中典型地將酵素分離。 作為此等萃取之起始物質，藻類可圼從其生長的海洋 區域收獲時之新鮮狀態使用，或於將葉狀體乾燥後使用， 乾燥所用之法例如於室溫之風乾法，或任何適當之工業乾 燥法例如於循環加熱空氣中之乾燥法或冷凍乾燥法。為了 有助於接下來的萃取步驟，可將新鮮或經乾燥之起始物質 磨碎，例如用研磨法或摻合法。 水性萃取介質，ΜΡΗ在6 - 8範圍内之媛衝溶液，例如 0.1 Μ鱗酸鈉緩衝液、20 mM三乙酵胺緩衝液或20 mM Tris - HC1緩衝液為適當。典型的從藻類物質萃取六碳糖氧化酶 之法係將起始物質懸浮於媛衝液中，較佳為於攬動下將懸 浮液保持於0-20°C範圍之溫度（例如於約5TO 1至10天。 然後利用適當分雛法，例如過濾、過篩或離心法，將 懸浮的藻類物質與水性介質分離，接著從濾液或上澄液中 回收六碳糖氧化酶。視需要地，將經分離之藻類物質進行 一或多個進一步之萃取步驟。 由於有幾種海藻含有例如藻籃蛋白之有色色素，因此 可能需要對濾液或上澄液進行進一步的純化Μ去除這些色 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 訂

經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 ^ 438887 A7 __ _ B7 五、發明説明（8 ) 素。舉例而言，將濾液或上澄液以色素可溶解之有機溶劑 處理，接著從水性介質中將含有已溶色素之溶劑分離，即 可去除色素。 從水性翠取介質中回收六碳糖氧化酶時，可利用容許 從水性介質中分離蛋白質之任何適當習知方法予Μ進行。 此等方法（其實例將於下文中詳述）包括雛子交換層析法 ，視需要隨後為濃縮步驟例如超滤法。也可利用加入引起 蛋白質沉澱的物質例如（NH4)2SCU,接著將沉澱分雛和視 需要對其進行令蛋白質溶解的條件，以回收酵素。 為了本發明之目的，一般希望提供實質上純型之酵素 ，例如主要為不含其他蛋白質或非蛋白質污染物之製劑， 因此，從上面萃取和分雛步驟所得相當粗製的酵素製劑較 佳為進行進一步的純化，例如進一步的層析步驟、凝膠過 濾法或將於下文中以實例敘述之色譜聚焦法（chromato -focusing) 〇 如上文所述，根據本發明之六碳糖氧化酶活性多肽係 利用重組DNA技術而提供，利用於培養基中培養含有指令 生合成六碳糖氧化酶基因之宿主生物，並從细胞及/或培 養基中回收酵素而製得。

本文所提供六碳糖氧化酶製法之第一步為分雛或構築 指令生合成六碳糖氧化酶之DNA片段。提供此等DNA片段有 許多方法可用。因此，DNA片段本身可從天然產生六碳糖 氧化酶的生物中分雛。為了鑑定指令DNA Η段的位置，需 要排列RNA或DNA探針序列（其於適當條件下會與所尋DNA 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 438887 A7 ____B7 五、發明説明（9 ) 片段雜交），然後將含有指令生合成序列之DNA片段分離 並將其轉殖至適當的轉殖載體中。 另一個將於下面實例中詳细揭示之適當方法為從產生 六碳糖氧化酶的生物中分離mRNA,使用此等mRNA為起點構 築cDNA基因庫，然後可用其進行聚合酶連鎖反應（PCR), 利用K六碳糖氧化酶胺基酸序列為基底合成的寡核苷酸引 子為基底，進行DNA之合成。頃發現此等方法對於指令產 生六碳糖氧化酶之DNA片段之提供很適當。在此僅將於下 文將詳细敘述之此等方法作為實例簡要述之。 合成寡核苷酸係Μ如下文所述製備之HOX-2和HOX-3多 肽序列為基底，利用從角叉菜華取的六碳糖氧化酶之40kD 多肽之endoLys-C水解作用予Μ製備。PCR使用第一股cDNA 為模板，並Μ意義HOX - 2引子和反義HOX - 3引子製造具有 407 bp之DNA片段。將此片段插入大腸桿菌載體（pT7 Blue )中，然後予Μ定序。頃發現除了 H0X-2和HOX-3多肽的序 列外，此407 bpM段尚含有含上面從角叉菜得到的40 kD 六碳糖氧化酶片段的Η0Χ-4和H0X-5多肽之譯謓架，其分離 也將於下文中敘述。 M407 bp片段為基底合成意義和反義寡核苷酸，然後 可利用PCR (McDNA為模板）分別分離出800和1400bp兩個 片段。將此二片段轉殖到PT7 Blue載體中，然後予Μ定序 。5’端片段之DNA序列顯示含Η0Χ-6多肽（也從上面角叉菜 得到的40 kD六碳糖氧化酶片段分離出）之譯謓架。同樣 地，3’端Η段顯示含Η0Χ-1 (其分離揭示於下）和Η0Χ - 7 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 r 438887 A7 ____ B7 五、發明説明（1〇） 與H0X-8之譯讀架，HOX-7與H0X_8二者均可利用endoLys-C 水解作用從角叉菜得到的29 kD六碳糖氧化酶多肽分離出 (也將於下文中敘述）。 Μ上面提及的組合DNA序列為基底，合成對應於推測 ΗΟΧ基因5’端之寡核苷酸和對應於該基因3’端之寡核苷酸。 於PCR中使用此二寡核登酸，以第一股cDNA為模板，產生 約1.8 kb之DNA Η段。將此片段轉殖於上面大腸桿菌載體 中並予以定序。其DNA序列與上面5 f端、407 bp和3’端組 合序列相同，因而推論此約1.8 kb DNA序列指令產生從角 叉菜得到的40 kD和29 kD六碳糖氧化酶片段。 上面用於分離指令生合成六碳糖氧化酶活性多肽DNA 片段之方法，包括六碳糖氧化酶的分離和鑑定，可用於構 築除了角叉菜Μ外，得自任何其他天然來源包括上面提及 的海洋藻類品種，及其他作物或得自微生物之指令生合成 六碳糖氧化酶之此等片段，對熟悉此項技藝者而言，這是 很顯然的。 替代地，指令生合成六碳糖氧化酶活性多肽的DNA片 段之DNA序列可利用已建立之標準方法予以合成和構築， 例如Beaucage和Caruthers (1981)戶/f述之磷醯B安法.或 Mattes等（1984)所述之法。根據磷醯胺法，合成寡核苷 酸（例如於自動DNA合成器中）、純化、徐冷、連結並轉 殖於適當載體中。 此外，DNA片段可為基因組與合成組混合、合成組與 cDNA混合或基因組與cDNA來源混合，根據標準技術，將合 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4388 8 7 A7 _B7 _五、發明説明（11 ) 成、基因組或適當cDNA來源之副片段（副片段與整個DNA 片段之各部分對應）連結予以製備。 於根據本發明方法接下來的步驟中，將分離或合成之 六碳糖氧化酶活性多肽指令生合成DNA片段引入適當宿主 生物中，其中DNA片段與該DNA片段之適當表現信號可運作 地結合。此等引入作用可利用熟悉此項技藝者悉知之法進 行之，包括構築具有插入片段之載體和將此載體轉形至宿 主生物中。適當載體包括於選定宿主生物中具有複製能力 之質體。一般也認為DNA片段可整合入宿主生物染色體中 ，例如將片段插入轉位因子（例如轉位子）中，使選定宿 主生物和轉位子之混合物處於轉因子整合入宿主生物染色 體並與適當表規信號結合之情況中。 根據本發明，利用上述方法或技藝中任何替代方法製 造之六碳糖氧化酶活性多肽指令生合成DNA片段（包括該 多肽之基因），可使用表現載體圼酵素活性型表現之。表 現載體通常包括典型轉殖載體成分，亦即容許該載體於選 定宿主生物中自主複製之單元，及達選定目的之一或多個 表現型標記。表現載體包括指令生合成啟動子、操縱子、 核糖體結合部位、轉譯起始信號和視需要地，抑制子基因 或一或多個活化子基因之控制序列。為了容許表現多肽之 分泌，可於基因指令生合成序列之上游插入信號序列。於 本文中，”表現信號”一詞包括上述任何控制序列、抑制子 或活化子序列和信號序列。欲達到在控制序列指定下之表 現，將六碳糖氧化酶指令生合成基因以適當方式可運作地 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-訂

經濟部中央榡準局員工消費合作、社印製 ^ 438887 A7 B7 五、發明説明（12 ) 連接於與表琨相關之控制序列。可併入質體載體中且可支 撐六碳糖氧化酶基因的轉錄之啟動子序列包括，惟不限於 ,tac啟動子、嗤菌體λ得到之啟動子包括P jDPr啟動子。 帶有本發明DNA片段之表現載體可為於選定宿主生物 中具有表現六碳糖氧化酶基因能力之任何載體，此載體之 選擇視其被引入之宿主细胞而定。因此，載體可為自主複 製載體，亦即，K染色體外實體存在、其複製與染色體複 製無關之載體，例如質體、噬菌體或染色體外單元、迷你 染色體或人工染色體。替代地，載體可為被引入宿主细胞 後，整合入宿主細胞基因體中，與染色體一起複製者。 於載體中，指令生合成六碳糖氧化酶活性多肽之DNA 片段須可蓮作地與適當啟動子序列結合。啟動子可為將轉 錄活性給予所選宿主生物之任何DNA序列，其可得自與宿 主生物同源或異源之指令產生蛋白質基因。於细菌宿主中 ，引導本發明DNA片段轉錄之適當啟動子為大腸桿菌之乳 糖操縱基因群啟動子、天藍色鏈撇菌瓊脂酶基因dagA啟動 子、地衣芽孢桿菌oc-澱粉酶基因（amyL)啟動子、嗜熱 脂肪芽孢桿菌麥芽糖生成澱粉酶基因（amyM)啟動子、解 殿粉芽孢桿菌oc-濺粉酶基因（amyQ)啟動子、枯草稈菌 xy 1A與xy 1B基因啟動子。 轉錄於真菌菌種中時，有用的啟動子實例為得自指令 產生巴斯德畢赤酵扭（Piohh MFvfcoris)醇氧化酶、米麴 撇菌TAKA搬粉酶、密黑根黏菌(Rh i zomucor miehe i )天冬 胺酸蛋白酶、黑麴黴菌中性cx-澱粉酶、黑麴撇菌酸性穩 14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4 3 88 8 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ B7五、發明説明（13 ) 定OC-澱粉酶、黑麴黴菌葡萄糖澱粉酶、密黑根黏菌脂肪 酶、米麴撇菌鹼性蛋白酶、米麴撇菌磷酸丙糖異構酶或構 巢麴徽乙醯胺酶之諸基因。於酵母菌種中表現之適當啟動 子實例可提及的為酿酒酵母（Saccharomyces cerev is iae )之Gal 1和Gal 10啟動子。於细菌菌種例如大腸桿菌中 表現時，適當啟動子可選自包括T7啟動子或入噬菌體啟動 子之嗤菌體啟動子。 含有指令產生六碳糖氧化酶活性多肽DNA片段之載體 也可含有選定的標記，例如其產物與宿主生物的缺陷（例 如給予需特別生長因子表現型之突變）互補之基因，或可 為具抗生素耐性或對重金屬離子具耐性之標記。 如上文所述含有DNA構築體或表現載體之本發明宿主 生物，於根據本發明之多肽重組製造中有利地作為宿主細 胞用。其细胞可用含指令產生本發明多肽的基因之DNA構 築體轉形，或方便地將DNA構築體整合入宿主染色體中。 由於DNA構築體好像更為穗定地維持於細胞中，因此此等 整合作用一般認為是有利的。DNA構築體進入宿主染色體 之整合作用可根據習知方法，例如同源或異源重組法或利 用轉位因子予以進行。替代地，宿主生物可用如上述之表 現載體予Μ轉形。 根據本發明，宿主生物可為高等生物之纟田胞，例如敷1 物细胞包括哺乳動物、鳥類或昆蟲细胞、或植物細胞。然 而，於較佳具體實例中，宿主生物為微生物细胞，例如細 菌或真菌细胞包括酵母細胞。 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇X 297公釐）

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 438887 A7 B7 五、發明説明（u) 適當細菌宿主生物為革蘭氐陽性細菌菌株例如芽孢桿 菌科包括枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、遲媛芽孢桿菌、短芽 孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢 桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、Bac.il 1Π5. lautus. 巨大芽抱桿菌和蘇力菌(Bacillus thur i ng lens is)、鍵 撇菌屬菌株例如鼠灰鏈撇菌、乳酸菌菌種包括乳球菌屬例 如乳酸球菌、乳桿菌屬包括Lactobacillus reuter i、白 念球菌屬和鏈球菌靥。替代地，革蘭氏陰性细菌菌株例如 屬於腸细菌科（包括大腸桿菌）或假單胞菌科之菌株也可 被選為宿主生物。 酵母宿主生物可有利地選自酵母菌靥（包括釀酒酵母 )之菌株或屬於裂殖酵母菌屬之菌株。絲狀真菌中之適當 宿主生物包括麴撇菌屬之菌株，例如米麴撇菌、構巢麴撇 菌或黑麴撇菌。替代地，鐮孢菌屬菌株例如尖鐮孢菌或根 黏菌菌株例如密黑根黏菌可作為宿主生物用。於一較佳具 體實例中，使用巴斯德畢赤酵母菌株為宿主生物。 有些上述有用宿主生物例如真菌菌株或革蘭氐陽性细 菌菌株可予Μ轉形，其方法包括原生質體形成，及將原生 質體轉形後，Μ本身已知之法使細胞壁再生。 欲製造六碳糖氧化酶活性多肽，將如上述之重組宿主 生物細胞於導引多肽以可回復型表現之條件下培養之。用 於培養此等细胞之培養基可為適於所論宿主生物生長且得 到多肽表現之任何習用培養基。適當培養基為市售可得或 可根據已發表的配方予Μ製備。 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I»—. .‘ , L·— i^n j 1 = ϋϋ ϋϋ-ί-rt mu m —ϋ 1.^1 ϋ.— In I I. a am n · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 438887 A7 _B7 五、發明説明（15 ) 將生成的多肽典型地利用習知方法從培養基中回收， 其方法包括Μ雛心或過滤法從培養基中將細胞分離，如果 需要，則於使细胞破裂後，舉例而言利用加入鹽（例如硫 酸銨）使上澄液或滤液中的蛋白質成分沉澱下來，接著進 行純化步驟。 微生物培養液，舉例而言如製造食品或飼料所用細菌 培養液，可作為表現指令生合成六碳糖氧化酶活性多肽的 宿主生物用，為本發明於工業上方便之觀點。因此，製造 乳製品或其他食品（例如肉製品或酒）所用之乳酸菌菌酉元 (其含有選自上述任何乳酸菌菌種之一或多種乳酸菌菌株 ),可作為宿主生物用，而六碳糖氧化酶於加入菌_之食 品中直接產生。 同樣地，根據本發明之六碳糖氧化酶指令生合成基因 可引入至乳酸菌菌gi中，作為加到飼料作物例如青草、玉 米或動物來源蛋白質廢棄物（例如製造動物飼料的青貯料 用之魚和屠宰場廢棄物）之接種體用。就此目的而言，六 碳糖氧化酶為青貯料接種體所表現，意味著最初存在作物 或待蜜藏廢棄物中之氧已耗盡，而建立起抑制好氣性腐敗 生物（例如革蘭氏陰性細菌和酵母）生長之嫌氣性條件。 一般也認為酵母培養液，例如麵包酵母或製造包括酒 和啤酒的酒精飲料用之酵母培養液，可作為指令生合成本 發明六碳糖氧化酶活性多狀的基因之宿主生物用。舉例而 言，於重組麵包酵母菌株之情形下，所產生之六碳糖氧化 酶具有改善麵糰的效果，如下文中所述。 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 438887 A7 ___B7 五、發明説明（16 ) 從上文中明顯地看出，將根據本發明表現六碳糖氧化 酶之重組微生物培養液直接加到需要六碳糖氧化酶活性之 食品或任何其他產品中，可作為添加分離酵素之代替品用 Ο 於工業上重要之進一步具體實例中，表現六碳糖氧化 酶活性多肽之重組微生物培養液係於生物反應器中使用， 以製造酵素或從上面提及可被六碳糖氧化酶活性酵素氧化 的任一種碳水化合物製造內酯。於後一用途中，微生物培 養液之細胞有利地固定於固體支撐物（例如聚合物材質） 上，該支撐物較佳為呈小粒子型Μ提供結合細胞之較大表 面。替代地，分雛酵素可用於上項目的，較佳為也結合於 固體支撐材質。有關細胞或酵素之此等結合，可Μ適合此 目的之任何習知方法提供之。 於本發明其他有用具體實例中，具六碳糖氧化酶活性 之多肽可為融合產物，亦即除了六碳糖氧化酶活性胺基酸 序列外，進一步地含有具其他有用活性的胺基酸序列之多 肽。因此，除了六碳糖氧化酶活性外具有一或多種酵素之 融合多肽也被考盧在内。此等附加之酵素活性可從具有分 解碳水化合物能力之酵素例如乳糖酶、澱粉酶包括葡萄糖 澱粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶、半木纖維質酶、木聚糖酶 、乳糖酶或任何其他氧化遨原酶例如葡萄糖氧化酶、半乳 糖氧化酶或啦喃糖氧化酶，Μ及從蛋白酶和胜肽酶、脂肪 酶或核酸酶中選出。被選擇整合入根據本發明六碳糖氧化 酶多肽中之附加酵素序列視該酵素活性融合產物意指之產

家一^ 二--J (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

ΔΊ^837 Α7 Β7 五、發明説明（17 ) 物而定。因此，擧例而言，一般認為製造乳製品用之六碳 糖氧化酶活性融合多肽有利地含有乳糖酶、蛋白酶或胜肽 酶，意欲作麵權改良之融合多肽可為含有任何上述碳水化 合物分解酵素之融合搭檔。顯然，如上述根據本發明且表 琨具有附加酵素活性之六碳糖氧化酶活性多肽之微生物細 胞，也可Μ如上述之方法接種到其他食品和動物飼料中。 一般也認為適當融合搭檔可為賜予六碳糖氧化酶改變 特性（例如溶解度）之序列，或可作為”加籤條”基團用， 賜予六碳糖氧化酶與特定固體材質結合更為強固或更具選 擇性Μ達六碳糖氧化酶多肽純化或固定目的之序列。 此外，在本發明範圍內提供嵌合型產物之多肽，其含 有得自不同來源之六碳糖氧化酶活性多肽之部分序列，且 被由結合得自這些不同來源之六碳糖氧化酶活性多肽指令 生合成DNA序列入指令生合成整個嵌合型多肽之一DNAH段 所構築之DNA片段指令生合成。 於一有用具體實例中，根據本發明之方法為其中指令 生合成六碳糖氧化酶活性多肽之DNA Η段含有至少一種指 令產生選自下列胺基酸序列之DNA序列： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 經濟部中央榡隼局員工消費合作社印製 ml ml —Βϋ nn -m mu i·^— mu nn

V ⑴

Tyr-Glu-Prο-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro, (ii) Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser, (iii) Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-lie-Ala - Ser-Asn-

Leu-X-Phe, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 19 4 3 88 8 7 A7 B7 五、發明説明（18 (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr, (v)

Tyr-Tyr-Phe-Lys, (vi) Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp, (vii) Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp, m 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (viii) X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met, 其中X 代表選自 Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、\l Glu、 Glx、 Gly、 His、 lie、 Leu、 Lys、 Met、 Phe、 Pro Ser、Thr、Trp、Tyr 和 Val 之胺基酸， 及其變異蛋白質和變體。 本文中，”變體”一詞用來代表不會造成六碳糖氧化酶 活性完全喪失之六碳糖氧化酶活性多肽序列之任何改變。 其改變可包括存在於得自天然來源的多肽或已更改的多肽 序列中的胺基酸基團之缺失、取代，或意指於此等多肽中 插入附加之胺基酸基團。一或多個胺基酸基團之取代作用 可利用修飾或取代指令產生希望取代之一或多個胺基酸之 一或多個密碼子予Μ進行，例如使用本身為已知方法之誘 變作用，特別是位置取向之誘變作用。同樣地，一或多個 胺基酸基團之缺失可利用使指令產生根據本發明多肽之DNA 片段中對應的一或多個密碼子缺失進行之。 上面也提及，根據本發明方法可於進一步之步驟中包 括最初從培養基及/或微生物回收之多肽製劑之純化。此 進一步步驟之目的在得到其中六碳糖氧化酶多肽實質上呈 20

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 438887 A7 B7 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 五、發明説明（19 ) 純型之酵素製劑。”實質上純型”一詞意指製劑中不含任何 不希望之源自培養基、生產宿主生物綑胞或培養期間由這 些細胞產生的物質之污染物質。因此，對許多用途而言， 頗具重要性的為從純化步驟得到的多肽製劑實質上不含任 何非六碳糖氧化酶活性。純化方法視希望的純化程度而定 ，惟典型地可選自習知蛋白質純化法例如鹽析、親和力或 離子交換層析法包括疏水性交互作用層析法、和凝膠過滤 法，例如下面實例中所述之法。 如上所述，本發明之進一步觀點係有關圼分雛型之具 六碳糖氧化酶活性之多肽，其含有至少一個上面胺基酸序 列，或其變異蛋白質及變體（如上所述）。較佳為，此多 肽係根據如上述之法予以製造。 視製造方法而定（特別是所論宿主生物），根據本發 明之多肽可被糖有1化成不同程度，或可為了某些目的被有 利地圼實質上非糖苷化型式來表現。 於本發明之一較佳具體實例中，多肽具有與於先前技 藝所述藻類品種角叉菜中天然存在之六碳糖氧化酶相同或 部分相同之功能特性。業者發現從藻類來源萃取之此等六 碳糖氧化酶施用於如本文所述之SDS-PAGE時，具有29、40 及/或60 kD之分雛蛋白質帶。 為了得到多肽之一般有效成本用途，較佳為此酵素於 寬廣的pH範圍內具有高的酵素活性。因此，根據本發明之 六碳糖氧化酶較佳為至少於1-9之pH範圍内（例如於2-9之 範圍內，包括5-9之範圍內）具有酵素活性。有關於此， 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .1%------ 1T------：

^ Ο Ο Ο Ο I ^ Ο Ο Ο Ο I 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 Α7 Β7___ 五、發明説明（2〇） 一般認為活性之pH範圍或天然得到的六碳糖氧化酶之最適 pH,可利用如上述修飾酵素之法依所需方向修飾至需要的 程度，或利用複製子或含有指令產生六碳糖氧化酶的DNA 之宿主生物之隨機誘變作用，隨後選擇具所需更改pH特性 之突變體。替代地，酵素之此等修飾作用可力求修改六碳 糖氧化酶活性多肽的活性之耐熱性和最適溫度，或改變酵 素之等電點。 此外，根據本發明多肽較佳為於寬廣溫度範圍内（例 如10_90°C之範圍內，如15-80°C之範圍，包括20-60°C之 範圍）具酵素活性。特別是，為了某些特定目的，較佳為 六碳糖氧化酶活性多肽於70°C或更高之溫度時，維持意義 重大之殘留酵素活性，例如酵素意欲作麵糰用途時，至少 於接下來之部分烘焙步驟中具有六碳糖氧化酶活性，可能 有用。 六碳糖氧化酶之應用範圍視其可作為受質用的碳水化 合物之範圍而定。雖然六碳糖氧化酶似乎對六碳糖（例如 葡萄糖、半乳糖和甘露糖）具有最高之受質特異性，頃發 現根據本發明多肽可作為受質用之碳水化合物範圍並不限 定於六碳糖。因此，較佳之多肽為除了對六碳糖具高度特 異性外，對其他碳水化合物包括雙釀類例如乳糖、麥芽糖 及/或纖維二糖也具高度特異性，甚至對五碳糖包括例如 木糖、或去氧五碳糖或去氧六碳糖例如鼠李糖或岩藻糖也 具實質特異性。六碳糖氧化酶除了對六碳糖和其他單醣之 高度特異性外，對雙醣也具實質特異性之事實具有意義重 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X^97公釐） 獻 ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 4388 8 7 A7 —___B7 五、發明説明（21 ) 大之實用含意，特別是存在牛乳中的乳糖和麥芽糖（其通 常存在於穀物粉末和麵糰中）。 因此，於另一較佳具體實例中，根據本發明多肽為除 了 D-葡萄糖外，氧化選自包括D-半乳糖、麥芽糖、纖維二 糖、乳糖、D-甘露糖、D-岩藻糖和D_木糖之至少一種糖者 Ο 於又一較佳具體實例中，六碳糖氧化酶活性多肽具有 在4-5範圍内之等電點。明確地說，多肽較佳為具有4.3 土 0.1或4.5土 CK 1之等電點。 一般而言，根據本發明之多肽典型地具有使用篩分丙 嫌基S - 200 Superfine (Pharmacia產品）Μ凝膠過漉法 測定之於100-150 kD範圍內之分子量。以此等或同等方法 測定之分子量也稱之為表觀分子量。明確地說，多肽具有 110 kD ± 10 kD之表觀分子量。 於另一觀點中，本發明提供含有指令生合成具有六碳 糖氧化酶活性多肽的DNA片段之重組DNA分子。如上面已述 ，此等DNA片段可從天然來源分離，或可如下面實例所詳 述予Μ構築。此外，此指令產生Η段也可根據原態六碳糖 氧化酶之胺基酸序列合成之。重組分子可選自如上面提及 之任何表現載體型。於較佳具體實例中，重組DNA分子含 有指令產生六碳糖氧化酶多肽之DNA片段，其中多肽含有 上面胺基酸序列（i)至（viii)之至少一種，或此等多肽之 變異蛋白質或衍生物。於一特定具體實例中，重組DNA分 子含有下面DNA序列： 23 1^^度適用中國國家標準（€灿）八4規格（210父297公釐） ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

438887 A7 B7 五、發明説明（22 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTCTG GTACCGTGTA TGTCAAAGGT 60 TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACGATGGCTA CTCTTCCTCA GAAAGACCCC GGTTATATTG 120 TAATTGATGT CAACGCGGGC ACCGCGGACA AGCCGGACCC ACGTCTCCCC TCCATGAAGC 180 AGGGCTTCAA CCGCCGCTGG ATTGGAACTA ATATCGATTT CGTTTATGTC GTGTACACTC 240 CTCAAGGTGC TTGTACTGCA CTTGACCGTG CTATGGAAAA GTGTTCTCCC GGTACAGTCA 300 GGATCGTCTC TGGCGGCCAT TGCTACGAGG ACTTCGTATT TGACGAATGC GTCAAGGCCA 360 TCATCAACGT CACTGGTCTC GTTGAGAGTG GTTATGACGA CGATAGGGGT TACTTCGTCA 420 GCAGTGGAGA TACAAATTGG GGCTCCTTCA AGACCTTGTT CAGAGACCAC GGAAGAGTTC 480 TTCCCGGGGG TTCCTGCTAC TCCGTCGGCC TCGGTGGCCA CATTGTCGGC GGAGGTGACG 540 GCATTTTGGC CCGCTTGCAT GGCCTCCCCG TCGATTGGCT CAGCGGCGTG GAGGTCGTCG 600 TTAAGCCAGT CCTCACCGAA GACTCGGTAC TCAAGTATGT GCACAAAGAT TCCGAAGGCA 660 ACGACGGGGA GCTCTTTTGG GCACACACAG GTGGCGGTGG CGGAAACTTT GGAATCATCA 720 CCAAATACTA CTTCAAGGAT TTGCCCATGT CTCCACGGGG CGTCATCGCA TCAAATTTAC 780 ACTTCAGCTG GGACGGTTTC ACGAGAGATG CCTTGCAGGA TTTGTTGACA AAGTACTTCA 840 AACTTGCCAG ATGTGATTGG AAGAATACGG TTGGCAAGTT TCAAATCTTC CATCAGGCAG 900 CGGAAGAGTT TGTCATGTAC TTGTATACAT CCTACTCGAA CGACGCCGAG CGCGAAGTTG 960 CCCAAGACCG TCACTATCAT TTGGAGGCTG ACATAGAACA GATCTACAAA ACATGCGAGC 1020 CCACCAAAGC GCTTGGCGGG CATGCTGGGT GGGCGCCGTT CCCCGTGCGG CCGCGCAAGA ioab GGCACACATC CAAGACGTCG TATATGCATG ACGAGACGAT GGACTACCCC TTCTACGCGC 一 11减 TCACTGAGAC GATCAACGGC TCCGGGCCGA ATCAGCGCGG CAAGTACAAG TCTGCGTACA 1200\ TGATCAAGGA TTTCCCGGAT TTCCAGATCG ACGTGATCTG GAAATACCTT ACGGAGGTCC 1260 CGGACGGCTT GACTAGTGCC GAAATGAAGG ATGCCTTACT CCAGGTGGAC ATGTTTGGTG 1320 GTGAGATTCA CAAGGTGGTC TGGGATGCGA CGGCAGTCGC GCAGCGCGAG TACATCATCA 1380 AACTGCAGTA CCAGACATAC TGGCAGGAAG AAGACAAGGA TGCAGTGAAC CTCAAGTGGA 1440 TTAGAGACTT TTACGAGGAG ATGTATGAGC CGTATGGCGG GGTTCCAGAC CCCAACACGC 1500 AGGTGGAGAG TGGTAAAGGT GTGTTTGAGG GATGCTACTT CAACTACCCG GATGTGGACT 1560 TGAACAACTG GAAGAACGGC AAGTATGGTG CCCTCGAACT TTACTTTTTG GGTAACCTGA 1620 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ 、1Τ

4388 8 A7 B7 五、發明説明（23

ACCGCCTCAT CAAGGCCAAA TGGTTGTGGG ATCCCAACGA GATCTTCACA AACAAACAGA GCATCCCTAC TAAACCTCTT AAGGAGCCCA AGCAGACGAA ATAGTAGGTC ACAATTAGTC ATCGACTGAA GTGCAGCACT TGTCGGATAC GGCGTGATGG TTGCTTTTTA TAAACTTGGT 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^ .；/ 此外，本發明另一方面係提供含有上面重組DNA分子 5[生物細胞。上面含有指令產生根據本發明多肽的DNA 片段之宿主生物涵蓋此等微生物细胞，因此，此等细胞可 選自上面提及之任何微生物群、科、屬和種，亦即此微生 物細胞可選自细菌細胞、真菌細胞和酵母細胞包括例如大 腸桿菌細胞、乳酸菌細胞、釀酒酵母細胞和巴斯德畢赤酵 母細胞。 根據本發明之微生物细胞，如果意欲直接加到需要具 有六碳糖氧化酶活性之產物（例如於製造過程中）時，可 圼微生物培養液型（較佳為圼濃縮液型）提供之。因此， 此等培養液可有利地含有濃度較佳為每克培養液1〇5至ΙΟ1 Σ 範圍内之根據本發明之微生物細胞。此等培養液可為新鮮 培養液，亦即細胞於液體培養基中之非凍結懸浮液，或可 呈冷凍或乾燥培養液型，例如冷凍乾燥培養液。微生物细 胞也可為了特定目的而固定於固體基質上。 如上所述，本發明之又一^進一^步觀點係有關根據本發 明之六碳糖氧化酶活性多肽或表現此等多肽之微生物細胞 於食品製造上之用途。於本文中，”製造”一詞應被瞭解為 其最廣闊的意義係涵蓋將六碳糖氧化酶或微生物細胞在任 何接下來的加工步驟之前、期間或之後、包裝期間和從成 25 1680 1740 1800 1801 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 438887 A7 ___B7 五、發明説明（4 ) 品至被消耗前之貯存期間，加到所論食品的成分中。方便 使用此等用途的食品為六碳糖氧化酶的最終產物賜予此食 品有利效果之任何產品。 當然，只有在酵素受質含量足夠時方可得到所需六碳 糖氧化酶活性。碳水化合物受質可能本來就存在食品或其 成分中，或可於製造過程中加入或產生。受質於製造過程 中產生之實例為雙-、寡-、或多醣被酵素性分解為可被六 碳糖氧化酶分解之低級糖類，此情形之發生為原來存在食 品中的酵素或製造期間加入的酵素的酵素活性之結果。此 夕卜，六碳糖氧化酶活性多肽的受質之產生，可為如上述融 合搭檔的酵素活性之結果。 含有酵素受質的產物中，六碳糖氧化酶活性之所需效 果包括從糖受質產生內酯，其可接下來被轉化為對應酸， 產生過氧化氫和消耗氧。 六碳糖氧化酶活性可能有利之典型實例包括例如乳製 品、含澱粉食品和非乳飲料。在一条列乳製品之製造中， 需要降低pH,利用以產生乳酸之菌gi接種於乳類中可方便 地達此目的。如上述，一般認為六碳糖氧化酶或表現此酵 素的生物可作為乳類酸化之替代方法。於製造過程中被酸 化之其他食品（例如一些肉製品或蔬菜製品）可能需要相 同效果，目前係利用加入乳酸菌菌酝予Μ酸化。 從六碳糖氧化酶活性產生的氧消耗相關於食品和藥學 組成物之製造有幾項有利的含意。六碳糖氧化酶由於會耗 盡或去除含脂質（易產生氧化性腐敗）的食品或藥學組成 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 3 88 8 7 A7 ________B7 五、發明説明（25 ) 物中之氧，而可作為抗氧化劑用，此外，氧含量減少可抑 制依靠氧存在而生長之腐敗性生物，因此，六碳糖氧化酶 活性多肽也可作為抗微生物劑用。 後一效果可用來延長包裝食品之商品薷命，其係利用 於食品本身併入根據本發明之六碳糖氧化酶活性多肽，或 於包裝中（與食品內容物分離）提供六碳糖氧化酶與適當 受質之混合物。於一典型實例中，此等混合物係附屬於食 品容器的内側。因此，根據本發明之六碳糖氧化酶可於食 品包裝中作為氧去除劑用。 顯然，根據本發明多肽於食品製造上之上述效果也可 應用於動物飼料之製造上。特別在從飼料作物例如青草或 玉米，或從屠宰場或魚類加工廠之蛋白質性動物廢棄物製 造青貯料時更需要這些效果。這些飼料產品目前係藉加入 酸或產生酸的細菌例如乳酸菌接種物予以窖藏。為了促進 酸化细菌的生長和預防好氣性腐敗生物例如革蘭氏陰性細 菌和酵母的生長，窖藏物質具低含氧量是很重要的。因此 一般認為根據本發明之六碳糖氧化酶可於飼料之窖藏中作 為氧去除劑和酸化劑用，視需要圼進一步含有一或多種習 知青貯料添加劑例如乳酸菌接種物或產生低分子糖類之酵 素之組成物型。 根據本發明六碳糖氧化酶多肽之進一步用途為使用酵 素來減少食品的糖含量，包括於產物中加入足夠量的多肽 或產生多肽之微生物細胞Μ去除最初存在食品中之至少部 分糖。此等用途可舉例而言用於需要低糖含量之糖尿病患 27 本度適用中國國—家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐) ^ "" (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 438887 A7 B7 五、發明説明（26 ) 者膳食之製造，以及減少醇含量的葡萄酒之製造。於後一^ 用途中，六碳糖氧化酶較佳為於酵母接種之前，加到葡萄 汁中。 本發明進一步之有用觀點係有關使用根據本發明之力 碳糖氧化酶活性多肽或產生此酵素之微生物細胞於製藥產 品、化粧品或護牙產品例如牙資或牙粉之製造。六碳糖氧 化酶於彼等產品中之所需效果主要為上述與食品和動物飼 料相關者。 根據本發明六碳糖氧化酶之一^特別有趣用途為r其作為 麵糰改良劑之用途。頃發現於麵權中加入六碳糖氧化酶， 在伸展麵糰時，使麵糰對破裂的抗力增加，亦即酵素使麵 糰的強度增加，使麵糰成為不容易受機械變形。基於有關 六碳糖氧化酶之此已知效果，一般認為於麵糰中加入根據 本發明六碳糖氧化酶之此效果為於麵粉蛋白質中含硫胺基 酸的硫醇基之間形成交聯的結果，其發生係由於麵糰中的 酵素產生的過氧化氫與硫醇基反應，使其氧化的結果。 因此，本發明也提供從麵糰製造烘焙產品之方法，包 括於麵糰中加入有效量之根據本發明之多肽或可表現此等 多肽之微生物，及有關於麵糰中含有多肽或可表現此多肽 的微生物之一種麵糰改良組成物，及至少一種習知麵禰成 分。於有用具體實例中，此等組成物可進一步地含有至少 一種麵糰或烘培產品改良酵素，例如選自纖維素酶、半纖 維素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、木聚糖酶、澱粉酶、葡萄糖 氧化酶和蛋白酶。 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央榡準局員工消費合作衽印m # 438887 A7 ____ B7 _ 五、發明説明（27 ) 於本發明之又一進一步觀點中，六碳糖氧化酶係作為 分析試劑用，Μ測定生物及其他試樣中可被該酵素轉化的 任何糖的濃度。典型地，糖含量之測定係測定從存在欲測 定試樣中的受質糖經酵素轉化產生之最終產物之童。有關 於此，一般認為六碳糖氧化酶可於活體外分析測定中直接 作為試劑用或可併於感測器中使用。 玆以下面實例和隨附之製圖對本發明加Κ詳述： 圖1為純化六碳糖氧化酶（ΗΟΧ)之概要縱覽，和得到 胺基酸序列資料所用的兩個方法， 圖2示出於不同純化步驟中，六碳糖氧化酶製劑之原 態、未解離聚丙烯醯胺凝膠電泳（原態PAGE)。各試樣代 表於陰離子交換層析法和濃縮後（第1道）、凝膠過滤後 (第2道）、及陽離子交換層析法後（第3道）或色譜聚 焦法後（第4道）所得酵素製劑。將Phast凝膠（Pharma-cia產品，8- 25%梯度凝膠）銀染。標準蛋白質（xlO-3 )分子童示於左側。對應於六碳糖氧化酶的色帶（Μ箭頭 示之）以另一凝膠並行酵素染色（未示出）鑑定之。 此四道係於不同凝膠上進行， 圖3示出於篩分丙烯基S_200 HR上Μ凝膠過滤法如本 文所述將六碳糖氧化酶純化過程中所得UV圖形。含六碳糖 氧化酶（ΗΟΧ)活性之區分Μ填滿之區域示之， 圖4示出從角叉菜得到的六碳糖氧化酶，利用於DEAE -Sepharose Fast Flow上之陰離子交換層析法、於飾分丙 烯基S-200上之凝膠過滤法，接著於S-Sepharose Fast 29 紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央榡準局員工消費合作、社印製 438887 A7 ______B7__ 五、發明説明（28 )

Flow上（第1道）或於Mono P管柱上（第2道）之陽雛子 交換層析法純化之SDS-PAGE。標準蛋白質（X 1〇~3)分子 量示於左側。於60 kD、40 kD和29 kD之多肽Μ箭頭標出 。試樣於12%聚丙稀醯胺凝膠上進行電泳，M Coomassie Brilliant Blue R-250予Μ染色。此二道係於不同凝膠上 進行， 圖5示出六碳糖氧化酶之等電聚焦（IEF)。凝膠以 Coomassie Brilliant Blue R-250 染色（第1道）或如本 文所述，針對酵素活性染色（第2道）。並行之等電點標 記位置示於左側。此二道係於不同凝膠上進行， 圖β示出將40 kD Η0Χ-多肽Μ蛋白質內切酶Lys-C分 解產生各多肽之逆相HPLC分離。對1、2、3、4和5標記處 之波峰進行胺基酸定序， 圖Ί7示出將29 kD Η0Χ-多肽以蛋白質内切酶Lys-C分 解產生各多肽之逆相HPLC分離。對1和2標記處之波峰進行 胺基酸定序， 圖8示出從角叉菜萃取的RNA之北方氏印跡（Northern blot) 分析。將變性的瓊脂糖凝膠分別裝填 30 微克 （ 第1道）和3微克（第2道）總RNA。左側箭頭代表六碳糖 氧化酶之特定轉錄本。分子量標記（單位為kb)位置示於 右側， 圖9示出於巴斯德畢赤酵母中表現重組六碳糖氧化酶 的介體PUP0153質體之構築。灰色部分代表六碳糖氧化酶 基因， 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

438887 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（29 ) 圖10示出於HiTrap-Q管柱上利用陰離子交換層析法（ 步驟一）之得自巴斯德畢赤酵母的重組六碳糖氧化酶之純 化。以本文所述之法測定收集區分之醇氧化酶（Α0Χ)活性（ )和六碳糖氧化酶（Η0Χ)活性（〇 ), 圖11示出於篩分丙婦基S-200 HR上利用凝膠過濾法（ 步驟二）之得自巴斯德畢赤酵母的重組六碳糖氧化酶之純 化。Μ本文所述之法測定收集區分之酵氧化酶（Α0Χ)活性（ )和六碳糖氧化酶（Η0Χ)活性（Ο)， 圖12示出於大腸桿菌中表現重組六碳糖氧化酶的介體 PUP0181質體之構築。小箭頭代表PCR引子（灰色部分代表 六碳糖氧化酶基因）， 圖13示出於大腸桿菌中重組六碳糖氧化酶之SDS-PAGE 。得自溶解细胞之粗萃取液於14%變性凝膠中進行分析。 標準蛋白質（X 1〇_3)分子量示於左側。凝膠以Coomassie Brilliant Blue R-250染色〇第1道示出具pUP0181質體的 大腸桿菌细胞萃取液，第2道示出不含質體之對照組。箭 頭示出六碳糖氧化酶色帶，和 圖14示出於酿酒酵母中表現重組六碳糖氧化酶的介體 PUP0155質體之構築。小箭頭代表PCR引子。灰色部分代表 六碳糖氧化酶基因。 實例1 潛自角艾键六；6巌_氣化遍之純彳b 純化和得到酵素胺基酸序列資料所用的兩個方法之概 31 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 438887 A7 ___B7 五、發明説明（3〇 ) 要縱覽示於圖1。 .hJL·角叉里之收集、乾和研磨 於四月至九月期間，在靠近丹麥日德蘭半島Grer^海 岸水深2- 5米處收集角叉菜紅海藻。新鮮收集的海藻葉狀 體用冷水洗，運送到實驗室期間（< 24小時）置於冰上貯 存。然後立即將海藻乾燥或貯存於冷凍狀態至進一步處理 前。將欲進行酵素純化的材料貯存於-18°C,欲進行mRNA 分離的材料則貯存於液態氮中。 於4°C將角叉菜葉狀體解凍並於室溫（20-25°C)乾燥 2 - 3天。經乾燥之物質於Waring工業用混合器（34BL97型， 美國康乃狄克州新哈佛市War ing公司產品）中研磨成细粉 Ο 1.2·酵表之越敗 將約500克角叉菜粉與2.5升20mM Tris-Cl (pH 7.0) 混合。所有萃取和純化步驟所用水係得自Milli-Q UF Plus 實驗室用水純化系統（Mill ipore產品）。緩衝液先預冷 至4°C。混合液保持於4C 6-8天。透過數層網過滤收集萃 取液。 如上述之萃取方式，對海藻材料進行重覆萃取。通常 在經過5 - 8次萃取後，當殘留活性降到幾乎可忽略的程度 時，將材料丟棄。 於Sorvall GSA雛心陀(Sorva 1 1 Instruments產品） 中，進行10,000 X g之離心Μ澄清濾液。上澄液通過What -man層析紙（chr 1)過濾，Μ水稀釋至具7-8 mS/cm之導 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 3 88 8 ? A7 _ B7 五、發明説明（31 ) 電度。將pH調至7.5。此時萃取液可進行如下述之陰離子 交換層析法。 1.3, __古避施氣化酶之測定 本文所用方法主要如Sull ivan與Ikawa於1973年所述 。此測定法乃基於於過氧化酶存在下之糖氧化產生的過氧 化氫與發色物質（鄰聯（二）茴香胺）形成色素（於402奈米 具吸光性）之原則。 測試混合液由1 - 40微升酵素試樣與850微升測試溶液 組成，測試溶液含有370微升0.1 Μ鱗酸鈉緩衝液，PH 7.0 ;460微升0.1 M D-葡萄糖之0.1 Μ鱗酸納媛衝液溶液，pH 7.0; 9微升辣根過氧化酶，0.1毫克/毫升水溶液（Sigma Chemicals ,目錄編號 P6782 或 Boehr inger Mannhe im,目 錄編號814 393);和9微升鄰聯（二）茴香胺二鹽酸鹽，3.0 毫克/毫升水溶液（3,3’-二甲氧聯苯胺）。於室溫保溫15 或30分鐘後，加入一滴37%HC1 (Merck, p.a·)使試驗停 止。將100微升試樣從試驗管移至微力價培養皿（NUNC, 丹麥）的凹槽，MTitertek Multiskan II PLUS±音養皿( Labsystems/Flow Laboratories,芬蘭）讀數器讀取410 奈米之吸光度。為了確定所觀察的活性係來自六碳糖氧化 酶-而非葡萄糖氧化酶-偶爾MD-半乳糖取代D-葡萄糖作 為受質進行試驗。 1.4*陰雛羊夺樹廇析法 於連接SuperRac區分收集器（LKB-Produkter AB，瑞 典）之BioPilot 層析系統（Pharmacia Biotech，瑞典） 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ 、1Τ 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 4388 8 7 A7 _ B7五、發明説明（32 ) 上進行此步驟。 此步驟和隨後之純化步驟均於室溫（20-25°C)進行， 惟區分收集器係置於冷藏庫中，使收集之區分於進行酵素 測定前均貯存於4°C。記錄280奈米之吸光度和導電度。將 翠取液施加於管柱床容積500毫升、已裝填DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)並Μ媛衝液A: 20mM Tris-Cl, pH 平衡之 XK50/30管柱（Pharmacia，5·0 x 25公分）。 施加試樣時之流速為5毫升/分鐘，接下來的層析步驟流速 為10毫升/分鐘。施加試樣後，M1200毫升緩衝液A洗管柱 。被吸附的蛋白質以2800毫升梯度從0%至100%之緩衝液 B： 20mM Tris-Cl , 500 mM HaCl , pH 7.5流洗〇 於梯度流 洗期間，收集區分，每區分15毫升。 每次層析後，以500毫升0.5 M NaOH將管柱再生，Μ 500毫升1·0 M Tris-Cl pH 7·5中和之，最後Μ1200毫升 緩衝液Α平衡之。如上述測試收集區分之六碳糖氧化酶活 性（40微升試樣，保溫時間30分鐘）。收集具六碳糖氧化 酶活性之區分，於4°C貯存之。 1 ♦ 5 l含六碳糠氬化胞法件區分夕港縮 收集得自DEAE-篩分瓊脂糖（Sepharose)層析法之數 個區分收集液，^Millipore Lab Ultrafiltration Cas-sette System (目錄編號XX420LCS0)中M超濾法予以濃 縮。此系統備有30,000公稱分子量極限（NMWL)膜元件（ 目錄編號PTTK0LCP2),係以蟠動泵推動。於室溫濃縮至 約50毫升後，於Centriprep濃縮器（美國Amicon產品，公 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 433887 A7 ___ B7 五、發明説明（33 ) 稱分子量斷流30,000)中，根據廠商指示，於4。(〕利用離心 超滤法將酵素製劑再濃縮至10 - 20毫升。將經濃縮之酵素 溶液貯存於4°C。

1,6.,原態聚西烯驢胺凝腿雷泳（PAGFO 利用離子交換層析法和超濾法得到的六碳糖氧化酶製 劑組成物，於Pharmacia Phast System上，Μ原態PAGE法 分析之，見圖2。根據廠商指示進行8-25%梯度凝膠和將 蛋白質銀染。含有下列分子童標記之套組也得自Pharmacia :甲狀腺球蛋白（669,000);鐵蛋白（440,000);過氧化氫 酶（232,000);乳酸鹽脫氫酶（140,000)和白蛋白（67,000 )〇 對六碳糖氧化酶活性的染色係根據Sock & Rohringer (1988)所述對葡萄糖氧化酶的作法予以進行。原則上，由 葡萄糖氧化酶或六碳糖氧化酶催化之氧化遨原反應與四鏈 鹽遨原反應偶聯生成有顔色、不溶解之甲腭。

Phast凝膠經電泳後立即浸潰於剛配製的10毫升染色 溶液中，其含有：0.1 M D-葡萄糖（或D-半乳糖）；85mM 檸懞酸/隣酸納，pH 6.5; 0.2毫克/毫升3-(4,5-二甲基噻 唑-2-基）-2,5-二笨基-四銼溴化物（”噻唑基藍”，MTT, Sigma Chemicals,目錄編號Μ 2128);和0.1毫克/毫升 Ν-甲基-二笨並啦哄甲基硫酸鹽（”吩哄甲基硫酸鹽”，PMS ，Signrn Chemicals,目錄編號Ρ 9625) ◦將凝膠置暗處 ，於室溫保溫至清楚地看到藍紫色色帶（通常需5-90分鐘 )，然後以10%醋酸、5%甘油清洗並予Μ風乾。 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

438887 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（3〇 銀染的凝膠示於圖2，第1道。由圖中明顯看出，於此 純化步驟仍存在許多蛋白質。但是，經酵素活性染色後， 只有圖2中Μ箭頭標示之色帶被染色（其結果未示出）。 1.7.凝臌满減法 純化中之此步驟係於備有350毫升管柱床容積之χκ26/ 70管柱（2·6 X 66公分，Pharmacia產品）之FPLC糸統（

Pharmacia產品）上進行。管柱根據廠商指示以篩分丙嫌基 S-200 HR (PhaFmacia產品）裝填。緩衝液為2〇1)^1"1^3-C1，500 mM NaCl，pH 7.5,流速為0·5毫升/分鐘。記錄 280奈米之UV-吸光度。以FRAC-100區分收集器（Pharmacia 產品）收集各區分，每區分2·5毫升，收集器置於冷藏庫（ 4°C)中，放在FPLC糸統旁邊。經濃縮之六碳糖氧化酶製 劑置於SW60搖斗離心陀（Beckman產品）中，於L7超速離 心機（Beckman產品）中，以30,000 rpm於4。<3，離心60分 鐘予以澄清。取上澄液3*0-4.0毫升與5%甘油（Sigma Che -micals，目錄編號G 7757)混合，通過孔徑0.22微米之即 棄式過濾單元（Millipore，目錄編號SLGV 025 BS)予以 過滤，使用與管柱入口連接之SA-5試樣施加器（Pharmacia 產品）施加於管柱上。具有六碳糖氧化酶活性之各區分以 上文所述之試驗方法（試樣10微升，保溫時間15分鐘）予 Μ鑑定，至進一步處理前，分別貯存於-18°C。 六碳糖氧化酶的UV-圖形和流洗位置示於圖3。由此圖 形可看出，於此步驟中，實際量之UV-吸收物質被除去。 原態PAGE之電泳分析和銀染（圖2,第2道）顯示，經此步 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 4 3 88 8 7 A7 -- B7 五、發明説明（35) 驟後，僅有少數污染成分殘留下來。 分析凝fl藝满漉法之原態六碳煻氬彳h翻之分子量

MM 原態六碳糖氧化酶的分子量係利用凝膠過滤法於篩分 丙婦基S-200 Superfine (Pharmacia產品）上測定之。 管柱大小、緩衝液、流速和區分收集均如上述。測定管柱 未填充空間容積（V。）的藍葡聚糖和校正管柱之下列標準 蛋白質均得自Pharmacia :卵清蛋白（43,000)、白蛋白 (67,〇〇〇)、過氧化氫酶（158,000)和醛縮酶（252,000)。含 六碳糖氧化酶之試樣係如上述利用DEAE -篩分瓊脂糖層析 法製得。以標準蛋白質和六碳糖氧化酶流洗容積（Ve)之 測定為準，計算對應之值（ve - v〇/vt - V。）。最後 ，將標準蛋白質之Ka^值對對應的1〇g (分子量）值作圖。 六碳糖氧化酶的Κπ對應於大約110,000之原態分子量。此 值與Sullivan & Ikawa (1973)發現的分子童約130,000 相當一‘致。Kerschensteiner & Klippenstein (1978)報 導分子量為140,000，也是Μ凝膠過滤法予Μ測定。 1-Q- Β暴雛罕夺換曆析法

此步驟係於備有裝填S-Sepharose Fast Flow (Phar-macia產品）白勺HR5/5管柱（Pharmac ia產品，0.5 x 5公分 ，管柱床容積1.0毫升）之SMART微純化層析系統（Phar-macia產品）上予Μ進行。管柱MA-緩衝液平衡：50 ιηΜ醋 酸鈉，pH 4.5 (其製備係MNaOH將50mM醋酸調至pH 4·5) 。作為梯度流洗液用之緩衝液Β含有50 mM醋酸納、500 mM 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 3 8 8 8 7 A7 _B7 五、發明説明（36 )

NaCl, pH 4.5。將得自凝膠過滤之諸區分於以25 mM醋酸 納，pH 4· 5平衡和流洗之預裝填、即棄式篩分多醣G-25管 柱（PD-10, Pharmacia產品）上進行脫鹽。得自6個凝膠 過滤區分之具高六碳糖氧化酶活性之已脫鹽試樣20毫升Μ 250微升/分鐘之流速，自50毫升Super loop (Pharmacia產 品）施加於管柱上。然後於相同流速下，以4個管柱床容 積之緩衝液A洗管柱。結合式蛋白質M5毫升Μ上從緩衝液 Α至緩衝液Β之梯度流洗。於梯度流洗期間，收集區分，每 區分250微升，如上述測定六碳糖氧化酶活性（1微升試樣 ,15分鐘保溫），於進一步使用前，均貯存於_18°C。 生成的六碳糖氧化酶製劑利用原態PAGE和銀染分析之 (圖2，第3道）。雖然也觀察到少量污染蛋白質，但六碳 糖氧化酶色帶為僅有之有意義色帶。

1」0分析用硫_ +二酯納PAGE (SDS-PAGFO 得自S-篩分瓊脂糖層析法顯示具六碳糖氧化酶活性之 諸區分也根據Laemmli (1970)之SDS-PAGE予以分析。將 厚度0.75毫米之12.5%丙烯醯胺/雙丙稀醯胺（37.5: 1混 合物）微小凝膨置於Min i-Protean II裝置（Bio-Rad產品 )中處理。凝B蓼M0.1%Coomassie Brilliant Blue R-250 、10%醋酸、40%乙醇染色，於10%醋酸、305¾乙醇中脫 色。 電泳的結果示於圖4,第1道。六碳糖氧化酶之純化製 劑於相當於40 kD和29 kD分子量處分別具有強色帶，於60 kD和25 kD分別具有弱色帶。此外，於55 kD和57 kD也看 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 4 3 88 8 7 A7 B7 ,----------- ： -- " -------- 五、發明説明（37 ) 到明顯的雙重色帶。 1」ΐ . SDS-PAGE後._水化合物印跡染色法 經分離六碳糖氧化酶中，碳水化合物的存在係M DIG Glycan檢測套組（Boehringer Mannheim產品）予以檢測 ，其係設計Μ檢測印跡上醣共輒體中之微克糖含量。原則 上，將碳水化合物中相連的經基氧化成醛。然後將地谷新 配質共價结合於這些醛基，接著以抗-地谷新配質-鹼性磷 酸酶抗體共幌體檢測之。 得自陽雛子交換層析法之純化六碳糖氧化酶如上述於 12%SDS-PAGE上處理，根據標準方法於硝基纖維素上形成 印跡，根據廠商指示，MGlycan檢測套組使碳水化合物染 色。於60 kD、40 kD、29 kD和25 kD之六碳糖氧化酶色帶 無一者被染色，惟有於57 kD-55 kD之明顯雙重色帶被強 烈地染色（結果未示出）。此57 kD-55 kD雙重色帶後來 如下述被鑑定為殘留污染物。 因此可推知，SDS-PAGE所見之六碳糖氧化酶成分無一 者被糖基化。 1.12.等雷聚隹法 集中得自S-篩分瓊脂糖層析法之六碳糖氧化酶諸區分 ，於Centricon濃縮器（Amicon產品）中，以離心超速過 濾法予K濃縮，並根據廠商（FMC Bi〇Pr〇ducts，Rockland ，ME, USA)指示，於Isogel壤脂糖培養皿（pH 3-10)上 以等電聚焦法（IEF)分析之。將pi標記（FMC Bioproduets )混合物與六碳糖氧化酶試樣平行處理。混合物中含有細 39 本紙張~^度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210'/297公釐） — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

438887 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 Α7 Β7 五、發明説明（38 ) 胞色素C (Pi = 1〇·2)、肌血紅素主要/次要色帶（7.4/ 7·0)、碳酸酧酶（6.1)、/?-乳球蛋白 Α/Β (5·4/5.5) 卵清蛋白（4· 8)、葡萄糖氧化酶（4· 2)和搬粉匍萄糖g 酶（3·6)。凝膨以Coomassie Brilliant Blue R-250 _ 色。如圖5，第1道所示，六碳糖氧化酶純化製劑由“分 別為4.3和4· 5的兩個變體組成。純化六碳糖氧化酶也根矛康 廠商指示，於預鑄聚丙烯醯胺凝膠（pH 3.5-9.5，phar_ macia, Ampholine PAGplates)上，从等電聚焦法分析之 。將這些凝膠置於染色混合液中保溫，根據上述原態聚丙 烯醯胺凝膠之染色法測定酵素活性。如圖5，第2道所示， 兩個Pi變體均具酵素活性。 ΐ·13·曆析聚隹法 於S-筛分瓊脂糖上純化的六碳糖氧化酶，最後步驟於 SDS-PAGE看到的幾個色帶使人懷疑其一或多個色帶可能代 表殘留污染物。此外，S-篩分瓊脂糖層析法的收率一致地 低。因此，以層析聚焦法取代S-篩分瓊脂糖上之陽離子交 換層析法為最後純化步驟。 層析聚焦法係於備有管柱床容積1毫升之Mono P HR 5 /5管柱（0*5 x 5公分，Pharmacia產品）和施加試樣用 的50毫升Super loop之SMART層析糸統上進行。分雛pH 5 · 〇 和3.5間隔用的起始緩衝液為25|^六氫吼哄以此1調至1^ 5·5。流洗液為Polybuffer 74 (Pharinaeia 產品），Μ水 稀釋10倍和MHC1調至pH 3.5。如廠商所建議，Μ起始_ 衝液預先處理和使平衡管柱。 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ameammmmmm ml 1 ϋϋ Λί 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 438887 A7 B7 五、發明説明（39 ) 試樣製劑Μ下法處理：典型實驗為將得自兩個凝膠過 濾處理之最佳區分（2 X 4區分，20毫升）集中起來，通 過已裝填於即棄式Poly-prep管柱（Bio-Rad製品）且於凝 膠過滤法所用緩衝液中（20 mM Tris-C1，500 mM NaCl, pH7.5)平衡之 1 毫升 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow ( Pharmacia產品）之管柱。此處理幾乎將此雛子強度下吸 附於凝膠基質上之殘留量紅蛋白質藻紅蛋白和其他有色物 質完全去除，因而除去其他純化方法中只能部分去除之污 染物。笨基篩分瓊脂糖管柱於使用後即丟棄。於流出液中 將六碳糖氧化酶活性定量回收，然後於以起始緩衝液平衡 和流洗之預先裝填之即棄式篩分多釀G-25管柱上脫鹽。 施加試樣前，將1毫升流洗液泵送於管柱上，流速為 0.5毫升/分鐘。於施加試樣後，泵送11毫升流洗液通過管 柱Μ形成pH梯度。於pH梯度流洗中，收集44個250微升之 區分。含有六碳糖氧化酶之區分Μ上述試驗方法（試樣1 微升，保溫時間15分鐘）予Μ鑑定並貯存於-18°C至進一 步使用前。 利用層析聚焦法純化之六碳糖氧化酶Μ原態PAGE和銀 染（圖2，第4道）及利用SDS-PAGE和以Coomassie Brilli -ant Blue染色（圖4,第2道）分析之。於原態PAGE中， 六碳糖氧化酶色帶為唯一具意義之色帶，只看到很少量的 污染物。利用SDS-PAGE清楚地證明，此純化方法可Μ將57 kD和55 kD明顯雙重色帶去除。於S-篩分瓊脂糖層析後， 在25 kD看到的色帶，經層析聚焦法後，成為很微弱。 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 3 88 8 7 A7 B7 五、發明説明（W ) 總之，利用DEAE層析、凝膠過濾和層析聚焦法得到的 六碳糖氧化酶於原態PAGE中具有一個色帶。於SDS-PAGE中 ,觀察到4〇 kD和29 kD處之強色帶和60 kD處之弱色帶。 由於60 kD成分的強度，相對於40 kD和29 kD成分， 隨著不同的酵素製法而異，因此假設29 kO和40 kD多肽可 能源自約6〇 kD前體之蛋白水角军_程。胃具有 (如上述利用凝膠過滤法也的確證實）— 120,000 原態分子量之酵素之同種二聚體結構不謀而合。此夕卜，此 假設也與Kerschensteiner和K1 ippenstein於凝膠過滤法 測定之140,000原態分子量和於SDS - PAGE中測定之70,800 次單元分子量(Kerschenste iner and K1 ippenste in, 1978) 一致 〇 實例2 六硝_璧:化酺冬吐Η段的產生和胺基酸序列分析 H Μ痗化氤將六碳糖氧化酶分解 此步驟之進行仍Μ使用S-篩分瓊脂糖之陽離子交換層 析法為其前之純化步驟。 將於DEAE飾分瓊脂糖、分丙烯基S-200、和S-篩分 瓊脂糖上純化所得六碳糖氧化酶，利用於裝設在上面SMART 系統中、含有篩分多釀G-25 Supergine之預裝填PC3.2/10 Fast Desalting Column (快速脫鹽管柱）（Pharmacia產 品，0.32 X 10公分，管柱床容積0.8毫升）上之緩衝劑-交換作用，轉移到揮發性緩衝劑中。管柱K200 mM碳酸氫 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4388 8 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明Ui ) §安（BDH, AnalaR )平衡和流洗。欲得到令人滿意的回收 率，於注射前需於六碳糖氧化酶試樣中力卩入500 mM氯化鈉 〇 將經流洗、緩衝劑交換之六碳糖氧化酶分配到1.5毫 升微離心管中並於Speedvac濃縮器（Savant Instruments) 中冷凍乾燥。加入溴化氰（CNBr, Pierce)於70%v/v甲 酸中之10毫克/毫升溶液200微升。（得自Promega之試劑 為”Probe DesignTM多肽分離糸統”之成分，目錄編號V60 30)。於室溫，將各管置於暗處保溫過夜。然後於Speed-vac濃縮器中將溶液乾燥，再懸浮於50微升中，再乾燥之。 2,2·利用高解析SDS - PAGE禾口聚二氩亞乙铺(PVDF)隱雷 印跡法之海化氤Η段分雛 利用根據Sch^igger & von Jagow(1987)之高解析SDS-PAGE法將由溴化氰分解產生的多肽予以分離。此系統對低 分子量多肽（20-250胺基酸基團）提供極佳之分離作用。 凝膠糸統由16.5%分離膠、10%成層膠和4 %堆集膠組成 ，所有膠均使用得自Promega之29 :1丙稀醯胺/雙丙嫌醯胺 混合物製成。 厚度0.75毫米之微小凝膠置於Mini-Protean II裝置 (Bio-Rad產品）中處理。過硫酸按和N, N, N ’，N f -四甲基-伸乙二胺（TEMED)得自 B i〇-Rad。SDS得自美國B i ochem ica 1 (超純）。Tris得自Fluka (目錄編號93350)。麥黃酮和 疏醋酸納得自Promega。甘胺酸（p.a·)、2-擁乙酵（p.a·) 和溴醜藍得自Merck,甘油得自GIBC0 BRL (超純）。於使 43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 4 3 R 8 8 7 A7 _ B7 五、發明説明（G ) 用前才將〇·1 mM疏醋酸鈉加到陽極緩衝液中，Μ防止分離 期間多肽胺基末端之化學性封阻。於30 V，將凝膠預先處 理60分鐘，讓疏醋酸鹽清除任何具胺基-反應性之物質。 試樣製備：將經乾燥之溴化氟多肽片段再懸浮於30微 升含有63 mM Tris-Cl, pH 6,8、1%SDS、2·5%2-離乙醇 、10%甘油和0.0012%溴齡藍之凝膠裝填緩衝液中。混合 時，由於殘留甲酸的含量而變黃之試樣，加入1-3微升1.0 M Tr is鹼至回復藍色為止。在施加於凝膠前，將試樣於95 C加熱5分鐘使其變性。將分子量在31，000和2,500間之低 範圍蛋白質分子量標準混合液（Promega產品）與六碳糖 氧化酶多肽試樣平行處理。於150V短定電壓下進行電泳。 電泳轉移至PVDF膜係根據廠商指示，於Mini Trans-B lot E lectrophoret ic Transfer Cell (微小轉印電泳轉 移元件，Bio-Rad產品）中進行。將三張剪成凝膠大小的 Problott膜（Applied Biosystems產品）短暫地於甲酉¥ ( Merck, p. a)中潤濕，然後浸在轉移媛衝液（25 mM Tr is ,192 mM甘胺酸，pH 8.5,於4°C預冷）中至組合轉印夾 層（blotting sandwich)為止。電泳後，凝膠於4 °C之轉移 媛衝液中保溫5分鐘，然後組合成具有下列層次之轉移層： ——張Whatman糸氐（3MM chr)、兩張Prob lott·膜、SDS—PAGE 多狀分雛膠、第三張Problott、和最後一紙。 夾層的指向為兩張Problott膜朝向電極組合的正極。冷卻 單位在裝填預冷的轉移緩衝液之前，即裝設於緩衝室中， 然後於室溫、100 V短定電壓下，進行轉移60分鐘。於轉 44 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ 訂 I . 4388 8 7 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 五、發明説明（U ) 移期間，電流從約270 πιΑ增加到約400 ιηΑ。 轉移後，將膜置於水中洗1分鐘，然後於1〇〇毫升剛配 製之含有0·1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad)、55¾醋酸（Merck，p* a)和45% 甲醇（Merck, p. a )之染色液中染色30-45秒。其後將膜置於約80毫升5%醋 酸、45%甲酵中脫色三次，每次30- 60秒，均換用剛配製 之溶液。最後將膜水洗三次，每次均換水，Μ除去殘留的 甘胺酸，然後予Μ風乾。將分子量分別為約2.5 kD、9kD 和16 kD之分離得很好、相當豐富之色帶切除，以進行胺 基酸分析和序列分析。 2· 3，六碳糖氣化酿Q kD海fh值Η段，胳某酿分析和亩席 胺基酸分析利用雛子交換層析法和Μ鄰酞二醛之管柱 後衍生作用進行之。試樣在6 M HC1、0.05%齡和0.05% 二硫二丙酸中，於U〇°C水解20小時（Barkholt and Jen-sen, 1989) 〇 多肽於得自 Applied Biosystems (477AM) 、備有線上PTH分析器（120A型）和數據分析系統之蛋白質/ 多肽自動定序器上予Μ定序。蛋白質定序試劑得自App 1 ied Biosystems。胺基酸分析和胜肽序列分析委託丹麥哥本哈 根大學蛋白質化學系Arne L.Jensen予Μ執行。 分析9 kD片段鑑定之多肽序列示於表2.1。 步驟一乙內醯苯硫脲-酪胺酸（PTH-Tyr)之初收量為 22微微莫耳。9K片段的胺基酸組成示於表2.2。 実2.1.未丨〖用六捕氣仆I薩Q kD海Yh值Hg夺序石f丨分析所揖 45 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 訂

V 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇'〆297公釐） 438887 五、發明説明 Η太序列 Α7 Β7 定序胜肽起源 序列鑑定 胺基酸序列 HOX, 9K CNBr片段 H0X -1胜肽 Y-E-P-Y-G-G-V-P- 縮寫：Y = Tyr ； E = Glu； P = Pro； G = Gly ； V = Val (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 :石炭糠氬彳h酿Θ kD湟fh值）={段某酿台日成 胺基_& 麵知 N Asx 16.4 14 Thr 4.8 4 Ser 4.6 4 Glx 9,9 8 Pro 8.1 7 Gly 11.2 9 Ala 4.3 4 Cys 0 0 Val 5.2 5 Met 0.2 .0 lie 3.6 3 Leu 9.3 8 Tyr 6.1 5 Phe 4.6 4 His 1.0 1 Lys 8.1 7 Arg 2.7 2 Trp 2 ~~ND17- 藝 總言· 100.0 85 υ·測定 製傲式法 V- 為了得到得自六碳_氧化酶製劑40 kD或29 kD多肽主 46 、1Τ ^wi. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 4 3 B B 8 7 A7 B7 五、發明説明（0 ) 幹之胺基酸序列而進行下面方法。 根據 Laemmli (Laemmli，U.K.k 1970)之法處理製備 性SDS-PAGE凝膠。將厚度〇♦ 75毫米、含有12.5%丙稀醯胺 /雙丙稀醯胺（37· 5: 1混合物）微小凝膠置於Mini-Protean II裝置（Bio-Rad產品）中處理。含有丙烯醯胺（BDH，目 錄編號44313)和N，N’-亞甲基-雙丙烯醯胺（BDH,目錄編 號44300)的溶液蓋過混合床離子交換樹脂（Bio-Rad,目 錄編號142-6425)予Μ貯存。所有其他試劑來源均如上述 〇 試樣製備：於具有NMWL 10,000和試樣容童400微升之 Ultra-free-MC滤器單元（Millipore,目錄編號UFC3 LGC 25)中，溫度41，利用離心超ί慮法將得自層析聚焦法之 區分濃縮。存留液與裝填含有125 mM Tris-Cl, pH 6.8、 2% SDS、5%2-疏乙醇、20%甘油和0.0025%溴酚藍2X緩 衝液之一倍容積凝膠混合。混合時，由於酸性Polybuffer 成分的含量而變黃之試樣，加入1-3微升1.0M Tr is鹼中和 ，至回復藍色為止。將試樣於95Ρ加熱5分鐘使其變性， Μ每道約30微升之量施加於凝膠上。 以分子量在97,400至14,400範圍內之分子量標記蛋白 質（Bio-Rad產品）混合物與六碳糖氧化酶試樣平行處理 。每一凝膠於10 mA之低電流下進行電泳，Μ減少由熱引 發試樣蛋白質化學改變之風險。 電泳轉移至PVDF膜係如上述予Μ進行，但只使用一張 Immobilon Ρ 膜（Millipore,目錄編號 IPVH 15150)而非 47 ^ ________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4 3 88 8 7 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 三張P r o b U> 11:。夾層方向為轉印膜朝著電極組合之正極。 轉移後，將Immob i 1 on P膜水洗10秒，然後於剛配製 含有 0 * 〇25%Coomass i e Brilliant Blue R - 250、5%醋酸 和405¾甲醇之100毫升染色溶液中染色45-60秒。再將膜於 250毫升剛配製之5%醋酸、30%乙醇（96%v/v，Dan isco ，丹麥）中脫色2_3分鐘。最後將膜風乾，貯存於4°C。 印跡上的色帶圖案與以層析聚焦法最後純化後於分析 用SDS-PAGE中所見圖案相同。除了於60 kD之弱色帶外， 於40 kD和29 kD具有強色帶。 從印跡上將40 kD和29 kD之色帶切除，根據下述方法 進行胺基酸分析和與膜結合的多肽之酵素分解。60K 於量太少，無法對此多肽作任何進一步分析 六碳艏氫,化酿40 kD和29 kD多 六碳糖氧化酶40 kD和29 kD成分之胺基酸組成示於表 2.3〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T-

V 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（21〇><297公釐） 4388 8 A7 B7 五、發明説明（々7

Ur ” 胺基醑/ : 髑耳& 40K 29K Asx 11.5 12.5 Thr 5.9 5.2 Ser 6.1 4.7 Glu 9.7 15.1 Pro 5.2 5.4 Gly 13.6 9.7 Ala 6.6 6.4 Cys 1.1 0.9 Val 7.3 5.5 Met 1.5 2.3 lie 3.7 4.4 Leu 8.5 8.6 Tvr 4.2 5.3 Phe 5.5 4.1 ^ His 2.2 1.4 WLys 3.9 6.1 3.5 2.4 ^"Trp ND17^ NDr) «計 100.0 100.0 測定 2.6.結合PVDF的六碳糠氬化酶多Η太之酵素分解

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 結合於PVDF的六碳糖氧化酶多肽之分解和生成蛋白水 解多狀之萃取係如Fernandez等（1992)和Fernandez等（ 1994)所述進行之。 六碳糖氧化酶40kD多狀之分解：從經Coomass ie b lue 染色之PVDF膜上，將總蛋白質估計含量約5微克（相當於約 125微微莫耳）的11個40 kD色帶切下，於甲酵中脫色1-2分 鐘，然後水洗2-3分鐘。將色帶膜切成1x1毫米的小方塊， 移到微離心管中。MPVDF膜的空白部分作為對照組。將切 塊的膜 Η 浸在含有 1%(ν/ν)氫化 Triton X~l〇〇 (RTX-100, Sigma Chemicals,目錄編號 X-l〇〇R-PC，或 Ca lb iochem , 蛋白質級，目錄編號648464)、10%乙腈（Merck, Grade 49 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 438887 A7 B7 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 五、發明説明（β) L ichroso 1 v)和 100 mM Tr is-~C 1 , pH 8.0 之 50 微升分解緩 衝液中。所選分解用蛋白水解酵素為蛋白質內切酶Lys - G( endoLys-C)，其自賴胺酸C端側將狀鍵裂解。取5微克endo Lys-C (Boehringer Mannheim,定序級，目錄編號1047 8 25)，加入20微升水再組成之。加入2微升酵素液，相當 於0.5微克（酵素··受質比1:10)。於37°C進行分解22-24 小時。 分解後，將試樣置於超音波槽（Elma transonic)超 音波處理5分鐘，置於微離心管中，於1700 rpm離心5分鐘 ，然後將上澄液移入新管中。繼績M50微升分解緩衝液和 100微升0.1%三氟醋酸（TEA, Pierce,目錄編號28902) 洗之，如上述進行超音波處理和離心。集中所有上澄液， 產生200微升之萃取容積。將萃取液保存於-18°C至進行多 肽純化。 六碳糖氧化酶29 kD多肽也與40 kD成分一樣進行分解 ，惟根據胺基酸分析，係使用總蛋白質含量為2.4微克（約 80微微莫耳）的四個色帶。 2.7 > 由pndoLvs-C產牛多狀之純化 將六碳糖氧化酶40 kD和29 kD多肽分解所得胜肽片段 於SMART層析糸統上進行分離。此糸統備有可見光波長微 波峰檢測器和具60小瓶之區分收集盤。分離所用逆相管柱 為以矽石為基底之hRPC C2/C18 SC2.1/10窄徑管柱（Phar-macia產品，管柱大小2· 1 X 100毫米，粒子大小3微米， 50 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) - 訂 __ 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 4 3 88 8 7 A7 B7 五、發明説明（α) 平均孔徑大小125A )。緩衝液A: 0*1%TFA (Pierce),於 Milli-Q水中，B: 0.1%TFA,於乙腈中（Merck，梯度級 Lichrosolv)。於0*5微米氟孔濾器（Millipore，目錄編 號FHLP04700 )上，Μ真空過濾法將媛衝液過濾和脫氣。 流速為每分鐘100微升。於220奈米、254奈米和280奈米偵 測流出液的UV-吸光度。梯度為0-30% Β (0-65分鐘）、 30-60% Β (65-95分鐘）和 60-80% Β (95-105分鐘）〇 然後於100微升/分鐘，Μ80% Β洗管柱10分鐘，於200微 升/分鐘，ΜΑ-緩衝液再平衡45分鐘。收集t = 15分鐘和 t = 105分鐘之間的區分，每區分50微升（3x60個區分）。 貯存於-18°C至進行胺基酸分析。 40 kD多肽經endoLys-C分解後所得胜肽圖示於圖6。 由此圖形看出，分解和HPLC分雛的結果，產生幾個分離得 相當好之具有髙信號對雑訊比之波峰。對照組分解混合液 之對應圖形（未示出）顯示，t = 83分鐘Μ後流洗的波峰 為非胜肽、得自試劑之波峰，可能是氫化Triton X-100或 殘留量Coomassie色素吸收UV之污染物。Μ下列標準選定 圖6中標號1-5之波峰進行胺基酸定序：1)波峰高度。2) 表觀純度。3)高A2 8CI:A2 2CI比及/或高A25 4:A2 2l3fcb,表示 含有芳族胺基酸基團，由於其遺傳密碼代替性較低，被選 定為PCR引子序列最有用。4)流洗時間遲，顯示胜肽鏈相 當長。 29 kD endoLys-C胜肽的圖形示於圖7。很明顯地，與 圖6之40 kD成分相較下，此六碳糖氧化酶成分僅提供少婁女 51 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

43 88 8 7 A7 B7 五、發明説明（5〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 有意義之胜肽片段。比較圖形時，沒有跡像顯示任何胜肽 片段同時存在兩個分解液中。此項發現說明40 kD和29 kD 六碳糖氧化酶成分未具共同胺基酸序列，如果29 kD鏈是 由40 kD多肽經蛋白水解作用而產生，則二者應有共同胺 基酸序列。（與40 kD分解液相較下，29 kD分解液於t = 83分鐘以後之流洗中只含少量污染物質。其可能原因為， 29 kD分解使用得自Calbiochem之氫化Triton X-100,而 40 kD 分解貝U使用得自 Sigma Chemicals 之Triton X-100 進行之。） 將對應於29 kD胜肽圖（圖7)標號1和2波峰之區分進 行胺基酸定序。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2.8.六石炭糖氬化酿番白解產生胖8女夕Bg甚醮序芕"分析 分析對應於圖 6 波峰 1-5 (Η0Χ-2、Η0Χ-3、Η0Χ-4、Η0Χ 一5禾CIH0X—6月生JK)禾DHI7 波峰 1 一2 (Η0Χ—7fDH0X—8胜)!*)之 區分鑑定出之胜肽序列示於下面表2.4中。PTH胺基酸之初 收量在從步驟一 Η0Χ-5胜肽的46微微莫耳PTH-Tyr至步驟二 Η0Χ-8胜肽的6微微莫耳PTH-Ile之範圍內。正如從所選定 波峰分別在254奈米和280奈米之吸光度所預測，所有定序 之胜肽至少含有一個芳族胺基酸基團。 表H將得自六碳糖氯彳h醃40 kD禾kD多太的蛋.白質 肉切酶胖Η太序芕丨丨分析所得胖肽序芕Π 52 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 4 3 88 8 7 A7 B7 五、發明説明（51 ) 定序胜肽起源 序列鑑定 胺基酸序列 40Κ,波峰1 Η0Χ-2胜肽 A-M-N-V-T-G-L-V-E-SO-Y-D-X1' -X2) -X3) -G-Y-X-V-S-S- 40Κ,波峰2 Η0Χ-3胜肽 D - - W-F - 40Κ,波峰3 Η0Χ-4胜肽 D-S-E-G-N-D-G-E-L-F-X-A-(Η)-T- 40Κ,波峰4 Η0Χ-5胜肽 Y-Y-F-K 40Κ,波峰5 Η0Χ-6胜肽 D~P-G-Y-I-V-I-D-V-N-A-G-T~P~D~ 29Κ,波峰1 Η0Χ-7胜肽 L-Q-Y-Q-T-Y-W-Q-(E)-(E)-(D)- 29Κ,波峰2 Η0Χ-8胜肽 X - HR) - D-F-Y-E-E-M- 無把握之鑑定基團示於括弧中。 1) 第15號基團經鑑定為Asp或Asn。 2) 第16號基團經鑑定為Asp或Ala。 3) 第17號基團經鑑定為Arg或trp。 實例3 從隹叉菜分雛六碳鑛氬脑某闵 3丄得自角叉菜的RNA之純化 剛收集之角叉菜葉狀體用冷水洗，立即貯存於液態氮 中至進一步使用前。於液態氮中凍結之角叉菜約15克置於 碾缽中均化成微細粉末。將凍结、均化的材料移至含有15 毫升举取液（8M胍鎌鹽酸鹽；20 mM 2-(N-嗎啉基）乙磺酸 (MES), pH 7·0; 20 mM伸乙二胺四乙酸（EDTA); 50 rtiM /3 -疏乙醇）之50毫升管（Nunc產品，目錄編號339497)中。 將管渦動，於接下來的步驟中，除非示出其他溫度， 否則均維持於0°C。於Heraeus Omnifuge 2.0RS中，將此 53 本紙張尺度適用中國國家標準fcNS ) A4規格（210X^^^釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4388 8 7 A7 B7 __ __ 五、發明説明（52 ) 管M6,000 X g離心20分鐘，小心地收集含RNA之上澄液（ 約15毫升），移到預先冷卻之50毫升管中。將1.5毫升2 Μ 醋酸納，pH 4.25、15毫升Μ水飽和之鼢和3毫升氯仿：異 戊醇（49:1)加到含有RNA萃取液之管中。 然後將管劇烈渦動1/2分鐘，於Omnifuge中，Μ6,000 X g將管離心20分鐘Μ分離各相。將水相（約17毫升）移 到30毫升Corex管（Sorva 11,目錄編號00156)中，加入 等容積（亦即約17毫升）之冷異丙酵。再渦動管，於-20 °0至少培育1小時。使用備有預冷的SS34迴轉輪之Sorval 1 RC-5B離心機，於10,000 rpm離心20分鐘將沉灘下來的RNA 壓片。丟棄上澄液，經壓片之RNA再懸浮於4毫升0.3 Μ醋 酸鈉，pH 5.5中，加入12毫升96%乙酵。 然後渦動Corex管，於-20°C再培育至少1小時，隨後 如上述離心20分鐘將RNA第二次壓片。小心丟棄上澄液， 將!^々壓片再懸浮於2毫升0*15^4醋酸納，&[15.5中。然後 加入8毫升4 Μ醋—鈉，pH 5.5, RNA於冰上沉澱30分鐘， 再如上述予Μ壓片。於70%乙酵中洗RNA壓再懸浮於 500微升水中。將經懸浮之RNA移到微離心管中，於_20°C 貯存至進一步使用前。 以瓊脂糖凝膠電泳法和於260奈米和280奈米之吸收測 定，女口 Ssimbrook等(1989)所述，分析RNA之純度禾口濃度0 H得自隹歹發勺聚腺符西分雛 使用含寡 dT 之磁珠（Dynabeads® Oligo (dT)25，於 mRNA Purification Kit™ Dynal)，從總RNA中分離 54 本&張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T #. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 438887 A7 _____B7 五、發明説明（53 ) 聚腺登酸化RNA。大約100微克總RNA與1毫克Dynabeads® 01 igo (dT)25y昆合，女DmRNA Purification KitTM 原報告 所述，分雛聚腺音酸化RNA。MDynabeads®分離的聚腺苷 酸化RNA之收率在1和3%之間。 其他方法也用來分雛得自角叉菜之聚腺苷酸化RNA, 包括裝填寡-(dT)-纖維素之管柱（Clontech產品，目錄編 號8832-2)或如mRNA Separator Ki tTM原報告戸万述之管柱 (mRNA Separator Kit™ , Clontech產品，目錄編號K1040 -1)。於寡-WT)管柱上分離的聚腺苷酸化RNA之收率在最 初總RNA量的0·1和1%間。於寡-（dT)管柱上分離的聚腺苷 酸化RNA在下面（3.4)敘述的cDNA合成反應中使用，惟第 一股cDNA的收率非常低（少於1%)。 與Dynabeads®純化的RNA相較下，於寡-（dT)管柱上 分雛的RNA收率較低和表現較弱的原因可能為總RNA萃取液 中碳水化合物或蛋白多醣之存在。被碳水化合物污染的總 RNA製劑已被證實會阻礙聚腺苷酸化RNA之純化和抑制cDNA 合成，因此，不含碳水化合物的RNA純化方法已逐漸產生（ Groppe等，1993; Yeh等）。然而，Μ這些方法純化的聚腺 音酸化RNA在cDNA合成反應中不如MDynabeads® 純化的 RNA有效。因此，於第一股cDNA合成反應中，使用MDyrm -beads® 純化的聚腺音酸化RNA為模板（參考下面3*4)。 3,3.六碳糖氬化脑特厘窠梭替酸 合成寡核苷酸係Μ得自六碳糖氧化酶胜肽Η0Χ-2、Η0Χ -3和肋乂-4之胺基酸序列（表2.4)為基底予以合成（0似 55 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -ϋϋ ·1_1 HI -ϋϋ a—— .ϋϋml ϋϋ ·ϋ ϋϋ ·ϋϋ 11 m I —^i —wm* In (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 3 88 8 7 A7 B7 五、發明説明（％ ) technology. ApS , Forskerparken, DK—8000 Aarhus C, Denmark)。表3.1示出寡核有:酸和其對應之胺基酸序列。 表3.1也示出於DNA定序或於PCR中所用引子之DNA序列。 表i六碳糖氧化酶特異合成篡核替酸夕按每酿序列 請 先 閱 讀 背 之 注

Hox-胜肽

Hox-丨引子!

Hox-2 A I I N V T G ^ΥΠ V E S G Y D X X X G Y X V Ηοχ2·3 十 σπ GAR WSI GGN TAY GA-T Ηοχ·3 D L P M S P R G - V I A S N L W F Ηοχ3-2- 3· CAN TAD CGN AGI TTR RAI ACC M5 Ηοχ-4 D S E G N D G E L F X A H T Ηοχ4-1 十 5 GAR GGI AAY GAY GGI GAR cm rry Hox4-2- TCIY CCN CCI GAI AA5* 合祆 ¥

Hox5+ Hox5- Hox6+ Hox7- Hox8- HoxlO- Hoxll+ Hoxl2- Hoxl3- Hox5，-l SATT GGG GCT CCT TCA AGA < ^TGA TGA TTC CAA AGT TTCy yTTG GAA GAA TAC GGT TGG3· yTAC TAT TTC GTC TGC TTG GG 3’ ^GAA CTC TTC CGT GGT CTC CTy yCCA CCT GCG TGT TGG GGT CT3’ SCAG ATC TAC AAA ACA TGC GAG3* ^TGT CGC AGA CTG TAC TTG3* 51 GAG TCT ACA CGA CAT AAA3*

(ATG

ACT

CCC CAG T3· G3. U, Y為C或τ時，R為A或G; W為A或T時，S為C或G;D為A、G或τ時，N為A、C、G或T，及1=去氧肌登 pfit 繂理J 師/、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨οχ297公釐） 56 A7 438887 ____B7 五、發明説明（55 ) 3,4，eDNA合成與聚合酶揮銷反應（PCR) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在使用市售商品套組之第一股cDNA合成反應中，係Μ 聚腺甘酸化RNA為模板。如MaratonTMcDNAAmplification Kit (Clontech產品，目錄編號Κ1802-1)原報告所述，Μ Ηοχ3-2-或Ηοχ4-2-為引子，將約1微克聚腺苷酸化RNA反轉 錄。於接下來的PCR擴增反應中，除了六碳糖氧化酶特異 引子Ηοχ3-2-或Ηοχ4-2-外，分別使用套組的錨引子或連接 引子。所用緩衝劑和擴增條件主要如Maraton™ cDNA Am-Pi if icat ion Kit之原報告所述。PCR擴增反應係以Ampli -Taq (Perk in-E 1 mer Cetus)進行，使用Perk in-E lmer Ther-malcycler 480TM規畫rj程序為94〇C 1分鐘、55°C2分鐘和72 °C2分鐘共30個循環。取5微升反應混合液於1%瓊脂糖凝 膠中（SeaPlaque® GTG, FMC)進行之凝膠電泳顯示，引 子Hox4-2-的DNA片段大小約為600個鹼基對（bp);引子 Hox3-2-的為 700bp〇 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 這些DNA片段Μ使用市售商品套組（QIAEXTM Gel Ex-tration Kit,目錄編號20020, QIAGEN產品）之瓊脂糖凝 膠予Μ純化，如pT7 Blue T-Vector Ki t (Novagen產品， 目錄編號69829-1)之原報告所述，約100奈克片段連接於 50奈克質體pT7 Blue〇 大腸桿菌 DH5 oc (Life Technolo-g ies ,目錄編號530-8258SA)或大腸桿菌NovaB lue (Nova-gen產品）M此連接混合物轉形，再進一步分析其白色、重 組菌落。 得自此等菌落之質體DNA使用QIAGEN Plasmid Midi 57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 4388 8 7 A7 __B7五、發明説明（56 ) Kit (QIAGEN,目錄編號12143)予Μ純化，和使用Seque -nase (Sequenase Version 2*0 DNA Sequencing Kit, USB )進行DNA序列分析。DNA定序反應均M丙烯醯胺凝膠電泳 法進行（Sequencing Gel - Mix® 6, Life technologies) 。700 bp片段之DNA序列分析顯示具有234個胺基酸密碼容 量之開放譯讀架。 下面表3.2顯示，所有得自40 kD多肽之胜肽序列，亦 艮卩Η0Χ—2、 Η0Χ—3、 Η0Χ—4、 Η0Χ—5 禾口Η0Χ—6, ±句在得自 ifcb開 放譯讀架的234個胺基酸序列中被發現。因此推知，700bp 片段指令產生部分之六碳糖氧化酶基因。600bp>i段的DNA 序列被證實與700 bp片段近端的600 bp相同（見表3.2) Ο 同樣地ί吏用弓丨子!1〇父2—3+禾口Hox3—2—方$cDNA合成ftJPCR 擴增實驗中 〇 如 3,-Amplif inderTM RACE Kit (Clontech 產品，目錄編號K1801-1)原報告所述，2-為引子 ，將約50奈克聚腺登酸化RNA反轉錄。於接下來的PCR擴增 反應中，使用引子Hox2-3+和Hox3-2-。所用緩衝劑和擴增 條件主要如用於AmpliTaq聚合酶（Perkin-Elmer Cetus )和3’-AmplifinderTM RACE Kit 原報告所述。5微升PCR 擴增混合液之凝膠電泳顯示大小為407 bp之Η段。 如上述，將此片段純化、嵌入質體ΡΤ7 Blue中和定序 。此Η段的DNA序列被證實與700 bp片段末端的407 bp相 同。 使用3 TAmpl if inder™ RACE Kit (Clontech),以此 58 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T #. .Jn 11 . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 4388 8 7 Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（π ) 套組之錨引子為3 ’引子和以、六碳糖氧化酶特異引子Ηοχ5 + 和Ηοχ4+為基因特異5’引子，將700和407 bp片段之DNA下 游擴增。擴增所用媛衝劑和條件如上所述。pCR和反應混 合液於瓊脂糖凝膠上之分析顯示大小約1.3 kb之片段。如 上所述將此片段分離和進行DNA序列分析。此：U3 kb>1段 之DNA序列顯示具有357個胺基之開放譯讀架。此357個胺 基酸譯謓架含有 Η0Χ-1、Η0Χ-3、Η0Χ-4、H0X-5·、Η0Χ-7和 Η0Χ-8諸胜肽之胺基酸序列。因此推知，1·3 kb DNA片段 指令產生9 kD CNBr片段、29 kD多肽、和部分之六碳糖氧 化酶40 kD多肽。 使用六碳糖氧化酶5’端特異引子，Hox5’-1，和寡-（d T)引子一起以擴增假設之整個六碳糖氧化酶開放譯讀架。 使用PCR將基因擴增，如上所述嵌入pT7 Blue質體中，和 定序。此1.8 kb片段之DNA序列與上述諸片段之諸DNA序列 相似，差異很小。這些差異的原因可能由於PCR擴增期間 之混雜併入、Μ至少三個不相關的PCR擴增作用將整個六 碳糖氧化酶基因擴增和分離所引起。因此，下面表3.2中 圼現之DNA序列係由至少三個各自獨立地得到之DNA序列所 組成，Μ排除序列中之PCR誤差。 從上面1.8 kb DNA序列上的開放譯讀架得到的胺基酸 序列被證實含有所有上面Η0Χ胜肽，亦即Η0Χ-1至H0X-8。 因此，1*8 kb DNA序列指令產生從角叉菜得到的六碳糖氧 化酶之9 kD、29 kD和40 kD片段。所得此開放譯讀架多肽 之分子量與多肽為二聚體六碳糖氧化酶分子次單元（可能 59 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 4 3 88 8 7 A7 B7 ___ 五、發明説明（58 ) 為單體片段）之假設一致。 H角叉菜尺似夕北方由印跡分^ 將得自角叉菜之總RNA進行北方氏印跡分析。如上述 (3.1)將RNA純化，於變性甲醛瓊脂糖凝膠上區分，並如 Sambrook等（1989)所述，印跡於 HybondC 滤膜（Amer-sham產品）上。使用Hox2-3+和Hox3-2-為引子，如上述 (3.4)合成400 bp DNA Η段。如Sambrook等（參照前文 )所述，將此片段以1.2%瓊脂糖凝膠（3的卩139110©〇丁〇 ,FMC)純化，並Μ 3 2P標記之。此放射活性六碳糖氧化酶 特異雜交探针係用來探測北方氏印跡。雜交條件為： 3.5.1·——預雜夺：於含有10 X鄧哈氏溶液（Denhardt’s solution) (0, l%Ficol 1、0* 1%聚乙稀啦咯燒0同、〇· 1 %牛血清白蛋白）、2 X SSC (1 X SSC為0.15 Μ氯化鈉、 0·15 Μ檸懞酸鈉，pH 7·0)、0·1%硫酸十二酯鈉（SDS) 、和50微克/毫升變性鮭魚精DNA)之媛衝液中，65eC，預 雑交兩小時。 於含有1 X鄧哈氐溶液、2 X SSC、0·1 % 葡聚糖硫酸鹽、和50微克/毫升變性鞋魚精DNA、和3 2Ρ-標 記探針（大約l〇s dpm/毫升）之緩衝液中，65°C,雜交至 少14小時。於65°C,在2 X SSC、0.1% SDS中將濾膜洗10 分鐘兩次，然後於65°C在1 X SSC、0·1% SDS中洗10分潼 兩次。最後一次方$65°C，在0·2 X SSC、0·1% SDS中洗10 分鐘後，將減膜包在Saran Wrap中，使用Siemens-Titarx HS加強篩，於-8(TC,暴露於X-射線膜（Kodak XAR2)兩 60 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 438887 A7 B7 五、發明説明（59 ) 天。產生之放射顯影圖（圖8)顯示出具有大約2 kb大小 之暗帶。表3.2. 1 -8 kb DNA序初f之梭赛序芕fflgg得自禽玄ΠΝΑΙ^初[具 有54R個防某酿之六碳糖齡ih脑防某醏席利聞协鹽識樓 TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTCTG GTACCGTGTA TGTCAAAGGT TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACG ATG GCT ACT CTT CCT CAG AAA GAC CCC Met Ala Thr Leu Pro Gin Lys Asp Pro 1 5 GGT Gly TAT ATT GTA ATT GAT GTC AAC GCG GGC ACC GCG GAC AAG CCG GAC Tyr lie Val lie Asp Val Asn Ala Gly Thr Ala Asp Lys Pro Asp 10 15 20 25 CCA CGT CTC CCC TCC ATG AAG CAG GGC TTC AAC CGC CGC TGG ATT GGA Pro Arg Leu Pro Ser Met Lys Gin Gly Phe Asn Arg Arg Trp lie Gly 30 35 40 ACT AAT ATC GAT TTC GTT TAT GTC GTG TAC ACT CCT CAA GGT GCT TGT Thr Asn lie Asp Phe Val Tyr Val Val Tyr Thr Pro Gin Gly Ala Cys 45 50 55

Thr Ala Leu Asp Arg Ala Met 60 GAA Glu

Lys Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg 65 70 ATC GTC TCT GGC GGC CAT TGC TAC GAG GAC TTC GTA TTT GAC GAA TGC lie Val Ser Gly Gly His Cys Tyr Glu Asp Phe Val Phe Asp Glu Cys 75 80 85 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 GTT Val

Val Lys Ala 11© lie Asn Val Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyx Asp 90 95 100 105 GAC GAT AGG GGT TAC TTC GTC AGC AGT GGA GAT ACA AAT TGG GGC TCC Asp Asp Arg Gly Tyx Phe Val Ser Ser Gly Asp Thr Asn Trp Gly Ser 110 115 120 TTC AAG ACC TTG TTC AGA GAC CAC GGA AGA GTT CTT CCC GGG GGT TCC Phe Lys Thr Leu Phe Arg Asp His Gly Arg Val Leu Pro Gly Gly Ser 125 130 135 TGC TAC TCC GTC GGC CTC GGT GGC CAC ATT GTC GGC GGA GGT GAC GGC Cys Tyr Ser Val Gly Leu Gly Gly His lie Val Gly Gly Gly Asp Gly 140 145 15061 60 110 158 206 254 302 350 398 446 494 542 m ilrrirrU ^ I 酬 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0Χ297公釐） _人 4 388 8 7 A7 B7 五、發明説明（60 ) ATT TTG GCC CGC TTG CAT GGC CTC CCC GTC GAT TGG CTC AGC GGC GTG lie Leu Ala Arg Leu His Gly Leu Pro Val Asp Trp Leu Ser Gly Val 155 160 165 GAG GTC GTC GTT AAG CCA GTC CTC ACC GAA GAC TCG GTA CTC AAG TAT Glu Val Val Val Lys Pro Val Leu Thr Glu Asp Ser Val Leu Lys Tyr '70 175 180 185 GTG CAC AAA GAT TCC GAA GGC AAC GAC GGG GAG CTC TTT TGG GCA CAC Val His Lys Asp Ser Glu Gly Asn Asp Gly Glu Leu Phe Trp Ala His 190 195 200 ACA GGT GGC GGT GGC GGA AAC TTT GGA ATC ATC ACC AAA TAC TAC TTC Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn Phe Gly lie lie Thr Lys Tyr Tyr Phe 205 210 215 AAG GAT TTG CCC ATG TCT CCA CGG GGC GTC ATC GCA TCA AAT TTA CAC Lys Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Gly Val lie Ala Ser Asn Leu His 220 225 230 TTC AGC TGG GAC GGT TTC ACG AGA GAT GCC TTG CAG GAT TTG TTG ACA Phe Ser Trp Asp Gly Phe Thr Arg Asp Ala Leu Gin Asp Leu Leu Thr 235 240 245 AAG TAC TTC AAA CTT GCC AGA TGT GAT TGG AAG AAT ACG GTT GGC AAG Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Arg Cys Asp Trp Lys Asn Thr Val Gly Lys 250 255 260 265 590 638 68 i；-·· & 73 782 830 878 4· 訂 TTT CAA ATC TTC CAT CAG Phe Gin lie Phe His Gin 270 GCA Ala GCG GAA GAG TTT GTC ATG TAC TTG TAT Ala Glu Glu Phe Val Met Tyr Leu Tyr 275 280 926 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 ACA TCC TAC TCG AAC GAC GCC GAG CGC GAA GTT GCC CAA GAC CGT CAC Thr Ser Tyr Ser Asn Asp Ala Glu Arg Glu Val Ala Gin Asp Arg His 285 290 295 TAT CAT TTG GAG GCT GAC ATA GAA CAG ATC TAC AAA ACA TGC GAG CCC Tyr His Leu Glu Ala Asp lie Glu Gin lie Tyr Lys Thr Cys Glu Pro 300 305 310 ACC AAA GCG CTT GGC GGG CAT GCT GGG TGG GCG CCG TTC CCC GTG CGG Thr Lys Ala Leu Gly Gly His Ala Gly Trp Ala Pro Phe Pro Val Arg 315 320 325 CCG CGC AAG AGG CAC ACA TCC AAG ACG TCG TAT ATG CAT GAC GAG ACG Pro Arg Lys Arg His Thr Ser Lys Thr Ser Tyr Met His Asp Glu Thr 330 335 340 345 ATG GAC TAC CCC TTC TAC GCG CTC ACT GAG ACG ATC AAC GGC TCC GGG Met Asp Tyr Pro Phe Tyr Ala Leu Thr Glu Thr lie Asn Gly Ser Gly 350 355 360 CCG AAT CAG CGC GGC AAG TAC AAG TCT GCG TAC ATG ATC AAG GAT TTC Pro Asn Gin Arg Gly Lys Tyr Lys Ser Ala Tyx Met lie Lys Asp Phe 365 370 375 974 1022 1070 1118 1166 1214 62 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 丨歸λ] 4388 87 A7 B7 五、發明説明（61 ) CCG GAT TTC CAG ATC GAC GTG ATC TGG ΆΆΑ TAC CTT ACG GAG GTC CCG Pro Asp Phe Gin He Asp Val He Trp Lys Tyr Leu Thr Glu Val Pro 380 385 390 1262 GAC GGC TTG ACT AGT GCC GAA ATG AAG GAT GCC TTA CTC CAG GTG GAC Asp Gly Leu Thr Ser Ala Glu Met Lys Asp Ala Leu Leu Gin Val Asp 405 1310 395 400 ATG TTT GGT GGT GAG ATT CAC AAG GTG GTC TGG GAT GCG ACG GCA GTC Met Phe Gly Gly Glu lie His Lys Val Val Trp Asp Ala Thr Ala Val 410 415 420 425 GCG CAG CGC GAG TAC ATC ATC AAA CTG CAG TAC CAG ACA TAC TGG CAG Ala Gin Arg Glu Tyr lie lie Lys Leu Gin Tyr Gin Thr Tyr Trp Gin 430 435 440 GAA GAA GAC AAG GAT GCA GTG AAC CTC AAG TGG ATT AGA GAC TTT TAC Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val Asn Leu Lys Trp lie Arg Asp Phe Tyx 445 450 455 1358 1406 1454

1502 GAG GAG ATG TAT GAG CCG TAT GGC GGG GTT CCA GAC CCC AAC ACG CAG Glu Glu Met Tyx Glu Pro Tyr Gly Gly Val Pro Asp Pro Asn Thr Gin 460 465 470 GTG GAG AGT GGT AT^A GGT GTG TTT GAG Val Glu Ser Gly Lys Gly Val Phe Glu 475 480 GGA Gly TGC TAC TTC AAC TAC CCG Cys Tyr Phe Asn Tyr Pro 485 1550 GAT GTG GAC TTG AAC AAC TGG AAG AAC GGC AAG TAT GGT GCC CTC Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu 490 495 500 GAA Glu 505 1598 CTT TAC TTT TTG GGT AAC CTG AAC CGC CTC ATC AAG GCC AAA TGG TTG Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu Asn Arg Leu lie Lys Ala Lys Trp Leu 510 515 520 1646 TGG GAT CCC AAC GAG ATC TTC ACA AAC AAA CAG AGC ATC CCT ACT AAA Trp Asp Pro Asn Glu lie Phe Thr Asn Lys Gin Ser lie Pro Thr Lys 525 530 535 1694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CCT CTT AAG GAG CCC AAG CAG ACG AAA TAGTAGGTCA CAATTAGTCA Pro Leu Lys Glu Pro Lys Gin Thr Lys 540 545 1741

TCGACTGAAG TGCAGCACTT GTCGGATACG GCGTGATGGT TGCTTTTTAT 63 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 4 3 bB 8 7 A7 _ B7 五、發明説明（62 ) 於表3.2所示之胺基酸序列中，阳¥-1至阳\-8胜肽以 粗體鉛字印刷或在字下面劃線之密碼示之。粗體印刷密碼 代表已利用胜肽胺基酸定序證實之胺基酸基團。下面劃線 之密碼代表得自核音酸序列、惟尚未由相關HOX胜肽定序 證實之胺基酸基團。 H0X-1為461-468胺基酸基團、HOX-2為92-114基團、 H0X-3為219-234基團、H0X-4為 189-202基團、HOX-5為215 -218基團、Η0Χ-6為8-22基團、Η0Χ-7為434-444基團和Η0Χ -8為452-460基團 〇 實例4 莉揉斤德墨赤職S：半產重組六碳糖氯化酶 n傾重日六碳糖氣化酶宑pq浙德舉赤酵母表規之載體之 mm 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將如表3·2所示指令生合成角叉菜六碳糖氧化酶之開 放譯讀架嵌入一巴斯德畢赤酵母表現載體，PPIC3 (Rese -arch Corporation Technologies, Inc * , Tucson, Ar i-zona 85711-3335)中。此質體含有醇氧化酶啟動子（aoxl 啟動子）和來自巴斯德畢赤酵母之轉錄終止信號（分別如 圖9中之aoxp和aoxt)。載體上之his4 +基因可用於挑選出 His +重組巴斯德畢赤酵母細胞。此表現匣轉形入巴斯德畢 赤酵母時，即整合入染色體DNA中。帶有表現匣（於aoxl 啟動子K游嵌入角叉菜六碳糖氧化酶基因）之巴斯德舉赤 酵母细胞，可利用加入aoxl啟動子誘導物，甲醇，而被誘 64 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 438887 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 Α7 Β7 五、發明説明（63) 導產生六碳糖氧化酶。巴斯德畢赤酵母變異株-KM71 (其 於主要酵氧化酶基因，aoxl,有缺陷）可用來作為六碳糖 氧化酶基因之受體菌（Cregg與Madden 1987; Tschopp等 1987 )。然而，巴斯德畢赤酵母含有另一個醇氧化酶基 因，aox2，也受甲酵之誘導。因此，帶有六碳糖表琨匣之 重备且巴斯德畢赤酵母轉形株，在添加甲醇時，將產生六碳 糖氧化酶和醇氧化酶兩種氧化酶。 在將六碳糖氧化酶基因嵌入表現載體PPIC3前，先修 改開放譯讀之5’端和3,端序列。利用第一股cDNM乍為PCR 之模板。使用特異於開放譯讀架5,端，Hox5，-1 (表3.1) 之合成寡核苷酸為PCR引子，及特異於指令生合成角叉菜 六碳糖氧化酶之3,端序列之引子（Hox3，-1)。Hox3，-l引 子之序歹(J為5 ’ -ACCAAGTTTATAAAAAGCAACCATCAC-3 ’ 〇 PCR擴 增係利用GeneAmp® PCR試劑套組及Ampl iTaq® DNA聚合酶 (Perkin - Elmer Cetus 產品）進行之。PCR 程序為 94〇C30 秒、55°C30秒及72°C2分鐘共30循環。反應混合物之凝膠 電泳顯示大小約1.7 kb之色帶。將此1.7 kbM段嵌入載體 pT7 Blue (Novagen產品）（質體pPUP0150)中，進行DNA 定序。 如圖9所示將指令生合成角叉菜六碳糖氧化酶之片段 進一步次選殖到巴斯德畢赤酵母表現載體PPIC3中（Clare 等，1991)。將帶有六碳糖氧化酶基因之質體pT7 BlueM 限制核酸內切酶Ndel切割，端點Μ主要如Sambrook等（ 1989)所述之法，MKlenow DNA聚合酶予Μ磨平。加熱使 65 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 4388 8 7 A7 B7 五、發明説明（Q ) DNA聚合酶失活（Sambrook等，1989)後，進一步M EcoRI 切割DNA,將含六碳糖氧化酶基因之DNA片段於壤脂糖凝膠 上純化，得到鈍端EcoRI DNA片段（QIAEXTM, QIAGEN)。 Μ限制酶SrmBI和EcoRI切割巴斯德畢赤酵母表現載體 PPIC3後，於瓊脂糖凝膠上予以純化。將純化載體與指令 生合成六碳糖氧化酶之片段連接，以主要如Sambrook等（ 1989)所述之法，將連接混合物轉形到大腸桿菌DH5oc ( Life Technologies產品）中。所生成含有得自角叉菜六 碳糖氧化酶基因之表現載體，質體PUP0153,進行DNA定序 ,Μ確定於次轉殖過程中，六碳糖氧化酶基因未發生變異 Ο 將質體PUP0153自大腸桿菌DH5oc中純化，再利用電穿 孔法（畢赤酵母表現系統，菲立浦石油分公司產品）或使 用 The Pichia Spheroplast Module ( Inv itrogen, San Diego, USA,目錄編號K1720-01)將其引入巴斯德畢赤酵 母中。以不能利用甲醇之巴斯德畢赤酵母變異株，KM71 ( 基因型 his4，aoxl ： : ARG4 ) (Cregg 與 Madden 1987 ； Tschopp等，1987)為受體菌。利用PCR,從不含組纖胺之 洋菜平板培養基上選出之重組巴斯德畢赤酵母菌落中，篩 選含六碳糖氧化酶基因者。除了特異於巴斯德畢赤酵母醇 氧化酶啟動子和轉錄終止信號之引子（Invitrogen產品， 目綠編號分別為M710-02和N720-02)夕卜，也使用特異於六 碳糖氧化酶之引子（表3.1)。 含PUP0153之巴斯德畢赤酵母KM71菌株試樣於1996年5 66 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ，438887 A7 _ B7 丨| " " ....... 1 .........丨· ' 1 Μ· 和" _丨 1 ' 11 1 _丨丨...... I·— 五、發明説明（65) 月 23 日寄存在德國Deutsche Sammlung von Mikroorgani -smen und Zellkulturen (DSM) , Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig,接受編號DSM 10693；及 1996年6 月24日寄存在中華民國臺灣新竹食品工業研究所（FIRD I), 接受編號CCRC 920011。 4,2.重gfl六碳糖氨化胞存田斯1德墨赤酵扭中之表壬鼠 將含表現匣（具有嵌入aoxl啟動子和轉錄終止信號之 間之六碳糖氧化酶基因）之巴斯德畢赤酵母菌株KM71於含 MD (每升含1.34克酵母氮基（Difco產品，目錄編號0919-15 - 3)、0.4毫克/升生物素、0.1%精胺酸和20克/升葡萄 糖）之振邇瓶中培養。含有150毫升培養液之1升振通培養 瓶於旋轉式振培養箱中，於3CTC, 300rpm培養。當细胞 密度達= 15-20時，M6,000 X g離心10分鐘收集 菌體後，再懸浮於相同容積（150毫升）之誘導培養基： ΜΜ (1·34克/升酵母氮基、0·4毫克/升生物素、0.1%精胺 酸和1%甲醇）中。生長兩天後，追加甲醇（0.5%)以補 充消耗和蒸發之甲醇。 誘導三或四天後，離心（6,000 X g )收集细胞，將 细胞再懸浮於約1/5生長容積之50 mM Tris-Cl，pH 7*5中 。將此懸浮細胞置於冷處直到利用FRENCETM Press (SLM Instruments, Inc. , Rochester，Ν·Υ·) δ皮壞细胞為止 〇 於 20Κ FRENCH™ Press Cell中，20, OOOpsi 壓力下， 打破細胞。於5°C, Kl〇,〇〇〇 x g雛心10分鐘，澄清细胞 萃取液。小心地移出含六碳糖氧化酶之上澄液，根據下述 67 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

438887 A7 ____B7 五、發明説明（66 ) 方法進行純化。 L 3.巴逝癍畢赤酵母重組六碳鋪氬化酿之純化 4· 3· 1.第一步，陰離子交換層析法 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將經FRENCH壓機均質化之澄清均化液（100-150毫升） 於裝有預裝填Q-Sepharose High Performance (Pharmacia 產品）的兩個5毫升HiTrap-Q管柱之FPLC:系統上進行陰離子 交換層析法。將管柱順序連接，於室溫進行色層分析。管 柱先M媛衝液A:20mMTris-Cl,pH7*5平衡。施加試樣 時，流速為1.25毫升/分鐘，沖洗及流洗時，流速為2.5毫 升/分鐘。施加試樣後，M30毫升媛衝液A沖洗管柱。然後 用200毫升從緩衝液A到緩衝液B: 20 mM Tris-C1、750 mM NaCl，pH 7·5之梯度流洗吸附之蛋白質。於沖洗和梯度流 洗過程中，收集區分，每區分2毫升。如上面實例1.3所述 (試樣10微升，保溫時間15分鐘）檢測各區分之六碳糖氧 化酶活性。也檢測各區分之醇氧化酶（Α0Χ )活性，檢測 方法除了Μ0.5%甲醇取代0·05 Μ葡萄糖為受質外，其他 均與六碳糖氧化酶檢測法相同。如圖1 〇所示之活性變化顯 不，Α0Χ與Η0Χ在鹽濃度為約400 mM NaCl時，同時被流洗 出來。收集含六碳糖氧化酶之諸區分並貯存於4。<〇。 4.3.2.第二步，凝膠過滤法 將純化第一^步之收集液（20-30毫升）於4°C ,在Cen-tr iprep濃縮機（Amicon，USA，公稱分子童斷流3〇, 〇〇〇) 中，以雛心式超離心法濃縮成約3.5毫升。經濃縮之六碳 糖氧化酶製劑以雛心法澄清，上澄液以甘油混合至最終濃 68 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 4388 8 7 A7 B7 五、發明説明（67 ) 度為5%。使用與管柱入口連接之SA-5試樣施加器（Phar-macia產品）將試樣施加於管柱上。於4°C，在管柱床容積 為350毫升之XK 26/70管柱（2.6 X 66公分，Pharmacia產 品）上進行凝膠過濾。管柱根據廠商指示裝填篩分丙烯基 S-200 HR (Pharmacia產品）。緩衝液為20 mM Tris-Cl、 500 πιΜ NaCl, pH 7·5,蠊動P1-泵（Pharmacia產品）設 定於0 · 5毫升/分鐘。記錄280奈米之UV吸光度。收集區分， 每區分2.5毫升，如上述（試樣10微升，保溫時間15分鐘 )檢測各區分之六碳糖氧化酶活性和醇氧化酶活性。圖11 之活性變化明顯示出Α0Χ與Η0Χ活性分開。此乃凝膠過滤之 預期結果，因根據1.8節所述，得自像巴斯德畢赤酵母這 類甲基利用酵母之醇氧化酶原態分子量為約600,000 (Sahm & Wagner, 1973),而Η0Χ 之原態分子量約 110,000-130,000 。重組Η0Χ之流洗容積與前述使用相同管柱之角叉菜原態 Η0Χ之流洗容積相同（1·7和1.8節）。因此，重組Η0Χ似與 直接自角叉菜分雛之原態Η0Χ有相同之分子量。收集含六 碳糖氧化酶之諸區分並貯存於4°C。 4、3·3·第三步，Mono管柱之陰離子交換層析法 將第二步之收集液利用備有Mono Q HR 5/5管柱（管柱 床容積1毫升）之FPLC条統之陰離子交換層析法進一步純化 。管柱先以緩衝液&:2〇1!^1>13-(：1,01^7.5平衡。流速 為1毫升/分鐘。將第二步之收集液用預先裝填篩分多醣G-25之管柱（PD-10, Pharmacia產品）於緩衝液A中以凝膠 過濾法脫鹽。胞加試樣後，K30毫升,緩衝液A沖洗管柱。 69 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 辞· 438887 A7 B7 五、發明説明（68 ) 然後用20毫升從〇%到100%緩衝液B: 20mM Tris-C1、500 mM NaCl, pH 7.5之梯度流洗吸附之蛋白質。收集區分， 每區分0*5毫升，如上述（試樣1〇微升，保溫時間15分鐘 )檢測各區分之六碳糖氧化酶活性。收集含六碳糖氧化酶 之諸區分並貯存於4°C。 4.3.4.第四步，層析聚焦法 將上面第三步之收集液根據實例1.13所述，惟省略苯 基篩分瓊脂糖吸附步驟，利用於Mono P HR 5/5管柱上之 層析聚焦法予Μ純化。比較均經層析聚焦法之最後純化步 驟所得之原態及重組六碳糖氧化酶，發現得自巴斯德畢赤 酵母之重組六碳糖氧化酶與從角叉菜分離之原態型式有相 同之比活性。如上所述，用SDS-PAGE分析含有六碳糖氧化 酶之區分和以Coomassie Br i 1 1 iant Blue R-250進行凝膠 染色。此純化重組六碳糖氧化酶製劑，係由分別移動到40 kD及29 kD的兩條蛋白質帶所組成。 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 總之，重組六碳糖氧化酶可自宿主生物巴斯德畢赤酵 母分離和純化。在SDS-PAGE上，此重組、純化酵素展琨與 得自角叉菜之對應原態酵素之於40 kD和29 kD之相同色帶 Ο 4♦也—B斯墨赤赌g：重_六50艘氬彳卜_夕神雷 重組六碳糖氧化酶（rHOX)胜肽片段之產生與胺基酸 序列分析 如實例2.4所述，將純化rH0X用於製備式SDS-PAGE， 並電轉印到PVDF膜上。如實例2.5所述，將生成之40 kD和 70 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 438887 A7 B7 五、發明説明（69 ) 29 kD色帶進行與PVDF結合的六碳糖氧化酶多肽之酵素分 解。如實例2.7所述，利用逆相液態層析法將胜肽Η段分 雛。如實例2· 3所述，選取分開良好且童多之胜肽，利用 自動Edman分解法（1〇個步驟）分析胺基酸序列。所得胺 基酸序列示於表4. 1。 志H刺用席利分析源自於巴斯德墨赤赌扭中表規之重 細六石炭糠氬化脑之40 kD與29 kD多壯夕番白肉t刀酶Lys-C ΒΦΗ太所得肿吐席罚t 定序胜肽 起源 序列鑑定 胺基酸序列 步驟編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 40 kD Η0Χ - 9胜肽 D P G Y I V I D V N 29 kD Η0Χ -10胜肽 L Q Y Q T Y W Q E E 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 Y L T E V P D G L T 一 _ 重組40 kD多肽之ΗΟΧ-9胜肽系列顯示如表3.2所示角_ 叉菜六碳糖氧化酶Aspx8到Asm 7相同之胺基酸序列。而得 自重組29 kD多肽之胜肽試樣顯示每一步有兩個基團。由 胺基酸鑑定結果顯示，試樣中存在兩個胜肽，分別與角叉 菜六碳糖氧化酶之胺基酸序列對應於Leu434到Gluw3及 丁；5^1"3 8 8到1[1111^3 3 7(見表3*2)。 因此可推知，重組六碳糖氧化酶之胜肽糸列與角叉菜 71 个、、、氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

•I 438887 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（) 原態六碳糖氧化酶對應之胺基酸序列相同。 此外，可推知Μ角叉菜六碳糖氧化酶基因轉形之巴斯 德畢赤酵母，具有製造重組六碳糖氧化酶之能力。 4.4.1.受質特異性 使用一些最終濃度為0.1 Μ的糖，檢驗方法如上述， 比較巴斯德畢赤酵母重組六碳糖氧化酶與角叉菜原態六碳 糖氧化酶之受質特異性，其相對速率如表4.2所示。 类H方令巴斯矛襄墨赤_进中弃据!夕蚩組六碳糖氣化酶 艾键原氛g六碳編氬勞皙Φ弃里f牛 相對速率 受質 重組酵素 原態酵素， 原態酵素， Sullivan & Ikawa, 1973 D-葡萄糖 100 100 100 D-半乳糖 75 75 82 麥芽糖 57 37 40 纖維二糖 51 33 32 乳糖 38 25 22 $ .................. Μ ................... ................................... _麵^ - 如表4· 2所示，重組六碳糖氧化酶之受質特異性幾乎 與原態酵素完全相同。然而，雖然兩種酵素型對雙醣之相 對速率下降依序均為麥芽糖、纖維二糖和乳糖，但重組酵 素氧化這些雙醣的能力選擇性似乎差些。原態酵素的结果 與較早由Sullivan等（1973)發表之數據幾乎完全相同。 72 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) Α4規格（210><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4

、1T 抑制作用（％) 抑制劑濃度 重組酵素 原態酵素 0.1 mM 96 95 0*01 mM 39 41 1 438887 A7 _____B7 __ 五、發明説明（71 ) 4·4·2.二乙基二硫胺申酸納夕抑削作用

Sullivan與Ikawa (1973)指出，角叉菜六碳糖氧化 酶受二乙基二硫胺甲酸鈉之強烈抑制。玆比較巴斯德畢赤 酵母重組六碳糖氧化酶與角叉菜原態酵素受此銅結合化合 物之抑制情形。如Sullivan與Ikawa (1973)所述，酵素 檢測液中使用〇·1 mM及〇.〇1 mM兩種抑制劑濃度，其结果 摘示於表4.3。 _4.3.二乙基二硫胺申酴納對F°t斯德墨赤赌扭蚩組六碳糖 氣化酶及角叉菜原態六硝辘氬化_酵素活件夕彻制效應hh

A .:1 由表4.3看出，重組及原態六碳糖氧化酶對二乙基二 硫胺甲酸納之抑制作用有相同的敏感度。此外，這些結果 與Sullivan與Ikawa (1973)發表有關原態六碳糖氧化酶 之數據相同。 實例5 禾【1用士瞧揑鋪社:基重組六石療摧氧4卜1酶 m共—細六碳艘醃於f腸棒菌— 中表据1夕舖f醬之織鏠 將如表3.2所示指令生合成角叉菜六碳糖氧化酶之開 73 ----—________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 ' 4388 8 7 A7 ____B7 五、發明説明（72 ) 放譯讀架嵌入大腸桿菌表琨載體，pET17b (N〇vag;en產品， 目錄編號69726-1)中。質體中含強誘導性随菌體T7啟動 子和T7轉錄終止信號。如果質體在特殊大腸桿菌宿主细胞 ，例如菌株BL21CDE3) (Novagen產品，目錄編號69387-1) 中增殖時，則嵌入這些控制元件之間的基因，可利用添加 冷-D- BH；喃型半乳糖硫普（IPTG)而予Μ表現。 為了要將基因嵌入表現載體pET17b中，乃修飾六碳糖 氧化酶基因之5 ’及3 ’端。以特異於六碳糖氧化酶基因之5， 及3’端為引子，利用PCR將六碳糖氧化酶基因分離。γ端 引子（Hox5’-2)之DNA序列為5’- ATGAATTCGTGGGTCGAAGAGCCC-3 τ ,特異於3 ’端之引子為Ηοχ 3’-1。使用得自角叉菜之第一股cDNA作為模板，PCR擴增 作用乃如實例4· 1所述，使用Amp 1 iTaq® DMA聚合酶（Per-kin-Elmer Cetus產品）進行之。反應混合物之凝膨電泳 顯示具有大小約1.7 kb之色帶。將此1*7 kb片段嵌入載體 pT7 Blue (Novagen產品）中，得到質體plIP0161。 圖12所示為將六碳糖氧化酶基因之5’端修飾後，再將 其次轉殖入大腸桿菌表現載體中。利用PCR將5’端修飾， 使正好於ΜΌ轉譯起點嵌入Ndel位置。序列為5’-CAGGAATTCATATGGCTACTCTTCCCCAGAAAG-3 ’ 之寡核替酸 Ηοχ 5’-4，與寡核登酸Ηοχ13-(序列編號：28)(表3·1) —起 使用。PCR擴增方法如實例4.1所述。反應混合物於2%瓊 脂糖上區分分離，如實例3.4所述，將六碳糖氧化酶特異 之180 bp片段純化。Μ限制核酸内切酶Clal與EcoRI切割 74 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T ? 438887 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（73 此180 bpH段，再與用相同酵素切割之PUP0161連接，得 到質體PUP0167。 將質體PUP0167中之六碳糖氧化酶基因再次轉殖以構 築大腸桿菌之六碳糖氧化酶表現載體。以酵素如㊀1與BamHI ，及酵素BamHI與Sail切割質體PUP0167。第一個反應生成 指令生合成5 ’端及六碳糖氧化酶基因中間部分之1*6 kb片 段，而酵素BamH I與Sa 11之反應則生成指令生合成六碳糖 氧化酶基因3’端之200 bp片段。將此二六碳糖氧化酶特異 片段根據實例3.4所述之法，於瓊脂糖凝膠上予Μ純化， 並與以限制核酸內切酶Ndel與Xhol切割之質體pET17b連接 。帶有六碳糖氧化酶基因之質體pET17b MpIIP0181示之。 由DNA定序顯示，在分雛及轉殖過程中，六碳糖氧化酶基 因未發生變異。 5.2.重組六碳摧氬fh酺亦f腸程蘭中之表琨 利用標準轉形法（Sambrook等，1989)將質體PUP0181 引入大腸桿菌菌株BL2UDE3) (Novagen產品）中。使细胞 於含LB培養基（Sambrook等，同上）之振盪瓶中生長。細 胞密度達0DetJ(J = 〇·5時，添加10—3M IPTG以誘導细胞表 現重組六碳糖氧化酶。添加IPTG—小時後，離心收集細胞 ，懸浮於試樣緩衝液中，如實例1.1〇所述進行SDS-PAGE。 電泳結果示於圖13。因質體PUP0181表現重組六碳糖 氧化酶酵素，使大腸桿菌粗萃取液在分子量為62 kD處， 出現顯著的蛋白質色帶。此62 kD色帶與由開放譯讀架推 沏I之轉譯產物之分子量相同。未轉形之大腸桿菌细胞則未 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 Λ 4388 8 7 Α7 Β7 五、發明説明（ 出現此等62 kD蛋白質。 含PUP0181之大腸桿菌BL21(DE3)試樣，於1996年5月 23 日寄存在德國Deutsche Sammlung von M ikroorgan is men und Ze11ku1turen (DSM) , Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig,接受編號 DSM 10692；及 1996年 6 月 24 日寄 存在中華民國臺灣新竹食品工業研究所（FIRDI),接受編 號CCRC 910056〇 實例6 泡[用酿、酒酵母生產重組六腺蝻璧：fh胞 6.1.供重姐六S炭糖氯化酶於_洒_扭中表現夕戧體夕織· 將如表3·2所示指令生合成角叉菜六碳糖氧化酶之開 放譯讀架嵌入酵母菌表琨載體，PYES2 (Invitrogen產品， 目錄編號V825-20)中。質體PYES2為設計用來誘導重組蛋 白質於釀酒酵母中表琨之高套數附加載體。此載體含有來 自釀酒酵母，供高標準、緊密調控轉錄之Gall基因之上游 活化和啟動序列。轉錄終止信號則來自CYC1基因。 為了要將基因嵌入表現載體PYES2中，乃修飾得自角 叉菜六碳糖氧化酶基因之5’及3’端。如實例4.1所述（圖9) ,將六碳糖氧化酶基因自質體PUP0150分離。如前述將六 碳糖氧化酶基因分離於鈍端EcoRI DNA Η段上，將其嵌入 Μ酵素PvuII和EcoRI切割之質體pYES2中（圖14)。測定 所得質體PUP0155之DNA序列Μ證實於轉殖過程中未發生變 異。 76 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 438887 A7 Β7 五、發明説明（75 ) 自大腸桿菌DH5oc純化質體PUP0155,利用電穿孔法（ Grey與Brendel 1992)將其轉形到釀酒酵母中。得到之菌 株PAP1500(基因型 oc、ura3-52、trpl::GAL10-GAL4、lys 2-801、1βα2Δ1-. his3A200. pep4: :HIS3·、prblAl-6R, canl. GAL) (Pedersen等，1996)作為受體菌 〇 重名日六碳糖氩彳卜酶在_洒_扭中夕宪1；目 根據Petersen等（1996)所述之法培養含質體plIP0155 之酿酒酵菌菌株1500，並M2%半乳糖進行誘導。誘導三 天後，如實例4.2所述，離心收集細胞並溶解之。如上面 實例1· 3所述，使用鄰聯（二）茴香胺檢測粗萃取液之六碳 糖氧化酶活性。表6.1顯示帶有六碳糖氧化酶基因之釀酒 酵母細胞具有表現活性六碳糖氧化酶之能力。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 表6.1 .禾【I用酿洒酵Q：生產重客日六石赓糖氣ibis 酿酒酵母 受質 +六碳糖氧化酶基因 未重組對照組 D-葡萄糖 + + 0 D-半乳糖 + 0 不含受質 0 0

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0 ==未具檢測活性 含質體PUP0155之釀酒酵母菌株1500試樣於1996年5月 23 日寄存在德國Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) , Mascheroder Ueg lb,D-38124 Braunschweig，接受編號 DSM 10694;及 1996年 6 月 24 曰寄 存在中華民國臺灣新竹食品工業研究所（FIRDI)，接受編 號CCRC 920010〇 77 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 438887 A7 B7 五、發明説明（76 ) 參考文獻 1. Barkholt, V. and A.L. Jensen 1989· Amino Acid Analysis： Determination of Cysteine plus Half-Cystine in Proteins after Hydrochloric Acid Hydrolysis with a Disulfide Compound as Additive. Analytical Biochemistry 177:318-322. 2. Bean, R.C. and W. Z. Hassid 1956. J. Biol. Chem· 218:425-436· 3. Clare, J J·, F.B. Rayment, S.P· Ballantine, K· Sreekrishna and M*A. Romanos 1991· High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia. pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene· Bio/Technology 9 ： 455-460. 4. Cregg, J.M. and Κ·Ν· Madden 1987. Development of transformation systems and constiruction of methanol-utilisation-defective mutants of Pichia pastoris by gene disruption· In: Biological Research on Industrial Yeast, Vol III. Stew-art, G. G. et al. (Eds.) . pp 1-18· CRC Press, Boca Raton, FL. 5. Fernandez, J. et al. 1992. Internal Protein Sequence Analysis： Enzymatic Digestion for Less Than 10 pg of Protein Bound to Polyvinylidene Difluoride or Nitrocellulose Membranes .Analytical Biochemistry, 201:255-264. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6. Fernandez, J. et al. 1994. An Improved Procedure for Enzymatic Digestion of Polyvinylidene Difluoride-Bound Pro-teins for Internal Sequence Analysis· Analytical Biochemistry, 218:112-117. 7. Groppe, J.C· and D.E. Morse 1993·工solation of full-length RNA templates for reverse transcription from tissues rich in RNase and proteoglycans, Anal. Biochem. # 210 ： 337-343 · 备_

78 稱病 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 438887 A7 B7 五、發明説明（77 8· Kerschensteiner, D.A· and G.L. Klippenstein 1978· Purification, Mechanism, and State of Copper in Hexose Oxidase. , Federation Proceedings 37:1816 abstract· 1 9. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during^ the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature (London) 227:680-685. 10. Pedersen P.A., J,H. Rasmussen, and P.L·· Jorgensen. 1996. Expression in high yield of pig aljSl Na,K-ATPase and inactive mutants D369N and D807N in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol· Chem· 271: 2514-2522· 11. Rand, A.G· 1972. Direct enzymatic conversion of lactose to acid： glucose oxidase and hexose oxidase. Journal of Food Science 37:698-701. 12. Sahm, H. and Wagner, F· 1973. Microbial assimilation of methanol · Eur · J. Biochem. 36: 250-256. 13 . Sambrook, J. , E·F. Fritsch and T. Maniatis 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先^注意事項再填寫本頁) 14. Schagger, H. and G. von Jagow 1987· Tricine-Sodium Dode-cyl Sul fate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the Range from 1 to 100 kDa· Analytical Biochemistry 166:368-379. 15. Sock, J· and R. Rohringer 1988. Activity Staining of Blotted Enzymes by Reaction Coupling with Transfer Membrane-Immobilized Auxiliary Enzymes. Analytical Biochemistry 171:310-319. 79 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 438887 A7 B7 五、發明説明（78 ) 16. Sullivan, J.D. and Μ.工kawa 1973. Purification and Characterization of Hexose Oxidase from the red Alga Chondrus crispus· Biochemica et Biophysica Acta 309:11-22. 17. Tschopp, J. F·, G. Sverlow, R. Kosson, W. Craig, and L·.

Grinna 1987. High-level secretion of glycosylated invert^ise in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Bio/Technology 5: 1305-1308. 讀 18. Yeh, K-W, R.H. Juang and J-C. Su. A rapid and efficient method for RNA isolation from plants with high carbohydrate content. Focus 13：102-103 訂 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 、申凊專利範圍ϋ 專利申請案第85107718號 ROC Patent Appln. No. 85107718 修正之申請專0範圍中文本-附件一 Amended Claims in Chinese - Enel. I 月i9日送呈) (Submitted on January 19，2001) (i) i ·種製造具有六碳糖氧化酶活性的多肽之方法，其包括 分離或合成指令生合成該多肽之DNA片段，將所述 DNA片段引入適當宿主生物中，於其中DNA片段與該 DNA片段之適當表現信號結合，於引導表現具六碳糖氧 化酶活性多肽之條件下培養宿主生物，和從培養基或宿 主生物中回收多肽，其中宿主生物係選自大腸桿菌、釀 酒酵母和巴斯德畢赤酵母，且該DNA片段含有至少一 種指令生合成選自下列胺基酸序列之DNA序列： Tyr - Glu - Pro - Tyr - Gly- Gly - Val - Pro f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (ii) ^l^-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr· Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser, (iii) Asp-Leu_Pro-Met-Ser-Pro-Arg_Gly_Val-Ile-Ala-Ser-Asn_ Leu-X-Phe, (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr, (v) Tyr-Tyr-Phe-Lys, (vi) Asp - Pro-Gly-Tyr- lie-Val - lie-Asp-Val-Asn· Ala-Gly-Thr-X-Asp, -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 85279B(9BIOTEK) 丨；-----.---'---f——·-----訂---------線# (請先閱讀背面之注咅2事項再填寫本頁) 438887 A8 B8 C8 D8 夂、申請專利範圍 (vii) Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-iyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met, 其中X 代表選自 Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gin 、Glu、 Glx、 Gly、 His、 lie、 Leu、 Lys、 Met、 Phe、 Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 和 Val 之胺基酸。 2·根據申請專利範圍第1項之製法，其中DNA片段係 自海藻品種分離。 3·根據申請專利範圍第2項之製法，其中海藻品種係選 自角叉菜(Chondrus crispus)、Iridophycus flaccidum 和 Euthora cristata ° 4.根據申請專利範圍第1項之製法，其包含進一步步 驟，將最初從培養基及/或微生物回收之多肽製劑純 化以得到其中多肽呈實質上純型之製劑。 5·根據申請專利範圍第1項之製法，其中具有六碳糖氧 化酶活性之多肽為融合產物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6· —種呈分離型式、具有六碳糖氧化酶活性之多肽，其 係由申請專利範圍第1項之製法製得且含有至少一種 選自下列之胺基酸序列： • (i) Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro, (ii) Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr- Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser, -82 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 438887 A8 B8 C8 D8 _____ 六、申請專利範圍 (iii) Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe, (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr, (v) Tyr-Tyr-Phe-Lys, (vi) Asp-Pr〇-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp, (vii) Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp, (viii) X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met, 其中 X代表選自 Ala、An Asn、Asp、Asx、Cys、Gin 、Glu、 Glx、 Gly、His、 lie、 Leu、 Lys、 Met、 Phe、 Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和 Val之胺基酸。 7·根據申請專利範圍第6項之多肽，其係根據申請專利 範圍第1項之製法製造。 8·根據申請專利範圍第6項之多肽，其係以選自細菌細 胞、真菌細胞及酵母細胞之微生物細胞製造。 9·根據申請專利範圍第8項之多肽，其係以選自大腸桿 菌細胞、釀酒酵母細胞及巴斯德畢赤酵母細胞之細胞 製造。 10·根據申請專利範圍第6項之多肽，其係呈實質上非 糖苷化之型式。 11·根據申請專利範圍第6項之多肽，其具有與角叉菜 中天然存在之六碳糖氧化酶相同或部分相同之功能 特性。 -83 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----‘——-——·-----訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 438887 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 12·根據申請專利範圍第11項之多肽，其進行SDS_ PAGE時’顯示具有29、4〇及/或6〇 kD之分離色 帶。 13. 根據中請專利範圍第6項之多肽，其於5_9之#範 圍内，具有酵素活性。 14. 根據申請專利範圍第6項之多肽，其酵素活性之最 適溫度在20-60°C之範圍内。 15·根據中請專利範圍第6項之多肽，其氧化選自包括 D-葡萄糖、D_半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、 D-甘露糖、D-岩藻糖和D_木糖之至少一種糖。 16·根據申請專利範圍帛6項之纽，其具有在心$範圍 内之等電點。 17·根據申請專利範圍第16項之多肽，其等電點為士 0.1。 ..... · 18·根據申請專利範圍帛16項之多肤，其等電點為“ ± 0.1。 19·根據申請專利範圍第6項之多肽，其為呈實質上純 化型。 20.根據申請專利範圍第6項之多肽，其具有使用篩分 丙烯基S-200 Superfine (Pharmacia產品）以凝膠過 濾法測定之於100_150 kD範圍内之分子量。 21·根據申請專利範圍第2〇項之多肽，其具有11〇 kD 士 10 kD之表觀分子量。 22·根據申請專利範圍第6項之多肽，其為含有附加酵 -84 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ._ —.-----^---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A8B8C8D8 4 3 8 887 六、申請專利範圍 素性活性胺基酸序列的融合產物之一部分。 23.—種重組DNA分子，其序列為： TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTCTG GTACCGTGTA TGTCAAAGGT 60 TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACGATGGCTA CTCTTCCTCA GAAAGACCCC GGTTATATTG 120 TAATTGATGT CAACGCGGGC ACCGCGGACA AGCCGGACCC ACGTCTCCCC TCCATGAAGC 180 AGGGCTTCAA CCGCCGCTGG ATTGGAACTA ATATCGATTT CGTTTATGTC GTGTACACTC 240 CTCAAGGTGC TTGTACTGCA CTTGACCGTG CTATGGAAAA GTGTTCTCCC GGTACAGTCA 300 GGATCGTCTC TGGCGGCCAT TGCTACGAGG ACTTCGTATT TGACGAATGC GTCAAGGCCA 3 60 TCATCAACGT CACTGGTCTC GTTGAGAGTG GTTATGACGA CGATAGGGGT TACTTCGTCA 420 GCAGTGGAGA TACAAATTGG GGCTCCTTCA AGACCTTGTT CAGAGACCAC GGAAGAGTTC 4 80 TTCCCGGGGG TTCCTGCTAC TCCGTCGGCC TCGGTGGCCA CATTGTCGGC GGAGGTGACG 540 GCATTTTGGC CCGCTTGCAT GGCCTCCCCG TCGATTGGCT CAGCGGCGTG GAGGTCGTCG 600 TTAAGCCAGT CCTCACCGAA GACTCGGTAC TCAAGTATGT GCACAAAGAT TCCGi 60 ACGACGGGGA GCTCTTTTGG GCACACACAG GTGGCGGTGG CXX3AAACTTT GGAA /20 CCAAATACTA CTTCAAQ3AT TTGCCCATGT CTCCACGGGG CGTCATCGCA TCAAATTTAC /80 ACTTCAGCTG GGACGGTTTC ACGAGAGATG CCTTGCAGGA TTTGTTGACA AAGTACXTCA 840 AACTTGCCAG ATGTGATTGG AAGAATACGG TTGGCAAGTT TCAAATCTTC CATCAGGCAG 900 CGGAAGAGTT TGTCATGTAC TTGTATACAT CCTACTCGAA CGACGCCGAG CGCGAAGTTG 9 60 CCCAAGACCG TCACTATCAT TTGGAGGCTG ACATAGAACA GATCTACAAA ACATGCGAGC 1020 CCACCAAAGC GCTTGGCGGG CATGCTGGGT GGGCGCCGTT CCCCGTGCGG CCGCGCAAGA 1080 GGCACACATC CAAGACGTCG TATATGCATG ACGAGACGAT GGACTACCCC TTCTACGCGC 1140 TCACTGAGAC GATCAACGGC TCCGGGCCGA ATCAGCGCGG CAAGTACAAG TCTGCGTACA 1200 TGATCAAGGA TTTCCCGGAT TTCCAGATCG ACGTGATCTG GAAATACCTT ACGGAGGTCC 1260 CGGACGGCTT GACTAGTGCC GAAATGAAGG ATGCCTTACT CCAGGIX^GAC ATGTTTGGTG 132 0 GTGAGATTCA CAAGGTGGTC TGGGATGCGA CGGCAGTCGC GCAGCGCGAG TACATCATCA 1380 AACTGCAGTA CCAGACATAC TGGCAGGAAG AAGACAAGGA TGCAGTGAAC CTCAAGTGGA 1440

   -85 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —.——-——.-----訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 438887 1 AS B8 C8 _ D8 六、申請專利範圍 TTAGAGACTT TTACGAGGAG ATGTATGAGC CGTATGGCGG GGTTCCAGAC CCCAACACGC 1500 AGGTGGAGAG TGGTAAAGGT GTGTTTGAGG GATGCTACTT CAACTACCCG GATGTGGACT 1560 TGAACAACTG GAAGAACGGC AAGTATGGTG CCCTCGAACT TTACTTTTTG GGTAACCTGA 1620 ACCGCCTCAT CAAGGCCAAA TGGTTGTGGG ATCCCAA.CGA GATCTTCACA AACAAACAGA 1680 GCATCCCTAC TAAACCTCTT AAGGAGCCCA AGCAGACGAA ATAGTAGGTC ACAATTAGTC 1740 ATCGACTGAA GTGCAGCACT TGTCGGATAC GGCGTGATGG TTCCTTTTTA TAAACTTGGT 1600 A 1801 K]Kj 24.根據申請專利範圍第6項之多肽，其係用於製造食 品。 25·根據申請專利範圍第24項之多肽，其中食品係選自 乳製品、含澱粉食品和非乳飲料。 26·根據申請專利範圍第24項之多肽，其中多肽係作為 抗微生物劑用或作為抗氧化劑用。 27·根據申請專利範圍第24項之多肽，其中多肽係於食 品包裝中作為氧去除劑用。 28. 根據申請專利範圍第6項之多肽，其係用於製造動 物飼料。 29. 根據申請專利範圍第28項之多肽，其中動物飼料為 青貯料。 30·根據申請專利範圍第6項之多肽，其係用於減少食 品糖含量。 31. 根據申請專利範圍第6項之多肽，其係用於製造選 自藥學組成物、化粧品和護牙產品之產品。 32. 根據申請專利範圍第6項之多肽，其係用於由麵糰 製備烘焙產品。 -86 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公楚"7 ----- -----‘---——*-----訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 438887 D8 六、申請專利範圍 '~^ 33 =據申請專利範圍第6項之多肽其係用於包含至 /一種習用_成分之麵糰改良組成物令。 34·根據申請專利範圍第 、· 固乐W項之多肽，其中該麵糰改良 、、且成物進纟地含有選自包括纖維素酶、半纖維素 酶木水糖酶、戊聚糖酶、殿粉酶、脂肪酶和蛋白 酶之至少一種酵素。 35·根據中請專利範圍第6項之多肽，其係於—分析試 樣含糖置之方法中作為分析試劑用。 36·根據申請專利範圍第6項之多肽，其係用於製造内 酉曰之方法中，所述方法包括將多肽施加於含有可被 該多肽氧化的碳水化合物之反應器中，於使該碳水 化合物被氧化成内酯之條件下操作反應器。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — ·-----訂---------線一 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）