NO324271B1

NO324271B1 - Rekombinant heksoseoksidasepolypeptid (HOX), rekombinant DNA molekyl, fremgangsmate for fremstilling av HOX-polypeptidet og anvendelse av et slikt enzym i et naeringsprodukt.

Info

Publication number: NO324271B1
Application number: NO19975693A
Authority: NO
Inventors: Peter Stougaard; Ole Cai Hansen
Original assignee: Danisco
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2007-09-17
Also published as: CN1190992A; ZA964616B; US7544795B2; JP3917183B2; AR051696A2; DE69623473D1; EP1020523A3; ES2182986T5; WO1996040935A1; AR002301A1; BRPI9609230B1; MX9709544A; EP0832245A1; JPH11511008A; US6924366B2; PL187218B1; US20050282249A1; CO4520252A1; PH11996053280B1; CA2224143A1

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av heksoseoksidase ved rekombinant DNA-teknologi, et sådant enzym fremstilt ved fremgangsmåten, og dets anvendelse i matvareindustrien og på andre områder.

Teknisk bakgrunn og teknikkens stand

Heksoseoksidase " (D-heksose:02-oksidoreduktase, EC 1.1.3.5) er et enzym som i nærvær av oksygen kan oksidere D-glukose og flere andre reduserende sukkere, heriblant maltose, laktose og cellobiose, til de tilsvarende laktoner med påføl-gende hydrolyse til de respektive aldobionsyrer. Heksoseoksidase skiller seg følgelig fra en annen oksidoreduktase, glukoseoksidase som kun kan overføre D-glukose, ved at enzymet kan benytte et bredere utvalg av sukkersubstrater. Oksida-sjonen som katalyseres av heksoseoksidase, kan f.eks. illustreres som følger:

Til nå er heksoseoksidase (i det påfølgende også betegnet HOX) blitt tilveiebrakt ved å isolere enzymet fra forskjellige rødalgearter, f.eks. Iridophycus flaccidum (Bean og Hassid, 1956) og Chondrus crispus (Sullivan et al. 1973). I tillegg er algearten Euthora cristata blitt vist å fremstille heksoseoksidase.

Sullivan og Ikawa (1973; Biochimica et Biophysica Acta 309: 11-22) beskriver en fremgangsmåte for protein-ekstraksjon fra det røde sjøgresset Chondros crispus. Protein-ekstraktet hadde et bånd på 130 000 Da, høye glykosylerings-nivåer og var resistent overfor proteolyse.

Det er rapportert at heksoseoksidase isolert fra disse naturlige kilder, kan ha mulig anvendelse ved fremstilling av visse matprodukter. Således er heksoseoksidase isolert fra Iridophycus flaccidum, vist å kunne overføre laktose i melk til den tilsvarende aldobionsyre og er vist å være av mulig interesse som et surgjøringsmiddel for melk, f.eks. for å erstatte surgjørende, mikrobielle kulturer for dette formål (Rand, 1972) . I denne forbindelse er heksoseoksidase blitt nevnt som et mer interessant enzym enn glukoseoksidase da dette enzym kun kan benyttes i melk eller matprodukter som ikke inneholder glukose ved samtidig tilsetning av glukose, eller, for et melkeprodukt, det laktosedegraderende enzym laktase, hvorved laktose degraderes til glukose og galaktose. Selv om glukose på denne måten vil gjøres tilgjengelig som et substrat for glukoseoksidase, er det åpenbart at kun 50% av laktasens sluttprodukter kan benyttes som substrat av glukoseoksidase slik at glukoseoksidase ikke er et effektivt surgjør-ingsmiddel for naturlig melk eller meieriprodukter.

Oksygenoksidoreduktasers, heriblant heksoseoksidases, evne til å danne hydrogenperoksid som har antimikrobiell virkning, er blitt utnyttet til å forbedre lagringsstabiliteten av visse matvareprodukter, heriblant ost, smør og fruktjuice som beskrevet i JP-B-73/016612. Det er også foreslått at oksido-reduktaser kan ha mulig anvendelse som oksygenfjernere eller antioksidanter i matvareprodukter.

Innen bakeriindustrien og mølleindustrien er det kjent å benytte oksideringsmidler som f.eks. jodater, perok-sider, askorbinsyre, K-bromat eller azodikarbonamid for å forbedre mels bakeegenskaper slik at det oppnås en deig med forbedret strekkevne som følgelig har en ønsket styrke og stabi-litet. Mekanismen bak denne virkning av oksidasjonsmidler er at melproteinene, f.eks. gluten i hvetemel, inneholder tiolgrupper som ved oksidasjon danner disulfidbindinger, hvorved proteinet danner'et mer stabilt støtteverk, noe som fører til bedre deigkvalitet og forbedret volum og skorpestruktur i bakeproduktene.

Slik anvendelse av flere av de for tiden tilgjengelige oksidasjonsmidler protesteres det imidlertid på av for-brukere, eller de er ikke tillatt av regulerende organer, og det er følgelig blitt forsøkt å finne alternativer til disse konvensjonelle mel- og deigtilsetningsstoffer, og teknikkens stand har foreslått anvendelse av glukoseoksidase for dette formål. Således beskriver US 2 783 150 tilsetning av glukoseoksidase til mel for å forbedre deigens reologiske egenskaper. CA 2 012 723 beskriver brødforbedrende midler som omfatter cellulolytiske enzymer og glukoseoksidase, og JP-A-084848 antyder anvendelse av et. brødforbedrende preparat som inneholder glukoseoksidase og lipase.

Anvendelse av glukoseoksidase som et deig- og brød-forbedrende tilsetningsmiddel har imidlertid den begrensning at dette enzym krever nærvær av glukose som substrat for å være effektivt i et deigsystem, og glukoseinnholdet i kornmel er generelt lavt. Således foreligger glukose i hvetemel i en mengde i området mellom 0-0,4% (vekt/vekt), dvs. at mel ikke nødvendigvis inneholder glukose i det hele tatt. Følgelig vil fravær eller lavt innhold av glukose i deiger være en begren-sende faktor for anvendelsen av glukoseoksidase som deigforbedringsmiddel. I motsetning til dette er maltoseinnholdet signifikant høyere allerede i den nylig fremstilte deig, og ytterligere maltose dannes i deigen grunnet aktiviteten av p-amylase som enten foreligger naturlig i melet eller er blitt tilsatt.

Dagens kilde for heksoseoksidase er rå eller delvis rensede enzympreparater isolert ved ekstraksjon fra de ovenfor nevnte, naturlig forekommende, marine algearter. Da mengden av heksoseoksidase i alger er lav, er det imidlertid åpenbart at fremstilling av enzymet på denne måte er for tidkrevende og kostbar til å tillate en kostnadseffektiv, kommersiell fremstilling av enzymet fra disse naturlige kilder. Videre er tilveiebringelse av et tilstrekkelig rent enzymprodukt på et kostnadseffektivt nivå ikke umiddelbart oppnåelig på denne måte. Det foreligger følgelig et betydelig industrielt behov for tilveiebringelse av en alternativ og mer kostnadseffektiv kilde for dette industrielt verdifulle enzym som ikke avhenger av en naturlig kilde, og også for tilveiebringelse av enzymet i ren tilstand, dvs. uten noen kontaminerende enzymaktiviteter eller andre uønskede, kontaminerende forbindelser, heriblant uønskede algepigmenter og miljøforurensninger som kan foreligge i havområdene hvor de heksoseoksidaseproduserende algearter vokser.

Videre vil industriell tilgjengelighet av heksoseoksidase av en kvalitet for anvendelse i næringsmidler i tilstrekkelige mengder og med kostnadseffektive priser uten tvil åpne for nye anvendelser av enzymet, ikke bare i nærings-middelindustrien, men også innenfor andre industrielle områder, som diskutert i det påfølgende. Ett eksempel på en slik ny anvendelse av rekombinant heksoseoksidase i næringsmiddel-industrien er anvendelse av enzymet som et deigforbedringsmiddel, mens et annet eksempel er anvendelse av heksoseoksidaseaktivt polypeptid eller en rekombinant organisme som produserer polypeptidet ved fremstilling av laktoner.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse har ved å benytte rekombinant DNA-teknologi, for første gang gjort det mulig å tilveiebringe heksoseoksidaseaktive polypeptider i industrielt tilfredsstillende mengder og med en kvalitet og renhet som gjør det heksoseoksidaseaktive polypeptid ifølge oppfinnelsen svært egnet for ethvert relevant, industrielt.formål, heriblant fremstilling av næringsmiddelprodukter og farmasøytika.

Ved en første side er det beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med heksoseoksidaseaktivitet som omfatter isolering eller syntese av et DNA-fragment som koder for polypeptidet, innføring av DNA-fragmentet i en egnet vertsorganisme hvor DNA-fragmentet er forbundet med et egnet ekspresjonssignal for DNA-fragmentet, dyrkning av vertsorganismen under betingelser som fører til ekspresjon av det heksoseoksidaseaktive polypeptid, og gjenvinning av polypeptidet fra dyrkningsmediet eller fra vertsorganismen.

Ved en annen side er det beskrevet et polypeptid i isolert form med heksoseoksidaseaktivitet som omfatter minst én aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av

(i) Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (SEKV.ID NR. 1),

(ii) Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (SEKV.ID NR. 2), (iii) Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-

Leu-X-Phe (SEKV.ID NR. 3),

(iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (SEKV.ID NR. 4),

(v) Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEKV.ID NR. 5),

(vi) Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (SEKV.ID NR. 6), (vii) Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (SEKV.ID

NR. 7),

(viii) X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (SEKV.ID NR. 8), hvor X står for en aminosyre utvalgt fra gruppen som består av Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val,

og muteiner og varianter av disse.

Ved nok en side er det beskrevet et rekombinant DNA-molekyl som omfatter et DNA-fragment som koder for et polypeptid med heksoseoksidaseaktivitet, og til en mikrobiell celle som omfatter et slikt rekombinant DNA-molekyl.

Det er også beskrevet anvendelse av det ovenfor nevnte heksoseoksidaseaktive polypeptid eller en mikrobiell celle som uttrykker et slikt polypeptid ved fremstilling av et næringsmiddelprodukt eller et dyrefor,, og fremstilling av et farmasøytisk produkt, et kosmetisk produkt eller et tannpleieprodukt.

Andre anvendbare sider tilveiebringer en fremgangsmåte for reduksjon av sukkerinnholdet i et næringsmiddelprodukt som omfatter tilsetning til næringsmiddelproduktet av en mengde av polypeptidet eller den mikrobielle celle som beskrives heri, som er tilstrekkelig til å fjerne i det minste en del av sukkeret som opprinnelig foreligger i næringsmiddelproduktet, en fremgangsmåte for fremstilling av et bakeprodukt fra en deig som omfatter tilsetning av det heksoseoksidaseaktive polypeptid eller en mikrobiell celle som uttrykker et slikt polypeptid til deigen, og et deigforbedrende preparat som omfatter polypeptidet eller den mikrobielle celle som beskrevet heri og minst én konvensjonell deigbestanddel.

Ved en annen side er det beskrevet anvendelse av polypeptidet eller en mikrobiell celle ifølge oppfinnelsen som analytisk reagens for å måle sukkerinnhold.

Det beskrives videre anvendelse av et polypeptid eller en mikrobiell celle ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av et lakton, hvorved polypeptidet og/eller den mikrobielle celle innføres i en reaktor som inneholder et karbohydrat som kan oksideres av polypeptidet, og operasjon av reaktoren under betingelser hvor karbohydratet oksideres.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av et heksoseoksidasepolypeptid (HOX) fra Chondrus crispus, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene med dyrking av en rekombinant vertsorganisme inneholdende en DNA-sekvens som koder for det nevnte HOX-polypeptid, hvori vertsorganismen er en mikroorganisme/• utvalgt fra grupper bestående av en E. coli-celle, en melkesyrebakteriecelle og en gjærcelle.

Oppfinnelsen omfatter videre et HOX-polypeptid, kjennetegnet ved at det fremstilles ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Også omfattet av oppfinnelsen er et isolert HOX-polypeptid, kjennetegnet ved at HOX-polypeptidet omfatter minst én aminosyresekvens utvalgt fra gruppen bestående av:

hvor X står for en aminosyre utvalgt fra gruppen som består av Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val, Oeller så omfatter HOX-polypeptidet aminosyresekvensen som er angitt i SEKV.ID NR. 31.

Oppfinnelsen omfatter også et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det har evnen til å kode for et HOX-polypeptid, hvori DNA-molekylet koder for et protein som har egenskaper som ligner HOX, isolert fra Condrus crispus og omfatter DNA-sekvensen som angitt i SEKV.ID NR. 30, eller omfatter DNA-sekvensen i den åpne leseramme som vist i SEKV.ID NR. 30; eller hvori det rekombinante DNA-molekyl koder for et Chondrus crispus-polypeptid med heksoseoksidaseaktivitet, hvori fragmentet som koder for et polypeptid, omfatter minst én aminosyresekvens utvalgt fra gruppen bestående av hvor X står for en aminosyre utvalgt fra gruppen som består av Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse et DNA-fragment, kjennetegnet ved at det omfatter det rekombinante DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen. Også omfattet av oppfinnelsen er en rekombinant celle, kjennetegnet ved at den omfatter det rekombinante DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen eller DNA-fragment ifølge oppfinnelsen, hvori den rekombinante celle er en mikroorganisme utvalgt fra gruppen bestående av en E. coli-celle, en melkesyrebakteriecelle og en gjærcelle.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et polypeptid som er fremstilt i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, eller et polypeptid ifølge oppfinnelsen, eller en rekombinant celle ifølge oppfinnelsen, for fremstilling av et næringsprodukt.

Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av et næringsprodukt, kjennetegnet ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet ved fremstilling i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, og/eller

ii) anvendelse av polypeptidet ifølge oppfinnelsen,

og/eller

iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge oppfinnelsen, med evnen til å uttrykke nevnte

polypeptid,

i fremgangsmåten for fremstilling av næringsproduktet.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en deigblanding, kjennetegnet ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet som fremstilt i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge foreliggende

oppfinnelse, og/ellef

ii) anvendelse av polypeptidet ifølge oppfinnelsen,

og/eller

iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge oppfinnelsen, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid,

iv) tilsetning av vanlige deigkomponenter, og blanding av bestanddelene inntil deigen er dannet. Også omfattet av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av et bakeprodukt fra en deig, kjennetegnet ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, og/eller

ii) anvendelse av polypeptidet ifølge oppfinnelsen,

og/eller

iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge oppfinnelsen, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, iv) tilsetning av deigkomponentene,

v) blanding inntil deigen dannes, og

vi) anvendelse av blandingen for baking.

Videre omfatter' oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en deigforbedrende sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, og/eller

ii) anvendelse av polypeptidet ifølge oppfinnelsen,

og/eller

polypeptid og

iv) blanding med i det minste én vanlig deigkomponent.

Også omfattet av oppfinnelsen er en deigforbedrende sammensetning,kjennetegnet ved at den fremstilles ifølge fremgangsmåten, som angitt ovenfor ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse avendelse av en deigforbedrende sammensetning ifølge oppfinnelsen, for forbedring av egenskapene til deig.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for reduksjon av sukkerinnholdet i et næringsprodukt, kjennetegnet ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, og/eller

ii) anvendelse av polypeptidet ifølge foreliggende

oppfinnelse, og/eller

iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge foreliggende oppfinnelse, som har evnen til å uttrykke

nevnte polypeptid,

hvori mengden er tilstrekkelig til å fjerne i det minste en del av sukkeret som er til stede i nevnte næringsprodukt innledningsvis.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et polypeptid når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, eller et polypeptid ifølge oppfinnelsen, eller en rekombinant celle ifølge oppfinnelsen, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, hvori polypeptidet virker som et antimikrobielt middel.

Også omfattet av oppfinnelsen er anvendelse av et polypeptid når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse eller et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, eller en rekombinant celle ifølge oppfinnelsen, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, hvori polypeptidet virker som en antioksidant. Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av et polypeptid når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen eller et polypeptid ifølge oppfinnelsen, eller en rekombinant celle ifølge oppfinnelsen, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, er virksomt som et oksygenfjernende middel i en næringspakning.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av et lakton ved anvendelse av rekombinant celle ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at den omfatter anbringelse av cellen til en reaktor inneholdende et karbohydrat som kan oksideres ved hjelp av det heksoseoksidaseaktive polypeptid og operering av reaktoren under betingelser der polypeptidet uttrykkes, hvorved karbohydratet oksideres til lakton. Også omfattet av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av et lakton ved anvendelse av HOX-polypeptidet ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at den omfatter at HOX-polypeptidet anbringes til en reaktor inneholdende et karbohydrat som kan oksideres ved hjelp av HOX-polypeptidet og operering av reaktoren under tilstander der karbohydratet er oksidert til lakton.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Heksoseoksidaser produseres naturlig av flere marine algearter. Slike arter finnes bl.a. i familien Gigartinaceae som tilhører ordenen Gigartinales. Eksempler på heksoseoksidaseproduserende algearter som tilhører Gigartinaceae er Chondrus crispus og Iridophycus flaccidum. Også algearter fra ordenen Cryptomeniales, heriblant arten Euthora cristata, er mulige kilder for det heksoseoksidaseaktive polypeptid som beskrevet heri. Slike algearter er følgelig mulig anvendbare kilder for heksoseoksidase og for DNA som koder for slike heksoseoksidaseaktive polypeptider. Som benyttet heri, betegner begrepet "heksoseoksidaseaktivt polypeptid" et enzym som i det minste oksiderer D-glukose, D-galaktose, D-mannose, maltose, laktose og cellobiose.

Ved anvendelse av slike naturlige kilder for isolering av nativ heksoseoksidase som dette er blitt utført innenfor teknikkens stand og, som beskrevet heri, med det formål å identifisere algemateriale som kunne benyttes som mRNA-kilde for anvendelse ved konstruksjon av cDNA og som utgangspunkt for utforming av syntetiske DNA-oligonukleotidprimere, isoleres enzymet typisk fra utgangsalgematerialet ved ekstraksjon med et vandig ekstraksjonsmedium.

Som utgangsmateriale for en slik ekstraksjon kan al-gene benyttes i sin ubehandlede tilstand som de høstes fra havområdet hvor de vokser, eller de kan benyttes etter tørking av algeflakene, f.eks. ved lufttørking ved romtemperatur eller ved enhver egnet industriell tørkefremgangsmåte, f.eks. tørk-ing i sirkulerende, oppvarmet luft eller ved frysetørking. For å lette det påfølgende ekstraksjonstrinn kan det ubehandlede eller tørkede utgangsmateriale finfordeles, f.eks. ved maling eller sammenblanding.

Som vandig ekstraksjonsmedium er bufferløsninger med en pH i området 6-8, f.eks. 0,1 M natriumfosfatbuffer, 20 niM trietanolaminbuffer eller 20 mM Tris-HCl-buffer, egnet. Heksoseoksidase ekstraheres typisk fra algematerialet ved å sus-pendere utgangsmaterialet i bufferen og holde suspensjonen ved en temperatur i området mellom 0-20 °C, f.eks. ved tilnærmet 5 °C, il til 10 dager, fortrinnsvis under omrøring.

Det suspenderte algemateriale atskilles så fra det vandige medium ved en egnet separasjonsmetode, f.eks. filtrering, siling eller sentrifugering, og heksoseoksidasen gjenvinnes deretter fra filtratet eller supernatanten. Om ønskelig, utsettes det atskilte algemateriale for ytterligere ett eller flere ekstraksjonstrinn.

Da flere marine alger inneholder fargede pigmenter, f.eks. fykocyaniner, kan det være påkrevet å utsette filtratet eller supernatanten for et ytterligere rensetrinn hvorved disse pigmenter fjernes. Pigmentene kan f.eks. fjernes ved å behandle filtratet eller supernatanten med et organisk løse-middel i hvilket pigmentene er løselige og deretter skille løsemidlet som inneholder de oppløste pigmenter, fra det vandige medium.

Gjenvinning av heksoseoksidase fra det vandige eks-traks jonsmedium kan utføres ved enhver egnet, konvensjonell fremgangsmåte som tillater isolering av proteiner fra vandige medier. Slike fremgangsmåter som det vil bli gitt detaljerte eksempler på i det følgende, omfatter fremgangsmåter som ionebytterkromatografi, ora ønskelig, fulgt av et oppkonsentrer-ings trinn som ultrafiltrering. Det er også mulig å gjenvinne enzymet ved å tilsette forbindelser som (NH^SCu som gjør at proteinet utfelles, fulgt av separasjon av det utfelte materiale, og om ønskelig, behandling av dette ved betingelser som får proteinet til å oppløses.

For oppfinnelsens formål er det ønskelig å tilveiebringe enzymet i i det vesentlige ren tilstand, f.eks. som et preparat som praktisk talt ikke inneholder andre proteiner eller forurensninger som ikke er proteiner, og det relativt urene enzympreparat som er resultatet av ekstraksjonen og iso-lasjonstrinnene beskrevet ovenfor, behandles derfor fortrinnsvis med ytterligere rensetrinn, f.eks. ytterligere kromatografitrinn, gelfiltrering eller kromatofokusering, som beskrevet i eksemplene nedenfor.

Som nevnt ovenfor, tilveiebringes det heksoseoksidaseaktive polypeptid ifølge oppfinnelsen ved å benytte rekombinant DNA-teknologifremgangsmåter som tillater fremstilling av enzymet ved å dyrke en egnet vertsorganismecelle i et dyrk-ningsmedium hvor vertscellen inneholder et gen som koder for heksoseoksidase, og gjenvinning av enzymet fra cellene og/eller dyrkningsmediet.

Fremgangsmåten for fremstilling av heksoseoksidase som tilveiebringes heri, omfatter som første trinn, isolering eller konstruksjon av et DNA-fragment som koder for heksoseoksidase. Flere strategier for tilveiebringelse av et slikt DNA-fragment er tilgjengelige. Således kan DNA-fragmentet isoleres som sådant fra en organisme som naturlig produserer heksoseoksidase. For å identifisere plasseringen av det kodende DNA-fragment er det nødvendig å ha til rådighet RNA- eller DNA-probesekvenser som under egnede betingelser vil hybridisere til DNA-fragmentet det søkes etter, og deretter isolere et DNA-fragment som omfatter den kodende sekvens og klone fragmentet i en egnet kloningsvektor.

En annen egnet strategi som beskrives i detalj i eksemplene nedenfor, er å isolere mRNA fra en organisme som produserer heksoseoksidase, og benytte dette mRNA som utgangspunkt for konstruksjon av et cDNA-bibliotek som deretter kan benyttes for polymerasekjedereaksjon (PCR)-syntese av DNA basert på oligonukleotidprimere_ som er syntetisert basert på aminosyresekvensene til heksoseoksidasen. Det ble funnet at en slik strategi er egnet for tilveiebringelse av et heksoseoksidasekodende DNA-fragment. Som eksempel beskrives summarisk en slik strategi som vil beskrives i detalj senere.

Syntetiske oligonukleotider ble fremstilt basert på H0X-2- og HOX-3-peptidsekvensene fremstilt som beskrevet nedenfor ved endoLys-C-kløyving av et heksoseoksidasepolypeptid på 4 0 kD ekstrahert fra Chondrus crispus. PCR med første-tråds-cDNA som templat og med en sense-HOX-2-primer og en an-ti-sense-HOX-3-primer ga et DNA-fragment på 407 bp. Dette fragment ble innsatt i en E. coli-vektor, pT7 Blue, og deretter sekvensert. Det ble funnet at i tillegg til sekvensene for HOX-2- og HOX-3-peptidet inneholdt dette fragment på 407 bp også en åpen leseramme som omfattet HOX-4- og H0X-5-peptidene fra det ovenfor nevnte Chondrus crispus-avledede heksoseoksi-dasefragment på 40 kD hvis isolering også beskrives i det på-følgende .

Sense- og anti-sense-oligonukleotider ble syntetisert basert på fragmentet på 407 bp, og to fragmenter på 800 hhv. 1 400 bp kunne deretter isoleres ved PCR med cDNA som templat. Disse to fragmenter ble klonet i pT7 Blue-vektoren og deretter sekvensert. DNA-sekvensen til 5'-fragmentet viste en åpen leseramme som omfattet HOX-6-peptidet som også var isolert fra det ovenfor nevnte Chondrus crispus-avledede heksoseoksidase-fragment på 40 kD. På tilsvarende måte viste 3<1->fragmentet en leseramme som omfattet HOX-1 hvis isolering beskrives nedenfor, og HOX-7 og HOX-8., begge isolert fra et Chondrus crispus-avledet heksoseoksidasepolypeptid på 29 kD, erholdt ved endoLys-C-kløyving,. også som beskrevet i det påfølgende.

Basert på de kombinerte DNA-sekvenser som nevnt ovenfor, ble et oligonukleotid som tilsvarte den 5' ende av det antatte hox-gen og et oligonukleotid som tilsvarte den 3' ende av genet, syntetisert. Disse to oligonukleotider ble benyttet i PCR med førstetråds-cDNA som templat, noe som førte til dannelse av et DNA-fragment på tilnærmet 1,8 kb. Dette fragment ble klonet i E. coli-vektoren nevnt ovenfor og sekvensert. DNA-sekvensen var identisk med den kombinerte sekvens fra de ovenfor nevnte 5'-endesekvenser, 407 bp-sekvenser og 3'-endesekvenser, og det ble konkludert med at denne DNA-sekvens på tilnærmet 1,8 kb koder for både 40 kD-fragmentet og 29 kD-fragmentet fra den Chondrus crispus-avledede heksoseoksidase.

Det vil være åpenbart for den erfarne fagmann at den ovenfor beskrevne strategi for isolering av et DNA-fragment som koder for et heksoseoksidaseaktivt polypeptid, heriblant isolering og karakterisering av heksoseoksidasen, kan benyttes for fremstilling av slike fragmenter som koder for heksoseoksidaser avledet fra enhver naturlig kilde i tillegg til Chondrus crispus, heriblant de marine algearter som ér nevnt ovenfor, så vel som fra andre planter eller fra en mikroorganisme.

Alternativt kan DNA-sekvensen til det heksoseoksidaseaktive, polypeptidkodende DNA-fragment fremstilles syntetisk ved etablerte standardfremgangsmåter, f.eks. fosfoamidittfremgangsmåten beskrevet av Beaucage og Caruthers (1981), eller fremgangsmåten beskrevet av Matthes et al. (1984). Ifølge fosfoamidittfremgangsmåten syntetiseres oligonukleotider, f.eks. i en automatisk DNA-syntesemaskin, renses, sam-menhybridiseres, ligeres og klones i en egnet vektor.

DNA-fragmentet kan videre være av blandet genomisk og syntetisk opphav, blandet syntetisk og cDNA-opphav eller blandet genomisk og cDNA-opphav, fremstilt ved ligering av sub-fragmenter av syntetisk, genomisk eller cDNA-opphav som det måtte passe seg, hvor subfragmentene tilsvarer forskjellige deler av det totale DNA-fragment, i samsvar med gjengse tek-nikker.

I et påfølgende trinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innføres det isolerte eller syntetiserte heksoseoksidaseaktive, polypeptidkodende DNA-fragment inn i en egnet vertsorganisme i hvilken DNA-fragmentet er operativt koblet til et egnet ekspresjonssignal for DNA-fragmentet. Slik inn-føring kan utføres ifølge fremgangsmåter som er velkjente for den erfarne utøver, og som omfatter konstruksjon av en vektor hvor fragmentet er innsatt og transformering av vertsorganismen med vektoren. Egnede vektorer omfatter plasmider som kan replikeres i den valgte vertsorganisme. En tenker seg også at kasjon, f.eks. et plasmid, en bakteriofag eller et ekstra-kromosomalt element, et minikromosom eller et kunstig kromosom. Alternativt kan vektoren være en som ved innføring i en vertscelle integreres i vertscellegenomet og replikeres sammen med kromosomet.

I vektoren bør DNA-fragmentet som koder for det heksoseoksidaseaktive polypeptid, være operativt koblet til en egnet promotersekvens. Promoteren kan være enhver DNA-sekvens som gir transkripsjonen aktivitet til den valgte vertsorganisme, og kan være avledet fra gener som koder for proteiner som enten er homologe eller heterologe for vertsorganismen. Eksempler på egnede promotere for styring av transkripsjon av DNA-fragmentet ifølge oppfinnelsen i en bakterievert er promoteren fra lac-operonet i E. coli, dagA-promoterene fra agarasegenet i Streptomyces coelicolor, promoterene fra a-amylasegenet ( amyL) i Bacillus licheniformis, promoterene fra det maltogene amylasegen ( amyM) i Bacillus stearothermophilus, promoterene fra a-amylasegenet ( amyQ) i Bacillus amyloliquefaciens og promoterene fra xylA- og xylB-genene i Bacillus subtilis.

For transkripsjon i en soppart er eksempler på anvendbare promotere slike som er avledet fra genene som koder for alkoholoksidase i Pichia pastoris, TAKA-amylase i Aspergillus oryzae, aspartatproteinase i Rhinozomucor miehei, nøy-tral a-amylase i Aspergillus niger, syrestabil a-amylase i A. niger, glukoamylase i A. niger, lipase i Rhizomucor miehei, alkalisk protease i Aspergillus oryzae, triosefosfatisomerase i Aspergillus oryzae eller acetamidase i Aspergillus nidulans. Som eksempler på egnede promotere for ekspresjon i en gjærart kan Gal 1- og Gal 10-promoteren fra Saccharomyces cerevisiae nevnes. Ved ekspresjon i en bakterieart som E. coli, kan en egnet promoter velges blant bakteriofagpromotere, heriblant T7-promotere og lambda-bakteriofagpromotere.

Vektoren som DNA-fragmentet som koder for det heksoseoksidaseaktive polypeptid, kan også omfatte en seleksjons-markør, dvs. et gen hvis produkt komplementerer en defekt i vertsorganismen, f.eks. en mutasjon som gir en auxotrof feno-type, eller markøren kan være én som gir antibiotikaresistens DNA-fragmentet kan integreres i vertsorganismens kromosom, f.eks. ved å innsette fragmentet i et transposerbart element, f.eks. et transposon, og behandle en blanding av den valgte vertsorganisme og transposonet ved betingelser hvor transposonet vil integreres i vertsorganismens kromosom og kombineres med et egnet ekspresjonssignal.

Ifølge oppfinnelsen kan et heksoseoksidaseaktivt, polypeptidkodende DNA-fragment som omfatter genet for polypeptidet, fremstilt ved fremgangsmåter som beskrevet ovenfor eller ved en rekke alternative fremgangsmåter kjent innen faget, uttrykkes i enzymatisk aktiv tilstand ved å benytte en ekspresjonsvektor. En ekspresjonsvektor omfatter vanligvis de samme bestanddeler som en typisk kloningsvektor, dvs. et element som tillater autonom replikasjon av vektoren i den valgte vertsorganisme og én eller flere fenotypiske markører for seleksjonsformål. En ekspresjonsvektor omfatter kontrollsekvenser som koder for en promoter, en operator, et ribosombin-dingssete, et translasjonsinitieringssignal og, om ønskelig, et repressorgen eller ett eller flere aktivatofgener. For å oppnå sekresjon av det uttrykte polypeptid kan en signalsek-vens innsettes oppstrøms for den kodende gensekvens. I den foreliggende sammenheng omfatter begrepet "ekspresjonssignal" enhver av de ovenfor nevnte kontrollsekvenser, repressorsek-venser og aktivatorsekvenser, og signalsekvensen. For ekspresjon under kontroll av kontrollsekvenser kobles det heksoseoksidasekodende gen operativt til kontrollsekvensene på en måte som tillater ekspresjon. Promotersekvenser som kan innføres i plasmidvektorer og som kan understøtte transkripsjon av heksoseoksidasegenet, omfatter, men er ikke begrenset til, tac-promoteren og bakteriofag lambda-avledede promotere, heriblant PL-promoteren og PR-promoteren.

En ekspresjonsvektor som bærer DNA-fragmentet ifølge oppfinnelsen, kan være enhver vektor som er i stand til å uttrykke heksoseoksidasegenet i den valgte vertsorganisme, og valg av vektor vil avhenge av vertscellen i hvilken den skal innføres. Vektoren kan således være en autonomt replikerende vektor, dvs. en vektor som foreligger som en ekstrakromosomal enhet hvis replikasjon er uavhengig av den kromosomale repli-

eller resistens for tungmetallioner.

Vertsorganismen ifølge oppfinnelsen som enten omfatter et DNA-konstrukt eller en ekspresjonsvektor som beskrevet ovenfor, benyttes med fordel som en vertsorganisme for rekombinant fremstilling av et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Cellen kan være transformert med et DNA-konstrukt som omfatter genet som koder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen, eller DNA-konstruktet kan med fordel være integrert i vertskromosomet. Slik integrasjon anses generelt som fordelaktig siden DNA-fragmentet mer sannsynlig vil opprettholdes stabilt i cellen. Integrasjon av DNA-konstruktene i vertskromosomet kan utføres ifølge sedvanlige fremgangsmåter, f.eks. ved homolog eller heterolog rekombinasjon eller ved å benytte et transposerbart element. Alternativt kan vertsorganismen transformeres med en ekspresjonsvektor som beskrevet ovenfor.

Vertsorganismen kan være en celle fra en høyere organisme, f.eks. en dyrecelle, heriblant en pattedyrcelle, en fuglecelle eller en insektcelle eller en plantecelle. I foretrukne utførelser er imidlertid vertsorganismen en mikrobiell celle, f.eks. en bakteriecelle eller én soppcelle, heriblant en gjærcelle.

Eksempler på egnede bakterielle vertsorganismer er grampositive bakteriearter som Bacillaceae, heriblant Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus cir-culans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium og Bacillus thuringiensis, Streptomyces- arter som Streptomyces murinus, melkesyrebakteriearter, heriblant Lactococcus spp. som Lactococcus lactis, Lactobacillus spp., heriblant Lactobacillus reuteri, Leuconostoc spp. og Streptococcus spp. Alternativt kan stammer fra gramnegative bakteriearter, f.eks. en art til-hørende Enterobacteriaceae, heriblant E. coli, eller til Pseudomonadaceae, velges som vertsorganisme.

En gjærvertsorganisme kan med fordel utvelges blant arter tilhørende Saccharomyces, heriblant Saccharomyces cerevisiae eller arter tilhørende Schizosaccharomyces. Egnede vertsorganismer blant filamentøse sopp omfatter arter fra Aspergillus, f.eks. Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans eller Aspergillus niger. Alternativt kan stammer av en Fusarium-ar.t, f.eks. Fusarium oxysporum, eller fra en. Rhizomucor-art, f.eks. Rhizomucor. miehei, benyttes som vertsorganisme. I en foretrukket utførelse benyttes en stamme av arten Pichia pastoris som vertsorganisme.

Noen av de ovenfor nevnte, anvendbare vertsorganismer, f.eks. sopparter og grampositive bakteriearter, kan transformeres ved en prosess som omfatter protoplastdannelse og transformasjon av protoplastene, fulgt av regenerering av celleveggen ved fremgangsmåter kjent per se.

For fremstilling av det heksoseoksidaseaktive polypeptid dyrkes de rekombinante vertsorganismeceller som beskrevet ovenfor, under betingelser som fører til ekspresjon av polypeptidet i en gjenvinnbar form. Mediet som benyttes for dyrking av cellene, kan være ethvert konvensjonelt medium som er egnet for dyrking av vertscellene det gjelder og for ekspresjon av polypeptidet. Egnede medier er tilgjengelige fra kommersielle leverandører, eller de kan fremstilles ifølge publiserte oppskrifter.

Det resulterende polypeptid gjenvinnes typisk fra dyrkningsmediet ved konvensjonelle fremgangsmåter som omfatter atskillelse av cellene fra mediet ved sentrifugering eller filtrering, om nødvendig, etter oppbrytning av cellene, fulgt av utfelling av de proteinholdige bestanddeler i supernatanten eller filtratet, f.eks. ved tilsetning av et salt som ammon-iumsulfat, fulgt av et'rensetrinn.

Det er en industrielt fordelaktig side ved oppfinnelsen at mikrobielle kulturer, f.eks. bakteriekulturer, som benyttes i fremstilling av næringsmiddel- eller forprodukter, kan benyttes som vertsorganisme som uttrykker genet som koder for det heksoseoksidaseaktive polypeptid. Således kan melkesyrebakterie-startkulturer som benyttes i fremstilling av meieriprodukter eller andre næringsmiddelprodukter, f.eks. kjøttprodukter eller vin, og som f.eks. omfatter én eller flere stammer av en melkesyrebakterie utvalgt blant enhver av de ovenfor nevnte melkesyrebakteriearter, benyttes som vertsorganisme, hvorved heksoseoksidase vil fremstilles direkte i næringsmiddelproduktet til hvilket startkulturene tilsettes.

På tilsvarende måte kan det heksoseoksidasekodende gen innføres i melkesyrebakterie-startkulturer som benyttes som inokulanter som tilsettes til foravlinger som gress eller mais, eller til proteinholdige avfallsprodukter fra dyr, f.eks. fiskeavfall og slakteriavfall for fremstilling av silo for benyttelse som dyrefor. For dette formål vil ekspresjon av heksoseoksidase i siloinokulantene medføre at oksygenet som opprinnelig forelå i avlingen eller avfallsstoffene som skal ensileres, fjernes, hvorved det etableres anaerobe betingelser som vil inhibere vekst av aerobe forråtnelsesorganismer som gramnegative bakterier og gjær.

Det omfattes også at gjærkulturer som brødgjær eller gjærkulturer som benyttes til fremstilling av alkoholholdige drikkevarer, heriblant vin og øl, kan benyttes som vertsorganismer for genet som koder for det heksoseoksidaseaktive polypeptid ifølge oppfinnelsen. Når det f.eks. gjelder slike rekombinante stammer av brødgjær, vil heksoseoksidasen som produseres, ha en deigforbedrende virkning.som beskrevet i det påfølgende.

Fra beskrivelsene ovenfor er det åpenbart at direkte tilsetning av rekombinante, mikrobielle kulturer som uttrykker heksoseoksidasen ifølge oppfinnelsen til et næringsmiddelprodukt eller ethvert annet produkt hvor heksoseoksidaseaktivitet er ønskelig, kan benyttes som et alternativ til tilsetning av det isolerte enzym.

I ytterligere industrielt viktige utførelser benyttes de rekombinante, mikrobielle kulturer som uttrykker et heksoseoksidaseaktivt polypeptid i en bioreaktor for fremstilling av enzymet eller for fremstilling av laktoner fra ethvert av de ovenfor nevnte karbohydrater som kan oksideres av det heksoseoksidaseaktive enzym. For denne siste anvendelse er det fordelaktig å immobilisere cellene fra de mikrobielle kulturer til et fast støttemiddel, f.eks. et polymermateriale, som fortrinnsvis foreligger i form av små partikler slik at det tilveiebringes en stor overflate for binding av cellene. Alternativt kan det isolerte enzym benyttes for formålet ovenfor, også fortrinnsvis bundet til et fast støttemiddel. I denne sammenheng kan binding av cellene eller enzymet oppnås ved enhver konvensjonell fremgangsmåte for dette formål.

I andre anvendbare utførelser av oppfinnelsen kan polypeptidet med heksoseoksidaseaktivitet være et fusjonsprodukt, dvs. et polypeptid som i tillegg til de heksoseoksidaseaktive aminosyresekvenser omfatter ytterligere aminosyresekvenser med andre anvendbare aktiviteter. Således omfattes fusjonspolypeptider med én eller flere enzymaktiviteter i tillegg til heksoseoksidaseaktiviteten. Slike tilleggsenzymakti-viteter kan utvelges blant enzymer som kan degradere karbohydrater, f.eks. laktase, amylaser, heriblant glukoamylaser, glukanaser, cellulaser, hemicellulaser, xylanaser, laktaser eller enhver annen oksidoreduktase, f.eks. glukoseoksidase, galaktoseoksidase eller pyranoseoksidase, og også blant pro-teaser og peptidaser, lipaser eller nukleaser. Den eller de tilleggsenzymsekvens(er) som utvelges for innføring i et heksoseoksidasepolypeptid ifølge oppfinnelsen, avhenger av produktet som det enzymatisk aktive fusjonsprodukt er tenkt rettet mot. Som eksempler omfattes således at et heksoseoksidaseaktivt fusjonspolypeptid som skal benyttes ved fremstilling av et meieriprodukt, med fordel vil omfatte en laktase, en protease eller en peptidase, og at et fusjonspolypeptid beregnet for deigforbedring, som fusjonspartner kan omfatte ethvert av de ovenfor nevnte karbohydratdegraderende enzymer. Det er også åpenbart at mikrobielle celler ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor som uttrykker et heksoseoksidaseaktivt fusjonspolypeptid med ytterligere enzymaktiviteter, kan benyttes for inokulering av andre næringsmiddelprodukter og dyrefor på samme måte som beskrevet ovenfor.

Det omfattes også at en egnet fusjonspartner kan være en sekvens som tilfører heksoseoksidasen endrede egenskaper, f.eks. løselighet, eller en sekvens som kan fungere som en "merkelapp" som gir heksoseoksidasen evnen til å bindes sterkere eller mer selektivt til et gitt, fast materiale for rensing av heksoseoksidasepolypeptid eller for å oppnå immobi-lisering .

Videre ligger det innenfor oppfinnelsens område å tilveiebringe polypeptidet som et kimært produkt som omfatter delsekvenser fra heksoseoksidaseaktive polypeptider avledet fra forskjellige kilder som kodes av et DNA-fragment som er fremstilt ved å kombinere heksoseoksidaseaktivt polypeptidkodende DNA-sekvenser fra disse forskjellige kilder inn i ett DNA-fragment som koder for hele det kimære polypeptid.

I én anvendbar utførelse er fremgangsmåten som beskrevet heri en fremgangsmåte hvori DNA-fragmentet som koder for det heksoseoksidaseaktive polypeptid, omfatter minst én DNA-sekvens som koder for en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av

hvor X står for en aminosyre utvalgt fra gruppen som består av Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val,

og muteiner og varianter av disse.

I den foreliggende sammenheng benyttes begrepet "variant" for å betegne enhver modifikasjon av en heksoseok-sidaseaktiv polypeptidsekvens som ikke fører til fullstendig

tap av heksoseoksidaseaktiviteten. Modifikasjonene kan omfatte delesjon, erstatning av aminosyrerester som foreligger i polypeptidet som avledet fra en naturlig kilde eller i en allerede modifisert polypeptidsekvens, eller modifikasjonen kan medføre innføring i et slikt polypeptid av ytterligere aminosyrerester. Erstatning av én eller flere aminosyrerester kan ut-føres ved å modifisere eller substituere kodonet eller kodonene som koder for aminosyren eller aminosyrene som det er ønskelig å erstatte, f.eks. mutagenese, særlig setestyrt mutagenese, ved å benytte fremgangsmåter som er kjente per se. På tilsvarende måte kan delesjon av én eller flere aminosyrerester utføres ved å delere det tilsvarende kodon eller kodonene i DNA-fragmentet som koder for polypeptidet som beskrevet heri.

Som også nevnt ovenfor, kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som et videre trinn omfatte rensing av polypep-tidpreparatet som først ble gjenvunnet fra dyrkningsmediet og/eller mikroorganismene. Formålet med dette videre rensetrinn er å erholde et enzympreparat i hvilket heksoseoksidase-polypeptidet foreligger i i det vesentlige ren tilstand. Begrepet "i det vesentlige ren tilstand" antyder at preparatet er uten noen uønskede, forurensende forbindelser som stammer fra dyrkningsmediet, vertsorganismecellene benyttet i fremstillingen eller substanser fremstilt av disse celler under dyrkning. Således er det i mange utførelser viktig at polypep-tidpreparatet som oppnås ved rensetrinnet, i det vesentlige er fritt for enhver enzymatisk aktivitet som ikke er heksoseoksidaseaktivitet. Rensefremgangsmåtene vil avhenge av renhets-graden som er ønskelig, men vil typisk utvelges blant konvensjonelle fremgangsmåter for proteinrensing som utsalting, af-finitetskromatografi- eller ionebytterkromatografifremgangs-måter, heriblant hydrofob interaksjonskromatografi, og gelfil-treringsfremgangsmåter, f.eks. fremgangsmåten beskrevet i de påfølgende eksempler.

Som nevnt ovenfor, er det videre beskrevet et polypeptid i isolert tilstand med heksoseoksidaseaktivitet som omfatter minst én av de ovenfor nevnte aminosyresekvenser eller muteiner og varianter av disse, som beskrevet ovenfor. Polypeptidet fremstilles fortrinnsvis ifølge fremgangsmåtene beskrevet ovenfor.

Avhengig av fremstillingsfremgangsmåten, særlig den aktuelle vertsorganisme, kan polypeptidet ifølge .oppfinnelsen være glykosylert i varierende grad, eller det kan for visse formål med fordel være uttrykt i en i det vesentlige ikke-glykosylert tilstand.

I én foretrukket utførelse av oppfinnelsen er polypeptidet et polypeptid med funksjonelle egenskaper som er identiske eller delvis identiske med egenskapene til heksoseoksidase som forekommer naturlig i algearten Chondrus crispus som disse egenskaper er beskrevet innen teknikkens stand. Det ble funnet at en slik heksoseoksidase ekstrahert fra alge-kilden, kan vise atskilte proteinbånd på 29, 40 og/eller 60 kD ved analyse ved SDS-PAGE som beskrevet heri.

For å oppnå en generelt kostnadseffektiv anvendelse av polypeptidet foretrekkes det at enzymet har en høy enzymatisk aktivitet over et vidt pH-område. Det foretrekkes således at heksoseoksidasen ifølge oppfinnelsen i det minste viser enzymatisk aktivitet ved en pH i området mellom 1 og 9, f.eks. i området mellom 2-9, heriblant området 5-9. I denne sammenheng omfattes det at pH-området for aktivitet eller pH-optimum for en naturlig avledet heksoseoksidase kan modifis-eres i ønsket retning og i ønsket grad ved å modifisere enzymet som beskrevet ovenfor, eller ved tilfeldig mutagenese av et replikon eller én vertsorganisme som omfatter DNA som koder for heksoseoksidase, fulgt av utvelgelse av mutanter med de ønskede, endrede pH-egenskaper. Alternativt kan slik modifisering av enzymet være rettet mot modifisering av varme-toleransen og optimal temperatur, for aktivitet av det heksoseoksidaseaktive polypeptid, eller mot å endre enzymets isoelektriske punkt.

Videre er polypeptidet ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis enzymatisk aktivt innenfor et bredt temperaturområde som mellom 10 og 90 °C, f.eks. innenfor et område fra 15 til 80 °C, heriblant området mellom 20-60 °C. Nærmere bestemt kan det for visse spesifikke formål foretrekkes at det heksoseoksidaseaktive polypeptid bibeholder en signifikant enzymatisk restaktivitet ved temperaturer på 70 °C eller høyere, f.eks. når enzymet er ment brukt i deiger hvor det kan være fordelaktig å ha heksoseoksidaseaktivitet under i det minste en del av det påfølgende baketrinn.

Området for anvendelse av heksoseoksidasen avhenger av utvalget av karbohydrater som enzymet kan benytte som substrat. Selv om heksoseoksidase synes å ha høyest substratspesifisitet for heksoner, f.eks. glukose, galaktose og mannose, er det funnet at utvalget av karbohydratforbindelser som kan benyttes som substrat for polypeptidet ifølge oppfinnelsen, ikke er begrenset til heksoser. Således er et foretrukket polypeptid ett som i tillegg til høy spesifisitet for heksoser også har høy spesifisitet for andre karbohydratforbindelser, heriblant disakkarider som laktose, maltose og/eller cellobiose, og også vesentlig spesifisitet overfor pentoser, f.eks. xylose, eller deoksypentoser eller deoksyheksoser, f.eks. ram-nose eller fukose. Det har betydelige praktiske følger at heksoseoksidasen i tillegg til høy spesifisitet overfor heksoser og andre monosakkarider også har vesentlig spesifisitet overfor disakkarider, særlig laktose som foreligger i melk, og maltose som bl.a. foreligger i kornmel og deiger.

Følgelig ér polypeptidet ifølge oppfinnelsen i en annen foretrukket utførelse et polypeptid som i tillegg til D-glukose oksiderer minst ett sukker utvalgt fra gruppen som består av D-galaktose, maltose, cellobiose, laktose, D-mannose, D-fukose og D-xylose.

I nok en annen foretrukket utførelse har det heksoseoksidaseaktive polypeptid et isoelektrisk punkt i området mellom 4 og 5. Nærmere bestemt kan polypeptidet fortrinnsvis ha et isoelektrisk punkt på 4,3 ± 0,1 eller et isoelektrisk punkt på 4,5 ± 0,1.

Generelt har polypeptidet ifølge oppfinnelsen typisk en molekylvekt, bestemt ved gelfiltrering med "Sephacryl S-200 Superfine" (Pharmacia), i området mellom 100-150 kD. En molekylvekt bestemt ved denne eller ekvivalente fremgangsmåter, betegnes også som en tilsynelatende molekylvekt. Nærmere bestemt kan polypeptidet ha en tilsynelatende molekylvekt på 110

kD ± 10 kD.

Nok en side ved oppfinnelsen tilveiebringer et rekombinant DNA-molekyl som omfatter et DNA-fragment som koder for et polypeptid med heksoseoksidaseaktivitet. Som beskrevet ovenfor, kan et slikt DNA-fragment isoleres fra en naturlig kilde eller konstrueres, f.eks. som beskrevet i detalj i eksemplene nedenfor. Videre kan det kodende fragment også syntetiseres basert på aminosyresekvenser fra en naturlig forekommende heksoseoksidase. Det rekombinante molekyl kan utvelges fra enhver av ekspresjonsvektortypene nevnt ovenfor. I foretrukne utførelser omfatter det rekombinante DNA-molekyl et DNA-fragment som koder for et heksoseoksidasepolypeptid som omfatter minst én av de ovenfor nevnte aminosyresekvenser (i) til (viii), eller et mutein eller derivat av et slikt polypeptid. I én spesifikk utførelse omfatter det rekombinante DNA-molekyl følgende DNA-sekvens (SEKV.ID NR. 30):

Videre tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utfør-else en mikrobiell celle som inneholder det ovenfor nevnte, rekombinante DNA-molekyl. Den generelle beskrivelse gitt ovenfor av vertsorganismen som inneholder et DNA-fragment som koder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen, omfatter en slik mikrobiell celle, og slike celler kan følgelig utvelges blant alle de ovenfor nevnte mikrobielle grupper, familier, slekter og arter, dvs. at den mikrobielle celle kan utvelges blant bakterieceller, soppceller eller gjærceller, f.eks. en E. coli- celle, en melkesyrebakteriecelle, en Saccharomyces cerevisiae- celle og en Pichia pastoris- celle.

Den mikrobielle celle ifølge oppfinnelsen kan, dersom den er beregnet for direkte tilsetning til et produkt hvor det er ønskelig å ha heksoseoksidaseaktivitet, f.eks. i en frem-stillingsprosess, foreligge i form av en mikrobiell kultur, fortrinnsvis i konsentrert tilstand. Således kan en slik kultur med fordel inneholde den mikrobielle celle ifølge oppfinnelsen i en konsentrasjon som fortrinnsvis ligger i.området mellom IO<5> og IO<12> pr. g kultur. Kulturen kan være en fersk kultur, dvs. en ikke nedfrosset suspensjon av cellene i et flytende medium, eller den kan foreligge i form av en nedfrosset eller tørket kultur, f.eks. en frysetørket kultur. Den mikrobielle celle kan også for spesifikke formål være immobi-lisert til et fast støttemiddel.

Som nevnt ovenfor, gjelder oppfinnelsen i nok en annen utførelse, anvendelse av det heksoseoksidaseaktive polypeptid ifølge oppfinnelsen eller en mikrobiell celle som uttrykker et slikt polypeptid ved fremstilling av næringsmiddelprodukter. I denne sammenheng bør begrepet "fremstilling" for-stås på bredest mulig måte slik at det omfatter tilsetning av heksoseoksidase eller den mikrobielle celle til bestanddeler for næringsmiddelproduktet det gjelder, før, under eller etter ethvert av de andre prosesstrinn, under pakking og under lagring av det ferdige produkt frem til det skal konsumeres. Næringsmiddelproduktene hvor slik anvendelse er fordelaktig, kan være ethvert produkt hvor sluttproduktene fra heksoseoksidase har fordelaktige virkninger på næringsmiddelproduktet. Naturligvis vil den ønskede aktivitet av heksoseoksidasen kun oppnås dersom substrat for enzymet foreligger i tilstrekkelige mengder. Substratkarbohydratene kan være naturlig foreliggende i næringsmiddelproduktet eller dettes bestanddeler, eller de kan tilsettes eller genereres i løpet av fremstillingsprosessen. Et eksempel på at substrat genereres under fremstillingen er den enzymatiske degradering av di-, oligo- eller polysakkarider til lavere sukkerforbindelser som kan degraderes av heksoseoksidasen, som kan foregå som et resultat av enzymatisk aktivitet av enzymer som naturlig foreligger i næringsmiddelproduktet, eller som tilsettes under fremstillingen. Videre kan substrat for det at heksoseoksidaseaktive polypeptid genereres som et resultat av enzymatisk aktivitet av en fusjonspartner som beskrevet ovenfor.

De ønskede virkninger av heksoseoksidaseaktivitet i et produkt som inneholder substrater for enzymet, omfatter dannelse av laktoner fra sukkersubstratet som deretter kan overføres til de tilsvarende syrer, dannelse av hydrogenperoksid og forbruk av oksygen.

Typiske eksempler på næringsmiddelprodukter hvor heksoseoksidaseaktivitet kan være fordelaktig, omfatter f.eks. meieriprodukter, stivelsesholdige næringsmiddelprodukter og ikke-meieridrikkevarer. Ved fremstilling av en rekke meieriprodukter er det således ønskelig å redusere pH. Dette oppnås konvensjonelt ved å inokulere melken med melkesyreproduserende startkulturer. Som nevnt ovenfor, omfattes det at heksoseoksidase eller organismer som uttrykker dette enzym, kan benyttes som en alternativ måte for surgjøring av melk. Den samme virkning kan være ønskelig i andre næringsmiddelprodukter som surgjøres under fremstillingen, f.eks. visse kjøttprodukter eller vegetabilske produkter som i dag surgjøres ved tilsetning av melkesyrebakterie-startkulturer.

Oksygenforbruket som følger av heksoseoksidasens aktivitet, har flere fordelaktige konsekvenser når det gjelder fremstilling av næringsmiddelprodukter og farmasøytika. Ved at den reduserer mengden av eller fjerner oksygen i næringsmidler og farmasøytika som inneholder lipider som lett utsettes for oksidative ødeleggelsesprosesser, kan heksoseoksidase virke som en antioksidant, og reduksjonen i oksygeninnhold kan i tillegg inhibere forråtnelsesorganismer hvis vekst avhenger av oksygennærvær, og det heksoseoksidaseaktive polypeptid kan følgelig også virke som et antimikrobielt middel.

Denne siste virkning kan utnyttes til å forlenge lagringsstabiliteten av innpakkede næringsmidler hvor ødeleg-gelse kan forhindres ved innføring av det heksoseoksidaseaktive polypeptid ifølge oppfinnelsen, enten i selve næringsmiddelproduktet eller ved å tilveiebringe en blanding av heksoseoksidase og et egnet substrat for enzymet i pakken, men atskilt fra næringsmiddelproduktinnholdet. I et typisk eksempel er en slik blanding festet til innsiden av en nærings-middelbeholder, f.eks. en hermetikkboks eller en krukke. Føl-gelig kan heksoseoksidasen ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes som et oksygenfjernende middel ved pakking av næringsmidler.

Det er åpenbart at virkningene nevnt ovenfor av polypeptidet ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av næringsmiddelprodukter, også vil kunne benyttes ved fremstilling av dyreforprodukter. Nærmere bestemt er.dis.se virkninger ønske-lige ved fremstilling av silofor som enten er.fremstilt av foravlinger som gress eller mais, eller fra proteinholdige avfallsprodukter fra slakterier eller fiskeproduktfremstill-ende bedrifter. Slike forprodukter ensileres i dag ved tilsetning av syrer eller syreproduserende bakterier, f.eks. melke-syrebakterielle inokulanter. For å fremme vekst av surgjørende bakterier og forhindre vekst av aerobe forråtnelsesorganismer som gramnegative bakterier og gjær, er det essensielt å ha et lavt oksygeninnhold i silomaterialet. Det omfattes derfor at heksoseoksidasen ifølge oppfinnelsen er anvendbar som oksygenfjernende og surgjørende middel ved ensilering av dyrefor, om ønskelig i form av preparater som videre omfatter ett eller flere konvensjonelle silotilsetningsstoffer, f.eks. melkesyre-bakterielle inokulanter eller enzymer som danner lavmolekylære sukkerforbindelser.

Nok en nyttig anvendelse av heksoseoksidasepolypep-tidet ifølge oppfinnelsen er anvendelse av enzymet for å redusere sukkerinnholdet i et næringsmiddelprodukt, som omfatter tilsetning til produktet av en mengde av polypeptidet eller en mikrobiell celle som produserer polypeptidet som er tilstrekkelig til å fjerne i det minste en del av sukkeret som opprinnelig forelå i næringsmiddelproduktet. Slik anvendelse kan f.eks. være nyttig ved fremstilling av diettmat for dia-betiske pasienter hvor et lavt sukkerinnhold er ønskelig, og ved fremstilling av vin med redusert alkoholinnhold. I denne siste anvendelse tilsettes heksoseoksidase fortrinnsvis til mosten før inokulering med gjær.

I nok en anvendbar utførelse gjelder oppfinnelsen anvendelse av det heksoseoksidaseaktive polypeptid eller av en mikrobiell celle som produserer enzymet ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av farmasøytiske produkter, kosmetika eller tannpleieprodukter, f.eks. tannpasta eller tannkritt. De ønskede virkninger av heksoseoksidase i slike produkter er i det vesentlige de samme som beskrevet ovenfor for næringsmiddelprodukter og dyrefor.

Én spesielt interessant anvendelse av heksoseoksidasen ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelse.av enzymet som et deigforbedringsmiddel. Det er funnet at tilsetning av heksoseoksidase til en deig fører til økt motstand av deigen for å brytes opp når deigen strekkes, dvs. at enzymet tilfører til deigen økt styrke hvorved den er mindre utsatt for mekan-isk deformasjon. Det er, basert på de kjente virkninger i denne sammenheng av glukoseoksidase, omfattet at denne virkning av tilsetning av heksoseoksidase ifølge oppfinnelsen til en deig er et resultat av dannelse av kryssbindinger mellom tiolgrupper i svovelholdige aminosyrer i melproteiner som foregår når hydrogenperoksidet som dannes av enzymet i deigen, reagerer med tiolgruppene som derved oksideres.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen også en fremgangsmåte for fremstilling av et bakeprodukt fra en deig som omfatter tilsetning til deigen av en effektiv mengde av polypeptidet eller en mikroorganisme ifølge oppfinnelsen som er i stand til å uttrykke et slikt polypeptid, og et deigforbedrende preparat som omfatter polypeptidet eller en mikroorganisme som kan uttrykke et slikt polypeptid i en deig, og minst én konvensjonell deigbestanddel. I anvendbare utførelser kan et slikt preparat videre omfatte minst ett deig- eller bakeri-produktforbedrende enzym, f.eks. en cellulase, en hemicellu-lase, en pentosanase, en lipase, en xylanase, en amylase, en glukoseoksidase eller en protease.

I ytterligere utførelser som beskrevet heri benyttes heksoseoksidasen som et analytisk reagens i fremgangsmåter for bestemmelse i en biologisk prøve eller en annen prøve av kon-sentrasjonen av ethvert sukker som kan konverteres av enzymet. Sukkerinnholdet måles typisk ved å bestemme mengden av sluttprodukter som følger av den enzymatiske omdannelse av sub-stratsukkeret som foreligger i prøven som skal analyseres. I denne sammenheng omfattes det at heksoseoksidasen kan benyttes direkte som et reagens i en analytisk analyse in vitro eller at enzymet kan innføres i en sensor.

Oppfinnelsen vil nå illustreres ved hjelp av de på-følgende eksempler og de vedlagte tegninger av hvilke: Figur 1 viser en skjematisk oversikt over rensing av heksoseoksidase (HOX) og de to strategier benyttet for å er-, holde aminosyresekvensinformasjon. Figur 2 viser nativ, ikke-dissosierende polyakrylamidgelelektroforese (nativ PAGE) av preparater av heksoseoksidase ved forskjellige rensetrinn. Prøvene representerer en-zympreparatet erholdt etter ionebytterkromatografi og konsen-trering (spor 1), etter gelfiltrering (spor 2) og etter enten kationbytterkromatografi (spor 3) eller kromatofokusering (spor 4). "Phast"-gelen (Pharmacia, 8-25% gradientgel) ble sølvfarget. Molekylvekten av standardproteiner (x IO"<3>) er angitt til venstre. Båndet som tilsvarer heksoseoksidase som er angitt med en pil, ble identifisert ved enzymfarging av en annen gel i parallell (ikke vist). De fire spor ble kjørt på atskilte geler. Figur 3 viser UV-profilen erholdt under rensing av heksoseoksidase ved gelfiltrering på "Sephacryl S-200 HR" som beskrevet i teksten. Fraksjoner som inneholder heksoseoksidase (HOX)-aktivitet, er angitt ved det skraverte område. Figur 4 viser SDS-PAGE av heksoseoksidase renset fra Chondrus crispus ved anionbytterkromatografi på "DEAE-Sepharose Fast Flow", gelfiltrering på "Sephacryl S-200", fulgt av enten kationbytterkromatografi på "S-Sepharose Fast Flow" (spor 1) eller kromatofokusering i en "Mono P"-kolonne (spor 2). Molekylvekten av standardproteiner (x IO"<3>) er angitt til venstre. Polypeptidene ved 60 kD, 40 kD og 29 kD er angitt med piler. Reduserte prøver ble analysert i en 12% polyakrylamid-gel som ble farget med "Coomassie Brilliant Blue R-250". De to spor ble kjørt på atskilte geler. Figur 5 viser isoelektrisk fokusering (IEF) av heksoseoksidase. Gelen ble enten farget med "Coomassie Brilliant Blue R-250" (spor 1) eller farget for enzymaktivitet som beskrevet i teksten (spor 2). Posisjonene av markører for det isoelektriske punkt kjørt i parallell, er vist til venstre. De to spor ble kjørt i atskilte geler. Figur 6 viser reversfase-HPLC-separasjon av peptider dannet ved kløyving av HOX-polypeptidet på 4 0 kD med endoproteinase Lys-C. Toppene merket 1, 2, 3, 4 og 5, ble analysert ved aminosyresekvensering. Figur 7 viser reversfase-HPLC-separasjon av peptider dannet ved kløyving av HOX-polypeptidet på 29 kD med endoproteinase Lys-C. Toppene merket 1 og 2, ble analysert ved aminosyresekvensering. Figur 8 viser en Northern-blot-analyse av RNA ekstrahert fra Chondrus crispus. Den denaturerende agarosegel ble tilført 30 ug (spor 1), hhv. 3 ug (spor 2) av total-RNA. Venstre pil angir det heksoseoksidase-spesifikke transkript. Posisjonene av molekylvektsmarkører i kb er vist til høyre. Figur 9 viser konstruksjon av plasmid pUP0153 som formidler ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase til Pichia pastoris. Små piler angir PCR-primere. Det grå rektangel angir heksoseoksidasegenet. Figur 10 viser rensing av rekombinant heksoseoksidase fra Pichia pastoris ved ionebytterkromatografi i "HiTrap-Q"-kolonne (trinn én). Alkoholoksidase (AOX)-aktivitet (o) og heksoseoksidase (HOX)-aktivitet (o) i de oppsamlede fraksjoner ble analysert som beskrevet i teksten. Figur 11 viser rensing av rekombinant heksoseoksidase fra Pichia pastoris ved gelfiltrering på "Sephacryl S-200 HR"

(trinn to). Alkoholoksidase (AOX)-aktivitet (o) og heksoseoksidase (HOX)-aktivitet (o) i de oppsamlede fraksjoner ble ana-

lysert som beskrevet i teksten.

Figur 12 viser konstruksjon av plasmid pUP0181 som formidler ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase i E. coli. Små piler angir PCR-primere (grått rektangel angir heksoseoksidasegenet). Figur 13 viser SDS-PAGE av rekombinant heksoseoksidase fremstilt i E. coli. Råekstrakter fra lyserte celler ble analysert i en 14% denaturerende gel. Molekylvekter av standardproteiner (x IO"<3>) er angitt til venstre. Gelen ble farget med "Coomassie Brilliant Blue R-250". Spor 1 viser ekstrakt fra E. coli-celler med pUP0181, spor 2 viser plasmidfri kontroll. Pilen angir heksoseoksidasebåndet. Figur 14 viser konstruksjon av plasmid pUP0155 som formidler ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase i Saccharomyces cerevisiae. Små piler angir PCR-primere. Det grå rektangel viser heksoseoksidasegenet.

Eksempel 1

Rensing av heksoseoksidase fra Chondrus crispus

En skjematisk oversikt over rensingen og to strategier benyttet for erholdelse av aminosyresekvensinformasjon for enzymet, er vist i fig. 1.

1. 1. Oppsamling, tørking og maling av Chondrus crispus

Det røde sjøgress Chondrus crispus ble oppsamlet i tidsrommet april til september på stranden nær Grenå, Jylland, Danmark ved en dybde på 2-5 m. Nyoppsamlede algeblader ble renset med kaldt vann og lagret på is under transport til laboratoriet (< 24 timer). Sjøgresset ble så enten tørket umiddelbart eller lagret i frossen tilstand inntil videre prosessering. For enzymrensing ble materialet lagret ved -18 °C, mens materialet beregnet for isolering av mRNA, ble lagret i flytende nitrogen.

Blader av Chondrus crispus ble tint ved 4 °C og luft-tørket ved romtemperatur (20-25 °C) i 2-3 dager. Det tørkede materiale ble malt til et fint pulver i en "Waring Commercial Blendor" (modell 34BL97, Waring, New Harford, Connecticut,

USA) .

1. 2. Ekstraksjon av enzym

Tilnærmet 500 g Chondrus crispus-pulver ble blandet med 2,5 1 20 mM Tris-C.l, pH 7,0. Vannet som ble benyttet gjennom ekstraksjonen og rensefremgangsmåtene, ble erholdt fra et "Milli-Q UF Plus Laboratory "Water Purification System" (Millipore). Bufferen var forkjølt til 4 °C. Blandingen ble holdt ved 4 °C i 6-8 dager. Ekstrakten ble oppsamlet ved filtrering gjennom flere gaslag.

Sjøgressmaterialet ble behandlet med gjentatte eks-traks joner som ble utført som den første beskrevet ovenfor. Materialet ble vanligvis kastet etter 5-8 ekstraksjoner når restaktiviteten var redusert til et nærmest neglisjerbart nivå.

Filtratet ble klaret ved sentrifugering ved 10 000 x g i en "Sorvall GSA"-rotor (Sorvall Instruments). Supernatanten ble filtrert gjennom Whatman kromatografipapir (chr 1) og fortynnet med vann til en ledningsevne på 7-8 mS/cm, pH ble justert til 7,5. Ekstrakten var nå klar for anionbytterkromatografi som beskrevet nedenfor.

1. 3. Analyse av heksoseoksidase

Den benyttede fremgangsmåte var i det vesentlige som beskrevet av Sullivan og Ikawa, 1973. Denne analyse bygger på prinsippet at det. hydrogenperoksid som dannes ved oksidasjon av sukkeret i nærvær av peroksidase, reagerer med den kromo-gene forbindelse o-diahisidin slik at det dannes et fargestoff som absorberer ved 402 nm.

Analyseblandingen besto av 1-40 ul enzymprøve og

850 ul av en analyseløsning som inneholdt 370 ul 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 462 ul 0,1 M D-glukose i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 9 ul pepperrotperoksidase, 0,1 mg/ml i vann (Sigma Chemicals, kat. nr. P 6782, eller Boehringer Mannheim, kat. nr. 814 393), og 9 ul o-dianisidin-2 HC1, 3,0 mg/ml i vann (3,3'-dimetoksybenzidin, Sigma Chemicals). Etter inkubasjon ved romtemperatur i 15 eller 30 minutter ble analysen stoppet ved tilsetning av én dråpe 37% HC1 (Merck, p.a.). Uttak på 100 pl ble overført fra analyserørene til brønnene i en

mikrotiterplate (NUNC, Danmark), og absorbansen ved 410 nm ble målt i en "Titertek Multiskan II PLUS"-plateleser (Labsys-tems/Flow Laboratories, Finland). For å sikre at den obser-verte aktivitet skyldtes heksoseoksidase - og ikke glukoseoksidase - ble analysen fra tid til annen utført med D-galaktose som substrat istedenfor D-glukose.

1. 4. Anionbytterkromatografi

Dette trinn ble utført i et "BioPilof-kromatografi-system (Pharmacia Biotech, Sverige) koblet til en "SuperRac"-fraksjonssamler (LKB-Produkter AB, Sverige).

Dette og de påfølgende trinn i rensingen ble utført ved romtemperatur (20-25 °C) , men fraksjonssamleren var plassert i et kjøleskap slik at de oppsamlede fraksjoner ble lagret ved 4 °C inntil enzymanalysen. Absorbansen ved 280 nm og ledningsevnen ble målt. Ekstrakten ble påsatt en XK50/30-kolonne (Pharmacia, 5,0 x 25 cm) med et kolonnevolum på 500 ml som var pakket med "DEAE-Sepharose Fast.Flow" (Pharmacia) og. ekvilibrert med buffer A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Gjehnomstføm-ningshastigheten var 5 ml/min under prøvepåsettingén og 10 ml/min under de påfølgende kromatografitrinn. Etter prøve-påsetting ble kolonnen vasket med 1 200 ml buffer A. Adsorberte proteiner ble eluert med 2 800 ml av en gradient fra 0% til 100% buffer B: 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5. Fraksjoner på 15 ml ble oppsamlet under gradientelueringen.

Etter hvert kromatografikjør ble kolonnen regenerert med 500 ml 0,5 M NaOH, nøytralisert med 500 ml 1,0 M Tris-Cl, pH 7,5, og endelig ekvilibrert med 1 200 ml buffer A. De oppsamlede fraksjoner ble analysert for heksoseoksidaseaktivitet som beskrevet ovenfor (40 ul prøve, 30 minutters inkubasjonstid) . Fraksjoner med heksoseoksidaseaktivitet ble slått sammen og lagret ved 4 °C.

1. 5. Konsentrasjon av heksoseoksidaseaktivitetsholdige frak-sj oner

Flere porsjoner med fraksjoner fra "DEAE-Sepharose"-kromatografi ble slått sammen og konsentrert ved ultrafiltrering i et "Millipore Lab Ultrafiltration Cassette System" (kat. nr. XX420LCS0). Systemet var utstyrt med en membrancelle med nominell molekylvektsgrense (NMWL) på 30 000 (kat. nr. PTTKOLCP2) og ble drevet av en peristaltisk pumpe. Etter opp-konsentrering ved romtemperatur til tilnærmet 50 ml ble enzym-preparatet ytterligere konsentrert til 10-20 ml ved sentrifugeultrafiltrering ved 4 °C i "Centriprep"-konsentratorer (Amicon, USA, nominell molekylvektsgrense 30 000) ifølge produsentens instruksjoner. Den konsentrerte enzymløsning ble lagret ved 4 °C.

1. 6. Nativ polyakrylamidgelelektroforese ( PAGE)

Sammensetningen av heksoseoksidasepreparatet erholdt ved ionebytterkromatografi og ultrafiltrering, ble analysert ved nativ PAGE i et "Pharmacia Phast System", se fig. 2. Gradientgeler fra 8-25% ble kjørt og sølvfarget for protein ifølge produsentens instruksjoner. Et sett som inneholdt føl-gende molekylvektsmarkører, ble også erholdt fra Pharmacia: . tyreglobulin (669 000), ferritin (440 000), katalase (232 000), laktatdehydrogenase (140 000) og-albumin (67 000) .

Farging for heksoseoksidaseaktivitet ble utført som ' beskrevet for glukoseoksidase av Sock & Rohringer (1988). I prinsippet er redox-reaksjonen som katalyseres av glukoseoksidase eller heksoseoksidase, koblet til reduksjon av tetra-zoliumsalt til farget, uløselig formazan.

Umiddelbart etter elektroforesen ble "Phast"-gelen neddyppet i 10 ml nylaget fargeløsning som inneholdt: 0,1 M D-glukose (eller D-galaktose), 85 mM sitronsyre/natriumfosfat, pH 6,5, 0,2 mg/ml 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetra-zoliumbromid ("thiazolyl blue", MTT, Sigma Chemicals, kat. nr. M 2128) og 0,1 mg/ml N-metyldibenzopyrazinmetylsulfatsalt ("phenazin methosulfat", PMS, Sigma Chemicals, kat. nr.

P 9625). Gelen ble inkubert ved romtemperatur i mørket inntil det fargede, blåfiolette bånd var klart synlig (vanligvis 5-90 min) og ble så vasket med 10% eddiksyre, 5% glyserol og lufttørket.

Den sølvfargede gel er vist i fig. 2, spor 1. Som figuren viser, forelå en rekke proteiner ved dette rensetrinn. Ved enzymfarging ble imidlertid kun båndet merket med en pil i

fig. 2, farget (resultater ikke vist).

1. 7. Gelfiltrering

Dette trinn i rensingen ble utført i et FPLC-system (Pharmacia) utstyrt med en XK26/70-kolonne (2,6 x 66 cm, Pharmacia) med kolonnevolum på 350 ml. Kolonnen ble pakket med "Sephacryl S-200 HR" (Pharmacia) ifølge produsentens instruksjoner. Bufferen var 20 mM Tris-Cl, 500 mMNaCl, pH 7,5, og gjennomstrømningshastigheten var 0,5 ml/min. UV-absorbansen ved 280 nm ble målt. Fraksjoner på 2,5 ml ble oppsamlet med en "FRAC-100"-fraksjonssamler (Pharmacia) som var plassert i et kjøleskap (4 °C) ved siden av FPLC-systemet. Det konsentrerte heksoseoksidasepreparat ble klaret ved sentrifugering ved 30 000 rpm i en SW60-utsvingsrotor (Beckman) i en L7-ultra-sentrifuge (Beckman) i 60 min ved 4 °C. Et uttak på 3,0-4,0 ml av supernatanten ble blandet med 5% glyserol (Sigma Chemicals, kat. nr. G 7757), filtrert gjennom en filtreringsenhet for engangsbruk med 0,22 um porestørrelse (Millipore, kat. nr. SLGV 025 BS) og påsatt kolonnen med en SA-5-prøvepåsetter (Pharmacia) koblet til kolonneinntaket. Fraksjoner med heksoseoksidaseaktivitet ble identifisert ved å benytte analysefremgangsmåten beskrevet ovenfor (10 ul prøve, 15 min inkubasjonstid) og lagret ved -18 °C inntil videre prosessering.

UV-profilen og elueringsposisjonen for heksoseoksidase er vist i fig. 3. Som figuren viser, ble en vesentlig mengde av UV-absorberende materiale eliminert i dette trinn. Elektroforetisk analyse ved nativ PAGE og sølvfarging (fig. 2, spor 2) viste at bare noen få kontaminerende bestanddeler var igjen etter dette trinn.

1. 8. Bestemmelse av molekylvekt for nativ heksoseoksidase ved analytisk gelfiltrering

Molekylvekten av nativ heksoseoksidase ble bestemt ved gelfiltrering i "Sephacryl S-200 Superfine" (Pharmacia). Kolonnedimensjoner, buffer, gjennomstrømningshastighet og fraksjonsoppsamling var som beskrevet ovenfor. "Blue dextran" for bestemmelse av voidvolumet (v0) for kolonnen og følgende standardproteiner for kalibrering av kolonnen ble erholdt fra

Pharmacia: Ovalbumin (43 000), albumin (67 000), katalase

(158 000) og aldolase (252 000). En prøve som inneholdt heksoseoksidase, ble erholdt ved "DEAE-Sepharose"-kromatografi som beskrevet ovenfor. Basert på bestemmelse av elueringsvolumene (ve) for standardproteinene og for heksoseoksidase, ble de tilsvarende Kav-verdier (ve - vQ/vt - vQ) beregnet. Endelig ble Kav-verdiene for standardproteinene fremstilt grafisk mot de tilsvarende log (molekylvekt)-verdier. Kav for heksoseoksidase tilsvarte en nativ molekylvekt på tilnærmet 110 000. Denne er i godt samsvar med Sullivan & Ikawa (1973) som fant en molekylvekt på tilnærmet 130 000. Kerschensteiner & Klippenstein

(1978) rapporterte en molekylvekt på 140 000, også bestemt ved gelfiltrering.

1. 9. Kationbytterkromatografi

Dette trinn ble utført i et "SMART Micropurification Chromatography System" (Pharmacia) utstyrt med en HR5/5-kolonne (Pharmacia, 0,5 x 5 cm, kolonnevolum 1,0 ml) pakket med "S-Sepharose Fast Flow" (Pharmacia). Kolonnen ble ekvilibrert i A-buffer: 50 mM natriumacetat, pH 4,5 (fremstilt ved å jus-tere 50 mM eddiksyre til pH 4,5 med NaOH). Buffer B benyttet for gradienteluering, inneholdt 50 mM natriumacetat, 500 mM NaCl, pH 4,5. Fraksjonene fra gelfiltreringen ble avsaltet på ferdigpakkede "Sephadex G-25"-kolonner for engangsbruk (PD-10, Pharmacia) som ble ekvilibrert og eluert med 25 mM natriumacetat, pH 4,5. 20 ml avsaltet prøve fra 6 gelfiltreringsfrak-sjoner med høy heksoseoksidaseaktivitet ble påsatt kolonnen fra en 50 ml "Superloop" (Pharmacia) ved en gjennomstrømnings-hastighet på 250 ul/min. Kolonnen ble så vasket med 4 kolon-nevolumer buffer A ved samme, gjennomstrømningshastighet. Bundne proteiner ble eluert med en gradient fra buffer A til buffer B over 5 ml. Fraksjoner på 250 ul ble oppsamlet under gradientelueringen og analysert for heksoseoksidaseaktivitet som beskrevet ovenfor (1 ul prøve, 15 min inkubasjonstid) og lagret ved -18 °C inntil videre anvendelse.

Det resulterende heksoseoksidasepreparat ble analysert ved nativ PAGE og sølvfarging (fig. 2, spor 3). Heksoseoksidasebåndet var nå det eneste signifikante bånd selv om små mengder av kontaminerende proteiner også ble observert.

1. 10. Analytisk natriumdodecylsulfat- PAGE ( SDS- PAGE)

Fraksjoner fra "S-Sepharose"-kromatografi som viste heksoseoksidaseaktivitet, ble også analysert ved SDS-PAGE ifølge Laemmli (1970). Minigeler med 12,5% akrylamid/bisakryl-amid (blandingsforhold 37,5:1) med tykkelse 0,75 mm ble kjørt i et "Mini-Protean II"-apparat (Bio-Rad). Gelene ble farget med 0,1% "Coomassie Brilliant Blue R-250", 10% eddiksyre, 40% etanol og avfarget i 10% eddiksyre, 30% etanol.

Resultatet fra elektroforesen er vist i fig. 4, spor 1. Det rensede heksoseoksidasepreparat viste sterke bånd med relative molekylvekter på 40 kD, hhv. 29 kD, og svake bånd ved

60 kD, hhv. 25 kD. Videre kunne to skarpe dobbeltbånd ved

55 kD og 57 kD observeres.

1. 11. SDS- PAGE fulgt av blotting og farging for karbohydrat

Forekomst av karbohydrat i den isolerte heksoseoksidase ble undersøkt med "DIG Glycan Detection Kit" (Boehringer Mannheim) som er utformet for påvisning av mikrogrammengder av sukkere i glykokonjugater på blot. I prinsippet oksideres nabohydroksylgrupper i karbohydrater til aldehyder. Digoksigenin bindes så kovalent til aldehydgruppene og påvises deretter med et anti-digoksigenin-alkalisk fosfatase-antistoffkon-jugat.

Renset heksoseoksidase fra kationbytterkromatografi ble analysert i en 12% SDS-PAGE-gel som beskrevet ovenfor, blottet til nitrocellulose ifølge standard fremgangsmåter og farget for karbohydrat, med "Glycan Detection Kit" ifølge produsentens instruksjoner. Ingen av heksoseoksidasebåndene ved 60 kD, 40 kD, 29 kD'og 25 kD ble- farget. Kun det skarpe dobbeltbånd ved 57 kD-55 kD ble intenst farget (resultater ikke vist). 57 kD-55 kD-dobbeltbåndet ble senere identifisert som en gjenværende kontaminant som beskrevet nedenfor.

Det kunne således konkluderes med at ingen av heksoseoksidasebestanddelene som ble observert ved SDS-PAGE, var glykosylerte.

1. 12. Isoelektrisk fokusering

Heksoseoksidasefraksjoner fra "S-Sepharose"-kromatografi ble slått sammen og konsentrert ved sentrifugeultrafiltrering i "Centricon"-konsentratorer (Amicon) og analysert ved isoelektrisk fokusering (IEF) i "Isogel"-agaroseplater, pH 3-10, ifølge produsentens instruksjoner (FMC Bioproducts, Rock-land, ME, USA). En blanding av pl-markører (FMC Bioproducts) ble analysert i parallell med heksoseoksidaseprøvene. Blandingen besto av cytokrom C (pl = 10,2), myoglobin hoved-bånd/svakere bånd (7,4/7,0), karbonsyreanhydrase (6,1), (3-lak-toglobulin A/B (5,4/5,5), ovalbumin (4,8), glukoseoksidase (4,2) og amyloglukosidase (3,6). Gelene ble farget med "Coomassie Brilliant Blue R-250". Som vist i fig. 5, spor 1, inneholdt det rensede heksoseoksidasepreparat to varianter med pl-verdier på 4,3, hhv. 4,5. Renset heksoseoksidase ble også analysert ved isoelektrisk fokusering på ferdigstøpte polyakrylamidgeler, pH 3,5-9,5 (Pharmacia, Ampholine PAGplates) ifølge produsentens instruksjoner. Disse geler ble farget for enzymaktivitet ved inkubasjon i en fargingsløsning som beskrevet ovenfor for native polyakrylamidgeler. Som vist i fig. 5, spor 2, var begge pl-varianter enzymatisk aktive.

1. 13. Kromatofokusering

Observasjonen av flere bånd ved SDS-PAGE av heksoseoksidase renset på "S-Sepharose" som siste trinn, reiste mis-tanke om at ett eller flere av båndene kunne representere gjenværende kontaminanter. Videre ga "S-Sepharose"-kromatografien gjennomgående lav gjenvinning. Kromatofokusering ble derfor innført som et siste rensetrinn istedenfor kationbytter-kromatograf i på "S-Sepharose".

Kromatofokusering ble utført i SMART-kromatografisys-temet utstyrt med en "Mono P HR 5/5"-kolonne (0,5 x 5 cm, Pharmacia) med et kolonnevolum på 1 ral og en 50 ml "Superloop" for prøvepåsetting. Startbufferen for separasjon i området mellom pH 5,0 og 3,5 var 25 mM piperazin justert til pH 5,5 med HC1. Elueringsbufferen var "Polybuffer 74" (Pharmacia) fortynnet 10 ganger med vann og justert til pH 3,5 med HC1. Kolonnen ble forbehandlet og ekvilibrert med startbuffer som

anbefalt av produsenten.

Prøvefremstillingen ble utført på følgende måte: I et typisk eksperiment ble de beste fraksjoner fra to gelfiltrer-ingskjøringer (2x4 fraksjoner, 20 ml) slått sammen og pas-sert gjennom en kolonne med 1 ml "Phenyl Sepharose 6 Fast Flow" (høy sub, Pharmacia) som var pakket i en engangs "Poly-prep"-kolonne (Bio-Rad) og ekvilibrert i bufferen som ble benyttet for gelfiltrering (20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5). Denne behandling fjernet nærmest fullstendig gjenværende mengder av det røde protein fykoerytrin og andre fargede substanser som ble adsorbert til gelmaterialet ved denne ione-styrke, og fjernet således kontaminanter som kun delvis ble fjernet ved de andre trinn i renseprosessen. "Phenyl Sepharose"-kolonnen ble kastet etter bruk. Heksoseoksidaseaktiviteten ble kvantitativt gjenvunnet i det utstrømmende materiale som deretter ble avsaltet på ferdigpakkede "Sephadex G-25"-kolonner for engangsbruk (PD-10, Pharmacia), ekvilibrert og eluert med startbuffer.

Før prøvepåsetting ble 1 ml. elueringsmiddel pumpet på kolonnen. Gjennomstrømningshastigheten var 0,5 ml/min. Etter prøvepåsetting ble pH-gradienten dannet ved å pumpe 11 ml elueringsmiddel gjennom kolonnen. Under pH-gradientelueringen ble 44 fraksjoner på 250 ul oppsamlet. Fraksjoner som inneholdt heksoseoksidase, ble identifisert ved analysefremgangsmåten beskrevet ovenfor (1 ul prøve, 15 min inkubasjonstid) og lagret ved -18 °C inntil videre anvendelse.

Heksoseoksidase renset ved kromatofokusering, ble analysert ved nativ PAGE og sølvfarging (fig. 2, spor 4) og ved SDS-PAGE og farging med "Coomassie Brilliant Blue" (fig. 4, spor 2). Ved nativ PAGE var heksoseoksidasebåndet det eneste signifikante bånd, og kun svært lave mengder av kontaminanter kunne observeres. Ved SDS-PAGE ble det klart vist at denne rensemetode var i stand til å fjerne de skarpe dobbeltbånd ved 57 kD og 55 kD. Båndet ved 25 kD som kunne observeres etter "S-Sepharose"-kromatografi, var svært svakt etter kroma-tof okusering .

Som konklusjon viste heksoseoksidase erholdt ved DEAE-kromatografi, gelfiltrering og kromatofokusering, ett bånd ved nativ PAGE. I SDS-PAGE kunne sterke bånd ved 40 kD og 29 kD og et svakt bånd ved 60 kD observeres.

Da intensiteten av 60 kD-bestanddelen relativt til 40 kD- og 29 kD-bestanddelen varierte mellom forskjellige enzympreparater, ble det foreslått at polypeptidene på 29 kD og 40 kD kunne oppstå ved proteolytisk prosessering av en for-løper på tilnærmet 60 kD. Dette ville stemme med tanken om en homodimer struktur av enzymet med en nativ molekylvekt på

110 000-120 000 som den faktisk ble bestemt ved gelfiltrering, som beskrevet ovenfor. Videre ville denne hypotese være i samsvar med resultatene erholdt av Kerschensteiner og Klippenstein som fant en nativ molekylvekt på 140 000 ved gelfiltrering og en subenhetsmolekylvekt på 70 800 ved SDS-PAGE (Kerschensteiner og Klippenstein, 1978).

Eksempel 2

Dannelse og aminosyresekvensanalyse av peptidfragmenter av heksoseoksidase

2. 1. Kløyving av renset heksoseoksidase med cyanogenbromid

Denne fremgangsmåte ble utført mens kationbytterkromatografi på "S-Sepharose" fortsatt ble benyttet som siste rensetrinn.

Heksoseoksidase erholdt ved rensing på "DEAE-Sepharose", "Sephacryl S-200" og "S-Sepharose", ble overført til en flyktig buffer ved bufferutbytting på en ferdigpakket "PC3.2/10 Fast Desalting Column" som inneholdt "Sephadex G-25 Superfine" (Pharmacia, 0,32 x 10 cm, kolonnevolum 0,8 ml) som ble montert i SMART-systemet nevnt ovenfor. Kolonnen ble ekvilibrert og eluert med 200 mM ammoniumbikarbonat (BDH, AnalaR). For å oppnå tilfredsstillende gjenvinning var det nødvendig å tilsette 500 mM natriumklorid til heksoseoksidase-prøven før injeksjon.

Eluert, bufferutbyttet heksoseoksidase ble fordelt i 1,5 ml mikrosentrifugerør og frysetørket i en "Speedvac"-kon-sentrator (Savant Instruments). Cyanogenbromid (CNBr, Pierce), 200 ul av en 10 mg/ml løsning i 70% (vol/vol) maursyre (Promega) ble tilsatt. (Reagenser fra Promega var bestanddeler i et "Probe Design"-peptidseparasjonssystem, kat. nr. V6030). Rørene ble inkubert over natten i mørket ved romtemperatur. Løsningene ble så tørket i speed-vac-konsentratoren, resuspendert i 50 ul vann og tørket på nytt.

2. 2. Separasjon av cyanogenbromidfragmenter ved høyresolu-sjons- SDS- PÅGE og elektroblotting til polyvinylidendifluorid ( PVDF)- membran

Peptidene dannet ved cyanogenbromidkløyving, ble fraksjonert ved høyresolusjons-SDS-PAGE ifølge Schågger & von Jagow (1987). Dette system gir fremragende separasjon av peptider med lav molekylvekt (20-250 aminosyrerester). Gelsys-temet besto av en 16,5% separasjonsgel, en 10% spacergel og en 4% "stacking"-gel, alle fremstilt ved å benytte en 29:1 akrylamid/bisakrylamidblanding fra Promega.

Minigeler med tykkelse 0,75 mm ble kjørt i et "Mini-Protean II"-apparat (Bio-Rad). Ammoniumpersulfat og N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin (TEMED) vår fra Bio-Rad. SDS var fra United States Biochemical (ultraren). Tris var fra Fluka (kat. nr. 93350). Tricin og natriumtioglykat var fra Promega. Glysin (p.a.), 2-merkaptoetanol (p.a.) og bromfenolblått var fra Merck og glyserol fra GIBCO BRL (ultraren). Natriumtiogly-kolat, 0,1 mM, ble tilsatt katodebufferen like før anvendelse for å forhindre kjemisk blokkering av peptidenes aminoende under separasjonen. Gelen ble forkjørt i 60 min ved 30 V for å la tioglykolatet fjerne eventuelle aminoreaktive forbindelser.

Prøvefremstilling: De tørkede cyanogenbromidpeptid-fragmenter ble resuspendert i 30 ul gelladningsbuffer som inneholdt 63 mM Tris-Cl, pH 6,8, 1% SDS, 2,5% 2-merkaptoetanol, 10% glyserol og 0,0012% bromfenolblått. Prøver som ble gule ved sammenblanding grunnet innhold av gjenværende maursyre, ble nøytralisert ved tilsetning av 1-3 ul 1,0 M Tris-base inntil blåfargen ble gjendannet. Prøvene ble denaturert ved oppvarming ved 95 °C i 5 min før påsetting på gelen. En blanding av "Low-Range" proteinmolekylvektstandarder (Promega) med molekylvekter mellom 31 000 og 2 500 ble analysert i parallell med heksoseoksidasepeptidprøvene. Elektroforesen ble kjørt ved en konstant spenning på 150 V.

Elektroforetisk overføring til PVDF-membran ble ut-ført i en "Mini Trans-Blot" elektroforetisk overføringscelle (Bio-Rad) ifølge produsentens instruksjoner. Tre ark med "Problott"-membran (Applied Biosystems) kuttet i gelens størrelse, ble raskt fuktet med metanol (Merck, p.a.) og deretter bløt-lagt i overføringsbuffer (25 mM Tris, 192 mM glysin, pH 8,5, på forhånd avkjølt til 4 °C)~inntil blottingenheten ble sam-menmontert. Etter elektroforese ble gelen inkubert i overfør-ingsbuffer i 5 min ved 4 °C og deretter montert i en overfør-ingsenhet med følgende lag: Et ark med Whatman-papir (3MM chr), to ark med "Problott"-membran, SDS-PAGE-peptidsepara-sjonsgelen, det tredje "Problott"-ark og et avsluttende ark med Whatman-papir. Denne enheten ble orientert med de to ark

med "Problott"-membran mot den positive elektrode i elektrodeenheten. Kjøleenheten ble montert i bufferkammeret før det ble fylt med ferdig avkjølt overføringsbuffer, og overføringen ble så utført ved romtemperatur i 60 min ved en konstant spenning på 100 V. Under overføringen økte strømstyrken fra tilnærmet 270 mA til tilnærmet 400 mA.

Etter overføringen ble membranen vasket i vann i

1 min og deretter farget i 30-45 sek i 100 ml av en nylig fremstilt fargeløsning som inneholdt 0,1% "Coomassie Brilliant Blue R-250" (Bio-Rad), 5% eddiksyre (Merck, p.a.) og 45% metanol (Merck, p.a.). Membranen ble så avfarget med 3 porsjoner på tilnærmet 80 ml av nylaget 5% eddiksyre, 45% metanol, 30-60 sek hver gang. Membranen ble endelig vasket i 3 porsjoner med vann for å fjerne gjenværende glysin og deretter lufttørket. Godt atskilte og relativt sterke bånd med molekylvekter på tilnærmet 2,5 kD, 9 kD, hhv. 16 kD, ble kuttet ut og utsatt for aminosyreanalyse og sekvensanalyse. 2. 3. Aminosyreanalyse og sekvensering av et cyanogenbromid-fragment på 9 kD fra heksoseoksidase

Aminosyreanalyse ble utført ved ionebytterkromatografi fulgt av derivatisering med o-ftaldialdehyd. Prøvene ble hydrolysert ved 110 °C i 20 t i 6 M HC1, 0,05% fenol og 0,05% ditiodipropionsyre (Barkholt og Jensen, 1989). Peptidene ble sekvensert i et automatisert protein/peptid-sekvenserings-instrument fra Applied Biosystems, modell 477A, utstyrt med "on-line" PTH-analysator, modell 120A, og et dataanalysesys-tem. Proteinsekvenseringsreagensene ble erholdt fra Applied Biosystems. Aminosyreanalyse og peptidsekvensanalyse ble ut-ført av Arne L. Jensen, Institutt for proteinkjemi, København universitet, Danmark.

Peptidsekvensen identifisert ved analyse av 9 kD-fragmentet, er vist i tabell 2.1.

Det opprinnelige utbytte av fenyltiohydantoin-tyrosin (PTH-Tyr) i trinn én var 22 pmol. Aminosyresammensetningen av 9 kD-fragmentet er vist i tabell 2.2.

2. 4. Preparativ SDS- PAGE og elektroblotting til PVDF- membran

Følgende fremgangsmåte ble utført for å erholde aminosyresekvenser som det spesifikt vites stammer fra enten 40 kD- eller 29 dK-polypeptidet fra heksoseoksidasepreparatet.

Preparative SDS-PAGE-geler ble kjørt ifølge Laemmli (Laemmli, U.K., 1970). Minigeler som inneholdt 12,5% akrylamid/bisakrylamid (37,5:1 blanding) med en tykkelse på

0,75 mm, ble kjørt i et "Mini-Protean II"-apparat (Bio-Rad).

Løsningen av akrylamid (BDH, kat. nr. 44313) og N,N'-metylen-bis-akrylamid (BDH, kat. nr. 44300) ble lagret over en blandet ionebytterresin (Bio-Rad, kat. nr. 142-6425). Alle andre reagenser ble erholdt fra kilder beskrevet ovenfor.

Prøvepreparering: Fraksjoner fra kromatofokuseringen ble konsentrert ved sentrifugeultrafiltrering ved 4 °C i "Ultra-free-MC"-filterenheter med NMWL 10 000 og en prøvekapa-sitet på 400 ul (Millipore, kat. nr. UFC3 LGC25). Tilbakeholdt materiale ble blandet med ett volum 2X gelladningsbuffer som inneholdt 125 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 5% 2-merkaptoetanol, 20% glyserol og 0, 0025% bromf enolblått. Prøver som ble gule. ved sammenblanding grunnet innhold av sure "Polybuffer"-bestanddeler, ble nøytralisert ved tilsetning av 1-3 ul 1,0 M Tris-base inntil blåfargen vendte tilbake. Prøvene ble denaturert ved oppvarming ved 95 °C i 5 min og påsatt gelen i porsjoner på tilnærmet 30 ul pr. spor.

En blanding av molekylvektsmarkørproteiner (Bio-Rad) med molekylvekter mellom 97 400 og 14 400 ble analysert i parallell med heksoseoksidaseprøvene. Elektroforesen ble kjørt ved lav strømstyrke, 10 mA pr. gel, for å redusere faren for varmeindusert, kjemisk modifisering av prøveproteinene.

Elektroforetisk overføring til PVDF-membran ble ut-ført som beskrevet ovenfor, bortsett fra at ett ark med "Immobilon P"-membran (Millipore, kat. nr. IPVH 15150) ble benyttet istedenfor tre ark med "Problott". Enheten ble orientert med blottemembranen mot den positive elektrode i elektrodeenheten.

Etter overføringen ble "Immobilon P"-membranen vasket med vann i 10 sek og deretter farget i 45-60 sek i 100 ml av en nylaget fargeløsning som inneholdt 0,025% "Coomassie Brilliant Blue R-250", 5% eddiksyre og 40% metanol. Membranen ble så avfarget i 2-3 min i 250 ml nylaget 5% eddiksyre, 30% etanol (96% (vol/vol), Danisco, Danmark). Membranen ble til slutt lufttørket og lagret ved 4 °C.

Båndmønsteret på blottet var identisk med mønsteret sett ved analytisk SDS-PAGE etter avsluttende rensing ved kro-matof okusering. Det viste sterke bånd ved 40 kD og 29 kD i tillegg til et svakt bånd ved 60 kD.

Båndene ved 40 kD og 29 kD ble kuttet ut fra blottet og benyttet for aminosyreanalyse og enzymatisk kløyving av polypeptider bundet til membranen som beskrevet nedenfor. Mengden av 60K-materiale var for lav til å tillate videre analyse av dette polypeptid.

2. 5. Aminosyreanalyse av 40 kD- og 29 kD- polypeptider fra heksoseoksidase

Aminosyresammensetningen til 40 kP- og 29 kP-bestanddelene fra heksoseoksidase er vist i tabell 2.3.

2. 6. Enzymatisk kløyving av PVDF- bundne heksoseoksidasepolypeptider

Kløyving av heksoseoksidasepolypeptider bundet til PVDF og ekstraksjon av de resulterende, proteolytiske peptider ble utført som beskrevet av Fernandez et al. (1992) og Fernandez et al. (1994) .

Kløyving av 40 kD-polypeptidet fra heksoseoksidase: Elleve 40K-bånd med et beregnet, totalt proteininnhold på tilnærmet 5 ug (tilsvarende tilnærmet 125 pmol) ble kuttet ut fra den "Coomassie blue"-fargede PVDF-membran, avfarget i metanol i 1-2 min og vasket med vann i 2-3 min. Membranbåndene ble så kuttet opp i 1 x 1 mm biter og overført til mikrosentrifuge-rør. Et proteinfritt område fra PVDF-membranen fungerte som bakgrunnskontroll. De oppkuttede membranbiter ble bløtlagt i 50 ul kløyvebuffer som inneholdt 1% (vol/vol) hydrogenert "Triton X-100" ("RTX-100", Sigma Chemicals, kat. nr. X-100R-PC, eller Calbiochem, proteingrad, kat. nr. 648464), 10% acetonitril (Merck, gradientgrad "Lichrosolv") og 100 mM Tris-Cl, pH 8,0. Det proteolytiske enzym som ble valgt for kløyvingen, var endoproteinase Lys-C (endoLys-C) som kløyver peptidkjeder på den C-terminale side av lysinrester. Et uttak på 5 ug endoLys-C (Boehringer Mannheim, sekvenseringsgrad, kat. nr. 1047 825) ble rekonstituert ved tilsetning av 20 ul vann. 2 ul enzymløsning som tilsvarte 0,5 ug, ble tilsatt (enzym:sub-stratforhold 1:10). Kløyvingen ble utført ved 37 °C i 22-24 t.

Etter kløyvingen ble prøvene ultralydbehandlet i en ultralydtank (Eima transonic) i 5 min og sentrifugert ved 1 700 rpm i en mikrosentrifuge i 5 min, og supernatanten ble så overført til et nytt rør. Vask med 50 ul kløyvebuffer fulgt av 100 ul 0,1% trifluoreddiksyre (TFA, Pierce, kat. nr. 28902) ble utført med ultralydbehandling og sentrifugering som beskrevet ovenfor. Alle supernatanter ble slått sammen, noe som ga et ekstraksjonsvolum på 200 ul. Ekstraktene ble lagret ved -18 °C inntil peptidrensingen. Kløyving av 29 kD-polypeptidet fra heksoseoksidase ble utført som beskrevet for 40 kD-bestanddelen, bortsett fra at fire bånd med et totalt proteininnhold på 2,4 ug (tilnærmet 80 pmol), beregnet fra aminosyre-analysen, ble benyttet.

2. 7. Rensing av endoLys- C- dannede peptider

Peptidfragmentene erholdt ved kløyving av 40 kD- og 29 kD-polypeptidene fra heksoseoksidase, ble separert i SMART-kromatografisystemet. Systemet var utstyrt med en "pPeak"-monitor med variabel bølgelengde og et fraksjonssamlerstativ for 60 ampuller. Reversfasekolonnen benyttet i separasjonen, var en kiselgelbasert pRPC C2/C18 SC2.1/10 kolonne med liten diameter (Pharmacia, kolonnedimensjoner 2,1 x 100 mm, partik-kelstørrelse 3 pm, gjennomsnittlig porestørrelse 125 Å). Bufferne var A: 0,1% TFA (Pierce) i "Milli-Q"-vann og B: 0,1% TFA i acetonitril (Merck, gradientgrad "Lichrosolv). Bufferne ble filtrert og avgasset ved vakuumfiltrering gjennom et 0,5 um "Fluoropore"-filter (Millipore, kat. nr. FHLP04700). Gjennom-strømningshastigheten var 100 ul/min. UV-absorbansen i eluatet ble målt ved 220 nm, 254 nm og 280 nm. Gradienten var 0-30% B (0-65 min), 30-60% B (65-95 min) og 60-80% B (95-105 min). Kolonnen ble deretter vasket med 80% B i 10 min ved 100 pl/min og reekvilibrert i A-buffer i 45 min ved 200 pl/min. Fraksjoner på 50 pl ble oppsamlet mellom t = 15 min og t = 105 min (3 x 60 fraksjoner) og lagret ved -18 °C inntil aminosyresek-vensanalysen.

Peptidkartet som ble erholdt etter endoLys-C-kløyving av 40 kD-polypeptidet, er vist i fig. 6. Som figuren viser, førte kløyving og HPLC-separasjon til flere godt atskilte topper med høyt signal/støy-forhold. Et tilsvarende kromatogram for en kontrollkløyvingsblanding (ikke vist) antydet at toppene som elueres etter t = 83 min, var ikke-peptider avledet fra reagensene, muligens UV-absorberende kontaminanter i det hydrogenerte "Triton X-100" eller gjenværende spor av "Coomassie"-fargestoff. Toppene merket 1-5 i fig. 6, ble utvalgt for aminosyresekvensering ut fra følgende kriterier: 1) Topphøyde. 2) Tilsynelatende renhet. 3) Høyt A28o:A22o og/eller høyt A254 : A22o-f orhold som antydet nærvær av aromatiske aminosyrerester, som er de mest nyttige for utvelgelse av PCR-primersekvenser grunnet lav degenererthet av deres genetiske kode. 4) Sen elueringstid, noe som kan tyde på et relativt langt peptid.

Kromatogrammet av 29 kD-endoLys-C-peptidene er vist i

Fig. 7. Denne heksoseoksidasebestanddel ga åpenbart opphav til kun noen få signifikante peptidfragmenter sammenlignet med 40 kD-bestanddelen i Fig. 6. Ved sammenligning av kromatogram-mene var det ingen tegn til at noe peptidfragment forelå i begge kløyvingsblandinger. Dette funn antyder at 40 kD- og 29 kD-heksoseoksidasebestanddelene ikke deler aminosyresekvenser, noe som ville vært tilfelle dersom 29 kD-kjeden var dannet ved proteolytisk omsetning av 40 kD-polypeptidet.

(Sammenlignet med 40 kD-kløyvingsblandingen inneholdt 29 kD-blandingen kun små mengder av de kontaminerende forbindelser som ble eluert senere enn t = 83 min. Grunnen til dette kan være at hydrogenert "Triton X-100" fra Calbiochem ble benyttet i 29 kD-kløyvingen, mens 40 kD-kløyvingen ble utført med "Triton X-100" fra Sigma Chemicals).

Fraksjoner som tilsvarte toppene merket 1 og 2 i

29 kD-peptidkartet (Fig. 7), ble analysert ved aminosyresekvensering. 2. 8. Aminosyresekvensanalyse av proteolytisk dannede peptider fra heksoseoksidase Peptidsekvensene identifisert ved analyse av fraksjoner som tilsvarte toppene 1-5 i Fig. 6 (HOX-2-, HOX-3-, HOX-4-, H0X-5- og HOX-6-peptidet) og toppene 1-2 i Fig. 7 (H0X-7- og HOX-8-peptidet), er vist i tabell 2.4 nedenfor. Det opprinnelige utbytte av PTH-aminosyrer varierte mellom 46 pmol PTH-Tyr i trinn én for HOX-5-peptidet til 6 pmol PTH-Ile i trinn to for H0X-8-peptidet. Som forventet fra absorbansen ved 254 nm og 280 nm for de utvalgte topper inneholdt alle de sek-venserte peptider minst én aromatisk aminosyrerest.

Usikre aminosyrerester er vist i parentes. 1) Aminosyrerest nr. 15 ble identifisert som enten Asp eller Asn. 2) Aminosyrerest nr. 16 ble identifisert som enten Asp eller Ala. 3) Aminosyrerest nr. 17 ble identifisert som enten Arg eller Trp.

Eksempel 3

Isolering av heksoseoksidasegenet fra Chondrus crispus

3. 1. Rensing av RNA fra Chondrus crispus

Nyinnsamlede flak av Chondrus crispus ble vasket med kaldt vann og umiddelbart etter lagret i flytende nitrogen inntil videre anvendelse. Tilnærmet 15 g Chondrus crispus-thallus frosset i flytende nitrogen, ble homogenisert til et fint pulver i en morter. Det frosne, homogeniserte materiale ble overført til et 50 ml rør (Nunc, kat. nr. 3394 97) som inneholdt 15 ml ekstraksjonsbuffer (8 M guanidiniumhydro-klorid, 20 mM 2-(N-morfolino)etansulfonsyre (MES), pH 7,0, 20 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 50 mM p-merkaptoetanol).

Røret ble omblandet og holdt kaldt (0 °C) under de påfølgende trinn med mindre andre temperaturer er angitt. Deretter ble røret sentrifugert i 20 min ved 6 000 x g i en "Heraeus Omnifuge 2.ORS", og den RNA-holdige supernatant (tilnærmet 15 ml) ble forsiktig oppsamlet og overført til et allerede avkjølt 50 ml rør. 1,5 ml 2 M natriumacetat, pH 4,25, 15 ml fenol mettet med vann og 3 ml kloroform:isoamylalkohol (4 9:1) ble tilsatt til røret som inneholdt RNA-ekstrakten.

Røret ble deretter omblandet kraftig i 1/2 min, og fasene ble separert ved sentrifugering av røret i 20 min i en "Omnifuge" ved 6 000 x g. Vannfasen (tilnærmet 17 ml) ble overført til et 30 ml "Corex"-rør (Sorvall, kat. nr. 00156), og et likt volum (dvs. tilnærmet 27 ml) kald isopropanol ble tilsatt. Røret ble igjen omblandet og inkubert i minst 1 time ved -20 °C. Utfelt RNA ble nedsentrifugert i 20 min ved 10 000 rpm i en "Sorvall RC-5B"-sentrifuge utstyrt med en på forhånd avkjølt SS -rotor. Supernatanten ble fjernet og utfelt RNA resuspendert i 4 ml 0,3 M natriumacetat, pH 5,5, og 12 ml 96% etanol ble tilsatt.

"Corex"-røret ble så omblandet og inkubert igjen i minst 1 time ved -20 °C fulgt av en ny nedsentrifugering av RNA i 20 min som beskrevet ovenfor. Supernatanten ble forsiktig fjernet og nedsentrifugert RNA resuspendert i 2 ml 0,15 M natriumacetat, pH 5,5. Deretter ble 8 ml 4 M natriumacetat, pH 5,5, tilsatt, og RNA ble utfelt på is i 30 minutter og ned-

sentrifugert igjen som beskrevet ovenfor. Utfelt RNA ble vasket med 70% etanol og resuspendert i 500 ul vann. Resuspendert RNA-.ble overført til ét mikrosentrifugerør og lagret ved

-20 °C inntil videre anvendelse.

Renhet og konsentrasjon av RNA ble analysert ved agarosegelelektroforese og ved absorpsjonsmålinger ved 260 nm og 280 nm som beskrevet i Sambrook et al. (1989).

3. 2. Isolering av polyadenylert RNA fra Chondrus crispus

Polyadenylert RNA ble isolert fra total-RNA ved å benytte magnetiske kuler som inneholdt oligo-dT ("Dynabeads" Oligo (dT)25/ i "mRNA Purification Kit", Dynal). Tilnærmet

100 ug total-RNA ble blandet med 1 mg "Dynabeads" Oligo (dT)25/ og polyadenylert RNA ble isolert som beskrevet i fremgangsmåten fra "mRNA Purification Kit". Utbyttet av polyadenylert RNA isolert med "Dynabeads" var mellom 1 og 3%.

Andre fremgangsmåter ble benyttet ved isolering av polyadenylert RNA fra Chondrus crispus, heriblant anvendelse av kolonner pakket med oligo-(dT)-cellulose (Clontech, kat. nr. 8832-2), eller ferdigpakkede kolonner ("mRNA Separator Kit", Clontech, kat. nr. K1040-1), som beskrevet i fremgangsmåten for "mRNA Separator Kit". Utbyttet av polyadenylert RNA isolert med oligo-(dT)-kolonner, var mellom 0,1 og 1% av det opprinnelige total-RNA. Polyadenylert RNA isolert med oligo-(dT)-kolonner, ble benyttet i cDNA-syntesereaksjoner som beskrevet ovenfor, men utbyttet av førstetråds-cDNA var svært lavt (mindre enn 1%). "

Årsaken til det lavere utbytte og den svakere ytelsen av RNA isolert med oligo-(dT)-kolonner sammenlignet med "Dynabeads "-renset RNA, kan være nærvær av karbohydrater eller proteoglykaner i.total-RNA-ekstrakten. Karbohydrater som kon-taminerer total-RNA-preparater, er vist å forstyrre rensing av polyadenylert RNA og inhibere cDNA-syntese, og fremgangsmåter for rensing av RNA fritt for karbohydrater er derfor blitt utviklet (Groppe et al., 1993, Yeh et al.). Imidlertid var polyadenylert RNA isolert ved disse fremgangsmåter, ikke så effektivt i cDNA-syntesereaksjoner som RNA isolert med "Dynabeads". Følgelig ble polyadenylert RNA renset med "Dynabeads",

benyttet som templat i førstetråds-cDNA-syntesereaksjoner (jf 3.4. nedenfor).

3. 3. Heksoseoksidasespesifikke oligonukleotider

Syntetiske oligonukleotider ble syntetisert (DNA technology, ApS, Forskerparken, DK-8000 Århus C, Danmark) basert på aminosyresekvensene avledet fra heksoseoksidasepep-tidene HOX-2, HOX-3 og HOX-4 (tabell 2.4..). Tabell 3.1. viser oligonukleotidene og de tilsvarende aminosyresekvenser. Videre vises i tabell 3.1. DNA-sekvensen for primerne benyttet til DNA-sekvensering og for PCR.

Hvor Y er C eller T, R er A eller G, W er A eller T, S er C eller G, D er A, G eller T, N er A, C, G eller T, og I = deoksyinosin.

3. 4. cDNA- syntese og polymerasekjedereaksjon ( PCR)

Polyadenylert RNA ble benyttet som templat i første-tråds-cDNA-syntesereaksjoner med kommersielt tilgjengelige sett. Tilnærmet 1 ug polyadenylert RNA ble reverstranskribert som beskrevet i fremgangsmåten fra "Maraton" cDNA-amplifiser-ingssett (Clontech, kat. nr. K1802-1) med Hox3-2- eller Hox4-2- som primere. I den påfølgende PCR-amplifisering ble ankerprimeren eller adapterprimeren fra settet benyttet i tillegg til de heksoseoksidasespesifikke primere Hox3-2-, hhv. Hox4-2. Bufferne som ble benyttet og betingelsene for amplifiseringen var i det vesentlige som beskrevet i fremgangsmåten fra "Maraton" cDNA-amplifiseringssettet. PCR-amplifiseringen ble utført med "AmpliTaq" (Perkin-Elmer Cetus) i en "Perkin-Elmer Ther-malcycler 480" programmert til 30 sykluser bestående av 1 min ved 94 °C, 2 min ved 55 °C og 2 min ved 72 °C. Gelelektroforese av 5 ul av reaksjonsblandingen i en. 1% agarosegel ("SeaPlaque" GTG, FMC) viste DNA-fragmenter med tilnærmet størrelse på 600 basepar (bp) med primer Hox4-2- og 700 bp med primer Hox3-2-.

Disse DNA-fragmenter ble renset fra agarosegelen ved å benytte et kommersielt tilgjengelig sett ("QIAEX"-geleks-traksjonssett, kat. nr. 20020, QIAGEN), og tilnærmet 100 ng fragment ble ligert til 50 ng plasmid "pT7 Blue" som beskrevet i fremgangsmåten fra "pT7 Blue T-Vector Kit" (Novagen, kat. nr. 69829-1) . Escherichia coli DH5ce (Life Technologies, kat. nr. 530-8258SA) eller E. coli NovaBlue (Novagen) ble transformert med ligeringsblandingen, og hvite, rekombinante kolonier ble analysert videre.

Plasmid-DNA fra slike kolonier ble renset ved å benytte QIAGEN "Plasmid Midi Kit" (QIAGEN, kat. nr. 12143) og utsatt for DNA-sekvensanalyse med "Sequenase" ("Sequenase" versjon 2.0 DNA-sekvenseringssett, USB). DNA-sekvenserings-reaksjonene ble analysert ved akrylamidgelelektroforese ("Sequencing Gel-Mix" 6, Life Technologies). DNA-sekvensana-lysen av 700 bp-fragmentet viste en åpen leseramme som kodet for 234 aminosyrer.

Tabéll 3.2. nedenfor viser at alle peptidsekvensene fra 40 kD-polypeptidet, dvs. HOX-2, HOX-3, HOX-4, HOX-5 og HOX-6, ble funnet i sekvensen på 234 aminosyrer utledet fra denne åpne leseramme. Det ble følgelig konkludert med at 700 bp-fragmentet kodet for en del av heksoseoksidasegenet. DNA-sekvensen for 600 bp-fragmentet ble vist å være identisk med de første 600 bp fra 700 bp-fragmentet (se tabell 3.2.).

Primerne Hox2-3+ og Hox3-2- ble benyttet på tilsvarende måte i cDNA-syntese og PCR-amplifiseringseksperimenter. Tilnærmet 50 ng polyadenylert RNA ble reverstranskribert med Hox3-2- som primer, som beskrevet i fremgangsmåten fra "3'-Amplifinder" RACE-settet (Clontech, kat. nr. K1801-1). I den påfølgende PCR-amplifisering ble primerne Hox2-3+ og Hox3-2-benyttet. De benyttede buffere og betingelsene for amplifiseringen var i det vesentlige som beskrevet for "AmpliTaq"-polymerase (Perkin-Elmer Cetus) og i fremgangsmåten for "3'-Amplifinder" RACE-settet. Gelelektroforese av 5 ul av PCR-amplifis-eringsblandingen viste et fragment med størrelse 407 bp.

Dette fragment ble renset, innsatt i plasmidet "pT7

Blue" og sekvensert som beskrevet ovenfor. DNA-sekvensen av dette fragment ble vist å være identisk med de siste 407 bp fra 700 bp-fragmentet.

DNA-sekvensen nedstrøms for fragmentene på 700 og 407 bp ble amplifisert med "3'-Amplifinder" RACE-settet (Clontech) med ankerprimeren fra settet som 3' primer og de heksoseoksidasespesifikke primere Hox5+ og Hox4+ som genspesi-fikke 5' primere. Buffere og betingelser for amplifiseringen var som beskrevet ovenfor. PCR og analyse av reaksjonsblandingen i agarosegeler viste et fragment med størrelse tilnærmet 1,3 kb. Fragmentet ble isolert og DNA-sekvensanalyse utført som beskrevet ovenfor. DNA-sekvensen fra dette 1,3 kb-fragment viste en åpen leseramme på 357 aminosyrer. Denne leseramme på 357 aminosyrer inneholdt aminosyresekvensene til peptidene HOX-1, HOX-3, HOX-4, HOX-5, HOX-7 og HOX-8. Det ble følgelig konkludert med at 1,3 kb DNA-fragmentet kodet for CNBr-fragmentet på 9 kD, polypeptidet på 29 kD og deler av 40 kD-polypeptidet fra heksoseoksidase.

En primer spesifikk for den 5' ende av heksoseoksidase, Hox5'-l, ble benyttet sammen med en oligo-(dT)-primer for amplifisering av den antatt fullstendige åpne leseramme for heksoseoksidase. Genet ble amplifisert ved PCR, innsatt i "pT7 Blue" og sekvensert som beskrevet ovenfor. DNA-sekvensen fra dette fragment på 1,8 kb var identisk med DNA-sekvensene fra fragmentene beskrevet ovenfor med mindre forskjeller. Da disse forskjeller kunne skyldes feilinkorporering under PCR-amplif iseringene, ble det fullstendige heksoseoksidasegen amplifisert og isolert fra minst tre uavhengige PCR-amplifis-eringer. DNA-sekvensen som presenteres i tabell 3.2. nedenfor, er således sammensatt av minst tre DNA-sekvenser erholdt uavhengig av hverandre for å utelukke PCR-feil i sekvensen.

Aminosyresekvensen avledet fra den åpne leseramme fra DNA-sekvensen ovenfor på 1,8 kb, viser seg å inneholde alle HOX-peptidene nevnt ovenfor, dvs. HOX-1 til HOX-8. DNA-sekvensen på 1,8 kb koder følgelig for de ovenfor nevnte Chondrus crispus-avledede heksoseoksidasefragmenter på 9 kD, 29 kD og 40 kD. Molekylvekten av polypeptidet utledet fra denne åpne leseramme, er i samsvar med antakelsen om at dette polypeptid er en subenhet (muligens et monomert fragment) fra et dimert heksoseoksidaseenzymmolekyl.

3. 5. Northern- blotanalyse av Chondrus crispus - KNA

Total-RNA isolert fra Chondrus crispus,. ble analysert ved Northern-blotanalyse. RNA ble renset som beskrevet ovenfor (3.1.) og fraksjonert i en denaturerende formaldehyd-agarosegel og blottet til et "HybondC"-filter (Amersham) som beskrevet av Sambrook et al. (1989). Ved å benytte primerne Hox2-3+ og Hox3-2- ble et DNA-fragment på 400 bp syntetisert ved PCR som beskrevet ovenfor (3.4.). Dette fragment ble renset fra en 1,2% agarosegel ("SeaPlaque" GTG, FMC) og merket med <32>P som beskrevet av Sambrook et al. ( supra). Denne radio-aktive, heksoseoksidasespesifikke hybridiseringsprobe ble benyttet for analyse av Northern-blottet. Hybridiseringsbetin-gelsene var: 3. 5. 1. Prehybridisering ved 65 °C i 2 timer i en buffer som inneholdt 10 x Denhardts løsning (0,1% "Ficoll, 0,1% poly-vinylpyrrolidon, 0,1% bovint serumalbumin), 2 x SSC (lx SSC er 0,15 M natriumklorid, 0,015 M natriumsitrat, pH 7,0), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) og 50 ug/ml denaturert laksemelke-DNA. 3. 5. 2. Hybridisering ved 65 °C i minst 14 timer i en buffer som inneholdt 1 x Denhardts løsning, 2 x SSC, 0,1% dekstran-sulfat, 50 ug/ml denaturert laksemelke-DNA og <32>P-merket probe (tilnærmet IO<6> dpm/ml). Filteret ble vasket to ganger ved 65 °C i 10 min i 2 x SSC, 0,1% SDS, fulgt av to gangers vask ved 65 °C i 10 min i 1 x SSC, 0,1% SDS. Etter en avsluttende vask i 10 min ved 65 °C i 0,2 x SSC, 0,1% SDS, ble filteret pakket i "Såran Wrap" og pålagt en røntgenfilm (Kodak XAR2) i to dager ved -80 °C med en "Siemens Titan HS"-intensiverings-folie. Det resulterende autoradiogram (fig. 8) viser at et bånd med tilnærmet størrelse 2 kb ble merket.

Tabell 3. 2. Nukleotidsekvens av DNA- sekvens på 1. 8 kb ( SEKV. ID NR. 30) oa den åpne leseramme for en heksoseoksidaseaminosvre-sekvens på 546 aminosyrer avledet fra DNA- sekvensen ( SEKV. ID NR. 31)

I aminosyresekvensen vist i tabell 3.2. ovenfor, er peptidene HOX-1 til HOX-8 vist med uthevede eller understrekede aminosyrekoder. Uthevede koder angir aminosyrerester som er bekreftet ved aminosyresekvensering av peptidene. Understrekede koder angir aminosyrerester som er utledet fra nukleotidsekvensen, men som ikke er bekreftet ved sekvensering av de relevante HOX-peptider.

HOX-1 er aminosyrerestene 461-468, HOX-2 aminosyrerestene 92-114, HOX-3 aminosyrerestene 219-234, HOX-4 aminosyrerestene 189-202, HOX-5 aminosyrerestene 215-218, HOX-6 aminosyrerestene 8-22, HOX-7 aminosyrerestene 434-444 og HOX-8 aminosyrerestene 452-460.

Eksempel 4

Fremstilling av rekombinant heksoseoksidase i Pichia pastoris Konstruksjon av en vektor for ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase i Pichia pastoris

Den åpne leseramme som koder for heksoseoksidase fra Chondrus crispus som vist i tabell 3.2., ble innsatt i en Pichia pastoris-ekspresjonsvektor, pPIC3 (Research Corporation Technologies, Inc., Tucson, Arizona 85711-3335). Plasmidet inneholder alkoholoksidasepromoteren (aoxl-promoter) og transkripsjonstermineringssignalet fra Pichia pastoris (aoxp, hhv. aoxt i fig. 9). Et his4*- qen i vektoren tillater seleksjon av His<+> rekombinante Pichia pastoris- celler. Når denne ekspre-sjonskassett transformeres inn i Pichia pastoris, integreres den i kromosomalt DNA. Pichia pastoris- celler som bærer en ekspresjonskassett med et heksoseoksidasegen fra Chondrus crispus innsatt nedstrøms for aoxl-promoteren, kan induseres til produksjon av heksoseoksidase ved tilsetning av induseren for aoxl-promoteren, metanol. En Pichia pastoris-mutant, KM71, som mangler det viktigste alkoholoksidasegen, aoxl, kan benyttes som mottaker av heksoseoksidasegenet (Cregg og Madden 1987, Tschopp et al. 1987). Pichia pastoris inneholder imidlertid et annet alkoholoksidasegen, aox2, som også kan induseres med metanol. Rekombinant Pichia pastoris transformert med en heksoseoksidaseekspresjonskassett, vil således produsere to oksidaser, heksoseoksidase og alkoholoksidase, ved tilsetning av metanol. ;Før innføring av heksoseoksidasegenet i ekspresjonsvektoren pPIC3 ble sekvenser som ligger 5' og 3' for den åpne leseramme, modifisert. Førstetråds-cDNA ble benyttet som PCR-templat. Det syntetiske oligonukleotid som er spesifikt for den 5' ende av den åpne leseramme, Hox5'-l (tabell 3.1.), ble benyttet som PCR-primer sammen med en primer (Hox3'-l) spesifikk for den 3' ende av sekvensen som koder for heksoseoksidase fra Chondrus crispus. Primeren Hox3'-l hadde sekvensen 5'-ACCAAGTTTATAAAAAGCAACCATCAC-3<1> (SEKV.ID NR. 32). PCR-amplifiseringen ble utført ved å benytte "GeneAmp" PCR-reagensset-■tet med "AmpliTaq" DNA-polymerase (Perkin-Elmer Cetus). PCR-programmet var 30 sykluser bestående av 30 sek ved 94 °C, 30 sek ved 55 °C og 2 min ved 72 °C. Gelelektroforese av reaksjonsblandingen viste et bånd med' tilnærmet størrelse 1,7 kb. Dette 1,7 kb-fragment ble innsatt i vektoren "pT7 Blue" (Novagen) (plasmid pUPO150). og analysert ved DNA-sekvensering. ;Fragmentet som koder for heksoseoksidase fra Chondrus crispus, ble videre subklonét i Pichia pastoris-ekspresjonsvektoren pPIC3 (Clare et al. 1991) som vist i fig. 9. Plasmidet "pT7 Blue" som bar heksoseoksidasegenet, ble kuttet med restriksjonsendonukleasen Ndel, og endene ble polert med Klenow DNA-polymerase, i det vesentlige som beskrevet av Sambrook et al. (1989). Etter varmeinaktivering av DNA-polymer-asen (Sambrook et al. 1989) ble DNA kuttet videre med £coRI, og DNA-fragmentet som inneholdt heksoseoksidasegenet, ble renset i en agarosegel som et buttendet EcoRI-DNA-fragment ;("QIAEX", QIAGEN). ;Pichia pastoris- ekspzesjonsvektoren pPIC3 ble kuttet med restriksjonsenzymene SnaBI og EcoRI og renset i en agarosegel. Den rensede vektor og fragmentet som koder for heksoseoksidase, ble ligert sammen, og ligeringsblandingen ble transformert inn i E. coli DH5a (Life Technologies), i det vesentlige som beskrevet av Sambrook et al. (1989). Den resulterende ekspresjonsvektor som inneholdt heksoseoksidasegenet fra Chondrus crispus, plasmid pUP0153, ble analysert med DNA-sekvensering for å sikre at ingen mutasjoner hadde skjedd i heksoseoksidasegenet under subkloningen. ;Plasmid pUP0153 ble renset ved E. coli DH5a og inn-ført i Pichia pastoris ved elektroporering ("The Pichia Yeast Expression System", Phillips Petroleum Company) eller ved å benytte "The Pichia Spheroplast Module" (Invitrogen, San Diego, USA, kat. nr. K1720-01). Den metanolutnyttelses-mangel-fulle mutant av Pichia pastoris,. KM71 (genotype his4, aoxl::ARG4), (Cregg og Madden 1987, Tschopp et al. 1987) ble benyttet som mottaker. Rekombinante Pichia pastoris-kolonier selektert på agarskåler uten histidin, ble gjennomsøkt for forekomst av heksoseoksidasegenet ved å benytte PCR. Primere spesifikke for heksoseoksidase (tabell 3.1.), ble benyttet sammen med primere spesifikke for promoteren og transkripsjonstermineringssignalet fra alkoholoksidase fra. Pichia pas- ;toris (Invitrogen, kat. nr. N710-02, hhv. N720-02). ;En prøve av Pichia pastoris KM71 som inneholdt pUP0153, ble deponert hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Tyskland, den 23. mai 1996 under aksesjonsbetegnelsen DSM 10693. ;4. 2. Ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase i Pichia pastoris ;Pichia pastoris stamme KM71 som inneholdt ekspre-sjonskassetten med heksoseoksidasegenet innsatt mellom promoteren og transkripsjonstermineringssignalet fra aoxl, ble dyrket i risteflasker i MD (1,34 g pr. 1 med "yeast nitrogen base" (Difco, kat. nr. 0919-15-3), 0,4 mg/l biotin, 0,1% arginin og 20 g/l glukose). 1-liters risteflasker tilsatt 150 ml kultur, ble inkubert i en rotasjonsristemaskin ved 30 °C, ;300 rpm. Når cellene nådde en tetthet på OD60o = 15-20, ble cellene høstet ved sentrifugering ved 6.000 x g i 10 min og resuspendert i et tilsvarende volum (150 ml) med induksjons-medium, MM (1,34 g/l "yeast nitrogen base", 0,4 mg/l biotin, 0,1% arginin og 1% metanol). Etter dyrking i 2 dager ble ytterligere metanol (0,5%) tilsatt for å kompensere for forbruk av avdamping av metanol. 3 eller 4 dager etter induksjon ble cellene høstet ved sentrifugering (6 000 x g, 10 min) og resuspendert i tilnærmet 1/5 av dyrkningsvolumet med 50 mM Tris-Cl, pH 7,5. De resuspenderte celler ble holdt kaldt inntil de ble oppbrutt i en "FRENCH"-presse (SLM Instruments, Inc., Rochester, N.Y.). Cellene ble åpnet i en 20K "FRENCH"-trykkcelle ved et internt trykk på 137 100 pKa. Celleekstrakten ble klaret ved sentrifugering ved 10 000 x g i 10 min ved 5 °C. Den heksoseoksidaseholdige supernatant ble forsiktig fjernet og renset som beskrevet nedenfor. 4. 3. Rensing av rekombinant heksoseoksidase fra Pichia pastoris ;4. 3. 1. Første trinn, anionbytterkromatografi ;Klaret homogenat fra "FRENCH"-pressehomogenisering ;(100-150 ml) ble behandlet ved anionbytterkromatografi i et FPLC-system utstyrt med to 5 ml "HiTrap-Q"-kolonner forpakket med "Q-Sepharose High Performance" (Pharmacia). Kolonnene var koblet i serie, og kromatografien ble utført ved romtemperatur. Kolonnen var ekvilibrert med buffer A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Gjennomstrømningshastigheten var 1,25 ml under prøve-påsettingen og 2,5 ml under vask og eluering. Etter prøve-påsetting ble kolonnen vasket med 30 ml buffer A. Adsorberte proteiner ble så eluert med 200 ml av en gradient fra buffer A til buffer B: 20 mM Tris-Cl, 750 mM NaCl, pH 7,5. Fraksjoner på 2 ml ble oppsamlet under vask og gradienteluering. Fraksjonene ble analysert for heksoseoksidaseaktivitet som beskrevet ovenfor i eksempel 1.3. (10 ul prøve, 15 min inkubasjonstid) . Fraksjonene ble også analysert for alkoholoksidase (AOX)-aktivitet i en analyse som var identisk med heksoseok-sidaseanalysen, bortsett fra at 0,5% metanol ble benyttet som substrat istedenfor 0,05 M glukose. Som vist i figur 10, viste aktivitetsprofilene åt AOX og HOX ble eluert sammen ved en saltkonsentrasjon på tilnærmet 400 mM NaCl. Heksoseoksidaseholdige fraksjoner ble slått sammen og lagret ved 4 °C. ;4. 3. 2. Annet trinn, gelfiltrering ;Sammenslåtte fraksjoner fra trinn én i rensingen (20-30 ml) ble konsentrert til tilnærmet 3,5 ml ved sentrifugal ultrasentrifugering ved 4 °C i "Centriprep"-konsentratorer (Amicon, USA, nominell molekylvektsgre.nse 30 000) . Det konsentrerte heksoseoksidasepreparat ble klaret ved sentrifugering, og supernatanten ble blandet med glyserol til en sluttkonsentrasjon på 5%. Prøven ble påsatt kolonnen med en "SA-5"-prøvepåsetter (Pharmacia) koblet til kolonnens innløp. Gelfiltreringen ble utført ved 4 °C i en XK 26/70-kolonne (2,6 x 66 cm, Pharmacia) med et kolonnevolum på 350 ml. Kolonnen var pakket med "Sephacryl S-200 HR" (Pharmacia) ifølge produsentens instruksjoner. Bufferen var 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5, og den peristaltiske Pl-pumpe (Pharmacia) var justert til 0,5 ml/min. UV-absorbansen ved 280 nm ble målt. Fraksjoner på 2,5 ml ble oppsamlet og analysert for heksoseoksidase- og alkoholoksidase-aktivitet som beskrevet ovenfor (10 ul prøve, 15 min inkubasjonstid). Aktivitetsprofilene viste tydelig at AOX- og HOX-aktiviteten ble separert, se fig. 11. Dette resultat av gelfiltreringen var forventet da alkoholoksidase fra metylotrofe gjærarter som Pichia pastoris, har en nativ molekylvekt på tilnærmet 600 000 (Sahm & Wagner, 1973), mens HOX har en nativ molekylvekt på tilnærmet 110 000-130 000, som beskrevet i seksjon 1.8. Elueringsvolumet for rekombinant HOX var identisk med elueringsvolumet observert tidligere med samme kolonne for nativ HOX fra Chondrus crispus (seksjon 1.7 og 1.8). Rekombinant HOX hadde således tilsynelatende samme molekylvekt som nativ HOX isolert direkte fra Chondrus crispus. Heksoseoksidaseholdige fraksjoner ble slått sammen og lagret ved 4 °C. 4. 3. 3. Tredje trinn, anionbytterkromatografi i " Mono Q"- kolonne. ;Sammenslåtte fraksjoner fra det andre trinn ovenfor ble videre renset ved anionbytterkromatografi i et FPLC-system utstyrt med en "Mono Q HR 5/5"-kolonne (kolonnevolum 1 ml) . Kolonnen ble ekvilibrert i buffer A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5; Gjennomstrømningshastigheten var 1 ml/min. Sammenslåtte fraksjoner fra trinn to ble avsaltet ved gelfiltrering i buffer A i ferdigpakkede "Sephadex G-25"-kolonner (PD-10, Pharmacia) . Etter prøvepåsetting ble kolonnen vasket med 30 ml buffer A. Adsorberte proteiner ble eluert med 20 ml av en gradient fra 0% til 100% buffer B: 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5. Fraksjoner på 0,5 ml ble oppsamlet og analysert for heksoseoksidaseaktivitet som beskrevet ovenfor (10 ul prøve, 15 min inkubasjonstid). Heksoseoksidaseholdige fraksjoner ble slått sammen og lagret ved 4 °C. ;4. 3. 4. Fjerde trinn, kromatofokusering ;Sammenslåtte fraksjoner fra trinn tre ovenfor ble renset ved kromatofokusering i en "Mono P HR 5/5"-kolonne som beskrevet ovenfor i eksempel 1.13, bortsett fra at "Phenyl Sepharose"-adsorpsjonstrinnet ble utelatt. Ved sammenligning av nativ og rekombinant heksoseoksidase - begge former erholdt ved avsluttende rensing ved kromatofokusering - ble det funnet at den spesifikke aktivitet av rekombinant heksoseoksidase fra Pichia pastoris tilsvarte den til den native form isolert fra Chondrus crispus. Heksoseoksidaseholdige fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE og gelfarging med "Coomassie Brilliant Blue R-250" som beskrevet ovenfor. Det rensede preparat med rekombinant heksoseoksidase besto av to bånd med migrasjon tilsvarende 40 kD, hhv. 29 kD. ;Som konklusjon kunne rekombinant heksoseoksidase isoleres og renses fra vertsorganismen Pichia pastoris. Ved SDS-PAGE viste det rekombinante, rensede enzym de samme bånd ved 40 kD og 29 kD som det tilsvarende native enzym fra Chondrus crispus. ;4. 4. Egenskaper til rekombinant heksoseoksidase fra Pichia pastoris ;Dannelse og aminosyresekvensanalyse av peptidfragmenter fra rekombinant heksoseoksidase (rHOX). ;Renset rHOX ble benyttet i preparativ SDS-PAGE og elektroblotting til PVDF-membran som beskrevet ovenfor i eksempel 2.4. De resulterende bånd på 4 0 kD og 29 kD ble behandlet med enzymatisk kløyving av PVDF-bundne heksoseoksidasepolypeptider som beskrevet ovenfor i eksempel 2.5. Peptidfragmentene ble atskilt ved reversfase-væskekromatografi som beskrevet ovenfor i eksempel 2.7. Godt atskilte peptider i rikelige mengder ble utvalgt for aminosyresekvensanalyse ved automatisert Edman-degradering (10 trinn) som beskrevet ovenfor i eksempel 2.3. De erholdte aminosyresekvenser er vist i tabell 4.1. ;HOX-9-peptidsekvensen fra det rekombinante 40 kD-polypeptid viste en sekvens som var identisk med sekvensen fra Aspxs til Asni7 i aminosyresekvensen for heksoseoksidase fra Chondrus crispus som vist i tabell 3.2. (SEKV.ID NR. 30). Sekvensanalyse av en peptidprøve erholdt fra det rekombinante polypeptid på 29 kD, viste to aminosyrerester i hvert trinn. Identifisering av aminosyrene viste at prøven inneholdt to peptider som tilsvarte området fra Leu434 til Glu443, hhv. Tyr388 til Thr397, fra aminosyresekvensen til heksoseoksidase fra Chondrus crispus, se tabell 3.2.. (SEKV.ID NR. 30) . ;Det kunne således konkluderes med at peptidsekvensene erholdt fra rekombinant heksoseoksidase, var identiske med de tilsvarende aminosyresekvenser fra nativ heksoseoksidase fra Chondrus crispus. ;Det kunne videre konkluderes med at Pichia pastoris transformert med heksoseoksidasegenet fra Chondrus crispus, kunne produsere rekombinant heksoseoksidase. ;4. 4. 1. Substratspesifisitet ;Substratspesifisiteten til rekombinant heksoseoksidase fra Pichia pastoris og nativ heksoseoksidase fra Chondrus crispus ble sammenlignet ved å benytte en rekke sukkere ved en sluttkonsentrasjon på 0,1 M i analysen beskrevet ovenfor. De relative reaksjonshastigheter er vist i tabell 4.2. ;Som vist i tabell 4.2., var substratspesifisiteten til rekombinant heksoseoksidase nærmest identisk med substrat-spesif isiteten til det native enzym. Selv om den relative reaksjonshastighet for disakkarider avtok for begge enzym-former i rekkefølgen maltose, cellobiose og laktose, var det rekombinante enzym imidlertid tilsynelatende mindre selektivt med hensyn til oksidasjon av disse disakkarider. Resultatene for det native enzym var tilnærmet identiske med resultatene rapportert tidligere av Sullivan et al. (1973). ;4. 4. 2. Inhibering med natriumdietylditiokarbamat ;Sullivan og Ikawa (1973) rapporterte at heksoseoksidase fra Chondrus crispus inhiberes kraftig av natriumdietylditiokarbamat. Rekombinant heksoseoksidase fra Pichia pastoris ble sammenlignet med det native enzym fra Chondrus crispus med hensyn til inhibering med denne kobberholdige forbindelse. Inhibitoren ble innført i enzymanalysen i to konsentrasjoner, 0,1 mM og 0,01 mM, som beskrevet av Sullivan og Ikawa (1973). Resultatene er oppsummert i tabell 4.3. ;Det fremgår fra tabell 4.3. at rekombinant og nativ heksoseoksidase viste tilsvarende sensitivitet ved inhibering med natriumdietylditiokarbamat. Resultatene var videre tilsvarende verdiene for nativ heksoseoksidase rapportert av Sullivan og Ikawa (1973). ;Eksempel 5 ;Fremstilling av rekombinant heksoseoksidase i Escherichia coli 5. 1. Konstruksjon av en vektor for ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase i Escherichia coli ;Den åpne leseramme som koder for heksoseoksidase fra Chondrus crispus vist i tabell 3.2. (SEKV.ID NR. 30), ble innsatt i en Escherichia coli-ekspresjonsvektor, pET17b (Novagen, kat. nr. 69726-1). Plasmidet inneholder en kraftig, induserbar promoter fra bakteriofag T7 og et T7-transkripsjonsterminer-ingssignal. Gener innsatt mellom disse kontrollelementer, kan uttrykkes ved tilsetning av isopropyl-p-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) dersom plasmidet innføres i spesielle E. coli- verts-celler, f.eks. stamme BL21 (DE3) (Novagen, kat. nr. 69387-1). ;Heksoseoksidasegenet ble modifisert i den 5' og 3' ende for å innsette genet i ekspresjonsvektoren pET17b. Heksoseoksidasegenet ble isolert ved PCR med primere spesifikke for den 5' og den 3' ende av heksoseoksidasegenet. Den 5' primer (Hox5'-2) hadde DNA-sekvensen 5'-ATGAATTCGTGGGTCGAAGAG-CCC-3<*> (SEKV.ID NR. 33), og primeren spesifikk for den 3' ende, var Hox3'-l. Førstetråds-cDNA fra Chondrus crispus ble benyttet som templat. PCR-amplifisering ble utført med "AmpliTaq" DNA-polymerase (Perkin-Elmer Cetus) som beskrevet i eksempel 4.1. Gelelektroforese av reaksjonsblandingen viste et bånd med tilnærmet størrelse 1,7 kb. Dette 1,7 kb-fragment ble innsatt i vektoren "pT7 Blue" (Novagen) slik at plasmid pUP0161 ble. dannet.

Modifisering av den 5' ende av.heksoseoksidasegenet og videre subkloning av genet i E. coli-ekspresjonsvektoren er vist i figur 12. Den 5' ende ble modifisert ved PCR for inn-føring av et Wdel-sete like ved translasjonsstartsignalet ATG. Oligonukleotidet, Hox5'-4, med sekvensen 5<1->CAGGAATTCATATGGCT-ACTCTTCCCCAGAAAG-3' (SEKV.ID NR. 34) ble benyttet sammen med oligonukleotidet Hoxl3- (SEKV.ID NR. 28) (tabell 3.1.). PCR-amplif isering var som beskrevet ovenfor i eksempel 4.1. Reaksjonsblandingen var fraksjonert i en 2% agarosegel, og det heksoseoksidasespesifikke fragment på 180 bp ble renset som beskrevet i eksempel 3.4. 180 bp-fragmentet ble kuttet med restriksjonsendonukleasene Clal og EcoRI og ligert til pUP0161 kuttet med de samme enzymer slik at plasmid pUP0167 ble dannet .

Heksoseoksidasegenet i plasmid pUPOl67 ble videre subklonet for å konstruere en heksoseoksidaseekspresjonsvektor for E. coli. Plasmid pUP0167 ble kuttet med enzymene Ndel og BamHI og med enzymene Bamtil og Sali. Den første reaksjon ga opphav til et fragment på 1,6 kb som kodet for den 5' del og den midtre del av heksoseoksidasegenet, mens reaksjonen med enzymene BamHI og Sali ga et fragment på 200 bp som koder for heksoseoksidasegenets 3' ende. De to heksoseoksidasespesifikke fragmenter ble renset i agarosegeler som beskrevet i eksempel 3.4 og ligert til plasmid pET17b kuttet med restriksjonsendonukleasene Wdel og Xhol. Plasmid pET17b som bar heksoseoksidasegenet, ble betegnet pUP0181. DNA-sekvensering viste at ingen mutasjoner var innført i heksoseoksidasegenet under isoleringen og kloningsprosessen.

5. 2. Ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase i Escherichia coli

Plasmid pUP0181 ble innført i E. coli stamme BL21 (DE3) (Novagen) ved en standard transformeringsfremgangsmåte (Sambrook et al. 1989). Cellene ble dyrket i risteflasker i LB-medium (Sambrook et al., supra). Ved en celletetthet på OD600 = 0,5 ble cellene indusert til ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase ved tilsetning av IO"<3> M IPTG. 1 time etter tilsetning av IPTG ble cellene høstet ved sentrifugering, resuspendert i prøvebuffer og analysert ved SDS-PAGE som beskrevet ovenfor i eksempel 1.10.

Resultatet av elektroforesen er vist i figur 13. Råekstraktet av E. coli som uttrykker rekombinant heksoseok-sidaseenzym fra plasmid pUP0181, viste et fremtredende proteinbånd ved Mr 62 kD. Dette 62 kD-bånd hadde samme molekylvekt som translasjonsproduktet utledet fra den åpne leseramme. Ikke-transformerte E. coli-celler viste intet tilsvarende protein på 62 kD.

En prøve av E. coli BL21 (DE3) inneholdende pUP0181, ble deponert hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Tyskland, den 23. mai 1996 under aksesjonsbetegnelsen DSM 10692.

Eksempel 6

Fremstilling av rekombinant heksoseoksidase i Saccharomyces cerevisiae

6. 1. Konstruksjon av en vektor for ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase i Saccharomyces cerevisiae

Den åpne leseramme'som koder for heksoseoksidase fra Chondrus crispus vist i tabell 3.2. (SEKV.ID NR. 30), ble inn-

satt i en gjærekspresjonsvektor, pYES2 (Invitrogen, kat. nr. V825-20). Plasmid pYES2 er en episomal vektor med høyt kopi-

tall utformet for induserbar ekspresjon av rekombinante pro-

teiner i Saccharomyces cerevisiae. Vektoren inneholder opp-

strøms aktiverende sekvenser og promotersekvenser fra Gall-

genet fra S. cerevisiae for tett regulert transkripsjon i høyt nivå. Transkripsjonstermineringssignalet er fra C<y>Cl-genet.

Heksoseoksidasegenet fra Chondrus crispus ble modi-

fisert i den 5' og den 3' ende for innsetting av genet i ekspresjonsvektoren pYES2. Heksoseoksidasegenet ble isolert fra plasmid pUPO150 som beskrevet i eksempel 4.1. (figur 9). Heksoseoksidasegenet ble isolert på et buttendet EcoRI-DNA-frag-

ment som beskrevet og innsatt i plasmid pYES2 kuttet med en-

zymene PvuII og EcoRI (figur 14). Det resulterende plasmid, pUP0155, ble analysert ved DNA-sekvensering for å vise at in-

gen mutasjoner hadde skjedd under kloningsprosedyren.

Plasmid pUOP155 ble renset fra E. coli DH5a og transformert inn i S. cerevisiae ved elektroporering (Grey og Bren-dell, 1992). Stamme PAP1500 (genotype ol, ura3- 52, trpl: :GAL10-GAL4, lys2- 801, leu2ål, his3A200, pep4::HIS3, prblAl.6R, canl,

GAL) (Pedersen et al. 1996) ble benyttet som mottaker.

6. 2. Ekspresjon av rekombinant heksoseoksidase i Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae stamme 1500 som inneholdt plasmid

pUP0l55, ble dyrket og indusert med 2% galaktose som beskrevet av Pedersen et al. (1996). 3 dager etter induksjon ble cellene høstet ved sentrifugering og lysert som beskrevet ovenfor i eksempel 4.2. Råekstraktet ble analysert for heksoseoksidaseaktivitet ved å benytte o-dianisidinanalysen beskrevet ovenfor i eksempel 1.3. Tabell 6.. 1 viser at S. cerevisiae- celler som

bærer heksoseoksidasegenet, kan uttrykke aktiv heksoseoksidase .

En prøve av S. cerevisiae stamme 1500 som inneholdt plasmid pUP0155, ble deponert hos Deutsche" Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg.lb, D-38124 Braunschweig, Tyskland, den 23. mai 1996 under aksesjonsbetegnelsen DSM 10694.

REFERANSER

1. Barkholt, V. og A.L. Jensen 1989. Amino Acid Analysis: Determination of Cysteine plus Half-Cystine in Proteins after Hydrochloric Acid Hydrolysis with a Disulfide Compound as Additive. Analytical Biochemistry 177:318-322. 2. Bean, R.C. og W.Z. Hassid 1956. Biol. Chem. 218:425-436. 3. Clare, J J-, F.B. Rayment, S.P. Ballantine, K. Sreekrishna og M.A. Romanos 1991. High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. Bio/Technology 9: 455-460. 4. Cregg, J.M. og K. N. Madden 1987. Development of transformation systems and construction of methanol-utilisa-tion-defective mutants of Pichia pastoris by gene disruption. In: Biological Research on Industriar Yeast, Vol III. Stew-art, G. G. et al. (red.), s. 1-18. CRC Press, Boca Raton, FL. 5. Femandez, J. et al. 1992. Internal Protein Seguence Analysis: Enzymatic Digestion for Less Than 10 us of Protein Bound to Polyvinyl idene Difluoride or Nitrocellulose Mem-branes. Analytical Biochemistry, 201:255-264. 6. Fernandez, J. et al. 1994. An Improved Procedure for Enzymatic Digestion of Polyvinyl idene Difluoride-Bound Proteins for Internal Seguence Analysis. Analytical Biochemistry, 218:112-117. 7. Groppe, J.C. og D.E. Morse 1993. Isolation of full-length RNA templates for reverse transcription from tissues rich in RNase and proteoglycans, Anal. Biochem., 210:337-343. 8. Kerschensteiner, D.A. og G.L. Klippenstein 1978. Purification, Mechanism, and State of Copper in Hexose Oxidase. Federation Proceedings 37:1816, sammendrag. 9. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature (London) 227:660-685. 10. Pedersen P.A., J.H. Rasmussen, og P.L. Jørgensen. 1996. Expression in high yield of pig al/Sl Na, K-ATPase and inactive mutants D369N and D807N i Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 271: 2514-2522. 11. Rand, A.G. 1972. Direct enzymatic conversion of lactose to acid: glucose oxidase and hexose oxidase. Journal of Food Science 37:698-701. 12. Sahm, H. og Wagner, F. 1973. Microbial assimilation of methanol. Eur. J. Biochem..36: 250-256. 13. Sambrook, J., E.F. Fritsch og T. Maniatis 1989. Molecu-lar Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY: 14. Schågger, H. og G. von Jagow 1987. Tricine-Sodium Dode-cyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Sepa-ration of Proteins in the Range from l to 100 kDa. Analytical Biochemistry 166:368-379. 15. Sock, J. og R. Rohringer 1988. Activity Staining of Blotted Enzymes by Reaction Coupling with Transfer Mexnbrane-Immobilized Auxiliary Enzymes. Analytical Biochemistry 171:310-319. 16. Sullivan, J.D. og M. Ikawa 1973. Purification and Cha-racterization of Hexose Oxidase from the red Alga Chondrus crispus. Biochemica et Biophysica Acta 309:11-22. 17. Tschopp, J. F., G. Sverlow, R. Kosson, W. Craig, og L. Grinna 1987. High-level secretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Bio/Technology 5: 1305-1308. 18. Yen, K-W, R.H. Juang og j-c. Su. A rapid and efficient method for RNA isolation from plants with high carbohydrate content. Focus 13:102-103

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et heksoseoksidasepolypeptid (HOX) fra Chondrus crispus, karakterisert ved at den omfatter trinnene med dyrking av en rekombinant vertsorganisme inneholdende en DNA-sekvens som koder for det nevnte HOX-polypeptid, hvori vertsorganismen er en mikroorganisme, utvalgt fra grupper bestående av en E. coli-celle, en melkesyrebakteriecelle og en gjærcelle.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen konstrueres syntetisk.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at polypeptidet omfatter én eller flere av aminosyresekvensene utvalgt fra: hvor X står for en aminosyre utvalgt fra gruppen som består av Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori fremgangsmåten videre omfatter trinnene med: (i) tilveiebringelse av en DNA-sekvens som koder for evnte HOX-polypeptid, (ii) introduksjon av nevnte DNA-sekvens inn i en vertsorganisme, (iii) dyrking av den rekombinante vertsorganisme under stabile betingelser for å fremme ekspresjon av nevnte polypeptid.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at DNA-sekvensen omfatter minst ett DNA-fragment som koder for en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen bestående av: hvor X står for en aminosyre utvalgt fra gruppen som består av Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val, eller nevnte DNA-sekvens omfatter det heksoseoksidasekodende område som angitt i SEKV.ID NR.

30.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at polypeptidet gj envinnes.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved. at det gjenvunne polypeptid utsettes for ytterligere et rensingstrinn.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at polypeptidet har evnen til å oksidere minst ett sukker utvalgt fra gruppen bestående av D-glukose, D-galaktose,- maltose, cellobiose, laktose, D-mannose, D-fukose og D-xylose.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at aktiviteten til polypeptidet inhiberes ved hjelp av natriumdietylditiokarbamat .

10. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den omfatter trinnene med isolering eller syntetisering av et DNA-fragment som koder for polypeptidet, introduksjon av DNA-fragmentet inn i en vertsorganisme, hvorved DNA-fragmentet kombineres med et ekspresjonssignal for fragmentet, dyrking av den resulterende rekombinante vertsorganisme i et dyrkingsme-dium under betingelser som fører til ekspresjon av det aktive heksoseoksidasepolypeptid og utvin-ning av polypeptidet fra dyrkingsmediet eller den rekombinante vertsorganisme.

11. HOX-polypeptid, karakterisert ved at det fremstilles ved hjelp av fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 10.

12. Isolert HOX-polypeptid, karakterisert ved at HOX-polypeptidet omfatter minst én aminosyresekvens utvalgt fra gruppen bestående av: hvor X står for en aminosyre utvalgt fra gruppen som består av Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val, eller så omfatter HOX-polypeptidet aminosyresekvensen som er angitt i SEKV.ID NR. 31.

13. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det har evnen til å kode for et HOX-polypeptid, hvori DNA-molekylet koder for et protein som har egenskaper som ligner HOX, isolert fra Condrus crispus og omfatter DNA-sekvensen som angitt i SEKV.ID NR. 30, eller omfatter DNA-sekvensen i den åpne leseramme som vist i SEKV.ID NR. 30; eller hvori det rekombinante DNA-molekyl koder for et Chondrus crispus-polypeptid med heksoseoksidaseaktivitet, hvori fragmentet som koder for et polypeptid, omfatter minst én aminosyresekvens utvalgt fra gruppen bestående av 8), hvor X står for en aminosyre utvalgt fra gruppen som består av Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.

14. DNA-fragment, karakterisert ved at det omfatter det rekombinante DNA-molekyl ifølge krav 13.

15. Rekombinant celle, karakterisert ved at den omfatter det rekombinante DNA-molekyl ifølge krav 13 eller DNA-fragment ifølge krav 14, hvori den rekombinante celle er en mikroorganisme utvalgt fra gruppen bestående av en E. coli-celle, en melkesyrebakteriecelle og en gjærcelle.

16. Anvendelse av et polypeptid som er fremstilt i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-10, eller et polypeptid ifølge krav 11 eller 12, eller en rekombinant celle ifølge krav 15, for fremstilling av et næringsprodukt.

17. Anvendelse ifølge krav 16, karakterisert ved at næringsproduktet er utvalgt fra gruppen bestående av et meieriprodukt, et stivelsesinneholdende næringsprodukt og en drikk som ikke er fra me.ieriet.

18. Anvendelse av et polypeptid for fremstilling i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-10 eller en rekombinant celle ifølge krav 15, for fremstilling av et næringsprodukt til dyr.

19. Anvendelse ifølge krav 18, karakterisert ved at næringsproduktet til dyr er silofor.

20. Anvendelse av et polypeptid når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-10 eller en rekombinant celle ifølge krav 15, for fremstilling av et farmasøytisk produkt, et kosmetisk produkt eller et tannpleieprodukt.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av et næringsprodukt, karakterisert ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet ved fremstilling i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-10, og/eller ii) anvendelse av polypeptidet ifølge ethvert av krav 11 eller 12, og/eller iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge krav 15, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, i fremgangsmåten for fremstilling av næringsproduktet.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av en deigblanding, karakterisert ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet som fremstilt i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-10, og/eller ii) anvendelse av polypeptidet ifølge ethvert av krav 11 eller 12, og/eller iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge krav 15, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, iv) tilsetning av vanlige deigkomponenter, og blanding av bestanddelene inntil deigen er dannet.

23. Fremgangsmåte for fremstilling av et bakeprodukt fra en deig, karakterisert ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-10, og/eller ii) anvendelse av polypeptidet ifølge ethvert av krav 11-12, og/eller iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge krav 15, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, iv) tilsetning av deigkomponentene, v) blanding inntil deigen dannes, og vi) anvendelse av blandingen for baking.

24. Fremgangsmåte for fremstilling av en deigforbedrende sammensetning, karakterisert ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-10, og/eller ii) anvendelse av polypeptidet ifølge ethvert av kravene 11 eller 12, og/eller iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge krav 15, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid og iv) blanding med i det minste én vanlig deigkomponent.

25. Deigforbedrende sammensetning, karakterisert ved at den fremstilles ifølge fremgangsmåten som angitt i krav 24.

26. Anvendelse av en deigforbedrende sammensetning ifølge krav 24, for forbedring av egenskapene til deig.

27. Fremgangsmåte for reduksjon av sukkerinnholdet i et næringsprodukt, karakterisert ved at den omfatter: i) anvendelse av polypeptidet når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-10, og/eller ii) anvendelse ay polypeptidet ifølge ethvert av krav 11 eller 12, og/eller iii) anvendelse av en rekombinant celle ifølge krav 15, som har evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, hvori mengden er tilstrekkelig til å fjerne i det minste en del av sukkeret som er til stede i nevnte næringsprodukt innledningsvis.

28. Anvendelse av et polypeptid når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge krav 1-10, eller et polypeptid ifølge ethvert av krav 11 eller 12, eller en rekombinant celle ifølge krav 15, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid,hvori polypeptidet virker som et antimikrobielt middel.

29. Anvendelse av et polypeptid når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge krav 1-10 eller et polypeptid ifølge ethvert av krave 11 eller 12, eller en rekombinant celle ifølge krav 15, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, hvori polypeptidet virker som en antioksidant.

30. Anvendelse av et polypeptid når det fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge krav 1-10 eller et polypeptid ifølge ethvert av krav 11 eller 12,' eller en rekombinant celle ifølge krav 15, med evnen til å uttrykke nevnte polypeptid, er virksomt som et oksygenfjernende middel i en næringspakning.

31. Fremgangsmåte for fremstilling av et lakton ved anvendelse av rekombinant celle ifølge krav 15, karakterisert ved at den omfatter anbringelse av cellen til en reaktor inneholdende et karbohydrat som kan oksideres ved hjelp av det heksoseoksidaseaktive polypeptid og operering av reaktoren under betingelser der polypeptidet uttrykkes, hvorved karbohydratet oksideres til lakton.

32. Fremgangsmåte for fremstilling av et lakton ved anvendelse av HOX-polypeptidet ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at den omfatter at HOX-polypeptidet anbringes til en reaktor inneholdende et karbohydrat som kan oksideres ved hjelp av HOX-polypeptidet og operering av reaktoren under tilstander der karbohydratet er oksidert til lakton.

33. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-10, karakterisert ved at gjærcellen er en Saccharomyces. cerevisiae- celle og en Pichia pastoris-celle.

34. Rekombinant celle ifølge krav 15, karakterisert ved at gjærcellen er en Saccharomyces cervisiae- celle eller en Pichia pastoris-celle.