JP2003515332A

JP2003515332A - 生地およびパンの品質を改良する方法

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Publication number: JP2003515332A
Application number: JP2001541343A
Authority: JP
Inventors: セー，イェルン・ボルク
Original assignee: ダニスコアクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2003-05-07
Also published as: EP1233676A1; NZ518687A; EP1108360A1; MXPA02005452A; WO2001039602A1; AU1723801A; CA2392116A1; CN1407856A; EP1108360A9; BR0016068A

Abstract

(57)【要約】生地を作る方法であって、無極性脂質、糖脂質およびリン脂質を同時に加水分解することができる酵素を生地に加えることを含む方法。その酵素の、１つ以上の基質、たとえば、ジガラクトジグリセリド（ＤＧＤＧ）等のガラクト脂質、または、たとえば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）等のリン脂質を加えてもよい。脂質基質を、オートムギ油等の穀類油の形で生地に加えることができる。本方法は、生地に、改良された伸展性および低い粘着性、および高い比体積、改良された柔らかさおよび優れた柔らかい中身の構造を有する焼成したパン製品を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の分野］本発明は、穀粉の生地および穀粉の生地を基にした製品を製造する分野に関し
、特に、生地の強さおよび機械加工性ならびにパンおよび他の焼成製品（ｂａｋ
ｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）の体積および柔らかい中身の構造（ｃｒｕｍｂｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ）を改良することに関する。具体的には、本発明は、生地中に存
在する無極性および極性脂質の両者を加水分解することができる酵素を使用して
、生地およびパンを製造し、それによって、生地および完成した焼成製品の品質
を高める方法を提供する。

【０００２】［技術背景および従来技術］生地および生地の取扱特性を改良するために、および／または体積を増やし、
鮮度が落ちるのを遅らせ、柔らかさを高めるように、焼成製品を改良するために
、アミラーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼおよびプロテアーゼ等の酵素を使用
することは、製パン業界内で周知である。

【０００３】リパーゼをパン焼成添加物（ｂａｋｉｎｇａｄｄｉｔｉｖｅｓ）として使用
することも知られている。リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）は、アシルグリセロ
ールの加水分解を触媒するカルボキシルエステラーゼと定義することができ、ア
ミラーゼおよびプロテアーゼと共に、主要な３つの消化酵素の１つとして、生理
学的に非常に重要な酵素である。リパーゼは、アシルグリセロール脂質を、グリ
セロールおよび脂肪酸に加水分解するが、エステル化またはエステル交換反応で
作用することもできる。

【０００４】従って、米国特許第３，３６８，９０３号には、パン生地混合物に加えたとき
、パンの鮮度が落ちるのを有意に遅らせる作用を有する、植物種子から単離され
た精製リパーゼ調製品が開示されている。

【０００５】日本特開昭６２−２８５７４９号広報には、リパーゼを、不可欠なグルテンお
よびレシチンと混合して生地に加える製パン方法が説明されている。しかし、こ
のリパーゼは、パンの体積および柔らかい中身の弾力性等の、品質を低下させる
ことが述べられている。

【０００６】Ｍｏｈｓｅｎｅｔａｌ．（Ｅｇｙｐｔ．Ｊ．ＦｏｏｄＳｃｉ．，１９８
６，１４：１７５−１８２）は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａｒにより産生
されるリパーゼは、パンの柔らかさを改良することができると記述している。

【０００７】欧州特許ＥＰ４６８７３１Ａ１号には、オキシダーゼまたはたとえばリパーゼ
等のヒドロラーゼと組合せてグルコースオキシダーゼを含むパン改良組成物が開
示されている。十分なかさのパンが得られる。しかし、この従来技術の記録によ
れば、リパーゼのみを使用した場合、満足のゆく品質のパンにはならなかった。

【０００８】ＷＯ−９４／０４０３５号には、生地（脂肪を加えたおよび加えない）および
／または微生物起源のリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を生地に加えて、生地か
ら作られる焼成製品の性質を改良する方法が開示されている。微生物のリパーゼ
を使用することによって、かさが増し、且つ焼成製品の柔らかさが改良された。
さらに、鮮度が落ちるのを防止する作用が確認された。

【０００９】欧州特許ＥＰ５８５９８８Ａ１号には、少なくとも１種のリパーゼ、少
なくとも１種のヘミセルラーゼおよび少なくとも１種のアミラーゼを含むパン改
良剤組成物が開示されている。焼成実験（ｂａｋｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ）から、脂肪を加えない生地でリパーゼのみを使用すると、焼成製品の体積が
減少するが、脂肪を加えた生地でリパーゼを使用したとき、かさに対する作用は
みられないことが分かった。

【００１０】ＷＯ９８／４５４５３号には、パンの柔らかい中身の構造を改良するために、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ由来のリパーゼを使用することが開示され
ている。しかし、この酵素は、パンの体積および柔らかさに対する有意な改良作
用を持っていなかった。

【００１１】従って、生地添加物として使用するとき、リパーゼの作用は、鮮度が落ちるの
を防止すること、または柔らかい中身が堅くなるのを遅らせること、およびパン
の体積を改良することに関して、非常に変化しやすいことが、従来技術から推論
される。

【００１２】ＷＯ９８／４５４５３号に開示されているリパーゼの重要な作用は、トリグリ
セリド加水分解作用に加えて、リパーゼは、穀粉中に存在する極性糖脂質、たと
えば、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）を加水分解できることである。
パンの柔らかい中身の構造を改良する作用は、この後者の作用と関連があると言
う仮説をたてた。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒリパーゼは、リン脂質加
水分解作用を持たないことも分かった。

【００１３】パンの品質を改良するために、ホスホリパーゼを使用することも知られている
。従って、日本特許ＪＰ−８２−６６２１３号には、凍結生地の改良に、ホスホ
リパーゼＣおよびリゾホスホリパーゼを使用することが開示されており、欧州特
許ＥＰ５７５１３３Ａ号には、生地の取扱特性を改良するためにホスホリパーゼ
Ａ１を使用することが開示されており、日本特開昭６０−０７８５２９号広報に
は、小麦粉生地およびヌードルの機械特性を改良するためにホスホリパーゼＡを
使用することが開示されており、欧州特許ＥＰ１０９２４４Ａ号には、ホスホリ
パーゼＡを使用して生地の特性を改良できることが開示されている。

【００１４】リパーゼまたはホスホリパーゼを生地に加えることによって、生地の機械特性
および／または完成した焼成製品の品質が改良されることは当技術分野で周知で
あるが、穀粉中に存在するそれぞれの酵素の脂質基質の量が限られていることは
重大な問題である。穀粉生地中のリパーゼの基質は、その約５０％が無極性脂質
であり、５０％が極性糖脂質およびリン脂質である内因性脂質である。

【００１５】欧州特許ＥＰ５８５９９８号およびＷＯ９４／０４０３５号に開示されている
ものを含め、製パン業界で現在使用されているリパーゼの幾つかは、無極性脂質
分画に対して活性であるに過ぎず、遊離脂肪酸およびグリセロールの形成、およ
びより少量のモノグリセリドまたはジグリセリドの形成を招く。しかし、遊離脂
肪酸がパンの品質に対して有害な作用を有することがあるため、生地またはパン
の品質に対する有益な作用はかなり限定される。ＷＯ９８／４５４５３号に開示
されている真菌リパーゼは、アシルグリセロールに対する作用に加えて、極性糖
脂質に対してある一定の加水分解作用を有する。

【００１６】さらに、上述の通り、ホスホリパーゼＡおよびＣの使用は、生地および／また
はパン改良用添加物として提案されている。このようなホスホリパーゼの酵素作
用は、生地中に存在するリン脂質が、有効な乳化剤であることが判明している、
対応するリゾリン脂質に転換されることである。しかし、パン生地中の内因性リ
ン脂質量は比較的少なく、従って、リン脂質に対して選択的に活性な添加酵素の
、生地およびパン改良作用は限定されるであろう。

【００１７】従って、穀粉生地中に存在する脂質型の実質的に全て、すなわち、無極性アシ
ルグリセロールおよび極性リン脂質および糖脂質を、加水分解することができる
生地および／またはパン改良用酵素が必要である。本発明は、これらの脂質を基
質として同時に使用することができる脂肪分解的に活性な酵素の発見に基づいて
おり、また、このような酵素を生地に加えると、生地の安定性および強さならび
に生地の取扱特性が有意に改良され、パンの体積、柔らかい中身の構造，柔らか
い中身の外観、およびパンの色および柔らかさの有意な向上に関して、焼成した
パン製品の品質が改良されることが確認されている。これらの新規な酵素の特に
興味深く且つ重要な態様は、これらの酵素が、極性脂質に選択性があることであ
り、アシルグリセロール加水分解リパーゼで確認された有害作用は、極性脂質を
優先的に加水分解する酵素を選択することによって調節し得ることを意味する。
これらの新規な酵素の、さらなる興味深く且つ重要な態様は、短鎖脂肪酸、たと
えば、Ｃ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸と比較して、長鎖脂肪酸、たとえば、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸
に選択性があることである。

【００１８】Ｒｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａｒ由来のリパーゼで、鎖長選択性は、アミノ
酸置換によって影響されることが、従来技術で証明されている。Ｒ．Ｄ．Ｊｏｅ
ｒｇｅｒｅｔａｌ（Ｌｉｐｉｄｓ，２９（６）３７７−３８４（１９９４）
）は、変異形Ｆ９５Ｄ，Ｆ１１２ＷおよびＶ２０９Ｗは、Ｃ₄およびＣ₈酸に対し
て変化した選択性を有することを示している。Ｒ．Ｒ．Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ
（ＪＡＯＣＳ，７４（１１）１４０１−１４０７（１９９７））は、変異形Ｖ２
０６Ｔ＋Ｆ９５Ｄは、Ｃ₈脂肪酸に対して高い選択性を有することを開示してい
る。Ｒ．Ｒ．Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ（Ｌｉｐｉｄｓ３２（２）１２３−１３
０（１９９７））は、変異形Ｖ２０９Ｗ＋Ｆ１１２Ｗ，Ｖ９４ＷおよびＦ９５Ｄ
＋Ｆ２１４Ｒは、Ｃ₄〜Ｃ₈脂肪酸に対して高い加水分解活性を有することを示し
、中間鎖長特異性の構造決定基は、アシル結合溝（ａｃｙｌｂｉｎｄｉｎｇ
ｇｒｏｏｖｅ）の遠位末端に在ることを示唆している。

【００１９】本発明による酵素の生地およびパン改良作用は、糖脂質および／またはリン脂
質を、たとえば、オートムギ油を含む穀類の脂質の形で、生地に加えることによ
って、さらに増強できることも確認されている。

【００２０】［発明の概要］従って、本発明は、第１の態様では、穀粉生地を作製する方法であって、生地
の状態で、無極性脂質，糖脂質およびリン脂質を加水分解することができる酵素
、または上記酵素を含む組成物を、生地成分に加えるステップと、生地を得るた
めに生地成分を混合するステップとを含む方法に関する。酵素の脂質基質はいず
れも、穀粉中に天然に存在する脂質であってもよく、生地に加えてもよい。

【００２１】さらなる態様において、生地の状態で、無極性脂質、糖脂質およびリン脂質を
加水分解することができる酵素、および任意に少なくとも１つのさらなる生地成
分を含む、生地改良用組成物を提供する。さらなる生地成分は、たとえば、生地
特性および／またはその生地から作られる焼成製品の品質に対して、改良作用を
有する他の酵素であってもよい。

【００２２】さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる生地、およ
びこのような生地を焼成することによって得られる焼成製品、および本発明によ
って作製されるヌードルおよびパスタ製品に関する。

【００２３】［発明の詳細な説明］本発明は、穀粉を主成分とする生地、およびこのような生地から作製される製
品の特性を改良する方法を、有利に提供する。これは、焼成製品に関しては、パ
ンの体積、柔らかい中身の構造および外観に関して極めて望ましい特性を有し、
且つ向上した柔らかさに反映される長時間にわたる貯蔵寿命をさらに有する、す
なわち、本発明の酵素を使用せずに作られた焼成製品に比べて、焼成製品の鮮度
が落ちるのが遅い、焼成製品を作製する方法を達成することによって達成される
。現在、パン塊、ロールパンまたはトースト用パン等の、酵母を加えたパン製品
の製造に本方法を使用することが好ましいが、他のタイプの生地および生地を基
にした製品、たとえば、ヌードルおよびパスタ製品およびケーキ（本発明の酵素
を加えることにより、その品質を改良できる）に本方法を使用することも考えら
れる。

【００２４】本方法は、生地の状態で、無極性脂質、糖脂質およびリン脂質を加水分解する
ことができる酵素の有効量、または、上記酵素を含む組成物が、生地に、既に混
合された生地に直接加えられるか、または１つ以上の生地成分の成分として加え
られることを必須ステップとして含む。

【００２５】本明細書の関連において、表現「有効量」は、一般に、生地の状態で、生地中
に存在するトリグリセリド、リン脂質および糖脂質の検出可能な加水分解を行う
のに十分な酵素の量を表すのに使用される。これらの加水分解活性を検出するこ
とが可能な分析方法の例を以下の実施例に示す。さらに具体的には、この表現は
、上記脂質基質の検出可能な加水分解をもたらすのみならず、酵素添加の結果と
考えられる、有意に改良された粘性スコアおよび／または伸展性スコア等の生地
の特性の改良をさらにもたらすレベルで、または、生地を焼成する場合、パンの
体積の増加、柔らかさの向上または改良された柔らかい中身の構造等の、焼成製
品の品質の改良をもたらすレベルで酵素による最終生成物の形成をもたらす量に
関する。

【００２６】本発明の酵素は、若干のトリグリセリド加水分解作用を有してもよい。この酵
素は、トリグリセリド加水分解活性のほかにも、リン脂質および糖脂質に対して
加水分解活性を有してもよい。

【００２７】あるいは、本発明の酵素は、リン脂質および糖脂質に対して顕著な加水分解活
性を有するが、トリグリセリド加水分解作用は顕著ではなくてもよい。

【００２８】本発明の酵素は、アシルグリセロール（グリセリド）（すなわち、一般に、リ
パーゼ（ＥＣ３．１．１．３）と呼ばれる酵素の部類と関連した、エステラーゼ
活性を有する）、リン脂質および糖脂質、たとえば、ガラクト脂質を同時に加水
分解することができる多機能酵素と記述することができる。従って、本酵素は、
一般に、ホスホリパーゼと呼ばれる様々な酵素と関連した加水分解活性を有する
。リン脂質は、２グループの酵素（その１つはリパーゼ群に含まれ、ホスホリパ
ーゼＡ₁およびホスホリパーゼＡ₂、およびホスホジエステラーゼ（ホスホリパー
ゼＣおよびＤ）などがある）によって２つの異なる方法で切断される。本発明の
酵素は、これらのホスホリパーゼ活性のいずれを有してもよい。

【００２９】本発明による酵素の加水分解特性を有する酵素は、脂質基質における脂肪酸部
分に対して異なるアフィニティを有してもよいこと（本発明の酵素は、Ｃ₄〜Ｃ₁ ₀ 脂肪酸等の短鎖脂肪酸を含む脂質を優先的に加水分解してもよく、あるいは、
Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸等の脂質長鎖脂肪酸基を有する脂質を優先的に加水分解しても
よいということを意味する）が確認されている。長鎖脂肪酸基を優先する酵素は
、そのままでは、遊離酪酸が望ましくない味および香味を生じさせる可能性があ
るという周知の問題である、たとえば、バターの脂肪または酪酸基を含む他の脂
質を含む生地で特に有用な可能性がある。

【００３０】非常に好ましい態様において、本発明の酵素は、Ｃ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸等の短鎖脂
肪酸と比較して、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸等の長鎖脂肪酸を含む脂質を優先的に加水分
解する。換言すれば、酵素は、短鎖脂肪酸に対しては比較的低い活性を有するが
、長鎖脂肪酸を有するグリセリドに対しては特に活性であることが好ましい。

【００３１】できれば、本発明の酵素は、短鎖脂肪酸に対して活性でないことが好ましい。

【００３２】短鎖脂肪酸に対して比較的低い活性を有する酵素を使用することにより、望ま
しくない香味の発生を回避もしくは抑制することが可能であり、その望ましくな
い香味は、短鎖脂肪酸の放出によって発生する可能性がある。

【００３３】この選択的基質の特徴は、レシピおよびその脂質含量に応じて、所与の生地で
特に活性な酵素を選択できることを意味する。

【００３４】本明細書に明示されている特性を有する酵素は、植物、動物および微生物、た
とえば、細菌種および酵母種を含む真菌種を含む、様々なソースに由来してもよ
い。本発明の酵素は、酵素を自然に産生する生物に由来してもよく、酵素をコー
ドする遺伝子を用いて適当な宿主細胞を形質転換することにより、組換え的に産
生することも可能である。酵素は、その酵素活性の全てに関する活性部位を本来
含む酵素であってもよいが、合成で、または組換えＤＮＡテクノロジーを使用し
て、本明細書に明示されている酵素活性を有するハイブリッド酵素を構築するこ
とも可能である。

【００３５】あるいは、本明細書に明示されている特性を有し、且つ望ましい基質特異性を
有する酵素を提供するために、たとえば、アミノ酸配列を変えることによって、
少なくとも最初は、本明細書に明示されている特定の特性を持たない酵素を修飾
することができる。酵素の改良された性能を得るために、ランダム突然変異誘発
によって酵素を修飾すること（米国特許第第４，８１４，３３１号、ＷＯ９３／
０１２８５号およびＷＯ９５／２２６１５号）、および部位特異的突然変異誘発
により脂肪分解酵素を修飾すること（ＷＯ９７／０４０７９号）は、当技術分野
で周知である。この一般に使用される概念は、当該脂肪分解酵素のアミノ酸鎖の
構造部分内にアミノ酸を、挿入、削除または置換することである。修飾に適した
酵素は、エステル結合を加水分解することができるものである。このような酵素
としては、たとえば、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）
、リポタンパク質リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３４）、モノグリセリドリパーゼ
（ＥＣ３．１．１．２３）、リゾホスホリパーゼ、フェルラ酸エステラーゼおよ
びエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１，ＥＣ３．１．１．２）等の、リパーゼな
どが含まれる。

【００３６】修飾に適した酵素は、植物、動物および微生物、たとえば、細菌種および酵母
種を含む真菌種を含む、様々なソースに由来してもよい。修飾に適した酵素の例
は、たとえばＰ．ｃｅｐａｃｉａ（米国特許第５，２９０，６９４号）、Ｐ．ｇ
ｌｕｍａｅ（ＦｒｅｎｋｅｎＮｅｔａｌ（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉ
ｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８３７８７−３７９１）、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ（欧州特許ＥＰ０３３４４６２号）またはＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｓｐ．菌株ＳＤ７０５（ＷＯ９５／０６７２０号、欧州特許Ｅ
Ｐ０７２１９８１号、ＷＯ９６／２７００２号、欧州特許ＥＰ０８
１２９１０号）に由来する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓリパーゼである。あるい
は、修飾に適した酵素は、たとえば、ＨｕｍｉｃｏｌａファミリーおよびＺｙｇ
ｏｍｙｃｅｔｅｓファミリーの脂肪分解酵素および真菌クチナーゼ等の、真菌脂
肪分解酵素であってもよい。Ｈｕｍｉｃｏｌａファミリーの脂肪分解酵素は、Ｈ
．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ菌株ＤＳＭ４１０９由来のリパーゼおよびこのリパー
ゼと５０％を超える相同性を有するリパーゼからなる。Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓ
ａ（異名Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼは
、欧州特許ＥＰ０２５８０６８号および欧州特許ＥＰ０３０５２１
６号に記載されており、米国特許第５，８６９，４３８号の配列番号２の位置１
〜２６９に示されているアミノ酸配列を有する。

【００３７】本発明で使用するのに現在好ましい酵素は、リパーゼＳＰ９７２およびリパ
ーゼＳＰ９７９であり、その作用を、以下の実施例で詳細に説明する。

【００３８】ほとんどの穀粉は、本発明の酵素の基質の役割を果たすことができる、トリグ
リセリドを含む無極性脂質、およびリン脂質および糖脂質を含む極性脂質を含む
。従って、本方法の１つの実施形態では、無極性脂質、ジガラクトシルジグリセ
リド（ＤＧＤＧ）を含むガラクト脂質等の糖脂質、およびホスファチジルコリン
（ＰＣ）等のリン脂質の少なくとも１つが、生地に使用される穀粉中に存在する
天然（または内因性）脂質成分である。

【００３９】しかし、穀粉生地は、本発明の酵素の脂質基質の全てを、十分量含まない可能
性がある。従って、酵素に十分な基質を提供するために、無極性脂質、糖脂質お
よびリン脂質の少なくとも１つを生地に加えることは、本発明の範囲内である。
表現「十分な基質」は、３つの主要なタイプの脂質基質はどれも、上述の、生地
改良作用または焼成製品の改良作用を得ることに関して、限定要因ではないとい
う意味を含むということが理解されるであろう。

【００４０】本発明の酵素用の補足的脂質基質は、アシルグリセロール等の無極性脂質であ
ってもよい。本発明によれば、たとえば、植物油、植物性脂肪、動物油、たとえ
ば、バターの脂肪、およびショートニング等の動物性脂肪等の、様々なこのよう
な脂質を使用することができる。この点に関して、特に有用な脂質は、穀類由来
の油または脂肪、たとえば、オートムギ油である。オートムギ油は、一般に、ト
リグリセリド類に加えて、５〜２５％のリン脂質および５〜１２％の糖脂質を含
む。オートムギ油を分留して、高含有率の極性脂質を有する分画を得ることがで
きる。

【００４１】従って、１つ以上のリン脂質を生地に加えてもよいことは、本発明の方法の１
つの態様である。この点に関して、有用なリン脂質としては、ホスファチジルイ
ノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコ
リン（ＰＣ）、レシチンおよびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）等があ
る。

【００４２】本発明によれば、酵素は、１０〜１００，０００ＬＵＴ／ｋｇ粉の範囲または
１０〜１００，０００ＰＬＵ／ｋｇ粉の範囲の量で加えられ、単位の指示は、１
００〜１０，０００ＬＵＴ／ｋｇ粉または１００〜１０，０００ＰＬＵ／ｋｇ粉
の範囲を含む、５０〜５０，０００ＬＵＴまたはＰＬＵ／ｋｇ粉の範囲等の、以
下の実施例に明示されているものである。

【００４３】本発明は、さらに、上述の改良された品質特性を有する、焼成製品を得る方法
を、有利に提供することが可能である。従って、１つの実施形態において、本発
明の方法で作製される生地はパン生地であり、方法は、焼成製品を得るために、
生地を焼成することを、さらなるステップとして含む。焼成したパン製品の１つ
の特に望ましい特性は、実施例に明示されている、高い比体積である。従って、
本発明の酵素を加えた結果、焼成製品の比体積が、酵素を加えないこと以外は同
一条件で作られた焼成製品に比べて、少なくとも１０％増加することが好ましい
。さらに好ましくは、比体積の増加は、少なくとも２０％、たとえば、少なくと
も３０％、たとえば、少なくとも４０％である。

【００４４】本発明は、さらに、パスタ生地、ヌードル生地およびケーキ生地またはバッタ
ー（ｂａｔｔｅｒｓ）、およびこのような生地またはバッターから作られる完成
製品を提供することが可能である。

【００４５】リパーゼ以外の酵素が、生地特性および焼成製品の品質を改良する一因となり
得ることは、当技術分野で周知である。本発明の酵素に加えて、少なくとも１つ
のさらなる酵素を生地に加えることは、本発明の範囲内である。このようなさら
なる酵素としては、エンドアミラーゼまたはエキソアミラーゼ等のでんぷん分解
酵素、プルラナーゼ、脱分枝酵素、キシラナーゼを含むヘミセルラーゼ、セルラ
ーゼおよび酸化還元酵素、たとえば、グルコースオキシダーゼ、リパーゼ、ホス
ホリパーゼおよびヘキソースオキシダーゼなどが含まれる。

【００４６】本発明の酵素は、たとえば、有効な界面活性剤であるジガラクトモノグリセリ
ド（ＤＧＭＧ）に転換されるジガラクトジグリセリド（ＤＧＤＧ）を含む、ガラ
クト脂質等のある種の糖脂質に対して特に活性であってもよいことが確認されて
いる。従って、有用な実施形態において、本発明の酵素は、生地中に最初に存在
するＤＧＤＧの少なくとも２５％を加水分解することができる酵素であり、ＤＧ
ＤＧの少なくとも５０％、たとえば、この少なくとも６０％または少なくとも７
５％が加水分解されることが好ましい。

【００４７】本酵素に有用な別の脂質基質は、リン脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）で
ある。従って、有用な実施形態において、酵素は、生地中に最初に存在するＰＣ
の少なくとも２５％、好ましくは、少なくとも６０％、たとえば、少なくとも７
５％を含む、少なくとも５０％を分解することができる。

【００４８】酵素が、他のタイプに対するよりも、上述の脂質基質タイプのある種に対して
、加水分解的に活性であってもよいことは、本発明の酵素の１つの有利な態様で
ある。従って、酵素は、無極性トリグリセリドに対するよりも、極性脂質に対し
て、相対的により活性であってもよい。このことは、いずれかの加水分解される
脂質基質タイプの量を分析し、次いで、脂質基質のいずれかの組（たとえば、ト
リグリセリド対糖脂質またはトリグリセリド対リン脂質）の、加水分解の関係を
示す曲線を構築することによって、示すことができる。

【００４９】ある特定の実施形態において、酵素がトリグリセリド類を加水分解できる能力
と、糖脂質を加水分解できる能力との関係を、少なくとも１．５または少なくと
も２．０等の、少なくとも１．０である勾配を有する曲線として描写できること
で、または、酵素が、トリグリセリドを加水分解できる能力と、リン脂質を加水
分解するできる能力との関係を、少なくとも０．５または少なくとも１．０を含
む、少なくとも０．２等の、少なくとも０．１である勾配を有する曲線として描
写できることで、本発明の酵素は特性決定される。

【００５０】さらなる態様において、本発明は、生地の状態で、無極性脂質、糖脂質および
リン脂質を加水分解することができる酵素、および任意に少なくとも１つのさら
なる生地成分を含む、生地改良用組成物を提供する。このようなさらなる生地成
分は、たとえば、本発明の酵素の基質プロフィールを持たないリパーゼまたはホ
スホリパーゼを含む、上述のさらなる酵素であってもよい。組成物中に組込むこ
とができる他の適する生地成分としては、小麦粉、米粉およびトウモロコシ粉等
の穀粉、酵母、化学膨張剤、酸化還元酵素およびアスコルビン酸塩等の生地強化
剤、乳化剤、砂糖、上述のタイプのアシルグリセロール類、大豆レシチンおよび
卵レシチン等のリン脂質、糖脂質および塩類などがある。

【００５１】本発明のさらなる態様において、上述の組成物、および本発明の方法従って得
られる生地に酵素が加えられる、上述の生地を作製する方法が提供される。この
ような生地は、生地を新鮮に保つように管理されたガスで任意に包装された生生
地であってもよく、凍結生地であってもよい。

【００５２】当業者は、本明細書に明示されている特定の特性を有する幾つかの酵素を容易
に同定することができるが、本発明は、さらに、無極性脂質、糖脂質およびリン
脂質を加水分解することができる酵素を同定する方法、または無極性脂質、糖脂
質およびリン脂質を加水分解することができる酵素になるのに好適な酵素を同定
する方法を提供する。本発明による酵素にするのに好適な１つのこのような酵素
は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ由来のリパーゼであり、このリパーゼ
は、ＷＯ９８／４５４５３（参照により本明細書に組み込む）に開示されている
。

【００５３】本発明は、さらに、無極性脂質、糖脂質およびリン脂質を加水分解することが
できる酵素を開発する方法を提供する。

【００５４】＜酵素をコードするヌクレオチド配列をクローニングする＞本明細書に明示されている特定の特性を有する酵素か、修飾に適した酵素のい
ずれかをコードするヌクレオチド配列を、上記酵素を産生する細胞または生物か
ら単離することが可能である。様々な方法が、ヌクレオチド配列を単離する技術
分野内で周知である。

【００５５】たとえば、酵素を産生する生物由来の染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮ
Ａを使用して、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーを構築するこ
とが可能である。酵素のアミノ酸配列が判明している場合、標識したオリゴヌク
レオチドプローブを合成して、生物から作製されたゲノムライブラリーから酵素
をコードしているクローンを同定することが可能である。あるいは、別の既知の
酵素の遺伝子に相同な配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを使用すれば
、酵素をコードするクローンを同定することが可能であろう。後者の場合、低ス
トリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を使用する。

【００５６】あるいは、プラスミド等の発現ベクターにゲノムＤＮＡのフラグメントを挿入
し、結果として得られるゲノムＤＮＡライブラリーを用いて酵素陰性細菌を形質
転換し、次いで酵素（すなわち、マルトース）の基質を含む寒天上に形質転換細
菌をプレーティングし、それによって、同定すべき酵素をクローンに発現させる
ことによって、酵素をコードするクローンを同定することが可能である。

【００５７】さらなる代替法では、確立された標準方法、たとえば、ＢｅｕｃａｇｅＳ．
Ｌ．ｅｔａｌ（１９８１）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２２，
ｐ１８５９−１８６９に記載のホスホロアミダイト法、Ｍａｔｔｈｅｓｅｔ
ａｌ（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３，ｐ８０１−８０５に記載の方法で、
酵素をコードするヌクレオチド配列を合成的に作製することができる。ホスホロ
アミダイト法では、たとえば、自動ＤＮＡシンセサイザーでオリゴヌクレオチド
を合成し、精製し、アニーリングし、ライゲートして、適当なベクターでクロー
ニングする。

【００５８】ヌクレオチド配列は、標準技法に従って、合成起源、ゲノム起源またはｃＤＮ
Ａ起源（必要に応じて）のフラグメントをライゲートすることによって作製した
、ゲノム起源と合成起源との混合、合成起源とｃＤＮＡ起源との混合、またはゲ
ノム起源とｃＤＮＡ起源との混合であってもよい。ライゲートされた各フラグメ
ントは、全ヌクレオチド配列の様々な部分に対応する。米国特許第４，６８３，
２０２号またはＳａｉｋｉＲＫｅｔａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）
２３９，ｐｐ４８７−４９１）に記載の、特定のプライマーを使用したポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、ＤＮＡ配列を作製することも可能である。

【００５９】＜ヌクレオチド配列＞本発明は、本明細書に明示されている特定の特性を有する酵素をコードするヌ
クレオチド配列も含む。本明細書で使用される用語「ヌクレオチド配列」は、オ
リゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、およびその変異形、相同体
、フラグメントおよび誘導体（たとえば、その一部）を指す。このヌクレオチド
配列は、ゲノム起源であってもよく、あるいは合成起源または組換え起源であっ
てもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を提示する二本鎖または１本鎖であっ
てもよい。

【００６０】本発明に関して、用語「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合
成ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。ヌクレオチド配列は、好ましくはＤＮＡ、さら
に好ましくは、本発明のコード配列に関するｃＤＮＡを意味することが好ましい
。

【００６１】好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチド配列それ自体は、それが自
然に関連した、同様に自然な環境にある、配列に連結しているとき、自然環境に
ある、本発明の生来のヌクレオチド配列をカバーしない。参照を容易にするため
に、我々は、この好ましい実施形態を「非生来ヌクレオチド配列」と呼ぶことに
する。この点に関して、用語「生来のヌクレオチド配列」は、その生来の環境に
あり、且つヌクレオチド配列が自然に関連しているプロモーター全体に作動可能
に連結されているヌクレオチド配列全体であり、そのプロモーターがやはりその
生来の環境にあるものを意味する。従って、本発明の酵素は、その生来の生物の
ヌクレオチド配列によって発現させることができるが、そのヌクレオチド配列は
、その生物内で、そのヌクレオチド配列と自然に関連しているプロモーターの調
節下にない。

【００６２】本発明の酵素は、他の酵素と共に使用してもよい。従って、本発明は、酵素の
組合せであって、本発明の酵素と、本発明による別の酵素であってもよい、別の
酵素とを含む組合せもカバーする。

【００６３】酵素は、自然の酵素ではないことが好ましい。この点に関して、用語「自然の
酵素」は、その自然環境にある酵素全体であり且つ酵素がその自然のヌクレオチ
ド配列によって発現されているとき、を意味する。

【００６４】一般に、本発明のヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技法（すなわち、組換え
ＤＮＡである）を使用して作製される。しかし、本発明の代替実施形態では、当
技術分野で周知の化学的方法を使用して、ヌクレオチド配列を、全部または一部
、合成することが可能である（ＣａｒｕｔｈｅｒｓＭＨｅｔａｌ（１９８
０）ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓＳｙｍｐＳｅｒ２１５−２３およびＨｏ
ｒｎＴｅｔａｌ（１９８０）ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓＳｙｍｐＳ
ｅｒ２２５−２３２参照）。

【００６５】＜アミノ酸配列＞本発明は、本明細書に明示されている特定の特性を有する酵素のアミノ酸配列
も含む。

【００６６】本明細書で使用される用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および
／または用語「タンパク質」と同義である。場合によっては、用語「アミノ酸配
列」は、用語「ペプチド」と同義である。場合によっては、用語「アミノ酸配列
」は、用語「酵素」と同義である。

【００６７】アミノ酸配列は、適当なソースから作製／単離してもよく、あるいは、合成的
に製造してもよく、または組換えＤＮＡ技法を使用して作製してもよい。

【００６８】＜変異形／相同体／誘導体＞本発明は、本発明の酵素のアミノ酸配列、またはこのような酵素をコードする
ヌクレオチド配列の変異形、相同体および誘導体の使用も含む。ここで、用語「
相同体」は、主題のアミノ酸配列および主題のヌクレオチド配列とある一定の相
同性を有する全体を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と同等と
みなすことができる。

【００６９】この関係において、相同な配列は、主題の配列と、少なくとも７５、８５また
は９０％同一であり得るアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９５または９８
％同一であり得るアミノ酸配列を含むと考えられる。一般に、相同体は、主題の
アミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性は、類似性（すなわち、類似した
化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）という観点で考えることもできるが、
本発明の関係では、相同性は、配列同一性の観点で相同性を表すことが好ましい
。

【００７０】この関係において、相同な配列は、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配
列（主題の配列）と、少なくとも７５、８５または９０％同一であり得るアミノ
酸配列、好ましくは、少なくとも９５または９８％同一であり得るヌクレオチド
配列を含むと考えられる。一般に、相同体は、主題のアミノ酸配列と同じ活性部
位等をコードする配列を含む。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的特
性／機能を有するアミノ酸残基）という観点で考えることもできるが、本発明の
関係では、相同性は、配列同一性の観点で相同性を表すことが好ましい。

【００７１】相同比較は、目で、または通常は、容易に入手できる配列比較プログラムを用
いて、実施することができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２
つ以上の配列間の％相同性を算出することができる。

【００７２】％相同性は、近接した配列に関して算出することが可能である、すなわち、１
つの配列を他の配列と一線上にそろえ、１つの配列における各アミノ酸を、他の
配列における対応するアミノ酸と（１度に残基１個）直接比較する。これは、「
アンギャップト（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。一般に、こ
のようなアンギャップトアラインメントは、比較的少数の残基に関してのみ実施
される。

【００７３】これは、非常に単純且つ堅実な方法であるが、たとえば、その他の点では全く
同じ配列対において、１つの挿入または欠失によって、以下のアミノ酸残基がア
ラインメントから締め出される、従って、広範囲のアラインメントを実施すると
き、潜在的に、％相同性が大きく低減する結果となることを考慮に入れていない
。従って、ほとんどの配列比較方法は、総体的な相同性スコアに、不当にペナル
ティを課さずに、可能な挿入および欠失を考慮に入れる最適アラインメントをも
たらすようにデザインされている。これは、局所的相同性が最大限になるように
、「ギャップ」を配列アラインメントに挿入することによって実現する。

【００７４】しかし、こうした、より複雑な方法は、同数の同一アミノ酸の場合、可能な限
り少数のギャップを有する配列アラインメント（比較される２配列間のより高い
関連性を示す）が、多くのギャップを有する配列アラインメントより高いスコア
を達成するように、アラインメントに存在する各ギャップに「ギャップペナルテ
ィ」を割り当てる。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ
における各後続の残基に小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が
一般に使用される。これは、もっともよく使用されるギャップスコアリングシス
テムである。高いギャップペナルティは、もちろん、少ないギャップを有する最
適化されたアラインメントをもたらす。ほとんどのアラインメントプログラムは
、ギャップペナルティを改変することができる。しかし、このような配列比較用
ソフトウェアを使用するとき、デフォルト値を使用することが好ましい。たとえ
ば、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｅｓｔｆｉｔパッケージを使用するとき、
ギャップに関するアミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは−１２であり
、各延伸のデフォルトギャップペナルティは−４である。

【００７５】従って、最大％相同性の算出には、先ず、ギャップペナルティを考慮に入れて
、最適アラインメントを作ることが必要である。このようなアラインメントを実
施するのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ１９８４
Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２ｐ３８７）。配列比較を実施す
ることができる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓ
ｕｂｅｌｅｔａｌ１９９９ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４^th Ｅｄ？Ｃｈａｐｔｅｒ１８のＳｈｏｒｔプロトコールを参照）、ＦＡＳ
ＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ１９９０Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−
４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式などが挙げられるが、その限
りではない。ＢＬＡＳＴもＦＡＳＴＡも共に、オフライン検索およびオンライン
に使用できる（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ１９９９，７−５８〜７−６０ペ
ージ参照）。しかし、一部の用途では、ＧＣＧＢｅｓｔｆｉｔプログラムを使
用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツ
ールも、タンパク質およびヌクレオチド配列の比較に使用できる（ＦＥＭＳＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ１９９９１７４（２）：２４７−５０；ＦＥ
ＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ１９９９１７７（１）：１８７−８お
よびｔａｔｉａｎａ@ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。

【００７６】同一性の観点で、最終％相同性を測定することができるが、アラインメント法
そのものは、一般に、全か無かの対比較に基づくものではない。そうではなく、
化学的類似性または進化的距離に基づいて、スコアを各二つ一組の比較に割り当
てる、基準化された類似性スコアマトリックスが一般に使用される。よく使用さ
れるこのようなマトリックスの１例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡ
ＳＴプログラム一式用デフォルトマトリックス）である。ＧＣＧＷｉｓｃｏｎ
ｓｉｎプログラムは、一般に、公的デフォルト値か、または提供されるのであれ
ば、注文符号比較表（さらなる詳細については、ユーザーマニュアル参照）のい
ずれかを使用する。一部の用途では、ＧＣＧパッケージ用公的デフォルト値を
使用することが好ましく、あるいは、他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵ
Ｍ６２等のデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。

【００７７】ソフトウェアが最適アラインメントを作成したら、その後は、％相同性を、好
ましくは、％配列同一性を、算出することができる。ソフトウェアは一般に、配
列比較の一部としてこれを行い、数値成績を作成する。

【００７８】配列は、同義的変化をもたらし、結果として機能的に等価の物質を生じる、ア
ミノ酸残基の欠失、挿入または置換も有してもよい。その物質の二次的結合活性
が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／また
は両親媒性の類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を行うことが可能である
。たとえば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン
酸などがあり、正に帯電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンなどが
あり、類似した親水性値を有する非帯電極性頭基を含むアミノ酸としては、ロイ
シン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン
、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンなどがある。

【００７９】たとえば、下表に従って、保存的置換を行うことが可能である。第２欄の同じ
ブロック内、好ましくは、第３欄の同じ行内のアミノ酸は、互いに置き換えるこ
とが可能である。

【００８０】

【表１】

【００８１】本発明は、起こってもよい相同な置換（本明細書では、置換（ｓｕｂｓｔｉｔ
ｕｔｉｏｎ）も、交換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）も、存在するアミノ酸残基の
代替残基との交換を意味するのに使用される）、すなわち、塩基同士、酸同士、
極性同士等の同種置換も含む。非相同置換、すなわち、１種の残基から、（オル
ニチン（以後、Ｚと表す）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後、Ｂと表す）、ノル
ロイシンオルニチン（以後、Ｏと表す）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン
、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシン等）他の慙愧、あるいは代わりに非
天然アミノ酸を含むものに関するものへの置換も起こってもよい。

【００８２】以下のものを含む、非天然アミノ酸によって交換を行うことも可能である；α
*およびα−二置換*アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸*、乳酸*、天然アミノ酸の
ハライド誘導体、たとえば、トリフルオロチロシン*、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラ
ニン*、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン*、Ｌ−アリ
ル−グリシン*、β−アラニン*、Ｌ−α−アミノ酪酸*、Ｌ−γ−アミノ酪酸*、
Ｌ−α−アミノイソ酪酸*、Ｌ−ε−アミノカプロン酸^#、７−アミノヘプタン酸
*、Ｌ−メチオニンスルホン(^*、Ｌ−ノルロイシン*、Ｌ−ノルバリン*、ｐ−ニ
トロ−Ｌ−フェニルアラニン*、Ｌ−ヒドロキシプロリン^#、Ｌ−チオプロリン*
、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、たとえば、４−メチル−Ｐｈｅ
*、ペンタメチル−Ｐｈｅ*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）^#、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル
）*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）*、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラ
ヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸(およ
びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）*。上記説明（相同置換非相同置換に関する）で
、表示*は、誘導体の疎水性を示すために使用し、#は、誘導体の親水性を示すた
めに使用し、#*は、両親媒性を示す。

【００８３】変異形アミノ酸配列は、グリシン残基またはβ−アラニン残基等のアミノ酸ス
ペーサーに加えて、メチル基、エチル基またはプロピル基等のアルキル基を含む
配列の、いずれか２つのアミノ酸残基の間に挿入することが可能な適当なスペー
サー基を含んでもよい。さらなる変異形は、ペプトイド形のアミノ酸残基の１つ
以上の存在を含み、当業者により十分に理解されるであろう。不確かさを避ける
ために、（α−炭素置換基が、α−炭素ではなく、残基の窒素原子上にある、変
異形アミノ酸残基を表すために）「ペプトイド形」を使用する。ペプトイド形の
ペプチドを作成する方法は、当技術分野で周知である。（たとえば、Ｓｉｍｏｎ
ＲＪｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７
１およびＨｏｒｗｅｌｌＤＣ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９
９５）１３（４），１３２−１３４）

【００８４】本発明で使用するのに適したヌクレオチド配列は、その中に、合成ヌクレオチ
ドまたは修飾ヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドへの、多数の異
なるタイプの修飾は、当技術分野で周知である。これらの修飾には、メチルホス
ホネートおよびホスホロチオエート主鎖および／または分子の３′および／また
は５′末端におけるアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明
のために、本明細書に記載のヌクレオチド配列を、当技術分野で利用できる任意
の方法で修飾してもよいことを理解すべきである。本発明のヌクレオチド配列の
ｉｎｖｉｖｏ活性または寿命を増大するために、このような修飾を行うことが
可能である。

【００８５】本発明は、本明細書に記載の配列、またはその誘導体、フラグメントまたは誘
導体に相補的なヌクレオチド配列の使用も含む。配列が、そのフラグメントに相
補的な場合、その配列をプローブとして使用して、他の生物等における類似した
コード配列を同定することができる。

【００８６】本発明の配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲内に入るポリヌクレオ
チドを、多数の方法で得ることができる。本明細書に記載の配列の他の変異形は
、たとえば、ある範囲の個体、たとえば異なる集団からの個体から作成されたＤ
ＮＡライブラリーを精査することによって、得ることが可能である。さらに、他
のウイルス／細菌相同体、または細胞相同体、特に哺乳類細胞（たとえば、ラッ
ト、マウス、ウシおよび霊長類細胞）にある細胞相同体を得ることができ、この
ような相同体およびそのフラグメントは、一般に、本明細書の配列リストに示す
配列に、選択的にハイブリダイズすることができる。このような配列は、他の動
物種から作成したｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを精査
し、このようなライブラリーを、添付の配列リスト内の配列のいずれか１つの全
部または一部を含むプローブを用いて、中ストリンジェンシーないし高ストリン
ジェンシー条件で、精査することによって、得ることが可能である。本発明のポ
リペプチドまたはヌクレオチド配列の種相同体および対立遺伝子変異形を獲得す
るのに、同様の考えが当てはまる。

【００８７】変異形および菌株／種相同体は、本発明の配列内に保存されるアミノ酸配列を
コードする変異形および相同体内の配列を標的とするようにデザインされたプラ
イマーを使用する変性ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅＰＣＲ）を使用して得る
ことも可能である。保存される配列は、たとえば、幾つかの変異形／相同体から
のアミノ酸配列を整列させることによって予測することができる。当技術分野で
周知のコンピューターソフトウェアを使用して、配列アラインメントを実施する
ことができる。たとえば、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰｉｌｅＵｐプログラ
ムが広く使用されている。

【００８８】変性ＰＣＲで使用されるプライマーは、１つ以上の変性位置を含み、既知の配
列に対して１つの配列プライマーを用いた配列のクローニングで使用されるもの
より低いストリンジェンシー条件で使用される。

【００８９】あるいは、このようなポリヌクレオチドを、特性決定された配列の位置指定突
然変異誘発によって得ることが可能である。これは、たとえば、ポリヌクレオチ
ド配列が発現されようとしている特定の宿主細胞に対するコドン優先傾向を最適
化するためにサイレントコドン配列変化が必要な場合に有用であろう。制限酵素
認識部位を導入するために、または、ポリヌクレオチドによってコードされるポ
リペプチドの特性または機能を変えるために、他の配列変化が望ましいこともあ
る。

【００９０】本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、たとえば、
ＰＣＲプライマー、代替増幅反応用プライマー、たとえば、放射性または非放射
性標識を使用する従来の方法で啓示的標識で標識されたプローブを作製するため
に使用してもよく、あるいは、このポリヌクレオチドを、ベクターにクローニン
グしてもよい。このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少
なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、たとえば
少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドの長さであり、本明細書で使用さ
れる用語、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。

【００９１】ＤＮＡポリヌクレオチドおよび本発明によるプローブ等のポリヌクレオチドは
、組換え的に、合成的に、または、当業者に利用できる任意の方法で、作製する
ことが可能である。これらのポリヌクレオチドを、標準技法でクローニングする
ことも可能である。

【００９２】一般に、プライマーは、所望の核酸配列の段階的製造を含む合成方法によって
、１ヌクレオチドが一つずつ作製される。オートメーション化した技法を使用し
てこれを遂行する技法は、当技術分野で容易に利用できる。

【００９３】長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え方法を使用して、たとえばＰＣＲ（
ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を使用して、作製される。この方法は
、クローニングに望ましい脂質標的配列の領域に隣接する一対のプライマー（た
とえば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作るステップと、このプライマーを、動
物またはヒト細胞から得たｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させるステップと、所
望の領域の増幅を引き起こす条件でポリメラーゼ連鎖反応を実施するステップと
、増幅されたフラグメントを（たとえば、反応混合物をアガロースゲルで精製す
ることによって）単離するステップと、増幅されたＤＮＡを回収するステップと
を含む。増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターにクローニングできる
ように、このプライマーを、適当な制限酵素認識部位を含むようにデザインする
ことが可能である。

【００９４】＜ハイブリダイゼーション＞本発明は、本発明の配列に相補的な配列、あるいは、本発明の配列またはそれ
に相補的な配列のいずれかにハイブリダイズすることができる配列も含む。

【００９５】本明細書で使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が、塩
基対合によって相補鎖と接合する過程」ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）技術で実施される増幅過程を含むものとする。

【００９６】本発明は、本明細書に記載の配列、またはその誘導体、フラグメントまたは誘
導体に相補的な配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用
も含む。

【００９７】用語「変異形」は、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする
ことができる配列に相補的な配列も含む。

【００９８】好ましくは、用語「変異形」は、ストリンジェントな条件で（たとえば、５０
℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍの
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０｝）、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハ
イブリダイズすることができる配列に相補的な配列を含む。

【００９９】さらに好ましくは、用語「変異形」は、高ストリンジェント条件（たとえば、
６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５
Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０｝）で、本明細書に記載のヌクレオチド配
列にハイブリダイズすることができる配列に相補的な配列を含む。

【０１００】本発明は、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に記載のものの相補配列を含
む）にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列にも関する。

【０１０１】本発明は、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に記載のものの相補配列を含
む）に本明細書に記載のものの相補配列を含む）ハイブリダイズすることができ
る配列に相補的なヌクレオチド配列にも関する。

【０１０２】中程度ないし最高のストリンジェンシー条件で、本明細書に記載のヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列も、本発明の範
囲内に含まれる。

【０１０３】好ましい態様において、本発明は、ストリンジェントな条件（たとえば、５０
℃および０．２×ＳＳＣ）で、本発明のヌクレオチド配列、またはその補体にハ
イブリダイズすることができるヌクレオチド配列をカバーする。

【０１０４】さらに好ましい態様において、本発明は、高ストリンジェント条件（たとえば
、６５℃および０．１×ＳＳＣ）で、本発明のヌクレオチド配列、またはその補
体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をカバーする。

【０１０５】＜位置指定変異誘発＞いったん、酵素をコードするヌクレオチド配列が単離されたら、その後は、本
発明の酵素を作製するために、その配列を突然変異させることが望ましいことも
ある。

【０１０６】合成オリゴヌクレオチドを使用して、突然変異を導入することが可能である。
こうしたオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接したヌクレオチド配
列を含む。

【０１０７】適当な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａｅｔａｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
（１９８４）２，ｐ６４６−６４９）に開示されており、ＤＮＡの１本鎖ギャッ
プ（酵素をコードする配列）が、酵素遺伝子を運搬するベクターで作られる。次
いで、所望の突然変異を担持する合成ヌクレオチドを、１本鎖ＤＮＡの相同部分
にアニーリングする。次いで、残りのギャップに、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレ
ノーフラグメント）を充填し、Ｔ４リガーゼを使用して、この構築物をライゲー
トする。

【０１０８】米国特許第４，７６０，０２５号には、カセットの些細な変更を実施すること
による、多数の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入が開示されてい
る。しかし、上述のＭｏｒｉｎａｇａ法で、様々な長さの、多数のオリゴヌクレ
オチドを導入することができるため、さらに大きい様々な突然変異を、いつでも
導入することができる。

【０１０９】ＮｅｌｓｏｎａｎｄＬｏｎｇ（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ（１９８９），１８０，ｐ１４７−１５１）には、酵素をコードする
ヌクレオチド配列に突然変異を導入する別の方法が記載されている。この方法は
、化学的に合成されたＤＮＡ鎖を、ＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして
使用することによって導入される所望の突然変異を含む、ＰＣＲフラグメントの
３段階生成である。制限エンドヌクレアーゼで切断し、発現プラスミドに再挿入
することによって、ＰＣＲ生成フラグメントから、突然変異を担持するＤＮＡフ
ラグメントを単離することが可能である。

【０１１０】さらに、Ｓｉｅｒｋｓｅｔａｌ（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ（１９８９）２
，６２１−６２５およびＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ（１９９０）３，１９３−１９
８）には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓグルコアミラーゼにおける位置指定変異誘発
が記載されている。

【０１１１】＜酵素の発現＞本発明で使用するのに適したヌクレオチド配列を、組換え複製可能ベクターに
組込むことができる。このベクターを使用して、ヌクレオチド配列を、酵素形で
、且つ／または適合する宿主細胞から、複製し、発現させることが可能である。
プロモーター／エンハンサーおよび他の発現制御シグナルを含む調節配列を使用
して、発現を調節することが可能である。原核細胞プロモーターおよび真核細胞
におけるプロモーター機能を使用してもよい。組織特異的または刺激特異的プロ
モーターを使用してもよい。上述の２つ以上の異なるプロモーター由来の配列エ
レメントを含むキメラプロモーターを使用してもよい。

【０１１２】ヌクレオチド配列の発現により、宿主組換え細胞によって産生される酵素は、
使用される配列および／またはベクターに応じて、分泌されてもよく、または細
胞内に含まれてもよい。ある特定の原核細胞膜または真核細胞膜を通って、物質
コード配列の分泌を指令するシグナル配列を含むコード配列をデザインすること
ができる。

【０１１３】＜発現ベクター＞用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロで発現させることができ
る構築物を意味する。

【０１１４】この発現ベクターは、生物のゲノムに組み込まれることが好ましい。用語「組
込まれる」は、ゲノムへの安定な組込みをカバーすることが好ましい。

【０１１５】本発明のベクターは、本発明による構築物を含むことが好ましい。代わりに発
現される、好ましくは本発明のヌクレオチド配列がベクターに存在し、制御配列
が、適当な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を実現することができるよう
に、すなわち、ベクターが発現ベクターであるように、ヌクレオチド配列が、制
御配列に、作動可能に連結されている。

【０１１６】以下に記載の通りに、本発明のベクターを、適当な宿主細胞に形質転換して、
本発明のポリペプチドの発現を実現することが可能である。従って、さらなる態
様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするコード配列のベクタ
ーによる発現を実現する条件で、上述の発現ベクターを用いて形質転換またはト
ランスフェクトされた宿主細胞を培養すること、および発現されたポリペプチド
を回収することを含む、本発明に従って次に使用するためのポリペプチドを作製
する方法を提供する。

【０１１７】ベクターは、たとえば、複製起点、任意に、上記ポリヌクレオチド発現のため
のプロモーター、および任意選択的に、プロモーターのレギュレーターを備えた
プラスミド、ウイルスベクターまたはファージベクターであってもよい。ベクタ
ーの選択は、多くの場合、ベクターが中に導入される宿主細胞によって異なる。

【０１１８】本発明のベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことが可能
である。工業用微生物に最も適した選択システムは、宿主生物における突然変異
を必要としない選択マーカー群によって形成されるものである。適当な選択マー
カーは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄ
ａｌ遺伝子であってもよく、あるいは、アンピシリン、カナマイシン、クロラム
フェニコールまたはテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を与えるものであっ
てもよい。代替選択マーカーは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤおよびｓＣ等の
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ選択マーカーであってもよく、あるいは、ヒグロマイシ
ン耐性を生じさせるマーカーであってもよい。他の真菌の選択マーカーの例は、
ＡＴＰシンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５′−ホスフ
ェート−デカルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、フレオマイシンおよびベノミル耐性
（ｂｅｎＡ）に関する遺伝子である。非真菌選択マーカーの例は、細菌のＧ４１
８耐性遺伝子（これを酵母で使用することも可能であるが、糸状菌で使用するこ
とはできない）、アンピシリン耐性遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネオマイシン耐性
遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードす
るＥ．ｃｏｌｉｕｉｄＡ遺伝子である。さらなる適当な選択マーカーとしては
、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺
伝子などがある。あるいは、共形質転換（ＷＯ９１／１７２４３に記載）によっ
て、選択を遂行することが可能である。

【０１１９】ベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏで、たとえばＲＮＡ産生のために使用すること
が可能であり、あるいは、宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換に使
用することも可能である。

【０１２０】従って、本発明に従って使用するのに適したヌクレオチド配列を、組換えベク
ター（一般に、複製可能ベクター）、たとえば、クローニングベクターまたは発
現ベクターに、組み込むことができる。このベクターを使用して、適合する宿主
細胞で核酸を複製することができる。従って、さらなる実施形態において、本発
明は、本発明のヌクレオチド配列を複製可能ベクターに導入し、このベクターを
適合する宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件で宿主細胞を増殖さ
せることによって、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。この
ベクターを宿主細胞から回収することが可能である。発現ベクターに関して、適
当な宿主細胞を以下に記載する。

【０１２１】本明細書に明示されている特定の特性を有する酵素をコードする本発明のＤＮ
Ａ構築物、および制御配列をライゲートし、それらを、複製に必要な情報を含む
適当なベクターに挿入する手順は、当業者に周知である（たとえば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋｅｔａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２^nd Ｅｄ．（１９８９）参照）。

【０１２２】ベクターは、さらに、ベクターが問題の宿主細胞で複製するのを可能にするヌ
クレオチド配列を含んでもよい。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９
、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１およびｐＩＪ７０
２の複製起点である。

【０１２３】＜制御配列＞一部の用途では、本発明で使用するのに適したヌクレオチド配列は、たとえば
、選択された宿主細胞による、ヌクレオチド配列の発現を実現することができる
制御配列に、作動可能に連結されている。例として、本発明は、このような制御
配列に作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクターをカバー
する、すなわち、ベクターは、発現ベクターである。

【０１２４】用語「作動可能に連結された」は、記載の成分が、記載の成分を所期の方式で
機能させることが可能な関係にある、近位を指す。コード配列に「作動可能に連
結された」制御配列は、調節配列と両立する条件で、コード配列の発現が達成さ
れる方法でライゲートされる。

【０１２５】用語「制御配列」は、プロモーターおよびエンハンサーおよび他の発現制御シ
グナルを含む。

【０１２６】用語「プロモーター」は、当技術分野の正常な意味、、たとえば、ＲＮＡポリ
メラーゼ結合部位の意味で使用される。

【０１２７】選択された発現宿主による関心のあるタンパク質の発現、および必要に応じて
、分泌レベルを増強し、且つ／または本発明の酵素の発現を誘導できる調節を実
現するのに役立つ、異種制御領域、たとえば、プロモーター、分泌リーダーおよ
び転写終結領域を選択することによって、本発明の酵素をコードするヌクレオチ
ド配列の発現増強を実現することも可能である。真核細胞では、ポリアデニル化
配列が、酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に接続されていてもよい
。

【０１２８】本発明のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連
結され得ることが好ましい。

【０１２９】本発明のヌクレオチド配列をコードする遺伝子に由来するプロモーターを除く
、他のプロモーターを使用して、本発明のポリペプチドの発現を指令することが
可能である。所望の発現宿主における、本発明のヌクレオチド配列発現の指令能
率に合うプロモーターを選択することが可能である。

【０１３０】別の実施形態において、本発明の所望のヌクレオチド配列の発現を指令するた
めに、構成的プロモーターを選択することが可能である。このような発現構築物
は、誘導基質を含む培地で発現宿主を培養する必要性をなくすため、さらなる利
点を提供することが可能である。

【０１３１】真菌発現宿主で使用するのに好ましい強力な構成的および／または誘導プロモ
ーターの例は、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンセターゼ
、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログ
ルコシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子由来のＡＧ）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）お
よびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター
に関する真菌遺伝子から得られるものである。真菌宿主における転写に有用なプ
ロモーターのその他の例は、Ａ．ｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）プロモーター
（Ａｌｂｅｒｅｔａｌ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１
、ｐ４１９−４３４）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸
プロテイナーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定な
α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍ
ｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｏｒｙｚａ
ｅトリオースリン酸イソメラーゼまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ
をコードする遺伝子に由来するものである。

【０１３２】強力な酵母プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、
３−ホスホグリセレートキナーゼおよびトリオースリン酸イソメラーゼに関する
遺伝子から得られるものである。

【０１３３】強力な細菌プロモーターの例は、α−アミラーゼプロモーターおよびＳＰ０２
プロモーター、ならびに、細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターである
。特に細菌宿主におけるヌクレオチド配列の転写を指令するのに適したその他の
プロモーターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモータ
ー、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼ遺伝子（
ａｍｙＬ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓマルトゲニック（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ
Ｍ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
α−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｉｓｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターである。

【０１３４】ハイブリッドプロモーターを使用して、発現構築物の誘導可能な制御を改良す
ることが可能である。

【０１３５】プロモーターは、さらに、適当な宿主における発現を保証または増大するため
の特徴を含むことができる。たとえば、この特徴は、ＰｒｉｂｎｏｗＢｏｘま
たはＴＡＴＡｂｏｘ等の、保存された領域であってもよい。プロモーターは、
本発明のヌクレオチド配列の発現レベルに影響する（たとえば、維持する、増強
する、減少させる）他の配列さえ含んでもよい。たとえば、適当な他の配列とし
ては、Ｓｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンなどがある。他の配列として
は、誘導可能な要素−たとえば、温度、化学的、光またはストレス誘導可能な要
素などがある。また、転写または翻訳を増強する適当な要素が存在してもよい。
後者の要素の１例は、ＴＭＶ５′シグナル配列である（Ｓｌｅａｔ１９８７
Ｇｅｎｅ２１７，２１７−２２５およびＤａｗｓｏｎ１９９３Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：９７参照）。

【０１３６】＜構築物＞用語「構築物」−「接合体」、「カセット」および「ハイブリッド」等の用語
と同義である−は、プロモーターに直接または間接に付着した、本発明によるヌ
クレオチド配列を含む。間接的付着の１例は、適当なスペーサー基、たとえば、
Ｓｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロン等のイントロン配列の提供であり、
本発明のプロモーターとヌクレオチド配列とを仲介する。直接または間接的付着
を含む、本発明に関連した用語「融合した」の場合も、同じである。野生型遺伝
子プロモーターと通常に関連し、且つ両者共に自然環境にあるとき、この用語は
、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の自然の組合せをカバーしない場合
もある。

【０１３７】本構築物は、たとえば、細菌で、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌で、またはマーカーが中に移入された植物
で、遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーを含むかまたは発現させることが
可能である。使用することが可能な様々なマーカー、たとえば、マンノース−６
−リン酸イソメラーゼをコードするもの（特に植物用）または抗生物質耐性（た
とえば、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲン
タマイシンに対する耐性）を提供するマーカー等が存在する。

【０１３８】一部の用途では、本発明の構築物は、少なくとも、プロモーターに作動可能に
連結された本発明のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。

【０１３９】＜宿主細胞＞本発明と関連した用語「宿主細胞」は、上述のヌクレオチド配列または発現ベ
クターのいずれかを含み、且つ本明細書に明示されている特定の特性を有する酵
素の組換え産生で使用される細胞を含む。

【０１４０】従って、本発明のさらなる実施形態は、本発明の酵素を発現するヌクレオチド
配列を用いて形質転換したまたはトランスフェクトした宿主細胞を提供する。上
記ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の複製および発現用のベクターで運搬
されることが好ましい。細胞は、上記ベクターと適合するように選択され、たと
えば、原核細胞（たとえば細菌の）、真菌細胞、酵母細胞または植物細胞であっ
てもよい。

【０１４１】グラム陰性菌Ｅ．ｃｏｌｉは、異種遺伝子発現用の宿主として広く使用されて
いる。しかし、細胞内部に多量の異種タンパク質が蓄積する傾向がある。後続す
る、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内タンパク質の大部分から所望のタンパク質を精製するこ
とは、時として困難である。

【０１４２】Ｅ．ｃｏｌｉと対照的に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｕｔ
ｕｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓまたはＳ．ｍｕｒｉｎｕｓ等の、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ属グラム陽性菌は、タンパク質を培地中に分泌することができるため、
異種宿主として非常に適する可能性がある。宿主として適する可能性があるその
他の細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の細
菌である。

【０１４３】本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の性質、および／または発現した
タンパク質のさらなるプロセッシングの望ましさによって、真核宿主、たとえば
、酵母または他の真菌が好ましいこともある。一般に、酵母細胞の方が操作しや
すいため、真菌細胞より酵母細胞が好ましい。しかし、一部のタンパク質は、酵
母細胞からの分泌が不十分であるか、または、場合によっては、プロセッシング
が不適切である（たとえば、酵母におけるグリコシル化過多）かのいずれかであ
る。こうした場合には、異なる真菌宿主生物を選択すべきである。

【０１４４】適当な酵母生物を、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種から、たとえば、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，またはＨａｎｓｅｎｕｌ
ａから、選択することが可能である（英国特許出願Ｎｏ．９９２７８０１．２
に開示）。

【０１４５】適当な糸状菌は、たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種に属する菌株、たと
えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒであってもよく、あるいは、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｉｕ
ｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（完全な状態では、Ｇｒｉｂｂ
ｅｒｅｌｌａｚｅａｅと呼ばれ、以前はＳｐｈａｅｒｉａｚｅａｅと呼ばれ
、ＧｉｂｂｅｒｅｌｌａｒｏｓｅｕｍおよびＧｉｂｂｅｒｅｌｌａｒｏｓｅ
ｕｍｆ．ｓｐ．Ｃｅｒｅａｌｉｓと同義）、またはＦｕｓａｒｉｕｍｓｕｌ
ｐｈｕｒｅｕｍ（完全な状態では、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｐｕｒｉｃａｒｉｓ
と呼ばれ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｒｃｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｕ
ｍ，ＦｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍおよびＦｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ
ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍと同義）、Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉ
ｓ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｋｋｗｅｌｌｎｓｅと同義）、またはＦｕｓａｒ
ｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍの菌株であってもよい。

【０１４６】例として、代表的な発現宿主は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖａｒ．ｔｕｂｉｇｅｎｉｓ、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ａｃｕｌｅａｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅから選択することが可能である。

【０１４７】本発明の組換え発現生成物に最適な生物学的活性を与える必要があれば、適当
な宿主細胞（たとえば、酵母宿主細胞、真菌宿主細胞および植物宿主細胞）を使
用することにより、翻訳後修飾（たとえば、ミリストイル化、グリコシル化、切
断、ラピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）およびチロシン、セリンまたはス
レオニンリン酸化）を行うことができる。

【０１４８】宿主細胞は、プロテアーゼ欠損菌株またはプロテアーゼマイナス菌株であって
もよい。宿主細胞は、たとえば「ａｌｐ」と呼ばれるアルカリプロテアーゼ遺伝
子が欠失した、プロテアーゼ欠損菌株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ
ＪａＬ１２５であってもよい。この菌株は、ＷＯ９７／３５９５６号に記載さ
れている。

【０１４９】＜生物＞本発明に関連した用語「生物」は、本発明による酵素をコードするヌクレオチ
ド配列および／またはそれから得られる産物を含むことが可能であり、且つ／ま
たは生物に存在するとき、プロモーターが、本発明によるヌクレオチド配列を発
現させることができるあらゆる生物を含む。

【０１５０】適当な生物は、原核生物、真菌、酵母または植物を含んでもよい。

【０１５１】本発明に関連した用語「トランスジェニック生物」は、本発明による酵素をコ
ードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られる産物を含むあらゆる
生物を含み、且つ／またはプロモーターが、本発明によるヌクレオチド配列を微
生物内で発現させることができるあらゆる生物を含む。このヌクレオチド配列は
、生物のゲノムに組み込まれることが好ましい。

【０１５２】用語「トランスジェニック生物」は、生来のヌクレオチドコード配列が、自然
環境にある、ヌクレオチドコード配列の生来のプロモーターの調節下にあるとき
、自然環境にある生来のヌクレオチドコード配列をカバーしない。

【０１５３】従って、本発明のトランスジェニック生物は、本発明による酵素をコードする
ヌクレオチド配列、本発明による構築物、本発明によるベクター、本発明による
プラスミド、本発明による細胞、本発明による組織、またはそれらの産物の、い
ずれか１つ、または組合せを含む生物を含む。たとえば、トランスジェニック生
物は、異種プロモーターの調節下にある本発明の酵素をコードするヌクレオチド
配列も含むことができる。

【０１５４】＜宿主細胞／微生物の形質転換＞記述の通り、宿主生物は、原核生物であってもよく、真核生物であってもよい
。適当な原核生物宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓｓ
ｕｂｔｉｌｉｓなどが挙げられる。原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当
技術分野において十分に資料が提供されており、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋｅ
ｔａｌ(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ)およびＡｕｓｕｂｅｌｅ
ｔａｌ.,ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ (１９９５)，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.
を参照されたい。

【０１５５】原核生物宿主を使用する場合、形質転換前に、（たとえば、イントロンを除去
することによって）ヌクレオチド配列を適当に修飾することが必要かもしれない
。

【０１５６】別の実施形態では、トランスジェニック生物は、酵母であってもよい。この点
に関して、酵母も、異種遺伝子発現の媒体として広く使用されてきた。種Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅには、異種遺伝子発現のための使
用を含む、工業用途の長い歴史がある。Ｇｏｏｄｅｙｅｔａｌ(１９８７，
ＹｅａｓｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＲＢｅｒｒｙｅｔａｌ，
ｅｄｓ，ｐｐ４０１-４２９，ＡｌｌｅｎａｎｄＵｎｗｉｎ，Ｌｏｎｄｏ
ｎ)およびＫｉｎｇｅｔａｌ (１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣ
ｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙｏｆＹｅａｓｔｓ，ＥＦＷａｌｔｏｎａｎｄ
ＧＴＹａｒｒｏｎｔｏｎ，ｅｄｓ，ｐｐ１０７-１３３，Ｂｌａｃｋｉ
ｅ，Ｇｌａｓｇｏｗ)によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅにおける異種遺伝子の発現が再検討されている。

【０１５７】幾つかの理由から、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、
異種遺伝子発現に適する。第１に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅは、ヒトに対して非病原性であり、且つ明白なエンドトキシンを産生す
ることができない。第２に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅには、様々な目的のために商業開発された後、何世紀にもわたって安全使用さ
れた長い歴史がある。このため、公的に広く受け入れられるようになった。第３
に、大量の商業的使用および生物に向けられた研究の結果、遺伝学および生理学
ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ独特の大規模醗酵
に関する豊富な知識が得られた。

【０１５８】ＥＨｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅＥＫｅｎｎｙ (１９９３，"Ｙｅａｓｔａ
ｓａｖｅｈｉｃｌｅｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅ
ｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓ"，Ｙｅａｓｔｓ，Ｖｏｌ５，Ａｎｔｈｏ
ｎｙＨＲｏｓｅａｎｄＪＳｔｕａｒｔＨａｒｒｉｓｏｎ，ｅｄｓ，
２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｔｄ.)により、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種遺伝子発現の原
理および遺伝子産物の分泌に関する総説が与えられている。

【０１５９】維持のために宿主ゲノムとの組換えを必要とする組込みベクター、および自主
的に複製するプラスミドベクターを含む、幾つかのタイプの酵母ベクターが利用
できる。

【０１６０】トランスジェニックＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを作製するためには、本発明
のヌクレオチド配列を、酵母における発現向けにデザインされた構築物に挿入す
ることによって、発現構築物を作製する。異種発現に使用される幾つかのタイプ
の構築物が開発されている。この構築物は、本発明のヌクレオチド配列に融合し
た酵母で活性なプロモーターを含み、通常は、酵母起源のプロモーター、たとえ
ば、ＧＡＬ１プロモーターが使用される。通常、酵母起源のシグナル配列、たと
えば、ＳＵＣ２シグナルペプチドをコードする配列が使用される。酵母で活性な
ターミネーターが、発現系を終結させる。

【０１６１】酵母の形質転換用に、幾つかの形質転換プロトコールが開発されている。たと
えば、Ｈｉｎｎｅｎｅｔａｌ（１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ
ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆ
ｔｈｅＵＳＡ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，ＪＤ（１９７８，Ｎａｔｕ
ｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）；およびＩｔｏ，Ｈｅｔａｌ（１９
８３，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１５３，１６３−１６８）の教示に従っ
て、本発明によるトランスジェニックＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを作製するこ
とができる。

【０１６２】様々な選択マーカーを使用して、形質転換酵母細胞を選択する。ＬＥＵ２、Ｈ
ＩＳ４およびＴＲＰ１等の多数の栄養要求マーカー、およびアミノグリコシド抗
生物質マーカー、ｅｇＧ４１８等の、主要な抗生物質耐性マーカーは、形質転
換に使用されるマーカーの中でも最たるものである。

【０１６３】プロトプラスト形成およびプロトプラストの形質転換に続く細胞壁の再生を含
む方法によって、既知の方式で、糸状菌細胞を形質転換することが可能である。
欧州特許ＥＰ０２３８０２３号には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを宿主生物として
使用することが記載されている。

【０１６４】別の宿主生物は植物である。遺伝学的に修飾された植物を構築する際の基本原
理は、挿入された遺伝物質の安定した維持を得られるように、植物ゲノムに遺伝
情報を挿入することである。遺伝情報を挿入するための技法が幾つかあり、２つ
の主な原理は、遺伝情報の直接導入、およびベクター系を使用した遺伝情報の導
入である。Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（ＡｎｎｕＲｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ
ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ [１９９１] ４２：２０５-２２５)およびＣ
ｈｒｉｓｔｏｕ (Ａｇｒｏ-Ｆｏｏｄ-ＩｎｄｕｓｔｒｙＨｉ-ＴｅｃｈＭａ
ｒｃｈ/Ａｐｒｉｌ１９９４１７-２７）には、一般技法の総説がある。欧州
特許ＥＰ−Ａ−０４４９３７５には、植物形質転換に関するさらなる教示がある
。

【０１６５】コードされた酵素の産生を助け、且つ細胞および／または培地からの酵素の回
収を容易にする条件で、ヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を培養するこ
とが可能である。

【０１６６】細胞の培養に使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖させて酵素の発現を得
るのに適した、従来の培地であってもよい。適当な培地は、業者から入手でき、
あるいは、公表された（たとえば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ
ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載の）レシピに従って作製することも
可能である。

【０１６７】組換え細胞によって産生されるタンパク質は、細胞の表面上に表示される可能
性がある。必要に応じて、また、当業者に理解されるだろうが、特定の原核細胞
膜または真核細胞膜を通過するコード配列の分泌を指令するシグナル配列を含む
、コード配列を含む発現ベクターをデザインすることができる。他の組換え構築
物は、コード配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメイ
ンをコードするヌクレオチド配列に接合することが可能である（ＫｒｏｌｌＤ
Ｊｅｔａｌ（１９９３）ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ１２：４４１-５３)
。

【０１６８】酵素は、宿主細胞から分泌され、遠心分離または濾過によって細胞を培地から
分離するステップと、硫酸アンモニウム等の塩に続いてイオン交換クロマトグラ
フィまたはアフィニティクロマトグラフィ等々のクロマトグラフィ的手順を用い
て、培地のタンパク質成分を沈澱させるステップとを含む、周知の手順で培地か
ら便利に回収することが可能である。

【０１６９】＜分泌＞多くの場合、酵素が、発現宿主から、酵素を容易に回収することが可能な培地
内に、分泌されることが望ましい。本発明によれば、所望の発現宿主に基づいて
、分泌リーダー配列を選択することが可能である。本発明の関連で、ハイブリッ
ドシグナル配列を使用することも可能である。

【０１７０】異種分泌リーダー配列の代表例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子
（ｇｌａＡ−たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の、１８アミノ酸バージョ
ンおよび２４アミノ酸バージョン）、ａ−因子遺伝子（酵母、たとえば、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ
）またはα−アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を起源とするものである。

【０１７１】＜融合タンパク質＞たとえば、抽出および精製に役立つように、本発明のアミノ酸配列を融合タン
パク質として産生することが可能である。融合タンパク質パートナーの例として
は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４
（ＤＮＡ結合性活性化ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）および（β
−ガラクトシダーゼなどがある。融合タンパク質配列の除去を可能にするために
、融合タンパク質パートナーと、関心のあるタンパク質配列との間に、タンパク
質分解切断部位を含むことも便利であろう。好ましくは、融合タンパク質は、タ
ンパク質配列の活性を妨害しない。

【０１７２】融合タンパク質は、抗原または本発明の物質に融合した抗原決定基を含んでも
よい。この実施形態において、融合タンパク質は、免疫系の一般化刺激を提供す
る意味で、アジュバントの役割をすることが可能な物質を含む非天然融合タンパ
ク質であってもよい。抗原または抗原決定基は、アミノ末端またはカルボキシ末
端のいずれかに付着していてもよい。

【０１７３】本発明の別の実施形態において、このアミノ酸配列を異種配列にライゲートし
て、融合タンパク質をコードすることが可能である。たとえば、物質活性に影響
することができる作用物質のペプチドライブラリーをスクリーニングするために
は、市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現させるキメラ物質をコ
ードすることが有用であろう。

【０１７４】以下の非限定的実施例および図面で、本発明をさらに説明する。

【０１７５】［実施例］＜材料および方法＞１．使用酵素ＳＰ９７２およびＳＰ９７９と呼ばれる酵素調製品（酵素が、無極性脂質、糖
脂質およびリン脂質を加水分解することができる修飾脂肪分解酵素である）は、
ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ（バグスバード、デンマーク）から入手した。酵素の
呼称は、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋで使用されているものである。

【０１７６】さらに、市販の酵素製剤は、ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｅＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅ
ｒｌａｎｄから入手した（指定されたカタログ番号６２２９９）。この酵素は、
Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａを起源とする。

【０１７７】参考として、以下のリパーゼを使用した：ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１
６（ＤａｎｉｓｃｏＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｂｒａｂｒａｎｄ，デンマーク
）およびＳｔａｌｉｎｇａｓｅ^TM（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ，Ｄｅｌｆｔｓ
，オランダ）。

【０１７８】２．トリブチリンを基質として使用したリパーゼ活性（ＬＵＴおよびＬＩＰＵ）
サンプルを、グリシン緩衝溶液ではなく脱イオン水に溶解し、ｐＨスタットセ
ットポイントが７ではなく５．５であるという改変を加えたこと以外、Ｆｏｏｄ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｄｅｘ，４ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ
ＡｃａｄｅｍｙＰｒｅｓｓ，１９９６，ｐ．８０３に記載の通りに、トリブ
チリンを基質として使用したリパーゼ活性を測定した。

【０１７９】１ＬＵＴは、アッセイ条件で、分当たり２μｍの酪酸を放出することができ
る酵素の量と定義される。１ＬＩＰＵは、アッセイ条件で、分当たり１μｍの
酪酸を放出することができる酵素の量と定義される。

【０１８０】３．ひまわり油を基質として使用するリパーゼアッセイ（ＬＵＳｏｌ，ｐＨ６．
５）試薬：アラビアゴム８．４ｇを鉱質除去水１００ｍｌに溶解し、３０ｍＭのＣａ
Ｃｌ₂ １００ｍｌを加える。エマルジョンを得るために、ＵｌｔｒａＴｕｒ
ｒａｘ^TMミキサーを２０，０００ｒｐｍで使用して混合しながら、ひまわり油３
６ｍｌを徐々に加える。

【０１８１】アッセイ：ビーカー内のひまわり油エマルジョン２０ｍｌを、３０℃で５分間、
平衡化し、ｐＨスタットを使用して、ｐＨを６．３〜６．５に調製する。酵素製
剤２ｍｌを加え、ｐＨを６．５に保ちながら、１０分間、０．０５ＮのＮａＯＨ
を連続的に加える。時間の関数としての、０．０５ＮのＮａＯＨ添加に関する曲
線の勾配を算出する。

【０１８２】１ＬＵＳｏｌは、アッセイ条件で、分当たり１μｍの脂肪酸を放出できる酵
素の量と定義される。

【０１８３】４．ホスホリパーゼアッセイ（ＰＬＵ，ｐＨ８．０）基質：４０〜５０℃に加熱しながら、レシチン粉末（ＭｅｔａｒｉｎＰ，０７
４７９３）８ｇを水１５０ｍｌに溶解する。５０ｍＭのＣａＣｌ₂ ４０ｍｌを
加え、水を加えて２００ｍｌとする。ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘ^TMミキサーを２
０，０００ｒｐｍで使用して、この基質混合物を、１分間、ホモジナイズする。

【０１８４】アッセイ：基質２０．０ｍｌをビーカーに移し、３０℃で５分間、平衡化し、ｐ
Ｈを８．０に調整し、酵素製剤２ｍｌを加え、続いて、ｐＨを８．０に保ちなが
ら、１０分間、０．０５ＮのＮａＯＨを連続的に加える。

【０１８５】時間の関数としての、０．０５ＮのＮａＯＨ添加に関する曲線の勾配を算出す
る。１ＰＵＬは、アッセイ条件で、１分当たり１μｍの脂肪酸を放出できる酵
素の量と定義される。

【０１８６】５．焼成試験（トーストパン）フック付きＨｏｂａｒｔ^TMミキサーを、低速で２分間および高速で１０分間使
用して、デニッシュ改質粉２０００ｇ、ドライイースト３０ｇ、砂糖３０ｇ、塩
３０ｇおよび４００Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ単位（ＢＵ）＋３％の水をこねた。混
合後の生地温度は２５℃であった。休止時間は、３０℃にて１０分であった。生
地を、生地ごとに７５０ｇで量り分け、３３℃および８５％ＲＨで５分間、再度
休止させた。Ｇｌｉｍｉｋ^TM成形装置を使用して、成形を行った。この生地を、
鍋の中で、３３℃にて５０分間寝かせ、Ｗａｃｈｔｅｌ^TMオーブン内で、２２０
℃にて４０分間焼き、１６秒間、蒸気噴射した。冷却後、パンを秤量し、菜種置
換法を使用して、パンの体積を測定した。

【０１８７】柔らかい中身も１〜１０の尺度で主観的に評価した。ここで、１＝きめの粗い
構造であり、１０＝均質な構造である。

【０１８８】鍋で焼成して３塊に蓋をして２０℃で保存し、堅さ測定に使用した。

【０１８９】６．堅さ測定コンピューターに接続したＩｎｓｔｒｏｎ^TM ＵＴＭモデル４３０１を使用し
て、パンの堅さを測定した。測定条件は、以下の通りであった：

【０１９０】

【表２】

【０１９１】力を、Ｎ／ｄｍ²に変換した。結果は、塊ごとに、パン１０切れの平均値とし
て算出した。

【０１９２】７．焼成試験（堅い皮のロールパン）フック付きＨｏｂａｒｔ^TMミキサーを低速で２分間および高速で６分間使用し
て、デニッシュ改質粉１５００、圧縮酵母９０ｇ、砂糖２４ｇ、塩２４ｇおよび
４００Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ単位＋２％の水をこねた。生地温度は２６℃であった
。生地を１３５０ｇで量り分け、３０℃で１０分間休止させ、Ｆｏｒｔｕｎａ^TM 成形装置を使用して成形した。成形した生地を３４℃にて４５分間寝かせ、Ｂａ
ｇｏ^TMオーブン内で、２２０℃にて１８分間焼成し、１２秒間、蒸気にあてた。
冷却後、ロールパンを秤量し、菜種置換法を使用して、ロールパンの体積を測定
した。

【０１９３】以下の通りに、ロールパンの比体積を算出した：比体積＝パンの体積（ｍｌ）／パンの重量（ｇ）

【０１９４】８．ミニ焼成試験５０ｇＢｒａｂｒｅｎｄｅｒ^TMミキシングボウルを３０℃にて５分間使用し
て、デニッシュ改質粉５０ｇ、ドライイースト１０ｇ、砂糖０．８ｇ、塩０．８
ｇ、アスコルビン酸７０ｐｐｍおよび４００Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ単位の水をこ
ねた。休止時間は、３４℃で１０分間であった。この生地を、生地ごとに、１５
ｇにて量り分け、木皿とプレキシガラス枠との間で生地を転がす装置を使用して
成形した。この生地を、鍋の中で、３４℃で４５分間寝かせ、Ｖｏｓｓ^TM家庭用
オーブン内で、２２５℃にて８分間焼成した。焼成後、小塊を環境温まで冷却し
、２０分後、この塊を秤量し、菜種置換法で体積を測定した。この塊を切断して
、柔らかい中身および皮を評価した。

【０１９５】９．脂質抽出および脂肪酸分析十分に寝かせた生地２０ｇを直ちに凍結し、凍結乾燥させた。コーヒー豆ミル
を使用して、凍結乾燥生地を製粉し、８００μｍスクリーンを通過させた。ネジ
蓋付１５ｍｌ遠沈管を使用して、凍結乾燥生地２ｇを秤量した。水飽和ブタノー
ル（ＷＳＢ）１０ｍｌを加えた。この遠沈管を、沸騰している水浴に１０分間入
れた。この遠沈管を、Ｒｏｔａｍｉｘ^TM装置に入れ、環境温で、４５ｒｐｍにて
２０分間回転させ、続いて、沸騰している水浴に１０分間入れ、Ｒｏｔａｍｉｘ ^TM 装置で、環境温にて３０分間回転させた。この遠沈管を３，５００ｇにて５分
間遠心分離し、上澄５ｍｌをバイアルに移した。窒素流れ下で、ＷＳＢを蒸発乾
固させた。

【０１９６】抽出物中の遊離脂肪酸を、７１５ｎｍにて測定されるイソオクタン中のＣｕ塩
として分析し、オレイン酸に基づく較正曲線に従って定量化した（Ｋｗｏｎ，Ｄ
.Ｙ．ａｎｄＪ.Ｓ．Ｒｈｅｅ (１９８６)，ＡＳｉｍｐｌｅａｎｄＲａ
ｐｉｄＣｏｌｏｕｒｉｍｅｔｒｉｃＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｏｎｏｆＦｒｅｅＦａｔｔｙＡｃｉｄｓｆｏｒＬｉｐａｓ
ｅＡｓｓａｙ，ＪＡＯＣＳ６３:８９）。

【０１９７】１０．ＨＰＬＣ分析カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ^TM１００ＤＩＯＬ５μｍ（Ｍｅｒｃｋａ
ｒｔ．１６１５２）２５０ × ４．０内寸、水ジャケット付、５０℃。

【０１９８】移動相：Ａ：ヘプタン／イソプロパノール／ブタノール／テトラヒドロフラン／イソオク
タン／Ｈ₂Ｏ^*、６４．５／１７．５／７／５／５／１Ｂ：イソプロパノール／ブタノール／テトラヒドロフラン／イソオクタン／Ｈ₂
Ｏ^*、７３０／７／５／５／１０^* １ｍｍｏｌトリフルオロ酢酸／移動相ｌ（ｐＨ＝６．６、ＮＨ₃で調整）

【０１９９】ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ^TM ５１０＋勾配コントローラー

【０２００】勾配：

【０２０１】

【表３】

【０２０２】検出器：ＣＵＮＯＷ^TMＤＤＬ２１（蒸発光散乱）（温度：１００℃、電圧：６０
０Ｖ、気流：６．０ｌ／分）

【０２０３】注入器：ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ^TM１０５０、注入体積５０μｌ

【０２０４】サンプル調製：小麦脂質をＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨ（７５：２５）５ｍｌに溶解し
、１０分間超音波処理し、０．４５μｍの孔サイズを有するフィルターを通過さ
せて濾過した。

【０２０５】計算：ＰＣ用較正曲線（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｅｃｉｔｈｉｎａｎ
ｄＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄＳｏｃｉｅｔｙからのレシチン標準）

【０２０６】参考文献：Ａｒｎｏｌｄｓｓｏｎ，Ｋ.Ｃ．ａｎｄＰ．Ｋａｕｆｍａｎｎ (１
９９６)，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ３８:３１７

【０２０７】１１．ガスクロマトグラフィ以下の条件で、ＷＣＯＴヒューズドシリカカラム（内寸１２．５×０．２５ｍ
ｍ）を備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ^TM ８４２０キャピラリーガスクロマ
トグラフおよび０．１μｍ５％フェニルメチルシリコーン（ＣＰＳｉｌ８
ＣＢｆｒｏｍＣｈｒｏｍｐａｃｋ）を使用し、ヘリウムを担体とした：

【０２０８】検出器：ＦＩＤ、３８５℃

【０２０９】オーブンプログラム：

【０２１０】

【表４】

【０２１１】サンプル調製：小麦脂質５０ｍｇを、２ｍｇ／ｍｌヘプタデカンを内部標準とし
て含む、ヘプタン：ピリジン２：１、１２ｍｌに溶解した。５００μｌをクリ
ンプ（ｃｒｉｍｐ）バイアルに移し、ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチル
シリル−トリフルオロアセトアミド）１００μｌを加え、９０℃で１５分間、反
応させた）。

【０２１２】計算：モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドおよび遊離脂肪酸に
関する応答因子を、これらの成分の参照混合物から決定した。Ｂａｓｅｄｏｎこ
れらの応答因子に基づいて、小麦脂質中の、モノグリセリド、ジグリセリドおよ
びトリグリセリドおよび遊離脂肪酸の含量を算出した。

【０２１３】１２．以下の実施例で使用する酵素の酵素活性

【０２１４】

【表５】

【０２１５】［実施例１］＜堅い皮のロールパン中のＳＰ９７２およびＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６の作用＞ロールパンを焼成し、上述の手順に従って試験した。結果を、下表１．１にま
とめる。

【０２１６】

【表６】

【０２１７】この焼成試験の、十分に寝かせた生地を抽出し、遊離脂肪酸の含量を測定した
。結果を、表１．２にまとめる。

【０２１８】

【表７】

【０２１９】以上の結果から、生地中の脂肪酸形成に対するリパーゼＳＰ９７２の明白な
作用がわかる。

【０２２０】さらに、図１から分かるように、リパーゼ９７２の添加によってパンの体積が
有意に改良され、また、この酵素は、白さおよび均質な柔らかい中身の構造を与
える。

【０２２１】［実施例２］＜リパーゼを加えた寝かせた生地中の脂肪酸および極性脂質の含量＞５種の試験生地（１〜５）は、５０ｇＢｒａｂｅｎｄｅｒ^TMＦａｒｉｎｏ
ｇｒａｐｈを、３０℃で５分間使用して混合し、３４℃で６０分間寝かせた後、
直ちに凍結して凍結乾燥させた。

【０２２２】試験生地の組成を表２．１にまとめる。

【０２２３】

【表８】

【０２２４】脂肪酸の含量をＧＣで分析した。これらの分析結果を表２．２にまとめる。

【０２２５】

【表９】

【０２２６】さらに、上述の通りに、対照生地（試験生地１）および試験生地５における極
性脂質の含量をＨＰＬＣで分析した。結果を、表２．３にまとめる。

【０２２７】

【表１０】

【０２２８】上の結果から、脂肪酸の形成に対するリパーゼＳＰ９７２の明白な作用がわ
かる。８９４ＬＵＴ／ｋｇ粉という最低用量でも、試験生地における脂肪酸含量
の有意な増加が認められた。ＨＰＬＣ分析から、リン脂質および糖脂質の加水分
解に関する、著明な作用がわかる。

【０２２９】従って、これらの実験から、ＳＰ９７２リパーゼは、グリセリド、リン脂質
および糖脂質を、基質として使用できることがわかる。

【０２３０】［実施例３］＜堅い皮のロールパン生地における脂肪酸および極性脂質の含量および焼成した
ロールパンの品質に対する、リパーゼＳＰ９７２単独の作用および大豆レシチ
ンと組合せた作用＞堅い皮のロールパンの品質に対する、リパーゼＳＰ９７２単独の活性および
大豆レシチンと組合せた活性について試験した。市販のリパーゼ製品、ＧＲＩＮ
ＤＡＭＹＬ^TMＥＸＥＬ１６（ＥＸＥＬ１６）および市販のＤＡＴＥＭ乳化剤
、Ｐａｎｏｄａｎ^TMＡ２０２０を比較のために試験した。

【０２３１】酵素および乳化剤添加物の使用量およびそれぞれの焼成したロールパンの品質
特性を表３．１にまとめる。

【０２３２】

【表１１】

【０２３３】ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TMＥＸＥＬ１６またはＰａｎｏｄａｎＡ２０２０
乳化剤と比較して、リパーゼＳＰ９７２を使用した焼成実験は、単独でも大豆
レシチンと組合せても、ＳＰ９７２の優れた焼成性能を示した。この作用は、
市販のリパーゼ，ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６より有意にすぐれてい
る。

【０２３４】上述の通り、生地からの脂質抽出物を、遊離脂肪酸および極性脂質について分
析した。これらの分析結果を、表３．２および３．３にまとめる。

【０２３５】

【表１２】

【０２３６】

【表１３】

【０２３７】上の結果から、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６は、ＤＧＤＧおよびＰ
Ｃの加水分解に対して全く作用しないことがわかる。従って、市販のリパーゼＧ
ＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６と比較するとき、リパーゼＳＰ９７２に
よって行われる生地中のリン脂質および糖脂質の修飾は、両者とも、リパーゼ９
７２のパン改良作用にとって重要ではないと結論することができる。

【０２３８】［実施例４］＜オートムギ脂質を加えた生地におけるリパーゼＳＰ９７２の酵素活性＞リパーゼＳＰ９７２を、オートムギ脂質分画、２１３３−１８−１を加えた
モデル生地で試験した。生地のレシピは以下の通りである。

【０２３９】

【表１４】

【０２４０】５０ｇＢｒａｂｅｎｄｅｒＦａｒｉｎｏｇｒａｐｈを使用して、生地を３
０℃で混合した。６０分間醗酵させた後、生地を凍結して凍結乾燥させ、続いて
、凍結乾燥生地から脂質を抽出し、ＨＰＬＣを使用して極性脂質を分析した。結
果を表４．２にまとめる。

【０２４１】

【表１５】

【０２４２】オートムギ脂質を添加することにより、リン脂質も糖脂質も高レベルになり、
また、ＳＰ９７２リパーゼは、だいたいにおいて、ＤＧＤＧおよびＰＣを基質
として使用すると思われる。従って、生地に酵素を加えることは、より多い極性
脂質成分の形成に関して、有意な作用を有する。

【０２４３】［実施例５］＜穀類脂質およびリパーゼＳＰ９７９を生地に加えることにより起こり得る相
乗効果を評価するための焼成実験＞パンの品質に対する、分留オートムギ脂質調製品（２１３３−１００−１）の
、単独およびリパーゼＳＰ９７９またはＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１
６と組合せた作用を試験して、オートムギ脂質とリパーゼとの相乗効果を証明す
ることができるかどうかを評価する、焼成実験を実施した。生地を作って生地を
焼成する手順は、「ミニ焼成試験」について上述した通りであった。添加物の使
用量およびパンの品質に関する結果を、表５．１にまとめる。

【０２４４】

【表１６】

【０２４５】これらの焼成実験から、オートムギ脂質とリパーゼＳＰ９７９との組合せに
よる非常に強力な体積作用がわかる。オートムギの脂質分画のみでは、パンの体
積に対する改良作用を全く示さなかった。市販のリパーゼＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６は、僅かな体積改良作用を示したものの、添加物を含まない対
照を基準にして、４３％の比体積改良を与え、市販のリパーゼを基準にして、約
２２％の改良を与えたＳＰ９７９リパーゼより有意に少ないパンの体積改良作用
を有していたことも非常に明白であった。

【０２４６】改良されたパンの体積に加えて、リパーゼＳＰ９７９を添加することにより、
パンの柔らかい中身の構造およびパンの外観が改良される結果となった。これを
図２に示すが、この図から、ＳＰ９７９を含む焼成されたパンは、上品で且つ繊
細な柔らかい中身の構造と、有意なオーブンスプリングとを与えたと思われる。

【０２４７】［実施例６］＜生地の品質およびトーストパンの品質に対する、リパーゼＳＰ９７の、単独お
よびアシルグリセロールと組合せた作用＞上述の通りに実行した、トーストパンを用いた焼成実験で、リパーゼＳＰ９
７２を、単独および大豆油と組合せて、試験し、生地特性およびパンの品質に対
する作用を、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６およびＤＩＭＯＤＡＮ^TMＳ
ＤＭ−Ｔの作用と比較した。これらの実験の、生地品質パラメーターおよびパン
の品質に関する結果を、下表にまとめる。

【０２４８】

【表１７】

【０２４９】

【表１８】

【０２５０】これらの焼成実験で、リパーゼＳＰ９７２を、単独およびアシルグリセロー
ル脂質と組合せて加えることにより、パンの体積および柔らかさが有意に改良さ
れ、且つこの作用は、市販のリパーゼＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６の
作用より明らかにすぐれていることが立証された。さらに、上表から明らかなよ
うに、リパーゼＳＰ９７２を加えることにより、生地伸展性および柔らかい中
身のスコアが向上した。ＳＰ９７２は、大豆油と組合せても、ショートニング
と組合せても、非常にプラスになる効果を示すことも、上の結果から明白である
。

【０２５１】リパーゼＳＰ９７２の作用と対照的に、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ
１６を加えても、パンの柔らかさは改良されなかった。

【０２５２】［実施例７］＜リパーゼＳＰ９７９の、生地特性およびパンの品質に対する作用＞短鎖トリグリセリドに対して比較的低い活性を有するが、長鎖脂肪酸を有する
グリセリド（上の、セクション１２参照）、およびリン脂質に対して特に活性な
リパーゼＳＰ９７９を、トーストパン焼成実験で試験した。生地およびパンの
品質に関して実験結果をまとめた下表７．１に示す通りに添加物を加えたこと以
外は、トーストパンを作る手順は上述の通りであった。

【０２５３】

【表１９】

【０２５４】これらの焼成実験から、改良されたパンの体積および柔らかい中身の構造に関
する、リパーゼＳＰ９７９の非常に興味深い作用がわかる。この作用は、市販
の乳化剤ＤＩＭＯＤＡＮ^TMＳＤＭ−Ｔより有意に優れている。

【０２５５】しかし、さらに興味深いのは、リパーゼＳＰ９７９は、単独でもアシルグリ
セロールおよびリン脂質と組合せても、有意な柔らかさ改良作用を有することを
明らかに示す、パンの柔らかさに対する酵素の作用である。この実験でＳＰ９
７９を加えて作ったパンの柔らかい中身は湿り気があること、およびこのような
パンの柔らかい中身の構造は、非常に均質であり且つ添加物を含まない対照パン
のそれより短い噛みを有することが認められた。

【０２５６】［実施例８］＜パンの品質に対する、リパーゼＳＰ９７９の、単独およびオートムギ脂質と
組合せた作用＞比体積および生地における遊離脂肪酸の形成（比色法で分析）に対する作用を
まとめた下表８．１に示す通りに添加物を加えたこと以外は、上述の手順に従っ
て、ミニパン焼成実験を実施した。

【０２５７】

【表２０】

【０２５８】良くなった比体積および柔らかい中身の構造および外観に反映される通り、リ
パーゼＳＰ９７９の有意な生地強化作用が、上の結果からわかる。ＳＰ９７
９の作用は、オートムギ油と組合せたとき、なおいっそう著明であった。

【０２５９】この焼成試験からの寝かせた生地を凍結乾燥させ、脂質を抽出し、ＨＰＬＣ分
析に付した。この分析結果を表８．２に示す。

【０２６０】

【表２１】

【０２６１】これらの結果から、リパーゼＳＰ９７９は、糖脂質（ＤＧＤＧ）もリン脂質
（ＰＣ）も加水分解できることがわかる。事実、ＳＰ９７９を加えることによ
って、存在するＤＧＤＧおよびＰＣの５０％以上が、加水分解された。

【０２６２】［実施例９］＜市販のリパーゼＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６およびＳｔａｌｉｎｇ
ａｓｅ^TMと比較した、リパーゼＳＰ９７２およびリパーゼＳＰ９７の生地およ
びパンの品質改良作用＞リパーゼＳＰ９７２およびリパーゼＳＰ９７９の脂質加水分解作用を、モ
デル生地システムで、２種の市販のリパーゼ、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ
１６およびＳｔａｌｉｎｇａｓｅ^TM（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ）（後者の
酵素は、＃１８６７とも呼ばれる）と比較した。生地を、３２℃にて１時間保ち
、凍結乾燥させ、極性脂質をＨＰＬＣで分析し、無極性脂質をＧＬＣ分析で分析
した。

【０２６３】モデル生地は次の組成を有していた。

【０２６４】

【表２２】

【０２６５】生地中の、遊離脂肪酸およびトリグリセリド（ＧＬＣ分析）、および極性脂質
、ＤＧＤＧおよびＰＣ（ＨＰＬＣ分析）の含量を表９．２にまとめる。

【０２６６】

【表２３】

【０２６７】これらの値を基に、生地中で形成された遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の量、および、
それぞれ、生地中で加水分解されたトリグリセリド、ＤＧＤＧおよびＰＣの量を
算出することができる。これらのデータを、表９．３に示す。

【０２６８】

【表２４】

【０２６９】上表に示すように、生地中のリパーゼの活性を、生地中で形成されたＦＦＡの
量によって表すとき、リパーゼＳＰ９７２およびリパーゼＳＰ９７９は、糖
脂質（ＤＧＤＧ）およびリン脂質（ＰＣ）の両者の加水分解に関して、試験した
市販のリパーゼ（これらの基質に対して、作用を全く示さなかった）に比べて、
非常に活性であることが明らかである。

【０２７０】トリグリセリドに対する作用に関しては、リパーゼＳＰ９７２もリパーゼＳ
Ｐ９７９も活性ではあるが、試験した市販のリパーゼより低い。

【０２７１】従って、これらの結果から、本発明による２種のリパーゼは、トリグリセリド
等の無極性脂質および糖脂質、ＤＧＤＧ等の極性脂質、およびリン脂質、ＰＣを
含む広範囲の脂質基質を加水分解することが裏付けられる。

【０２７２】表９．３にまとめたデータは、グラフで表して、酵素がトリグリセリドを加水
分解できる能力と、糖脂質を加水分解できる能力との間の関係（図３）、および
酵素がトリグリセリドを加水分解できる能力と、リン脂質を加水分解できる能力
との間の関係（図４）を示すことが可能である。リパーゼＳＰ９７２およびリ
パーゼＳＰ９７９のこの関係は、それぞれ、ＤＧＤＧに関して、それぞれ、１
．３９６５および２．６４０５の勾配を有する曲線として表すことができ、ＰＣ
に関して対応する値は、それぞれ、０．１６４８および０．７２４８であること
が、これらの図からわかる。

【０２７３】トリグリセリドに対する作用を基準にして、比較的高いリパーゼＳＰ９７２
およびリパーゼＳＰ９７９の、糖脂質およびリン脂質に対する活性が、これら
のデータからわかる。

【０２７４】［実施例１０］＜異なる脂肪酸に対するリパーゼＳＰ９７９およびＳＰ９７２の作用＞バター脂肪を含む試験生地を作ることによって、異なる脂肪酸に対するＳＰ
９７９およびＳＰ９７２リパーゼの活性を評価した。市販のリパーゼ製品ＧＲ
ＩＮＤＡＭＹＬ( ＥＸＥＬ１６を、比較のために試験した。

【０２７５】表１０．１に略述したレシピに従って、試験生地を作った。

【０２７６】

【表２５】

【０２７７】４種の試験生地（１〜４）は、５０ｇＢｒａｂｅｎｄｅｒ(ミキシングボウ
ルを使用して混合して寝かせた（上の、「８．ミニ焼成試験」と題するセクショ
ンに詳述した通り）。寝かせた後、生地を凍結し、凍結乾燥した。生地中の総脂
質を、水飽和ブタノールで抽出した。ＢｏｎｄＥｌｕｔ−ＮＨ₂カラムを使用
して生地脂質中の遊離脂肪酸を単離し、遊離脂肪酸組成物を、脂肪酸メチルエス
テルとしてＧＬＣで分析した（表１０．２参照）。生地脂質中の遊離脂肪酸の総
量（生地乾燥重量に基づいて算出した、％）を、Ｃｕ塩として、分光光度法で分
析した（表１０．２も参照）。

【０２７８】

【表２６】

【０２７９】遊離脂肪酸および脂肪酸組成物の量を基に、リパーゼを加えていない対照生地
を基準にして、リパーゼを含む生地で生成した遊離脂肪酸の量を、算出すること
が可能である（表１０．３参照）。

【０２８０】たとえば、リパーゼを加えていない生地番号１と比較した、リパーゼＧＲＩＮ
ＤＡＭＹＬＥＸＥＬ１６を含む生地番号２で生成したＣ１６（パルミチン）
脂肪酸の量は、以下の通りに算出される：

【数１】

【０２８１】この情報を基に、生地で生成された長鎖脂肪酸（炭素数(１２）の量を基準に
して、短鎖脂肪酸（炭素数≦１０）の量を算出することが可能である（表１０．
３参照）。

【０２８２】

【表２７】

【０２８３】表１０．３に示した結果から、同一基質で、異なるリパーゼは、異なる脂肪酸
に対して異なる活性を有することが明白であり、リパーゼＳＰ９７２およびＳ
Ｐ９７９は、ＧｒｉｎｄａｍｙｌＥＸＥＬ１６と比較して、短鎖脂肪酸に
対して低い活性を有することがわかる。

【０２８４】［実施例１１］＜極性脂質に対する市販のリパーゼの活性。＞カタログ番号６２２９９として表されていて、ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｅＡ
Ｇ，スイスから入手可能な市販のリパーゼの活性を評価した。このリパーゼをモ
デル生地システム試験し、リパーゼを加えていない対照生地と比較した。

【０２８５】表１１．１に略述したレシピに従って、穀粉１０ｇに基づく試験生地を作った。

【０２８６】

【表２８】

【０２８７】５０ｇＢｒａｂｅｎｄｅｒ(ミキシングボウルを使用して、生地（１〜２）
を３０℃にて５分間こね、３４℃にて４５分間寝かせた。寝かせた後、生地を凍
結し、凍結乾燥させた。凍結乾燥生地を水飽和ブタノールで抽出した。次いで、
単離された生地脂質の遊離脂肪酸を、Ｃｕ塩類として比色法で分析し、生地脂質
をＨＰＬＣでも分析した（表１１．２参照）。

【０２８８】

【表２９】

【０２８９】表１１．２に示した結果から、Ｆｌｕｋａリパーゼｎｏ．６２２９９は、遊離
脂肪酸の形成中の生地システムで活性なこと、およびＦｌｕｋａリパーゼｎｏ．
６２２９９は、糖脂質（ＤＧＤＧ）およびリン脂質（ＰＣ）の両者に対して活性
なことがわかる。

【０２９０】［要約］次に、番号付けしたパラグラフによって、本発明を要約する。１．穀粉の生地を作る方法であって、生地の状態で、無極性の脂質、糖脂質お
よびリン脂質を加水分解することができる酵素、または上記酵素を含む組成物を
、生地成分に加えるステップと、生地成分を混合して生地を得るステップとを含
む方法。２．無極性脂質、糖脂質およびリン脂質の少なくとも１つが、生地に使用する
ための穀粉中に存在する天然脂質成分である、パラグラフ１に記載の方法。３．天然脂質がリン脂質である、パラグラフ２に記載の方法。４．リン脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）である、パラグラフ３に記載の方法。５．天然脂質が糖脂質である、パラグラフ２に記載の方法。６．糖脂質がジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）である、パラグラフ５
に記載の方法。７．無極性脂質、糖脂質およびリン脂質の少なくとも１つが生地に加えられる
、パラグラフ１に記載の方法。８．添加される無極性脂質がアシルグリセロールである、パラグラフ７に記載
の方法。９．添加されるアシルグリセロールが、植物油、植物性脂肪、動物油、動物性
脂肪、ショートニングおよびバターからなる群から選択される、パラグラフ８に
記載の方法。１０．植物油が、オートムギ油を含む天然穀類油である、パラグラフ９に記載
の方法。１１．添加される極性脂質が、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスフ
ァチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファ
チジルエタノールアミン（ＰＥ）からなる群から選択されるリン脂質である、パ
ラグラフ７に記載の方法。１２．生地が、酵母で発酵させる生地である、パラグラフ１に記載の方法。１３．酵素が、１０〜１００，０００ＬＵＴ／ｋｇ粉の範囲、または１０〜
１００，０００ＰＵＬ／ｋｇ粉の範囲である量で添加される、パラグラフ１に記
載の方法。１４．酵素の量が、１００〜１０，０００ＬＵＴ／ｋｇ粉または１００〜１０
，０００ＰＵＬ／ｋｇ粉の範囲である、パラグラフ１３に記載の方法。１５．生地がパン生地であるパラグラフ１に記載の方法であって、さらなるス
テップとして、生地を焼成して焼成製品を得ることを含む方法。１６．生地が、パスタ生地、ヌードル生地およびケーキ生地またはバッターか
らなる群から選択される生地である、パラグラフ１に記載の方法。１７．酵素が添加されないこと以外は同じ条件で作られた焼成製品を基準にし
て、少なくとも１０％である焼成製品の比体積の増加を来たす量で酵素が添加さ
れる、パラグラフ１に記載の方法。１８．さらなる酵素が生地に添加される、パラグラフ１に記載の方法。１９．さらなる酵素が、リパーゼ、でんぷん分解酵素、ヘミセルラーゼ、セル
ラーゼおよび酸化還元酵素からなる群から選択される、パラグラフ１８に記載の
方法。２０．生地中に最初に存在するＤＧＤＧの少なくとも２５％が加水分解される
、パラグラフ１に記載の方法。２１．生地中に最初に存在するＰＣの少なくとも２５％が加水分解される、パ
ラグラフ１または２０に記載の方法。２２．酵素がトリグリセリドを加水分解できる能力と、糖脂質を加水分解でき
る能力との間の関係を、少なくとも１．０である勾配を有する曲線として表せる
点で酵素を特徴付けられる、パラグラフ１に記載の方法。２３．酵素がトリグリセリドを加水分解できる能力と、リン脂質を加水分解で
きる能力との間の関係を、少なくとも０．１である勾配を有する曲線として表せ
る点で酵素を特徴付けられる、パラグラフ１に記載の方法。２４．無極性脂質がＣ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸を含むトリグリセリドおよびＣ₁₂〜Ｃ₂₀
脂肪酸を含むトリグリセリドであり、酵素が、Ｃ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸を含むトリグリ
セリドと比較して、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸を含む上記トリグリセリドを優先的に加水
分解する、パラグラフ１〜２３のいずれか１つに記載の方法。２５．生地を作る方法であって、生地の状態で、Ｃ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸を含むトリ
グリセリド、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸を含むトリグリセリド、糖脂質およびリン脂質を
加水分解することができ、且つその酵素が、Ｃ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸を含むトリグリセ
リドと比較して、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸を含む上記トリグリセリドを優先的に加水分
解する酵素を生地成分に添加するステップと、生地成分を混合して生地を得るス
テップとを含む、方法。２６．上記糖脂質がジガラクトシルジグリセリドである、パラグラフ２５に記
載の方法。２７．ａ）少なくとも１つの酵素を、トリグリセリドにおけるＣ₄〜Ｃ₁₀脂肪
酸、トリグリセリドにおけるＣ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸、ジガラクトシルジグリセリドお
よびリン脂質に対する、その加水分解活性について試験するステップと、ｂ）ジガラクトシルジグリセリドおよびリン脂質に対する加水分解活性を有し
、且つＣ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸と比較して、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸に対してより大きい活性
を有する酵素を選択するステップと、ｃ）選択された酵素を生地に添加するステップと、を含む、生地または生地から作られた焼成製品を作る方法。２８．生地の状態で、無極性脂質、糖脂質およびリン脂質を加水分解すること
ができる酵素、および任意選択的に少なくとも１つのさらなる生地成分を含む、
生地改良用組成物。２９．リパーゼ、でんぷん分解酵素、ヘミセルラーゼ、セルラーゼおよび酸化
還元酵素からなる群から選択されたさらなる酵素を含む、パラグラフ２８に記載
の組成物。３０．さらなる生地成分が、穀類の粉、酵母、化学膨張剤、生地強化剤、乳化
剤、砂糖、アシルグリセロール、リン脂質、糖脂質および塩からなる群から選択
される、パラグラフ２８に記載の組成物。３１．酵素が、パラグラフ２８〜３０のいずれか１つに記載の組成物の状態で
添加される、パラグラフ１に記載の方法。３２．パラグラフ１〜２７および３１のいずれか１つに記載の方法で得られる
生地。３３．凍結されるか、または管理されたガスで包装されている、パラグラフ３
２に記載の生地。３４．パラグラフ３２の生地を焼成することによって得られる焼成製品。３５．パラグラフ３２の生地から作られる、ヌードル製品。３６．パラグラフ３２の生地から作られる、パスタ製品。

【０２９１】上の明細書に記載の全ての刊行物を、参照により本明細書に組み込む。本発明
の範囲および精神から逸脱することのない、記載の方法および本発明のシステム
の様々な修飾および変更は、当業者に明白であるだろう。具体的な好ましい実施
形態に関連して本発明を説明してきたが、クレームに記載されている本発明は、
具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際、
分子生物学または関連分野における当業者に明白な、記載されている発明を実行
する方式の様々な修飾は、本クレームの範囲内であるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】リパーゼを添加しない対照（右側のロールパン）と比較したときの、パンの柔
らかい中身の構造に対する、市販のリパーゼ、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ
１６（２００ｐｐｍ）（左側のロールパン）、リパーゼＳＰ９７２（それぞ
れ、１０００，２５００および５０００ＬＵＴ／ｋｇ穀粉）（ロールパン２〜４
）の作用を表す図である。

【図２】パンの体積および柔らかい中身の構造に対する、オートムギ脂質単独（左側の
パン）、オートムギ脂質＋１０１０ｐｐｍＳＰ９７９（中程のパン）および
オートムギ脂質＋２００ｐｐｍＧＲＩＮＤＡＭＹＬ^TM ＥＸＥＬ１６（右側
のパン）添加の作用を示す図である。

【図３】リパーゼＳＰ９７２およびリパーゼＳＰ９７９が、トリグリセリドを加水
分解できる能力と、それらが糖脂質を加水分解できる能力との関係を示す図であ
る。

【図４】リパーゼＳＰ９７２およびリパーゼＳＰ９７９が、トリグリセリドを加水
分解できる能力と、リン脂質を加水分解できる能力との関係を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号００２８７０１．１ (32)優先日平成12年11月24日(2000．11．24) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】穀粉の生地を作る方法であって、生地の状態で、無極性の脂
質、糖脂質およびリン脂質を加水分解することができる酵素、または前記酵素を
含む組成物を、生地成分に加えるステップと、前記生地成分を混合して前記生地
を得るステップとを含む方法。
【請求項２】前記無極性脂質、前記糖脂質および前記リン脂質の少なくと
も１つが、前記生地に使用するための穀粉中に存在する天然脂質成分である、請
求項１に記載の方法。
【請求項３】前記天然脂質がリン脂質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記リン脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）である、請求
項３に記載の方法。
【請求項５】前記天然脂質が糖脂質である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】前記糖脂質がジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）であ
る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記無極性脂質、前記糖脂質および前記リン脂質の少なくと
も１つが前記生地に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】添加される前記無極性脂質がアシルグリセロールである、請
求項７に記載の方法。
【請求項９】添加される前記アシルグリセロールが、植物油、植物性脂肪
、動物油、動物性脂肪、ショートニングおよびバターからなる群から選択される
、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記植物油が、オートムギ油を含む天然穀類油である、請
求項９に記載の方法。
【請求項１１】添加される前記極性脂質が、ホスファチジルイノシトール
（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ
）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からなる群から選択されるリ
ン脂質である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】前記生地が、酵母で発酵させる生地である、請求項１に記
載の方法。
【請求項１３】前記酵素が、１０〜１００，０００ＬＵＴ／ｋｇ粉の範
囲、または１０〜１００，０００ＰＵＬ／ｋｇ粉の範囲である量で添加される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】前記酵素の量が、１００〜１０，０００ＬＵＴ／ｋｇ粉
または１００〜１０，０００ＰＵＬ／ｋｇ粉の範囲である、請求項１３に記載
の方法。
【請求項１５】前記生地がパン生地である請求項１に記載の方法であって
、さらなるステップとして、前記生地を焼成して焼成製品を得ることを含む方法
。
【請求項１６】前記生地が、パスタ生地、ヌードル生地およびケーキ生地
またはバッターからなる群から選択される生地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】前記酵素が添加されないこと以外は同じ条件で作られた焼
成製品を基準にして、少なくとも１０％である前記焼成製品の比体積の増加を来
たす量で酵素が添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】さらなる酵素が前記生地に添加される、請求項１に記載の
方法。
【請求項１９】前記さらなる酵素が、リパーゼ、でんぷん分解酵素、ヘミ
セルラーゼ、セルラーゼおよび酸化還元酵素からなる群から選択される、請求項
１８に記載の方法。
【請求項２０】前記生地中に最初に存在するＤＧＤＧの少なくとも２５％
が加水分解される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】前記生地中に最初に存在するＰＣの少なくとも２５％が加
水分解される、請求項１または２０に記載の方法。
【請求項２２】前記酵素がトリグリセリドを加水分解できる能力と、糖脂
質を加水分解できる能力との間の関係を、少なくとも１．０である勾配を有する
曲線として表せる点で前記酵素を特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】前記酵素がトリグリセリドを加水分解できる能力と、リン
脂質を加水分解できる能力との間の関係を、少なくとも０．１である勾配を有す
る曲線として表せる点で前記酵素を特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】前記無極性脂質がＣ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸を含むトリグリセリド
およびＣ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸を含むトリグリセリドであり、前記酵素が、Ｃ₄〜Ｃ₁₀
脂肪酸を含むトリグリセリドと比較して、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸を含む前記トリグリ
セリドを優先的に加水分解する、請求項１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】生地を作る方法であって、生地の状態で、Ｃ₄〜Ｃ₁₀脂肪
酸を含むトリグリセリド、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸を含むトリグリセリド、糖脂質およ
びリン脂質を加水分解することができ、且つその酵素が、Ｃ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸を含
むトリグリセリドと比較して、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸を含む前記トリグリセリドを優
先的に加水分解する酵素を前記生地成分に添加するステップと、前記生地成分を
混合して前記生地を得るステップとを含む、方法。
【請求項２６】前記糖脂質がジガラクトシルジグリセリドである、請求項
２５に記載の方法。
【請求項２７】ａ）少なくとも１つの酵素を、トリグリセリドにおけるＣ ₄ 〜Ｃ₁₀脂肪酸、トリグリセリドにおけるＣ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸、ジガラクトシルジ
グリセリドおよびリン脂質に対する、その加水分解活性について試験するステッ
プと、ｂ）ジガラクトシルジグリセリドおよび前記リン脂質に対する加水分解活性を
有し、且つＣ₄〜Ｃ₁₀脂肪酸と比較して、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀脂肪酸に対してより大きい
活性を有する酵素を選択するステップと、ｃ）選択された酵素を前記生地に添加するステップと、を含む、生地または生地から作られた焼成製品を作る方法。
【請求項２８】生地の状態で，無極性脂質、糖脂質およびリン脂質を加水
分解することができる酵素、および任意選択的に少なくとも１つのさらなる生地
成分を含む、生地改良用組成物。
【請求項２９】リパーゼ、でんぷん分解酵素、ヘミセルラーゼ、セルラー
ゼおよび酸化還元酵素からなる群から選択されたさらなる酵素を含む、請求項２
８に記載の組成物。
【請求項３０】前記さらなる生地成分が、穀類の粉、酵母、化学膨張剤、
生地強化剤、乳化剤、砂糖、アシルグリセロール、リン脂質、糖脂質および塩か
らなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】前記酵素が、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の組
成物の状態で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】請求項１〜２７および３１のいずれか１項に記載の方法で
得られる生地。
【請求項３３】凍結されるか、または管理されたガスで包装されている、
請求項３２に記載の生地。
【請求項３４】請求項３２の前記生地を焼成することによって得られる焼
成製品。
【請求項３５】請求項３２の前記生地から作られる、ヌードル製品。
【請求項３６】請求項３２の前記生地から作られる、パスタ製品。