CN110790823B - 一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法 - Google Patents

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Abstract

一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，属于微生物技术领域。本发明对解淀粉芽孢杆菌进行培养，得到发酵上清液，对上清液分离纯化后制得一种新的六肽。本发明提供的方法所得发酵上清液可以直接用于抑菌，经过对发酵上清液进一步分离纯化后可以得到三种抑菌物质，其中包括一种新的六肽，同样具有抑菌作用；当三者联合作用于指示菌细胞时，对细胞损伤程度更大。三者之间两两组合作用指示菌发现乳酸与Surfactin具有协同作用；乳酸与六肽具有协同作用；Surfactin与六肽具有相加作用。为新型抗菌肽的不断开发提供理论支撑，为天然抑菌物质的高效使用提供新思路。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法
技术领域
本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌，属于革兰氏阳性菌，兼性厌氧型，能够产生乳酸，可产生抑菌活性物质，抑制某些腐败和病原微生物生长。由于其对人体无毒无害，在动物肠道中对肠道致病菌有较佳的抑制力，可以应用于医疗保健领域。
有关研究表明，解淀粉芽孢杆菌可产生抑菌活性物质，但由于该类产物依赖于发酵条件的控制，且发酵产物中抑菌物质的成分复杂，其含量较低，对抑菌物质的作用机理研究不够深入，限制了其发展应用。因此明确抑菌主要成分及多种成分之间的协同抑菌作用机理是目前解决抑菌物质高效利用的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，其发酵上清液可以直接用于抑菌，经过分离纯化后还可得到一种新的六肽，具有抑菌作用。
本发明的第一个目的在于提供一种六肽，其由解淀粉芽孢杆菌发酵上清液分离产生，具有抑菌活性。
上述六肽的氨基酸序列具体为Leu-Val-Asn-Pro-Pro-Thr。
本发明的第二个目的在于对解淀粉芽孢杆菌进行培养，得到发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌培养条件为培养温度48-52℃，初始pH 6-8，种龄2.5-5.5h，接种量1.5%-2％，装液量45-50 mL。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基具体为：麦芽糖9-11 g/L，蛋白胨14-16g/L，MgSO4·7H2O 1.5-2 g/L，活性CaCO3 8-10 g/L。
本发明的第三个目的在于提供解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，对所得发酵上清液以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过酸沉、有机溶剂萃取，DEAE阴离子交换层析，结合制备型RP-HPLC层析分离纯化，得到抑菌活性物质，对纯化产物进行LC-MS分析。
在本发明的一种实施方式中，所述金黄色葡萄球菌具体为Staphylococcus aureus ATCC 29213。
在本发明的一种实施方式中，具体步骤如下：
（1）对所得发酵上清液中缓慢滴加6 mol×L-1 HCl，不断搅拌至pH为2，4℃过夜保存；在4℃下，以8000 r×min-1离心20 min，弃上清，用等量的无菌水重悬沉淀，用2mol×L-1NaOH调节pH至7；冷冻干燥后，用体积比3:1的三氯甲烷与甲醇多次萃取，40℃旋转蒸发仪蒸发有机溶剂，得到黄色晶体；测定蛋白浓度并检测抑菌活性；
（2）进行DEAE阴离子交换层析，色谱柱：DEAE-Sepharose-Fast Flow阴离子色谱柱，流动相A: 20 mmol/L，pH 8的Tris-HCl缓冲液，流动相B：1mol/L NH4HCO3的Tris-HCl缓冲液，进样量：5mL，检测波长：220nm；用3倍柱体积的缓冲液A洗脱后，依次用0％、60％、80％和100％浓度的流动相B进行梯度洗脱；以金黄色葡萄球菌作为指示菌，采用改良牛津杯法测定分离峰的抑菌活性；
（3）对分离峰B进行RP-HPLC分离；色谱条件：Waters XBridge Prep C18色谱柱，10×250 mm，5μm，流动相A：含0.1％TFA的乙腈，流动相B：含0.1％TFA的超纯水，流速：0.5 mL/min，检测波长：220 nm，进样量：0.5 mL；用流动相B平衡3倍柱体积，选择线性洗脱方式；
（4）收集抑菌活性较高的分离峰，选用WATERS ACQUITY UPLC色谱仪，层析柱：BEHC18；2.1×50 mm 1.7μm，流动相A：含0.1％TFA的乙腈，流动相B：含0.1％TFA的Milli-Q水，流速0.3 mL/min，进样量：5 μL，检测波长220 nm，柱温：45 ℃，梯度洗脱：0~3 min，5％A相95％B相；3~15 min，5％~95％A相，95％~5％B相；15~17 min，95％~100％A相，5％~0％B相；17.1 min，5％A相，95％B相；UPLC分离峰被注入WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，采用正离子模式电喷雾，获得信号峰的质谱图。
本发明的第四个目的在于提供一种抑菌活性物质对致病菌的细胞膜作用的研究方法，是将分离纯化得到的抑菌物质作用于金黄色葡萄球菌的细胞膜。
在本发明的一种实施方式中，所采用的方法有测定作用致病菌前后，其胞外K+、OD260、OD280浓度变化，及通过电子显微镜观察细胞形态变化。
利用改良牛津杯方法与抑菌率计算方法结合对抑菌活性考察。抑菌率是指取100μL BCA浓度为1mg/mL的抑菌剂与100 μL菌浓度为108 CFU/mL的指示菌菌悬液混合均匀，37℃，培养24 h，用酶标仪测OD600，记为A1。等量无菌LB液体培养基代替抑菌剂作对照，记为A0。
Figure 404568DEST_PATH_IMAGE001
式中：A1为实验组的吸光度；A0为对照组的吸光度。
通过对解淀粉芽孢杆菌上清液中抑菌物质的分离，纯化得到三种抑菌活性物质，分别为乳酸、含有C13-15的表面活性肽和六肽；
经过液相质谱分析（LC-MS）其中一种为含有C13-15的Surfactin物质，另一种为6个氨基酸（Leu-Val-Asn-Pro-Pro-Thr）组成的新型抑菌肽。再一种为乳酸。以金黄色葡萄球菌为指示菌，测定六肽、Surfactin与乳酸的最小抑制浓度分别为0.8mg/mL、0.5mg/mL、1.563mg/mL。
本发明的第五个目的是提供解淀粉芽孢杆菌所产的三种抑菌活性物质之间的协同抑菌作用效果。
在本发明的一种实施方式中，采用三种抑菌物质两两组合作用于指示菌。
在本发明的一种实施方式中，分离纯化后得到三种抑菌活性物质，分别为乳酸、含有C13-15的表面活性肽和六肽；
对三种抑菌物质的机理研究发现乳酸可破坏细胞壁，六肽可透过细胞壁作用细胞膜，进一步对细胞损伤，Surfactin不仅可破坏细胞壁，还能透过细胞膜作用细胞内部，干扰细胞分裂。当三者联合作用于指示菌细胞时，对细胞损伤程度更大。三者之间两两组合作用指示菌，发现乳酸与Surfactin具有协同作用；乳酸与六肽具有协同作用；Surfactin与六肽具有相加作用。为新型抗菌肽的不断开发提供理论支撑，为天然抑菌物质的高效使用提供新思路。
本发明的有益效果：本发明提供的方法所得发酵上清液可以直接用于抑菌，经过对发酵上清液进一步分离纯化后可以得到三种抑菌物质，其中包括一种新的六肽，同样具有抑菌作用；当三者联合作用于指示菌细胞时，对细胞损伤程度更大。三者之间两两组合作用指示菌发现乳酸与Surfactin具有协同作用；乳酸与六肽具有协同作用；Surfactin与六肽具有相加作用。为新型抗菌肽的不断开发提供理论支撑，为天然抑菌物质的高效使用提供新思路。
附图说明
图1 为DEAE阴离子交换层析图谱。
图2 为分离峰B的RP-HPLC层析图谱。
图3 为分离纯化活性峰的抑菌直径。
图4 为活性峰D的色谱图。
图5 为主要信号峰的二级质谱图。
图6 为活性峰F的色谱图。
图7 为活性峰F的质谱图。
图8 为乳酸、六肽与Surfactin对金黄色葡萄球菌的胞外K+浓度的影响。
图9 为乳酸、六肽与Surfactin对金黄色葡萄球菌的胞外紫外吸收物质吸光度的影响。
图10 为电镜下乳酸、六肽与surfactin对金黄色葡萄球菌菌体形态影响。
a、b、c、d、e为TEM图，A、B、C、D、E为FESEM图；a、A为正常细胞；b、B为乳酸作用后细胞；c、C 为六肽作用后细胞；d、D为Surfactin作用后细胞；e、E为乳酸、六肽与Surfactin联合作用后细胞。
具体实施方式
发酵培养基：麦芽糖10 g/L，蛋白胨15 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，活性CaCO3 10 g/L；培养条件：培养温度50℃，初始pH 7，种龄3h，接种量2％，装液量50 mL。
实施例1
以发酵培养基培养解淀粉芽孢杆菌，对上清液酸沉有机溶剂萃取后进行DEAE阴离子交换层析，色谱柱：DEAE-Sepharose-Fast Flow阴离子色谱柱，流动相A：20 mmol/L，pH 8的Tris-HCl缓冲液，流动相B：1 mol/L NH4HCO3的Tris-HCl缓冲液，进样量：5 mL，检测波长：220 nm。用3倍柱体积的缓冲液A洗脱后，用0％、60％、80％、100％浓度的流动相B进行梯度洗脱。以金黄色葡萄球菌作为指示菌，采用改良牛津杯法测定分离峰的抑菌活性，结果如图1显示，洗脱峰B检测出抑菌圈，测定抑菌直径为（19.2±0.3）mm，计算抑菌率为61.25％。
实施例2
对分离峰B进行RP-HPLC分离。色谱条件：Waters XBridge Prep C18色谱柱（10×250 mm，5μm），流动相A：含0.1％TFA的乙腈，流动相B：含0.1％TFA的超纯水，流速：0.5 mL/min，检测波长：220 nm，进样量：0.5 mL。用流动相B平衡3倍柱体积，选择线性洗脱方式,。结果如图2，洗脱峰D的抑菌活性最高，抑菌直径为（18.0±0.2）mm，抑菌率为57.62％，洗脱峰F的抑菌活性次之，抑菌直径（16.2±0.3）mm，其抑菌率为48.35％。分离纯化活性峰的抑菌直径如图3所示。
实施例3
收集抑菌活性较高的分离峰，选用WATERS ACQUITY UPLC色谱仪，层析柱：BEH C18(2.1×50 mm 1.7 μm)，流动相A：含0.1％TFA的乙腈，流动相B：含0.1％TFA的Milli-Q水，流速0.3 mL/min，进样量：5 μL，检测波长220 nm，柱温：45 ℃，梯度洗脱：0~3 min，5％A相95％B相；3~15 min，5％~95％A相，95％~5％B相；15~17 min，95％~100％A相，5％~0％B相；17.1 min，5％A相，95％B相。UPLC分离峰被注入WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，采用正离子模式电喷雾，获得信号峰的质谱图。如图4-7。
实施例4
预测活性峰F是由6个氨基酸组成的小肽，序列为L-V-N-P-P-T。借助ExPasy中的ProtParam软件，在线分析该抑菌肽的分子量为639.75 Da，分子式为C29H49N7O9，等电点为5.52，GRAVY为0.100，脂溶性指数113.33。将此多肽在NCBI、APD数据库进行同源性分析，发现与APD数据库中已报道抑菌肽的同源相似性较低，与来自链霉菌属的抗菌肽，APD ID 为AP02577的氨基酸序列的同源性最高，为37.5％。由此推断，此六肽为一种新型抗菌肽（见表1）。
表1
Figure 321708DEST_PATH_IMAGE003
实施例5
分别加入终浓度为3 MIC的乳酸、3 MIC的Surfactin及3 MIC的六肽与三者终浓度均为3 MIC的混合物抑菌物质。37℃，150 r/min培养3 h，每0.5 h取样离心，对上清过滤膜除杂，对照组为不加抑菌物质的指示菌菌悬液，用原子吸收仪测定胞外K+浓度。乳酸、六肽与Surfactin三者都可增大细胞膜的通透性，当三者联合作用时，对细胞膜通透性的改变更大（如图8所示，其中CK表示空白对照样）。
实施例6
实施方式同实施例5，其区别在于，调节酶标仪检测波长260 nm、280 nm，测胞外紫外吸收物质浓度的变化。三者单独作用细胞3h后，紫外吸收物质都有不同程度的泄漏，联合作用时，260nm、280 nm处吸收值的增长幅度更大，说明三者联合作用时对胞内核酸、蛋白类物质外泄作用更强。（如图9所示）
实施例7
实施方式同实施例5，其区别在于，对照组为不加抑菌物质的指示菌菌悬液。37℃，150 r/min培养3 h后，离心收集菌体，用无菌水洗涤沉淀两次，用SEM、TEM观察、拍摄细胞结构、形态。乳酸作用可使指示菌的细胞壁脱落。Surfactin的可作用细胞壁、细胞膜，严重破坏细胞结构，使细胞质大量外泄、细胞核暴露，干扰细胞分裂。六肽可破坏细胞壁，且透过细胞膜作用细胞内部，破坏细胞结构使细胞质少量外泄。当三者联合作用指示菌细胞时，对细胞损伤程度更大。（如图10所示）（a、b、c、d、e为TEM图，A、B、C、D、E为FESEM图；a、A为正常细胞；b、B为乳酸作用后细胞；c、C 为六肽作用后细胞；d、D为Surfactin作用后细胞；e、E为乳酸、六肽与Surfactin联合作用后细胞。）
实施例8
采用棋盘稀释法，按照从左往右Surfactin的浓度递减，从上往下乳酸的浓度递减，加入96孔板中，控制两者终浓度分别为2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16MIC、0。超净台中风干后，加入200 μL浓度为107 CFU/mL的S.aureus菌悬液。37℃培养24 h，用酶标仪测定OD600。对照组为不加抑菌物质的200 μL菌液。用抑菌浓度指数(fractionalinhibitory concentration index，FICI)判断两种物质是否存在协同作用。
按照公式：
Figure 914495DEST_PATH_IMAGE004
Figure 309704DEST_PATH_IMAGE005
协同作用：FICI≤0.5，相加作用：0.5＜FICI≤1，无关作用：1＜FICI≤2，拮抗作用：FICI≥2。
计算菌体不生长时，所对应的FICI值。当乳酸浓度为0.098mg/mL（1/16 MIC），Surfactin浓度为0.125 mg/mL（1/4 MIC），此时两者的FICI值最小为0.3125。0.3125＜0.5，说明乳酸协同Surfactin对S.aureus有较强烈的抑菌作用（如表2）
表2 乳酸与Surfactin联合抑制Staphylococcus aureus ATCC 29213
Figure 124076DEST_PATH_IMAGE006
实施例9
实施方式同实施例8，其区别在于，测定乳酸与六肽的最小抑菌浓度，计算两者的FICI值。发现随着六肽浓度逐渐降低，乳酸对S.aureus的MIC逐渐升高。当乳酸浓度为0.195mg/mL（1/8 MIC），六肽浓度0.20mg/mL（1/4 MIC）时，两者的FICI值最小为0.375。0.375＜0.5，说明乳酸与六肽对S.aureus有协同抑制作用。（如表3）
表3乳酸与六肽联合抑制Staphylococcus aureus ATCC 29213
Figure 8856DEST_PATH_IMAGE007
实施例10
实施方式同实施例8，其区别在于，测定六肽与Surfactin的最小抑菌浓度，计算两者的FICI值。发现发现当Surfactin浓度为0.125mg/mL（1/4MIC），六肽浓度0.40mg/mL（1/2MIC）或六肽浓度0.20 mg/mL（1/4MIC），Surfactin浓度0.250mg/mL（1/2MIC），两种情况下，Surfactin联合六肽作用对指示菌的FICI值最低，均为0.75。明Surfactin与六肽对S.aureus无明显的协同作用，只是有相加的抑菌作用。（如表4）
表4 Surfactin与六肽联合抑制Staphylococcus aureus ATCC 29213
Figure 275889DEST_PATH_IMAGE008

Claims (7)

1.一种具有抑菌活性的六肽，其特征在于：由解淀粉芽孢杆菌发酵上清液分离产生，其氨基酸序列具体为Leu-Val-Asn-Pro-Pro-Thr。
2.一种发酵产权利要求1所述抑菌活性六肽的方法，其特征在于：由解淀粉芽孢杆菌发酵上清液分离产生，所述解淀粉芽孢杆菌培养条件为培养温度48-52℃，初始pH 6-8，种龄2.5-5.5h，接种量1.5%-2％，装液量45-50 mL；
所述培养基具体为：麦芽糖9-11 g/L，蛋白胨14-16g/L，MgSO4·7H2O 1.5-2 g/L，活性CaCO3 8-10 g/L。
3.根据权利要求2所述发酵产抑菌活性六肽的方法，其特征在于：对所得发酵上清液以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过酸沉、有机溶剂萃取，DEAE阴离子交换层析，结合制备型RP-HPLC层析分离纯化，得到抑菌活性物质，对纯化产物进行LC-MS分析。
4.根据权利要求3所述发酵产抑菌活性六肽的方法，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌具体为Staphylococcus aureus ATCC 29213。
5.根据权利要求2所述发酵产抑菌活性六肽的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）对所得发酵上清液中缓慢滴加6 mol×L-1 HCl，不断搅拌至pH为2，4℃过夜保存；在4℃下，以8000 r×min-1离心20 min，弃上清，用等量的无菌水重悬沉淀，用2mol×L-1 NaOH调节pH至7；冷冻干燥后，用体积比3:1的三氯甲烷与甲醇多次萃取，40℃旋转蒸发仪蒸发有机溶剂，得到黄色晶体；测定蛋白浓度并检测抑菌活性；
（2）进行DEAE阴离子交换层析，色谱柱：DEAE-Sepharose-Fast Flow阴离子色谱柱，流动相A：20 mmol/L，pH 8的Tris-HCl缓冲液，流动相B：1mol/L NH4HCO3的Tris-HCl缓冲液，进样量：5mL，检测波长：220nm；用3倍柱体积的缓冲液A洗脱后，依次用0％、60％、80％和100％浓度的流动相B进行梯度洗脱；以金黄色葡萄球菌作为指示菌，采用改良牛津杯法测定分离峰的抑菌活性；
（3）对分离峰B进行RP-HPLC分离；色谱条件：Waters XBridge Prep C18色谱柱，10×250 mm，5μm，流动相A：含0.1％TFA的乙腈，流动相B：含0.1％TFA的超纯水，流速：0.5 mL/min，检测波长：220 nm，进样量：0.5 mL；用流动相B平衡3倍柱体积，选择线性洗脱方式；
（4）收集抑菌活性较高的分离峰，选用WATERS ACQUITY UPLC色谱仪，层析柱：BEH C18；2.1×50 mm 1.7μm，流动相A：含0.1％TFA的乙腈，流动相B：含0.1％TFA的Milli-Q水，流速0.3 mL/min，进样量：5 μL，检测波长220 nm，柱温：45 ℃，梯度洗脱：0~3 min，5％A相95％B相；3~15 min，5％~95％A相，95％~5％B相；15~17 min，95％~100％A相，5％~0％B相；17.1min，5％A相，95％B相；UPLC分离峰被注入WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，采用正离子模式电喷雾，获得信号峰的质谱图。
6.根据权利要求2所述发酵产抑菌活性六肽的方法，其特征在于：所得发酵上清液分离纯化后得到三种抑菌活性物质，分别为乳酸、含有C13-C15的表面活性肽Surfactin和所述抑菌活性六肽；
所述乳酸协同含有C13-15的表面活性肽Surfactin对S.aureus进行抑菌；
所述乳酸协同抑菌活性六肽进行抑菌；
所述含有C13-C15的表面活性肽Surfactin协同所述抑菌活性六肽进行抑菌。
7.权利要求1所述抑菌活性六肽用于抑菌。
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