DE69623473T3

DE69623473T3 - Rekombinante hexose oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69623473T3
Application number: DE69623473T
Authority: DE
Inventors: Peter Stougaard; Cai Ole HANSEN
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: EP0832245B2; NO975693D0; US7544795B2; ATE223489T1; BR9609230A; CN1266275C; ES2182986T5; DK0832245T3; US7727572B2; DE69623473T2; WO1996040935A1; BRPI9609230B1; AU705562B2; US20020106725A1; US20050282249A1; EP0832245A1; ZA964616B; PH11996053280B1; CA2224143C; CA2224143A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Hexoseoxidase mittels rekombinanter DNA-Technologie und dieses Enzym, hergestellt nach dem Verfahren, und dessen Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie und anderen Gebieten bereit.
TECHNISCHER HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
Hexoseoxidase (D-Hexose: O₂-Oxidoreduktase, EC 1.1.3.5) ist ein Enzym, welches in der Gegenwart von Sauerstoff in der Lage ist, D-Glucose und mehrere andere reduzierende Zucker, einschließlich Maltose, Lactose und Zellobiose, zu ihren entsprechenden Lactonen zu reduzieren mit anschließender Hydrolyse zu den jeweiligen Aldobionsäuren. Dementsprechend unterscheidet sich Hexoseoxidase von einer anderen Oxidoreduktase, Glucoseoxidase, welche nur D-Glucose umwandeln kann, dahingehend, daß dieses Enzym einen breiteren Bereich von Zuckersubstraten verwenden kann. Die durch Hexoseoxidase katalysierte Oxidation kann z. B. wie folgt dargestellt werden: D-Glucose + O₂ → δ-D-Gluconolacton + H₂O₂ oder D-Galactose + O₂ → γ-D-Galactogalacton + H₂O₂.
Bis heute wurde Hexoseoxidase (die nachfolgend auch als HOX bezeichnet wird) durch Isolierung des Enzyms aus verschiedenen Rotalgenspezies, wie Iridophycus flaccidum (Bean und Hassid, 1956) und Chondrus crispus (Sullivan et al., 1973) bereitgestellt. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß die Algenspezies Euthora cristata Hexoseoxidase produziert.
Es wurde berichtet, daß aus diesen natürlichen Quellen isolierte Hexoseoxidase eine potentielle Eignung bei der Herstellung bestimmter Nahrungsmittelprodukte besitzt. So wurde gezeigt, daß aus Iridophycus flaccidum isolierte Hexoseoxidase in der Lage ist, Lactose in Milch unter Herstellung der entsprechenden Aldobionsäure umzuwandeln, und es wurde gezeigt, daß sie von möglichem Interesse als ein Säuerungsmittel in Milch ist, z. B. um ansäuernde mikrobielle Kulturen für diesen Zweck zu ersetzen (Rand, 1972). In diesem Zusammenhang wurde Hexoseoxidase als ein stärker interessierendes Enzym als Glucoseoxidase erwähnt, da dieses letztgenannte Enzym in Milch- oder Nahrungsmittelprodukten, die keine Glucose enthalten, nur unter gleichzeitiger Zugabe von Glucose oder, im Falle eines Milchprodukts, des lactoseabbauenden Enzyms Lactase, wobei die Lactose zu Glucose und Galactose abgebaut wird, verwendet werden kann. Auch wenn Glucose auf diese Weise als ein Substrat für die Glucoseoxidase verfügbar wird, ist es offensichtlich, daß nur 50% des Endprodukts von Lactase als Substrat von der Glucoseoxidase verwendet werden können, und dementsprechend ist Glucoseoxidase kein wirkungsvolles Säuerungsmittel in natürlicher Milch oder Molkereiprodukten.
Die Fähigkeit von Sauerstoff-Oxidoreduktasen, einschließlichen derjenigen von Hexoseoxidase, Wasserstoffperoxid zu erzeugen, welches eine antimikrobielle Wirkung hat, wurde dazu verwendet, die Lagerstabilität bestimmter Nahrungsmittelprodukte, einschließlich Käse, Butter und Fruchtsaft, zu verbessern, wie es in der JP-B-73/016612 offenbart ist. Es wurde auch vorgeschlagen, daß Oxidoreduktasen möglicherweise als Sauerstoffänger oder Antioxidantien in Nahrungsmittelprodukten brauchbar sein können.
In der Backwaren- und Mehlindustrie ist es bekannt, oxidierende Mittel, wie z. B. Iodate, Peroxide, Ascorbinsäure, K-Bromate oder Azodicarbonamide, zur Verbesserung der Backleistung von Mehl zu verwenden, um einen Teig mit verbesserter Dehnbarkeit zu erhalten und somit eine gewünschte Stärke und Stabilität zu bekommen. Der Mechanismus hinter dieser Wirkung oxidierender Mittel ist, daß die Mehlproteine, wie z. B. Gluten in Weizenmehl, Thiolgruppen enthält, welche, wenn sie oxidiert werden, Disulfidbindungen ausbilden, wobei das Protein eine stabilere Matrix bildet, was zu einer besseren Teigqualität und zu Erhöhungen des Volumens und der Krumenstruktur des gebackenen Produkts führt.
Jedoch haben Verbraucher Einwände gegen solch eine Verwendung von einigen der derzeit zur Verfügung stehenden Oxidationsmittel oder sie wird von Aufsichtsbehörden nicht zugelassen, und dementsprechend wurde versucht, Alternativen für diese herkömmlichen Mehl- und Teigzusätze zu finden, und der Stand der Technik hat für den oben genannten Zweck die Verwendung von Glucoseoxidase vorgeschlagen. So offenbart die US 2 783 150 den Zusatz von Glucoseoxidase zu Mehl zur Verbesserung der rheologischen Eigenschaften von Teig. Die CA 2 012 723 offenbart brotverbessernde Mittel, welche cellulolytische Enzyme und Glucoseoxidase enthalten, und die JP-A-084848 schlägt die Verwendung einer brotverbessernden Zusammensetzung vor, welche Glucoseoxidase und Lipase enthält.
Jedoch hat die Verwendung von Glucoseoxidase als ein teig- und brotverbessernder Zusatz die Beschränkung, daß dieses Enzym das Vorhandensein von Glucose als Substrat erfordert, um in einem Teigsystem wirksam zu sein, und im allgemeinen ist der Glucosegehalt in Getreidemehlen niedrig. So ist in Weizenmehl Glucose in einer Menge, die im Bereich von 0 bis 0,4 Gew.-% liegt, vorhanden, d. h. Mehle können überhaupt keine Glucose enthalten. Daher ist das Fehlen oder ein niedriger Gehalt an Glucose in Teigen ein begrenzender Faktor für die Verwendung von Glucoseoxidase als ein teigverbesserndes Mittel. Im Gegensatz dazu ist der Gehalt an Maltose bereits in dem frisch hergestellten Teig erheblich höher, und weiterhin wird Maltose in dem Teig aufgrund der Aktivität von α-Amylase, die entweder von Natur aus in dem Mehl vorhanden ist oder zugesetzt wird, gebildet.
Die derzeitige Quelle für Hexoseoxidase sind rohe oder teilweise gereinigte Enzympräparationen, die durch Extraktion aus den oben genannten natürlich vorkommenden Meeresalgenspezies isoliert werden. Da jedoch die Menge an Hexoseoxidase in Algen gering ist, ist es klar, daß eine Produktion des Enzyms auf diese Art und Weise zu langwierig und kostspielig ist, um eine kosteneffektive kommerzielle Produktion des Enzyms aus diesen natürlichen Quellen zu garantieren. Darüber hinaus ist die Bereitstellung eines ausreichend reinen Enzymprodukts auf einem kosteneffektiven Niveau auf diese Art und Weise nicht ohne weiteres zu erreichen.
Es besteht daher ein erheblicher industrieller Bedarf daran, eine alternative und kosteneffektivere Quelle für dieses industriell wertvolle Enzym bereitzustellen, ohne von einer natürlichen Quelle abhängig zu sein, und auch daran, das Enzym in einer reinen Form bereitzustellen, d. h. ohne jegliche kontaminierende Enzymaktivitäten oder jegliche andere unerwünschte kontaminierende Stoffe, einschließlich unerwünschter Algenpigmente und Umweltverunreinigungen, die in den Meeresgebieten vorhanden sind, wo die Hexoseoxidase produzierenden Algenspezies wachsen.
Darüber hinaus wird die industrielle Verfügbarkeit einer Nahrungsmittelqualitätsstufe von Hexoseoxidase in ausreichenden Mengen und zu kosteneffektiven Preisen unzweifelhaft neue Anwendungen für dieses Enzym nicht nur in der Nahrungsmittelindustrie, sondern auch auf anderen industriellen Gebieten eröffnen, wie es im folgenden diskutiert wird. Ein Beispiel für solch eine neue Anwendung der rekombinanten Hexoseoxidase in der Nahrungsmittelindustrie ist die Verwendung davon als ein teigverbesserndes Mittel, ein anderes Beispiel ist die Verwendung von hexoseoxidaseaktivem Polypeptid oder einem rekombinanten Organismus, der das Polypeptid produziert, bei der Herstellung von Lactonen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung hat es durch die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie zum ersten Mai möglich gemacht, hexoseoxidaseaktive Polypeptide in industriell geeigneten Mengen und in einem Qualitäts- und Reinheitsgrad bereitzustellen, welche das hexoseoxidaseaktive Polypeptid gemäß der Erfindung in hohem Maße für jeden relevanten industriellen Zweck, einschließlich der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten und Pharmazeutika, geeignet machen.
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einem ersten Gesichtspunkt ein Verfahren zur Herstellung eines Chondrus crispus-Polypeptids mit Hexoseoxidaseaktivität, bei dem man ein DNA-Fragment isoliert oder synthetisiert, welches das Polypeptid codiert, das DNA-Fragment in eine geeignete Wirtszelle einbringt, in der das DNA-Fragment mit einem geeigneten Expressionssignal für das DNA-Fragment kombiniert wird, die resultierende rekombinante Zelle in einem Kulturmedium unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des hexoseoxidaseaktiven Polypeptids führen, und das Polypeptid aus dem Kulturmedium oder aus der rekombinanten Zelle gewinnt, wobei das DNA-Fragment wenigstens eine DNA-Sequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz codiert, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
worin X eine Aminosäure repräsentiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val, wobei die Wirtszelle eine Hefespezies ist.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine rekombinante Zelle, welche ein exprimierbares DNA-Fragment enthält, das ein hexoseoxidaseaktives Polypeptid codiert, wobei das DNA-Fragment isoliert oder synthetisiert ist, wie es oben definiert ist, und ein Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels, wobei solch eine rekombinante Zelle unter Bedingungen verwendet wird, bei denen das hexoseoxidaseaktive Polypeptid exprimiert wird, wobei die rekombinante Zelle eine Hefezelle ist.
Gemäß noch einem anderen Gesichtspunkt wird ein Verfahren zur Herstellung eines Tierfutters bereitgestellt, wobei die oben genannte rekombinante Zelle unter Bedingungen verwendet wird, bei denen das hexoseoxidaseaktive Polypeptid exprimiert wird; ein Verfahren zur Reduzierung des Zuckergehalts eines Lebensmittels, bei dem man dem Produkt eine Menge einer rekombinanten Zelle der Erfindung hinzufügt, welche ausreicht, um wenigstens einen Teil des anfänglich in dem Lebensmittel vorhandenen Zuckers zu entfernen, und ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem pharmazeutischen Produkt, einem kosmetischen und einem Zahnpflegeprodukt besteht, wobei die genannte rekombinante Zelle verwendet wird.
Darüber hinaus stellt die Erfindung eine teigverbessernde Zusammensetzung bereit, wie in Anspruch 19 definiert, wobei der wenigstens eine herkömmliche Teigbestandteil eine Zellulase, eine Hemizellulase, eine Xylanase, eine Pentosanase, eine Amylase, eine Lipase und eine Protease enthält, und ein Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts aus einem Teig, bei dem man zu dem Teig eine wirksame Menge der teigverbessernden Zusammensetzung der Erfindung hinzufügt.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse des Anteils eines Zuckers in einer Probe bereit, wobei man die rekombinante Zelle der Erfindung als ein analytisches Reagens verwendet, und ein Verfahren zur Herstellung eines Lactons unter Verwendung der rekombinanten Zelle, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, bei denen man die Zelle auf einen Reaktor anwendet, der ein Kohlenhydrat enthält, welches von dem hexoseoxidaseaktiven Polypeptid oxidiert werden kann, und den Reaktor unter Bedingungen betreibt, bei denen das Polypeptid exprimiert wird, wobei das Kohlenhydrat zu einem Lacton oxidiert wird.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein isoliertes DNA-Fragment, wie es oben definiert ist und das ein Chondrus crispus-Polypeptid mit Hexoseoxidaseaktivität codiert.
Es wird auch eine Präparation bereitgestellt, welche ein rekombinant erhaltenes Chondrus crispus-Polypeptid mit Hexoseoxidaseaktivtität enthält, wobei die Präparation im wesentlichen keine anderen Proteine enthält und das Polypeptid wenigstens eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

worin X eine Aminosäure repräsentiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val, und Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels oder eines Tierfutters, bei dem die oben genannte Präparation verwendet wird.
Weitere Gesichtspunkte der Erfindung umfassen ein Verfahren zur Reduzierung des Zuckergehalts in einem Lebensmittel, bei dem man zu dem Produkt eine Menge der Präparation der Erfindung hinzufügt, die ausreicht, um wenigstens einen Teil des anfänglich in dem Lebensmittel vorhandenen Zuckers zu entfernen; ein Verfahren zur Herstellung eines Produkts, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem pharmazeutischen Produkt, einem kosmetischen und einem Zahnpflegeprodukt besteht, wobei die genannte Präparation verwendet wird; ein Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts aus einem Teig, wobei man die Präparation der Erfindung zu dem Teig hinzufügt; eine teigverbessernde Zusammensetzung, welche die Präparation und wenigstens einen herkömmlichen Teigbestandteil enthält; ein Verfahren zum Analysieren des Anteils eines Zuckers in einer Probe, wobei die Präparation der Erfindung als ein analytisches Reagens verwendet wird, und ein Verfahren zur Herstellung eines Lactons unter Verwendung der Präparation, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, in denen man die Präparation auf einen Reaktor anwendet, der ein Kohlenhydrat enthält, welches von dem Polypeptid oxidiert werden kann und den Reaktor unter Bedingungen betreibt, bei denen das Kohlenhydrat zu einem Lacton oxidiert wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Hexoseoxidasen werden in der Natur von verschiedenen Meeresalgenspezies hergestellt. Solche Spezies findet man unter anderem in der Familie der Gigartinaceae, welche zu der Ordnung der Gigartinales gehören. Beispiele für Hexoseoxidase herstellende Algenspezies, die zu den Gigar tinaceae gehören, sind Chondrus crispus und Iridophycus flaccidum. Auch Algenspezies der Ordnung Cryptomeniales, welche die Spezies Euthora cristata umfassen, sind potentielle Quellen für das hexoseoxidaseaktive Polypeptid gemäß der Erfindung. Dementsprechend sind diese Algenspezies potentiell geeignete Quellen für Hexoseoxidase und für DNA, welche diese hexoseoxidaseaktiven Polypeptide codiert. Wie es hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff "hexoseoxidaseaktives Polypeptid" ein Enzym, das wenigstens D-Glucose, D-Galactose, D-Mannose, Maltose, Lactose und Cellobiose oxidiert.
Wenn man solche natürlichen Quellen für die Isolierung von nativer Hexoseoxidase verwendet, wie es im Stand der Technik und in der vorliegenden Erfindung zu dem Zweck der Identifizierung von Algenmaterial, das als eine Quelle für mRNA zur Verwendung bei der Konstruktion von cDNA und als der Ausgangspunkt zum Konstruieren von Primern aus synthetischen DNA-Oligonukleotiden verwendet werden könnte, vorgenommen wurde, wird das Enzym typischerweise aus dem Algenausgangsmaterial durch Extraktion unter Verwendung eines wäßrigen Extraktionsmediums isoliert.
Als Ausgangsmaterial für solch eine Extraktion können die Algen in ihrem frischen Zustand, wie sie von dem Wachstumsgebiet im Meer geerntet wurden, verwendet werden, oder sie können nach Trocknung der Blätter, z. B. durch Lufttrocknung bei Umgebungstemperatur oder mittels jedes geeigneten industriellen Trocknungsverfahrens, wie dem Trocknen in umgewälzter erhitzter Luft oder durch Gefriertrocknung, eingesetzt werden. Um die anschließende Extraktionsstufe zu erleichtern, kann das frische oder getrocknete Ausgangsmaterial z. B. durch Zermahlen oder Mischen zerkleinert werden.
Als das wäßrige Extraktionsmedium sind Pufferlösungen mit einem pH-Wert im Bereich von 6–8, wie ein 0,1 M Natriumphosphatpuffer, ein 20 mM Triethanolaminpuffer oder ein 20 mM Tris-HCl-Puffer, geeignet. Die Hexoseoxidase wird typischerweise aus dem Algenmaterial extrahiert, indem man das Ausgangsmaterial in dem Puffer suspendiert und die Suspension bei einer Temperatur im Bereich von 0–20°C, wie bei etwa 5°C, für 1–10 Tage, vorzugsweise unter Bewegung, hält.
Das suspendierte Algenmaterial wird dann mittels eines geeigneten Trennverfahrens, wie Filtration, Sieben oder Zentrifugation, von dem wäßrigen Medium abgetrennt und die Hexoseoxidase anschließend aus dem Filtrat oder dem Überstand gewonnen. Optional wird das abgetrennte Algenmaterial einer oder mehreren weiteren Extraktionsstufen unterzogen.
Da mehrere Meeresalgen gefärbte Pigmente, wie Phycocyanine, enthalten, kann es erforderlich sein, das Filtrat oder den Überstand einer weiteren Reinigungsstufe zu unterziehen, wobei diese Pigmente entfernt werden. Zum Beispiel können die Pigmente entfernt werden, indem man das Filtrat oder den Überstand mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem die Pigmente löslich sind, behandelt und anschließend das Lösungsmittel, das die gelösten Pigmente enthält, von dem wäßrigen Medium abtrennt.
Die Gewinnung von Hexoseoxidase aus dem wäßrigen Extraktionsmedium kann nach jedem geeigeten herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, das die Isolierung von Proteinen aus wäßrigen Medien erlaubt. Solche Verfahren, von denen Beispiele nachfolgend ausführlich beschrieben werden, umfassen Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, optional gefolgt von einer Konzentrierungsstufe, wie Ultrafiltration. Es ist auch möglich, das Enzym zu gewinnen, indem man Stoffe, wie z. B. (NH₄)₂SO₄, zusetzt, die bewirken, daß das Protein präzipitiert, gefolgt von einer Abtrennung des Präzipitats und dieses optional Bedingungen unterzieht, die erlauben, daß sich das Protein löst.
Zum Zwecke der Erfindung ist es erwünscht, das Protein in einer im wesentlichen reinen Form bereitzustellen, z. B. als eine Präparation im wesentlichen ohne andere Proteine oder Kontaminationen, die keine Proteine sind, und dementsprechend wird die relativ rohe Enzympräparation, die aus den oben genannten Extraktions- und Isolierungsstufen erhalten wird, vorzugsweise weiteren Reinigungsstufen unterzogen, wie weiteren Chromatographiestufen, Gelfiltration oder Chromatofokussierung, wie es auch anhand von Beispielen nachfolgend beschrieben werden wird.
Wie es oben erwähnt ist, wird das hexoseoxidaseaktive Polypeptid gemäß der Erfindung mittels rekombinanter DNA-Technologieverfahren bereitgestellt, die es erlauben, es durch Kultivieren einer geeigneten Hefewirtsorganismenzelle, die ein Gen enthält, das die Hexoseoxidase codiert, in einem Kulturmedium und Gewinnung des Enzyms aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium herzustellen.
Das Verfahren zur Herstellung von Hexoseoxidase, welches hierin bereitgestellt wird, umfaßt eine erste Stufe der Isolierung oder der Herstellung eines DNA-Fragmentes, das Hexoseoxidase codiert. Es stehen mehrere Strategien zur Bereitstellung solch eines DNA-Fragmentes zur Verfügung. So kann das DNA-Fragment als solches aus einem Organismus isoliert werden, welcher von Natur aus Hexoseoxidase produziert. Um den Ort des codierenden DNA-Fragmentes zu identifizieren, ist es erforderlich, RNA- oder DNA-Sondensequenzen vorzusehen, die unter geeigneten Bedingungen mit dem DNA-Fragment, nach welchem man sucht, hybridisieren und anschließend ein DNA-Fragment, welches die codierende Sequenz enthält, zu isolieren und es in einen geeigneten Klonierungsvektor zu klonieren.
Eine weitere geeignete Strategie, welche ausführlich in den nachfolgenden Beispielen offenbart wird, besteht darin, mRNA aus einem Organismus zu isolieren, der die Hexoseoxidase produziert, und diese mRNA als den Ausgangspunkt für die Erstellung einer cDNA-Bibliothek zu verwenden, welche dann für eine Polymerase-Kettenreaktion-(PCR-)Synthese von DNA auf der Grundlage von Oligonukleotidprimern, die auf der Grundlage von Aminosäuresequenzen der Hexoseoxidase synthetisiert sind, verwendet werden kann. Es wurde gefunden, daß solch eine Strategie zur Bereitstellung eines Hexoseoxidase codierenden DNA-Fragments geeignet ist. Beispielhaft wird solch eine Strategie, die nachfolgend ausführlich beschrieben wird, knapp beschrieben.
Synthetische Oligonukleotide wurden auf der Grundlage der HOX-2- und HOX-3-Peptidsequenzen hergestellt, die, wie es hierin nachfolgend beschrieben ist, durch endoLys-C-Verdau eines 40 kD Polypeptids von Hexoseoxidase, das aus Chondrus crispus extrahiert worden war, hergestellt worden waren. PCR unter Verwendung eines ersten Stranges cDNA als Vorlage und mit einem Sense-HOX-2-Primer und einem Anti-Sense-HOX-3-Primer produzierte ein DNA-Fragment von 407 Bp. Länge. Dieses Fragment wurde in einen E. coli-Vektor, pT7 Blue, eingesetzt und anschließend sequenziert. Es wurde gefunden, daß dieses 407 Bp. Fragment zusätzlich zu der Sequenz für die HOX-2- und HOX-3-Peptide auch einen offenen Leserahmen enthielt, der die HOX-4- und HOX-5-Peptide des oben genannten aus Chondrus crispus erhaltenen 40 kD Hexoseoxidasefragments enthielten, dessen Isolierung ebenfalls nachfolgend beschrieben ist.
Sense- und Anti-Sense-Oligonukleotide wurden auf der Grundlage des 407 Bp. Fragmentes synthetisiert, und zwei Fragmente von 800 bzw. 1400 Bp. konnten anschließend durch PCR unter Verwendung von cDNA als Vorlage isoliert werden. Die zwei Fragmente wurden in den pT7 Blue-Vektor kloniert und anschließend sequenziert. Die DNA-Sequenz des 5'-Fragmentes zeigte einen offenen Leserahmen, der das HOX-6-Peptid enthielt, welcher ebenfalls aus dem oben genannten aus Chondrus crispus erhaltenen 40 kD Hexoseoxidasefragment isoliert worden war. In gleicher Weise zeigte das 3'-Fragment einen Leserahmen, der das HOX-1 enthielt, dessen Isolierung unten beschrieben ist, und HOX-7 und HOX-8, die beide aus einem aus Chondrus crispus erhaltenen 29 kD Hexoseoxidasepolypeptid isoliert worden waren, welches durch endoLys-C-Verdau erhalten worden war, wie es auch nachfolgend beschrieben ist.
Auf der Grundlage der kombinierten DNA-Sequenzen, wie sie oben erwähnt sind, wurden ein Oligonukleotid, das dem 5'-Ende des mutmaßlichen hox-Gens entsprach, und ein Oligonukleotid, das dem 3'-Ende dieses Gens entsprach, synthetisiert. Diese zwei Oligonukleotide wurden in einer PCR unter Verwendung eines ersten Stranges cDNA als Vorlage unter Erhalt eines DNA-Fragmentes von etwa 1,8 kB eingesetzt. Dieses Fragment wurde in den oben genannten E. coli-Vektor kloniert und sequenziert. Die DNA-Sequenz war zu der kombinierten DNA-Sequenz der oben genannten 5'-Ende-, 407 Bp.- und 3'-Ende-Sequenzen identisch, und es wurde geschlußfolgert, daß diese etwa 1,8 kB lange DNA-Sequenz sowohl die 40 kD als auch die 29 kD aus Chondrus crispus erhaltenen Hexoseoxidasefragmente codiert.
Wie es für den Fachmann deutlich werden wird, kann die oben genannte Strategie zur Isolierung eines DNA-Fragments, das ein hexoseoxidaseaktives Polypeptid codiert, einschließlich der Isolierung und Charakterisierung der Hexoseoxidase, für die Herstellung solcher Hexoseoxidasen codierender Fragmente verwendet werden, die aus irgendeiner anderen natürlichen Quelle als Chondrus crispus, einschließlich der oben genannten Meeresalgenspezies, erhalten wurden, wie aus anderen Pflanzen oder aus einem Mikroorganismus.
Alternativ kann die DNA-Sequenz des das hexoseoxidaseaktive Polypeptid codierenden DNA-Fragments nach etablierten Standardverfahren synthetisch hergestellt werden, z. B. nach dem Phosphoamidit-Verfahren, beschrieben von Beaucage und Caruthers (1981), oder nach dem von Matthes et al. (1984) beschriebenen Verfahren. Nach dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide z. B. in einem automatischen DNA-Synthetisierer synthetisiert, gereinigt, annealed, ligiert und in einen geeigneten Vektor kloniert.
Darüber hinaus kann das DNA-Fragment gemäß Standardtechniken von gemischt genomischem und synthetischem, gemischt synthetischem und cDNA- oder gemischt genomischem und cDNA-Ursprung sein, hergestellt durch Ligieren von Unterfragmenten von synthetischem, genomischem oder cDNA-Ursprung, je nach Eignung, wobei die Unterfragmente verschiedenen Teilen des gesamten DNA-Fragments entsprechen.
In einer anschließenden Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung wird das isolierte oder synthetisierte DNA-Fragment, das das hexoseoxidaseaktive Polypeptid codiert, in einen geeigneten Wlrtsorganismus eingebracht, in welchem das DNA-Fragment funktionsfähig mit einem geeigneten Expressionssignal für das DNA-Fragment kombiniert ist. Solch eine Einführung kann nach Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, einschließlich der Konstruktion eines Vektors, bei dem das Fragment eingefügt ist, und Transformieren des Wirtsorganismus mit dem Vektor. Geeignete Vektoren umfassen Plasmide, die zur Replikation in dem ausgewählten Wirtsorganismus in der Lage sind. Es wird auch in Erwägung gezogen, daß das DNA-Fragment in das Chromosom des Wirtsorganismus integriert werden kann, z. B. durch Einfügen des Fragments in ein transposables Element, wie ein Transposon, und Aussetzen eines Gemisches des ausgewählten Wlrtsorganismus und des Transposons an Bedingungen, bei denen das Transposon in das Wirtsorganismenchromosom integriert und mit einem geeigneten Expressionssignal kombiniert wird.
Gemäß der Erfindung kann ein DNA-Fragment, das ein hexoseoxidaseaktives Polypeptid codiert, einschließlich des Gens für das Polypeptid, welches nach Verfahren hergestellt wird, wie sie oben beschrieben sind, oder nach irgendwelchen alternativen auf dem Gebiet bekannten Verfahren, in enzymatisch aktiver Form unter Verwendung eines Expressionsvektors exprimiert werden. Ein Expressionsvektor umfaßt üblicherweise die Bestandteile eines typischen Klonierungsvektors, d. h. ein Element, das die autonome Replikation des Vektors in dem ausgewählten Wirtsorganismus erlaubt, und einen oder mehrere phänotypische Marker zu Selektionszwecken. Ein Expressionsvektor umfaßt Kontrollsequenzen, die einen Promotor, einen Operator, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsinitiationssignal und optional ein Regressorgen oder ein oder mehrere Aktivatorgene codieren. Um die Sekretion des exprimierten Polypeptids zu ermöglichen, kann eine Signalsequenz stromaufwärts der codierenden Sequenz des Gens eingefügt werden. Im vorliegenden Kontext umfaßt der Begriff "Expressionssignal" jede der oben genannten Kontrollsequenzen, Repressor- oder Aktivatorsequenzen und Signalsequenzen. Für eine Expression unter der Steuerung von Kontrollsequenzen ist das Hexoseoxidase codierende Gen funktionsfähig mit den Kontrollsequenzen in geeigneter Art und Weise bezüglich Expression verbunden. Promotorsequenzen, die in Plasmidvektoren aufgenommen werden können und welche die Transkription des Hexoseoxidasegens unterstützen können, umfassen den tac-Promotor, von Phage Lambda abgeleitete Promotoren, einschließlich der P_L- und P_R-Promotoren, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Ein Expressionsvektor, der das DNA-Fragment der Erfindung trägt, kann jeder Vektor sein, der in der Lage ist, das Hexoseoxidasegen in dem ausgewählten Wirtsorganismus zu exprimieren, und die Auswahl des Vektors wird von der Wirtszelle abhängen, in welche er eingebracht werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit vorliegt, deren Replikation unabhängig von chromosomaler Replikation ist, z. B. ein Plasmid, ein Bakteriophage oder ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem Chromosom repliziert wird.
In dem Vektor sollte das DNA-Fragment, das das hexoseoxidaseaktive Polypeptid codiert, funktionsfähig mit einer geeigneten Promotorsequenz kombiniert sein. Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die dem gewählten Wirtsorganismus Transkriptionsaktivität verleiht, und kann aus Genen abgeleitet sein, die Proteine codieren, welche für den Wirtsorganismus entweder homolog oder heterolog sind. Beispiele für geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription des DNA-Fragments der Erfindung in einem bakteriellen Wirt sind der Promotor des lac-Operons von E. coli, die Agarasegen-dagA-Promotoren von Streptomyces coelicolor, die Promotoren des α-Amylasegens (amyL) von Bacillus licheniformis, die Promotoren des maltogenen Amylasegens (amyM) von Bacillus stearothermophilus, die Promotoren des α-Amylasegens (amyQ) von Bacillus amyloliquefaciens und die Promotoren der xylA- und xylB-Gene von Bacillus subtilis.
Für die Transkription in einer Pilzspezies sind Beispiele für geeignete Promotoren diejenigen, die von den Genen abgeleitet sind, die Pichia pastoris-Alkoholoxidase, Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei-Asparaginproteinase, neutrale α-Amylase aus Aspergillus niger, säurestabile α-Amylase aus A. niger, Glucoamylase aus A. niger, Lipase aus Rhizomucor miehei, alkalische Protease aus Aspergillus oryzae, Triosephosphatisomerase aus Aspergillus oryzae oder Acetamidase aus Aspergillus nidulans codieren. Als Beispiele für geeignete Promotoren für eine Expression in Hefespezies können die Gal 1- und Gal 10-Promotoren von Saccharomyces cerevisiae genannt werden.
Der Vektor, der das DNA-Fragment enthält, welches das hexoseoxidaseaktive Polypeptid codiert, kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in dem Wirtsorganismus ergänzt, wie eine Mutation, die einen auxotrophen Phänotyp verleiht, oder der Marker kann ein solcher sein, der Antibiotikaresistenz oder Resistenz gegen Schwermetallionen verleiht.
Der Wirtsorganismus der Erfindung, welcher entweder ein DNA-Konstrukt oder einen Expressionsvektor, wie er oben beschrieben ist, enthält, wird mit Vorteil als eine Wirtszelle bei der rekombinanten Herstellung eines Polypeptids gemäß der Erfindung verwendet. Die Zelle kann mit einem DNA-Konstrukt, welches das Gen enthält, das das Polypeptid der Erfindung codiert, transformiert sein oder es in herkömmlicher Weise durch Integration des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom enthalten. Solch eine Integration wird im allgemeinen als vorteilhaft angesehen, da es wahrscheinlicher ist, daß das DNA-Fragment stabil in der Zelle erhalten bleibt. Integration des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, wie z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination oder mittels eines transposablen Elements. Alternativ kann der Wirtsorganismus mit einem Expressionsvektor, wie er oben beschrieben ist, transformiert werden.
Ein Hefewirtsorganismus kann mit Vorteil unter einer Spezies von Saccharomyces, einschließlich Saccharomyces cerevisiae, oder einer Spezies, die zu Schizosaccharomyces gehört, ausgewählt werden. Geeignete Wirtsorganismen unter fadenförmigen Pilzen umfassen Spezies von Aspergillus, z. B. Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans oder Aspergillus niger. Alternativ können Stämme einer Fusarium-Spezies, z. B. Fusarium oxysporum, oder von einer Rhizomucor-Spezies, wie Rhizomucor miehei, als der Wirtsorganismus verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Stamm der Spezies Pichia pastoris als Wirtsorganismus verwendet.
Einige der oben genannten geeigneten Wirtsorganismen können durch ein Verfahren transformiert werden, welches eine Protoplastenherstellung und Transformation der Protoplasten, gefolgt von einer Regeneration der Zellwand in einer an sich bekannten Art und Weise umfaßt.
Für die Herstellung des hexoseoxidaseaktiven Polypeptids werden die rekombinanten Wirtsorganismuszellen, wie sie oben beschrieben sind, unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des Polypeptids in einer gewinnbaren Form führen. Das Medium, das zur Kultivierung der Zellen verwendet wird, kann jedes herkömmliche Medium sein, das zum Züchten der betreffenden Wirtszellen und zum Erzielen der Expression des Polypeptids geeignet ist. Geeignete Medien sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich oder können nach veröffentlichten Rezepten hergestellt werden.
Das resultierende Polypeptid wird typischerweise aus dem Kulturmedium mittels herkömmlicher Verfahren gewonnen, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, falls notwendig, nach Zerstörung der Zellen, gefolgt von Präzipitieren der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats, z. B. durch Zugabe eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, gefolgt von einer Reinigungsstufe.
Es ist ein industriell günstiger Gesichtspunkt der Erfindung, daß mikrobielle Kulturen, die zur Herstellung von Nahrungsmitteln oder Futterprodukten verwendet werden, als der Wirtsorganismus verwendet werden können, der das Gen exprimiert, welches das hexoseoxidaseaktive Polypeptid codiert.
Es wird auch in Erwägung gezogen, daß Hefekulturen, wie Bäckerhefe, oder Hefekulturen, die bei der Herstellung von alkoholischen Getränken, einschließlich Wein und Bier, verwendet werden, als Wirtsorganismen für das Gen, welches das hexoseoxidaseaktive Polypeptid der Erfindung codiert, verwendet werden können. Zum Beispiel wird die hergestellte Hexoseoxidase im Falle solcher rekombinanter Bäckerhefestämme eine teigverbessernde Wirkung haben, wie es nachfolgend beschrieben werden wird.
Aus dem Vorgenannten wird deutlich, daß die direkte Zugabe von rekombinanten mikrobiellen Kulturen, welche die Hexoseoxidase gemäß der Erfindung exprimieren, zu einem Nahrungsmittelprodukt oder irgendeinem anderen Produkt, wo Hexoseoxidaseaktivität erwünscht ist, als eine Alternative zu der Zugabe des isolierten Enzyms eingesetzt werden kann.
In weiteren industriell wichtigen Ausführungsformen werden die rekombinanten mikrobiellen Kulturen, die ein hexoseoxidaseaktives Polypeptid exprimieren, in einem Bioreaktor für die Herstellung des Enzyms oder für die Herstellung von Lactonen aus irgendeinem der oben genannten Kohlenhydrate, die von dem hexoseoxidaseaktiven Enzym oxidiert werden können, eingesetzt. Für diese letztgenannte Anwendung werden die Zellen der mikrobiellen Kulturen vorteilhafterweise an einem festen Träger, wie einem Polymermaterial, welches vorzugsweise die Form kleiner Teilchen hat, um eine große Oberfläche zum Binden der Zellen bereitzustellen, immobilisiert. Alternativ kann das isolierte Enzym für den oben genannten Zweck, auch vorzugsweise an ein festes Trägermaterial gebunden, eingesetzt werden. In diesem Zusammenhang kann die Bindung der Zellen oder des Enzyms durch jedes herkömmliche Verfahren für diesen Zweck bereitgestellt werden.
Bei anderen geeigneten Ausführungsformen der Erfindung kann das Polypeptid mit Hexoseoxidaseaktivität ein Fusionsprodukt sein, d. h. ein Polypeptid, welches zusätzlich zu den hexoseoxidaseaktiven Aminosäuresequenzen weiterhin Aminosäuresequenzen mit anderen brauchbaren Aktivitäten umfaßt. Somit werden Fusionspolypeptide mit einer oder mehreren Enzymaktivitäten zusätzlich zu der Hexoseoxidaseaktivität vorgeschlagen. Solche zusätzlichen Enzymaktivitäten können unter Enzymen ausgewählt sein, die in der Lage sind, Kohlenhydrate, wie Lactase, Amylasen, einschließlich Glucoamylasen, Glucanasen, Zellulasen, Hemizellulasen, Xylanasen, Lactasen oder irgendwelche anderen Oxidoreduktasen, wie Glucoseoxidase, Galactoseoxidase oder Pyranoseoxidase, oder auch unter Proteasen und Peptidasen, Lipasen oder Nukleasen, ausgewählt sein. Die zusätzliche(n) Enzymsequenz(en), die für eine Integration in ein Hexoseoxidasepolypeptid gemäß der Erfindung auszuwählen sind, ist/sind von dem Produkt, für welches das enzymatisch aktive Fusionsprodukt vorgesehen ist, abhängig. Als Beispiel wird somit vorgeschlagen, daß ein hexoseoxidaseaktives Fusionspolypeptid für die Verwendung bei der Herstellung eines Molkereiprodukts vorteilhafterweise eine Lactase, eine Protease oder eine Peptidase enthält, und daß ein Fusionspolypeptid, das zur Teigverbesserung vorgesehen ist, als Fusionspartner irgendeines der oben genannten Kohlenhydrate abbauenden Enzyme enthalten kann. Es ist auch offensichtlich, daß mikrobielle Zellen gemäß der Erfindung, wie sie oben beschrieben sind und welche ein hexoseoxidaseaktives Fusionspolypeptid mit zusätzlichen Enzymaktivitäten exprimieren, zur Inokulierung anderer Nahrungsmittelprodukte und Tierfutter in der ebenfalls oben beschriebenen Art und Weise verwendet werden können.
Es wird auch vorgeschlagen, daß ein geeigneter Fusionspartner eine Sequenz sein kann, die der Hexoseoxidase veränderte Eigenschaften, wie Löslichkeit, verleiht, oder eine Sequenz, die als eine "Markierungs"-Gruppe dienen kann, die der Hexoseoxidase die Fähigkeit verleiht, stärker oder selektiver an ein bestimmtes festes Material für die Hexoseoxidasepolypeptidreinigung oder zu Immobilisierungszwecken zu binden.
Weiterhin liegt es im Umfang der Erfindung, das Polypeptid als ein chimäres Produkt bereitzustellen, welches Teilsequenzen von hexoseoxidaseaktiven Polypeptiden enthält, die von verschiede nen Quellen hergeleitet sind und von einem DNA-Fragment codiert werden, welches durch Kombinieren von DNA-Sequenzen, die hexoseoxidaseaktives Polypeptid codieren, aus diesen verschiedenen Quellen zu einem DNA-Fragment, das das gesamte chimäre Polypeptid codiert, konstruiert ist.
In einer geeigneten Ausführungsform ist das Verfahren gemäß der Erfindung ein solches, bei dem das DNA-Fragment, welches das hexoseoxidaseaktive Polypeptid codiert, wenigstens eine DNA-Sequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz codiert, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
worin X eine Aminosäure repräsentiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val.
Wie es oben ebenfalls erwähnt ist, kann das Verfahren gemäß der Erfindung als eine weitere Stufe eine Reinigung der anfänglich aus dem Kulturmedium und/oder den Mikroorganismen gewonnenen Polypeptidpräparation umfassen. Der Zweck dieser weiteren Stufe besteht darin, eine Enzympräparation zu erhalten, in der das Hexoseoxidasepolypeptid in einer im wesentlichen reinen Form vorliegt. Der Ausdruck "im wesentlichen reine Form" bedeutet, daß die Präparation ohne irgendwelche unerwünschten kontaminierenden Substanzen ist, die aus dem Kulturmedium, den Wirtsorganismuszellen für die Herstellung oder Substanzen, die von diesen Zellen wäh rend der Kultivierung produziert werden, stammen. Somit ist es für viele Anwendungen von Bedeutung, daß die aus der Reinigungsstufe erhaltene Polypeptidpräparation im wesentlichen ohne jede nicht-hexoseoxidaseenzymatische Aktivität ist. Die Reinigungsverfahren werden von dem Reinheitsgrad, welcher erwünscht ist, abhängen, jedoch werden sie typischerweise unter herkömmlichen Proteinreinigungsverfahren ausgewählt, wie Aussalzen, Affinitäts- oder Ionenaustauschchromatographieverfahren, einschließlich hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, und Gelfiltrationsverfahren, wie dem in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Verfahren.
Wie oben erwähnt, betrifft die Erfindung in einem weiteren Gesichtspunkt ein Polypeptid in isolierter Form mit Hexoseoxidaseaktivität, welches wenigstens eine der oben genannten Aminosäuresequenzen enthält, oder Mutanten und Varianten hiervon, wie sie oben beschrieben sind. Vorzugsweise wird das Polypeptid nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Abhängig von dem Herstellungsverfahren, insbesondere dem jeweiligen Wirtsorganismus, kann das Polypeptid gemäß der Erfindung in einem variierenden Maße glycosyliert sein, oder es kann für bestimmte Zwecke mit Vorteil in einer im wesentlichen nicht glycosylierten Form exprimiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polypeptid ein solches, welches funktionale Eigenschaften besitzt, die zu denjenigen von natürlich in der Algenspezies Chondrus crispus vorkommender Hexoseoxidase, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, identisch oder teilweise identisch sind. Es wurde herausgefunden, daß solch eine Hexoseoxidase, die aus einer Algenquelle extrahiert wurde, wenn sie SDS-PAGE unterzogen wurde, wie es hierin beschrieben ist, getrennte Proteinbanden von 29, 40 und/oder 60 kD zeigen kann.
Um eine im allgemeinen kosteneffektive Verwendung des Polypeptids zu erreichen, ist es bevorzugt, daß das Enzym eine hohe enzymatische Aktivität über einen breiten pH-Wert-Bereich besitzt. Somit ist es bevorzugt, daß die Hexoseoxidase gemäß der Erfindung wenigstens eine enzymatische Aktivität bei einem pH-Wert in einem Bereich von 1–9, wie in dem Bereich von 2–9, einschließlich in dem Bereich von 5–9 zeigt. In diesem Zusammenhang wird vorgeschlagen, daß der pH-Wert-Bereich der Aktivität oder das pH-Wert-Optimum einer natürlich erhaltenen Hexoseoxidase in einer gewünschten Richtung und in einem gewünschten Ausmaß durch Modifizieren des Enzyms, wie es oben beschrieben ist, oder durch zufällige Mutagenese eines Replikons oder eines Wirtsorganismus, der die DNA enthält, welche die Hexoseoxidase codiert, gefolgt von einer Selektion von Mutanten, welche die gewünschten veränderten pH-Wert-Eigenschaften aufweisen, modifiziert werden kann. Alternativ können solche Modifikationen des Enzyms beim Verändern der Hitzetoleranz und der optimalen Temperatur für die Aktivität des hexoseoxidaseaktiven Polypeptids oder beim Verändern des isoelektrischen Punktes des Enzyms erzielt werden.
Weiterhin ist das Polypeptid gemäß der Erfindung vorzugsweise innerhalb eines breiten Temperaturbereichs, wie in einem Bereich von 10–90°C, z. B. innerhalb eines Bereichs von 15–80°C, einschließlich des Bereichs von 20–60°C, enzymatisch aktiv. Insbesondere kann es für bestimmte spezielle Zwecke bevorzugt sein, daß das hexoseoxidaseaktive Polypeptid eine signifikante enzymatische Restaktivität bei Temperaturen von 70°C oder höher behält, z. B. wenn das Enzym für eine Verwendung in Teigen vorgesehen ist, wo es nützlich sein kann, Hexoseoxidaseaktivität während wenigstens eines Teils der anschließenden Backstufe zu haben.
Der Anwendungsbereich der Hexoseoxidase hängt von dem Bereich an Kohlenhydraten ab, welche sie als Substrat verwenden kann. Obwohl die Hexoseoxidase die höchste Substratspezifität für Hexosen, wie Glucose, Galactose und Mannose, zu haben scheint, hat man herausgefunden, daß der Bereich an Kohlenhydratsubstanzen, die als Substrate für das Polypeptid gemäß der Erfindung eingesetzt werden können, nicht auf Hexosen beschränkt ist. Somit ist ein bevorzugtes Polypeptid ein solches, welches zusätzlich zu einer hohen Spezifität für Hexosen auch eine hohe Spezifität für andere Kohlenhydratsubstanzen besitzt, einschließlich Disacchariden, wie Lactose, Maltose und/oder Zellobiose, und sogar auch erhebliche Spezifität für Pentosen, einschließlich beispielsweise Xylose, oder Desoxypentosen oder Desoxyhexosen, wie Rhamnose oder Fucose. Es ist von erheblicher praktischer Bedeutung, daß die Hexoseoxidase zusätzlich zu einer hohen Spezifität für Hexosen und andere Monosaccharide auch erhebliche Spezifität für Disaccharide, insbesondere Lactose, die in Milch vorhanden ist, und Maltose, welche unter anderem in Getreidemehlen und Teigen vorkommt, besitzt.
Dementsprechend ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Polypeptid gemäß der Erfindung ein solches, welches zusätzlich zu D-Glucose wenigstens einen Zucker oxidiert, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus D-Galactose, Maltose, Zellobiose, Lactose, D-Mannose, D-Fucose und D-Xylose besteht.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat das hexoseoxidaseaktive Polypeptid einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4–5. Spezieller kann das Polypeptid vorzugsweise einen isoelektrischen Punkt von 4,3 ± 0,1 oder einen solchen von 4,5 ± 0,1 haben.
Im allgemeinen hat das Polypeptid gemäß der Erfindung typischerweise ein Molekulargewicht, wenn es durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia) bestimmt wird, das im Bereich von 100-150 kD liegt. Ein Molekulargewicht, das nach diesem oder äquivalenten Verfahren bestimmt wird, wird auch als ein scheinbares Molekulargewicht bezeichnet. Speziell kann das Polypeptid ein scheinbares Molekulargewicht von 110 kD ± 10 kD haben.
Gemäß noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, das ein DNA-Fragment umfaßt, welches ein Polypeptid mit Hexoseoxidaseaktivität codiert. Wie es oben beschrieben ist, kann solch ein DNA-Fragment aus einer natürlichen Quelle isoliert werden, oder es kann konstruiert werden, z. B. wie es ausführlich in den nachfolgenden Beispielen beschrieben ist. Darüber hinaus kann das codierende Fragment auch auf der Grundlage von Aminosäuresequenzen einer natürlich vorkommenden Hexoseoxidase synthetisiert werden. Das rekombinante Molekül kann aus irgendeinem der Expressionsvektortypen, wie sie oben erwähnt sind, ausgewählt werden. Das rekombinante DNA-Molekül umfaßt ein DNA-Fragment, das ein Hexoseoxidasepolypeptid codiert, welches wenigstens eine der oben genannten Aminosäuresequenzen (i) bis (viii) enthält. In einer speziellen Ausführungsform enthält das rekombinante DNA-Molekül die folgende DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 30):
Weiterhin stellt die Erfindung in einem weiteren Gesichtspunkt eine mikrobielle Hefezelle bereit, welche das oben genannte rekombinante DNA-Molekül enthält. Die obige allgemeine Beschreibung des Wirtsorganismus, der ein DNA-Fragment enthält, welches das Polypeptid gemäß der Erfindung codiert, umfaßt solch eine mikrobielle Zelle, und dementsprechend können solche Zellen unter jeder der oben genannten mikrobiellen Gruppen, Familien, Gattungen und Spezies ausgewählt sein, d. h. die mikrobielle Zelle kann unter einer Hefezelle, einschließlich beispielsweise einer Saccharomyces cerevisiae-Zelle und einer Pichia pastoris-Zelle ausgewählt sein.
Die mikrobielle Zelle gemäß der Erfindung kann, wenn es erwünscht ist, für eine direkte Zugabe zu einem Produkt, wo es erwünscht ist, Hexoseoxidaseaktivität zu haben, z. B. bei einem Herstellungsverfahren, in der Form einer mikrobiellen Kultur, vorzugsweise in einer Konzentratform, bereitgestellt werden. Somit kann solch eine Kultur vorteilhafterweise die mikrobielle Zelle gemäß der Erfindung in einer Konzentration enthalten, die vorzugsweise im Bereich von 10⁵–10¹² pro Gramm Kultur liegt. Die Kultur kann eine frische Kultur sein, d. h. eine nicht gefrorene Suspension der Zellen in einem flüssigen Medium, oder sie kann in der Form einer gefrorenen oder getrock neten Kultur vorliegen, z. B. als eine gefriergetrocknete Kultur. Die mikrobielle Zelle kann auch für spezielle Zwecke an einem festen Substrat immobilisiert sein.
Wie es oben erwähnt wurde, betrifft die Erfindung in einem weiteren Gesichtspunkt die Verwendung des hexoseoxidaseaktiven Polypeptids gemäß der Erfindung oder einer mikrobiellen Hefezelle, die solch ein Polypeptid exprimiert, bei der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten. In diesem Zusammenhang sollte der Begriff "Herstellen" in seinem breitesten Sinne verstanden werden, so daß er die Zugabe der Hexoseoxidase oder der mikrobiellen Hefezelle zu Zutaten für das betreffende Nahrungsmittelprodukt vor, während oder nach einem aufeinanderfolgenden Verfahrensschritt, während des Verpackens und während der Lagerung des fertigen Produkts bis hin zu seinem Verbrauch umfassen. Die Nahrungsmittelprodukte können, wo solch eine Verwendung vorteilhaft ist, alle Produkte sein, bei denen die Endprodukte der Hexoseoxidase dem Nahrungsmittelprodukt vorteilhafte Wirkungen verleihen.
Natürlich wird die gewünschte Aktivität der Hexoseoxidase nur erhalten werden, wenn Substrat für das Enzym in ausreichenden Mengen vorhanden ist. Kohlenhydrate als das Substrat können von Natur aus in dem Nahrungsmittelprodukt oder den Zutaten dafür vorhanden sein, oder sie können hinzugegeben oder während des Herstellungsverfahrens erzeugt werden. Ein Beispiel für ein Substrat, das während der Herstellung erzeugt wird, ist der enzymatische Abbau von Di-, Oligo- oder Polysacchariden zu niedrigeren Zuckerstoffen, welche von der Hexoseoxidase oxidierbar sind, was als Ergebnis von enzymatischer Aktivität von Enzymen, die von Natur aus in dem Nahrungsmittelprodukt vorhanden sind oder die während der Herstellung zugegeben werden, auftreten kann. Darüber hinaus kann Substrat für das hexoseoxidaseaktive Polypeptid als Ergebnis der enzymatischen Aktivität eines Fusionspartners, wie es oben beschrieben ist, erzeugt werden.
Die gewünschten Wirkungen von Hexoseoxidaseaktivität in einem Produkt, das Substrate für das Enzym enthält, umfassen die Erzeugung von Lactonen aus dem Zuckersubstrat, welche anschließend in entsprechende Säuren umgewandelt werden können, die Erzeugung von Wasserstoffperoxid und den Verbrauch von Sauerstoff.
Typische Beispiele von Nahrungsmittelprodukten, bei denen Hexoseoxidaseaktivität vorteilhaft sein kann, umfassen beispielsweise Molkereiprodukte, stärkehaltige Nahrungsmittelprodukte und Getränke, die keine Milchprodukte sind. Somit ist es bei der Herstellung einer Reihe von Molkereiprodukten erwünscht, den pH-Wert zu erniedrigen. Dies wird herkömmlicherweise durch Inokulieren der Milch mit milchsäureproduzierenden Starterkulturen erreicht. Wie es oben erwähnt ist, wird vorgeschlagen, daß Hexoseoxidase oder Organismen, die dieses Enzym exprimieren, als ein alternatives Mittel zum Ansäuren von Milch verwendet werden können. Die gleiche Wirkung kann in anderen Nahrungsmittelprodukten, die während der Herstellung angesäuert werden, erwünscht sein, wie in bestimmten Fleischprodukten oder Gemüseprodukten, die derzeit durch die Zugabe von Milchsäurebakterienstarterkulturen angesäuert werden.
Der aus der Aktivität der Hexoseoxidase resultierende Verbrauch von Sauerstoff hat mehrere vorteilhafte Implikationen in Bezug auf die Herstellung von Nahrungsmittelprodukten und Pharmazeutika. Indem eine Abreicherung oder Entfernung von Sauerstoff in Nahrungsmitteln oder Pharmazeutika bewirkt wird, welche Lipide enthalten, die für oxidative Verderblichkeitsprozesse anfällig sind, kann die Hexoseoxidase als ein Antioxidans wirken, und zusätzlich kann die Reduzierung des Sauerstoffgehalts verderbliche Organismen hemmen, deren Wachstum vom Vorhandensein von Sauerstoff abhängig ist und dementsprechend kann das hexoseoxidaseaktive Polypeptid auch als ein antimikrobielles Mittel wirken.
Diese letztgenannte Wirkung kann dazu verwendet werden, die Lagerfähigkeit von verpackten Nahrungsmitteln zu verlängern, wobei ein Verderben durch die Aufnahme des hexoseoxidaseaktiven Polypeptids gemäß der Erfindung entweder in das Nahrungsmittelprodukt selbst oder durch Bereitstellen eines Gemisches aus der Hexoseoxidase und einem geeigneten Substrat hierfür in der Verpackung, aber getrennt von dem Inhalt des Nahrungsmittelprodukts, verhindert wird. In einem typischen Beispiel wird solch ein Gemisch an die Innenseite eines Nahrungsmittelbehälters, wie z. B. einer Weißblechdose oder eines Glases, befestigt. Dementsprechend kann die Hexoseoxidase gemäß der Erfindung als ein sauerstoffentfernendes Mittel in einer Nahrungsmittelverpackung verwendet werden.
Es ist klar, daß die oben genannten Wirkungen des Polypeptids gemäß der Erfindung bei der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten auch bei der Herstellung von Tierfutterprodukten anwendbar sind. Insbesondere sind diese Wirkungen bei der Herstellung von Silage, die entweder aus Futterfrüchten, wie Gras oder Mais, oder aus proteinhaltigen Tierabfallprodukten aus Schlachthöfen oder fischverarbeitenden Fabriken, erwünscht. Solche Futterprodukte werden derzeit durch die Zugabe von Säuren oder säureproduzierenden Bakterien, wie Milchsäurebaktieren-Inokulierungsmitteln, siliert. Um das Wachstum von ansäuernden Bakterien zu fördern und das Wachstum von aeroben verderbenden Organismen, wie gramnegativen Bakterien und Hefen, zu verhindern, ist es wesentlich, in dem Silagematerial einen niedrigen Sauerstoffgehalt zu haben. Es wird daher in Betracht gezogen, daß die Hexoseoxidase gemäß der Erfindung als ein sauerstoffentfernendes und ansäuerndes Mittel bei der Silierung von Futter geeignet ist, optional in der Form von Zusammensetzungen, die weiterhin einen oder mehrere herkömmliche Silagezusatzstoffe, wie Milchsäurebakterien-Inokulierungsmittel oder Enzyme, welche niedermolekulare Zuckersubstanzen erzeugen, enthalten.
Eine weitere nützliche Anwendung des Hexoseoxidasepolypeptids gemäß der Erfindung ist die Verwendung des Enzyms zur Verminderung des Zuckergehalts eines Nahrungsmittelprodukts, wobei man dem Produkt eine Menge des Polypeptids oder einer mikrobiellen Zelle, die das Polypeptid produziert, hinzufügt, die ausreichend ist, um wenigstens einen Teil des anfänglich in dem Nahrungsmittelprodukt vorhandenen Zuckers zu entfernen. Solch eine Anwendung kann z. B. für die Herstellung von Diätkost für Diabetespatienten nützlich sein, wo ein niedriger Zuckergehalt erwünscht ist, und bei der Herstellung von Weinen mit einem reduzierten Alkoholgehalt. Bei dieser letztgenannten Anwendung wird die Hexoseoxidase vorzugsweise vor der Hefeinokulierung zu dem Most hinzugegeben.
Gemäß einem weiteren nützlichen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung die Verwendung des hexoseoxidaseaktiven Polypeptids oder einer mikrobiellen Hefezelle, die das Enzym gemäß der Erfindung produziert, bei der Herstellung von pharmazeutischen Produkten, Kosmetika oder Zahnpflegeprodukten, wie Zahnpasten oder Zahncremes. Die gewünschten Wirkungen der Hexoseoxidase in solchen Produkten sind im wesentlichen diejenigen, wie sie oben unter Bezugnahme auf Nahrungsmittelprodukte und Tierfutter beschrieben wurden.
Eine besonders interessante Anwendung der Hexoseoxidase gemäß der Erfindung ist ihre Verwendung als ein teigverbesserndes Mittel. Es wurde gefunden, daß die Zugabe der Hexoseoxidase zu einem Teig zu einer erhöhten Beständigkeit desselben gegen Reißen führt, wenn der Teig gedehnt wird, d. h. das Enzym verleiht dem Teig eine erhöhte Dehnung, wobei er weniger anfällig für mechanische Verformung wird. Auf der Grundlage der bekannten Wirkungen in diesem Zusammenhang für Glucoseoxidase wird vorgeschlagen, daß diese Wirkung der Zugabe der Hexoseoxidase gemäß der Erfindung zu einem Teig das Ergebnis der Bildung von Vernetzungen zwischen Thiolgruppen in schwefelhaltigen Aminosäuren in Mehlproteinen ist, welche auftreten, wenn das Wasserstoffperoxid, das von dem Enzym in dem Teig erzeugt wird, mit den Thiolgruppen reagiert, welche hierbei oxidiert werden.
Dementsprechend stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts aus einem Teig bereit, bei dem man zu dem Teig eine wirksame Menge eines Polypeptids oder einer Hefe gemäß der Erfindung, welche in der Lage ist, solch ein Polypeptid zu exprimieren, hinzugibt, und eine teigverbessernde Zusammensetzung, welche das Polypeptid oder eine Hefe, die in der Lage ist, solch ein Polypeptid in einem Teig zu exprimieren, und wenigstens einen herkömmlichen Teigbestandteil enthält. Bei brauchbaren Ausführungsformen kann solch eine Zusammensetzung weiterhin wenigstens ein den Teig oder das Bäckereiprodukt verbesserndes Enzym enthalten, das z. B. unter einer Zellulase, einer Hemizellulase, einer Pentosanase, einer Lipase, einer Xylanase, einer Amylase, einer Glucoseoxidase und einer Protease ausgewählt ist.
Gemäß noch einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Hexoseoxidase als ein analytisches Reagens in Verfahren zur Bestimmung der Konzentration jedes Zuckers, der von dem Enzym umgewandelt werden kann, in einer biologischen oder in andere Proben verwendet. Typischerweise wird der Zuckergehalt durch Bestimmung der Menge an Endprodukten, die aus der enzymatischen Umwandlung des in der zu vermessenden Probe vorhandenen Substratzuckers erhalten wird, gemessen. In diesem Zusammenhang wird vorgeschlagen, daß die Hexoseoxidase direkt als ein Reagens in einem in vitro-Analyseverfahren eingesetzt wird oder daß es in einem Sensor enthalten sein kann.
Die Erfindung wird nun erläuternd in den folgenden Beispielen (Beispiel 5 dient Vergleichszwecken) und den anhängenden Figuren beschrieben werden:
1 zeigt eine schematische Übersicht der Reinigung von Hexoseoxidase (HOX) und der zwei Strategien, die zum Erhalt von Aminosäuresequenzinformation übernommen wurden.
2 zeigt eine native, nicht-dissoziierende Polyacrylamidgelelektroforese (native PAGE) von Präparationen von Hexoseoxidase bei verschiedenen Stufen der Reinigung. Die Proben repräsentieren die Enzympräparation, erhalten nach Anionenaustauschchromatographie und Konzentrierung (Spur 1), nach Gelfiltration (Spur 2) und nach entweder Kationenaustauschchromatographie (Spur 3) oder Chromatofokussierung (Spur 4). Das Phast-Gel (Pharmacia, 8–25%-iges Gradientengel) wurde mit Silber gefärbt. Die Molekulargewichte von Standardproteinen (×10^–3) sind auf der linken Seite angegeben. Die Hexoseoxidase entsprechende Bande, welche durch einen Pfeil angezeigt ist, wurde durch parallele Enzymfärbung eines Gels (nicht dargestellt) identifiziert. Die vier Spuren wurden auf separaten Gelen laufen gelassen.
3 zeigt das UV-Profil, das während der Reinigung von Hexoseoxidase durch Gelfiltration auf Sephacryl S-200 HR, wie es im Text beschrieben ist, erhalten wird. Fraktionen, die Hexoseoxidase-(HOX-)Aktivität enthalten, sind durch den gefüllten Bereich angezeigt.
4 zeigt SDS-PAGE von Hexoseoxidase, die mittels Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose Fast Flow, Gelfiltration an Sephacryl S-200, gefolgt von entweder Kationenaustauschchromatographie an S-Sepharose Fast Flow (Spur 1) oder Chromatofokussierung an einer Mono P-Säule (Spur 2), aus Chondrus crispus gereinigt wurde. Die Molekulargewichte von Standardproteinen (×10^–3) sind auf der linken Seite angegeben. Die Polypeptide bei 60 kD, 40 kD und 29 kD sind durch Pfeile markiert. Reduzierte Proben wurden auf einem 12%-igen Polyacrylamidgel laufen gelassen, welches mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt wurde. Die zwei Spuren wurden auf separaten Gelen laufen gelassen.
5 zeigt isoelektrische Fokussierung (IEF) von Hexoseoxidase. Das Gel wurde entweder mit Coomassie Brilliant Blue R-250 (Spur 1) gefärbt oder hinsichtlich Enzymaktivität, wie es im Text beschrieben ist, gefärbt (Spur 2). Die Positionen von Markern des isoelektrischen Punktes, die parallel laufen gelassen wurden, sind auf der linken Seite gezeigt. Die zwei Spuren wurden auf separaten Gelen laufen gelassen.
6 zeigt Umkehrphasen-HPLC-Trennung von Peptiden, die durch Verdau des 40 kD HOX-Polypeptids mit Endoproteinase Lys-C erzeugt wurden. Die mit 1, 2, 3, 4 und 5 markierten Peaks wurden einer Aminosäuresequenzierung unterzogen.
7 zeigt Umkehrphasen-HPLC-Trennung von Peptiden, die durch Verdau des 29 kD HOX-Polypeptids mit Endoproteinase Lys-C erzeugt wurden. Die mit 1 und 2 markierten Peaks wurden einer Aminosäuresequenzierung unterzogen.
8 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von RNA, die in Chondrus crispus exprimiert wurde. Das denaturierende Agarosegel wurde mit 30 μg (Spur 1) bzw. 3 μg (Spur 2) Gesamt-RNA beladen. Der Pfeil auf der linken Seite zeigt hexoseoxidasespezifisches Transkript an. Die Positionen von Molekulargewichtmarkern in kB sind auf der rechten Seite gezeigt.
9 zeigt die Konstruktion des Plasmides pUPO153, welches die Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in Pichia pastoris vermittelt. Kleine Pfeile zeigen PCR-Primer an. Der graue Kasten zeigt das Hexoseoxidasegen an.
10 zeigt die Reinigung von rekombinanter Hexoseoxidase aus Pichia pastoris durch Anionenaustauschchromatographie an einer HiTrap-Q-Säule (Stufe 1). Alkoholoxidase-(AOX-)Aktivität
und Hexoseoxidase-(HOX-)Aktivität (O) in den gesammelten Fraktionen wurden untersucht, wie es in dem Text beschrieben ist.
11 zeigt die Reinigung von rekombinanter Hexoseoxidase aus Pichia pastoris durch Gelfiltration an Sephacryl S-200 HR (Stufe 2). Alkoholoxidase-(AOX-)Aktivität
und Hexoseoxidase-(HOX-)Aktivität (O) in den gesammelten Fraktionen wurden untersucht, wie es in dem Text beschrieben ist.
12 zeigt die Konstruktion des Plasmides pUPO181, welches die Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in E. coli vermittelt. Kleine Pfeile zeigen PCR-Primer an (ein grauer Kasten zeigt das Hexoseoxidasegen an).
13 zeigt SDS-PAGE von rekombinanter Hexoseoxidase, produziert in E. coli. Rohextrakte von lysierten Zellen wurden in einem 14%-igen denaturierenden Gel analysiert. Die Molekulargewichte von Standardproteinen (×10^–3) sind auf der linken Seite angezeigt. Das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt. Spur 1 zeigt einen Extrakt aus E. coli-Zellen mit pUPO181, Spur 2 zeigt eine plasmidfreie Kontrolle. Der Pfeil zeigt die Hexoseoxidasebande.
14 zeigt die Konstruktion des Plasmides pUPO155, welches die Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in Saccharomyces cerevisiae vermittelt. Kleine Pfeile zeigen PCR-Primer an. Der graue Kasten zeigt das Hexoseoxidasegen.
BEISPIEL 1
Reinigung von Hexoseoxidase aus Chondrus crispus
Eine schematische Übersicht der Reinigung und von zwei Strategien, die zum Erhalt der Aminosäuresequenzinformation für das Enzym angewendet wurden, ist in 1 gezeigt.
1.1. Sammeln, Trocknen und Zerkleinern von Chondrus crispus
Das Rotmeerkraut Chondrus crispus wurde von April bis September an der Küste in der Nähe von Grenå, Jütland, Dänemark, in einer Tiefe von 2–5 m gesammelt. Frisch gesammelte Algenblätter wurden mit kaltem Wasser gespült und während des Transports ins Labor (< 24 Stunden) auf Eis gelagert. Das Seekraut wurde dann entweder unmittelbar getrocknet oder in gefrorenem Zustand bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Für die Enzymreinigung wurde das Material bei –18°C gelagert, wogegen das Material, das für die Isolierung von mRNA vorgesehen war, in flüssigem Stickstoff gelagert wurde.
Blätter von Chondrus crispus wurden bei 4°C aufgetaut und bei Raumtemperatur (20–25°C) für 2–3 Tage luftgetrocknet. Das getrocknete Material wurde in einem handelsüblichen Waring-Mixer (Modell 34BL97, Waring, New Harford, Connecticut, USA) zu feinem Pulver zerkleinert.
1.2. Extraktion von Enzym
Etwa 500 g Chondrus crispus-Pulver wurden mit 2,5 120 mM Tris-Cl, pH 7,0, gemischt. Das in allen Extraktions- und Reinigungsverfahren verwendete Wasser wurde aus einem Milli-Q UF Plus-Laborwasserreinigungssystem (Millipore) erhalten. Der Puffer wurde auf 4°C vorgekühlt. Das Gemisch wurde für 6–8 Tage bei 4°C gehalten. Der Extrakt wurde mittels Filtration durch mehrere Lagen Gaze gesammelt.
Das Seekrautmaterial wurde wiederholten Extraktionen unterzogen, die wie die oben beschriebene erste durchgeführt wurden. Das Material wurde normalerweise nach 5–8 Extraktionen verworfen, wenn die Restaktivität auf ein fast vernachlässigbares Maß abgenommen hatte.
Das Filtrat wurde durch Zentrifugation bei 10000 × g in einem Sorvall GSA-Rotor (Sorvall Instruments) geklärt. Der Überstand wurde durch Whatman-Chromatographiepapier (chr 1) filtriert und mit Wasser bis zu einer Leitfähigkeit von 7–8 mS/cm verdünnt. Der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt. Der Extrakt war dann fertig für eine Anionenaustauschchromatographie, wie sie nachfolgend beschrieben ist.
1.3. Test von Hexoseoxidase
Das verwendete Verfahren war im wesentlichen dasjenige, wie es von Sullivan und Ikawa, 1973, beschrieben ist. Dieser Test basiert auf dem Prinzip, daß das bei der Oxidation des Zuckers in der Gegenwart von Peroxidase gebildete Wasserstoffperoxid mit der chromogenen Substanz o-Dianisidin unter Bildung eines Farbstoffs mit einer Absorption bei 402 nm reagiert.
Das Testgemisch bestand aus 1–40 μl Enzymprobe und 850 μl einer Testlösung, die 370 μl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 462 μl 0,1 M D-Glucose in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 9 μl Meerrettichperoxidase, 0,1 mg/ml in Wasser (Sigma Chemicals, Katalog Nr. P 6782, oder Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 814 393), und 9 μl o-Dianisidin-2 HCl, 3,0 mg/ml in Wasser (3,3'-Dimethoxybenzidin, Sigma Chemicals) enthielt. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 15 oder 30 Minuten wurde der Test durch Zugabe eines Tropfens 37%-iger HCl (Merck, p. a.) gestoppt. Proben von 100 μl wurden aus den Teströhrchen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (NUNC, Dänemark) überführt, und die Absorption bei 410 nm wurde auf einem Plattenlesegerät Titertek Multiskan II PLUS (Labsystems/Flow Laborstories, Finnland) gemessen. Um sicherzustellen, daß die beobachtete Aktivität auf Hexoseoxidase zurückzuführen war – und nicht auf Glucoseoxidase –, wurde der Test gelegentlich mit D-Galactose als Substrat anstelle von D-Glucose durchgeführt.
1.4. Anionenaustauschchromatographie
Diese Stufe wurde auf einem BioPilot-Chromatographiesystem (Pharmacia Biotech, Schweden), das mit einem SuperRac-Fraktionssammler (LKB-Produkter AB, Schweden) verbunden war, durchgeführt.
Diese und die folgenden Stufen in der Reinigung wurden bei Raumtemperatur (20–25°C) durchgeführt, aber der Fraktionssammler wurde in einem Kühlschrank angeordnet, so daß die gesammelten Fraktionen bei 4°C bis zum Enzymtest gelagert wurden. Die Absorption bei 280 nm und die Leitfähigkeit wurden aufgezeichnet. Der Extrakt wurde auf eine XK 50/30-Säule (Pharmacia, 5,0 × 25 cm) mit einem Bettvolumen von 500 ml, die mit DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gepackt und mit Puffer A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, equilibriert worden war, aufgebracht. Die Strömungsrate betrug 5 ml/Min. während des Probenauftrags und 10 ml/Min. während der darauffolgenden Stufen der Chromatographie. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit 1200 ml Puffer A gewaschen. Adsorbierte Proteine wurden mit 2800 ml eines Gradienten von 0%–100% Puffer B: 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5, eluiert. Fraktionen von 15 ml wurden während der Gradientenelution gesammelt.
Nach jedem chromatographischen Lauf wurde die Säule mit 500 ml 0,5 M NaOH regeneriert, mit 500 ml 1,0 M Tris-Cl, pH 7,5, neutralisiert und schließlich mit 1200 ml Puffer A equilibriert. Die gesammelten Fraktionen wurden auf Hexoseoxidaseaktivität getestet, wie es oben beschrieben ist (40 μl Probe, 30 Min. Inkubationszeit). Fraktionen von Hexoseoxidaseaktivität wurden vereinigt und bei 4°C gelagert.
1.5. Konzentrierung von Hexoseoxidaseaktivität enthaltenden Fraktionen
Mehrere Fraktionspools aus der DEAE-Sepharose-Chromatographie wurden vereinigt und durch Ultrafiltration in einem Millipore Lab Ultrafiltration Cassette System (Katalog Nr. XX420LCS0) konzentriert. Das System war mit einer Membranzelle für eine Begrenzung des nominalen Molekulargewichts von 30000 (Katalog Nr. PTTKOLCP2) ausgestattet und wurde mittels einer Peristaltikpumpe betrieben. Nach Konzentrierung bei Raumtemperatur auf etwa 50 ml wurde die Enzympräparation weiter auf 10–20 ml durch Zentrifugenultrafiltration bei 4°C in Zentriprep-Konzentratoren (Amicon, USA, nominales Ausschlußmolekulargewicht von 30000) gemäß den Anleitungen des Herstellers weiter konzentriert. Die konzentrierte Enzymlösung wurde bei 4°C gelagert.
1.6. Native Polyacrylamidgelelektroforese (PAGE)
Die Zusammensetzung der durch Ionenaustauschchromatographie und Ultrafiltration erhaltenen Hexoseoxidasepräparation wurde durch native PAGE auf einem Pharmacia Phast System analysiert, siehe 2. Die 8–25% Gradientengele wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers laufen gelassen und hinsichtlich Protein mit Silber gefärbt. Ein Kit, das die folgenden Molekulargewichtsmarker enthielt, wurde ebenfalls von Pharmacia bezogen: Thyreglobulin (669.000), Ferritin (440.000), Catalase (232.000), Lactatdehydrogenase (140.000) und Albumin (67.000).
Die Färbung auf Hexoseoxidaseaktivität wurde durchgeführt, wie es von Sock & Rohringer (1988) für Glucoseoxidase beschrieben ist. Im Prinzip wird die von Glucoseoxidase oder Hexoseoxidase katalysierte Redoxreaktion mit einer Reduktion von Tetrazoliumsalz zu gefärbtem, unlöslichem Formazan gekoppelt.
Unmittelbar nach der Elektroforese wurde das Phast-Gel in 10 ml frisch hergestellte Färbelösung eingetaucht, die folgendes enthielt: 0,1 M D-Glucose (oder D-Galactose), 85 mM Zitronensäure/Natriumphosphat, pH 6,5, 0,2 mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid ("Thiazolylblau", MTT, Sigma Chemicals, Katalog Nr. M 2128) und 0,1 mg/ml N-Methyldibenzopyracinmethylsulfatsalz ("Phenazinmethosulfat", PMS, Sigma Chemicals, Katalog Nr. P 9625). Das Gel wurde bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubiert, bis die gefärbte, blauviolette Bande deutlich sichtbar war (üblicherweise 5–90 Minuten) und wurde anschließend in 10% Essigsäure, 5% Glycerin gespült und luftgetrocknet.
Das mit Silber gefärbte Gel ist in 2, Spur 1, gezeigt. Es scheint aus 2, daß bei dieser Reinigungsstufe viele Proteine vorhanden waren. Durch Enzymfärbung wurde jedoch nur die mit einem Pfeil in 2 markierte Bande gefärbt (Ergebnisse nicht gezeigt).
1.7. Gelfiltration
Diese Stufe bei der Reinigung wurde auf einem FPLC-System (Pharmacia), ausgestattet mit einer XK26/70-Säule (2,6 × 66 cm, Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 350 ml, durchgeführt. Die Säule war mit Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) gemäß den Anleitungen des Herstellers gepackt. Der Puffer war 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5, und die Strömungsrate betrug 0,5 ml/Min. Die UV-Lichtabsorption bei 280 nm wurde aufgezeichnet. Fraktionen von 2,5 ml wurden mit einem FRAC-100 Fraktionssammler (Pharmacia) gesammelt, der in der Nähe der FPLC in einem Kühlschrank (4°C) angeordnet war. Die konzentrierte Präparation von Hexoseoxidase wurde durch Zentrifugation bei 30000 U. p. M. in einem SW60 Schwingbecherrotor (Beckman) in einer L7-Ultrazentrifuge (Beckman) für 60 Min. bei 4°C geklärt. Ein aliquoter Teil von 3,0–4,0 ml des Überstands wurde mit 5% Glycerin (Sigma Chemicals, Katalog Nr. G 7757) gemischt, durch eine Einwegfiltereinheit mit 0,22 μm Porengröße (Millipore, Katalog Nr. SLGV 025 BS) filtriert und unter Verwendung eines SA-5 Probenapplikators (Pharmacia), der mit dem Einlaß der Säule verbunden war, auf die Säule aufgebracht. Fraktionen, die Hexoseoxidaseaktivität zeigten, wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Testverfahrens identifiziert (10 μl Probe, 15 Min. Inkubationszeit) und getrennt bei –18°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
Das UV-Profil und die Elutionsposition von Hexoseoxidase ist in 3 gezeigt. Es wird aus dieser Figur deutlich, daß ein erheblicher Anteil an UV-absorbierendem Material in dieser Stufe eliminiert wurde. Elektroforetische Analyse mittels nativer PAGE und Silberfärbung (2, Spur 2) zeigten, daß nur wenige verunreinigende Bestandteile nach dieser Stufe verblieben.
1.8. Bestimmung des Molekulargewichts von nativer Hexoseoxidase durch analytische Gelfiltration
Das Molekulargewicht von nativer Hexoseoxidase wurde durch Gelfiltration an Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia) bestimmt. Säulenabmessungen, Puffer, Strömungsrate und Fraktionssammlung wurden oben beschrieben. Dextranblau zur Bestimmung des Totvolumens (v₀) der Säule und die folgenden Standardproteine zur Kalibrierung der Säule wurden von Pharmacia bezogen: Ovalbumin (43.000), Albumin (67.000), Catalase (158.000) und Aldolase (252.000). Eine Probe, die Hexoseoxidase enthielt, wurde durch DEAE-Sepharose-Chromatographie erhalten, wie es oben beschrieben ist. Auf der Grundlage der Bestimmung des Elutionsvolumens (v_e) der Standardproteine und von Hexoseoxidase wurden die entsprechenden K_av-Werte (v_e – v₀/v_t – v₀) berechnet. Schließlich wurden die K_av-Werte der Standardproteine gegen die entsprechenden log-Werte (Molekulargewicht) aufgetragen. K_av von Hexoseoxidase entsprach einem nativen Molekulargewicht von etwa 110.000. Dies stimmt gut mit Sullivan und Ikawa (1973) überein, die ein Molekulargewicht von etwa 130.000 fanden. Kerschensteiner & Klippenstein (1978) beschrieben ein Molekulargewicht von 140.000, ebenfalls bestimmt durch Gelfiltration.
1.9. Kationenaustauschchromatographie
Diese Stufe wurde auf einem SMART Mikroreinigungschromatographiesystem (Pharmacia) durchgeführt, das mit einer HR5/5-Säule (Pharmacia, 0,5 × 5 cm, Bettvolumen 1,0 ml), gepackt mit S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), ausgestattet war. Die Säule wurde in A-Puffer equilibriert: 50 mM Natriumacetat, pH 4,5 (hergestellt durch Einstellen von 50 mM Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,5 mit NaOH). Der für die Gradientenelution verwendete Puffer B enthielt 50 mM Natriumacetat, 500 mM NaCl, pH 4,5. Fraktionen aus der Gelfiltration wurden über vorgepackte Sephadex G-25 Einwegsäulen (PD-10, Pharmacia), die mit 25 mM Natriumacetat, pH 4,5, equilibriert und eluiert wurden, entsalzt. 20 ml entsalzte Probe, die aus 6 Gelfiltrationsfraktionen mit hoher Hexoseoxidaseaktivität erhalten worden waren, wurden auf die Säule aus einem 50 ml Superloop (Pharmacia) mit einer Strömungsrate von 250 μl/Min. aufgetragen. Die Säule wurde anschließend mit 4 Bettvolumen Puffer A mit der gleichen Strömungsrate gewaschen. Gebundene Proteine wurden mit einem Gradienten von Puffer A zu Puffer B über 5 ml eluiert. Fraktionen von 250 μl wurden während der Gradientenelution gesammelt und auf Hexoseoxidaseaktivität getestet, wie es oben beschrieben ist (1 μl Probe, 15 Min. Inkubationszeit), und bis zur weiteren Verwendung bei –18°C gelagert.
Die resultierende Hexoseoxidasepräparation wurde durch native PAGE und Silberfärbung analysiert (2, Spur 3). Die Hexoseoxidasebande war nun die einzige signifikante Bande, obwohl geringe Mengen an verunreinigenden Proteinen ebenfalls beobachtet wurden.
1.10. Analytische Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
Fraktionen aus der S-Sepharose-Chromatographie, die Hexoseoxidaseaktivität zeigten, wurden auch durch SDS-PAGE gemäß Laemmli (1970) analysiert. Minigele mit 12,5% Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1-Gemisch) mit einer Dicke von 0,75 mm wurden in einer Mini-Protean II-Apparatur (Bio-Rad) laufen gelassen. Die Gele wurden mit 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 10% Essigsäure, 40% Ethanol gefärbt und in 10% Essigsäure, 30% Ethanol entfärbt.
Das Ergebnis der Elektroforese ist in 4, Spur 1, gezeigt. Die gereinigte Hexoseoxidasepräparation zeigte starke Banden bei relativen Molekulargewichten von 40 kD bzw. 29 kD und schwache Banden bei 60 kD bzw. 25 kD. Darüber hinaus wurden zwei scharfe Doppelbanden bei 55 kD und 57 kD beobachtet.
1.11. SDS-PAGE, gefolgt von Blotten und Färben von Kohlenhydrat
Das Vorhandensein von Kohlenhydrat in der isolierten Hexoseoxidase wurde mit dem DIG Glycan-Detektionskit (Boehringer Mannheim) untersucht, das für die Detektion von Mikrogramm-Mengen von Zuckern in Glycokonjugaten auf Blots aufgelegt ist. Im Prinzip werden benachbarte Hydroxylgruppen in Kohlenhydraten zu Aldehyden oxidiert. Digoxigenin wird dann kovalent an die Aldehydgruppen gebunden und anschließend mit einem Anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase-Antikörperkonjugat festgestellt.
Gereinigte Hexoseoxidase aus der Kationenaustauschchromatographie wurde auf einem 12% SDS-PAGE-Gel laufen gelassen, wie es oben beschrieben ist, gemäß Standardverfahren auf Nitrozellulose geblottet und hinsichtlich Kohlenhydrat mit dem Glycan-Detektionskit gemäß den Anleitungen des Herstellers gefärbt. Keine der Hexoseoxidasebanden bei 60 kD, 40 kD, 29 kD und 25 kD wurde gefärbt. Nur die scharfe Doppelbande bei 57 kD–55 kD wurde deutlich gefärbt (Ergebnisse nicht gezeigt). Die 57 kD–55 kD-Doppelbande wurde später als eine Restkontamination identifiziert, wie es nachfolgend beschrieben ist.
Somit könnte geschlossen werden, daß keiner der Hexoseoxidasebestandteile, den man in der SDS-PAGE sieht, glycosyliert war.
1.12. Isoelektrische Fokussierung
Hexoseoxidasefraktionen aus der S-Sepharose-Chromatographie wurden vereinigt und durch Zentrifugenultrafiltration in Centricon-Konzentratoren (Amicon) konzentriert und durch isoelektrische Fokussierung (IEF) auf Isogel-Agaroseplatten, pH 3–10, gemäß den Anleitungen des Herstellers (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) analysiert. Ein Gemisch aus pl-Markern (FMC Bioproducts) wurde parallel zu den Hexoseoxidaseproben laufen gelassen. Das Gemisch bestand aus Cytochrom C (pl = 10,2), Myoglobin Haupt-/Unterbande (7,4/7,0), Carboanhydrase (6,1), β-Lactoglobulin NB (5,4/5,5), Ovalbumin (4,8), Glucoseoxidase (4,2) und Amyloglucosidase (3,6). Die Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt. Wie es in 5, Spur 1, gezeigt ist, war die gereinigte Hexoseoxidasepräparation aus zwei Varianten mit pls von 4,3 bzw. 4,5 zusammengesetzt. Gereinigte Hexoseoxidase wurde ebenfalls durch isoelektrische Fokussierung auf vorgegossenen Polyacrylamidgelen, pH 3,5–9,5 (Pharmacia, Ampholine PAG-Platten) gemäß den Anleitungen des Herstellers analysiert. Diese Gele wurden hinsichtlich Enzymaktivität durch Inkubation in einem Färbegemisch, wie es oben für native Polyacrylamidgele beschrieben ist, gefärbt. Wie es in 5, Spur 2, gezeigt ist, waren beide pl-Varianten enzymatisch aktiv.
1.13. Chromatofokussierung
Die Beobachtung mehrerer Banden in der SDS-PAGE von Hexoseoxidase, die als die letzte Stufe über S-Sepharose gereinigt worden war, legte die Vermutung nahe, daß eine oder mehrere der Banden Restkontaminationen repräsentieren könnten. Darüber hinaus lieferte die S-Sepharose-Chromatographie durchgängig niedrige Ausbeuten. Daher wurde Chromatofokussierung als eine letzte Reinigungsstufe anstelle von Kationenaustauschchromatographie auf S-Sepharose eingeführt.
Chromatofokussierung wurde auf dem SMART-Chromatographiesystem durchgeführt, das mit einer Mono P HR 5/5-Säule (0,5 × 5 cm, Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 1 ml und einem 50 ml Superloop für den Probenauftrag ausgestattet war. Der Startpuffer für die Trennung in dem Intervall zwischen pH 5,0 und 3,5 war 25 mM Piperazin, eingestellt auf pH 5,5 mit HCl. Das Eluti onsmittel war Polypuffer 74 (Pharmacia), zehnfach verdünnt mit Wasser und mit HCl auf pH 3,5 eingestellt. Die Säule wurde mit Startpuffer vorbehandelt und equilibriert, wie es vom Hersteller empfohlen wird.
Die Probenpräparation wurde in der folgenden Art und Weise durchgeführt: In einem typischen Experiment wurden die besten Fraktionen aus zwei Gelfiltrationsläufen (2 × 4 Fraktionen, 20 ml) vereinigt und durch eine Säule aus 1 ml Phenylsepharose 6 (Fast Flow, Pharmacia), die in eine Einweg-Poly-Prep-Säule (Bio-Rad) gepackt und in dem für Gelfiltration verwendeten Puffer (20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5) equilibriert worden war, hindurchgeleitet. Diese Behandlung entfernte fast vollständig restliche Mengen des roten Proteins Phycoerythrin und anderer gefärbter Substanzen, die bei dieser Ionenstärke an der Gelmatrix absorbiert wurden, und entfernte dabei Kontaminationen, die während der anderen Stufen des Reinigungsverfahrens nur teilweise entfernt wurden. Die Phenylsepharosesäule wurde nach der Verwendung verworfen. Hexoseoxidaseaktivität wurde quantitativ in dem Ausfluß gewonnen, welcher dann auf vorgepackten Einweg-Sephadex G-25-Säulen (PD-10, Pharmacia), die mit Startpuffer equilibriert und eluiert wurden, entsalzt.
Vor dem Probenauftrag wurde 1 ml Elutionsmittel auf die Säule gepumpt. Die Strömungsrate betrug 0,5 ml/Min. Nach dem Probenauftrag wurde der pH-Wert-Gradient durch Pumpen von 11 ml Elutionsmittel durch die Säule ausgebildet. Während der pH-Wert-Gradientenelution wurden 44 Fraktionen von je 250 μl gesammelt. Fraktionen, die Hexoseoxidase enthielten, wurden durch das oben beschriebene Testverfahren identifiziert (1 μl Probe, 15 Min. Inkubationszeit) und bis zur weiteren Verwendung bei –18°C gelagert.
Durch Chromatofokussierung gereinigte Hexoseoxidase wurde durch native PAGE und Silberfärbung (2, Spur 4) und durch SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (4, Spur 2) analysiert. In der nativen PAGE war die Hexoseoxidasebande die einzige signifikante Bande, und es wurden nur sehr geringe Mengen an Kontaminationen beobachtet. Durch SDS-PAGE wurde deutlich gezeigt, daß dieses Reinigungsverfahren in der Lage war, die scharfe Doppelbande bei 57 kD und 55 kD zu entfernen. Die Bande bei 25 kD, die nach S-Sepharose-Chromatographie beobachtet wurde, war nach Chromatofokussierung sehr schwach.
Zusammenfassend zeigte Hexoseoxidase, die durch DEAE-Chromatographie, Gelfiltration und Chromatofokussierung erhalten wurde, eine Bande in der nativen PAGE. In der SDS-PAGE wurden starke Banden bei 40 kD und 29 kD und eine schwache Bande bei 60 kD beobachtet.
Da die Intensität des 60 kD Bestandteils relativ zu den 40 kD und 29 kD Bestandteilen zwischen verschiedenen Präparationen des Enzyms variierte, wurde angenommen, daß die 29 kD und 40 kD Polypeptide von einer proteolytischen Verarbeitung eines Vorläufers von etwa 60 kD stammen könnten. Dies würde mit der Idee einer homodimeren Struktur des Enzyms mit einem nativen Molekulargewicht von 110.000 bis 120.000, wie man es tatsächlich durch Gelfiltration findet und wie es oben beschrieben ist, übereinstimmen. Darüber hinaus wäre diese Annahme mit den von den Kerschensteiner & Klippenstein beobachteten Ergebnissen konsistent, die ein natives Molekulargewicht von 140.000 in der Gelfiltration und ein Untereinheitsmolekulargewicht von 70.800 in der SDS-PAG fanden (Kerschensteiner & Klippenstein, 1978).
BEISPIEL 2
Erzeugung und Aminosäuresequenzanalyse von Peptidfragmenten von Hexoseoxidase
2.1. Verdau von gereinigter Hexoseoxidase mit Cyanogenbromid
Dieses Verfahren wurde durchgeführt, während Kationenaustauschchromatographie an S-Sepharose noch als die letzte Reinigungsstufe verwendet wurde.
Hexoseoxidase, die durch Reinigung an DEAE-Sepharose, Sephacryl S-200 und S-Sepharose erhalten worden war, wurde in einem flüchtigen Puffer durch Pufferaustausch an einer vorgepackten PC3.2/10 Schnellentsalzungssäule, die Sephadex G-25 Superfine (Pharmacia, 0,32 × 10 cm, Bettvolumen 0,8 ml) enthielt, welche in dem oben genannten SMART-System installiert war, überführt. Die Säule wurde mit 200 mM Ammoniumbicarbonat (BDH, AnalaR) equilibriert und eluiert. Um eine zufriedenstellende Ausbeute zu erhalten, war es notwendig, vor der Injektion 500 mM Natriumchlorid zu der Hexoseoxidase zuzugeben.
Eluierte, puffergetauschte Hexoseoxidase wurde in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verteilt und in einem Speedvac-Konzentrator (Savant Instruments) lyophilisiert. Cyanogenbromid (CNBr, Pierce), 200 μl einer 10 mg/ml Lösung in 70% v/v Ameisensäure (Promega), wurden hinzugegeben. (Reagenzien von Promega waren Bestandteil eines "Probe Design^TM Peptide Separation System", Katalog Nr. V 6030). Die Röhrchen wurden über Nacht in der Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden anschließend in dem Speedvac-Konzentrator getrocknet, in 50 μl Wasser resuspendiert und erneut getrocknet.
2.2. Trennung von Cyanogenbromidfragmenten durch hochauflösende SDS-PAGE und Elektroblotten auf Polyvinylidendifluoridmembran (PVDF)
Die durch Cyanogenbromidverdau erzeugten Peptide wurden durch hochauflösende SDS-PAGE gemäß Schägger & von Jagow (1987) getrennt. Dieses System liefert eine ausgezeichnete Tren nung von Peptiden mit niedrigem Molekulargewicht (20–250 Aminosäurereste). Das Gelsystem bestand aus einem 16,5%-igen Trenngel, einem 10%-igen Abstandshaltergel und einem 4%-igen Sammelgel, alle hergestellt unter Verwendung eines 29:1 Acrylamid/Bisacrylamid-Gemischs von Promega.
Minigele mit einer Dicke von 0,75 mm wurden in einer Mini-Protean II-Apparatur (Bio-Rad) laufen gelassen. Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) stammten von Bio-Rad. SDS stammte von United States Biochemical (ultrarein). Tris stammte von Fluka (Katalog Nr. 93350). Tricin und Natriumthioglycat stammten von Promega. Glycin (p. a.), 2-Mercaptoethanol (p. a.) und Bromphenolblau stammten von Merck und Glycerin von GIBCO BRL (ultrarein). Natriumthioglycolat, 0,1 mM, wurde unmittelbar vor der Verwendung dem Kathodenpuffer hinzugegeben, um eine chemische Blockierung der aminoterminalen Enden der Peptide während der Trennung zu verhindern. Das Gel wurde für 60 Min. bei 30 V vorlaufen gelassen, um zu ermöglichen, daß das Thioglycolat alle aminoreaktiven Substanzen ausspült.
Probenpräparation: Die getrockneten Cyanogenbromidpeptidfragmente wurden in 30 μl Gelladepuffer resuspendiert, welcher 63 mM Tris-Cl, pH 6,8, 1% SDS, 2,5% 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin und 0,0012% Bromphenolblau enthielt. Proben, die sich aufgrund des Gehalts an restlicher Ameisensäure beim Mischen gelb färbten, wurden durch Zugabe von 1–3 μl 1,0 M Tris-Base neutralisiert, bis die blaue Farbe wiederhergestellt war. Die Proben wurden durch Erhitzen bei 95°C für 5 Min. vor dem Auftragen auf das Gel denaturiert. Ein Gemisch aus Proteinmolekulargewichtsstandards im niedrigen Bereich (Promega) mit Molekulargewichten zwischen 31.000 und 2.500 wurden parallel zu den Hexoseoxidasepeptidproben laufen gelassen. Die Elektroforese wurde bei 150 V konstante Spannung durchgeführt.
Elektroforetische Überführung auf PVDF-Membran wurde in einer Mini Trans-Blot Elektroforesetransferzelle (Bio-Rad) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Drei Bögen Problott-Membran (Applied Biosystems), die auf die Größe des Gels zugeschnitten waren, wurden kurz in Methanol (Merck, p. a.) befeuchtet und anschließend in Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, pH 8,5, vorgekühlt auf 4°C) vollgesogen bis zum Zusammenbau des Blot-Sandwiches. Nach der Elektroforese wurde das Gel in Transferpuffer für 5 Min. bei 4°C inkubiert und anschließend in ein Transfersandwich eingebaut, das die folgenden Schichten hatte: eine Lage Whatman-Papier (3 MM chr), zwei Lagen Problott-Membran, das SDS-PAGE-Peptidtrenngel, die dritte Lage Problott und eine abschließende Lage Whatman-Papier. Das Sandwich wurde mit den zwei Lagen der Problott-Membran in Richtung der positiven Elektrode in der Elektrodenanordnung ausgerichtet. Die Kühleinheit wurde in der Pufferkammer montiert, bevor diese mit vorgekühltem Transferpuffer gefüllt wurde, und der Transfer wurde dann bei Raum temperatur für 60 Min. bei 100 V konstante Spannung durchgeführt. Während des Transfers stieg der Strom von etwa 270 mA auf etwa 400 mA an.
Nach dem Transfer wurde die Membran in Wasser für 1 Min. gewaschen und anschließend für 30 bis 45 Sek. in 100 ml frisch hergestellter Färbelösung, die 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad), 5% Essigsäure (Merck, p. a.) und 45% Methanol (Merck, p. a.) enthielt, gefärbt. Die Membran wurde anschließend mit drei Wechseln mit etwa 80 ml frisch hergestellter Lösung von 5% Essigsäure, 45% Methanol für jeweils 30–60 Sek. entfärbt. Die Membran wurde schließlich mit drei Wechseln mit Wasser gewaschen, um restliches Glycin zu entfernen, und anschließend luftgetrocknet. Gut aufgelöste und relativ reichlich vorhandene Banden mit Molekulargewichten von etwa 2,5 kD, 9 kD bzw. 16 kD wurden ausgeschnitten und der Aminosäureanalyse und Sequenzanalyse übergeben.
2.3. Aminosäureanalyse und Sequenzierung eines 9 kD Cyanogenbromidfragmentes von Hexoseoxidase
Eine Aminosäureanalyse wurde durch Ionenaustauschchromatographie und Nach-Säulen-Derivatisierung mit o-Phthaldialdehyd durchgeführt. Die Proben wurden bei 110°C für 20 h in 6 M HCl, 0,05% Phenol und 0,05% Dithiodipropionsäure hydrolysiert (Barkholt und Jensen, 1989). Die Peptide wurden auf einem automatisierten Protein-/Peptid-Sequenzierer von Applied Biosystems, Modell 477A, ausgestattet mit einem Online-PTH-Analysierer, Modell 120A, und einem Datenanalysesystem, sequenziert. Proteinsequenzierungsreagenzien wurden von Applied Biosystems bezogen. Aminosäureanalyse und Peptidsequenzanalyse wurden freundlicherweise von Arne L. Jensen, Institut für Proteinchemie, Universität Kopenhagen, Dänemark, durchgeführt.
Die durch Analyse des 9 kD Fragmentes identifizierte Peptidsequenz ist in Tabelle 2.1. gezeigt.
Die anfängliche Ausbeute an Phenylthiohydantoin-Tyrosin (PTH-Tyr) in Stufe 1 betrug 22 pMol. Die Aminosäurezusammensetzung des 9 kD-Fragmentes ist in Tabelle 2.2. gezeigt. Tabelle 2.1. Peptidsequenz, erhalten durch Sequenzanalyse eines 9 kD Cyanogenbromidfragmentes von Hexoseoxidase

Ursprung des sequenzierten Peptids Sequenzidentifizierung Aminosäuresequenz

HOX, 9 K CNBr-Fragment HOX-1-Peptid Y-E-P-Y-G-G-V-P-

Abkürzungen: Y = Tyr, E = Glu, P = Pro, G = Gly, V = Val

Aminosäure	Mol-%	N
Asx	16,4	14
Thr	4,8	4
Ser	4,6	4
Glx	9,9	8
Pro	8,1	7
Gly	11,2	9
Ala	4,3	4
Cys	0	0
Val	5,2	5
Met	0,2	0
Ile	3,6	3
Leu	9,3	8
Tyr	6,1	5
Phe	4,6	4
His	1,0	1
Lys	8,1	7
Arg	2,7	2
Trp	ND¹⁾	-
Gesamt	100,0	85

¹⁾ Nicht bestimmt

2.4. Präparative SDS-PAGE und Elektroblotten auf PVDF-Membran
Das folgende Verfahren wurde durchgeführt, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, von denen mit Bestimmtheit bekannt war, daß sie entweder von dem 40 kD oder dem 29 kD Polypeptid der Hexoseoxidasepräparation stammten.
Präparative SDS-PAGE-Gele wurden gemäß Laemmli (Laemmli, U. K., 1970) laufen gelassen. Minigele, die 12,5% Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1-Gemisch) enthielten, mit einer Dicke von 0,75 mm wurden in einer Mini-Protean II-Apparatur (Bio-Rad) laufen gelassen. Die Lösung aus Acrylamid (BDH, Katalog Nr. 44313) und N,N-Methylenbisacrylamid (BDH, Katalog Nr. 44300) wurden über Mischbettionenaustauscherharz (Bio-Rad, Katalog Nr. 142–6425) gelagert. Die Quellen für alle anderen Reagenzien waren die gleichen, wie sie oben beschrieben sind.
Probenpräparation: Fraktionen aus der Chromatofokussierung wurden durch Zentrifugenultrafiltration bei 4°C in Ultrafree-MC-Filtereinheiten mit NMWL 10.000 und einer Probenkapazität von 400 μl (Millipore, Katalog Nr. UFC3 LGC25) konzentriert. Der Rückstand wurde mit einem Volumen zweifach konzentriertem Gelladepuffer gemischt, welcher 125 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 5% 2-Mercaptoethanol, 20% Glycerin und 0,0025% Bromphenolblau enthielt. Proben, die sich aufgrund des Gehaltes an sauren Polypufferbestandteilen beim Mischen gelb färbten, wurden durch Zugabe von 1–3 μl 1,0 M Tris-Base neutralisiert, bis die blaue Farbe wiederhergestellt war. Die Proben wurden durch Erhitzen bei 95°C für 5 Min. denaturiert und in aliquoten Teilen von etwa 30 μl pro Spur auf das Gel aufgetragen.
Ein Gemisch aus Molekulargewichtsmarkerproteinen (Bio-Rad) mit Molekulargewichten im Bereich von 97.400 bis 14.400 wurde parallel zu den Hexoseoxidaseproben laufen gelassen. Die Elektroforese wurde bei niedrigem Strom, 10 mA pro Gel, durchgeführt, um das Risiko von thermisch induzierter chemischer Modifikation der Probenproteine zu minimieren.
Elektroforetischer Transfer auf PVDF-Membran wurde durchgeführt, wie es oben beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß eine Lage Immobilon P-Membran (Millipore, Katalog Nr. IPVH 15150) anstelle von drei Lagen Problott verwendet wurde. Das Sandwich wurde mit der Blotmembran in Richtung der positiven Elektrode in der Elektrodenanordnung ausgerichtet.
Nach dem Transfer wurde die Immobilon P-Membran in Wasser für 10 Sek. gespült und anschließend für 45–60 Sek. in 100 ml frisch hergestellter Färbelösung gefärbt, welche 0,025% Coomassie Brilliant Blue R-250, 5% Essigsäure und 40% Methanol enthielt. Die Membran wurde anschließend für 2–3 Min. in 250 ml frisch hergestellter Lösung mit 5% Essigsäure, 30% Ethanol (96% v/v, Danisco, Dänemark) entfärbt. Die Membran wurde schließlich luftgetrocknet und bei 4°C gelagert.
Das Bandenmuster auf dem Blot war identisch zu dem Muster, das man in der analytischen SDS-PAGE nach abschließender Reinigung durch Chromatofokussierung gesehen hat. Es zeigte starke Banden bei 40 kD und 29 kD, zusätzlich zu einer schwachen Bande bei 60 kD.
Banden bei 40 kD und 29 kD wurden aus dem Blot ausgeschnitten und für die Aminosäureanalyse und für enzymatischen Verdau der an die Membran gebundenen Polypeptide verwendet, wie es unten beschrieben ist. Die Menge an 60 kD Material war zu gering, um eine weitere Analyse dieses Polypeptids zu ermöglichen.
2.5. Aminosäureanalyse von 40 kD und 29 kD Polypeptiden von Hexoseoxidase

Die Aminosäurezusammensetzungen der 40 kD und 29 kD Bestandteile von Hexoseoxidase sind in Tabelle 2.3. gezeigt. Tabelle 2.3. Aminosäurezusammensetzung der 40 kD und 29 kD Polypeptide von Hexoseoxidase

Aminosäure	Mol-%
	40 K	29 K
Asx	11,5	12,5
Thr	5,9	5,2
Ser	6,1	4,7
Glu	9,7	15,1
Pro	5,2	5,4
Gly	13,6	9,7
Ala	6,6	6,4
Cys	1,1	0,9
Val	7,3	5,5
Met	1,5	2,3
Ile	3,7	4,4
Leu	8,5	8,6
Tyr	4,2	5,3
Phe	5,5	4,1
His	2,2	1,4
Lys	3,9	6,1
Arg	3,5	2,4
Trp	ND¹⁾	ND¹⁾
Gesamt	100,0	100,0

¹⁾ Nichtbestimmt

2.6. Enzymatischer Verdau von PVDF-gebundenen Hexoseoxidasepolypeptiden
Verdau von an PVDF gebundenen Hexoseoxidasepolypeptiden und Extraktion der resultierenden proteolytischen Peptide wurde durchgeführt, wie es von Fernandez et al. (1992) und Fernandez et al. (1994) beschrieben ist.
Verdau des 40 kD Polypeptids von Hexoseoxidase: Elf 40 K Banden mit einem geschätzten Gesamtproteingehalt von etwa 5 μg (was etwa 125 pmol entspricht) wurden aus der mit Coomassie Blue gefärbten PVDF-Membran ausgeschnitten, in Ethanol für 1–2 Min. entfärbt und in Wasser für 2–3 Min. gespült. Die Membranbanden wurden dann in 1 × 1 mm große Stücke gewürfelt und in Mlkrozentrifugenröhrchen überführt. Ein leerer Bereich von PVDF-Membran diente als Hintergrundkontrolle. Die gewürfelten Membranstücke wurden in 50 μl Verdaupuffer vollgesogen, welcher 1% (v/v) hydriertes Triton X-100 (RTX-100, Sigma Chemicals, Katalog Nr. X-100R-PC, oder Calbiochem, Proteingrad, Katalog Nr. 648464), 10% Acetonitril (Merck, Gradientengrad Lichrosolv) und 100 mM Tris-Cl, pH 8,0, enthielt. Das für den Verdau ausgewählte proteolytische Enzym war Endoproteinase Lys-C (endoLys-C), welches Peptidketten auf der C-terminalen Seite von Lysinresten spaltet. Ein aliquoter Teil von 5 μg von endoLys-C (Boehringer Mannheim, Sequenziergrad, Katalog Nr. 1047 825) wurde durch Zugabe von 20 μl Wasser rekonstituiert. 2 μl Enzymlösung, entsprechend 0,5 μg, wurden hinzugegeben (Enzym:Substrat-Verhältnis 1:10). Der Verdau wurde bei 37°C für 22–24 Stunden durchgeführt.
Nach dem Verdau wurden die Proben in einem Ultraschallbehälter (Elma transonic) für 5 Min. sonifiziert und bei 1700 U. p. M. in einer Mikrozentrifuge für 5 Min. zentrifugiert, und der Überstand wurde anschließend in ein neues Röhrchen überführt. Aufeinanderfolgende Waschschritte mit 50 μl Verdaupuffer und 100 μl 0,1% Trifluoressigsäure (TFA, Pierce, Katalog Nr. 28902) wurden mit Sonifizierung und Zentrifugation, wie es oben beschrieben ist, durchgeführt. Alle Überstände wurden vereinigt, was zu einem Extraktvolumen von 200 μl führte. Die Extrakte wurden bis zur Peptidreinigung bei –18°C gehalten. Verdau des 29 kD Polypeptids von Hexoseoxidase wurde durchgeführt, wie es für die 40 kD Komponente beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß vier Banden mit einem Gesamtproteingehalt von 2,4 μg (etwa 80 pmol), gemäß Aminosäureanalyse, verwendet wurden.
2.7. Reinigung von mit endoLys-C erzeugten Peptiden
Die durch Verdau von 40 kD und 29 kD Polypeptiden von Hexoseoxidase erhaltenen Peptidfragmente wurden auf dem SMART-Chromatographiesystem getrennt. Das System war mit einem μPeak-Monitor mit variabler Wellenlänge und einer Fraktionssammlerschale für 60 Gefäße ausgestattet. Die für die Trennung verwendete Umkehrphasensäule war eine auf Siliciumoxid basierende μRPC C2/C18 SC2.1/10 Narrowbore-Säule (Pharmacia, Säulenabmessungen 2,1 × 100 mm, Teilchengröße 3 μm, durchschnittliche Porengröße 125 Å). Die Puffer waren A: 0,1% TFA (Pierce) in Milli-Q-Wasser, und B: 0,1% TFA in Acetonitril (Merck, Gradientengrad Lichrosolv). Die Puffer wurden filtriert und durch Vakuumfiltration über einen 0,5 μm Fluoropore-Filter (Millipore, Katalog Nr. FHLP 04700) entgast. Die Strömungsrate betrug 100 μl/Min. Die UV-Lichtabsorption in dem Ausfluß wurde bei 220 nm, 254 nm und 280 nm aufgezeichnet. Der Gra dient war 0–30% B (0–65 Min.), 30–60% B (65–95 Min.) und 60–80% B (95–105 Min.). Die Säule wurde anschließend bei 80% B für 10 Min. mit 100 μl/Min. gewaschen und in A-Puffer für 45 Min. mit 200 μl/Min. reequilibriert. Fraktionen von je 50 μl wurden zwischen t = 15 Min. und t = 105 Min. (3 × 60 Fraktionen) gesammelt und bei –18°C bis zur Aminosäuresequenzanalyse gelagert.
Die nach dem endoLys-C-Verdau des 40 kD Polypeptids erhaltene Peptidkarte ist in 6 gezeigt. Wie man in dieser Figur sieht, führten der Verdau und die HPLC-Trennung zu mehreren gut aufgelösten Peaks mit einem hohen Signal-zu-Rauschen-Verhältnis. Ein entsprechendes Chromatogramm eines Kontrollverdaugemischs (nicht dargestellt) zeigte, daß die Peaks, die später als t = 83 Min. eluierten, nichtpeptidische, von Reagens herrührende Peaks, möglicherweise UV-Licht absorbierende Kontaminationen des hydrierten Triton X-100 oder Restspuren von Coomassie-Farbstoff waren. Die in 6 mit 1–5 markierten Peaks wurden für die Aminosäuresequenzierung nach den folgenden Kriterien ausgewählt: 1) Peakhöhe; 2) offensichtliche Reinheit; 3) hohes A₂₈₀:A₂₂₀- und/oder hohes A₂₅₄:A₂₂₀-Verhältnis, welches das Vorhandensein von aromatischen AMinosäureresten anzeigte, die aufgrund ihrer geringen Degenerierung des genetischen Codes besonders geeignet für die Auswahl von PCR-Primersequenzen sind; 4) später Elutionszeitpunkt, welcher ein relativ langes Peptid anzeigen kann.
Das Chromatogramm des 29 kD endoLys-C-Peptids ist in 7 gezeigt. Offensichtlich lieferte diese Hexoseoxidasekomponente nur wenige signifikante Peptidfragmente im Vergleich zu der 40 kD Komponente in 6. Beim Vergleich der Chromatogramme gab es kein Anzeichen für irgendein Peptidfragment, das in beiden Verdauen vorhanden war. Dieses Ergebnis legt nahe, daß die 40 K und 29 K Hexoseoxidasekomponenten keine gemeinsamen Aminosäuresequenzen besitzen, was der Fall gewesen wäre, wenn die 29 kD Kette durch proteolytische Umwandlung des 40 kD Polypeptids erzeugt worden wäre. (Verglichen mit dem 40 kD Verdau, enthielt der 29 kD Verdau nur geringe Mengen der kontaminierenden Substanzen, die später als t = 83 Min. eluierten. Der Grund dafür kann sein, daß hydriertes Triton X-100 von Calbiochem für den 29 kD Verdau verwendet wurde, wogegen der 40 kD Verdau mit Triton X-100 von Sigma Chemicals durchgeführt wurde.)
Fraktionen, die den in der 29 kD Peptidkarte (7) mit 1 und 2 markierten Peaks entsprachen, wurden der Aminosäuresequenzierung unterzogen.
2.8. Aminosäuresequenzanalyse von proteolytisch erzeugten Peptiden von Hexoseoxidase

Die Peptidsequenzen, die durch Analyse von Fraktionen identifiziert wurden, welche den Peaks 1–5 in 6 (HOX-2-, HOX-3-, HOX-4-, HOX-5- und HOX-6-Peiltide) und den Peaks 1–2 in 7 (HOX-7- und HOX-8-Peptide) entsprechen, sind in der nachfolgenden Tabelle 2.4. gezeigt. Die anfänglichen Ausbeuten von PTH-Aminosäuren lagen im Bereich von 46 pmol für PTH-Tyr bei Stufe 1 in dem HOX-5-Peptid bis 6 pmol für PTH-Ile bei Stufe 2 in dem HOX-8-Peptid. Wie es von der Absorption bei 254 nm bzw. 280 nm der ausgewählten Peaks erwartet wurde, enthielten alle sequenzierten Peptide wenigstens einen aromatischen Aminosäurerest. Tabelle 2.4. Peptidsequenzen, erhalten durch Sequenzanalyse von Endoproteinase Lys-C-Peptiden, die aus 40 kD und 29 kD Polypeptiden von Hexoseoxidase erhalten wurden

Ursprung des sequenzierten Peptids	Sequenzidentifizierung	Aminosäuresequenz
40 K, Peak 1	HOX-2-Peptid	A-I-I-N-V-T-G-L-V-E-S-G-Y-D-X¹⁾-X²⁾-X³⁾-G-Y-X-V-S-S-
40 K, Peak 2	HOX-3-Peptid	D-L-P-M-S-P-R-G-V-I-A-S-N-L-W-F-
40 K, Peak 3	HOX-4-Peptid	D-S-E-G-N-D-G-E-L-F-X-A-(H)-T-
40 K, Peak 4	HOX-5-Peptid	V-Y-F-K
40 K, Peak 5	HOX-6-Peptid	D-P-G-Y-I-V-I-D-V-N-A-G-T-P-D-
29 K, Peak 1	HOX-7-Peptid	L-Q-Y-Q-T-Y-W-Q-(E)-(E)-(D)-
29 K, Peak 2	HOX-8-Peptid	X-I-(R)-D-F-Y-E-E-M-

Vorläufig identifizierte Reste sind in Klammern angegeben.

1) Rest Nr. 15 wurde als entweder Asp oder Asn identifiziert.
2) Rest Nr. 16 wurde als entweder Asp oder Ala identifiziert.
3) Rest Nr. 17 wurde als entweder Arg oder Trp identifiziert.
HOX-2-Peptid = SEQ ID NO: 9
HOX-3-Peptid = SEQ ID NO: 10
HOX-4-Peptid = SEQ ID NO: 11
HOX-5-Peptid = SEQ ID NO: 12
HOX-6-Peptid = SEQ ID NO: 13
HOX-7-Peptid = SEQ ID NO: 14
HOX-8-Peptid = SEQ ID NO: 15

BEISPIEL 3
Isolierung des Hexoseoxidasegens aus Chondrus crispus
3.1. Reinigung von RNA aus Chondrus crispus
Frisch gesammelte Blätter von Chondrus crispus wurden mit kaltem Wasser gespült und unmittelbar in flüssigem Stickstoff bis zur weiteren Verwendung gelagert. Etwa 15 g Chondrus crispus-Thallus, der in flüssigem Stickstoff eingefroren war, wurden in einem Mörser zu einem feinen Pulver homogenisiert. Das gefrorene, homogenisierte Material wurde in ein 50 ml Röhrchen (NUNC, Katalog Nr. 339497), das 15 ml Extraktionspuffer (8 M Guanidinhydrochlorid, 20 ml mM 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES), pH 7,0, 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 50 mM β-Mercaptoethanol) enthielt, überführt.
Das Röhrchen wurde gevortext und während der folgenden Stufen kalt (0°C) gehalten, wenn nicht andere Temperaturen angegeben sind. Anschließend wurde das Röhrchen für 20 Minuten bei 6000 × g in einer Heraeus-Omnifuge 2.0 RS zentrifugiert, und der RNA enthaltende Überstand (etwa 15 ml) wurde sorgfältig gesammelt und in ein vorgekühltes 50 ml Röhrchen überführt. 1,5 ml 2 M Natriumacetat, pH 4,25, 15 ml mit Wasser gesättigtes Phenol und 3 ml Chloroform:Isoamylalkohol (49:1) wurden zu dem Röhrchen, das den RNA-Extrakt enthielt, hinzugegeben.
Das Röhrchen wurde anschließend intensiv für 1/2 Min. gevortext, und die Phasen wurden durch Zentrifugieren des Röhrchens für 20 Min. in einer Omnifuge bei 6000 × g getrennt. Die wäßrige Phase (etwa 17 ml) wurde in ein 30 ml Corex-Röhrchen (Sorvall, Katalog Nr. 00156) überführt und ein gleiches Volumen (d. h. etwa 17 ml) kalter Isopropanol hinzugegeben. Das Röhrchen wurde wieder gevortext und für wenigstens 1 h bei –20°C inkubiert. Die präzipitierte RNA wurde durch Zentrifugation für 20 Min. bei 10000 U. p. M. unter Verwendung einer Sorvall RC-5B Zentrifuge, die mit einem vorgekühlten SS34-Rotor ausgestattet war, pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, und die pelletierte RNA wurde in 4 ml 0,3 M Natriumacetat, pH 5,5, resuspendiert, und 12 ml 96%-iger Ethanol wurden hinzugegeben.
Das Corex-Röhrchen wurde anschließend gevortext und wieder für wenigstens 1 h bei –20°C inkubiert, gefolgt von einer zweiten Pelletierung von RNA durch Zentrifugation für 20 Min., wie es oben beschrieben ist. Der Überstand wurde vorsichtig verworfen und das RNA-Pellet in 2 ml 0,15 M Natriumacetat, pH 5,5, resuspendiert. Anschließend wurden 8 ml 4 M Natriumacetat, pH 5,5, hinzugegeben, und die RNA wurde auf Eis für 30 Min. präzipitiert und wieder pelletiert, wie es oben beschrieben ist. Das RNA-Pellet wurde in 70% Ethanol gewaschen und in 500 μl Wasser resuspendiert. Die resuspendierte RNA wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Die Reinheit und Konzentration der RNA wurden durch Agarosegelelektroforese und durch Absorptionsmessungen bei 260 nm und 280 nm, wie es in Sambrook et al. (1989) beschrieben ist, analysiert.
3.2. Isolierung von poly-adenylierter RNA aus Chondrus crispus
Poly-adenylierte RNA wurde aus Gesamt-RNA isoliert, wobei magnetische Perlen verwendet wurden, die Oligo-dT enthielten (Dynabeads^® Oligo (dT)₂₅ in einem mRNA Purification Kit^TM, Dynal). Etwa 100 μg Gesamt-RNA wurden mit 1 mg Dynabeads^® Oligo (dT)₂₅ gemischt, und poly-adenylierte RNA wurde isoliert, wie es in dem Protokoll für das mRNA Purification Kit^TM beschrieben ist. Die Ausbeute an poly-adenylierter RNA, die mit Dynabeads^® isoliert wurde, betrug zwischen 1 und 3%.
Es wurden auch andere Verfahren zur Isolierung von poly-adenylierter RNA aus Chondrus crispus verwendet, einschließlich der Verwendung von Säulen, die mit Oligo-(dT)-Zellulose (Clontech, Katalog Nr. 8832–2) gepackt waren, oder vorgepackten Säulen (mRNA Separator Kit^TM Clontech, Katalog Nr. K1040-1), wie es in dem Protokoll für das mRNA Separator Kit^TM beschrieben ist. Die Ausbeute an poly-adenylierter RNA, die über Oligo-(dT)-Säulen isoliert wurde, betrug zwischen 0,1 und 1% der anfänglichen Gesamt-RNA. Poly-adenylierte RNA, die über Oligo-(dT)-Säulen isoliert worden war, wurde in cDNA-Synthesereaktionen eingesetzt, wie es nachfolgend (3.4) beschrieben ist, aber die Ausbeute an Erststrang-cDNA war sehr gering (weniger als 1%).
Der Grund für die niedrigere Ausbeute und die schlechtere Leistung von RNA, die über Oligo-(dT)-Säulen isoliert worden war, im Vergleich zu über Dynabeads^® gereinigter RNA könnte das Vorhandensein von Kohlenhydraten oder Proteoglycanen in dem Extrakt der Gesamt-RNA gewesen sein. Von Kohlenhydraten, die Gesamt-RNA-Präparationen verunreinigen, wurde gezeigt, daß sie die Reinigung von poly-adenylierter RNA behindern und cDNA-Synthese hemmen, und daher wurden Verfahren für die Reinigung von RNA, die frei von Kohlenhydraten ist, entwickelt (Groppe et al., 1993; Yeh et al.). Jedoch war poly-adenylierte RNA, die mit diesem Verfahren gereinigt worden war, nicht so wirksam in cDNA-Synthesereaktionen wie RNA, die mit Dynabeads^® isoliert worden war. Dementsprechend wurde poly-adenylierte RNA, die unter Verwendung von Dynabeads^® gereinigt worden war, als Vorlage in Erststrang-cDNA-Synthesereaktionen verwendet (siehe 3.4 unten).
3.3. Hexoseoxidasespezifische Oligonukleotide
Synthetische Oligonukleotide wurden auf der Grundlage der von Hexoseoxidasepeptiden HOX-2, HOX-3 und HOX-4 abgeleiteten Aminosäuresequenzen (Tabelle 2.4) synthetisiert (DNA-Technologie, ApS, Forskerparken, DK-8000 Aarhus C, Dänemark). Tabelle 3.1 zeigt die Oligonukleotide und ihre entsprechenden Aminosäuresequenzen. Ebenfalls in Tabelle 3.1 gezeigt ist die DNA-Sequenz der bei der DNA-Sequenzierung oder in der PCR verwendeten Primer. Tabelle 3.1. Nukleotidsequenzen von synthetischen Oligonukleotiden, die für Hexoseoxidase spezifisch sind
Wenn Y gleich C oder T ist, dann ist R gleich A oder G; wenn W gleich A oder T ist, dann ist S gleich C oder G; wenn D gleich A, G oder T ist, dann ist N gleich A, C, G oder T und I = Desoxyinosin.

HOX-2 = SEQ ID NO: 9
HOX2-3+ = SEQ ID NO: 16
HOX-3 = SEQ ID NO: 10
HOX3-2- = SEQ ID NO: 17
HOX-4 = SEQ ID NO: 11
HOX4-1+ = SEQ ID NO: 18
HOX4-2- = SEQ ID NO: 19
HOR5+ = SEQ ID NO: 20
HOR5- = SEQ ID NO: 21
HOX6+ = SEQ ID NO: 22
HOX7- = SEQ ID NO: 23
HOR8- = SEQ ID NO: 24
HOX10- = SEQ ID NO: 25
HOX11+ = SEQ ID NO: 26
HOX12- = SEQ ID NO: 27
HOX13- = SEQ ID NO: 28
HOR5'-1 = SEQ ID NO: 29

3.4. cDNA-Synthese und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Poly-adenylierte RNA wurde als Vorlage in Erststrang-cDNA-Synthesereaktionen mit handelsüblich erhältlichen Kits eingesetzt. Etwa 1 μg poly-adenylierte RNA wurde revers transkribiert, wie es in dem Protokoll für das Marathon^TM cDNA-Vervielfältigungskit (Clontech, Katalog Nr. K1802-1) beschrieben ist, mit HOX3-2- oder HOX4-2- als Primer. Bei der anschließenden PCR-Vervielfältigung wurde der Anker- oder Adapterprimer des Kits zusätzlich zu den hexoseoxidasespezifischen Primern HOX3-2- bzw. HOX4-2- verwendet. Die verwendeten Puffer und die Bedingungen für die Vervielfältigung waren im wesentlichen diejenigen, wie sie in dem Protokoll für das Marathon^TM cDNA-Vervielfältigungskit beschrieben sind. PCR-Vervielfältigung wurde mit AmpliTaq (Perkin-Elmer-Cetus) unter Verwendung eines Perkin-Elmer Thermalcycler 480^TM, der auf 30 Zyklen von 1 Min. bei 94°C, 2 Min. bei 55°C und 2 Min. bei 72°C programmiert war, durchgeführt. Gelelektroforese von 5 μl des Reaktionsgemisches in einem 1%-igen Agarosegel (SeaPlaque^® GTG, FMC) zeigte DNA-Fragmente mit ungefähren Größen von 600 Basenpaaren (Bp) mit dem Primer HOX4-2- und von 700 Bp mit dem Primer HOX3-2-.
Diese DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel unter Verwendung eines handelsüblich erhältlichen Kits (QIAEX^TM Gelextraktionskit, Katalog Nr. 20020, QIAGEN) gereinigt, und etwa 100 ng Fragment wurden mit 50 ng Plasmid pT7 Blue ligiert, wie es in dem Protokoll für das pT7 Blue T-Vektorkit (Novagen, Katalog Nr. 69829-1) beschrieben ist. Escherichia coli DH5α (Life Technologies, Katalog Nr. 530-8258SA) oder E. coli NovaBlue (Novagen) wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert, und weiße, rekombinante Kolonien wurden weiter analysiert.
Plasmid-DNA aus solchen Kolonien wurde unter Verwendung eines QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Katalog Nr. 12143) gereinigt und DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung von Sequenase (Sequenase Version 2.0 DNA-Sequenzierungskit, USB) unterzogen. DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden Acrylamidgelelektroforese (Sequencing Gel-Mix^®6, Life Technologies) unterzogen. DNA-Sequenzanalyse des 700 Bp Fragmentes zeigte einen offenen Leserahmen mit einer Codierungskapazität von 234 Aminosäuren.
Die nachfolgende Tabelle 3.2. zeigt, daß alle Peptidsequenzen aus dem 40 kD Polypeptid, d. h. HOX-2, HOX-3, HOX-4, HOX-5 und HOX-6, in der 234 Aminosäuren langen Sequenz, die von diesem offenen Leserahmen abgeleitet sind, gefunden wurden. Daher wurde geschlossen, daß das 700 Bp Fragment einen Teil des Hexoseoxidasegens codiert. Es wurde gezeigt, daß die DNA-Sequenz des 600 Bp Fragments mit den Proximalen 600 Bp des 700 Bp Fragments identisch ist (siehe Tabelle 3.2.).
Die Primer HOX2-3+ und HOX3-2- wurden in gleicher Weise in cDNA-Synthese- und PCR-Vervielfältigungsexperimenten eingesetzt. Etwa 50 ng poly-adenylierte RNA wurde revers transkribiert mit HOX3-2- als Primer, wie es in dem Protokoll für das 3'-Amplifinder^TM RACE Kit (Clontech, Katalog Nr. K1801-1) beschrieben ist. In der anschließenden PCR-Vervielfältigung wurden die Primer HOX2-3+ und HOX3-2- verwendet. Die verwendeten Puffer und die Bedingungen für die Vervielfältigung waren im wesentlichen diejenigen, wie sie für AmpliTaq Polymerase (Perkin-Elmer-Cetus) und in dem Protokoll für das 3'-Amplifinder^TM RACE Kit beschrieben sind. Gelelektroforese von 5 μl des PCR-Vervielfältigungsgemischs zeigte ein Fragment mit einer Größe von 407 Bp.
Dieses Fragment wurde gereinigt, in das Plasmid pT7 Blue eingesetzt und sequenziert, wie es oben beschrieben ist. Es wurde gezeigt, daß die DNA-Sequenz dieses Fragments mit den distalen 407 Bp des 700 Bp Fragments identisch ist.
Die DNA-Sequenz stromabwärts der 700 und 407 Bp Fragmente wurde mit dem 3'-Amplifinder^TM RACE Kit (Clontech) unter Verwendung der Ankerprimer des Kits als 3'-Primer und der hexoseoxidasespezifischen Primer HOX5+ und HOX4+ als genspezifische 5'-Primer vervielfältigt. Die Puffer und die Bedingungen für die Vervielfältigung waren diejenigen, wie sie oben beschrieben sind. PCR und Analyse des Reaktionsgemisches auf Agarosegelen zeigten ein Fragment mit der Größe von etwa 1,3 kB. Das Fragment wurde isoliert und DNA-Sequenzanalyse unterzogen, wie es oben beschrieben ist. Die DNA-Sequenz dieses 1,3 kB Fragmentes zeigte einen offenen Leserahmen von 357 Aminosäuren. Dieser 357 Aminosäuren lange Leserahmen enthielt die Aminosäuresequenzen der Peptide HOX-1, HOX-3, HOX-4, HOX-5, HOX-7 und HOX-8. Daher wurde geschlossen, daß das 1,3 kB DNA-Fragment das 9 kD CNBr-Fragment, das 29 kD Polypeptid und einen Teil des 40 kD Polypeptids von Hexoseoxidase codiert.
Ein Primer, der für das 5'-Ende von Hexoseoxidase spezifisch war, HOX5'-1, wurde zusammen mit einem Oligo-(dT)-Primer eingesetzt, um den angenommenen gesamten offenen Leserahmen von Hexoseoxidase zu vervielfältigen. Das Gen wurde unter Verwendung von PCR vervielfältigt, in pT7 Blue eingesetzt und sequenziert, wie es oben beschrieben ist. Die DNA-Sequenz dieses 1,8 kB Fragmentes war identisch zu den DNA-Sequenzen der Fragmente, die oben beschrieben sind, mit geringfügigen Unterschieden. Da diese Unterschiede durch Fehleinbauten während der PCR-Vervielfältigungen verursacht worden sein konnten, wurde das gesamte Hexoseoxidasegen vervielfältigt und aus wenigstens drei unabhängigen PCR-Vervielfältigungen isoliert. Daher ist die DNA-Sequenz, die in der nachfolgenden Tabelle 3.2. wiedergegeben ist, aus wenigstens drei unabhängig erhaltenen DNA-Sequenzen zusammengesetzt, um PCR-Fehler in der Sequenz auszuschließen.
Von der Aminosäuresequenz, die von dem offenen Leserahmen der oben genannten 1,8 kB DNA-Sequenz abgeleitet ist, ist gezeigt, daß sie alle der oben genannten HOX-Peptide enthält, d. h. HOX-1 bis HOX-8. Dementsprechend codiert die 1,8 kB DNA-Sequenz die oben genannten 9 kD, 29 kD und 40 kD von Chondrus crispus abgeleiteten Hexoseoxidasefragmente. Das Molekulargewicht dieses abgeleiteten Polypeptids des offenen Leserahmens stimmt mit der Annahme überein, daß das Polypeptid eine Untereinheit (möglicherweise ein monomeres Fragment) eines dimeren Hexoseoxidaseenzymmoleküls ist.
3.5. Northern-Blot-Analyse von Chondrus crispus-RNA
Aus Chondrus crispus isolierte Gesamt-RNA wurde Northern-Blot-Analyse unterzogen. Die RNA wurde gereinigt, wie es oben (3.1) beschrieben ist, und auf einem denaturierenden Formaldehyd-Agarosegel fraktioniert und auf einen HybondC-Filter (Amersham) geblottet, wie es von Sambrook et al. (1989) beschrieben ist. Unter Verwendung der Primer HOX2-3+ und HOX3-2- wurde ein 400 Bp DNA-Fragment durch PCR synthetisiert, wie es oben (3.4) beschrieben ist. Dieses Fragment wurde aus einem 1,2%-igen Agarosegel (SeaPlaque^® GTG, FMC) gereinigt und mit ³²P markiert, wie es von Sambrook et al. (oben) beschrieben ist. Diese radioaktive, hexoseoxidasespezifische Hybridisierungssonde wurde verwendet, um den Northern-Blot zu sondieren. Die Bedingungen für die Hybridisierung waren folgende:

3.5.1. Prähybridisierung bei 65°C für 2 h in einem Puffer, der 10 × Denhardts-Lösung (0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Rinderserumalbumin), 2 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt.
3.5.2 Hybridisierung bei 65°C für wenigstens 14 h in einem Puffer, der 1 × Denhardts-Lösung, 2 × SSC, 0,1% Dextransulfat, 50 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und ³²P-markierte Sonde (etwa 10⁶ dpm/ml) enthielt. Der Filter wurde zweimal bei 65°C für 10 Min. in 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen, gefolgt von zwei Waschschritten bei 65°C für 10 Min. in 1 × SSC, 0,1% SDS. Nach dem letzten Waschschritt für 10 Min. bei 65°C in 0,2 × SSC, 0,1% SDS wurde der Filter in Saran Wrap eingewickelt und ein Röntgenfilm (Kodak XAR2) für zwei Tage bei –80°C unter Verwendung eines Siemens-Titan HS Intensivierungsschirms damit exponiert. Das resultierende Autoradiogramm (8) zeigt, daß eine Bande mit der ungefähren Größe von 2 kB hervortrat.

In der Aminosäuresequenz, die in der obigen Tabelle 3.2. gezeigt ist, sind die HOX-1- bis HOX-8-Peptide mit fettgedruckten oder unterstrichenen Codes dargestellt. Fettgedruckte Codes zeigen Aminosäurereste an, die durch Aminosäuresequenzierung der Peptide bestätigt wurden. Die unterstrichenen Codes zeigen Aminosäurereste an, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wurden, die jedoch nicht durch Sequenzierung der relevanten HOX-Peptide bestätigt wurden.
HOX-1 entspricht den Aminosäureresten 461–468, HOX-2 den Resten 92–114, HOX-3 den Resten 219–234, HOX-4 den Resten 189–202, HOX-5 den Resten 215–218, HOX-6 den Resten 8–22, HOX-7 den Resten 434–444 und HOX-8 den Resten 452–460.
BEISPIEL 4
Herstellung von rekombinanter Hexoseoxidase in Pichia pastoris
4.1. Konstruktion eines Vektors für die Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in Pichia pastoris
Der offene Leserahmen, der Chondrus crispus-Hexoseoxidase codiert, wie er in Tabelle 3.2. gezeigt ist, wurde in einen Pichia pastoris-Expressionsvektor, pPIC3 (Research Corporation Technologies, Inc., Tucson, Arizona 85711–3335) eingesetzt. Das Plasmid enthält den Alkoholoxidasepromotor (aox1-Promotor) und das Transkriptionsterminierungssignal von Pichia pastoris (in 9, aoxp bzw. aoxt). Ein his4⁺-Gen in dem Vektor ermöglicht die Selektion von His⁺-rekombinanten Pichia pastoris-Zellen. Wenn diese Expressionskassette in Pichia pastoris transformiert wird, integriert sie sich in die chromosomale DNA. Pichia pastoris-Zellen, die stromabwärts von dem aoxl-Promotor eine Expressionskassette mit einem eingesetzten Chondrus crispus-Hexoseoxidasegen tragen, können induziert werden, so daß sie Hexoseoxidase durch die Zugabe des Induktionsmittels des aoxl-Promotors Methanol produzieren. Eine Mutante von Pichia pastoris, KM71, die in dem Hauptalkoholoxidasegen aox1 defekt ist, kann als Empfänger für das Hexoseoxidasegen verwendet werden (Cregg & Madden 1987; Tschopp et al. 1987). Jedoch enthält Pichia pastoris ein weiteres Alkoholoxidasegen, aox2, welches auch durch Methanol induziert werden kann. Somit werden rekombinante Pichia pastoris, die mit einer Hexoseexpressionskassette transformiert sind, bei Zugabe von Methanol zwei Oxidasen produzieren, Hexoseoxidase und Alkoholoxidase.
Vor dem Einsetzen des Hexoseoxidasegens in den Expressionsvektor pPIC3 wurden die Sequenzen 5' und 3' des offenen Leserahmens modifiziert. Erststrang-cDNA wurde als Vorlage in der PCR eingesetzt. Das für das 5'-Ende des offenen Leserahmens spezifische synthetische Oligonukleotid, Hox5'-1 (Tabelle 3.1), wurde als PCR-Primer zusammen mit einem Primer (Hox3'-1), der für das 3'-Ende der Sequenz, die Chondrus crispus-Hexoseoxidase codiert, spezifisch ist, eingesetzt. Der Primer Hox3'-1 hatte die Sequenz 5'-ACCAAGTTTATAAAAAGCAACCATCAC-3' (SEQ ID NO: 32). PCR-Vervielfältigung wurde unter Verwendung des GeneAmp^® PCR Reagenzienkits mit AmpliTaq^® DNA-Polymerase (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus 30 Zyklen mit 30 Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 55°C und 2 Min. bei 72°C. Gelelektroforese des Reaktionsgemisches zeigte eine Bande mit der ungefähren Größe von 1,7 kB. Dieses 1,7 kB Fragment wurde in den Vektor pT7 Blue (Novagen) eingesetzt (Plasmid pUPO150) und einer DNA-Sequenzierung unterzogen.
Das Chondrus crispus-Hexoseoxidase codierende Fragment wurde weiter in den Pichia pastoris-Expressionsvektor pPIC3 (Clare et al. 1991) subkloniert, wie es in 9 gezeigt ist. Das Plasmid pT7 Blue, welches das Hexoseoxidasegen enthielt, wurde mit der Restriktionsendonuklease Ndel geschnitten, und die Enden wurden mit Klenow-DNA-Polymerase, im wesentlichen wie es von Sambrook et al. (1989) beschrieben ist, geglättet. Nach Hitzeinaktivierung der DNA-Polymerase (Sambrook et al. 1989) wurde die DNA weiter mit EcoRI geschnitten, und das DNA-Fragment, welches das Hexoseoxidasegen enthielt, wurde über ein Agarosegel als ein stumpfes Ende-EcoRI-DNA-Fragment gereinigt (QIAEX^TM, QIAGEN).
Der Pichia pastoris-Expressionsvektor pPIC3 wurde mit den Restriktionsenzymen SnaBI und EcoRI geschnitten und über ein Agarosegel gereinigt. Der gereinigte Vektor und das Fragment, das Hexoseoxidase codiert, wurden ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in E. coli DH5α (Life Technologies) transformiert, im wesentlichen wie es von Sambrook et al. (1989) beschrieben ist. Der resultierende Expressionsvektor, der das Hexoseoxidasegen von Chondrus crispus enthielt, das Plasmid pUPO153, wurde einer DNA-Sequenzierung unterzogen, um sicherzustellen, daß keine Mutationen in dem Hexoseoxidasegen während des Subklonierungsverfahrens aufgetreten waren.
Das Plasmid pUPO153 wurde aus E. coli DH5α gereinigt und in Pichia pastoris unter Verwendung von Elektroporation (The Pichia Yeast Expression System, Phillips Petroleum Company) oder unter Verwendung des The Pichia Spheroblast Module (Invitrogen, San Diego, USA, Katalog Nr. K1720-01) eingebracht. Die bezüglich der Methanolverwendung defekte Mutante von Pichia pastoris, KM71 (Genotyp his4, aox1::ARG4) (Cregg und Madden 1984, Tschopp et al. 1987) wurde als Empfänger verwendet. Rekombinante Pichia pastoris-Kolonien, die auf Agarplatten ohne Histidin selektiert worden waren, wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des Hexoseoxidasegens unter Verwendung von PCR durchmustert. Es wurden Primer, die für Hexoseoxidase spezifisch waren (Tabelle 3.1), zusätzlich zu Primern, die für den Pichia pastoris-Alkoholoxidasepromotor und das Transkriptionsterminierungssignal spezifisch waren (Invitrogen, Katalog Nr. N710-02 bzw. N720-02), verwendet.
Eine Probe von Pichia pastoris KM71, welche pUPO153 enthielt, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, am 23. Mai 1996 unter der Hinterlegungsnummer DSM 10693 hinterlegt.
4.2. Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in Pichia pastoris
Der Pichia pastoris-Stamm KM71, der die Expressionskassette mit dem Hexoseoxidasegen enthielt, welches zwischen dem aoxI-Promotor und dem Transkriptionsterminierungssignal eingesetzt war, wurde in Schüttelkolben in MD kultiviert (1,34 g pro Liter Hefestickstoffbasis (Difco, Katalog Nr. 0919-15-3), 0,4 mg/l Biotin, 0,1% Arginin und 20 g/l Glucose). Ein-Liter-Schüttelkolben, die 150 ml Kultur enthielten, wurden in einem Rotationsschüttler bei 30°C, 300 U. p. M. inkubiert. Wenn die Zellen eine Dichte von OD₆₀₀ = 15–20 erreicht hatten, wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 6000 × g für 10 Min. geerntet und in einem gleichen Volumen (150 ml) Induktionsmedium MM resuspendiert (1,34 g/l Hefestickstoffbasis, 0,4 mg/l Biotin, 0,1% Arginin und 1% Methanol). Nach Wachstum für zwei Tage wurde zusätzlich Methanol (0,5%) hinzugegeben, um den Verbrauch und das Verdampfen von Methanol zu kompensieren.
Drei oder vier Tage nach der Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation (6.000 × g, 10 Min.) geerntet und in etwa 1/5 des Wachstumsvolumens 50 mM Tris-Cl, pH 7,5 resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden kalt gehalten bis zur Zerstörung in einer FRENCH^® Press (SLM Instruments, Inc., Rochester, N. Y.).
Die Zellen wurden in einer 20 K FRENCH^® Druckzelle bei einem Innendruck von 20.000 psi geöffnet. Der Zellextrakt wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Min. bei 5°C geklärt. Der Hexoseoxidase enthaltende Überstand wurde vorsichtig abgenommen und einer Reinigung unterzogen, wie es nachfolgend beschrieben ist.
4.3. Reinigung von rekombinanter Hexoseoxidase aus Pichia pastoris
4.3.1. Erste Stufe, Anionenaustauschchromatographie
Geklärtes Homogenisat aus einer FRENCH Press Homogenisierung (100–150 ml) wurde Anionenaustauschchromatographie auf einem FPLC-System, das mit zwei 5-ml HiTrap Q-Säulen ausgestattet war, die mit Q-Sepharose High Performance (Pharmacia) vorgepackt waren, unterzogen. Die Säulen waren in Reihe miteinander verbunden, und die Chromatographie wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Säule wurde equilibriert in Puffer A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Die Strömungsrate betrug 1,25 ml während des Probenauftrags und 2,5 ml während des Waschens und der Elution. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit 30 ml Puffer A gewaschen. Adsorbierte Proteine wurden dann eluiert mit 200 ml eines Gradienten von Puffer A bis Puffer B: 20 mM Tris-Cl, 750 mM NaCl, pH 7,5. Fraktionen von je 2 ml wurden während des Waschens und der Gradientenelution gesammelt. Die Fraktionen wurden auf Hexoseoxidaseaktivität getestet, wie es oben in Beispiel 1.3 beschrieben ist (10 μl Probe, 15 Min. Inkubationszeit). Die Fraktionen wurden auch auf Alkoholoxidaseaktivität (AOX) in einem Test untersucht, der mit dem Hexoseoxidasetest identisch war mit der Ausnahme, daß anstelle von 0,05 M Glucose 0,5% Methanol als Substrat verwendet wurden. Wie man es in 10 sieht, zeigten die Aktivitätsprofile, daß AOX und HOX bei einer Salzkonzentration von etwa 400 mM NaCl koeluierten. Fraktionen, die Hexoseoxidase enthielten, wurden vereinigt und bei 4°C gelagert.
4.3.2. Zweite Stufe, Gelfiltration
Der Pool aus Stufe 1 in der Reinigung (20–30 ml) wurde durch Zentrifugenultrazentrifugation bei 4°C in Centriprep-Konzentratoren (Amicon, USA, nominales Ausschlußmolekulargewicht von 30.000) auf etwa 3,5 ml konzentriert. Die konzentrierte Präparation von Hexoseoxidase wurde durch Zentrifugation geklärt und der Überstand mit Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 5% gemischt. Die Probe wurde unter Verwendung eines SA-5 Probenapplikators (Pharmacia), der mit dem Einlaß der Säule verbunden war, auf die Säule aufgebracht. Gelfiltration wurde bei 4°C an einer XK 26/70 Säule (2,6 × 66 cm, Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 350 ml bei 4°C durchgeführt. Die Säule war mit Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) gemäß den Anleitungen des Herstellers gepackt. Der Puffer war 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5, und die Peristaltik-P1-Pumpe (Pharmacia) wurde auf 0,5 ml/Min. eingestellt. Die UV-Lichtabsorption bei 280 nm wurde aufgezeichnet. Fraktionen von je 2,5 ml wurden gesammelt und auf Hexoseoxidase- und Alkoholoxidaseaktivität getestet, wie es oben beschrieben ist (10 μl Probe, 15 Min. Inkubationszeit). Die Aktivitätsprofile zeigten deutlich, daß AOX- und HOX-Aktivitäten getrennt waren, siehe 11. Dieses Ergebnis der Gelfiltration wurde erwartet, da Alkoholoxidase aus methylotrophen Hefen, wie Pichia pastoris, ein natives Molekulargewicht von etwa 600.000 hat (Sahm & Wagner, 1973), wogegen HOX ein natives Molekulargewicht von etwa 110.000–130.000 besitzt, wie es in Abschnitt 1.8. beschrieben ist. Das Elutionsvolumen von rekombinanter HOX war identisch mit dem Elutionsvolumen, das zuvor auf der gleichen Säule für native HOX aus Chondrus crispus beobachtet worden war (Abschnitt 1.7 und 1.8). Somit schien rekombinante HOX das gleiche Molekulargewicht zu haben wie native HOX, die direkt aus Chondrus crispus isoliert wurde. Fraktionen, die Hexoseoxidase enthielten, wurden vereinigt und bei 4°C gelagert.
4.3.3. Dritte Stufe, Anionenaustauschchromatographie an einer Mono Q-Säule
Der Pool aus der oben genannten zweiten Stufe wurde weiter durch Anionenaustauschchromatographie auf einem FPLC-System, das mit einer Mono Q HR 5/5-Säule (Bettvolumen 1 ml) ausgestattet war, gereinigt. Die Säule wurde equilibriert in Puffer A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Die Strömungsrate betrug 1 ml/Min. Der Pool aus Stufe 2 wurde durch Gelfiltration in Puffer A über vorgepackte Sephadex G-25-Säulen (PD-10, Pharmacia) entsalzt. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit 30 ml Puffer A gewaschen. Adsorbierte Proteine wurden eluiert mit 20 ml eines Gradienten von 0% bis 100% Puffer B: 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5. Fraktionen von je 0,5 ml wurden gesammelt und auf Hexoseoxidaseaktivität getestet, wie es oben beschrieben ist (10 μl Probe, 15 Min. Inkubationszeit). Fraktionen, die Hexoseoxidase enthielten, wurden vereinigt und bei 4°C gelagert.
4.3.4. Vierte Stufe, Chromatofokussierung
Der Pool aus der oben genannten dritten Stufe wurde durch Chromatofokussierung über eine Mono P HR 5/5-Säule gereinigt, wie es oben ein Beispiel 1.13 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die Phenyl-Sepharose-Adsorptionsstufe ausgelassen wurde. Wenn man native und rekombinante Hexoseoxidase verglich – wobei beide Formen durch eine abschließende Reinigung durch Chromatofokussierung erhalten worden waren –, wurde gefunden, daß die spezifische Aktivität von rekombinanter Hexoseoxidase aus Pichia pastoris ähnlich zu derjenigen der nativen Form war, die aus Chondrus crispus isoliert worden war. Fraktionen, die Hexoseoxidase enthielten, wurden durch SDS-PAGE und Färbung des Gels mit Coomassie Brilliant Blue R-250 analysiert, wie es oben beschrieben ist. Die gereinigte Präparation von rekombinanter Hexoseoxidase war aus zwei Banden zusammengesetzt, die bei 40 kD bzw. 29 kD liefen.
Zusamemnfassend konnte rekombinante Hexoseoxidase aus dem Wirtsorganismus Pichia pastoris isoliert und gereinigt werden. In der SDS-PAGE zeigte das rekombinante, gereinigte Enzym die gleichen Banden bei 40 kD und 29 kD, wie das entsprechende native Enzym aus Chondrus crispus.
4.4. Eigenschaften von rekombinanter Hexoseoxidase aus Pichia pastoris
Herstellung und Aminosäuresequenzanalyse von Peptidfragmenten von rekombinanter Hexoseoxidase (rHOX).
Gereinigte rHOX wurde für präparative SDS-PAGE und Elektroblotten auf PVDF-Membran verwendet, wie es oben in Beispiel 2.4. beschrieben ist.

Die erhaltenen 40 kD und 29 kD Banden wurden enzymatischem Verdau von an PVDF gebundenen Hexoseoxidasepolypeptiden unterzogen, wie es oben in Beispiel 2.5. beschrieben ist. Die Peptidfragmente wurden durch Umkehrphasenflüssigchromatographie getrennt, wie es oben in Beispiel 2.7 beschrieben ist. Gut aufgelöste und in großer Menge vorhandene Peptide wurden für die Aminosäuresequenzanalyse mittels automatisiertem Edman-Abbau (10 Stufen) ausgewählt, wie es oben in Beispiel 2.3 beschrieben ist. Die erhaltenen Aminosäuresequenzen sind in Tabelle 4.1. gezeigt. Tabelle 4.1.

Peptidsequenzen, erhalten durch Sequenzanalyse von Endoproteinase Lys-C-Peptiden, die
von 40 kD und 29 kD Polypeptiden von rekombinanter Hexoseoxidase, exprimiert in Pichia pastoris, erhalten wurden
Ursprung des sequenzierten Peptids	Sequenzidentifizierung	Aminosäuresequenz
Ursprung des sequenzierten Peptids	Stufe Nr.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
40 kD	HOX-9-Peptid	D	P	G	Y	I	V	I	D	V	N
29 kD	HOX-10-Peptid	L	Q	Y	Q	T	Y	W	Q	E	E
		und	und	und	und	und	und	und	und	und	und
		Y	L	T	E	V	P	D	G	L	T

Die HOX-9-Peptidsequenz von dem rekombinanten 40 kD Polypeptid zeigte eine Sequenz, die zu Aspx₈ bis Asn₁₇ in der Aminosäuresequenz von Hexoseoxidase aus Chondrus crispus, wie sie in Tabelle 3.2. gezeigt ist (SEQ ID NO: 30), identisch war. Sequenzanalyse einer Peptidprobe, die von dem rekombinanten 29 kD Polypeptid erhalten wurde, zeigte zwei Reste in jeder Stufe. Die Aminosäureidentifizierungen zeigten, daß zwei Peptide in der Probe vorhanden waren, die Leu₄₃₄ bis Glu₄₄₃ bzw. Tyr₃₈₈ bis Thr₃₉₇ in der Aminosäuresequenz von Hexoseoxidase aus Chondrus crispus, siehe Tabelle 3.2. (SEQ ID NO: 30), entsprachen.
Es konnte daher geschlossen werden, daß die aus rekombinanter Hexoseoxidase erhaltenen Peptidsequenzen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz von nativer Hexoseoxidase aus Chondrus crispus identisch waren.
Darüber hinaus konnte geschlossen werden, daß Pichia pastoris, welche mit dem Hexoseoxidasegen aus Chondrus crispus transformiert war, in der Lage war, rekombinante Hexoseoxidase zu produzieren.
4.4.1. Substratspezifitäten

Die Substratspezifitäten von rekombinanter Hexoseoxidase aus Pichia pastoris und nativer Hexoseoxidase aus Chondrus crispus wurden verglichen, wobei eine Anzahl von Zuckern in einer Endkonzentration von 0,1 M in dem oben beschriebenen Test eingesetzt wurden. Die relativen Raten sind in Tabelle 4.2. gezeigt. Tabelle 4.2.

Substratspezifität von in Pichia pastoris exprimierter rekombinanter Hexoseoxidase und von nativer Hexoseoxidase aus Chondrus crispus
	Relative Rate
Substrat	Rekombinantes Enzym	Natives Enzym, diese Arbeit	Natives Enzym, Sullivan und Ikawa, 1973
D-Glucose	100	100	100
D-Galactose	75	75	82
Maltose	57	37	40
Cellobiose	51	33	32
Lactose	38	25	22

Wie es in Tabelle 4.2 gezeigt ist, war die Substratspezifität von rekombinanter Hexoseoxidase fast identisch mit derjenigen des nativen Enzyms. Obwohl jedoch die relative Rate unter den Disacchariden für beide Enzymformen in der Reihenfolge Maltose, Cellobiose und Lactose abnahm, schien das rekombinante Enzym bezüglich seiner Fähigkeit, diese Disaccharide zu oxidieren, weniger selektiv zu sein. Die Ergebnisse für das native Enzym waren fast identisch mit den früher von Sullivan et al. (1973) berichteten Daten.
4.4.2. Inhibition durch Natriumdiethyldithiocarbamat

Sullivan und Ikawa (1973) berichteten, daß Hexoseoxidase aus Chondrus crispus durch Natriumdiethyldithiocarbamat stark inhibiert wird. Rekombinante Hexoseoxidase aus Pichia pastoris wurde mit dem nativen Enzym aus Chondrus crispus hinsichtlich der Inhibition durch diese Kupfer bindende Verbindung verglichen. Der Inhibitor wurde in den Enzymtest in zwei Konzentrationen, 0,1 mM und 0,01 mM, eingesetzt, wie es von Sullivan und Ikawa (1973) beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.3. zusammengefaßt. Tabelle 4.3.

Vergleich des inhibitorischen Effekts von Natriumdiethyldithiocarbamat auf die enzymatische Aktivität von rekombinanter Hexoseoxidase aus Pichia pastoris und nativer Hexoseoxidase aus Chondrus crispus
	Inhibition (%)
Konzentration des Inhibitors	Rekombinantes Enzym	Natives Enzym
0,1 mM	96	95
0,01 mM	39	41

Es scheint aus Tabelle 4.3., daß rekombinante und native Hexoseoxidase gleich empfindlich sind, wenn sie einer Inhibition durch Natriumdiethyldithiocarbamat unterworfen werden. Darüber hinaus waren die Ergebnisse zu den von Sullivan und Ikawa (1973) berichteten Daten für native Hexoseoxidase ähnlich.
BEISPIEL 5 – ZU VERGLEICHSZWECKEN
Herstellung von rekombinanter Hexoseoxidase in Escherichia coli
5.1. Konstruktion eines Vektors für die Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in Escherichia coli
Der offene Leserahmen, der die in Tabelle 3.2. (SEQ ID NO: 30) gezeigte Chondrus crispus-Hexoseoxidase codiert, wurde in einen Escherichia coli-Expressionsvektor, pET17b (Novagen, Katalog Nr. 69726-1) eingesetzt. Das Plasmid enthält einen starken induzierbaren Bakteriophage T7-Promotor und ein T7-Transkriptionsterminierungssignal. Gene, die zwischen diese Kontrollelemente eingesetzt sind, können durch die Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) exprimiert werden, wenn das Plasmid in speziellen E. coli-Wirtszellen, z. B. dem Stamm BL21 (DE3) (Novagen, Katalog Nr. 69387-1), vermehrt wird.
Das Hexoseoxidasegen war an den 5'- und 3'-Enden modifiziert, um das Gen in den Expressionsvektor pET17b einzusetzen. Das Hexoseoxidasegen wurde durch PCR mit Primern, die für die 5'- und 3'-Enden des Hexoseoxidasegens spezifisch waren, isoliert. Der 5'-Primer (Hox5'-2) hatte die DNA-Sequenz 5'-ATGAATTCGTGGGTCGAAGAGCCC-3' (SEQ ID NO: 33), und der für das 3'-Ende spezifische Primer war Hox3'-1. Erststrang-cDNA von Chondrus crispus wurde als Vorlage verwendet. PCR-Vervielfältigung wurde mit AmpliTaq^®-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt, wie es in Beispiel 4.1. beschrieben ist. Gelelektroforese des Reaktionsgemisches zeigte eine Bande mit einer ungefähren Größe von 1,7 kB. Dieses 1,7 kB Fragment wurde in den Vektor pT7 Blue (Novagen) unter Erhalt des Plasmides pUPO161 eingesetzt.
Die Modifikation des 5'-Endes des Hexoseoxidasegens und die weitere Subklonierung des Gens in den E. coli-Expressionsvektor ist in 12 gezeigt. Das 5'-Ende wurde mittels PCR modifiziert, um eine NdeI-Schnittstelle unmittelbar an der ATG-Translationsstartstelle einzuführen. Das Oligonukleotid Hox5'-4 mit der Sequenz 5'-CAGGAATTCATATGGCTACTCTTCCCCAGAAAG-3' (SEQ ID NO: 34) wurde zusammen mit dem Oligonukleotid Hox13- (SEQ ID NO: 28) (Tabelle 3.1) verwendet. PCR-Vervielfältigung wurde durchgeführt, wie es oben in Beispiel 4.1. beschrieben ist. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem 2%-igen Agarosegel fraktioniert, und das hexoseoxidasespezifische 180 Bp Fragment wurde gereinigt, wie es in Beispiel 3.4. beschrieben ist. Das 180 Bp Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen ClaI und EcoRI geschnitten und mit pUPO161 ligiert, der mit den gleichen Enzymen geschnitten war, wobei das Plasmid pUPO167 erhalten wurde.
Das Hexoseoxidasegen in dem Plasmid pUPO167 wurde weiter subkloniert, um einen Hexoseoxidaseexpressionsvektor für E. coli herzustellen. Das Plasmid pUPO167 wurde mit den Enzymen NdeI und BamHI und mit den Enzymen BamHI und SalI geschnitten. Die erste Reaktion lieferte ein 1,6 kB Fragment, das den 5'- und den mittleren Teil des Hexoseoxidasegens codierte, wogegen die Reaktion mit den Enzymen BamHI und SalI ein 200 Bp Fragment lieferte, welches das 3'-Ende des Hexoseoxidasegens codierte. Die zwei hexoseoxidasespezifischen Fragmente wurden über Agarosegele gereinigt, wie es in Beispiel 3.4. beschrieben ist, und mit dem Plasmid pET17b ligiert, welches mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und XhoI geschnitten war. Das Plasmid pET17b, welches das Hexoseoxidasegen enthielt, wurde mit pUPO181 bezeichnet. DNA-Sequenzierung zeigte, daß während des Isolierungs- und Klonierungsverfahrens keine Mutation in das Hexoseoxidasegen eingeführt worden war.
5.2. Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in Escherichia coli
Das Plasmid pUPO181 wurde in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) (Novagen) nach einem Standardtransformationsverfahren (Sambrook et al., 1989) eingebracht. Die Zellen wurden in Schüttelkolben in LB-Medium gezüchtet (Sambrook et al., oben). Bei einer Zelldichte von OD₆₀₀ = 0,5 wurden die Zellen zur Expression von rekombinanter Hexoseoxidase durch die Zugabe von 10^–3 M IPTG induziert. Eine Stunde nach der Zugabe von IPTG wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in Probenpuffer resuspendiert und SDS-PAGE unterzogen, wie es oben in Beispiel 1.10. beschrieben ist.
Das Ergebnis der Elektroforese ist in 13 gezeigt. Der Rohextrakt von E. coli, welche rekombinantes Hexoseoxidaseenzym von dem Plasmid pUPO181 exprimierten, zeigte eine hervortretende Proteinbande bei Mr 62 kD. Diese 62 kD Bande hatte das gleiche Molekulargewicht wie das Translationsprodukt, das von dem offenen Leserahmen vorhergesagt war. Nicht transformierte E. coli-Zellen zeigten kein solches 62 kD Protein.
Eine Probe von E. coli BL21 (DE3), welche pUPO181 enthielten, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, am 23. Mai 1996 unter der Hinterlegungsnummer DSM 10692 hinterlegt.
BEISPIEL 6
Herstellung von rekombinanter Hexoseoxidase in Saccharomyces cerevisiae
6.1. Konstruktion eines Vektors für die Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in Saccharomyces cerevisiae
Der in Tabelle 3.2. (SEQ ID NO: 30) gezeigte offene Leserahmen, der Chondrus crispus-Hexoseoxidase codiert, wurde in einen Hefeexpressionsvektor, pYES2 (Invitrogen, Katalog Nr. V825-20), eingesetzt. Das Plasmid pYES2 ist ein episomaler Vektor für hohe Kopienzahlen, der für eine induzierbare Expression von rekombinanten Proteinen in Saccharomyces cerevisiae ausgestaltet ist. Der Vektor enthält stromaufwärts gelegene Aktivierungs- und Promotorsequenzen aus dem Gal1-Gen von S. cerevisiae für streng regulierte Transkription in hoher Menge. Das Transkriptionsterminierungssignal stammt aus dem CYC1-Gen.
Das Hexoseoxidasegen von Chondrus crispus wurde an den 5'- und 3'-Enden modifiziert, um das Gen in dem Expressions pYES2 einzusetzen. Das Hexoseoxidasegen wurde aus dem Plasmid pUPO150 isoliert, wie es in Beispiel 4.1. beschrieben ist (9). Das Hexoseoxidasegen wurde als ein stumpfes Ende-EcoRI-DNA-Fragment isoliert, wie es beschrieben ist, und in das mit den Enzymen PvulI und EcoRI geschnittene Plasmid pYES2 eingesetzt (14). Das erhaltene Plasmid, pUPO155, wurde einer DNA-Sequenzierung unterzogen, um zu zeigen, daß während des Klonierungsverfahrens keine Mutation aufgetreten war.
Das Plasmid pUPO155 wurde aus E. coli DH5α gereinigt und durch Elektroporation in S. cerevisiae transformiert (Grey und Brendel, 1992). Der Stamm PAT1500 (Genotyp α, ura3-52, trp1::GAL10-GAL4, lys2-801, leu2Δ1, his3Δ200, pep4::HIS3, prb1Δ1.6R, can1, GAL) (Pedersen et al., 1996) wurde als Empfänger verwendet.
6.2. Expression von rekombinanter Hexoseoxidase in Saccharomyces cerevisiae

Der S. cerevisiae-Stamm 1500, der das Plasmid pUPO155 enthielt, wurde gezüchtet und mit 2% Galactose induziert, wie es von Pedersen et al. (1996) beschrieben ist. Drei Tage nach der Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und lysiert, wie es oben in Beispiel 4.2. beschrieben ist. Der Rohextrakt wurde auf Hexoseoxidaseaktivität unter Verwendung des o-Dianisidin-Tests getestet, wie es oben in Beispiel 1.3. beschrieben ist. Tabelle 6.1. zeigt, daß S. cerevisiae-Zellen, die das Hexoseoxidasegen enthalten, in der Lage sind, aktive Hexoseoxidase zu exprimieren. Tabelle 6.1.

Herstellung von rekombinanter Hexoseoxidase in Saccharomyces cerevisiae
	Saccharomyces cerevisiae
Substrat	+ Hexoseoxidasegen	nicht rekombinante Kontrolle
D-Glucose	++	0
D-Galactose	+	0
kein Substrat	0	0
0 = keine feststellbare Aktivität

Eine Probe des S. cerevisiae-Stamms 1500, der das Plasmid pUPO155 enthielt, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, am 23. Mai 1996 unter der Hinterlegungsnummer DSM 10694 hinterlegt.
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14. Schägger, H. und G. von Jagow 1987. Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Elektrophoresis for teh Separation of Proteins in the Range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry 166: 368–379.
15. Sock, J. und R. Rohringer 1988. Activity Staining of Blotted Enzymes by Reaction Coupling with Transfer Membrane-immobilized Auxiliary Enzymes. Analytical Biochemistry 171: 310–319.
16. Sullivan, J. D. und M. Ikawa 1973. Purification and Characterization of Hexose Oxidase from the red Alga Chondrus crispus. Biochemica et Biophysica Acta 309: 11–22.
17. Tschopp, J. F., G. Sverlow, R. Kosson, W. Craig und L. Grinna 1987. High-level secretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastor/s. Bio/Technology 5: 1305–1308.
18. Yeh, K. W., R. H. Juang und J. C. Su. A rapid and efficient method for RNA isolation from pfants with high carbohydrate content. Focus 13: 102–103.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Chondrus crispus-Polypeptids mit Hexoseoxidaseaktivität, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, in denen man ein DNA-Fragment, welches das Polypeptid codiert, isoliert oder synthetisiert, das DNA-Fragment in eine Wirtszelle einführt, in welcher das DNA-Fragment mit einem Expressionssignal für das Fragment kombiniert wird, die resultierende rekombinante Zelle in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die zur Expression des hexoseoxidaseaktiven Polypeptids führen, kultiviert und das Polypeptid aus dem Kulturmedium oder der rekombinanten Zelle gewinnt, wobei das DNA-Fragment wenigstens eine DNA-Sequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz codiert, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
worin X eine Aminosäure repräsentiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val, wobei die Wirtszelle eine Hefespezies ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer S. cerevisiae-Zelle und einer P. pastoris-Zelle besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, welches als eine weitere Stufe eine Reinigung der Polypeptidpräparation, die anfänglich aus dem Kulturmedium und/oder aus den rekombinanten Zellen gewonnen wurde, umfaßt, wobei man eine Präparation erhält, in der das Polypeptid in einer im wesentlichen reinen Form vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid mit Hexoseoxidaseaktivität ein Fusionsprodukt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Fragment den Hexoseoxidase codierenden Bereich von SEQ ID NO: 30 enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Fragment in einem rekombinanten DNA-Molekül enthalten ist, in dem das DNA-Fragment funktionsfähig mit einem Expressionssignal verknüpft ist, das nicht nativ dem DNA-Fragment zugeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das rekombinante DNA-Molekül ein Plasmid ist.
Rekombinante Zelle, welche ein exprimierbares DNA-Fragment enthält, das ein hexoseoxidaseaktives Polypeptid codiert, wobei das DNA-Fragment isoliert oder synthetisiert ist, wie es in Anspruch 1 definiert ist, wobei die Zelle eine Hefezelle ist.
Zelle nach Anspruch 8, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer S. cerevisiae-Zelle und einer P. pastoris-Zelle besteht.
Zelle nach Anspruch 8, welche den Hexoseoxidase codierenden Bereich von SEQ ID NO: 30 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels, wobei die Zelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen verwendet wird, bei denen das hexoseoxidaseaktive Polypeptid exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Lebensmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Molkereiprodukt, einem Stärke enthaltenden Lebensmittel und einem Nicht-Milchgetränk besteht.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid als ein antimikrobielles Mittel oder als ein Antioxidans wirkt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid als ein Sauerstoff entfernendes Mittel in einer Lebensmittelverpackung wirkt.
Verfahren zur Herstellung eines Tierfutters, wobei die Zelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen verwendet wird, bei denen das hexoseoxidaseaktive Polypeptid exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Tierfutter Silage ist.
Verfahren zur Reduzierung des Zuckergehalts eines Lebensmittels, bei dem man dem Produkt eine Menge der Zelle nach Anspruch 8 hinzufügt, welche ausreicht, um wenigstens einen Teil des anfänglich in dem Lebensmittel vorhandenen Zuckers zu entfernen.
Verfahren zur Herstellung eines Produkts, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem pharmazeutischen Produkt, einem kosmetischen und einem Zahnpflegeprodukt besteht, wobei die Zelle nach Anspruch 8 verwendet wird.
Eine Teig verbessernde Zusammensetzung, welche die rekombinante Zelle nach Anspruch 8, welche in der Lage ist, das hexoseoxidaseaktive Polypeptid in Teig oder ein Polypeptid mit Hexoseoxaseaktivität zu exprimieren, und wenigstens einen herkömmlichen Teigbestandteil enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, welche weiterhin wenigstens ein Enzym enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Cellulase, einer Hemicellulase, einer Xylanase, einer Pentosanase, einer Amylase, einer Lipase und einer Protease besteht.
Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts aus einem Teig, bei dem man zu dem Teig eine wirksame Menge der Zusammensetzung gemäß Anspruch 19 oder 20 hinzufügt.
Verfahren zur Analyse des Anteils eines Zuckers in einer Probe, wobei man die Zelle nach Anspruch 8 als ein analytisches Reagens verwendet.
Verfahren zur Herstellung eines Lactons unter Verwendung der Zelle nach Anspruch 8, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, bei denen man die Zelle auf einen Reaktor anwendet, der einen Kohlenwasserstoff enthält, welcher von dem hexoseoxidaseaktiven Polypeptid oxidiert werden kann, und den Reaktor unter Bedingungen betreibt, bei denen das Polypeptid exprimiert wird, wobei der Kohlenwasserstoff zu einer Lacton oxidiert wird.
isoliertes DNA-Fragment, welches ein Chondrus crispus-Polypeptid mit Hexoseoxidaseaktivität codiert, wobei das Fragment ein Polypeptid codiert, das wenigstens eine Aminsosäuresequenz enthält, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
worin X eine Aminosäure repräsentiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val.
DNA-Fragment nach Anspruch 24, welches den Hexoseoxidase codierenden Bereich der folgenden Sequenz (SEQ ID NO: 30) enthält:
Rekombinantes DNA-Molekül, welches das DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 24 bis 25 enthält.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 26, wobei das DNA-Fragment funktionsfähig mit einem Expressionssignal verknüpft ist, das nicht nativ dem DNA-Fragment zugeordnet ist.
Präparation, welche ein rekombinant erhaltenes Chondrus crispus-Polypeptid mit Hexoseoxidaseaktivität enthält, wobei die Präparation keine anderen Proteine enthält und das Polypeptid wenigstens eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

worin X eine Aminosäure repräsentiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val.
Präparation nach Anspruch 28, wobei das Polypeptid nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erhalten wurde.
Präparation nach Anspruch 28, welche das Polypeptid in einer nicht glycosylierten Form enthält.
Präparation nach Anspruch 28, wobei das Polypeptid funktionale Eigenschaften aufweist, die mit denjenigen von natürlich in Chondrus crispus vorkommender Hexoseoxidase identisch sind.
Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels, wobei die Präparation nach Anspruch 28 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Lebensmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Molkereiprodukt, einem Stärke enthaltenden Lebensmittel und einem Nicht-Milchgetränk besteht.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Polypeptid als ein antimikrobielles Mittel oder als ein Antioxidans wirkt.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Polypeptid als ein Sauerstoff entfernendes Mittel in einer Lebensmittelverpackung wirkt.
Verfahren zur Herstellung eines Tierfutters, wobei die Präparation nach Anspruch 28 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Tierfutter Silage ist.
Verfahren zur Reduzierung des Zuckergehalts in einem Lebensmittel, bei dem man zu dem Produkt eine Menge der Präparation nach Anspruch 28 hinzufügt, die ausreicht, um wenigstens einen Teil des anfänglich in dem Lebensmittel vorhandenen Zuckers zu entfernen.
Verfahren zur Herstellung eines Produkts, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem pharmazeutischen Produkt, einem kosmetischen und einem Zahnpflegeprodukt besteht, wobei die Präparation nach Anspruch 28 verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts aus einem Teig, wobei man die Präparation nach Anspruch 28 zu dem Teig hinzufügt.
Teig verbessernde Zusammensetzung, welche die Präparation nach Anspruch 28 und wenigstens einen herkömmlichen Teigbestandteil enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 41, welche weiterhin wenigstens ein Enzym enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Cellulase, einer Hemicellulase, einer Xylanase, einer Pentosanase, einer Amylase, einer Lipase und einer Protease besteht.
Verfahren zum Analysieren des Anteils eines Zuckers in einer Probe, wobei die Präparation nach Anspruch 28 als ein analytisches Reagens verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung eines Lactons unter Verwendung der Präparation nach Anspruch 28, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, in denen man die Präparation auf einen Reaktor anwendet, der einen Kohlenwasserstoff enthält, welcher von dem Polypeptid oxidiert werden kann, und den Reaktor unter Bedingungen betreibt, bei denen der Kohlenwasserstoff zu einem Lacton oxidiert wird.