JP6427110B2 - アスペルギルスニガー由来の新規グルコース酸化酵素 - Google Patents
アスペルギルスニガー由来の新規グルコース酸化酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6427110B2 JP6427110B2 JP2015554195A JP2015554195A JP6427110B2 JP 6427110 B2 JP6427110 B2 JP 6427110B2 JP 2015554195 A JP2015554195 A JP 2015554195A JP 2015554195 A JP2015554195 A JP 2015554195A JP 6427110 B2 JP6427110 B2 JP 6427110B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gox
- glucose
- activity
- glucose oxidase
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 title claims description 364
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 title claims description 98
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 title claims description 96
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 title claims description 96
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 title description 34
- 101100229716 Aspergillus niger gox gene Proteins 0.000 claims description 250
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 209
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 147
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 143
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 143
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 143
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 142
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 136
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 88
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 88
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 88
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 71
- 102200131194 rs3219154 Human genes 0.000 claims description 71
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 54
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 47
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 47
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 35
- 102220640318 Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial_T30V_mutation Human genes 0.000 claims description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 30
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 29
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 29
- 238000010269 ABTS assay Methods 0.000 claims description 26
- KOOMFXGDLMRWSN-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitrous amide Chemical compound O=NNC1=CC=CC=C1 KOOMFXGDLMRWSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 25
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 claims description 24
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 22
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 claims description 20
- -1 (2-hydroxy) Ethyl Chemical group 0.000 claims description 19
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 18
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 15
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 15
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 12
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 9
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 9
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 claims description 9
- WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 10H-phenothiazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3SC2=C1 WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 claims description 8
- RLEHYCNEHWSDLS-UHFFFAOYSA-N 2-[n-(2-hydroxyethyl)-4-nitrosoanilino]ethanol Chemical compound OCCN(CCO)C1=CC=C(N=O)C=C1 RLEHYCNEHWSDLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229950000688 phenothiazine Drugs 0.000 claims description 8
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 8
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 8
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 8
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- FHCPAXDKURNIOZ-UHFFFAOYSA-N tetrathiafulvalene Chemical compound S1C=CSC1=C1SC=CS1 FHCPAXDKURNIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N abts Chemical compound S/1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N\N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 134
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 86
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 54
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 50
- 239000000463 material Substances 0.000 description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 25
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 14
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 14
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N D-glucono-1,5-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 9
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 235000012209 glucono delta-lactone Nutrition 0.000 description 8
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108010000445 Glycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 7
- 108010029645 galactitol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000002079 cooperative effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 229960003681 gluconolactone Drugs 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000001973 Ficus microcarpa Species 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QIPPZHGUSZEMNW-UHFFFAOYSA-N 2-[n-(2-hydroxyethyl)-2-methoxy-4-nitrosoanilino]ethanol Chemical compound COC1=CC(N=O)=CC=C1N(CCO)CCO QIPPZHGUSZEMNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- SALQMMXSINGXMI-UHFFFAOYSA-N 4-nitrosoaniline Chemical class NC1=CC=C(N=O)C=C1 SALQMMXSINGXMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YPZRHBJKEMOYQH-UYBVJOGSSA-L FADH2(2-) Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C(NC(=O)NC2=O)=C2NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 YPZRHBJKEMOYQH-UYBVJOGSSA-L 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000894166 Penicillium amagasakiense Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GNWYUPQAANEWFB-UHFFFAOYSA-N [4-(dimethylamino)phenyl]iminourea Chemical class CN(C)C1=CC=C(N=NC(N)=O)C=C1 GNWYUPQAANEWFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- DPXDJGUFSPAFJZ-UHFFFAOYSA-L disodium;4-[3-methyl-n-(4-sulfonatobutyl)anilino]butane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].CC1=CC=CC(N(CCCCS([O-])(=O)=O)CCCCS([O-])(=O)=O)=C1 DPXDJGUFSPAFJZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 2
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 2
- 101150094958 gox gene Proteins 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 2
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- RZFVLEJOHSLEFR-UHFFFAOYSA-N phenanthridone Chemical compound C1=CC=C2C(O)=NC3=CC=CC=C3C2=C1 RZFVLEJOHSLEFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000002824 redox indicator Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FBMQNRKSAWNXBT-UHFFFAOYSA-N 1,4-diaminoanthracene-9,10-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(N)=CC=C2N FBMQNRKSAWNXBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDZLIAZRGGTCJZ-UHFFFAOYSA-N 1h-indole;phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1.C1=CC=C2NC=CC2=C1 NDZLIAZRGGTCJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 101000904208 Aspergillus niger Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 1
- 150000000780 D-glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 101000904209 Penicillium amagasakiense Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000228343 Talaromyces flavus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- JIAXDTQSRYOZEF-IDMXKUIJSA-L [Na+].[Na+].S(=O)(=O)([O-])CCCCN([C@@H](CC)C(=O)O)CCCCS(=O)(=O)[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].S(=O)(=O)([O-])CCCCN([C@@H](CC)C(=O)O)CCCCS(=O)(=O)[O-] JIAXDTQSRYOZEF-IDMXKUIJSA-L 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000027734 detection of oxygen Effects 0.000 description 1
- LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl peroxide Chemical compound CC(C)(C)OOC(C)(C)C LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 108010054770 glucose dehydrogenase (pyrroloquinoline-quinone) Proteins 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 108010018734 hexose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000000075 primary alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001008 quinone-imine dye Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 102220212423 rs55907012 Human genes 0.000 description 1
- 102220049370 rs587783484 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
- C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
Description
D−グルコース+O2→グルコノラクトン+H2O2
によって表される。
a)生物化学的成分、すなわち基質としてグルコースを有する各酵素、
b)インジケーター(電子的成分)、および
c)シグナル変換子
からなる電気化学的センサーである。
驚くべきことに、および予期せぬことに、本発明者らは、Zhuら(2006、2007)において記載されたGOxの二重突然変異体T30V;I94V(以下、「GOx−T30V;I94V」と略される)が、基質グルコースに対する特異性を維持しながら、顕著に低減されたオキシダーゼ活性および同時に顕著に増大されたデヒドロゲナーゼ活性を有する酸素非依存性のGOx変異体を得るためのさらなる特異的アミノ酸置換(または複数の置換)の基礎として適切であることを発見した。さらに、本発明者らは、本発明にしたがい、追加でまたは単独で酸素以外の電子メディエーターに対する顕著に増大されたメディエーター活性を示すGOx変異体を発見した。この意味において、本発明者らはまた、本発明にしたがい、電子移動のための酸素以外の特定の電子メディエーターを受容するGOx変異体を発見した。したがって、本発明によるGOx変異体は、改良されたグルコース測定、とりわけ、改良された血糖測定に適切である。
糖尿病患者は、毎日の生活のなかで正確な血糖測定を必要とする。科学的背景の項に概説されているように、既存の酵素的測定システムは、酸素依存性GOxsおよびグルコースに非特異的なGDHsに基づいている。
A173V;A332S;F414Y;およびV560A、または
A173V;A332S;およびF414Y
の追加のアミノ酸置換を有するGOx変異体は、材料および方法の段落のff)の項において記載されるメディエーターアッセイによって測定される場合、配列番号1に記載のGOx−T30V;I94Vのそれぞれのメディエーター活性と比較して、メディエーターN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−メトキシ−4−ニトロソアニリンに対して150%のメディエーター活性を示す。
A173V;A332S;F414Y;およびV560A、または
A173V;A332S;およびF414Y
は、本明細書において提供されるGOx変異体の別の特徴、すなわち、電子移動のための酸素以外の特定の電子メディエーター、この場合ではN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−メトキシ−4−ニトロソアニリンメディエーターを受容する能力を反映する。
a)配列番号1に記載のグルコース酸化酵素であって、2つのアミノ酸置換T30VおよびI94Vに加えて、前記配列番号1におけるS53;A137;A173;A332;F414;V560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を有するグルコース酸化酵素、または
b)b)のグルコース酸化酵素が2つのアミノ酸置換T30VおよびI94Vに加えて、前記配列番号1におけるS53;A137;A173;A332;F414;V560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を有するという条件で、a)のグルコース酸化酵素に少なくとも70%、特には少なくとも80%、または90%より高いアミノ酸配列同一性を示すグルコース酸化酵素、ただし、
b)のグルコース酸化酵素は、a)のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも70%、特には少なくとも80%、または90%より高い酵素活性を示し、および、a)のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも70%、特には少なくとも80%、または90%より高い酵素特異性を示し、かつ
b)のグルコース酸化酵素は、配列番号1のグルコース酸化酵素の、電子受容体としての酸素に対する活性より5倍低下された活性を示す、または配列番号1のグルコース酸化酵素の、酸素以外の電子受容体に対する活性より1.5倍増大された活性を示すか、またはその両方であり、
c)a)またはb)に記載のグルコース酸化酵素の活性フラグメントであって、ただし、c)の活性フラグメントにおいて、a)またはb)において記載されるようなアミノ酸置換が、a)またはb)に記載のグルコース酸化酵素と比較して保持されており、かつ
c)のグルコース酸化酵素は、a)のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも70%、特には少なくとも80%、または90%より高い酵素活性を示し、および、a)のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも70%、特には少なくとも80%、または90%より高い酵素特異性を示し、かつ
c)のグルコース酸化酵素は、配列番号1に記載のグルコース酸化酵素の、電子受容体としての酸素に対する活性より5倍低下された活性を示すか、または配列番号1に記載のグルコース酸化酵素の、酸素以外の電子受容体に対する活性より少なくとも1.5倍増大された活性を示すか、またはその両方である、
からなる群より選択される、配列番号1に記載のグルコース酸化酵素という主題に関する。
電子受容体としての酸素に対する前記活性が、以下の工程
a)75μLのサンプル酵素溶液が100μLのリン酸バッファー(pH7)を含む平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)20μLの反応混合物が、以下の濃度、0.91U/mL HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ);2.3mM ABTS(2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸))、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の30秒間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)ABTSの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて414nmで速度論的に測定される工程
を含むABTSアッセイによって測定されており、
酸素以外の電子メディエーターの前記活性が、以下の工程
a)75μLの酵素溶液が平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)100μLのメディエーター溶液(19.05mMのN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−4−ニトロソアニリン);5%(w/w)ポリビニルピロリドン、pH7および20μLの25mM りんモリブデン酸が添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の1分間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて700nmでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される。
S53位におけるPhe;および/または
A137位におけるSer、Leu;および/または
A173位におけるIle、Thr、Val;および/または
A332位におけるSer、Asn、Val;および/または
F414位におけるArg、Asn、Asp、Cys、Gly、His、Ile、Met、Ser、Thr、Tyr、Val;および/または
V560位におけるAla、Ile、Leu、Met、Pro、Thr、Tyr、およびVal
の群より選択される。
a)75μLのサンプル酵素溶液が100μLのリン酸バッファー(pH7)を含む平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)20μLの反応混合物が、以下の濃度、0.91U/mL HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ);2.3mM ABTS(2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸))、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の30秒間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)ABTSの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて414nmで速度論的に測定される工程
を含むABTSアッセイによる電子受容体としての酸素に対する活性が、アスペルギルス ニガー由来の野生型GOxと比較しておよび/または配列番号1のGOxと比較して、少なくとも5倍低下したGOx変異体を提供する。
a)75μLの酵素溶液が平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)100μLのメディエーター溶液(19.05mMのN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−4−ニトロソアニリン);5%(w/w)ポリビニルピロリドン、pH7および20μLの25mM りんモリブデン酸が添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の1分間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて700nmでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、配列番号1のGOxと比較して、酸素以外の電子メディエーターに対して少なくとも1.5倍増大した活性を示す。
a)75μLの酵素溶液が平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)100μLのメディエーター溶液(19.05mMのN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−4−ニトロソアニリン);5%(w/w)ポリビニルピロリドン、pH7および20μLの25mM りんモリブデン酸が添加される工程
c)25μLのそれぞれの糖である基質溶液を添加することおよびその後の1分間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて700nmでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、少なくとも99.9%のグルコース特異性および/または4%未満のガラクトース特異性および/または0.3%未満のマルトース特異性および/または6%未満のキシロース特異性および/または0.1%未満のマルトトリオース特異性を示すGOx変異体を提供する。
a)75μLの酵素溶液が平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)100μLのメディエーター溶液(19.05mMのN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−4−ニトロソアニリン);5%(w/w)ポリビニルピロリドン、pH7および20μLの25mM りんモリブデン酸が添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の1分間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて700nmでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、配列番号1のGOxのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、400%より大きい、または500%より大きい、または600%より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示し、
かつ、以下の工程
a)75μLのサンプル酵素溶液が100μLのリン酸緩衝液(pH7)を含む平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)20μLの反応混合物が、以下の濃度、0.91U/mL HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ);2.3mM ABTS(2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸))、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の30秒間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)ABTSの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて414nmで速度論的に測定される工程
を含むABTSアッセイにより、配列番号1のGOxの酸素活性と比較して、30%以下、または25%未満、または20%未満、特には15%未満、または10%以下の酸素活性を示す
GOx変異体を提供する。
i)GOxsのグルコース特異性特性
ii)オキシダーゼ活性からデヒドロゲナーゼ活性へのシフトを介するGDHsの酸素非依存性の酵素活性特性を有し
iii)および任意には酸素以外の特定の電子メディエーターに対する増大された活性
を、正確なグルコース測定、とりわけ正確な血糖測定を達成するために、備える。
材料および方法の段落のgg)の項において概説されるようなABTSアッセイによって測定される場合に、参照としてGOx−T30V;I94Vの1.0から始まり、0.3以下、または0.25より小さい、または0.2より小さい、特には0.15より小さい、または0.1以下の本発明によるGOx変異体の残余の酸素活性へとむかう、酸素活性における低下、および
材料および方法の段落のff)の項において概説されるようなメディエーターアッセイによって測定される場合に、参照としてGOx−T30V;I94Vのメディエーター活性1.0から始まり、本発明によるGOx変異体の少なくとも1.5のメディエーター活性へとむかう、デヒドロゲナーゼ活性における同時的な増大
を示す。
本明細書の意味において、「酸素依存性(oxygen-dependent)」および「酸素依存度(oxygen dependency)」との表現は、材料および方法の段落のgg)の項において概説されるようなABTSアッセイによって測定される場合に、残余の酸素活性が、30%より大きいことによって特徴づけられるGOx活性を意味している。
AA アミノアンチピリン
HRP ホースラディッシュペルオキシダーゼ
GOx グルコース酸化酵素
GOx−WTまたはWT 真菌アスペルギルス ニガー由来の野生型GOx
GDH グルコース脱水素酵素
ABTS 2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸
PMO りんモリブデン酸
グルコース特異性、低下した酸素消費速度および/または酸素以外の電子メディエーターに対する増大した活性の観点から、GOx特性におけるその改良のための適切なアミノ酸置換を試験するために、本発明の特定のGOx変異体が
(i)その酸素消費速度に関して、すなわち、呈色ABTSアッセイにおける電子受容体としての酸素を使用する酵素活性に関して、
(ii)メディエーターの例としてのニトロソアニリンメディエーターによって媒介される電子移動に関して、
(iii)基質として種々の糖、すなわちグルコース、ガラクトース、マルトース、キシロース、マルトトリオースの存在下、メディエーターの例としてのニトロソアニリンメディエーターによって媒介される電子移動に関して
試験された。
本発明によって、Zhuら(2006;2007)に記載されている二重変異体が本明細書で提供される特定のアミノ酸置換のための出発物質として選択された。この二重変異体は、本質的に存在している2つの置換T30VおよびI94Vを有する(配列番号1)。GOx−T30V;I94Vは、改善された熱安定性、改善されたpH安定性および増加されたKcat値(69.5/sから137.7/s)を示す(Zhu, Z., Wang, M., Gautam, A., Nazor, J., Momeu, C., R, P., and U, S. (2007). Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus niger for ferrocenemethanol-mediated electron transfer. Biotechnology Jounal 2, 241-248)。
本発明者らはさらに、本明細書で提供されるGOx変異体の特定のアミノ酸位置、すなわちS53;A137;A173;A332;F414;およびV560を明らかにした。これらの位置は、図3に示されている。
特定のGOx変異体をさらに試験するために、本発明者らは、以下の特性
1)酸素消費、
2)基質としてのグルコース特異性、
3)ミカエリス−メンテン速度論(メディエーター活性/グルコース親和性)、および
4)温度安定性
を考慮して予備特性分析を行った。
酸素消費は、材料および方法の段落のgg)の項において概説されるように発色性基質ABTSの酸化によって間接的に測定された。このデータを試験するために、酸素消費が光学的酸素プローブを用いて直接的に測定された。GOx変異体は、反応導入において2U/Lに標準化された。
上記に既に概説されているように、基質グルコースに対するGOx特異性は、グルコース周辺には例えばガラクトース、マルトース、キシロース、およびマルトトリオースの4つの糖などの臨床的に関連する糖が存在しているため、酵素的グルコース測定において主要な役割を果たしている。したがって、本明細書で提供されるGOx変異体の特性を証明するために、前記糖が選択され、そして、グルコースと比較された。これらの試験のためにはメディエーターアッセイが使用され、181.8mMのそれぞれの糖が適用された。
メディエーター活性におけるより詳細な試験のため、およびグルコース親和性のため、本発明者らは本明細書において開示される変異体のミカエリス−メンテン速度論に関する試験を行った。
本発明の選択されたGOx変異体の温度安定性は、材料および方法の段落のff)の項において概説されるようなメディエーターアッセイを適用して分析された。追加のコントロールとして、アスペルギルス ニガーにおいて発現された、過度にグリコシル化されたGOxおよび脱グリコシル化されたGOx−WTもまた分析された。
最終的な特性分析のために、GOx−EZ07を発現しているS.セレビシエの各株が10Lの発酵槽中で培養され、得られたGOx−EZ07が続いて精製された。最終的な酵素調製物の純度は、pH7の50mM リン酸カリウム緩衝液中、90%より高かった。予備特性分析段階と同様に、酸素消費、特異性、活性、およびグルコース親和性が試験された。GOx濃度の具体的な決定には、ELISAが適用された(材料および方法の段落のee)の項参照)。
1a)酸素消費、
2a)基質としてのグルコース特異性、
3a)ミカエリス−メンテン速度論(メディエーター活性/グルコース親和性)、および
4a)温度安定性
においても特性分析された。
測定は1)に記載されるように行われた。全ての試験された酵素(GOx−WT、GOx−T30V;I94V、およびGOx−EZ07)は、材料および方法の段落のdd)の項において概説されるような標準的なプロトコールで精製され、そして、5μg/mLのタンパク質濃度に調製された。
測定は2)に記載されるように行われた。
測定は3)に記載されるように行われた。
測定は4)に記載されるように行われた。
本発明者らは、低下した酸素消費速度および/または増大した酸素以外の電子メディエーターに対するメディエーター活性の原因となる、6つの別個のアミノ酸位置S53;A137;A173;A332;F414;およびV560を発見した。さらに、本発明者らは、当業者らが、グルコース特異性、顕著に低下した酸素消費速度、および/または酸素以外の電子メディエーターに対する増大した活性の観点からGOx変異体をデザインすることを可能にさせる6つのアミノ酸位置のあいだの協同的効果を発見した。
A173およびA332の位置は、活性部位からかなり離れている。A173は、表面に位置しており、A332は基質入口チャネルに近接して位置している。酸素活性に影響を及ぼすF414およびV560の2つの位置は、活性部位に近接して位置している。F414はグルコース結合部位の上方に位置しており、そして、V560はグルコースおよびFADに接して位置している。2つの活性位置A137およびS53の両方はFADに近接する表面位置である。
選択された予備特性分析された変異体の結果は以下のとおりである。
図4は時間の関数としての反応混合物中の酸素含有量の進行(a)および1分あたりの酸素消費速度(b)を示している。対照として、GOx−T30V;I94V、GOx−WTおよびネガティブコントロール株の上澄み液が同様に分析された。
表3はグルコースに関する残余のGOx酵素活性を示している。
ミカエリス−メンテン速度論が図5に示されている。表4は、VmaxおよびKMの計算値を示している。
図6に、8つの異なる温度における残余の活性が図示されている。
全ての予備特性分析試験における特定の試験1)〜4)の決論において、GOx−EZ07およびGOx−EZ10変異体が最も重要な結果を示した。酸素活性における顕著な降下およびメディエーター活性における顕著な増大が、予備特性分析結果にしたがって達成された。GOx−EZ07およびGOx−EZ10の特異性はほぼ変化せず、キシロースに対するわずかな活性変化のみが検出された。EZ07の活性はEZ10の活性よりおよそ1.7倍高いため、GOx−EZ07が最終的な特性分析に選択された。
最終的な特性分析のために、精製されたGOx−EZ07変異体が選択された。
GOx−WT、GOx−T30V;I94VおよびGOx−EZ07のそれぞれの酸素消費速度が図7に示されている。
図8は、グルコース(100%)に関するGOx−WT、GOx−T30V;I94VおよびGOx−EZ07の残余の活性を示している。図8は、GOx−T30V;I94VおよびGOx−WTと比較してGOx−EZ07の特異性において顕著な変化はないことを示している。
図9は、メディエーターアッセイにおけるGOx−WT、GOx−T30V;I94VおよびGOx−EZ07の速度論を比較している。
図10は、GOx−WTおよびGOx−T30V;I94Vと比較して、GOx−EZ07の温度安定性がそれぞれの置換によって維持されていたことを示している。
本明細書において提供されるGOx変異体のグルコース特異性、媒介される電子移動に関する酵素活性および酸素活性に影響を示す6つのアミノ酸位置が、親変異体GOx−T30V;I94Vにおいて特定された。全ての位置が個々に飽和されている。協同的効果を調べるために活性部位(S53;A137;A173;A332;F414;V560)の周囲にクラスター化されている位置が同時に飽和された。親変異体の特性と比較して改良されたメディエーター活性および/または低下された酸素消費速度のための最も重要な変異体が予備特性分析のために選択された。変異体GOx−EZ07(A173V;A332S;F414I;およびV560Tの追加の置換を有する)が、本発明の意味におけるグルコース特異性、メディエーター活性および酸素消費速度の試験された特性において最も顕著な結果を示している。
全ての化学薬品は、分析用グレードであり、Sigma−Aldrich(Taufkirchen、Germany)、Applichem(Darmstadt、Germany)またはCarl Roth(Karlsruhe、Germany)から購入された。全ての酵素は、New England Biolabs(UK)およびSigma−Aldrich(Taufkirchen、Germany)から購入された。pHES2シャトルベクターおよび大腸菌株DH5aは、Invitrogen(Karlsruhe、Germany)から購入された。サッカロミセス セレビシエ株7087(ngd29mnnn1)は、Roche diagnosticsより提供された(Lehle, L., Eiden, A., Lehnert, K., Haselbeck, A., and Kopetzki, E. (1995). Glycoprotein biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: ngd29, an N-glycosylation mutant allelic to och1 having a defect in the initiation of outer chain formation. FEBS Lett 370, 41-45)。DNAはNanoDrop光度計(NanoDrop Technologies、Wilmington、DE、USA)を用いて定量化された。シークエンシングおよびオリゴヌクレオチド合成は、Eurofins MWG Operon(Ebersberg、Germany)によって行われた。使用されたプライマーは、表5に示されている(補足情報)。
多重サイトの飽和的変異のため、Omnichangeプロトコールが適用された(Dennig, A., Shivange, A.V., Marienhagen, J., and Schwaneberg, U. (2011). OmniChange: The Sequence Independent Method for Simultaneous Site-Saturation of Five Codons. PLoS ONE 6, e26222)。400μLのPCR反応混合物は、1ng/μLのプラスミドテンプレート、1×Phusion緩衝液(New England Biolabs、Frankfurt、Germany)、1U Phusionポリメラーゼおよび200μM dNTP’Sを含んでいた。反応混合物は、4つの等しい容積に分注され、そして、特定のサイトを標的とする250nMのフォーワードプライマーおよびリバースプライマーがフラグメント増幅のために添加された。ベクター骨格増幅のための混合物において、追加のdNTP’Sが最終的な濃度300μMに到達するように添加された。A173を標的とするフラグメント1のために、プライマーP7およびP8がマスターミックスに添加された。一方、A332飽和のためにはP9およびP10が使用された。F414サイトはP11およびP12を使用することにより標的化された。V560サイトはベクターの骨格に含まれ、P13およびP14によって増幅された。フラグメント増幅のためのPCRプログラムは、98℃で45秒間(1サイクル);98℃で15秒間;65℃で30秒間;72℃で30秒間(20サイクル);72℃で5分間(1サイクル)であった。ベクターの骨格の増幅のためには、伸長時間4分が適用された。全てのフラグメントはカラム精製され、そして、濃度がNanoDrop光度計(NanoDrop Technologies、Wilmington、DE、USA)上で測定された。PCR産物は続いて、DPnIによる終夜消化(それぞれ5U)に付された。
突然変異されたGOx遺伝子のpYES2ベクターの骨格へのクローニングは、リガーゼフリーの方法を介する組換えによって行われた(Oldenburg, K.R., Vo, K.T., Michaelis, S., and Paddon, C. (1997). Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Research 25, 451-452)。始めに、2μgのpYES2−GOx T30V、I94V二重変異体がSalI/BamHI消化(10U/μg DNA、6時間、37℃)によって直鎖化され、続いて、NucleoSpin(登録商標) Extract II−kit(MACHERY−NAGEL、Dueren、Germany)を用いるゲル抽出により精製された。ライブラリーの増幅に使用されるプライマーは、プライマー配列の全体が直鎖化されたベクターの骨格に相補的であるようにデザインされた。
2%グルコースを含むSC−U選択寒天プレート上で培養されたシングルコロニーが、1ウェル当たり100μLのSC−U培養液(1%グルコース)を含む96ウェルマイクロリッタープレート(PS−F底、greiner bio−one)中に楊枝を用いて移された。前培養のための培養は、以下の条件、900rpm、30℃、70%湿度、24時間、の下、プレートシェーカー(Infors GmbH、Eisenach、Germany)中で行われた。一定の量の前培養物がそれぞれのウェルからディープウェルプレート(riplate−rectangular、ritter)中の500μL SC−U自己誘導培養液(0.5%グルコース/2%ガラクトース)へと移された。本培養は、前培養と同じ条件下で、ただし72時間培養された。プレートは20分間、室温(RT)で、4000rpmで遠心分離された。結果として得られた上澄み液が活性測定に使用された。
前培養:500mLのSynY培養液(2%グルコース)がSc7087/pYES2−GOxの終夜培養物を用いて、OD 600=0.2まで播種され、培養が30℃で12時間および250rpmで5Lの振とうフラスコ中で行われた。本培養:10LのSynY培養液(1%グルコース)が500mLの前培養物で播種された。培養のためには、10Lの発酵槽が、以下の条件、温度:30℃、攪拌:400rpm、通気:1vvm、時間:48時間、を適用して使用された。
酵素免疫測定法(ELISA)がGOx濃度の特異的測定のために使用された。ストレプトアビジンでコートされたマイクロリッタープレート(Roche−Material No.11643673001)のそれぞれのウェルが100μLの一次抗体溶液(2μg/mL;ウサギ PAK GOD−ビオチン Acris R1083B)で満たされ、プレートは1時間、室温にてインキュベートされた。その後の洗浄工程(4回の、350μLの9g/L NaCl_0.1% Tween(登録商標) 20)の後、100mLの酵素サンプルがピペットにてウェルに加えられ、第二のインキュベーション工程に続けられた。洗浄工程が繰り返され、そして、プレートが100μLの二次抗体溶液(10μg/mL;ウサギ PAK GOD−HRP Acris R1083HRP)によって満たされた。第3のインキュベーションおよび洗浄工程の後、プレートは100μLのABTS/H2O2溶液(11684302001、Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)によって満たされた。プレートは、405nmでの吸収が測定される前に、室温にて30分インキュベートされた。アスペルギルス ニガー由来のグルコース酸化酵素(G7141−50KU SIGMA−ALDRICH)が内部標準として使用された。
液体取扱いのために、Brand社製のマルチチャネルピペット(Transferpette(登録商標) S−8)およびEppendorf社製のマルチチャネルピペット(Research(登録商標) pro)が使用された。75μLのサンプル(調製された上澄み液/酵素溶液)が96ウェル平底マイクロプレート(greiner bio−one)に移された。100μLのメディエーター溶液(19.05mM N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−4−ニトロソアニリン(Becker, O. (2005). Die Glucose-Dye-Oxidoreduktase in der klinischen Diagnostik. DISSERTATION thesis, Technische Universitat Kaiserslautern, Kaiserslautern)、Roche−Material No.100088314;5%(w/w)ポリビニルピロリドン、Roche−10003476964;pH7)および10μLの25mM りんモリブデン酸(Roche、Genisys−nr.:11889893001)が添加された。反応は25μLの基質溶液を添加すること、およびその後、1分間1000rpmでプレートを振とうすることによって開始された。りんモリブデン酸還元の速度が、マイクロプレートリーダー、Tecan Sunrise(登録商標)(Tecan Trading AG、Switzerland)を用いて700nmでモニターされた。速度分析のため、VmaxおよびKM値が、基質濃度の関数としてプロットされた(線形相関係数は0.99より大きかった)初期速度データから決定された。
液体取扱いのために、Brand社製のマルチチャネルピペット(Transferpette(登録商標) S−8)およびEppendorf社製のマルチチャネルピペット(Research(登録商標) pro)が使用された。75μLのサンプル(調製された上澄み液/酵素溶液)が、100μLのリン酸バッファー(pH7)を含む96ウェル平底マイクロプレート(greiner bio−one)に移された。20μLの反応混合物がそれぞれのウェルに添加され、以下の濃度が達成された:0.91U/mL HRP;2.3mM ABTS。反応は25μLの基質溶液を添加すること、およびその後、30秒間1000rpmでプレートを振とうすることによって開始された。ABTSの酸化が、マイクロプレートリーダー、FLUOstar(登録商標) Omega(BMG LABTECH)を用いて414nmで速度論的に測定された。速度分析のため、VmaxおよびKM値が、基質濃度の関数としてプロットされた(線形相関係数は0.99より大きかった)初期速度データから決定された。
酸素消費の直接的な測定のために、光学的な酸素プローブ「Fibox3−ミニセンサー 酸素濃度計」(Precision Sensing GmbH、Regensburg、Germany)が使用された。1540μLの反応混合物は、840μLのリン酸バッファー(0.2M/pH7)、175μLの基質溶液および525μLのGOx溶液から構成された。酸素消費(%/分)が速度論的に決定された。
100μLの酵素溶液が15分間、対応する温度でインキュベートされ、そしてその後、5分間氷上で冷却された。活性測定のために75μLが使用された。以下の温度:30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、および65℃が試験された。
Claims (27)
- a)配列番号1に記載のグルコース酸化酵素であって、2つのアミノ酸置換T30VおよびI94Vに加えて、前記配列番号1におけるS53;A137;A173;A332;F414;V560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を有するグルコース酸化酵素、または
b)b)のグルコース酸化酵素が2つのアミノ酸置換T30VおよびI94Vに加えて、前記配列番号1におけるS53;A137;A173;A332;F414;V560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を有するという条件で、a)のグルコース酸化酵素に少なくとも90%より高いアミノ酸配列同一性を示すグルコース酸化酵素、ただし、
b)のグルコース酸化酵素は、a)のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも70%より高い酵素活性を示し、および、a)のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも70%より高い酵素特異性を示し、かつ
b)のグルコース酸化酵素は、配列番号1のグルコース酸化酵素の、電子受容体としての酸素に対する活性より5倍低下された活性を示す、または配列番号1のグルコース酸化酵素の、酸素以外の電子受容体に対する活性より1.5倍増大された活性を示すか、またはその両方である、
からなる群より選択されるグルコース酸化酵素であって、
前記追加の置換のためのアミノ酸が、
S53位におけるPhe;および/または
A137位におけるLeu;および/または
A173位におけるIle、Thr、Val;および/または
A332位におけるSer、Val、Thr;および/または
F414位におけるIle、Leu、Met、Val;および/または
V560位におけるLeu、Pro、Thr
の群より選択される、グルコース酸化酵素。 - 前記b)のグルコース酸化酵素が、前記a)のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも80%より高い酵素活性を示すグルコース酸化酵素である請求項1記載のグルコース酸化酵素。
- 前記b)のグルコース酸化酵素が、前記a)のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも90%より高い酵素活性を示すグルコース酸化酵素である請求項1または2記載のグルコース酸化酵素。
- 前記b)のグルコース酸化酵素が、前記a)のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも80%より高い酵素特異性を示すグルコース酸化酵素である請求項1〜3のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記b)のグルコース酸化酵素が、前記a)のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも90%より高い酵素特異性を示すグルコース酸化酵素である請求項1〜4のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 電子受容体としての酸素に対する前記活性が、以下の工程
a)75μLのサンプル酵素溶液が100μLのリン酸バッファー(pH7)を含む平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)20μLの反応混合物が、以下の濃度、0.91U/mL HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ);2.3mM ABTS(2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸))、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の30秒間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)ABTSの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて414nmで速度論的に測定される工程
を含むABTSアッセイによって測定されており、
酸素以外の電子メディエーターの前記活性が、以下の工程
a)75μLの酵素溶液が平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)100μLのメディエーター溶液(19.05mMのN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−4−ニトロソアニリン);5%(w/w)ポリビニルピロリドン、pH7および20μLの25mM りんモリブデン酸が添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の1分間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて700nmでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される請求項1〜5のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。 - 前記酸素以外の電子メディエーターが、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ru−およびOS−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択される請求項1〜6のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 配列番号1に記載の2つの置換T30VおよびI94Vに加えて、配列番号1に記載のS53;A137;A173;A332;F414;およびV560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に、追加の、2つのアミノ酸置換を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 配列番号1に記載の2つの置換T30VおよびI94Vに加えて、配列番号1に記載のS53;A137;A173;A332;F414;およびV560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に、追加の、3つのアミノ酸置換を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 配列番号1に記載の2つの置換T30VおよびI94Vに加えて、配列番号1に記載のS53;A137;A173;A332;F414;およびV560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に、追加の、4つのアミノ酸置換を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 配列番号1に記載の2つの置換T30VおよびI94Vに加えて、配列番号1に記載のS53;A137;A173;A332;F414;およびV560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に、追加の、5つのアミノ酸置換を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 配列番号1に記載の2つの置換T30VおよびI94Vに加えて、配列番号1に記載のS53;A137;A173;A332;F414;およびV560の群より選択される6つの位置のうちの任意の位置に、追加の、6つのアミノ酸置換を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 配列番号1に記載の前記T30VおよびI94Vの置換に加えて、F414および/またはV560の位置における少なくとも1つの追加のアミノ酸置換が、A137および/またはA173および/またはA332の位置における少なくとも1つのアミノ酸置換と組み合わせられている請求項1〜12のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記T30VおよびI94Vの置換に加えて、配列番号4に記載のA173I;A332S;およびF414Lの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項1〜13のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記T30VおよびI94Vの置換に加えて、配列番号3に記載のA173V;A332S;F414I;およびV560Tの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項1〜14のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記T30VおよびI94Vの置換に加えて、配列番号6に記載のA173V;A332N;F414V;およびV560Lの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項1〜15のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 以下の工程
a)75μLの酵素溶液が平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)100μLのメディエーター溶液(19.05mMのN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−4−ニトロソアニリン);5%(w/w)ポリビニルピロリドン、pH7および20μLの25mM りんモリブデン酸が添加される工程
c)25μLのそれぞれの糖である基質溶液を添加することおよびその後の1分間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて700nmでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、少なくとも99.9%のグルコース特異性および/または4%未満のガラクトース特異性および/または0.3%未満のマルトース特異性および/または6%未満のキシロース特異性および/または0.1%未満のマルトトリオース特異性を示す請求項1〜16のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。 - 以下の工程
a)75μLの酵素溶液が平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)100μLのメディエーター溶液(19.05mMのN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−4−ニトロソアニリン);5%(w/w)ポリビニルピロリドン、pH7および20μLの25mM りんモリブデン酸が添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の1分間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて700nmでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによる配列番号1のGOxのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、400%より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示し、かつ
以下の工程
a)75μLのサンプル酵素溶液が100μLのリン酸緩衝液(pH7)を含む平底96ウェルマイクロプレートへと移される工程
b)20μLの反応混合物が、以下の濃度、0.91U/mL HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ);2.3mM ABTS(2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸))、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
c)25μLのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の30秒間の1000rpmでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
d)ABTSの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて414nmで速度論的に測定される工程
を含むABTSアッセイによる配列番号1のGOxの酸素活性と比較して、30%以下の酸素活性を示す請求項1〜17のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。 - 前記メディエーターアッセイによる配列番号1のGOxのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、500%より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示す請求項1〜18のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記メディエーターアッセイによる配列番号1のGOxのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、600%より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示す請求項1〜19のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記ABTSアッセイによる配列番号1のGOxの酸素活性と比較して、25%未満の酸素活性を示す請求項1〜20のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記ABTSアッセイによる配列番号1のGOxの酸素活性と比較して、20%未満の酸素活性を示す請求項1〜21のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記ABTSアッセイによる配列番号1のGOxの酸素活性と比較して、15%未満の酸素活性を示す請求項1〜22のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 前記ABTSアッセイによる配列番号1のGOxの酸素活性と比較して、10%以下の酸素活性を示す請求項1〜23のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素をエンコードする単離ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載のグルコース酸化酵素によってエクスビボサンプルにおいてグルコースを検出する、決定する、または測定するための方法であって、前記検出、決定または測定が、エクスビボサンプルを前記グルコース酸化酵素に接触させることを含む方法。
- グルコースの前記検出、決定または測定が、センサーまたはテストストリップ装置を使用して行われる請求項26記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13152935.6 | 2013-01-28 | ||
EP13152935 | 2013-01-28 | ||
PCT/EP2014/051602 WO2014114810A1 (en) | 2013-01-28 | 2014-01-28 | Novel glucose oxidases derived from aspergillus niger |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016506723A JP2016506723A (ja) | 2016-03-07 |
JP2016506723A5 JP2016506723A5 (ja) | 2017-02-23 |
JP6427110B2 true JP6427110B2 (ja) | 2018-11-21 |
Family
ID=47603476
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015554195A Active JP6427110B2 (ja) | 2013-01-28 | 2014-01-28 | アスペルギルスニガー由来の新規グルコース酸化酵素 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9926536B2 (ja) |
EP (1) | EP2948547B1 (ja) |
JP (1) | JP6427110B2 (ja) |
KR (1) | KR101854602B1 (ja) |
CN (1) | CN105026558B (ja) |
CA (1) | CA2891285C (ja) |
ES (1) | ES2779725T3 (ja) |
HK (1) | HK1217212A1 (ja) |
PL (1) | PL2948547T3 (ja) |
WO (1) | WO2014114810A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3572503B1 (en) * | 2018-05-22 | 2021-01-27 | ARKRAY, Inc. | Mutant glucose oxidase and use thereof |
CN108893453B (zh) * | 2018-06-04 | 2020-05-22 | 中国农业科学院饲料研究所 | 葡萄糖氧化酶god突变体及其基因和应用 |
CN111349622B (zh) * | 2018-12-20 | 2022-04-08 | 南京百斯杰生物工程有限公司 | 一种葡萄糖氧化酶突变体及其在工业化生产中的应用 |
EP3978602A4 (en) * | 2019-05-31 | 2023-07-05 | Nanjing Bestzyme Bio-engineering Co., Ltd. | THERMOSTABLE GLUCOSE OXIDASE |
CN112301009B (zh) * | 2019-07-26 | 2022-12-09 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体god及其基因和应用 |
US20230135464A1 (en) * | 2019-09-12 | 2023-05-04 | The Trustees Of Dartmouth College | Compositions and methods related to fungal hypoxia responsive morphology factor a (hrma) and biofilm architecture factor (baf) proteins |
KR102080670B1 (ko) | 2019-09-16 | 2020-02-24 | (주)아이언박스 | 글루코오스 옥시다아제를 함유하는 당뇨 진단용 조성물 |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6058958B2 (ja) | 1981-02-03 | 1985-12-23 | 静岡大学長 | 電子キヤリアー |
US5094951A (en) | 1988-06-21 | 1992-03-10 | Chiron Corporation | Production of glucose oxidase in recombinant systems |
DE3826922A1 (de) | 1988-08-09 | 1990-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen bestimmung eines analyten mittels enzymatischer oxidation |
DE4003194A1 (de) | 1990-02-03 | 1991-08-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und sensorelektrodensystem zur elektrochemischen bestimmung eines analyts oder einer oxidoreduktase sowie verwendung hierfuer geeigneter verbindungen |
GB9212010D0 (en) | 1992-06-05 | 1992-07-15 | Medisense Inc | Mediators to oxidoreductase enzymes |
WO1995014784A1 (en) * | 1993-11-24 | 1995-06-01 | Monsanto Company | Method of controlling plant pathogens |
US5393615A (en) | 1994-02-03 | 1995-02-28 | Miles Inc. | Mediators suitable for the electrochemical regeneration of NADH, NADPH or analogs thereof |
AUPM379294A0 (en) | 1994-02-10 | 1994-03-03 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms |
US5741688A (en) | 1994-05-03 | 1998-04-21 | Novo Nordisk A/S | Alkaline glucose oxidase obtained from cladosporium oxysporum |
US5498542A (en) | 1994-09-29 | 1996-03-12 | Bayer Corporation | Electrode mediators for regeneration of NADH and NADPH |
US5520786A (en) | 1995-06-06 | 1996-05-28 | Bayer Corporation | Mediators suitable for the electrochemical regeneration of NADH, NADPH or analogs thereof |
ATE223489T1 (de) | 1995-06-07 | 2002-09-15 | Danisco | Rekombinante hexose oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung |
DE19629656A1 (de) | 1996-07-23 | 1998-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostischer Testträger mit mehrschichtigem Testfeld und Verfahren zur Bestimmung von Analyt mit dessen Hilfe |
DE19639169A1 (de) | 1996-09-24 | 1998-04-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Redoxaktive Verbindungen und deren Anwendung |
US5879921A (en) | 1996-11-07 | 1999-03-09 | Novo Nordisk A/S | Recombinant expression of a glucose oxidase from a cladosporium strain |
DE19753847A1 (de) | 1997-12-04 | 1999-06-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Analytisches Testelement mit Kapillarkanal |
US5997817A (en) | 1997-12-05 | 1999-12-07 | Roche Diagnostics Corporation | Electrochemical biosensor test strip |
CN1098931C (zh) * | 1999-01-28 | 2003-01-15 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 葡萄糖氧化酶基因在培育抗病转基因植物中的应用 |
US6376210B1 (en) * | 1999-07-06 | 2002-04-23 | General Atomics | Methods and compositions for assaying analytes |
US8226814B2 (en) | 2001-05-11 | 2012-07-24 | Abbott Diabetes Care Inc. | Transition metal complexes with pyridyl-imidazole ligands |
CA2529378C (en) | 2003-06-20 | 2014-04-15 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Method and reagent for producing narrow, homogenous reagent strips |
DE202006004030U1 (de) | 2006-03-14 | 2006-05-18 | Hidde, Axel R., Dr. Ing. | Stoßdämpfender pumpender dampfdurchlässiger wasserdichter Schuh |
JP2010513511A (ja) | 2006-12-20 | 2010-04-30 | ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン | 貯蔵に安定なグルコースオキダーゼ |
KR100964026B1 (ko) | 2008-02-22 | 2010-06-15 | 한국생명공학연구원 | 글루코즈 옥시다제 변형체를 이용한 혈당 센서 |
US8262874B2 (en) | 2008-04-14 | 2012-09-11 | Abbott Diabetes Care Inc. | Biosensor coating composition and methods thereof |
EP2415863A1 (en) | 2010-08-03 | 2012-02-08 | B.R.A.I.N. | Mutant glucose oxidase |
ES2556605T3 (es) * | 2011-08-25 | 2016-01-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Glucosa oxidasa |
CN102382773B (zh) * | 2011-10-26 | 2013-01-30 | 江南大学 | 一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用 |
-
2014
- 2014-01-28 CN CN201480005873.XA patent/CN105026558B/zh active Active
- 2014-01-28 PL PL14702514T patent/PL2948547T3/pl unknown
- 2014-01-28 JP JP2015554195A patent/JP6427110B2/ja active Active
- 2014-01-28 KR KR1020157020392A patent/KR101854602B1/ko active IP Right Grant
- 2014-01-28 EP EP14702514.2A patent/EP2948547B1/en active Active
- 2014-01-28 CA CA2891285A patent/CA2891285C/en active Active
- 2014-01-28 ES ES14702514T patent/ES2779725T3/es active Active
- 2014-01-28 WO PCT/EP2014/051602 patent/WO2014114810A1/en active Application Filing
-
2015
- 2015-07-27 US US14/810,070 patent/US9926536B2/en active Active
-
2016
- 2016-04-29 HK HK16104912.9A patent/HK1217212A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016506723A (ja) | 2016-03-07 |
ES2779725T3 (es) | 2020-08-19 |
EP2948547B1 (en) | 2020-01-22 |
CA2891285A1 (en) | 2014-07-31 |
CN105026558B (zh) | 2020-05-15 |
KR101854602B1 (ko) | 2018-05-04 |
PL2948547T3 (pl) | 2020-06-15 |
EP2948547A1 (en) | 2015-12-02 |
HK1217212A1 (zh) | 2016-12-30 |
CN105026558A (zh) | 2015-11-04 |
US20160002609A1 (en) | 2016-01-07 |
US9926536B2 (en) | 2018-03-27 |
CA2891285C (en) | 2021-05-04 |
KR20150101466A (ko) | 2015-09-03 |
WO2014114810A1 (en) | 2014-07-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6427110B2 (ja) | アスペルギルスニガー由来の新規グルコース酸化酵素 | |
Gutierrez et al. | Reengineered glucose oxidase for amperometric glucose determination in diabetes analytics | |
KR20130038914A (ko) | 글루코스 탈수소효소 | |
US9506042B2 (en) | Glucose dehydrogenase | |
RU2652913C2 (ru) | Новые варианты глюкозооксидазы | |
JP7042085B2 (ja) | シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法 | |
EP3414325B1 (en) | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from rhodobacter sphaeroides as well as methods and uses involving the same | |
KR100879491B1 (ko) | 아미노산 삽입을 포함하는 유전자 엔지니어링된피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 | |
JP2022133274A (ja) | フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 | |
KR20180087329A (ko) | 알칼리게네스 파에칼리스로부터의 돌연변이체 3-히드록시부티레이트 탈수소효소 뿐만 아니라 이의 관련 방법 및 용도 | |
US9796963B2 (en) | Glucose dehydrogenase | |
JPWO2016063984A1 (ja) | デヒドロゲナーゼ活性の向上したアマドリアーゼ | |
JP6934720B2 (ja) | 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JPWO2015129475A1 (ja) | 比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ | |
WO2018115422A1 (en) | Glucose dehydrogenase variants with improved properties | |
KR20050042771A (ko) | 글루코오스 탈수소효소 | |
JP7165493B2 (ja) | 保存安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ及び持続血糖測定 | |
JP2022173549A (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼを用いた持続血糖測定 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170123 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170123 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171128 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180228 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180427 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180528 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181002 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181026 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6427110 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |