CN102382773B

CN102382773B - 一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用

Info

Publication number: CN102382773B
Application number: CN 201110329425
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 顾磊; 张娟; 堵国成; 沈伊娜; 费丽杰; 刘玮
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-10-26
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-10-26
Also published as: CN102382773A

Abstract

本发明公开了一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选得到一株黑曲霉，发酵96小时葡萄糖氧化酶活可达2.2U mL^-1，于2011年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2011291，分类学命名：黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。本发明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶产量高的优点，经优化摇瓶产量可达4.6U mL^-1；该菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受较高温度，粗酶液40℃、45℃条件下，60分钟酶活没有损失，60℃条件下30分钟降到降到原有酶活的65％，60分钟降到50％。

Description

一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用

技术领域

本发明涉及一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD，E.C.1.1.3.4)是一种黄素糖蛋白。葡萄糖氧化酶分子为二聚体，含有两个亚基，分子量约160kDa，每亚基结合一个FAD分子，因此每个酶分子含有两个FAD分子。它是一种需氧脱氢酶，以氧为电子接受体，能专一地氧化β-D-葡萄糖为葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶由于具有催化专一性和高效性的优点，在食品、化工、医药、农业、饲料等领域有比较广泛的应用。由于葡萄糖氧化酶良好的应用效果，目前已经在很多行业中得到了广泛应用，近年来倍受关注，市场需求量也越来越大。

发明内容

本发明提供了一种用于葡萄糖氧化酶生产的黑曲霉，该菌株于2011年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2011291，分类学命名：黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。

上述黑曲霉的筛选方法，包括如下步骤：

1)定性筛选：采用Fiedure.K.J显色法，将分离出黑曲霉菌株点种于平板分离培养基，28℃培养3～4d后直至出现蓝色颜色圈，进行蓝色圈大小定性比对。所述平板分离培养基组成如下：葡萄糖40g L^-1，蛋白胨2g L^-1，，氯化钾0.5g L^-1，碳酸钙3.5g L^-1，可溶性淀粉10g L^-1，KI 1.7g L^-1，脱氧胆酸钠0.2g L^-1，琼脂20g L^-1，磷酸缓冲液0.1mol L^-1，pH 5.6；

2)定量筛选：将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3mL的18％葡萄糖，0.1mL的90U mL^-1辣根过氧化物酶，35℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL，反应3min后，加入2mol L^-1硫酸终止反应，取出试管，测OD540的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。

所述1mol L^-1磷酸缓冲液(pH6.0)：将132mL的1mol L^-1磷酸氢二钾(K₂HPO₄)和868ml的1mol L^-1磷酸二氢钾(KH₂PO₄)混合，调整pH值到6.0，过滤灭菌，常温保存。

所述邻联茴香胺溶液：0.1g邻联茴香胺，溶于10mL甲醇，为储存液，4℃保存，实验前取0.1ml储存液，溶于12mL的0.1mol L^-1，pH 6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中；所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：0.2mol L^-1磷酸氢二钠溶液330.5mL与0.1mol L^-1柠檬酸缓冲液169.5mL混合，调整pH值到6.2，去离子水定容至1L，常温保存。

经定性定量筛选后，获得一株黑曲霉BBE11721，发酵96小时后葡萄糖氧化酶活可达2.2U mL^-1，对酶的热稳定性进行了分析，将酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下，每隔10分钟取样测定酶活。40℃与45℃下，60分钟酶活没有下降。50℃与55℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到60％。60℃下，30分钟降到降到原有酶活的65％，60分钟降到50％。

本发明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶产量高的优点，经优化摇瓶产量可达4.6U mL^-1；该菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受较高温度，粗酶液40℃、45℃条件下，60分钟酶活没有损失，60℃条件下30分钟降到降到原有酶活的65％，60分钟降到50％。

附图说明

图1：葡萄糖氧化酶活标准曲线

图2：黑曲霉BBE11721的系统发育树

图3：采用所筛菌株在平板分离培养基上的显色效果图

图4：黑曲霉BBE11721发酵过程曲线

图5：40℃水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性

图6：55℃水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性

图7：60℃水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性

具体实施方式

实施例1产葡萄糖氧化酶菌株的定性筛选方法

(一)样品来源

采样来源为富含淀粉的土壤。

(二)培养方法

将采样所得土壤，取土壤样品5g，加入45mL的无菌水(含50u庆大霉素)中，摇床培养(200r min^-1)。

斜面培养28℃恒温，培养4d后置于4℃冰箱保存备用。

摇床培养250mL摇瓶50mL装量，28℃恒温，旋转摇床(200r min^-1)，培养4d。

(三)定性筛选方法

采用Fiedure.K.J显色法，将富集培养后的土壤悬液稀释到10^-4，分离出黑曲霉菌株。再将其点种于平板分离培养基，28℃培养3～4d后出现蓝色颜色圈，挑取颜色圈较大的的菌株接种至斜面培养。

实施例2：产葡萄糖氧化酶的黑曲霉的定量筛选方法

(一)实验试剂

0.1mol L^-1磷酸氢二钠-0.05mol L^-1柠檬酸缓冲液(pH6.2)：0.2mol L^-1磷酸氢二钠溶液330.5mL与0.1mol L^-1柠檬酸缓冲液169.5mL混合，调整pH值到6.2，去离子水定容至1L，常温保存。

1mol L^-1磷酸缓冲液(pH6.0)：将132mL的1mol L^-1磷酸氢二钾(K₂HPO₄)和868m1的1mol L^-1磷酸二氢钾(KH₂PO₄)混合，调整pH值到6.0，过滤灭菌，常温保存。

邻联茴香胺溶液：0.1g邻联茴香胺，溶于10mL甲醇，为储存液，4℃保存，实验前取0.1ml储存液，溶于12mL的0.1mol L^-1，pH 6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中。

(二)酶活测定方法

将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3mL的18％葡萄糖，0.1mL的90U mL^-1辣根过氧化物酶，35℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL，反应3min后，加入2mol L^-1硫酸终止反应，取出试管，测OD540的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。以上海生工葡萄糖氧化酶做为标准品。将葡萄糖氧化酶标准品稀释成0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4U mL^-1，在试管中加入2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3mL的18％D-葡萄糖和0.1mL的90U mL^-1辣根过氧化物酶溶液，35℃保温2min，加入0.1mL稀释好的葡萄糖氧化酶标准品，反应3min后加入2mL的2mol L^-1硫酸终止反应，在540nrn下测定反应液吸光值。如下：

表1葡萄糖氧化酶标准曲线

表2平板显色分离与酶活测定试验结果

经定性定量筛选发现，平板显色菌株G2的酶活最高，发酵96小时葡萄糖氧化酶活可达2.2U mL^-1。

经鉴定该菌株为黑曲霉BBE11721，于2011年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2011291，分类学命名：黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。

实施例3：产葡萄糖氧化酶筛选出发菌株的培养基优化

(一)菌株

出发菌株选择的是定性定量筛选结果最佳的G2菌株，发酵96小时后葡萄糖氧化酶活可达2.2U mL^-1。

(二)培养基优化

选取不同的碳源、氮源和无机盐，对所筛选菌株进行培养基优化，优化后发酵培养基组成如下：葡萄糖80g L^-1，蛋白胨3g L^-1，磷酸二氢钾2g L^-1，七水合硫酸镁0.7g L^-1，氯化钾0.5g L^-1，硝酸钠4g L^-1，碳酸钙3.5g L^-1，pH自然，发酵时间为96小时。

(三)酶活测定方法

将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3 mL的18％葡萄糖，0.1mL的90U mL^-1辣根过氧化物酶，35℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL，反应3min后，加入2mol L^-1硫酸终止反应，取出试管，测OD540的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。

出发菌株经过碳氮源优化后，发酵96小时的葡萄糖氧化酶活最高达到4.6U mL^-1。

实施例4：葡萄糖氧化酶的热稳定性分析

对酶的热稳定性进行了分析，将酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下，每隔10分钟取样测定酶活。

在40℃与45℃水浴保存下，60分钟酶活没有下降。50℃与55℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到60％。60℃下，30分钟降到原有酶活的65％，60分钟降到50％。

Claims

1.一种黑曲霉，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2011291，分类学命名：黑曲霉 BBE11721（Aspergillus niger BBE11721）。

2、权利要求1所述黑曲霉在葡萄糖氧化酶发酵生产中的应用。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：葡萄糖80 g/L，蛋白胨3 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，七水合硫酸镁0.7 g/L，氯化钾0.5 g/L，硝酸钠4 g/L，碳酸钙3.5 g/L，pH 自然。