CN102382773A - 一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用,属于微生物技术领域。本发明筛选得到一株黑曲霉,发酵96小时葡萄糖氧化酶活可达2.2UmL-1,于2011年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M2011291,分类学命名:黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。本发明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶产量高的优点,经优化摇瓶产量可达4.6UmL-1;该菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受较高温度,粗酶液40℃、45℃条件下,60分钟酶活没有损失,60℃条件下30分钟降到降到原有酶活的65%,60分钟降到50%。
Description
技术领域
本发明涉及一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用,属于微生物技术领域。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,简称GOD,E.C.1.1.3.4)是一种黄素糖蛋白。葡萄糖氧化酶分子为二聚体,含有两个亚基,分子量约160kDa,每亚基结合一个FAD分子,因此每个酶分子含有两个FAD分子。它是一种需氧脱氢酶,以氧为电子接受体,能专一地氧化β-D-葡萄糖为葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶由于具有催化专一性和高效性的优点,在食品、化工、医药、农业、饲料等领域有比较广泛的应用。由于葡萄糖氧化酶良好的应用效果,目前已经在很多行业中得到了广泛应用,近年来倍受关注,市场需求量也越来越大。
发明内容
本发明提供了一种用于葡萄糖氧化酶生产的黑曲霉,该菌株于2011年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉、武汉大学,保藏编号:CCTCC NO:M2011291,分类学命名:黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。
上述黑曲霉的筛选方法,包括如下步骤
1)定性筛选:采用Fiedure.K.J显色法,将分离出黑曲霉菌株点种于平板分离培养基,28℃培养3~4d后直至出现蓝色颜色圈,进行蓝色圈大小定性比对。所述平板分离培养基组成如下:葡萄糖40g L-1,蛋白胨2g L-1,,氯化钾0.5g L-1,碳酸钙3.5g L-1,可溶性淀粉10g L-1,KI 1.7g L-1,脱氧胆酸钠0.2g L-1,琼脂20g L-1,磷酸缓冲液0.1mol L-1,pH 5.6;
2)定量筛选:将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2.5mL邻联茴香胺溶液,0.3mL的18%葡萄糖,0.1mL的90Um L-1辣根过氧化物酶,35℃保温2min后,向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL,反应3min后,加入2mol L-1硫酸终止反应,取出试管,测OD540的吸光值,以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果,计算葡萄糖氧化酶活力单位。
所述1mol L-1磷酸缓冲液(pH6.0):将132mL的1mol L-1磷酸氢二钾(K2HPO4)和868ml的1mol L-1磷酸二氢钾(KH2PO4)混合,调整pH值到6.0,过滤灭菌,常温保存。
所述邻联茴香胺溶液:0.1g邻联茴香胺,溶于10mL甲醇,为储存液,4℃保存,实验前取0.1ml储存液,溶于12mL的0.1mol L-1,pH 6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中;所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液:0.2mol L-1磷酸氢二钠溶液330.5mL与0.1mol L-1柠檬酸缓冲液169.5mL混合,调整pH值到6.2,去离子水定容至1L,常温保存。
经定性定量筛选后,获得一株黑曲霉BBE11721,发酵96小时后葡萄糖氧化酶活可达2.2 UmL-1,对酶的热稳定性进行了分析,将酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下,每隔10分钟取样测定酶活。40℃与45℃下,60分钟酶活没有下降。50℃与55℃下,30分钟降到原有酶活的80%,60分钟降到60%。60℃下,30分钟降到降到原有酶活的65%,60分钟降到50%。
本发明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶产量高的优点,经优化摇瓶产量可达4.6U mL-1;该菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受较高温度,粗酶液40℃、45℃条件下,60分钟酶活没有损失,60℃条件下30分钟降到降到原有酶活的65%,60分钟降到50%。
附图说明
图1:葡萄糖氧化酶活标准曲线
图2:黑曲霉BBE11721的系统发育树
图3:采用所筛菌株在平板分离培养基上的显色效果图
图4:黑曲霉BBE11721发酵过程曲线
图5:40℃水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性
图6:55℃水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性
图7:60℃水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性
具体实施方式
实施例1产葡萄糖氧化酶菌株的定量筛选方法
(一)样品来源
采样来源为富含淀粉的土壤。
(二)培养方法
将采样所得上壤,取土壤样品5g,加入45mL的无菌水(含50u庆大霉素)中,摇床培养(200r min-1)。
斜面培养28℃恒温,培养4d后置于4℃冰箱保存备用。
摇床培养250mL摇瓶50mL装量,28℃恒温,旋转摇床(200r min-1),培养4d。
(三)定性筛选方法
采用Fiedure.K.J显色法,将富集培养后的土壤悬液稀释到10-4,分离出黑曲霉菌株。再将其点种于平板分离培养基,28℃培养3~4d后出现蓝色颜色圈,挑取颜色圈较大的的菌株接种至斜面培养。
实施例2:产萄萄糖氧化酶的黑曲霉的定量筛选方法
(一)实验试剂
0.1mol L-1磷酸氢二钠-0.05mol L-1柠檬酸缓冲液(pH6.2):0.2mol L-1磷酸氢二钠溶液330.5mL与0.1mol L-1柠檬酸缓冲液169.5mL混合,调整pH值到6.2,去离子水定容至1L,常温保存。
1mol L-1磷酸缓冲液(pH6.0):将132mL的1mol L-1磷酸氢二钾(K2HPO4)和868ml的1mol L-1磷酸二氢钾(KH2PO4)混合,调整pH值到6.0,过滤灭菌,常温保存。
邻联茴香胺溶液:0.1g邻联茴香胺,溶于10mL甲醇,为储存液,4℃保存,实验前取0.1ml储存液,溶于12mL的0.1mol L-1,pH 6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中。
(二)酶活测定方法
将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2.5mL邻联茴香胺溶液,0.3mL的18%葡萄糖,0.1mL的90U mL-1辣根过氧化物酶,35℃保温2min后,向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL,反应3min后,加入2mol L-1硫酸终止反应,取出试管,测OD540的吸光值,以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果,计算葡萄糖氧化酶活力单位。以上海生工葡萄糖氧化酶做为标准品。将葡萄糖氧化酶标准品稀释成0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,2.4U mL-1,在试管中加入2.5mL邻联茴香胺溶液,0.3mL的18%D-葡萄糖和0.1mL的90U mL-1辣根过氧化物酶溶液,35℃保温2min,加入0.1mL稀释好的葡萄糖氧化酶标准品,反应3min后加入2mL的2mol L-1硫酸终止反应,在540nrn下测定反应液吸光值。如下:
表1葡萄糖氧化酶标准曲线
表2平板显色分离与酶活测定试验结果
经定性定量筛选发现,平板显色菌株G2的酶活最高,发酵96小时葡萄糖氧化酶活可达2.2U mL-1。
经鉴定该菌株为黑曲霉BBE11721,于2011年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉、武汉大学,保藏编号:CCTCC NO:M2011291,分类学命名:黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。
实施例3:产葡萄糖氧化酶筛选出发菌株的培养基优化
(一)菌株
出发菌株选择的是定性定量筛选结果最佳的G2菌株,发酵96小时后葡萄糖氧化酶活可达2.2U mL-1。
(二)培养基优化
选取不同的碳源、氮源和无机盐,对所筛选菌株进行培养基优化,优化后发酵培养基组成如下:葡萄糖80g L-1,蛋白胨3g L-1,磷酸二氢钾2g L-1,七水合硫酸镁0.7g L-1,氯化钾0.5g L-1,硝酸钠4g L-1,碳酸钙3.5g L-1,pH自然,发酵时间为96小时。
(三)酶活测定方法
将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2.5mL邻联茴香胺溶液,0.3mL的18%葡萄糖,0.1mL的90U mL-1辣根过氧化物酶,35℃保温2min后,向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL,反应3min后,加入2mol L-1硫酸终止反应,取出试管,测OD540的吸光值,以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果,计算葡萄糖氧化酶活力单位。
出发菌株经过碳氮源优化后,发酵96小时的葡萄糖氧化酶活最高达到4.6U mL-1。
实施例4:葡萄糖氧化酶的热稳定性分析
对酶的热稳定性进行了分析,将酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下,每隔10分钟取样测定酶活。
在40℃与45℃水浴保存下,60分钟酶活没有下降。50℃与55℃下,30分钟降到原有酶活的80%,60分钟降到60%。60℃下,30分钟降到原有酶活的65%,60分钟降到50%。
Claims (4)
1.一种黑曲霉,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M2011291,分类学命名:黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。
2.一种权利要求1所述黑曲霉的筛选方法,其特征在于,具体步骤如下:
1)定性筛选:采用Fiedure.K.J显色法,将分离出黑曲霉菌株点种于平板分离培养基,28℃培养3~4d后直至出现蓝色颜色圈,进行蓝色圈大小定性比对;
2)定量筛选:将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2.5mL邻联茴香胺溶液,0.3mL的18%葡萄糖,0.1mL的90U mL-1辣根过氧化物酶,35℃保温2min后,向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL,反应3min后,加入2mol L-1硫酸终止反应,取出试管,测OD540的吸光值,以热失活的酶液做空白对照,根据标准曲线的结果,计算葡萄糖氧化酶活力单位。
3.权利要求1所述黑曲霉在葡萄糖氧化酶发酵生产中的应用。
4.根据权利要求3所述方法,其特征在于,发酵培养基组成如下:葡萄糖80g L-1,蛋白胨3g L-1,磷酸二氢钾2g L-1,七水合硫酸镁0.7gL-1,氯化钾0.5g L-1,硝酸钠4g L- 1,碳酸钙3.5g L-1,pH自然。
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