KR100879491B1 - 아미노산 삽입을 포함하는 유전자 엔지니어링된피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 - Google Patents

아미노산 삽입을 포함하는 유전자 엔지니어링된피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아시네토백터 칼코아세티커스 (Acinetobacter calcoaceticus) 로부터 알려진 아미노산 서열에 상응하는 428 및 429 위치 사이에 아미노산 삽입을 포함하는 가용성 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ)-의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH) 의 개선된 변이체, 그러한 s-GDH 변이체를 엔코딩 하는 유전자, 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성을 갖는 상기 s-GDH 의 단백질, 및 그러한 s-GDH 변이체의 상이한 적용, 특히 시료 중 당의 농도, 그중에서도 글루코오스의 농도를 결정하기 한 적용에 관한 것이다.
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Description

아미노산 삽입을 포함하는 유전자 엔지니어링된 피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 {GENETICALLY ENGINEERED PYRROLOQUINOLINE QUINONE DEPENDENT GLUCOSE DEHYDROGENASE COMPRISING AN AMINO ACID INSERTION}
본 발명은 아시네토백터 칼코아세티커스 (Acinetobacter calcoaceticus) 로부터 알려진 아미노산 서열에 상응하는 428 및 429 위치 사이에 아미노산 삽입을 포함하는 가용성 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ)-의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH) 의 개선된 변이체, 그러한 s-GDH 변이체를 엔코딩 하는 유전자, 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성을 갖는 상기 s-GDH 의 단백질, 및 그러한 s-GDH 변이체의 상이한 적용, 특히 시료 중 당의 농도, 그중에서도 글루코오스의 농도를 결정하기 위한 적용에 관한 것이다.
혈액 글루코오스 농도의 측정은 당뇨의 임상적 진단 및 관리에 매우 중요하다. 전세계적으로 약 1억 5000만명이 만성 질병인 당뇨병을 앓고 있으며, WHO 에 따르면 이 숫자는 2025년도까지 2배가 될 수 있다. 당뇨가 쉽게 진단되고 치료되기는 하지만, 성공적인 장기적 관리는 혈액 글루코오스 농도를 신속하고 정확하게 기록할 수 있는 저가의 진단 도구를 필요로 한다. PQQ-의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (EC 1.1.99.17) 는 글루코오스가 글루코놀락톤으로 산화되는 반응을 촉매화한다. 따라서, 이러한 유형의 효소는 혈당 측정에 사용된다. 이러한 도구 중 하나는 아시네토백터 칼코아세티커스로부터 원래 유래되는 피롤로퀴놀린 퀴논-함유 효소인 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GlucDOR, EC 1.1.99.17) 이다.
퀴노단백질은 퀴논을 보조인자로 사용하여 알코올, 아민 및 알도오스를, 그들의 상응하는 락톤, 알데하이드 및 알돌산으로 산화시킨다 (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-284; Davidson, V. L., in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker; Anthony, C, Biochem. J. 320 (1996) 697-711; Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C, Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417; Anthony, C. and Ghosh, M., Prog. Biophys. MoI. Biol. 69 (1998) 1-21). 퀴노단백질 중, 비공유적으로 결합된 2,7,9-트리카르복시-lH-피롤로[2,3-f]퀴놀린-4,5-디온 (PQQ) 보조인자를 함유하는 것이 가장 큰 하위군을 구성한다 (Duine 1991, 상기 참조). 지금까지 알려진 모든 박테리아성 퀴논 글루코오스 디히드로게나아제는 PQQ 를 보조인자로 갖는 상기 하위군에 속한다 (Anthony and Ghosh 1997 위 참조, Goodwin, P.M. and Anthony, C, Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80; Anthony, C, Adv. in Phot, and Resp. 15 (2004) 203-225).
두 종류의 PQQ-의존성 글루코오스 디히드로게나아제 (EC 1.1.99.17) 가 박테리아에서 특성화되었다: 하나는 막결합 (m-GDH) 이며, 다른 것은 가용성 (s-GDH) 이다. 상기 두 유형은 어떠한 현저한 서열 상동성도 공유하지 않았다 (Cleton- Jansen, A. M., et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436; Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79; Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791). 이들은 그 동역학적 특성 및 그 면역학적 특성 모두에 있어서 상이하다 (Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnol. & Biochem. 59 (1995) 1548-1555). m-GDHs 는 그람-음성 박테리아에서 보편적이지만, s-GDH 는 A. 칼시코아세티커스 (Duine, J.A., 1991a; Cleton-Jansen, A.M. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125; Matsushita and Adachi, 1993) 및 A. 바우마니이 (A. baumannii) (JP 11243949) 와 같은 아시네토백터 균주의 원형질막주위 공간에서만 발견되었다.
서열 데이터베이스를 통해, 전장 A. 칼코아세티커스 s-GDH 와 상동성인 두개의 서열이 E. 콜라이 (E. coli) K-12 및 시네코시스티스 종에서 확인되었다. 추가적으로, A. 칼코아세티커스 s-GDH 와 상동성인 두 개의 불완전 서열이 또한 P. 애루지노사 (P. aeruginosa) 및 보데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis) (Oubrie et al. 1999 a, b, c) 및 엔테로박터 인터미디엄 (Enterobacter intermedium) (Kim, CH. et al., Current Microbiol. 47 (2003) 457-461) 에서 각각 발견되었다. 이들 4 개의 비특성화 단백질의 추론된 아미노산 서열은 A. 칼코아세티커스 s-GDH 와 밀접하게 관련되며 추정 활성 부위 내의 많은 잔기가 완전 히 보존 되어 있다. 이러한 동종 단백질은 유사한 구조를 가지며 유사한 PQQ-의존성 반응을 촉진시킬 수 있다 (Oubrie et al., 1999 a, b, c; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151; Reddy, S., and Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438; Yamada, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192).
박테리아성 s-GDH 및 m-GDH 는 꽤 다른 서열 및 다른 기질 특이성을 지니는 것으로 발견되었다. 예를 들어, A. 칼코아세티커스는 두 개의 다른 PQQ-의존성 글루코오스 디히드로게나아제를 함유하며, 하나는 생체 내에서 활성인 m-GDH 이고, 기타는 오로지 시험관 내 활성만 나타낼 수 있는 s-GDH 로 불린다. Cleton-Jansen 등, 1988; 1989 a, b 는 두 개의 GDH 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하였고 이들 GDH 유전자 모두의 DNA 서열을 결정하였다. m-GDH 및 s-GDH 간에 명백한 상동성이 없으며 m-GDH 및 s-GDH 가 두 개의 완전히 상이한 분자를 나타내는 것을 확증한다 (Laurinavicius, V., et al, Biologija (2003) 31-34).
A. 칼코아세티커스로부터의 s-GDH 유전자가 E. 콜라이에 클로닝되었다. 세포 내에서 제조된 후, s-GDH 는 세포질막을 통해 원형질막주위 공간으로 이동한다 (Duine, J. A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Matsushita, K. and Adachi, O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker). A. 칼코아세티커스 로부터의 천연 s-GDH 와 같이, E. 콜라이에서 발현되는 재조합 s-GDH 는 단량체 당 3 개의 칼슘 이온 및 1 개의 PQQ 분자를 갖는 동종이합체이다 (Dokter, P. et al., Biochem. J. 239 (1986) 163-167; Dokter, P. et al., FEMS Microbiol. Lett. 43 (1987) 195-200; Dokter, P. et al., Biochem. J. 254 (1988) 131-138; Olsthoorn, A. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Oubrie, A., et al., J. MoI. Biol. 289 (1999) 319-333, Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791, Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187- 5194). s-GDH 는 광범위한 모노사카리드 및 다이사카리드를 상응하는 케톤으로 산화시키고, 이는 나아가 알돈산으로 가수분해되며, 이는 또한 PMS (페나진 메토술페이트), DCPIP (2,6-디클로로페놀린도페놀), WB (Wurster's blue) 및 단쇄 유비퀴논 예컨대 유비퀴논 Q1 및 유비퀴논 Q2 (Matsushita, K., et al., Biochem. 28 (1989) 6276-6280; Matsushita, K., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), 몇몇의 인위적 전자 수용체 예컨대 N-메틸페나조늄 메틸 술페이트 (Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochem. 37 (1998) 13854-13861) 및 전도성 중합체 (Ye, L., et al., Anal. Chem. 65 (1993) 238) 에 전자를 제공할 수 있다. 글루코오스에 대한 s-GDH 의 높은 특이적 활성 (specific activity) (Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., (1996), 위 참조) 및 그의 넓은 인위적 전자 수용체 특이성을 고려하여, 이 효소는 분석적 적용, 특히 진단 적용에서의 글루코오스 측정을 위한 테스트 스트립 (test strip) 또는 (바이오-)센서에서의 사용에 적합하다 (Kaufmann, N. et al., Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH; Malinauskas, A.; et al., Sensors and Actuators, B: Chemical BlOO (2004) 395-402).
글루코오스 산화는 3개 이상의 상당히 다른 군의 효소, 즉, NAD/P-의존성 글루코오스 디히드로게나아제, 플라보단백질 글루코오스 옥시다제 또는 퀴노단백질 GDH (Duine, J.A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23) 에 의해 촉매화될 수 있다. 환원된 s-GDH 의 다소 느린 자체산화가 관찰되었으며, 산소가 s-GDH 에 대한 매우 빈약한 수용체임을 나타냈다 (Olsthoorn and Duine, 1996). s-GDH 는 환원된 퀴논으로부터 PMS, DCPIP, WB 와 같은 매개체 및 Q1 및 Q2 과 같은 단쇄 유비퀴논에 전자를 효율적으로 제공할 수 있지만, 이는 산소에 직접 전자를 효율적으로 제공할 수 없다.
예를 들어 당뇨 환자로부터의 혈액, 혈청 및 소변 중의 글루코오스 수준을 모니터 하기 위한 통상적인 테스트 스트립 및 센서는 글루코오스 옥시다아제를 사용한다. 효소의 성능은 산소 농도에 의존한다. 공기 중 상이한 산소 농도를 갖는 상이한 고도에서의 글루코오스 측정은 잘못된 결과를 초래할 수 있다. PQQ-의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 주요 장점은 그의 산소로부터의 독립성이다. 이러한 중요한 특징은, 예를 들어, US 6,103,509 에 기술되어 있으며, 여기서 막결합 GDH 의 몇몇의 특징이 조사된다.
이 분야로의 중요한 기여는 적절한 매개체와 함께 s-GDH 의 사용이었다. s-GDH 기재 테스트 스트립 장치 및 분석 방법은 US 5,484,708 에 상세하게 개시되어 있다. 이 특허는 또한 글루코오스 측정을 위한 분석의 셋업 (set-up) 및 s-GDH-기재 시험 스트립의 제조를 포함한다. 그에 기술된 방법 및 여기에 인용된 문헌이 참조문으로서 포함된다.
글루코오스 디히드로게나아제 활성을 갖는 효소에 대한 다양한 적용 방법에 대한 특정 자료를 포함하는 상기 분야에 관련한 기타 특허 또는 출원은 US 5,997,817; US 6,057,120; EP 0 620 283; 및 JP 11-243949-A 이다.
s-GDH 및 반응이 일어날 때의 색 변화를 생성하는 지시약 (Kaufmann et al. 1997 위 참조) 을 이용하는 시판되는 시스템은 Roche Diagnostics GmbH 에 의해 유통되는 Glucotrend® 이다.
PQQ 의존성 s-GDH 의 사용에 대한 상기된 장점에도 불과하고, 글루코오스의 측정에서 단점 또한 고려되어야 한다. 상기 효소는 m-GDH 에 비해 다소 넓은 기질 범위를 갖는다. 즉, s-GDH 는 글루코오스 뿐만이 아니라 말토오스, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 자일로오스 및 리보오스를 포함하는 기타 몇몇의 당 또한 산화시킨다 (Dokter et al. 1986 a; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151). 글루코오스 이외의 당에 대한 반응성은 어떤 경우에 혈액 글루코오스 수준 측정의 정확성을 감소시킬 수 있다. 특히, 이코덱스트린 (글루코오스 중합체) 처리된 복막 투석 중의 환자는 그의 체액, 예를 들어 혈액 중, 높은 수준의 기타 당, 특히 말토오스를 함유할 수 있다 (Wens, R., et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998).603-609).
따라서, 예컨대 당뇨 환자, 특히 신장 합병증이 있는 환자 및 특히 투석 중의 환자로부터 수득된 임상 시료는 상당 수준의 기타 당, 특히 말토오스를 함유할 수 있다. 이러한 위독한 환자로부터 수득된 시료에서의 글루코오스 측정은 말토오스에 의해 손상될 수 있다 (Davies, D., Perit. Dial. Int. 14 (1994) 45-50; Frampton, J. E.; and Plosker, G. L, Drugs 63 (2003) 2079-2105).
변경된 기질 특이성을 갖는 개질된 PQQ-의존성 s-GDH 를 제조하기 위한 시도에 대한 보고가 문헌에 거의 없다. [Igarashi, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824] 은 Glu277 위치에서의 점 돌연변이 도입이 변경된 기질 특이성 프로파일을 갖는 돌연변이를 초래하는 것을 보고한다.
Sode (EP 1 176 202) 는 s-GDH 내의 특정 아미노산 치환이 개선된 글루코오스 친화성을 갖는 s-GDH 돌연변이를 초래하는 것을 보고한다. EP 1 167 519 에서는, 동일 저자가, 개선된 안정성을 갖는 돌연변이 s-GDH 에 대해 보고한다. 추가적으로, 동일 저자는 JP2004173538 에서, 글루코오스에 대한 개선된 친화성을 갖는 기타 s-GDH 에 대해 보고한다.
Kratzsch, P. 등 (WO 02/34919) 은 글루코오스에 대한 s-GDH 의 특이성이 기타 당 기질에 비교하여, 특히 말토오스와 비교하여, s-GDH 의 특정 위치에서의 아미노산 치환에 의해 개선될 수 있다는 것을 보고한다.
Takeshima, S. 등 (EP 1 367 120) 은 아시네토백터 칼코아세티커스로부터 알려진 아미노산 서열에 상응하는, 427 및 428 위치 사이의 아미노산 삽입 또는 특정 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 s-GDH 에 대해 보고한다.
그러나, 개선된 특성을 갖는 s-GDH 의 돌연변이 또는 변이체 생성에 대해 꽤 많은 개선이 보고되었지만, 추가적인 대안 및/또는 추가의 개선이 여전히 필요하다.
이미 공지된 돌연변이와 함께, 또는 단독으로, 기질로서 글루코오스에 대한 개선된 특이성을 초래하는 추가의 s-GDH 의 돌연변이 또는 변이체 형태에 대한 많은 요구 및 임상적 필요가 존재한다.
본 발명의 과제는 이미 공지된 돌연변이와 함께, 또는 단독으로, 기타 선택된 당 분자, 예를 들어 갈락토오스 또는 말토오스와 비교하여 현저히 개선된 글루코오스에 대한 기질 특이성을 초래하는, s-GDH 의 새로운 돌연변이 또는 변이체를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 아시네토백터 칼코아세티커스로부터 알려진 아미노산 서열에 상응하는, s-GDH 의 428 및 429 위치 사이에 아미노산 삽입을 하여 기타 당에 비해 글루코오스에 대한 s-GDH 의 기질 특이성을 현저히 개선할 수 있으며, 이에 따라 당업계에 알려진 상기된 문제들을 적어도 부분적으로 해결하는 것이 가능함을 발견하였다.
기타 선택된 당 분자와 비교한 글루코오스에 대한 기질 특이성은 본 발명에 따른 s-GDH 의 삽입 변형을 제공하여 현저히 개선되었으며 여기서 하기 및 부가된 청구항에 기술된 바와 같다.
s-GDH 의 새로운 형태의 개선된 기질 특이성에 때문에, 다양한 적용 분야에 서 글루코오스 측정을 위한 상당한 기술적 발전이 가능하다. 개선된 s-GDH 변이체는 생물학적 시료 중, 특히 테스트 스트립 장치 또는 바이오센서에서 글루코오스의 특이적 검출 또는 측정을 위해 매우 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 개요:
본 발명은 PQQ-의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH) 로도 알려진 EC 1.1.99.17 의 가용성 형태의 변이체에 관한 것이며, 상기 변이체는 A. 칼코아세티커스로부터의 s-GDH 야생형 서열 (SEQ ID NO: 2) 의 428 및 429 위치에 상응하는 아미노산 위치 사이에 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 및 임의로 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게 328 및 428 위치에서의 치환을 추가로 포함한다.
개선된 특성, 특히 글루코오스에 대한 증가된 특이성을 나타내는 s-GDH 의 바람직한 변이체 및 그러한 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 그러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 제공된다.
본 발명은 추가적으로 특히 테스트 스트립 장치 또는 바이오센서에 의한, 글루코오스의 측정 방법에서 본 발명에 따른 변이체의 사용에 관한 것이다.
하기 실시예, 참조, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되었으며, 그의 정확한 범위는 부가된 청구항에 설명되어 있다. 본 발명의 의도에서 벗어나지 않으며, 기재된 방법에 변경이 있을 수 있다.
도 1: 서열 상동성에 따라 정렬된 A. 칼코아세티커스 PQQ-의존성 s-GDH (상) 및 A. 바우마니이 s-GDH (하) 의 단백질 서열.
도 2: 가용성 PQQ-의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 야생형 또는 돌연변이 DNA 서열을 각각 포함하는, 실시예 1 에서 언급된 pACSGDH 의 예시.
도 3: 가용성 PQQ-의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 야생형 DNA 서열을 포함하는 실시예 1 에서 언급된 pACSGDH 벡터의 뉴클레오티드 (DNA) 서열.
본 발명의 상세한 설명:
상기에 언급된 바와 같이, 글루코오스 디히드로게나아제 활성을 갖는 두 개의 완전히 다른 퀴노단백질 효소 유형 (막결합 및 가용성) 은 EC 1.1.99.17 하, 함께 분류되었다. 이러한 두 유형은 서로 관련되어 보이지 않는다.
본 발명의 목적을 위해 오로지 가용성 형태의 GDH (s-GDH) 만이 적절하며, 그의 개선된 변형이 하기에 기술된다.
제 1 구현예에서, 본 발명은 PQQ-의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH) 로도 알려진 EC 1.1.99.17 의 가용성 형태의 변이체에 관한 것이며, 상기 변이체는 A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 428 및 429 위치에 상응하는 아미노산 위치 사이에 하나 이상의 아미노산 잔기삽입을 포함하며, 임의로 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 오로지 하나의 아미노산이 A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 428 및 429 위치에 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다.
A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO:2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 428 및 429 위치에 상응하는 아미노산 위치 사이에 아미노산 삽입을 포함하는 s-GDH 변이체는, 상기 삽입된 아미노산이 루신, 페닐알라닌, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다. 바람직하게는 삽입된 아미노산이 프롤린이다.
가용성 PQQ-의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 야생형 DNA-서열이 아시네토백터의 균주로부터 단리될 수 있는 것이 당업계에 공지되어 있다. 가장 바람직한 것은 아시네토백터 칼코아세티커스-유형 균주 LMD 79.41 로부터의 단리이다. 야생형 s-GDH (성숙 단백질) 의 서열이 SEQ ID NO: 2 에 제공된다. 아시네토백터의 기타 LMD 균주도 야생형 s-GDH 의 원천으로 사용될 수 있다. 이러한 서열을 A. 칼코아세티커스로부터 수득된 서열에 정렬시켜 서열 비교를 할 수 있다. 예를 들어, E. 콜라이 K12 (Oubrie, A., et al., J. MoI. Biol. 289 (1999) 319-333) 에 대해 기술된 것과 같이, 기타 박테리아 균주의 DNA-라이브러리를 스크리닝하고, 그러한 유전체에서 s-GDH 에 관련된 서열을 동정하는 것 또한 가능해 보인다. 이러한 서열 및 아직 동정되지 않은 동종 서열을 사용하여 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 를 생성할 수 있다.
본 발명의 의미에서 "변이체" 란 용어는 상응하는 야생형 서열과 비교하여, A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 의 428 및 429 위치에 상 응하는 아미노산 위치 사이에 아미노산 삽입을 갖는 단백질에 관련된다.
본 발명의 의미에서 "돌연변이" 는 A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열과 비교하여, 상응하는 야생형 서열에 비해, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 s-GDH 에 관련된다.
"변이체" 또는 "돌연변이" 라는 용어는 상응하는 야생형 서열에 비교하여, A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 428 및 429 위치에 상응하는 아미노산 위치 사이에 아미노산 삽입을 가지며, 그에 추가로 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 s-GDH 단백질에 모두 공통적으로 적용된다.
추가로 바람직한 구현예에서는, s-GDH 의 개선된 변형의 효소적 또는 기능적 특성이 야생형 효소 또는 428 및 429 위치 사이에 아미노산 삽입이 없는 돌연변이와 각각 비교된다.
본 발명에 따른 바람직한 변이체는 상응하는 야생형 효소에 비해, 하나 이상의 선택된 기타 당 기질과 비교하여 글루코오스에 대해 2배 이상 개선된 기질 특이성을 갖는 것을 특징으로 한다.
기질 특이성 또는 교차반응성을 계산하기 위해, 하나의 쉬운 방법은 글루코오스를 기질로서 측정된 활성을 100% 으로 설정하고 기타 선택된 당으로 측정된 활성을 글루코오스 값과 비교하는 것이다. 가끔 장황함을 피하기 위해, 한편으로 글루코오스에 대해, 다른 한편으로 선택된 기타 당 기질에 대해 언급하지 않고, 간단하게 특이성이란 용어를 사용한다.
당업자는 효소적 활성은 명확히 정의된 분석 조건을 하용하여 조사된 기질 분자의 등몰 농도에서 가장 잘 비교된다는 것을 이해할 것이다. 그렇지 않으면, 농도 차에 대한 보정을 해야 한다.
기질 특이성 (의 개선) 을 평가하기 위해 표준화되고 명확히 정의된 분석 조건이 선택되어야 한다. 기질로서 글루코오스에 대한 s-GDH 의 효소적 활성 및 기타 선택된 당 기질이 실시예 7 에 기술된 바와 같이 측정된다.
글루코오스 또는 선택된 다른 당, 바람직하게는 말토오스에 대한 효소 활성 의 측정에 기초하여, 교차반응성 (및 그의 개선) 이 평가되었다.
선택된 당에 대한 s-GDH (교차)반응성이 하기와 같이 계산되었다:
교차반응성 [%] = (선택된 당 활성/글루코오스 활성) x 100%.
상기 식에 따른 야생형 s-GDH 의 말토스에 대한 (교차)반응성은 약 105% 로 측정되었다. 갈락토오스에 대한 야생형 s-GDH (교차) 반응성은 약 50% 로 측정되었다 (표 1 참조).
(개선된) 특이성을 하기 화학식에 따른 계산하였다:
Figure 112007005830029-pct00001
야생형 효소와 비교하여, 말토오스에 비한 글루코스 (말토오스/글루코오스) 에 대한 특이성에 있어서 10-배 이상의 개선을 갖는 s-GDH 형태, 이에 따라 말토오스를 기질로 한 것은 글루코스를 기질로하여 측정된 활성의 10,5% 이하를 갖는다. 또는, 예를 들어 돌연변이 s-GDH 가 20% (상기된 바와 같이 측정 및 계산됨) 의 말토오스에 대한 교차-반응성을 갖는다면, 따라서 이 돌연변이는 야생형 s-GDH 와 비교하여 5.25 배의 개선된 기질 특이성 (말토오스/글루코오스) 을 갖는다.
기질에 대한 "특이적 활성" 이란 용어는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이는 바람직하게 단백질의 양 당 효소 활성을 기술하기 위해 사용된다. 글루코오스 또는 기타 당을 기질로 사용하여, GDH 분자의 특이적 활성을 측정하기 위한 다양한 방법 (Igarashi, S., et al., (1999) 위 참조) 이 당업계에서 사용된다. 이러한 측정을 위해 이용가능한 방법 중 하나는 실시예 부분에 상세하게 기술되어 있다.
다수의 서로 다른 당 분자를 선택하고 그러한 선택된 임의의 당 분자와 비교한 s-GDH 의 글루코오스 특이성을 조사하는 것이 가능하지만, 그러한 비교를 위한 임상적으로 적절한 당 분자를 선택하는 것이 바람직하다. 바람직한 선택 당은 만노오스, 알로오스, 갈락토오스, 자일로오스, 및 말토오스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 말토오스 또는 갈락토오스가 선택되며, 돌연변이 s-GDH 는, 갈락토오스 또는 말토오스와 비교한 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성에 대해 검사된다. 추가의 바람직한 구현예에서 선택된 당은 말토오스이다.
예를 들어, 말토오스 대 글루코오스에 있어서, 본 발명에 따른 s-GDH 변이체의 글루코오스 특이성의 개선이 꽤 상당한 것으로 발견되었다. 따라서, 하나 이상의 선택된 기타 당 기질 중 하나 이상에 대한 기질 특이성과 비교한 글루코오스에 대한 상기 기질 특이성이 3배 이상 개선되는 것이 더욱 바람직하다. 기타 바람직한 구현예는 선택된 기타 당 분자와 비교하여, 5배 이상 높거나, 또한 바람직하게 10배 이상 높은, 글루코오스에 대한 개선된 기질 특이성을 특징으로 하는 s-GDH 돌연변이를 포함한다.
s-GDH 의 돌연변이는 다수의 경우 글루코오스 기질에 대한 극적으로 감소된 특이적 활성을 가진 효소 변이체를 초래한다. 그러나, 글루코오스 기질에 대한 특이적 활성의 10 배 초과의 감소 (절대적 또는 종합적) 는 일상적 적용에 대해 중요할 수 있다. 따라서, 글루코오스 기질에 대해 개선된 특이성을 갖는 s-GDH 가 야생형 효소로 측정된 글루코오스에 대헤 10% 이상의 특이적 활성을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 돌연변이 효소가 야생형 s-GDH 의 각각의 글루코오스 활성의 20% 이상 또는 더욱 바람직하게 30% 이상을 나타내는 것이 더욱 바람직하다.
더욱 바람직한 것은 말토오스 특이적 활성이 테스트 스트립 또는 액체 실험 상에서 상응하는 야생형 효소에 대해 측정된 말토오스 특이적 활성의 10% 이하 또는 단지 5% 이하일 뿐이며, 글루코오스에 대한 특이적 활성은 상응하는 야생형 효소의 글루코오스에 대한 특이 활성과 비교하여 ≥ 10% 인 돌연변이이다.
428 및 429 위치 사이에 삽입을 포함하는 s-GDH 변이체의 기질 특이성이, 이러한 변이체를 추가로 변형시켜 명확히 정의된 특정 아미노산 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 부가적으로 포함시킴에 의해 더욱 개선되는 것이 가능함을 발견하였다.
아시네토백터 칼코아세티커스 유형 균주 LMD 79.41 로부터 단리된 s-GDH 의 야생형 서열 SEQ ID NO: 2 로부터 알려진 아미노산 위치가 언급되며 본 발명의 달성이 매우 상세하게 기술된다. SEQ ID NO: 2 의 위치에 상응하는 서로 다른 s- GDH 단리체 (isolate) 내의 아미노산 위치가 적절한 서열 비교에 의해 쉽게 확인된다.
SEQ ID NO: 2 의 야생형 서열과의 s-GDH 서열의 다중 정렬 및 비교가 GCG Package Version 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.) 의 PileUp 프로그램으로 수행되었다. PileUp 은 [Feng, D. F. and Doolittle, R. F., J. MoL Evol. 25 (1987) 351-360] 의 점진 정렬법의 간이화를 사용하여 다중 서열 정렬을 생성하며, 동일, 유사 또는 상이한 아미노산 잔기에 대한 측정 행렬이 그에 따라 정의된다. 상기 과정은 2 개의 가장 유사한 서열의 2 쌍 정렬로 시작되며, 2 개의 정렬된 서열의 집단을 생성한다. 이러한 집단은 다음의 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열의 집단에 정렬될 수 있다. 서열의 2 개 집단은 2 개의 개별 서열의 2 쌍 정렬의 간단한 확장에 의해 정렬될 수 있다. 최종의 정렬은 모든 서열이 최종의 2 쌍 정렬에 포함될 때까지 증가적 비유사 서열 (increasingly dissimilar sequence) 및 집단을 포함하는 점진적인 2쌍 정렬의 일련에 의해 달성된다. 이러한 식으로, 기타 동종의 s-GDH 분자 내의 위치가, 각각 SEQ ID NO: 1 및 2 에서의 A. 칼코아세티커스에 대해 제공된 위치에 상응하는 것으로 쉽게 확인될 수 있다. 그리하여 여기에 제공된 아미노산 위치가 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 위치 또는 기타 동종 s-GDH 분자 내의 그에 상응하는 위치로 이해될 수 있는 것이다.
348 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 s-GDH 와, s-GDH 의 428 및 429 위치 사이의 아미노산 삽입을 포함하는 돌연변이는 글루코오스에 대한 특이성과 관련하여 현저하게 긍정적인 효과를 나타내는 것이 발견되었다. 표 1 에 나타난 바와 같이, 글루코오스에 대해 개선된 특이성을 갖는 여러 s-GDH 변이체가 동정되고 생성되었다. 변이체 s-GDH 에 있어서 글루코오스 특이성의 개선은 트레오닌 348 위치의 아미노산이 적절한 기타 아미노산으로 치환되고, 적절한 아미노산이 428 및 429 위치 사이에 삽입되는 한 나타난다. 따라서 본 발명의 매우 바람직한 구현예는 A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 의 428 및 429 아미노산 사이에 삽입 및 추가적으로 348 위치에 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 PQQ-의존성 s-GDH 의 변이체 단백질에 관련된다.
SEQ ID NO:2 의 169, 171, 245, 341, 349 및/또는 428 위치에 상응하는 아미노산 위치에서의 추가적인 치환이 아미노산 428 및 429 사이의 삽입 및 348 위치의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 s-GDH 변이체의 글루코오스에 대한 특이성을 더욱 개선시키기 위한 노력에서 유리한 것이 발견되었다.
아시네토백터 칼코아세티커스 유형 균주 LMD 79.41 로부터 단리된 s-GDH 의 428 및 429 위치 사이의 아미노산의 삽입 또는 위치 348 의 트레오닌 잔기 중 어떠한 것도 s-GDH 의 기질 결합에 기여하지 않는 것으로 당업계에 공지되어 있다 (Oubrie, A., et al, Embo J. 18 (1999) 5187-5194; Oubrie, A. and Dijkstra, B. W., Protein Sci. 9 (2000) 1265-1273). s-GDH 의 상기 두 변이체가 관심 대상의 기타 당 분자와 비교하여, 특히 말토오스와 비교하여, 왜 글루코오스에 대한 기질 특이성을 개선시키는지에 대한 화학적 또는 물리학적 설명이 없다.
추가의 바람직한 구현예에서 s-GDH 변이체는, 348 위치에서의 트레오닌 아미 노산 잔기가 알라닌, 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직한 구현예에서는 글리신을 사용하여 위치 348 에서 트레오닌이 치환된다. T348G 란 용어는 당업자에게 공지되어 있으며 트레오닌이 348 위치에서 글리신으로 대체되는 것을 가리킨다.
추가로 바람직한 구현예는 PQQ-의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH) 로도 알려진 EC 1.1.99.17 의 가용성 형태의 변이체이며, 상기 변이체는 A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 428 및 429 위치에 상응하는 아미노산 위치 사이에 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 및 428 위치에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 바람직하게는, 428 위치에서 아스파라긴의 치환은 루신, 프롤린 및 발린에 의한 것이다. 더욱 바람직한 428 위치에서의 치환은 프롤린에 의한 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 s-GDH 변이체의 한 군은 348 위치에서의 아미노산 잔기의 치환, 및/또는 428 위치에서의 아미노산 치환 및 428 및 429 위치 사이의 아미노산 삽입을 포함한다. 이러한 변이체는 임의적으로, A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 169, 171, 245, 341, 및/또는 349 위치에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하도록 추가로 변형될 수 있다.
A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 169 위치에 상응하는 아미노산이 본 발명의 변이체에 치환되는 경우, 자연 발생 아미노산 루신이 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판으로 치환되는 것이 바람직하다. 169 위치에서의 바람직한 치환은 페닐알라닌에 의한 것이다.
A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 171 위치에 상응하는 아미노산이 본 발명의 변이체에 치환되는 경우, 자연 발생 아미노산 타이로신이 알라닌, 메티오닌, 글리신으로 이루어진 군으로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산에 의해 치환되는 것이 바람직하다. 171 위치에서 더욱 바람직한 치환은 글리신에 의한 것이다.
A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 245 위치에 상응하는 아미노산이 본 발명의 변이체에 치환되는 경우, 자연 발생 아미노산 글루탐산이 아스파르트산, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환되는 것이 바람직하다. 245 위치에서 더욱 바람직한 치환은 아스파르트산에 의한 것이다.
A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 341 위치에 상응하는 아미노산이 본 발명의 변이체에 치환되는 경우, 자연 발생 아미노산 메티오닌이 발린, 알라닌, 루신 또는 이소루신에 의해 치환되는 것이 바람직하다. 341 위치에서 더욱 바람직한 치환은 발린에 의한 것이다.
A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열에 상응하는 s-GDH 서열의 349 위치에 상응하는 아미노산이 본 발명의 변이체에 치환되는 경우, 자연 발생 아미노산 발린이 알라닌, 글리신에 의해 치환되는 것이 바람직하다. 349 위치에서 더욱 바람직한 치환은 알라닌에 의한 것이다.
WO 02/34919 에 기술된 바와 같이, A. 칼코아세티커스로부터 단리된 야생형 서열에 상응하는 s-GDH 서열의 348 위치에서의 아미노산 치환을 사용하여 s-GDH 의 글루코오스 특이성을 현저하게 개선시킬 수 있다. 당업자는 WO 02/34919 에서, 본 발명에 따른 삽입과 조합되고 치환될 수 있는 기타 적절한 위치를 찾을 수 있다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 s-GDH 변이체는 428 및 429 아미노 잔기 사이의 삽입 외에, A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 아미노산 위치에 상응하는 171, 245, 341, 348 및 349 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
또 하나의 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 s-GDH 변이체는 428 및 429 아미노 잔기 사이의 삽입 외에, A. 칼코아세티커스 (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 아미노산 위치에 상응하는 171, 245, 341, 348 및 349 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
당업자가 통찰하고 있듯이, s-GDH 의 특성에 크게 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 예를 들어 침묵 돌연변이를 취하는 것이 가능하다. 그러나, 본 발명에 따른 변이체는 SEQ ID NO: 2 와 비교하여 45 개 이하의 아미노산 교환을 갖는다. 바람직하게 변이체는 20 개 이하의 아미노산 치환을 포함할 것이며, 더욱 바람직하게는, 10 개 이하의 아미노산 치환이 존재할 것이다.
본 발명에 따른 s-GDH 변이체는 실시예 부분에 제공된다. 이들 변이체는 또한 본 발명의 바람직한 구현예를 나타낸다. 지금까지 발견된 가장 적은 글루코오스 방해를 갖는 변이체는 아미노산 428 및 429 사이에 바람직하게는 프롤린에 의한 삽입 및 Yl71G, E245D, M341V 및 T348G 돌연변이 또는 L169F, Y171G, E245D, M341V 및 T348G 돌연변이를 각각 포함한다. 이들 두 변이체는 본 발명의 추가의 바람직한 구현예이다.
아미노산 서열 분석은 한편으로는 A. 칼코아세티커스 및 한편으로는 A. 바우마니이로부터의 야생형 s-GDH 에서 발견되는 서열 모티프가 본 발명에서 동정된 바와 같은 글루코오스에 대한 특이성을 개선하는 주요 관련 위치, 즉, A. 칼코아세티커스로부터의 야생형 s-GDH 에 상응하는 428 및 429 위치 주변의 삽입 부위 주변에서 매우 보존성인 것으로 보인다.
AGNXaaVQK (SEQ ID NO: 2) 의 아미노산 서열을 포함하는 PQQ-의존성 s-GDH 의 변이체는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타낸다. SEQ ID NO: 2 는 A. 칼코아세티커스 야생형 s-GDH 의 426-431 위치 또는 A. 바우마니이 야생형 s-GDH 의 427-432 위치에 상응하지만 428 및 429 (A. 칼코아세티커스) 위치 사이 또는 429 및 430 (A. 바우마니이) 위치 사이에 하나의 아미노산 (Xaa) 의 삽입 각각 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 G-N-Xaa-V-Q-K-D (SEQ ID NO: 11) 서열을 포함하는 s-GDH 변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, SEQ ID NO: 11 을 함유하는 s-GDH 변이체는 상기 삽입 아미노산 Xaa 가 루신, 프롤린, 페닐알라닌 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 Xaa 가 프롤린 잔기인 것을 특징으로 한다.
앞서 언급한 바와 같이, 야생형 s-GDH 의 428 위치의 아미노산 아스파라긴은 아미노산 치환될 수 있다. 이러한 경우 SEQ ID NO: 11 은 P428 대신, 치환된 아미노산을 포함할 것이다.
돌연변이 단백질을 생성할 수 있는 여러 가능성이 당업계에 공지되어 있다. 결정적으로 중요한, 428 및 429 위치 사이의 아미노산 삽입을 개시하는 본 발명의 중요한 발견을 기초로 하여, 이제 당업자는 s-GDH 의 더욱 적절한 변이체를 쉽게 생성할 수 있다. 이러한 변이체는 예를 들어 무작위 돌연변이생성 (Leung, D. W., et al., Technique 1 (1989) 11-15) 및/또는 지정 돌연변이생성 (Hill, D. E., et al., Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568) 으로 알려진 방법으로 수득될 수 있다. 요망되는 특성을 갖는 단백질 제조의 대안적인 방법은 2 개 이상의 상이한 원천으로부터의 서열 요소를 포함하는 키메라성 구축물을 제공하거나, 적절한 s-GDH 유전자를 완전히 합성하는 것이다. 당업계에 공지된 이러한 방법은 본 발명에 개시된 정보와 함께 사용되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 2 의 428 및 429 위치 사이의 개시된 삽입과 함께 추가의 아미노산 치환을 포함하는 s-GDH 의 돌연변이 또는 변이체를 제공한다.
본 발명에 따른 s-GDH 변이체는 예를 들어 아세토백터 칼코아세티커스-유형 균주 LMD 79.41 로부터 단리된 s-GDH 유전자로부터 시작, 및 동종 서열로부터 시작하여 생성될 수 있다. 본 출원의 문맥에서 "동종" 은 SEQ ID NO: 2 와 비교하여 90% 이상의 일치도를 갖는 s-GDH 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 다르게 말하면, PileUp 프로그램을 사용한 적절한 정렬 후, 상기와 같은 동종 s-GDH 의 아미노산의 90% 이상이 SEQ ID NO: 2 에 기술된 아미노산과 동일하다.
DNA 및 아미노산 서열의 변이가 자연적으로 존재하거나, 당업계에 공지된 방 법을 사용하여 의도적으로 도입될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변이는 전체 서열 중 10% 이하의 아미노산 차이를 초래할 수 있는데, 이는 SEQ ID NO: 2 와 비교하여, 상기 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기의 삭제, 치환, 삽입, 역위 또는 추가 때문이다. 이러한 아미노산 치환은 예를 들어 수반된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 특성의 유사함을 기초로 하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 음전하 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하며; 양전하 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성 값을 갖는 무전하 극성 머리기 또는 무극성 머리기를 갖는 아미노산은 하기를 포함한다: 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 타이로신. 기타 고려되는 변이는 상기된 폴리펩티드의 염 및 에스테르, 그리고 상기된 폴리펩티드의 전구체, 예를 들어 선도 서열로 사용되는 메티오닌, N-포르밀메티오닌과 같은 N-말단 치환을 갖는 전구체를 포함한다. 이러한 변이는 반드시 본 발명의 범위 및 의도에서 벗어나지 않으며 생성될 수 있다.
실시예 부분에 제공된 방법에 따른 당업계에 공지된 방법에 따라, 상기에 기술된 임의의 s-GDH 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 상기된 s-GDH 돌연변이 단백질을 엔코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열도 포함한다.
본 발명은 추가적으로 숙주 세포 내에서 그의 발현을 지시할 수 있는 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 (operably linked) 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 추가적으로 숙주 세포 내에서 그의 발현을 지시할 수 있는 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 바람직한 벡터는 도 2 및 3 에 나타난 pACSGDH 와 같은 플라스미드이다.
본 발명에 유용한 발현 벡터는 전형적으로 복제 원점, 선택을 위한 항생제 내성, 발현을 위한 프로모터 및 s-GDH 유전자 변이체의 전체 또는 일부를 포함한다. 발현 벡터는 또한 당업계에 공지된 기타 DNA 서열, 예컨대 (보다 양호한 폴딩 (folding), 원형질막공간으로의 수송 또는 분비를 위한) 신호 서열, 발현의 보다 양호한 조정을 위한 유도 인자, 또는 클로닝을 위한 분절 부위를 포함할 수 있다.
선택된 발현 벡터의 특성은 사용될 숙주 세포와 친화성이어야 한다. 예를 들어, E. 콜라이 세포 시스템에서 클로닝하는 경우, 발현 벡터는 E. 콜라이의 유전체로부터 단리된 프로모터 (예를 들어, lac 또는 trp) 를 포함해야 한다. ColE1 플라스미드 복제 원점과 같은 적합한 복제 원점이 사용될 수 있다. 적합한 프로모터는, 예를 들어 lac 및 trp 을 포함한다. 또한, 발현 벡터가 항생제 내성 유전자와 같은 선택 표지자 (selection marker) 를 코딩하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 선택 표지자로서, 암피실린 내성, 또는 카나마이신 내성이 편리하게 이용될 수 있다. 이러한 모든 물질은 당업계에 공지되어 있으며 시판된다.
요망되는 코딩 및 조절 서열을 포함하는 적절한 발현 벡터는 당업계에 공지 된 표준 재조합 DAN 기법을 사용하여 구축될 수 있으며, 이들의 다수는 [Sambrook et al, in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press] 에 기술되어 있다.
본 발명은 추가적으로 돌연변이 s-GDH 의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 바람직하게 실시예 2-8 에 나타나 있는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 DNA 서열 중 하나의 일부 또는 전부를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 적합한 숙주 세포는, 예를 들어, Pomega (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA) 에서 시판되는 E. 콜라이 HB 101 (ATCC 33694), Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) 에서 시판되는 XLl-Blue MRF' 등을 포함한다.
발현 벡터는 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터를 가진 숙주 세포의 형질전환은 폴리에틸렌 글리콜 매개 프로토플라스트 (protoplast) 형질전환 방법 (Sambrook et al. 1989, 위 참조) 에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 전기천공법, 바이올리스틱 주입법 (biolistic injection) 또는 프로토플라스트 융합과 같은, 숙주 세포 내로 발현 벡터를 도입하는 기타 방법 또한 이용될 수 있다.
s-GDH 변이체를 포함하는 발현 벡터가 적절한 숙주 세포에 도입된 후, 숙주 세포는 요망되는 s-GDH 변이체의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양될 수 있다. s-GDH 돌연변이의 일부 또는 전체를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 요망되는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포는 즉 항생제 선택에 의해 용이하게 확인될 수 있다. s-GDH 변이체의 발현은 s-GDH mRNA 전사의 생성 측정, 유전자 생성물의 면역적 검출 또는 유전자 생성물의 효소 활성의 검출과 같은 상이한 방법에 의해 확인될 수 있다. 바람직하게는 효소 분석이 적용된다.
본 발명은 또한 s-GDH 변이체의 생성 및 스크리닝을 교시한다. 무작위 돌연변이생성 및 포화 돌연변이생성은 당업계에 공지된 바와 같이 수행된다. 변이체는 글루코오스에 대한 기질 특이성 (말토오스와 비교한 글루코오스로의 활성) 및 KM 값에 대해 스크리닝된다. 선택된 분석 조건은, 예를 들어 단일의 아미노산 치환에 의해 초래되는, 예상되는 작은 개선이 측정될 수 있도록 개조한다. 적절한 돌연변이의 선택 또는 스크리닝의 한 방법은 실시예 3 에 제공된다. 이러한 방식으로 야생형 효소와 비교된 어떠한 변화 또는 개선도 명확하게 검출될 수 있다.
물론, 모든 발현 벡터 및 DNA 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현시킴에 있어서 동일하게 잘 작용하는 것은 아님을 이해해야 할 것이다. 또한, 모든 숙주 세포도 동일한 발현 시스템으로 동일하게 잘 작용하지만은 않는다. 그러나, 당업자는 과도한 실험 없이 여기에 제공된 지시로, 발현 벡터, DNA 조절 서열, 및 숙주 세포 중에서 적절한 선택을 할 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 s-GDH 돌연변이의 생성에 적합한 조건 하에서 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 본 발명의 s-GDH 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 박테리아 숙주 세포에 있어서, 전형적인 배양 조건은, (사용되는 발현 벡터에 따라) 탄소 및 질소원, 적절한 항생제 및 유도제를 포함하는 액체 매질이다. 전형적인 적절한 항생제는 암피실린, 카나마이신, 클로로암페니콜, 테트라사이클린 등을 포함한다. 전형적인 유도제는 IPTG, 글루코오스, 락토오스 등을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드가 돌연변이 s-GDH 를 코딩하는 DNA 서열을 발현하는 숙주 세포 내에서 제조되어 수득되는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 돌연변이 s-GDH 를 코딩하는 DNA 서열에 의해 엔코딩되는 mRNA 의 시험관내 번역에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, DNA 서열은 상기된 바와 같이 합성되어 적절한 발현 벡터로 삽입될 수 있으며, 이는 이어서 시험관내 전사/번역 시스템에서 사용될 수 있다.
세포가 없는 펩티드 합성 시스템에서 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된, 상기 정의되고 기술된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예를 나타낸다.
예를 들어 상기된 방법으로 제조된 폴리펩티드는 이후 단리되고 여러 일상적 단백질 정제 기법을 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 친화 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 개선된 s-GDH 변이체의 주요 적용 중 하나는 당뇨 환자에서 혈액-글루코오스 수준을 모니터하는 테스트 스트립에서의 사용을 위한 것이다. 산소에 대한 PQQ-의존성 글루코오스 디히드로게나아제의 무감응은 상기된 바와 같이, 글루코오스 옥시다아제에 비해 큰 장점이 있다. 더욱 중요하게는, s-GDH 변이 체가 글루코오스에 대해 개선된 특이성을 가지며 기타 당에 대해 현저히 감소된 효소 활성을 갖기 때문에, 분석될 시료 중 존재할 수 있는 말토오스, 갈락토오스 및/또는 기타 당에 의한 방해가 현저히 감소되는 것이다. 물론 여러 종류의 시료가 조사될 수 있다. 혈청, 혈장, 장액 또는 소변과 같은 체액이 그러한 시료를 위한 바람직한 공급원이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 s-GDH 변이체 돌연변이를 사용한 시료 중의 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법을 포함한다. 시료 중의 글루코오스 검출을 위한 개선된 방법은, 상기 글루코오스 검출, 결정 또는 측정이 센서 또는 테스트 스트립 장치를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 것이 특히 바람직하다.
또한 본 발명의 범위 내에는, 본 발명에 따른 s-GDH 돌연변이를 포함하는 시료 중의 글루코오스 검출 또는 측정을 위한 장치, 및 상기 측정을 위해 필요한 기타 시약이다.
본 발명의 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 는 또한 반응기 또는 시료 중 글루코오스의 온라인 모니터링을 위한 바이오센서 (D'Costa, E. J., et al., Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., et al., Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., et al., Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281; Malinauskas, A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100 (2004) 395-402) 에서 매우 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, s-GDH 변이체는, 글루코오스 농도의 보다 정확한 측정을 위해, 예를 들어, 산화환원 전도성 에폭시 네트워크를 포함하는 오스뮴 복합체를 가지는 산소-무감응성 유리질 전극 (Ye et al., 1993 위 참조) 을 코팅하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 개선된 기질 특이성을 갖는 s-GDH 변이체의 기타 가능한 적용이 있다. 예를 들어, 이러한 s-GDH 변이체는 알돈산 생성 과정에서 사용할 수 있다. 야생형 s-GDH 는 글루콘산 및 기타 알돈산을 생성하는 기질 산화에서 높은 전환을 갖는다. 글루코오스에 대해 보다 특이적인 s-GDH 변이체를 사용함에 의해, 글루콘산의 제조는 훨씬 더 적은 부산물을 초래할 것이다. 상이한 기질 특이성을 갖는 기타 s-GDH 변이체로, 필요에 따라 상이한 알돈산을 제조하는 것이 가능하다.
하기 실시예에서, 모든 시약, 제한 효소, 및 기타 재료는 다른 시판중의 공급원이 명시되지 않는 한, Roche Diagnostics Germany 로부터 수득되었으며, 공급자에 의해 제공된 지시에 따라 사용되었다. DNA 의 정제, 특성화 및 클로닝에 이용되는 작업 및 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며 (Ausubel, F., et al, in "Current protocols in molecular biology" (1994) Wiley Verlag), 당업자에 의해 필요에 따라 개조될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 본 발명의 이해를 더욱 돕기 위한 것이다.
실시예 1
E. 콜라이에서의 야생형 A. 칼코아세티커스 가용성 PQQ 의존성 글루코오스 디 히드로게나아제의 클로닝 및 발현
s-GDH 유전자를, 표준 방법에 따라 아시네토백터 칼코아세티커스 균주 LMD 79.41 로부터 단리하였다. 야생형 s-GDH 유전자를, 조절가능한 발현을 위한 mgl 프로모터를 포함하는 플라스미드로 서브클로닝하였다 (특허 출원 제 WO 88/09373 호 참조). 새로운 구축물을 pACSGDH (도 2 및 3 참조) 로 칭하였다. 재조합 플라스미드를 E. 콜라이 군으로부터 선택된 숙주 생물체에 도입하였다. 이후, 이들 생물체를 적절한 조건 하에서 배양하고 s-GDH 활성을 나타내는 콜로니를 선택하였다.
플라스미드 pACSGDH 는 QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) 을 사용하여 상기 언급된 클론의 200 ml 하룻밤 동안의 배양물로부터 제조사의 프로포콜에 따라 단리하였다. 플라스미드를 1 ml 의 재증류수 (bidest water) 에 재현탁시켰다. 플라스미드의 농도를 Beckman DU 7400 Photometer 를 사용하여 측정하였다.
수율은 600 ㎍ 이었다. 플라스미드의 질을 아가로스 겔 전기영동으로 결정하였다.
실시예 2
T348G 돌연변이 생성
삽입 변이체의 생성을 위해 중요한 출발 주형으로서 T348G 돌연변이를 갖는 돌연변이 s-GDH 를 제조하였다. 상기 s-GDH 돌연변이는 글루코오스와 비교하여 감소된 말토오스의 활성 때문에 선택되었다 (WO 02/34919 참조).
The QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Cat. 200518) 을 사용하여 348 위치의 트레오닌을 글리신으로 치환하였다. 적절한 프라이머를 설계하였다.
돌연변이생성에 사용되는 5'- 및 3'- 프라이머는 서로 상보적이며, 트레오닌에서 글리신 (ACA 에서 AGG) 으로의 교환을 위한 변형된 코돈을 중앙 위치에 포함하였다. 이들 뉴클레오티드의 각 측면에 12 내지 16 개의 뉴클레오티드가 위치하였다. 뉴클레오티드의 서열은 아미노산 교환을 위한 코돈의 측면에 위치한 센스 및 안티-센스 DNA-가닥과 동일하였다. 센스에 대한 ACA = 트레오닌 및 안티-센스 가닥에 대한 TGT 코돈 대신, 프라이머는 센스에 대해 GGG = 글라이신 및 안티-센스 가닥에 대해 CCC 를 포함하였다 (SEQ ID NO: 3 및 4 참조).
PCR-반응 및 DpnI 소화를 설명서에 따라 수행하였다. 이후, 1 ㎕ 의 시료를 XL-MRF'- 세포의 전기천공을 위해 사용하였다. 전기천공은 BioRad E. Coli Pulser (BioRad) 를 사용하여 0.2 cm 큐벳에서 2.5 KV 로 달성하였다. 1 ml LB 중 37℃ 에서 1 시간 동안 키운 후, 박테리아를 LB-암피실린 아가 플레이트 (100 ㎍/ml 암피실린) 에 플레이팅하고 37℃ 에서 밤새 키웠다. 돌연변이 s-GDH 클론을 하기 스크리닝 방법을 사용하여 조사하였다.
실시예 3
스크리닝
상기된 아가 플레이트 상의 돌연변이 콜로니를, 200 ㎕ LB-암피실린-배지/웰을 포함하는 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 로 찍어 넣고 37℃ 에서 밤새 배양하였다. 이러한 플레이트를 마스터 플레이트라 칭한다.
각 마스터 플레이트로부터, 웰 당 5 ㎕ 시료를, 세포 붕괴를 위해 웰 당 5 ㎕ 의 B (B = Bacterial Protein Extraction Reagent; Pierce No. 78248) 를 함유하는 MTP 에 옮기고, s-GDH 의 활성을 위해, 240 ㎕ 의 0.0556 mM 피롤로-퀴놀린 퀴논 (PQQ); 50 mM Hepes; 15 mM CaCl2 pH 7.0/웰을 25℃ 에서 2 시간 동안 및 10℃ 에서 밤새 배양하였다. 상기 플레이트를 작업 플레이트라 칭한다.
작업 플레이트로부터 구멍 당 3 x 10 ㎕ 시료를 3개의 빈 MTP 에 옮겼다. 그 후, 하나는 표준 농도에서 글루코오스로 실험하였고, 두번째는 감소된 글루코오스 농도 (30 mM 대신 1.9 mM) 로 실험하였고, 세번째는 말토오스 또는 기타 선택된 당 분자를 기질로 하여 실험하였다. 선택된 기타 모든 당 분자를 등몰의 표준 농도, 즉 30 mM 로 사용하였다. 모든 분석에 있어서, 분석될 당을 이미 함유하는 90 ㎕ 의 매개액 (mediator solution) (실시예 7 참조) 를 적용하였다.
dE/분을 계산하고, 기질로서 30 mM 글루코오스를 사용한 값을 100% 활성으로 설정하였다. 기타 당으로 수득된 값을 글루코오스 값과 비교하고 퍼센트 활성 (예를 들어, 말토오스에 대해: dE/분 말토오스/dE 글루코오스)*100) 으로 계산하였다. 이는 (변이체) 효소의 교차반응성과 같다.
1.9 mM 글루코오스로 수득된 값을 30 mM 글루코오스 값과 비교하고 퍼센트 활성 (dE/분 1.9 mM 글루코오스/30 mM 글루코오스)*100) 으로 계산하였다. 이는 분석되는 변이체에 대한 KM 값의 간접 척도인 %-값을 제공한다. 이러한 계산에 따르면, 더 높은 %-값이 더 낮은 (= 더 양호한) KM 값을 나타낸다.
하기 돌연변이가 동정되었다:
효소 M/G (30 mM 당, %) 활성 1,9/30 mM 글루코오스, % 아미노산 교환
WT 105 70% -
돌연변이 25-30% 21% T348G
실시예 4
지정부위 돌연변이생성으로부터의 돌연변이 s- GDH 유전자의 염기서열분석
25-30% 말토오스/글루코오스 교차반응성을 갖는 s-GDH T348G 돌연변이에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드를 단리하고 (High Pure Plasmid Isolation Kit, Roche Diagnostics GmbH, No. 1754785), ABI Prism Dye Terminator Sequencing Kit 및 ABI 3/73 및 3/77 염기서열분석기 (Amersham Pharmacia Biotech) 를 사용하여 염기서열분석을 수행하였다.
하기 프라이머를 사용하였다:
센스 가닥: GDH 1: 5'-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (= SEQ ID NO: 5)
GDH 2: 5'-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC -3' (= SEQ ID NO: 6)
결과:
DNA 및 아미노산 수준 상에서 요망되는 돌연변이를 달성하여, 348 위치에서 T 에서 G 로의 변화가 초래되었다 (성숙 단백질). 유전자 상의 추가적인 돌연변이는 발견되지 않았다.
실시예 5
T348G 돌연변이에 기초한 삽입 변이체 생성
삽입 변이체는 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Cat. 200518) 를 사용하여 생성되었다. 428 및 429 위치의 아미노산 (서열 ID NO: 2참조) 사이의 삽입을 위한 적절한 프라이머를 설계하고 제조자의 설명에 따라 s-GDH 의 돌연변이 (T348G 돌연변이, 실시예 4 참조) 로 PCR 을 수행하였다.
프라이머에 있어서, 가능한 모든 20 개의 아미노산 교환을 수득하기 위해 삽입 위치에서의 각 코돈을 무작위로 합성하였다. 이러한 코돈 뉴클레오티드는 각 말단에 11 내지 13 개의 뉴클레오티드가 측면에 접해 있었다.
센스 가닥:
in429X_F: 5'- CTGCCGGAAATNNNGTCCAAAAAGATG -3'
(= SEQ ID NO: 7)
안티-센스 가닥:
in429X_R 5'- CATCTTTTTGGACNNNATTTCCGGCAG -3'
(= SEQ ID NO: 8)
PCR 반응 및 DpnI 소화는 설명서에 따라 수행하였다. 이후, 1 ㎕ 의 각 반응물을, 상기된 바와 같이 XL1F-세포의 전기천공을 위해 사용하였다. 37℃ 에서 1 ml LB 중 1 시간 동안 키운 후, 박테리아를 LB-암피실린 아가 플레이트 (100 ㎍/ml 암피실린) 에 플레이팅하고 37℃ 에서 밤새 키웠다. 돌연변이 s-GDH 클론에 기술된 스크리닝 방법을 수행하였다. 20 개의 가능한 아미노산 삽입을 갖는 변이체가 스크리닝된 것을 통계적으로 확실히 하기위해, 200 개의 클론을 시험하였다. 변경된 기질 특이성을 갖는 클론에 플라스미드 단리를 수행하 고 상기된 바와 같이 염기서열분석을 수행하였다.
결과:
표 1:
Figure 112007005830029-pct00002
실시예 6
말토오스에 비해 글루코오스 에 대한 높은 기질 특이성을 갖는 추가의 삽입 돌연변이 생성
WO 02/34919 에서, s-GDH 의 상이한 위치에서의 몇몇의 아미노산 교환이, 예를 들어 말토오스에 비해 글루코오스에 대한 기질 특이성을 향상시키는 것으로 확인되었다. 아미노산 교환 T348G 과 기타 위치, 예를 들어 169, 171, 245, 341 위치, 및/또는 349 에서의 아미노산 치환과의 조합은 기질 특이성을 더욱 개선시켰다. 각각 3,5 및 7% 의 말토오스/글루코오스에 대한 기질 특이성을 갖는, 상기된 2개의 돌연변이가 선택되어 428 및 429 위치 사이에 본 발명에 따른 삽입 (이 경우, 프롤린) 을 수행하였다. 삽입은 SEQ ID NO: 9 및 10 의 프라이머를 사용 하여 달성되었다.
SEQ ID NO:9 insP429_F:
5'-GATACTGCCGGAAATCCAGTCCAAAAAG -3'
SEQ ID NO: 10 insP429_R:
5'-CTTTTTGGACTGGTCCTCCGGCAGTATC -3'
주형의 플라스미드 DNA 단리, 지정부위 돌연변이생성 PCR, 전기천공, 스크리닝, 선택 돌연변이의 DNA 염기서열분석을 상기된 바와 같이 수행하였다.
결과:
Figure 112007005830029-pct00003
상기 표에서 말토오스/글루코오스 기질 특이성이 현저히 변화된 것이 뚜렷하게 나타난다. 말토오스 전환은, 야생형 s-GDH 의 말토오스/글루코오스 전환과 비교하여 105% 에서 2-4% 로 감소한 것으로 확인되었다. C/1 및 D/1 돌연변이를 상세하게 조사하였다.
실시예 7
야생형 또는 변이체 s- GDH 각각에 대한 정제 및 효소 활성의 분석
성장한 세포 (LB-Amp. 37℃) 를 수확하고 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.0 에 현탁시켰다. 세포 붕괴는 French Press passage (700-900 bar) 로 수행하였다. 원심분리 후, 상청액을 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.0 으로 평형화 (equilibration) 된 S-세파로스 (AmershamBiosciences) 컬럼에 적용하였다. 세척 후, 0-1 M NaCl 염 구배를 사용하여 s-GDH 를 용리시켰다. s-GDH 활성을 나타내는 분획을 모아 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.0 에 대해 분리하고, 재-평형화된 S-세파로스 컬럼 상에서 다시 크로마토그래피하였다. 활성 분획을 모으고 Superdex® 200 컬럼 (Amersham Biosciences) 를 사용하여 겔 여과를 수행하였다. 활성 분획을 모아 -20℃ 에 저장하였다.
정제된 야생형 및 변이체 s- GDH 각각의 효소 분석 및 단백질 측정:
단백질 측정은 Pierce 의 Protein Assay Reagent no. 23225 (BSA 로의 보정 곡선, 30 분, 37℃) 를 사용하여 수행하였다.
0.0556 mM 피롤로-퀴놀린 퀴논 (PQQ); 50 mM Hepes; 15 mM CaCl2 pH 7.0 로 시료를 1 mg 단백질/ml 로 희석하고 재구성 또는 활성을 위해 25℃ 에서 30 분간 배양하였다.
배양 후, 시료를 50 mM Hepes; 15 mM CaCl2 pH 7.0 으로, 약 0,02 U/ml 까지 희석하고, 50 ㎕ 의 각 희석 시료를, 매개체로서의 0.315 mg (4-(디메틸포스피닐메 틸)-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로소페닐)-아민 (특허 US 5,484,708 참조)/ml 및 30 mM 당을 함유하는 0.2 M 시트레이트 완충액 (pH 5.8; 25℃) 1000 ㎕ 에 첨가하였다.
620 nm 에서의 흡광도를 25℃ 에서 처음 5 분 동안 모니터하였다.
1 단위 효소 활성은 상기 분석 조건 하에서 1 mMol 매개체/분의 전환에 상응한다.
계산: 활성 = (총 부피*dE/분 [U/ml]): (ε* 시료 부피*1)
(ε= 흡광도의 계수; ε620 nm = 30[l* mmol-1* cm-1]).
글루코오스 및 말토오스 (Merck, Germany) 각각으로 분석을 수행하였다.
결과:
Figure 112007005830029-pct00004
s-GDH 의 428 및 429 위치 사이에 삽입을 포함하는 신규한 변이체 C/1 및 D/1 가 말토오스/글루코오스 교차반응성에 대해 추가적인 개선을 나타내는 것이 상기 표로부터 명백하다. 여러 아미노산 치환 및 삽입에도 불구하고, mg/단백질 당 글루코오스에 대한 효소 활성은 여전히, 상응하는 야생형 효소 활성의 10% 를 초과한다.
실시예 8
말토오스의 존재 또는 부재 하에서 글루코오스 의 측정
야생형 s-GDH 및 s-GDH 의 C/1 및 D/1 변이체는 각각 말토오스의 존재 또는 부재 하에서 글루코오스 측정을 위해 적용될 수 있다. 참조 시료는 50 mg 글루코오스/dl 을 함유한다. "시험" 시료는 50 mg 글루코오스/dl 및 100 또는 200 mg/dl 말토오스를 각각 함유한다. 동일한 양의 GDH (U/ml; 상기의 효소 분석 참조) 활성이 각 분석을 위해 사용된다.
큐벳 내에서 하기를 혼합한다:
1 ml 0.315 mg (4-(디메틸포스피닐메틸)-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로소페닐)-아민 ml/0.2 M 시트레이트 pH 5.8
0.033 ml 참조 또는 시험 시료
0.050 ml s-GDH (글루코오스 전환에 대해 초과량의 s-GDH 임) 을 큐벳에 첨가하여 분석을 개시하였다. 620 nm 에서의 흡수의 변화를 모니터하였다. 2-5 분 후, 일정한 값이 관찰되었고 dE/5 분이 계산되었다. 야생형 s-GDH 로 참조 시료를 측정하여 수득된 값을 100% 로 설정하였다. 기타 값을 상기 참조 값과 비교하여 % 로 계산하였다.
결과:
신규한 변이체를 사용할 때 시험 시료 내에서 뚜렷하게 적은 말토오스 방해가 검출되었다. 시료 중 글루코오스를 말토오스로부터 가장 잘 구별하기 위한 s-GDH 의 농도가 더욱 최적화될 수 있음이 명백하다. 너무 많은 효소는 말토오 스 전환을 증가시키고, 너무 적은 효소는 모든 글루코오스를 전환시키지 않음에 따라 흡수의 종점에 도달하지 않을 것이다.
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Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 ggt ttt gcc ttc cat cct gat ttt aaa aat aat cct tat atc tat att 288 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 tca ggt aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aac 336 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 caa acg att att cgt cgt tat acc tat aat aaa tca aca gat acg ctc 384 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 gag aag cca gtc gat tta tta gca gga tta cct tca tca aaa gac cat 432 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 cag tca ggt cgt ctt gtc att ggg cca gat caa aag att tat tat acg 480 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 att ggt gac caa ggg cgt aac cag ctt gct tat ttg ttc ttg cca aat 528 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 caa gca caa cat acg cca act caa caa gaa ctg aat ggt aaa gac tat 576 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 cac acc tat atg ggt aaa gta cta cgc tta aat ctt gat gga agt att 624 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 cca aag gat aat cca agt ttt aac ggg gtg gtt agc cat att tat aca 672 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 ctt gga cat cgt aat ccg cag ggc tta gca ttc act cca aat ggt aaa 720 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 tta ttg cag tct gaa caa ggc cca aac tct gac gat gaa att aac ctc 768 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 att gtc aaa ggt ggc aat tat ggt tgg ccg aat gta gca ggt tat aaa 816 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 gat gat agt ggc tat gct tat gca aat tat tca gca gca gcc aat aag 864 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 tca att aag gat tta gct caa aat gga gta aaa gta gcc gca ggg gtc 912 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 cct gtg acg aaa gaa tct gaa tgg act ggt aaa aac ttt gtc cca cca 960 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 tta aaa act tta tat acc gtt caa gat acc tac aac tat aac gat cca 1008 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 act tgt gga gag atg acc tac att tgc tgg cca aca gtt gca ccg tca 1056 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 tct gcc tat gtc tat aag ggc ggt aaa aaa gca att act ggt tgg gaa 1104 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 aat aca tta ttg gtt cca tct tta aaa cgt ggt gtc att ttc cgt att 1152 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 aag tta gat cca act tat agc act act tat gat gac gct gta ccg atg 1200 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 ttt aag agc aac aac cgt tat cgt gat gtg att gca agt cca gat ggg 1248 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 aat gtc tta tat gta tta act gat act gcc gga aat gtc caa aaa gat 1296 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 gat ggc tca gta aca aat aca tta gaa aac cca gga tct ctc att aag 1344 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 ttc acc tat aag gct aag 1362 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 2 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for T348G sense strand <400> 3 catttgctgg ccaggggttg caccgtcat 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for T348G antisense strand <400> 4 atgacggtgc aacccctggc cagcaaatg 29 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer GDH 1 <400> 5 ttaacgtgct gaacagccgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer GDH 2 <400> 6 atatgggtaa agtactacgc 20 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wobbled insertion primer in429X_F sense strand <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 7 ctgccggaaa tnnngtccaa aaagatg 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wobbled insertion primer in429X_R anti sense strand <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 catctttttg gacnnnattt ccggcag 27 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insP429 <400> 9 gatactgccg gaaatccagt ccaaaaag 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insP429_R <400> 10 ctttttggac tggtcctccg gcagtatc 28 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Gly Asn Xaa Val Gln Lys Asp 1 5

Claims (22)

  1. PQQ-의존성 가용성 글루코오스 디히드로게나아제 (s-GDH) 로도 알려진 EC 1.1.99.17 의 가용성 형태의 변이체로서, 상기 변이체가 A. 칼코아세티커스 (A. calcoaceticus) (SEQ ID NO: 2) 로부터 알려진 s-GDH 야생형 서열의 428 및 429 위치 사이에 페닐알라닌, 루신, 메티오닌 또는 프롤린으로부터 선택되는 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 포함하고 348 위치의 트레오닌에 알라닌, 글리신 또는 세린으로부터 선택되는 하나의 아미노산 잔기의 치환을 추가로 포함하는 변이체.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 삽입된 아미노산이 프롤린인 변이체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 428 위치의 아스파라긴이 루신, 프롤린 또는 발린으로부터 선택되는 하나의 아미노산 잔기로 치환되는 것을 추가로 특징으로 하는 PQQ-의존성 s-GDH 의 변이체.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서, 171 위치의 타이로신에 알라닌, 메티오닌 또는 글리신으로부터 선택되는 하나의 아미노산의 치환을 추가로 포함하는 변이체.
  10. 제 1 항에 있어서, 245 위치의 글루탐산에 아스파르트산, 아스파라긴 또는 글루타민으로부터 선택되는 하나의 아미노산의 치환을 추가로 포함하는 변이체.
  11. 제 1 항에 있어서, 341 위치의 메티오닌에 발린, 알라닌, 루신 또는 이소루신으로부터 선택되는 하나의 아미노산의 치환을 추가로 포함하는 변이체.
  12. 제 1 항에 있어서, 169 위치의 루신에 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판으로부터 선택되는 하나의 아미노산의 치환을 추가로 포함하는 변이체.
  13. 제 1 항에 있어서, 349 위치의 발린에 알라닌 또는 글리신의 치환을 추가로 포함하는 변이체.
  14. 제 1 항에 따른 s-GDH 변이체 단백질을 엔코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  15. 숙주 세포 내의 폴리뉴클레오티드의 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 (operably linked) 제 14 항에 정의된 바와 같은, 단리된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  16. 제 15 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  17. s-GDH 변이체 제조 방법으로서, 효소 변이체의 제조에 적합한 조건 하에서 제 16 항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  18. 세포가 없는 펩티드 합성 시스템에서 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 제 14 항에 정의된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오티드 를 포함하는 발현 벡터.
  19. 삭제
  20. 제 1 항에 따른 s-GDH 변이체를 사용하여 시료 중 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법으로서, 상기 개선은 시료를 상기 변이체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 글루코오스의 상기 검출, 결정 또는 측정이 센서 또는 테스트 스트립 장치를 사용하여 수행되는 것을 추가로 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 따른 s-GDH 변이체를 포함하는, 시료 중 글루코오스의 검출 또는 측정을 위한 장치.
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