GLUCOSA-DESHIDROGENASA DEPENDIENTE DE PIRROLOQUINOLIN-QUINONA MANIPULADA POR INGENIERÍA GENÉTICA QUE COMPRENDE UNA INSERCIÓN
DE AMINO CIDO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a variantes mejoradas de glucosa-deshidrogenasas dependientes de pirroloquinolin-quinona (PQQ) solubles (s-GDH) que comprenden una inserción de aminoácido entre las posiciones 428 y 429 correspondiente a la secuencia de aminoácidos conocida de Acinetobacter calcoaceticus, para genes que codifican tales variantes s-GDH, a proteínas de tales variantes s-GDH con especificidad de sustrato mejorada para glucosa, y a diferentes aplicaciones de estas variantes s-GDH, particularmente para determinar concentraciones de azúcares, especialmente de glucosa en una muestra. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La determinación de la concentración de glucosa en sangre es extremadamente importante en el diagnóstico clínico y en el manejo de la diabetes. Aproximadamente 150 millones de personas en todo el mundo sufren de la enfermedad crónica diabetes melli tus, un número que puede duplicarse en el 2025 de acuerdo a la Organización Mundial de la Salud. Aunque la diabetes se diagnostica y se trata fácilmente, el manejo exitoso a largo plazo requiere herramientas de diagnóstico de REF:177886 bajo costo que reporten de manera rápida y precisa las concentraciones de glucosa en sangre. Las glucosa-deshidrogenasas dependientes de PQQ (EC 1.1.99.17) catalizan una reacción en la cual la glucosa se oxida a gluconolactona. Por consiguiente, este tipo de enzima se utiliza en la medición del azúcar en la sangre. Una de estas herramientas es una tira de diagnóstico basada en la glucosa-deshidrogenasa soluble (s-GlucDOR, EC 1.1.99.17), una enzima que contiene pirroloquinolin-quinona derivada originalmente de Acinetobacter calcoaceticus . Las quinoproteínas utilizan quinona como cofactor para oxidar los alcoholes, aminas y aldosas a sus correspondientes lactonas, aldehidos y ácidos aldólicos
(Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter"
(1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J
Biochem 200 (1991) 271-284; Davidson, V. L., en "Principies and applications of quinoproteins" (1993) el libro completo,
New York, Marcel Dekker; Anthony, C, Biochem J. 320 (1996) 697-711; Anthony, C. and Ghosh, M. , Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C. Biochem. Soc. Trans. 26(1998) 413-417; Anthony, C. and Ghosh, M. , Prog. Bi hys . Mol. Biol. 69 (1998) 1-21. Entre las quinoproteínas, aquellas que contienen el cofactor de enlace no covalentemente 2, 7 , 9-tricarboxi-lH-pirrólo- [2 , 3-f] quinolin-4, 5-diona (PQQ) constituyen el subgrupo más grande (Duine 1991, supra) Todas las quinon-glucosa-deshidrogenasas bacterianas conocidas hasta ahora pertenecen a este subgrupo con PQQ como cofactor (Anthony and Ghosh 1997 supra, Goodwin, P.M. and Anthony, C, Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80; Anthony, C, Adv. en Phot and Resp. 15 (2004) 203-225) . Dos tipos de glucosa-deshidrogenasa dependiente de PQQ (EC 1.1.99.17) se han caracterizado en bacterias: uno está unido a la membrana (m-GDH) , el otro es soluble (s-GDH) . .Ambos tipos no comparten alguna homología secuencial significativa
(Cleton-Jansen, A. M. , et al . , Mol. Genet. 217 (1989) 430-436;
Cleton-Jansen, A. M. , et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56
(1989) 73-79; Oubrie, A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A
96 (1999) 11787-11791. Éstos también son diferentes respecto a su cinética así como a sus propiedades inmunológicas (Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnol. & Biochem. 59 (1995) 1548-1555) . Las -GDHs están esparcidas en bacterias gram-negativas, las s-GDHs, no obstante, se han encontrado solamente en el espacio periplasmático de cepas de Acinetojbacter, como A . calcoaceticus (Duine, J.A., 1991a; Cleton-Jansen, A.M. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125; Matsushita and Adachi , 1993) y A . baumannii (JP 11243949) . A través de la búsqueda en bases de datos de secuencias, se han identificado dos secuencias homologas a la s-GDH de A . calcoaceticus de longitud completa en K-12 de E. coli y Synechocystis sp . Adicionalmente, también se encontraron dos secuencias incompletas, homologas de s-GDH de A . calcoaceticus en el genoma de P. aeruginosa y Bordetella pertussis (Oubrie et al. 1999 a, b, c) y Enterobacter intermedium (Kim, C.H. et al., Current Microbiol. 47 (2003) 457-461) , respectivamente. Las secuencias deducidas de aminoácidos de estas cuatro proteínas no caracterizadas están estrechamente relacionadas a s-GDH de A. calcoaceticus con muchos residuos en el sitio putativo activo, conservado totalmente. Estas proteínas homologas probablemente tienen una estructura similar y catalizan reacciones similares dependientes de PQQ (Oubrie et al., 1999 a, b, c; Oubrie A., Biochim Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151; Reddy, S., and Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438; Yamada, M. et al., Biochim. Biophys Acta 1647 (3003) 185-192). Se ha descubierto que las s-GDHs y m-GDHs bacterianas poseen secuencias muy diferentes y especificidad de sustrato diferente. Por ejemplo, A . calcoaceticus contiene dos glucosa-deshidrogenasas dependientes de PQQ diferentes, una m-GDH que es activa in vivo, y la otra designada s-GDH para la cual solamente se puede mostrar actividad in vi tro . Cleton-Jansen et al., 1988; 1989 a, b clonaron los genes que codifican para las dos enzimas de GDH y determinaron las secuencias de DNA de ambos de estos genes de GDH. ?o existe homología obvia entre m-GDH y s-GDH, corroborando el hecho de que m-GDH y s-GDH representan dos moléculas completamente diferentes (Laurinavicius, V., et al, Biologija (2003) 31-34). El gen de s-GDH de A . calcoaceticus ha sido clonado en E. coli . Después de ser producida en la célula, la s-GDH es traslocada a través de la membrana citoplásmica en el espacio periplásmico (Duine, J.A. , Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312 New York, Plenum Press; Matsushita, K. .And Adachi, O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principies and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker) . Como la s-GDH nativa proveniente de A . cal coaceticus, s-GDH recombinante expresada en E. coli es un homodímero, con una molécula de PQQ y tres iones de calcio por monómero (Dokter, P. et al., Biochem. J. 239 (1986) 163-167; Dokter, P. et al., FEMS Microbiol. Lett. 43 (1987) 195-200; Dokter, P. et al., Biochem. J. 254 (1988) 131-138; Olsthoorn, A. and Duine, J. A., Arch. Biochem Biophys. 336 (1996) 42-48; Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333, Oubrie, A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96 (1999) 11787-11791, Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194). s-GDH oxida una amplia gama de mono-y disacáridos a las cetonas correspondientes, las cuales después hidrolizan a los ácidos aldónicos, y también es capaz de donar electrones a PMS (metosulfato de fenazina), DCPIP (2, 6-dicloro-fenolindofenol, WB (azul de Wurster) y ubiquinonas de cadena corta tales como ubiquinona Ql y ubiquinona Q2 (Matsushita, K., et al., Biochem. 28 (1989) 6276-6280 Matsushita, K. , et al . , Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), varios aceptores de electrones artificiales tales como metil-sulfato de N-metilfenazonio (Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochem 37 (1998) 13854-13861) y polímeros electroconductores (Ye, L., et al . , Anal. Chem. 65 (1993) 238-241) . En vista de la actividad muy específica de s-GDHs hacia la glucosa (Olsthoorn, A. J. Duine, J. A., (1996) supra) y su especificidad de aceptor de electrones artificial amplia, la enzima es muy adecuada para aplicaciones analíticas, particularmente para utilizarse en (bio-) sensor o tiras de pruebas para determinación de glucosa en aplicaciones de diagnóstico (Kaufmann, N. Et al., Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH; Malinauskas, A; et al., Sensors and Actuators, B: Chemical BlOO (2004) 395-402). La oxidación de glucosa se puede catalizar por al menos tres grupos muy distintos de enzimas, es decir, por glucosa-deshidrogenasas dependientes de NAD/P, por glucosa-oxidasas de flavoproteína o por DGS de quinoproteína (Duine, J.A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23). Se ha observado una autooxidación más bien baja de s-GDH reducida, demostrando que el oxígeno es un aceptor de electrones muy pobre para s-GDH (Olsthoorn and Duine, 1996) s-GDH puede donar electrones eficientemente de la quinona reducida a mediadores tales como PMS, DCPIP, WB y ubiquinonas de cadena corta tales como Ql y Q2 , pero no puede donar electrones eficientemente directamente al oxígeno. Las tiras y sensores para prueba, tradicionales para monitorear el nivel de glucosa en sangre, suero y orina, por ejemplo, de pacientes diabéticos, utilizan glucosa-oxidasa. El desempeño de la enzima depende de la concentración de oxígeno. Las mediciones de glucosa en diferentes altitudes con diferentes concentraciones de oxígeno en el aire, pueden conducir a falsos resultados. La mayor ventaja de las glucosa-deshidrogenasas dependientes de PQQ es su independencia del oxígeno. Esta característica importante se describe por ejemplo en el documento US 6,103,509, en el cual se han investigado algunas características de GDH unida a membrana. Una contribución importante al campo ha sido el uso de s-GDH junto con mediadores apropiados. Los métodos de ensayo y los dispositivos de tiras de prueba basados en s-GDH se describen con detalle en la patente US 5,484,708. Esta patente también contiene información detallada sobre el establecimiento de ensayos y la producción de tiras de prueba basadas en s-GDH para la medición de glucosa. Los métodos descritos ahí así como los documentos citados, se incluyen en la presente como referencia. Otras patentes o solicitudes que se refieren al campo y que comprenden información específica sobre varios modos y aplicaciones para enzimas con actividad de glucosa-deshidrogenasa son US 5,997,817; US 6,057,120; EP 0 620 283; y
JP 11-243949-A. Un sistema comercial que utiliza s-GDH y un indicador que produce un cambio de color cuando ocurre la reacción (Kaufmann et al. 1997 supra) es el sistema Glucotrend® distribuido por Roche Diagnostics GmbH. A pesar de las ventajas descritas anteriormente para utilizar una s-GDH dependiente de PQQ, en la determinación de glucosa, también se tiene que considerar una desventaja. La enzima tiene más bien un espectro de sustrato amplio en comparación a m-GDH. Es decir, s-GDH oxida no solamente la glucosa sino también otros diversos azúcares incluyendo maltosa, galactosa, lactosa, mañosa, xilosa y ribosa (Dokter et al. 1986 a; Oubrie A., Biochim Biophys Acta 1647 (2003) 143-151) . La reactividad hacia los azúcares diferentes a la glucosa, en ciertos casos puede dañar la precisión en la determinación de los niveles de glucosa en sangre. En particular, pacientes en diálisis peritoneal, tratados con icodextrina (un polímero de glucosa) pueden contener fluidos en su cuerpo, por ejemplo, en sangre, altos niveles de otros azúcares, especialmente maltosa (Wens, R. , et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609). Hasta la fecha, las muestras clínicas como por ejemplo las obtenidas de pacientes diabéticos, especialmente de pacientes con complicaciones renales y especialmente de pacientes en diálisis, pueden contener niveles significativos de otros azúcares, especialmente maltosa Las determinaciones de glucosa en muestras obtenidas de tales pacientes críticos pueden estar dañadas por la maltosa (Davies, D. , Perit Dial. Int. 14 (1994) 45-50; Frampton, J. E.; y Plosker, G. L., Drugs 63 (2003) 2079-2105) . En la literatura existen escasos reportes sobre intentos para producir s-GDHs dependientes de PQQ modificadas, con especificidad alterada de sustrato. Igarashi, S., et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824 reportan que introducir una mutación puntual en la posición Glu277 conduce a mutantes con perfil de especificidad del sustrato alterado. Sode, en la patente EP 1 176 202, reporta que ciertas sustituciones de aminoácidos dentro de s-GDH conducen a s-GDH mutante con una afinidad mejorada para la glucosa. En la patente EP 1 167 519, el mismo autor reporta sobre s-GDH mutante con estabilidad mejorada. Además, el mismo autor reporta en JP2004173538 respecto a otros mutantes de s-GDH con afinidad mejorada por la glucosa.
Kratzsch, P. Et al., WO 02/34919 reportan que la especificidad de s-GDH para glucosa en comparación a otros sustratos de azúcar, especialmente en comparación a la maltosa, se puede mejorar por sustituciones de aminoácidos en ciertas posiciones de s-GDH. Takeshima, S., et al. (EP 1 367 120) reportan respecto a s-GDH mutada que comprende ciertas sustituciones de aminoácidos o una inserción de aminoácido entre la posición 427 y la 428, correspondiente a la secuencia de aminoácidos conocida de Acinetobacter calcoaceticus . No obstante, mientras que realmente se han reportado algunos mejoramientos para generar mutantes o variantes de s-GDH con propiedades mejoradas también, todavía se requieren alternativas y/o mejoramientos adicionales. Por lo tanto existe una gran necesidad clínica y demanda por mutantes adicionales o formas variantes de s-GDH, las cuales solas o en combinación con las mutaciones ya conocidas den origen a una especificidad mejorada para glucosa como sustrato. La tarea de la presente invención fue proporcionar nuevos mutantes o variantes de s-GDH, los cuales solos o en combinación con las mutaciones ya conocidas, conducen a una especificidad de sustrato significativamente mejorada para glucosa en comparación a otras moléculas seleccionadas de azúcar, por ejemplo, como galactosa o maltosa.
Sorprendentemente se descubrió que es posible mejorar significativamente la especificidad de sustrato de s-GDH para glucosa, en comparación a otros azúcares, mediante la producción de una inserción de aminoácido entre las posiciones 428 y 429 de s-GDH como corresponde a la secuencia de aminoácidos conocida de Acinetojbacter calcoaceticus, y por lo tanto al menos para superar parcialmente los problemas anteriormente descritos, conocidos en la técnica. La especificidad de sustrato para glucosa en comparación a otras moléculas seleccionadas de azúcar, se ha mejorado significativamente mediante la provisión de variantes de inserción de s-GHD de acuerdo a la presente invención y como se describe más adelante, y en las reivindicaciones anexas . Debido a la especificidad de sustrato mejorada de las nuevas formas de s-GDH, es posible el progreso técnico significativo para determinaciones de glucosa en varios campos de aplicaciones. Las variantes de s-GDH mejoradas se pueden utilizar con gran ventaja para la detección específica o medición de glucosa en muestras biológicas, especialmente en dispositivos de tiras de prueba o en biosensores. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una variante de la forma soluble de 1.1.99.17 conocida como glucosa-deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH) , tal variante comprende al menos una inserción de residuo de aminoácido entre las posiciones del aminoácido correspondientes a las posiciones 428 y 429 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) y opcionalmente además comprende una o más sustituciones de aminoácido, preferentemente sustituciones en la posición 348 y 428. Las variantes preferidas de s-GDH muestran propiedades mejoradas, especialmente especificidad aumentada para glucosa, así como secuencias de polinucleótidos que codifican para tales variantes, un vector de expresión que comprende tal secuencia de polinucleótidos, y una célula hospedera que comprende el vector de expresión, también se proporcionan. La invención también se refiere al uso de una variante de acuerdo a la presente invención, en un método para medir glucosa, especialmente por un dispositivo de tira de prueba o con un biosensor. Los siguientes ejemplos, referencias, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a comprender la presente invención, el alcance real de la cual se establece en las reivindicaciones anexas. Se comprende que las modificaciones se pueden realizar en los procedimientos establecidos, sin apartarse del espíritu de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra secuencias proteicas de s-GDH dependiente de PQQ de A calcoaceticus (superior) y s-GDH A. baumannii (inferior) alineadas de acuerdo a homología secuencial . La figura 2 es una ilustración del vector pACSGDH indicado en el Ejemplo 1, que contiene las secuencias de DNA mutadas o de tipo silvestre, respectivamente, de glucosa-deshidrogenasa dependiente de PQQ. Las figuras 3a-3b muestran la secuencia nucleotídica de (DNA) del vector pACSGDH indicado en el Ejemplo 1, que contiene la secuencia de DNA tipo silvestre de glucosa-deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se indicó anteriormente, dos tipos de enzimas de quinoproteína, completamente diferente con actividad de glucosa-deshidrogenasa (unida a membrana y soluble) se agrupan conjuntamente bajo EC 1.1.99.17. Estos dos tipos parecen no estar relacionados entre si . Para el objeto de esta invención, solamente la forma soluble de GDH (s-GDH) es relevante y se describen en la presente más adelante las variantes mejoradas de la misma. En una primera modalidad, la invención se refiere a una variante de la forma soluble de EC 1.1.99.17 también conocida como glucosa-deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH) , dicha variante comprende al menos una inserción de residuo de aminoácido entre las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 428 y 429 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH, conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) y opcionalmente comprende además una o más sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, solamente se inserta un aminoácido entre las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 428 y 429 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) . También se prefiere que la variante de s-GDH que comprende una inserción de aminoácido entre las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 428 y 429 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté caracterizada porque el aminoácido insertado se selecciona del grupo que consiste de leucina, fenilalanina, metionina y prolina. Preferentemente, el aminoácido insertado es prolina. En la técnica se sabe que la secuencia de DNA de tipo silvestre de una glucosa-deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble se puede aislar de cepas de Acinetojbacter. Se prefiere más el aislamiento de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus . La secuencia de esta s-GDH tipo silvestre (la proteína madura) se da en la SEQ ID N: 2. También se pueden utilizar otras cepas de LMD de Acinetobacter como fuente de s-GDH tipo silvestre. Tales secuencias se pueden alinear a la secuencia obtenida de A . calcoaceticus y se pueden realizar las comparaciones secuenciales. También parece factible seleccionar librerías de DNA de otras cepas bacterianas, como por ejemplo las que se describen para E. coli K-12 (Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333) y para identificar secuencias relacionadas a s-GDH en tales genomas . Dicha secuencia y las secuencias homologas ya identificadas se pueden utilizar para generar variantes de s-GDH con especificidad de sustrato mejorada. El término "variante" en el sentido de la presente invención se refiere a una proteína de s-GDH la cual comparada a una secuencia de tipo silvestre correspondiente, tiene una inserción de aminoácido entre las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 428 y 429 de la secuencia tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO : 2 ) . El término "mutante" en el sentido de la presente invención se refiere a una proteína de s-GDH, la cual comparada a una secuencia de tipo silvestre correspondiente, tiene al menos una substitución de aminoácido en comparación a la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) . Los términos "variantes" o "mutantes", por lo tanto se aplican mutuamente para una proteína de s-GDH, la cual en comparación a una secuencia de tipo silvestre correspondiente tiene una inserción de aminoácido entre las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 428 y 429 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) y además de ésta, al menos una substitución de aminoácido. En una modalidad preferida adicional, las propiedades enzimáticas o funcionales de una variante mejorada de s-GDH, se comparan con la enzima de tipo silvestre o con mutantes sin una inserción de aminoácido entre las posiciones 428 y 429, respectivamente. Una variante preferida de acuerdo a la presente invención está caracterizada porque con relación a la enzima de tipo silvestre correspondiente, tiene al menos una especificidad de sustrato mejorada doble para la glucosa en comparación al menos a otro sustrato de azúcar seleccionado. Con el fin de calcular la especificidad del sustrato o la reactividad cruzada, una manera fácil es establecer actividad medida con glucosa como sustrato en 100%, y comparar la actividad medida con el otro azúcar seleccionado al valor de la glucosa. Algunas veces, con el fin de no ser redundante, se utiliza simplemente el término especificidad sin hacer referencia especial a la glucosa por un lado y a otro sustrato de azúcar seleccionado, por otro lado. El experto en la técnica se dará cuenta que la comparación de actividades enzimáticas se hace mejor a concentraciones equimolares de las moléculas sustrato investigadas, utilizando condiciones de ensayo bien definidas. En caso contrario se tienen que realizar correcciones para las diferencias en las concentraciones. Las condiciones de ensayo bien definidas y estandarizadas se tienen que elegir con el fin de evaluar (mejoramientos en) la especificidad de sustrato. La actividad enzimática de s-GDH para glucosa como sustrato así como para otros sustratos de azúcar seleccionados, se mide como se describe en el Ejemplo 7. Con base en estas mediciones de actividad enzimática para glucosa o una azúcar diferente seleccionada, se evalúa preferentemente la maltosa, la reactividad cruzada (y los mejoramientos de ésta) . La reactividad de s-GDH (cruzada) para un azúcar seleccionado, en porciento se calcula como Reactividad cruzada [%]= (actividad de azúcar seleccionada/actividad de glucosa) x 100%. La reactividad (cruzada) para maltosa de s-GDH tipo silvestre de acuerdo a la fórmula anterior, se ha determinado como de aproximadamente 105%. La reactividad (cruzada) de s-GDH tipo silvestre para galactosa se ha medido como aproximadamente 50% (ver tabla 1) . La especificidad (mejorada) se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula :
actividad mutante glucosa actividad azúcar tipo silvestre Especificidad (mejoramiento) = x Actividad glucosa actividad mutante tipo silvestre azúcar seleccionado
En comparación con la enzima tipo silvestre una forma de s-GDH con al menos un mejoramiento de 10 veces de especificidad para glucosa versus maltosa (maltosa/glucosa) consecuentemente con la maltosa como sustrato, tiene cuando mucho 10.5% de la actividad como se mide con la glucosa como sustrato. O, si por ejemplo una s-GDH mutante tiene una reactividad cruzada para maltosa de 20% (determinada y calculada como se describe anteriormente) , este mutante en comparación a la s-GDH de tipo silvestre, tiene por lo tanto una especificidad de sustrato mejorada 5.25 veces (maltosa/glucosa) . El término "actividad específica" para un sustrato, se conoce muy bien en la técnica, se utiliza preferentemente para describir la actividad enzimática por cantidad de proteína. Varios métodos se conocen en la técnica para determinar la actividad específica de moléculas de GDH, utilizando glucosa u otros azúcares como sustratos (Igarashi, S., et al., (1999) supra). Uno de los métodos disponibles para tal medición, se describe con detalle de la sección de ejemplos . Mientras sea posible, seleccionar muchas moléculas diferentes de azúcar e investigar la especificidad de glucosa de s-GDH en comparación a cualquier molécula de azúcar seleccionada tal, se prefiere seleccionar una molécula de azúcar clínicamente relevante para tal comparación. Los azúcares seleccionados preferidos se seleccionan del grupo que consiste de mañosa, alosa, galactosa, xilosa, y maltosa. Preferentemente, se seleccionan maltosa o galactosa y la s-GDH mutante se prueba para observar la especificidad mejorada de sustrato por la glucosa en comparación a galactosa o maltosa. En una modalidad preferida adicional, el azúcar seleccionado es maltosa. Se ha descubierto que los mejoramientos en la especificidad de glucosa de variantes de s-GDH de acuerdo a esta invención, por ejemplo, para maltosa versus glucosa, son muy considerables . Por lo tanto se prefiere aún más que la especificidad de sustrato para glucosa en comparación a la especificidad de sustrato para al menos uno de los sustratos de azúcar seleccionados diferentes esté mejorado al menos tres veces. Otras modalidades preferidas comprenden mutantes de s-GDH, caracterizados por una especificidad de estrato mejorada para glucosa, la cual es al menos 5 veces superior o también se prefiere al menos 10 veces superior, en comparación a la otra molécula de azúcar seleccionada. Las mutaciones en s-GDH conducen en muchos casos a variantes enzimáticos con actividad específica dramáticamente reducida para la glucosa sustrato. Una disminución mayor a 10 veces en la actividad específica (absoluta o total) para la glucosa sustrato, no obstante, puede ser crítica para aplicaciones rutinarias . Por lo tanto se prefiere que la s-GDH con especificidad mejorada hacia la glucosa sustrato muestre al menos 10% de la actividad específica para glucosa, como se mide con la enzima de tipo silvestre. Por supuesto se prefiere más que tales enzimas mutadas muestren al menos 20%, ó se prefiere más al menos 30% de la actividad de la glucosa respectiva de s-GDH de tipo silvestre. Se prefieren también que tales mutantes para los cuales la actividad específica de maltosa sea de 10% o menos, o incluso solamente de 5% o menos de la actividad específica de maltosa como se mide para la enzima de tipo silvestre correspondiente sobre tiras de prueba o pruebas líquidas, mientras que la actividad específica para glucosa sea > 10% en comparación a la actividad específica para glucosa de la enzima de tipo silvestre correspondiente. Se ha descubierto que es posible mejorar además la especificidad de sustrato de una variante de s-GDH que comprende una inserción entre la posición 428 y 429 al modificar adicionalmente tal variante para que comprenda además una o más sustituciones de aminoácido en ciertas posiciones de aminoácido bien definidas. Los logros de la presente invención se describen con mayor detalle haciendo referencia a las posiciones de aminoácidos conocidas de SEQ ID N: 2, la secuencia de tipo silvestre de s-GDH como se aisló de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus . Las posiciones de aminoácidos en diferentes aislados de s-GDH que corresponden a las posiciones de la SEQ ID NO: 2, se identifican fácilmente por comparación de secuencias apropiadas . El alineamiento múltiple y la comparación de una secuencia de s-GDH con la secuencia tipo silvestre de SEQ ID NO: 2, se realiza con el programa PileUp del paquete GCG versión 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.) PileUp crea un alineamiento de secuencias múltiples que utiliza una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng, D.F. and Doolittle, R.F., j. Mol. Evol . 25 (1987) 351-360, se definen por consiguiente y las matrices de calificación para residuos de aminoácidos idénticos, similares, o diferentes. Este proceso comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un cúmulo de dos secuencias alineadas. Este cúmulo puede luego ser alineado a la siguiente secuencia más relacionada o cúmulo de secuencias alineadas. Dos cúmulos de secuencias se pueden alinear por una simple extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se logra por una serie de alineamientos por pares progresivos, que incluyen secuencias y cúmulos cada vez más disímiles, hasta que todas las secuencias han sido incluidas en el alineamiento final por pares . Estas posiciones guías en otras moléculas de s-GDH homologas, se pueden identificar fácilmente como correspondientes a las posiciones dadas para s-GDH A. calcoaceticus en la SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Este es el porqué las posiciones de aminoácidos dadas en la presente se comprenderán como las posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o como las posiciones correspondientes a ésta o en otra molécula de s-GDH homologa. Se ha descubierto que los mutantes de s-GDH que comprenden una substitución de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 348, en combinación con una inserción de aminoácido entre la posición 428 y 429 s-GDH muestra un efecto notablemente positivo con respecto a la especificidad por glucosa. Como se demuestra en la tabla 1, un grupo de variantes de s-GDH con especificidad mejorada para glucosa se ha identificado y generado. El mejoramiento de la especificidad de glucosa para una s-GDH variante se ve tan largo como el aminoácido en la posición 348 de treonina está substituida con otro aminoácido apropiado y un aminoácido apropiado es insertado entre la posición 428 y 429. Por consiguiente, una modalidad muy preferida de la presente invención se refiere a una proteína variante de s-GDH dependiente de PQQ que comprende una inserción entre los aminoácidos 428 y 429 de la secuencia de tipo silvestre s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) y además comprende una substitución de residuo de aminoácido en la posición del aminoácido correspondiente a la posición 348. También se ha descubierto que sustituciones adicionales en la posición de un aminoácido correspondiente a las posiciones 169, 171, 245, 341, 349, y /o 428 de la SEQ ID NO: 2 son ventajosas en los esfuerzos de mejoramiento adicional de la especificidad para glucosa de una variante de s-GDH que comprende una inserción entre los aminoácidos 428 y 429 y una substitución de residuo de aminoácido en la posición 348. Ni el residuo de treonina en la posición 348 ni la inserción de un aminoácido entre la posición 428 y 429 s-GDH como se aisla de la cepa LMD 79.41 del tipo de Acinetobacter calcoaceticus se conocen en la técnica que contribuyan a la unión de sustrato de s-GDH (Oubrie, A., et al., Embo J. 18
(1999) 5187-5194; Oubrie, A. y Dijkstra, B.W. , Protein Sci.
9(2000) 1265-1273) no se encuentra disponible explicación química o física, el porqué especialmente estas dos modificaciones de s-GDH mejoran la especificidad de sustrato para glucosa, en comparación a otras moléculas de azúcar de interés, especialmente en comparación a la maltosa. En una modalidad preferida adicional, la s-GDH variante está caracterizada porque el residuo de aminoácido treonina en la posición 348 está substituida con un residuo de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de alanina, glicina, y serina. En una modalidad más preferida, la glicina se utiliza para sustituir por treonina en la posición 348. La terminología T348G es conocida por los técnicos expertos e indica que la treonina en la posición 348 está reemplazada por glicina. Una modalidad preferida adicional es una variante de la forma soluble de EC 1.1.99.17 también conocida como glucosa-deshidrogenasa soluble dependiente de PQQ (s-GDH) , tal variante comprende al menos una inserción de residuo de aminoácido entre una posición de aminoácido correspondiente a las posiciones 428 y 429 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) y al menos una sustitución de residuo de aminoácido en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 428. Preferentemente, la sustitución de la asparagina en la posición 428 es por leucina, prolina y valina. La sustitución más preferida en la posición 428 es por prolina. Un grupo de variantes de s-GDH, preferida de acuerdo a esta invención comprende una sustitución del residuo de aminoácido en la posición 348, y una sustitución de aminoácido en la posición 428, y una inserción de aminoácido entre la posición 428 y 429. Estas variantes opcionalmente pueden ser además modificadas para comprender una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones de aminoácido correspondientes a las posiciones 169, 171, 245, 341, y/o 349 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ. ID NO : 2 ) . En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 169 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituida en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural, leucina esté sustituida por fenilalanina, tirosina o triptófano la sustitución más preferida en la posición 169 es por fenilalanina. En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 171 de la secuencia de tipo silvestre s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituida en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural tirosina esté sustituido por una aminoácido seleccionado del grupo que consiste de alanina, metionina, glicina. La sustitución más preferida en la Ó posición 171 es por glicina. En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 245 de la secuencia de tipo silvestre s-GDH conocida como A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituida en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural, ácido glutámico esté sustituido por ácido aspártico, asparagina o glutamina. La sustitución más preferida en la posición 245 es por ácido aspártico. En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 341 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituida en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural metionina esté sustituido por valina, alanina, leucina isoleucina. La sustitución más preferida en la posición 341 es por valina. En caso de que el aminoácido correspondiente a la posición 349 de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) esté sustituida en una variante de la presente invención, se prefiere que el aminoácido de origen natural valina esté sustituido por alanina, glicina. La sustitución más preferida en la posición 349 es por alanina. Como se describe en el documento WO 02/34919, una sustitución del aminoácido en la posición 348 de la secuencia s-GDH correspondiente a la secuencia de tipo silvestre, aislada de A. calcoaceticus, se puede utilizar para mejorar significativamente la especificidad de glucosa de s-GDH. El técnico experto encontrará en el documento WO 02/34919 otras posiciones apropiadas que pueden estar sustituidas y combinadas con la inserción de acuerdo a la presente invención. En una modalidad preferida adicional, la variante de s-GDH de acuerdo a la presente invención, además de la inserción entre los residuos de aminoácidos 428 y 429, comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 171, 245, 341, 348 y 349 como correspondientes a las posiciones de aminoácidos de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) . En todavía una modalidad preferida adicional, la variante de s-GDH de acuerdo a la presente invención, además de la inserción entre los residuos de aminoácidos 428 y 429, comprende al menos tres sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 171, 245, 341, 348 y 349 como correspondientes a las posiciones de aminoácidos de la secuencia de tipo silvestre de s-GDH conocida de A . calcoaceticus (SEC. ID NO: 2) . Como será evidente para el experto técnico, es posible emprender sustituciones de aminoácidos, por ejemplo mutaciones silenciosas, que no influyen en las propiedades de s-GDH a un grado significativo. La variante de acuerdo a la presente invención, no obstante, tendrá no más de 45 intercambios de aminoácidos en comparación a la SEQ ID NO: 2. Preferentemente, la variante comprenderá 20 ó menos sustituciones de aminoácidos, más preferentemente, solamente 10 sustituciones de aminoácidos o menos sustituciones estarán presentes . Las variantes de s-GDH de acuerdo a la presente invención se dan en la sección de Ejemplos. Estas variantes también representan modalidades preferidas de la invención. Las variantes con menos interferencia de glucosa encontradas hasta ahora comprenden la inserción entre los aminoácidos 428 y 429 preferentemente por prolina, y las mutaciones Y171G, ' E245D, M341V y T348G o las mutaciones L169F, Y171G, E245D, M341V y T348G, respectivamente. Estas dos variantes también son modalidades preferidas adicionales de la presente invención. El análisis de secuencia de aminoácidos reveló que la secuencia motiva encontrar en s-GDH de tipo silvestre proveniente de A. calcoaceticus por un lado y A. baumannii por otro lado, parecen ser muy conservadoras alrededor de las posiciones de mayor relevancia para mejorar la especificidad por glucosa, como se identifica en la presente invención, es decir, el sitio de inserción alrededor de la posición 428 y 429 como corresponde a la s-GDH de tipo silvestre proveniente de A. calcoaceticus . Una variante de s-GDH dependiente de PQQ, que comprende la secuencia de aminoácidos de AGNXaaVQK (SEQ ID NO: 2), representa una modalidad preferida de la invención. La SEQ ID NO: 2 corresponde a la posición 426-431 de una s-GDH de tipo silvestre de A. calcoaceticus o para la posición 427-432 de s-GDH tipo silvestre de A. baumannii pero comprende la inserción de un aminoácido (Xaa) entre las posiciones 428 y 429 (A . calcoaceticus, o entre 429 y 430 (A. baumannii) , respectivamente . En una modalidad preferida, la presente invención se refiere a una s-GDH variante que comprende la secuencia G-N-Xaa-V-Q-K-D (SEQ ID NO: 11) preferentemente, la variante de s-GDH que comprende la SEQ ID NO: 11 está caracterizada además porque el aminoácido Xaa se selecciona del grupo que consiste de leucina, prolina, fenilalanina y metionina, el Xaa más preferido es un residuo de prolina. Como se explicó anteriormente además, el aminoácido asparagina en la posición 428 de s-GDH de tipo silvestre se puede someter a una sustitución de aminoácido. En este caso, la SEQ ID NO: 11 comprenderá el aminoácido substituido en vez de P428. Se conocen numerosas posibilidades en la técnica para producir proteínas mutantes. Con base en los descubrimientos importantes de la presente invención, que describen la importancia crítica de una inserción de aminoácido entre la posición 428 y 429, el técnico experto ahora puede producir fácilmente más variantes apropiadas de s-GDH. Tales variantes por ejemplo pueden ser obtenidas por los métodos conocidos como mutagénesis aleatoria (Leung, D.W., et al., Technique 1 (1989) 11-15 y/o mutagénesis dirigida (Hill, D.E. et al., Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568). Un método alternativo para producir una proteína con las propiedades deseadas es proporcionar construcciones quiméricas, las cuales contienen elementos secuenciales de al menos dos fuentes diferentes o sintetizar completamente un gen apropiado de s-GDH. Tales procedimientos conocidos en la técnica se pueden utilizar en combinación con la información descrita en la presente invención, para proporcionar mutantes o variantes de s-GDH que comprenden por ejemplo sustituciones adicionales de aminoácidos en combinación con la inserción descrita entre la posición 428 y 429 de la SEQ ID NO: 2. Una variante de s-GDH de acuerdo a la presente invención por ejemplo se puede producir mediante el inicio a partir de un gen de s-GDH como se aisla de la cepa LMD 79.41 de tipo Acinetobacter calcoaceticus, así como mediante el inicio a partir de una secuencia homologa. En el contexto de esta solicitud, el término "homólogo" significa que comprende una secuencia de aminoácidos de s-GDH con al menos 90% de identidad en comparación a la SEQ ID NO: 2. En otras palabras, después del alineamiento apropiado utilizando el programa PileUp, al menos 90% de los aminoácidos de tal s-GDH homólogo son idénticos a los aminoácidos descritos en la SEQ ID NO: 2. Se comprenderá que las variaciones de DNA y secuencia de aminoácidos que existen naturalmente, o que pueden ser intencionalmente introducidas utilizando métodos conocidos en la técnica. Estas variaciones pueden dar por resultado hasta 10% de diferencias de aminoácidos en la secuencia completa, debido a supresiones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más residuos de aminoácidos en dicha secuencia, en comparación a la SEQ ID NO: 2. Tales sustituciones de aminoácidos se pueden producir, por ejemplo, con base en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos guías polares no cargados o grupos guías no polares que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, tirosina. Otras variaciones contempladas incluyen sales y esteres de los polipéptidos anteriormente mencionados, así como precursores de los polipéptidos anteriormente mencionados, por ejemplo, precursores que tienen sustitución N-terminal tal como metionina, N-formilmetionina, utilizados como secuencias guías . Tales variaciones se pueden producir sin apartarse necesariamente del alcance y el espíritu de la presente invención. De acuerdo a procedimientos conocidos en el estado de la técnica o de acuerdo a los procedimientos dados en la sección de ejemplos, es posible obtener secuencias de polinucleótidos que codifican para alguno de los mutantes de s-GDH como se describe anteriormente. La invención comprende por lo tanto también secuencias aisladas de polinucleótidos que codifican para proteínas mutantes de s-GDH como se describe anteriormente. La presente invención también incluye un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención, operablemente enlazado a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula hospedera. La presente invención incluye además un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención, operablemente enlazado a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula hospedera. Los vectores preferidos son plásmidos tales como pACSGDH mostrados en las figuras 2 y 3. Los vectores de expresión útiles en la presente invención contienen típicamente un origen de replicación, una resistencia a antibióticos para selección, un promotor para expresión y la totalidad o parte de la variante del gen s-GDH. Los vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias de DNA conocidas en la técnica, similares a secuencias de señal (para un mejor plegamiento, transporte en el periplasma o secreción) inductores para una mejor modulación de la expresión, o sitios de escisión para clonación. Las características del vector de expresión seleccionado deben ser compatibles con la célula hospedera, que se va a emplear. Por ejemplo, cuando la clonación en un sistema de células de E. coli , el vector de expresión debe contener promotores aislados del genoma de células de E. coli (por ejemplo, lac, o trp) . Los orígenes adecuados de replicación similares al origen de replicación del plásmido ColEl se pueden utilizar. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, lac y trp. También se prefiere que el vector de expresión incluya una secuencia que codifique para un marcador de selección como un gen de resistencia a antibióticos. Como marcadores seleccionables, se pueden emplear convenientemente resistencia a ampicilina, o resistencia a kanamicina. Todos estos materiales son conocidos en la técnica y se encuentran disponibles comercialmente. Los vectores de expresión adecuados que contienen las secuencias de codificación y control deseadas se pueden construir utilizando técnicas de DNA recombinante, estándares, conocidas en el ámbito muchas de las cuales se describen en Sambrook et al., en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press . La presente invención se refiere adicionalmente a células hospederas que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica para la totalidad o parte de la s-GDH mutante. Las células hospederas preferentemente contienen un vector de expresión que comprende la totalidad o parte de una de las secuencias de DNA que tienen una o más mutaciones mostradas en los ejemplos 2-8. Las células hospederas adecuadas incluyen, por ejemplo, E. coli
HB101 (ATCC 33694) disponible de Pomega (2800 Woods Hollow
Road, Madison, Wl, USA), XLl-Blue MRF' disponible de Sratagene
(11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) y similares. Los vectores de expresión se pueden introducir en las células hospederas mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la transformación de células hospederas con vectores de expresión se puede efectuar por el método de transformación de protoplastos mediado por polietilenglicol (Sambrook et al. 1989, supra) sin embargo, también se pueden emplear otros métodos para introducir vectores de expresión en las células hospederas, por ejemplo, electroporación, inyección biolística, o fusión de protoplastos . Una vez que un vector de expresión que contiene una variante de s-GDH se ha introducido en una célula hospedera apropiada, la célula hospedera puede ser cultivada en condiciones que permitan la expresión de las variantes deseadas de s-GDH. Las células hospederas que contienen el vector de expresión deseado con la secuencia de DNA que codifica para la totalidad o parte de la s-GDH mutante, se pueden identificar fácilmente por selección de antibióticos, por ejemplo. La expresión de las variantes de s-GDH se puede identificar por diferentes métodos similares a la producción de medición de los transcritos de mRNA de s-GDH, detección del producto génico inmunológicamente o detección de la actividad enzimática del producto génico. Preferentemente, se aplica un ensayo enzimático. La presente invención también muestra la generación y selección de variantes de s-GDH. La mutagénesis aleatoria y la mutagénesis por saturación se efectúan como se conoce en la técnica. Las variantes se seleccionan para la especificidad de sustrato (actividad con glucosa comparada a maltosa) y el valor KM para glucosa. Las condiciones de ensayo elegidas se adaptan para asegurarse que se puedan medir los pequeños mejoramientos esperados originados por ejemplo, por una simple sustitución de aminoácidos. Un modo de selección o evaluación de mutantes apropiados se da en el Ejemplo 3. Cualquier cambio o mejoramiento en comparación a la enzima de tipo silvestre, se puede detectar claramente de esta manera. Por supuesto, se debe comprender que no todos los vectores de expresión y las secuencias reguladoras de DNA funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de DNA de la presente invención. No todas las células hospederas funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, alguien de experiencia ordinaria en la técnica producirá una selección apropiada entre los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de DNA, y las células hospederas utilizando la guía proporcionada en la presente, sin experimentación indebida. La invención también se refiere a un proceso para producir variantes de s-GDH de la presente invención, que comprende cultivar una célula hospedera de la invención en condiciones adecuadas para la producción de la s-GDH mutante de la invención. Para células hospederas bacterianas, las condiciones típicas de cultivo son medio líquido que contiene fuentes de carbono y nitrógeno, el agente de inducción y antibiótico apropiado (dependiendo del vector de expresión utilizados) . Los antibióticos apropiados típicos incluyen ampicilina, kanamicina, cloranfenicol, tetraciclina y similares. Se prefiere que los polipéptidos de la presente invención se obtengan mediante producción en células hospederas que expresan una secuencia de DNA que codifica para la s-GDH mutante. Los polipéptidos de la presente invención también se pueden obtener por traducción in vi tro del mRNA codificado por la secuencia de DNA que codifica para la s-GDH mutante. Por ejemplo, la secuencias de DNA se pueden sintetizar como se describe anteriormente e insertar en un vector de expresión adecuado, el cual a su vez se puede utilizar en un sistema de transcripción /traducción in vi tro . Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado como se define y se describe anteriormente, operablemente enlazado a una secuencia promotora capaz de promover su expresión en un sistema de síntesis de péptidos sin células, representa otra modalidad preferida de la presente invención. Los polipéptidos producidos por ejemplo mediante procedimientos como los descritos anteriormente, se pueden aislar y purificar utilizando diversas técnicas de purificación de proteínas, rutinarias. Por ejemplo, los procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad, se pueden emplear. Una de las mayores aplicaciones de las variantes de s-GDH mejoradas de esta invención es para el uso en tiras de prueba para monitorear el nivel de glucosa en sangre en pacientes diabéticos. La insensibilidad de la glucosa-deshidrogenasa dependiente de PQQ hacia el oxígeno es, como se indicó anteriormente, una gran ventaja sobre la glucosa-oxidasa. Más importante, ya que las variantes de s-GDH tienen especificidad mejorada hacia la glucosa y actividad enzimática significativamente disminuida hacia otros azúcares, la interferencia debido a la maltosa, galactosa, y/u otros azúcares relacionados que pudieran estar presentes en una muestra que va a hacer analizada, se reduce significativamente. Por supuesto, se pueden investigar muchos tipos de muestras. Los fluidos corporales como suero, plasma, fluido intestinal u orina son fuentes preferidas para tales muestras . La invención también comprende un método de detección, determinación o medición de glucosa en una muestra, utilizando un mutante de s-GDH de acuerdo a la presente invención. Especialmente se prefiere que el método mejorado para detección de glucosa en una muestra esté caracterizado porque la detección, determinación o medición de glucosa se lleven a cabo utilizando un dispositivo sensor o tira de prueba . También dentro del alcance de la presente invención, se encuentra un dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende un mutante de s-GDH de acuerdo a esta invención, así como otros reactivos requeridos para dicha medición. Las variantes de s-GDH con especificidad de sustrato mejorada de esta invención también se pueden utilizar para mayor ventaja en biosensores (D'Costa, E.J.,et al., Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., et al., .Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., et al . , Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281; Malinauskas, A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100 (2004) 395-402) para monitorear en línea la glucosa en una muestra o un reactor. Para este objetivo, las variantes de s-GDH por ejemplo, se pueden utilizar para cubrir un electrodo vitreo insensible al oxígeno con un complejo de osmio que contiene una red epóxica conductiva redox (Ye et al., 1993 supra) para determinación más precisa de la concentración de glucosa. También existen otras posibles aplicaciones de las variantes de s-GDH con la especificidad de sustrato mejorada de acuerdo a esta invención. Por ejemplo, estas variantes de s-GDH se pueden utilizar en un proceso de producción de ácido aldónico. S-GDH de tipo silvestre tiene una producción alta en oxidación de sustrato produciendo ácidos glucónico y otros aldónicos . Mediante el uso de variantes de s-GDH, que son más específicas para la glucosa, la producción de ácido glucónico daría por resultado menos subproductos . Con otras variantes de s-GDH de especificidad de sustrato diferente, es posible producir diferentes ácidos aldónicos, como se requiera. En los siguientes ejemplos, todos los reactivos, enzimas de restricción, y otros materiales se obtuvieron de Roche Diagnostics Germany, a no ser que se especifiquen otras fuentes comerciales, y se utilizaron de acuerdo a las instrucciones proporcionadas por los proveedores. Las operaciones y métodos empleados para la purificación, caracterización y clonación de DNA son bien conocidos en la técnica (Ausubel, F., et al., in "Current protocols in molecular biology" (1994) Wiley Verlag) y se pueden adaptar como se requiera por el técnico experto. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Estos ejemplos no están diseñados para limitar el alcance de la presente invención, pero proporcionan mayor comprensión de la invención. Ejemplo 1 Clonación y expresión de la glucosa-deshidrogenasa dependiente de PQQ soluble de A . calcoaceticus de tipo silvestre en E. coli El gen de s-GDH se aisló de la cepa LMD 79.41 Acinetojbacter calcoaceticus , de acuerdo a procedimientos estándares. El gen s-GDH de tipo silvestre se subclonó en un plásmido que contenía el promotor mgl para la expresión ajustable (ver solicitud de patente WO 88/09373). La nueva construcción se denominó pACSGDH (ver figuras 2 y 3) Los plásmidos recombinantes se introdujeron en un organismo hospedero, seleccionado del grupo E. coli . Estos organismos después se cultivaron en condiciones apropiadas y se seleccionaron las colonias que mostraban actividad de s-GDH. El plásmido pACSGDH se aisló de un cultivo de 200 ml toda la noche del clon mencionado anteriormente, utilizando el equipo QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) de acuerdo al protocolo de los fabricantes . El plásmido se resuspendió en 1 ml de agua bidestilada. La concentración del plásmido se determinó utilizando un fotómetro Beckman DU 7400. El rendimiento fue de 600 µg. Posteriormente, se determinó la calidad del plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa. Ejemplo 2 Generación de mutante T348G Como una plantilla de inicio importante para la generación de variantes de inserción, se fabricó una s-GDH mutante con la mutación T348G. Este mutante de s-GDH se eligió debido a que se sabe tiene actividad reducida para maltosa, en comparación a glucosa (véase WO 02/34919) . El equipo de mutagénesis dirigida al sitio de cambio rápido (Stratagene, Cat. 200518) se utilizó para sustituir la treonina en la posición 348 por una glicina. Se designaron los cebadores apropiados . El cebador 5 '-y 3'- utilizados para mutagénesis fueron complementarios entre si y contenían el codón modificado para el intercambio de treonina a glicina (ACA a GGG) en una posición central. Estos nucleótidos estuvieron flanqueados por 12 a 16 nucleótidos en cada extremo. Las secuencias de los nucleótidos eran idénticas a la hebra de DNA en sentido y anti-sentido que flanquean el codón para el intercambio de aminoácidos . En vez del codón ACA = treonina para la hebra en sentido y TGT para la anti-sentido los cebadores contenían GGG = glicina para la hebra en sentido y CCC para la anti-sentido (véase SEQ ID Nos: 3 y 4) . La reacción de PCR y la digestión Dpnl se realizaron de acuerdo al manual. Después de eso, se utilizó un micro litro de muestra para la electroporación de células XL-MRF' . La electroporación se logró con 2.5 KV en probetas de 0.2 cm utilizando pulsador de E. coli (Bio Rad) después de desarrollo en 1 ml de LB a 37°C por una hora, las bacterias se colocaron sobre placas de agar con LB-ampicilina (100 µg/ ml de ampicilina) y se desarrollaron toda la noche a 37°C los clones de s-GDH mutados se examinaron utilizando el siguiente método de selección. Ejemplo 3 Selección Las colonias mutantes sobre las placas de agar, descritas anteriormente se recogieron en placas de micro titulación (MTPs) que contenían 200 µl de medio de LB-ampicilina/pozo y se incubaron toda la noche a 37°C Estas placas se denominaron placas maestra. A partir de cada placa maestra, se transfirieron 5 µl muestra/pozo a un MTP que contenía 5 µl/pozo de B (B = Reactivo de extracción de proteína bacteriana; Pierce No. 78248) para la desintegración celular y 240 µl de pirrólo-quinolin-quinona (PQQ); 0.0556 mM; Hepes; 50 mM; CaCl2 15 mM de pH 7. O/pozo para la activación de s-GDH, se agregaron. Para completar la formación de la holoenzima, el MTP se incubó a 25°C durante 2 horas y a 10°C toda la noche. Esta placa se denominó placa de trabajo. A partir de la placa de trabajo, se transfirieron 3 x 10 µl de muestra/pozo a tres MTPs vacíos. Después de eso, uno se probó con glucosa a concentración estándar, el segundo con una concentración reducida de glucosa (1.9 mM en vez de 30 mM) y el tercero con maltosa u otra molécula de azúcar seleccionada como un sustrato. Todas las otras moléculas de azúcar seleccionadas, se utilizaron en concentración estándar equimolar, por ejemplo a 30 mM. Para todos los ensayos, se aplicaron 90 µl de solución mediadora (ver Ejemplo7) que ya contenía el azúcar que iba a ser analizada. Se calculó el dE/min y el valor utilizando glucosa 30 mM como sustrato se ajustó al 100% de actividad. El valor obtenido con el otro azúcar se comparó con el valor de glucosa y se calculó la actividad porcentual ( (por ejemplo para maltosa como: dE/min maltosa/dE glucosa) *100) . Esto es equivalente a la reactividad cruzada de la enzima (variante) . El valor obtenido con la glucosa 1.9 mM se comparó al valor de la glucosa 30 mM y se calculó la actividad porcentual ((dE/min glucosa 1.9 mM /glucosa 30 mM)*100). Esto da un valor % que es un indicador indirecto del valor KM para la variante analizada. De acuerdo a este cálculo, un valor de % superior indica un valor de KM inferior (= mejor) . Se identificó el siguiente mutante:
Ejemplo 4 Secuenciamiento de gen de s-GDH mutante proveniente de mutagénesis dirigida al sitio El plásmido que contenía el gen para T348G, de s-GDH mutante, cuyo mutante tiene una reactividad cruzada de 25-30% de maltosa/glucosa, se aisló (equipo de aislamiento plásmido muy puro, Roche Diagnostics GmbH, No. 1754785) y se secuenció utilizando un equipo de frecuenciamiento terminador de colorante prismático ABI y secuenciador ABI 3/73 y 3/77
(Amersham Pharmacia Biotech) . Se utilizaron los siguientes cebadores: Hebra en sentido: GDH 1: 5' -TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (=
SEQ ID NO: 5) GDH 2: 5 '-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3' (= SEQ ID NO: 6) Resultado Se logró la mutación deseada sobre el nivel de aminoácido y DNA, dando por resultado cambio de T a G en la posición 348 (enzima madura) . No se encontró mutación adicional sobre el gen. Ejemplo 5 Generación de variantes de inserción con base en T348G mutante Se crearon variantes de inserción mediante el uso del equipo de mutagénesis dirigido al sitio de cambio rápido
(Stratagen, Cat. 200518) . Se designaron los cebadores apropiados para la inserción entre los aminoácidos de las posiciones 428 y 429 (ver secuencia: ID NO: 2) y se efectuó una PCR con un mutante de s-GDH (T348G mutante, ver Ejemplo 4) de acuerdo a la descripción de los fabricantes . Para los cebadores, se sintetizó el codón respectivo en la posición de inserción en forma aleatoria para obtener todos los intercambios posibles de 20 aminoácidos. Estos nucleótidos codón se flanquearon por 11 a 13 nucleótidos en cada extremo . Hebra en sentido: in429X_F : 5 ' -CTGCCGGAAATNNNGTCCAAAAAGATG-3 ' (= SEQ ID NO: 7) Hebra antisentido: in429X_R 5 ' -CATCTTTTTGGACNNNATTTCCGGCAG-3 ' (= SEQ ID NO: 8) } La reacción de PCR y la digestión con Dpnl se realizaron de acuerdo al manual. Después de eso, se utilizó 1 µl de cada reacción para la electroporación de células XLlF-como se describe anteriormente. Después de desarrollo en 1 ml LB a 37°C por una hora, las bacterias se transfirieron a placas de agar con LB-ampicilina (100 µg/ml de ampicilina) y se desarrollaron toda la noche a 37°C. Los clones de s-GDH mutados se sometieron al procedimiento de selección descrito. Para asegurar estadísticamente que se seleccionaron las variantes con las 20 inserciones posibles de aminoácidos, se probaron 200 clones. Los clones con especificidad alterada de sustrato, se sometieron a aislamiento de plásmido y se secuenciaron como se describe anteriormente. Resultados: Tabla 1 :
Ejemplo 6 Generación de inserción adicional de mutantes con gran especificidad de sustrato para glucosa en comparación a maltosa En el documento WO 02/34919 varios intercambios de aminoácidos en diferentes posiciones de s-GDH se identificaron para aumentar la especificidad de sustrato para glucosa, en comparación a por ejemplo, maltosa. Las combinaciones del intercambio de aminoácidos de T348G con sustituciones de aminoácidos en otras posiciones por ejemplo en las posiciones 169, 171, 245, 341 y/o 349 aumentaron la especificidad de sustrato más aún. Dos de los mutantes descritos presentaron especificidades de sustrato para maltosa/glucosa de 3.5 y 7% respectivamente, se seleccionaron para recibir la inserción (en este caso prolina) de acuerdo a la presente invención entre las posiciones 428 y 429. La inserción se logró mediante el uso de los cebadores de la SEQ ID Nos: 9 y 10. SEQ ID NO: 9 insP429_F: 5 ' -GATACTGCCGGAAATCCAGTCCAAAAAG-3 ' SEQ ID NO: 10 insP429_R: 5 ' -CTTTTTGGACTGGTCCTCCGGCAGTATC-3 ' El aislamiento del DNA plásmido de las plantillas, PCR de mutagénesis dirigida al sitio, electroporación, selección, secuenciamiento de DNA de mutantes seleccionados, se dio como se describe anteriormente.
Resultados
Se puede observar claramente a partir de la tabla anterior, que la especificidad de sustrato de maltosa/glucosa cambió dramáticamente. Se descubrió que la conversión de maltosa disminuye desde 105% hasta 2-4% en comparación a la conversión de maltosa/glucosa de s-GDH de tipo silvestre. Los mutantes C/l y D/1 se examinaron con detalle. Ejemplo 7 Purificación y análisis de actividad enzimática para s-GDH de tipo silvestre o variante, respectivamente. Las células desarrolladas (LB-Amp. 37°C) se cosecharon y resuspendieron en amortiguador de fosfato de potasio a pH 7.0. Se realizó la desintegración celular por pase en prensa French (700.900 bar). Después de la centrifugación, el sobrenadante se aplicó a una columna de s-sefarosa (Amersham Biosciences) equilibrada con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM a pH 7.0. Después de lavado, la s-GDH eluyó utilizando un gradiente salino de NaCl 0.1 M. Las fracciones que muestran actividad de s-GDH se combina, se dializan contra amortiguador de fosfato de potasio a pH 7.0 y se someten nuevamente a cromatografía en columna s-sefarosa reequilibrada. Las fracciones activas se combinan y se someten a una filtración en gel utilizando una columna superdex® 200 (Amersham Biosciences) . Las fracciones activas se combinaron y se almacenaron a - 20°C. Ensayo enzimático y determinación de proteínas de s-GDH de tipo silvestre y variante, purificada, respectivamente: Se realizó la determinación de proteínas utilizando el reactivo de ensayo proteico no. 23225 de Pierce (curva de calibración con BSA, 30 minutos 37°C) . Las muestras de GDH se diluyeron a 1 mg de proteína/ml con pirrolo-quinolin-quinona 0.0556 mM (PQQ); Hepes 50 mM; Cacl2 15 mM pH 7.0 y se incubaron a 25°C durante 30 minutos para la reconstitución o activación. Después de activación, las muestras se diluyeron con hepes 50 mM; CaCl2 15 mM pH 7.0 hasta aproximadamente 0,02 U/ml, y se agregaron 50 µl de cada muestra diluida a 1000 µl de una solución amortiguadora de citrato 0.2 M (pH 5.8; a 25°C) que contenía 0.315 mg (4- (dimetilfosfinilmetil) -2-metil-pirazolo- [1.5a] -imidazol-3-il) - (4-nitrosofenil) -amina (ver patente US 5 , 484, 708) /ml como un mediador y azúcar 30 mM. Se monitoreó la extinción a 620 nm durante los primeros 5 minutos a 25°C. Una actividad enzimática unitaria corresponde a la conversión de mediador 1 mMol/minuto bajo las condiciones anteriores de ensayo . Cálculo: Actividad = (volumen total * dE/min [U/ml]) : (e * volumen de muestra * 1) (e = coeficiente de extinción; e62o nm =30[1* mmol"1* cm"1] ) . El ensayo se realizó con glucosa y maltosa (Merck, Alemania) , respectivamente. Resultados :
Es obvio a partir de la tabla anterior, que las variantes nuevas C/l y D/1, que comprenden una inserción entre las posiciones 428 y 429 de s-GDH, representan mejoramientos adicionales con respecto a la reactividad cruzada de maltosa/glucosa. A pesar de las diversas sustituciones de aminoácidos y a pesar de la inserción, la actividad enzimática para glucosa por ml/proteína es aún mayor del 10% de la actividad enzimática de tipo silvestre correspondiente.
Ejemplo 8 Determinación de glucosa en presencia o ausencia de maltosa s-GDH de tipo silvestre y variantes C/l y D/1 de s-GDH, respectivamente, se pueden aplicar para la determinación de glucosa en presencia o ausencia de maltosa. La muestra de referencia contiene 50 mg de glucosa/dl. La muestra de "prueba" contiene 50 mg de glucosa/dl y 100 ó 200 mg/dl de maltosa, respectivamente. Se utilizan las mismas cantidades de actividad de GDH (U/ml; ver ensayo enzimático anterior) para cada ensayo. En una probeta se mezclan: 1 ml 0.315 mg de (4- (dimetilfosfinilmetil) -2-metil-pirazolo- [1.5a] -imidazol-3-il) - (4-nitrosofenil) -amina ml/citrato 0.2 M, pH 5.8 0.033 ml de muestra de referencia o de prueba. El ensayo se inicia agregando 0.050 ml de s-GDH (que es un exceso de s-GDH para conversión de glucosa) a la probeta. Se monitorea el cambio de absorción en 620 nm. Después de 2-5 minutos, se observan valores constantes y se calcula el valor de dE/5 minutos. El valor obtenido midiendo la muestra de referencia con s-GDH de tipo silvestre se ajusta al 100%. Los otros valores se comparan con este valor de referencia y se calculan en %. Resultados: Se detecta claramente interferencia con menos maltosa en las muestras de prueba, cuando se utilizan las nuevas variantes. Es obvio que la concentración de s-GDH con el fin de discriminar de mejor manera la glucosa de la maltosa en una muestra, se puede optimizar adicionalmente. Demasiada enzima podría incrementar la conversión de maltosa, muy poca enzima no convertiría toda la glucosa y por consiguiente no se alcanzaría el punto final de la absorción. Lista de referencias Anthony, C, Biochem. J. 320 (1996) 697-711 Anthony, C, and Ghosh, M. , Current Science 72 (1997)716-727
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