CN1989241A - 包含氨基酸插入的遗传改造的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可溶性吡咯并喹啉醌(PQQ)－依赖性葡萄糖脱氢酶的改良变体，该变体包含在对应于从醋酸钙不动杆菌中获知的氨基酸序列的位点428和429之间的氨基酸插入，本发明涉及编码这样的变体s－GDH的基因，涉及具有提高的对葡萄糖的底物特异性的这样的s－GDH变体蛋白，并涉及这些s－GDH变体的不同应用，特别是用于测定样品中的糖尤其是葡萄糖的浓度。

Description

包含氨基酸插入的遗传改造的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶
本发明涉及可溶吡咯并喹啉醌(PPQ)依赖性葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的改良变体，该变体包含了在对应于从醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)获知的氨基酸序列的位点428和429之间的氨基酸插入，本发明涉及编码这样的变体s-GDH的基因，涉及对葡萄糖具有改进的底物特异性的这样的s-GDH变体的蛋白，并涉及这些s-GDH变体的不同应用，特别是用于测定样品中的糖尤其是葡萄糖的浓度。
技术领域
血液葡萄糖浓度的测定在糖尿病的临床诊断和管理中是极其重要的。全世界大约有1亿5千万人患有慢性疾病糖尿病，据WHO分析，该数字在2025年可能翻番。尽管糖尿病易于诊断和治疗，成功的长期管理需要快速且准确地报告血液葡萄糖浓度的低成本诊断工具。PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.17)催化下述反应，在该反应中，葡萄糖被氧化成葡糖酸内酯。因此，这类酶被用于测量血糖。一种这样的工具是基于可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GlucDOR，EC1.1.99.17)的诊断条，该酶是最初从醋酸钙不动杆菌中获得的含有吡咯并喹啉醌的酶。
醌蛋白使用醌作为辅助因子将醇、胺和醛糖氧化成相应的内酯、醛和醛糖酸(Duine，J.A.Energy generation and the glucosedehydrogenase pathway in Acinetobacter在“The Biology ofAcinetobacter”(1991)一书295-312，New York，Plenum Press；Duine，J.A.，Eur J Biochem 200(1991)271-284；Davidson，V.L.，在“Principlesand applications of quinoproteins”(1993)整本书中，New York，MareelDekker；Anthony，C.，Biochem.J.320(1996)697-711；Anthony，C.和Ghosh，M.，Current Science 72(1997)716-727；Anthony，C.，Biochem.Soc.Trans.26(1998)413-417；Anthony，C.和Ghosh，M.，Prog.Biophys.Mol.Biol.69(1998)1-21)。在这些醌蛋白中，那些包含了非共价结合的辅助因子2，7，9-三羧基-1H-吡咯并[2，3-f]喹啉-4，5-二酮(PQQ)的醌蛋白组成了最大的亚组(Duine 1991，同上)。至今已知的所有细菌醌葡萄糖脱氢酶属于具有PQQ作为辅助因子的该亚组(Anthony和Ghosh1997，同上，Goodwin，P.M.和Anthony，C.，Adv.Microbiol.Physiol.40(1998)1-80；Anthony，C.，Adv.in Phot.and Resp.15(2004)203-225)。
在细菌中已表征了两类PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.17)：一类是膜结合的(m-GDH)，另一类是可溶的(s-GDH)。两类没有显著的序列同源性(Cleton-Jansen，A.M.，等，Mol.Gen.Genet.217(1989)430-436；Cleton-Jansen，A.M.，等，Antonie VanLeeuwenhoek 56(1989)73-79；Oubrie，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96(1999)11787-11791)。它们在动力学以及它们的免疫学性质方面也是不同的(Matsushita，K.，等，Bioscience Biotechnol.&Biochem.59(1995)1548-1555)。m-GDH广泛分布于革兰氏阴性细菌中，而s-GDH仅在不动杆菌菌株例如醋酸钙不动杆菌(Duine，J.A.，1991a；Cleton-Jansen，A.M.等，J.Bacteriol.170(1988)2121-2125；Matsushita和Adachi，1993)和鲍曼不动杆菌(A.baumannii)(JP11243949)的周质间隙中被发现。
通过检索序列数据库，已经在大肠杆菌(E.coli)K-12和集胞藻(Synechocystis sp.)中鉴定出了与全长醋酸钙不动杆菌s-GDH同源的两条序列。此外，也在绿脓杆菌(P.aeruginosa)和百日咳杆菌(Bordetellapertussis)(Oubrie等，1999 a，b，c)以及中间肠杆菌(Enterobacterintermedium)(Kim，C.H.等，Current Microbiol.47(2003)457-461)的基因组中分别发现了与醋酸钙不动杆菌s-GDH同源的两条不完全的序列。由这四个未被表征的蛋白推断出的氨基酸序列与醋酸钙不动杆菌s-GDH非常相近，在推定的活性位点中，很多残基是绝对保守的。这些同源蛋白很可能具有相似的结构且催化相似的PQQ-依赖性反应(Oubrie等，1999 a，b，c；Oubrie A.，Biochim.Biophys.Acta 1647(2003)143-151；Reddy，S.，和Bruice，T.C.，J.Am.Chem.Soc.126(2004)2431-2438；Yamada，M.等，Biochim.Biophys.Aeta 1647(2003)185-192)。
已经发现细菌s-GDHs和m-GDHs具有相当不同的序列和不同的底物特异性。例如，醋酸钙不动杆菌包含两种不同的PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶，一种是在体内有活性的m-GDH，另一种被命名为s-GDH，该酶仅可以显示体外活性。Cleton-Jansen等，1988；1989 a，b克隆了编码两种GDH酶的基因且测定了这两个GDH基因的DNA序列。在m-GDH和s-GDH之间没有明显的同源性，确认了m-GDH和s-GDH代表了两个完全不同的分子的事实(Laurinavicius，V.，等，Biologija(2003)31-34)。醋酸钙不动杆菌的s-GDH基因已被克隆进大肠杆菌。在细胞中产生之后，s-GDH被转运通过胞质膜进入周质间隙(Duine，J.A.，Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway inAcinetobacter在“The Biology of Acinetobacter”(1991)一书295-312，New York，Plenum Press；Matsushita，K.和Adachi，O.，Bacterialquinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase在“Principles and applications of Quinoproteins”(1993)一书47-63，NewYork，Marcel Dekker)。和来自醋酸钙不动杆菌的天然s-GDH一样，在大肠杆菌中表达的重组s-GDH是同二聚体，每个单体具有1个PQQ分子和三个钙离子(Dokter，P.等，Biochem.J.239(1986)163-167；Dokter，P.等，FEMS Microbiol.Lett.43(1987)195-200；Dokter，P.等，Biochem.J.254(1988)131-138；Olsthoorn，A.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Oubrie，A.，等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333，Oubrie，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96(1999)11787-11791，Oubrie，A.，等，Embo J.18(1999)5187-5194)。s-GDH将广泛的单糖和二糖氧化成相应的酮，该酮进一步水解成醛糖酸，且s-GDH也能够为PMS(吩嗪metosulfate)、DCPIP(2，6-二氯酚靛酚)、WB(Wurster氏蓝)和短链泛醌例如泛醌Q1和泛醌Q2(Matsushita，K.，等，Biochem.28(1989)6276-6280；Matsushita，K.，等，Antonie VanLeeuwenhoek 56(1989)63-72)、一些人造电子受体例如N-甲基吩嗪甲硫酸盐(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Biochem.37(1998)13854-13861)以及导电聚合物(Ye，L.，等，Anal.Chem.65(1993)238-241)提供电子。考虑到s-GDH对葡萄糖的高度特异活性(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，(1996)同上)以及对广泛的人造电子受体的特异性，该酶非常适合于分析应用，特别是在诊断应用中用于测定葡萄糖的(生物)感应器或测试条中(Kaufmann，N.等，Development and evaluation of anew system for determining glucose from fresh capillary blood andheparinised blood在“Glucotrend”(1997)一书1-16，BoehringerMannheim GmbH；Malinauskas，A.；等，Sensors and Actuators，B：Chemical B100(2004)395-402)。
葡萄糖氧化可被至少三组相当不同的酶催化，即由NAD/P-依赖性葡萄糖脱氢酶、由黄素蛋白葡萄糖氧化酶或由醌蛋白GDHs催化(Duine，J.A.，Biosens.Bioelectronics 10(1995)17-23)。已经观察到被还原的s-GDH相当慢的自氧化，证明氧是s-GDH的非常弱的电子受体(Olsthoorn和Duine，1996)。s-GDH可以高效地将被还原的醌上的电子提供给介体(mediator)例如PMS、DCPIP、WB和短链泛醌例如Q1和Q2，但它不能高效地将电子直接提供给氧。
监测例如来自糖尿病患者的血液、血清和尿液中的葡萄糖水平的传统测试条和感应器使用葡萄糖氧化酶。该酶的性能依赖于氧浓度。在不同海拔在空气具有不同氧浓度的情况下的葡萄糖测量可能产生错误的结果。PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的主要优势在于其不依赖于氧。该重要特征在例如US6,103,509中被讨论，其中，膜结合GDH的一些特征已被研究。
对本领域的重要贡献是将s-GDH和合适的介体一同使用。基于s-GDH的实验方法和测试条装置在US5,484,708中详细公开。该专利也包含了用于葡萄糖测量的实验设置和基于s-GDH的测试条的生产的具体信息。在该专利以及所引用文献中说明的方法在此通过参考并入本文。
涉及本领域以及包含关于具有葡萄糖脱氢酶活性的酶的各种应用模式的具体信息的其它专利或申请是US5,997,817；US6,057,120；EP0620283；和JP11-243949-A。
利用s-GDH和指示剂的商业系统是由Roche Diagnostics GmbH分销的Glucotrend系统，该指示剂在反应发生时产生颜色变化(Kaufmann等，1997同上)。
除了以上讨论的使用PQQ-依赖性s-GDH的益处之外，在葡萄糖的测定中也必须考虑一个不足。该酶与m-GDH相比具有相对广的底物谱。也就是说，s-GDH不仅氧化葡萄糖也氧化一些其它的糖包括麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖(Dokter等，1986a；OubrieA.，Biochim.Biophys.Acta 1647(2003)143-151)。对除了葡萄糖以外的其它糖的反应活性在某些情况下可能破坏测定血液葡萄糖水平的准确性。特别是对腹膜透析患者，使用糊精(葡萄糖多聚体)的治疗可使他们的体液例如血液中包含高水平的其它糖，特别是麦芽糖(Wens，R.，等，Perit.Dial.Int.18(1998)603-609)。
因此，临床样品例如从糖尿病患者尤其是具有肾脏并发症的患者和特别是在进行透析的患者中获得的样品可能包含显著水平的其它糖，尤其是麦芽糖。对从这些严重患者获取的样品进行的葡萄糖测定可能受到麦芽糖的破坏(Davies，D.，Perit.Dial.Int.14(1994)45-50；Frampton，J.E.；和Plosker，G.L.，Drugs 63(2003)2079-2105)。
在文献中很少有关于尝试制备具有改变的底物特异性的经修饰的PQQ-依赖性s-GDH的报道。Igarashi，S.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.264(1999)820-824报道了在位点Glu277引入点突变生成具有改变的底物特异性特征的突变体。
Sode，EP 1 176 202报道了在s-GDH内的某些氨基酸取代产生了对葡萄糖具有提高的亲和力的突变体s-GDH。在EP1167519中，相同的作者报道了具有改进的稳定性的突变体s-GDH。此外，相同的作者在JP2004173538中报道了对葡萄糖具有提高的亲和力的其它s-GDH突变体。
Kratzsch，P.等，WO02/34919报道了s-GDH对葡萄糖相比于其它糖底物特别是相比于麦芽糖的特异性可以通过在s-GDH的某些位点的氨基酸取代得以提高。
Takeshima，S.，等(EP1367120)报道了突变的s-GDH，该s-GDH包含了某些氨基酸取代或在对应于从醋酸钙不动杆菌获知的氨基酸序列的位点427和428之间的氨基酸插入。
然而，尽管用以产生具有进一步改良性质的s-GDH突变体或变体的相当一些改进已被报道，其它的和/或另外的改进仍然是需要的。
因此存在对s-GDH的另外的突变体或变体形式的巨大要求和临床需要，该突变体或变体形式单独地或与已知的突变组合带来对作为底物的葡萄糖的提高的特异性。
本发明的任务是提供s-GDH的新的突变体或变体，其单独地或与已知的突变组合产生：较之其它选定的糖分子例如半乳糖或麦芽糖而言对葡萄糖显著提高的底物特异性。
令人吃惊的是，已经发现通过在对应于从醋酸钙不动杆菌获知的氨基酸序列的s-GDH的位点428和429之间进行氨基酸插入，可能显著提高s-GDH对葡萄糖较之其它糖的底物特异性，且因此至少部分地克服了本领域已知的上述问题。
通过提供根据本发明和如在此以下所述以及所附权利要求书中的s-GDH的插入变体，较之其它选定的糖分子而言对葡萄糖的底物特异性已被显著提高。
由于新形式的s-GDH提高的底物特异性，在各种应用领域中对葡萄糖测定的显著的技术进步成为可能。改良的s-GDH变体可被用于对生物样品中葡萄糖的特异性进行检测或测量，特别是在测试条装置或生物感应器中进行，这具有极大的优势。
发明内容
本发明涉及可溶形式的EC 1.1.99.17(也被称作PQQ-依赖性可溶葡萄糖脱氢酶(s-GDH))的变体，所述变体包含在对应于从醋酸钙不动杆菌中获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点428和429的氨基酸位点之间的至少一个氨基酸残基的插入，且可选地，还包含一或多个氨基酸取代，优选地在位点348和428的取代。
本发明还提供了呈现出改良性质特别是提高的葡萄糖特异性的s-GDH优选变体，以及编码这些变体的多核苷酸序列，包含这样的多核苷酸序列的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明进一步涉及本发明的变体在葡萄糖的测量方法中的应用，特别是通过测试条装置或生物感应器进行的测量。
提供以下的实施例、参考文献、序列表以及附图来帮助理解本发明，本发明的真正范围示于所附的权利要求中。应当理解的是在不背离本发明的精神的情况下可以对提供的流程进行修改。
附图说明
图1：根据序列同源性比对的醋酸钙不动杆菌PQQ-依赖性s-GDH(上)和鲍曼不动杆菌s-GDH(下)的蛋白质序列。
图2：实施例1中提及的pACSGDH载体的示意图，该载体分别包含可溶性PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型或突变的DNA序列。
图3：实施例1中提及的pACSGDH载体的核苷酸(DNA)序列，该序列包含可溶性PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型DNA序列。
具体实施方式
如上所述，具有葡萄糖脱氢酶活性的两种完全不同类型的醌蛋白酶(膜结合的和可溶的)被一同分在EC1.1.99.17组下。这两种类型似乎彼此并不相关。
就本发明的目的而言，仅可溶形式的GDH(s-GDH)是相关的，下文中对其改进的变体进行讨论。
在第一具体实施方式中，本发明涉及EC1.1.99.17的可溶形式，其也被称作PQQ-依赖性可溶葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的变体，所述变体包含在对应于从醋酸钙不动杆菌中获知的s-GDH野生型序列(SEQ IDNO：2)的位点428和429的氨基酸位点之间的至少一个氨基酸残基的插入，以及可选地还包含一或多个氨基酸取代。
优选地，仅一个氨基酸被插入下述氨基酸位点之间，所述氨基酸位点对应于从醋酸钙不动杆菌中获知的s-GDH野生型序列(SEQ IDNO：2)的位点428和429。
进一步优选的是，s-GDH变体包含位于下述氨基酸位点之间的氨基酸的插入，所述氨基酸位点对应于从醋酸钙不动杆菌中获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点428和429，该s-GDH的特征在于所述的插入的氨基酸选自亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。插入的氨基酸优选是脯氨酸。
本领域已知可以从不动杆菌菌株中分离出可溶PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型DNA-序列。最优选的是从醋酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41中进行分离。在SEQ ID NO：2中提供了该野生型s-GDH(成熟蛋白)的序列。不动杆菌的其它LMD菌株也可被用作野生型s-GDH的来源。可将这些序列与从醋酸钙不动杆菌中获得的序列进行比对，且对序列进行比较。筛选其它细菌菌株的DNA文库例如针对大肠杆菌K-12描述的DNA文库(Oubrie，A.，等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333)，并鉴定出这样的基因组中与s-GDH相关的序列看起来也是可行的。这样的序列和还没有被鉴定出的同源序列可被用于生成具有提高的底物特异性的s-GDH变体。
就本发明而言，术语“变体”涉及下述s-GDH蛋白，该蛋白与相应的野生型序列相比在下述氨基酸位点之间具有氨基酸的插入，所述氨基酸位点对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQID NO：2)的位点428和429。
就本发明而言，术语“突变体”涉及下述s-GDH蛋白，当与从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)相比时，该蛋白与相应野生型序列相比具有至少一个氨基酸取代。
因此术语“变体”或“突变体”均可相互用于下述s-GDH蛋白，该蛋白相比于相应的野生型序列在下述氨基酸位点之间具有氨基酸的插入，这些位点对应于从醋酸钙不动杆菌中获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点428和429，且该蛋白还具有至少一个的氨基酸取代。
在另一种优选的具体实施方式中，将改良的s-GDH变体的酶性质或功能性质分别与野生型酶或在位点428和429之间没有氨基酸插入的突变体进行比较。
根据本发明的优选变体其特征在于相对于相应的野生型酶，该变体具有较之至少一种其它的选定的糖底物而言提高了2倍的对葡萄糖的底物特异性。
为了计算底物特异性或交叉反应性，一种简单的方法是将把葡萄糖作为底物测量的活性设定为100％，且将用其它选定的糖测量出的活性与葡萄糖的值进行比较。有时，为了避免重复，简单使用术语特异性，而并不特别提到一方面是葡萄糖另一方面是选定的其它糖底物。
本领域的专家将认同，对酶活性的比较最好使用充分确定的实验条件在待研究底物分子的等摩尔浓度下进行。否则必须进行浓度差异的校正。
为了评价底物特异性(的改进)必须选择标准化的和充分确定的实验条件。如实施例7中所述，对s-GDH对葡萄糖作为底物以及其它选定的糖底物的酶活性进行了测量。
根据针对葡萄糖或选定的不同的糖(优选麦芽糖)的酶活性的这些测量，评价交叉反应性(及对其的改进)。
s-GDH对选定糖的(交叉)反应性的百分比被计算作
交叉反应性[％]＝(选定糖的活性/葡萄糖的活性)×100％。
根据以上公式，野生型s-GDH对麦芽糖的(交叉)反应性被确定为大约105％。野生型s-GDH对半乳糖的(交叉)反应性被测量为大约50％(比较，表1)。
根据以下公式计算(改进的)特异性：
特异性(改进)＝(葡萄糖突变体活性/葡萄糖野生型活性)×(选定糖野生型活性/选定糖突变体活性)
在与野生型酶比较时，因此，对葡萄糖的特异性比对麦芽糖(麦芽糖/葡萄糖)的特异性有至少10倍提高的s-GDH形式，用麦芽糖作为底物时具有用葡萄糖作为底物测量的活性的最多10.5％。或者，如果例如突变体s-GDH对麦芽糖的交叉反应性为20％(如上所述进行确定和计算)，因此该突变体与野生型s-GDH相比具有5.25倍提高的底物特异性(麦芽糖/葡萄糖)。
术语对底物的“比活性(specific activity)”是本领域公知的，其优选被用于描述每一定量的蛋白质的酶活性。本领域已知多种方法使用葡萄糖或其它糖作为底物来测定GDH分子的比活性(Igarashi，S.，等，(1999)同上)。可用于这些测量的一种方法在实施例部分详细描述。
尽管选择很多不同的糖分子并与任何这些选定的糖分子进行比较从而研究s-GDH的葡萄糖特异性是可能的，优选地选择临床相关的糖分子用于这样的比较。优选选定的糖选自甘露糖、阿洛糖、半乳糖、木糖和麦芽糖。优选地，麦芽糖或半乳糖被选定且测试突变体s-GDH对葡萄糖较之对半乳糖或麦芽糖的提高的底物特异性。在更优选的具体实施方式中，选定的糖是麦芽糖。
已经发现，本发明的s-GDH变体对葡萄糖特异性的提高例如麦芽糖/葡萄糖是相当可观的。因此更优选地，对葡萄糖的所述底物特异性与对至少一种选定的其它糖底物的底物特异性相比提高了至少3倍。其它优选具体实施方式包含具有提高的葡萄糖底物特异性的s-GDH突变体，该底物特异性与其它选定的糖分子相比至少高5倍或同样优选地至少高10倍。
s-GDH的突变很多情况下产生对底物葡萄糖的比活性急剧降低的酶变体。但是，对底物葡萄糖的(绝对的或总体的)比活性多于10倍的降低可能对常规应用是关键的。因此，优选的是，具有对底物葡萄糖提高的特异性的s-GDH呈现出用野生型酶测量的葡萄糖比活性的至少10％。当然，更优选的是，这些突变的酶呈现了野生型s-GDH相应葡萄糖活性的至少20％或更优选的至少30％。
进一步优选的是这样的突变体，这些突变体的麦芽糖比活性是测试条上或液体测试中测量的相应野生型酶的麦芽糖比活性的10％或更少或甚至仅有5％或更少，而其葡萄糖的比活性与相应野生型酶的葡萄糖比活性相比≥10％。
已经发现，通过进一步修饰这样的变体使其在某些充分确定的氨基酸位点额外包含一或多个氨基酸取代，从而进一步提高在位点428和429之间包含插入的s-GDH变体的底物特异性是可能的。
通过参照从SEQ ID NO：2获知的氨基酸位点，对本发明的成果进行详细说明，SEQ ID NO：2是从醋酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41中分离的s-GDH的野生型序列。通过恰当的序列比较，可以容易地鉴定出对应于SEQ ID NO：2的位点的不同s-GDH分离物的氨基酸位点。
s-GDH序列和SEQ ID NO：2的野生型序列的多重比对和比较使用GCG Package 10.2版的PileUp程序(Genetics Computer Group公司)进行。PileUp创造了多序列比对，该比对使用Feng，D.F.和Doolittle，R.F.，J.Mol.Evol.25(1987)351-360的渐进比对法的简化，并且相同、相似或不同氨基酸残基的积分矩阵被相应地确定。该方法首先进行两个最接近序列的成对比对，产生两个比对序列的簇(cluster)。随后可将该簇与下一个最相关的序列或比对序列的簇进行比对。通过两个独立序列的成对比对的简单延伸可以对两个序列簇进行比对。通过一系列的渐进成对比对实现最终的比对，渐进成对比对包括逐渐不相似的序列和群，直至所有的序列已被包含在最终的成对比对中。通过该方法，其它同源s-GDH分子中分别对应于醋酸钙不动杆菌s-GDH的SEQ IDNO：1和2中的位点可轻易鉴定。这就是为何在此提供的氨基酸位点应被理解为SEQ ID：2中的氨基酸位点或在其它同源s-GDH分子中对应的位点的原因。
已经发现包含了在对应于s-GDH的位点348的位点的氨基酸取代以及在位点428和429之间具有氨基酸插入的s-GDH突变体就对于葡萄糖的特异性而言呈现了突出的正面效应。如表1中所证实，已经识别和生成了具有提高的葡萄糖特异性的各种s-GDH变体。如果位点苏氨酸348的氨基酸被合适的其它氨基酸取代且合适的氨基酸被插入位点428和429之间，可以观察到变体s-GDH的葡萄糖特异性的提高。因此本发明的一种非常优选的具体实施方式涉及下述PQQ-依赖性s-GDH变体蛋白，该蛋白包含在从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的氨基酸428和429之间的插入，并还包含对应于位点348的氨基酸位点的氨基酸残基取代。
还已经发现，为了进一步提高包含了氨基酸428和429之间的插入和位点348的氨基酸残基取代的s-GDH变体对葡萄糖的特异性，在对应于SEQ ID NO：2的位点169、171、245、341、349和/或428的氨基酸位点的进一步的氨基酸取代是有利的。
从醋酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41分离出的s-GDH的位点348的苏氨酸残基或在位点428和429之间的氨基酸插入对s-GDH的底物结合的作用均非本领域已知(Oubrie，A.，等，Embo J.18(1999)5187-5194；Oubrie，A.和Dijkstra，B.W.，Protein Sci.9(2000)1265-1273)。为何特别是s-GDH的这两个改良提高了对葡萄糖较之对其它感兴趣的糖分子(特别是较之麦芽糖)的底物特异性，目前没有化学或物理解释。
在另一种优选的具体实施方式中，变体s-GDH的特征在于在位点348的氨基酸残基苏氨酸被选自以下的氨基酸残基取代：丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。在一种更优选的具体实施方式中，甘氨酸被用于取代位点348的苏氨酸。术语T348G是技术人员已知的，其表示在位点348的苏氨酸被甘氨酸置换。
另一优选具体实施方式是可溶形式的EC1.1.99.17也被称作PQQ-依赖性可溶葡萄糖脱氢酶的变体，所述变体包含在对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点428和429的氨基酸位点之间的至少一个氨基酸残基的插入以及在对应于位点428的氨基酸位点的至少一个氨基酸残基取代。优选地，在位点428的天冬酰胺由亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸取代。更优选地，在位点428的取代由脯氨酸实现。
本发明的一组优选的s-GDH变体包含在位点348的氨基酸残基的取代和/或在位点428的氨基酸取代，和在位点428和429之间的氨基酸插入。可选地，这些变体可被进一步修饰，以包含在对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点169、171、245、341和/或349的氨基酸位点的一或多个氨基酸取代。
如果在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点169的氨基酸被取代，优选地，天然存在的氨基酸亮氨酸由苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代。更优选地，位点169的取代由苯丙氨酸实现。
如果在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点171的氨基酸被取代，优选地，天然存在的氨基酸酪氨酸由选自以下的氨基酸取代：丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸。更优选地，位点171的取代由甘氨酸实现。
如果在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点245的氨基酸被取代，优选地，天然存在的氨基酸谷氨酸由天冬氨酸、精氨酸或谷氨酰胺取代。更优选地，位点245的取代由天冬氨酸实现。
如果在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点341的氨基酸被取代，优选地，天然存在的氨基酸甲硫氨酸由缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代。更优选地，位点341的取代由缬氨酸实现。
如果在本发明的变体中对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点349的氨基酸被取代，优选地，天然存在的氨基酸缬氨酸由丙氨酸、甘氨酸取代。更优选地，位点349的取代由丙氨酸实现。
如在WO02/34919中所述，在对应于从醋酸钙不动杆菌中分离出的野生型序列的s-GDH序列的位点348的氨基酸取代可被用于显著地提高s-GDH的葡萄糖特异性。技术人员将在WO02/34919中发现其它合适的位点，这些位点可被取代并与根据本发明的插入组合。
在另一种优选的具体实施方式中，除了在氨基酸残基428和429之间的插入外，本发明的s-GDH变体包含至少两个选自以下位点的氨基酸取代：对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQID NO：2)的氨基酸位点的位点171、245、341、348和349。
在还一种优选的具体实施方式中，除了在氨基酸残基428和429之间的插入外，本发明的s-GDH变体包含至少三个选自以下位点的氨基酸取代：对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQID NO：2)的氨基酸位点的位点171、245、341、348和349。
如同技术人员将认同的，进行不以显著程度影响s-GDH性质的氨基酸取代例如沉默突变是可能的。然而本发明的变体和SEQ ID NO：2相比具有不多于45个氨基酸的交换。优选地，变体将包含20个或更少的氨基酸取代，更优选地，将仅存在10个氨基酸取代或更少的取代。
在实施例部分给出本发明的s-GDH变体。这些变体也代表了本发明的优选具体实施方式。至今发现的具有最小的葡萄糖干扰的变体包含在氨基酸428和429之间的插入，优选地由脯氨酸实现，且分别包含突变Y171G、E245D、M341V和T348G或突变L169F、Y171G、E245D、M341V、T348G。这两个变体也是本发明的其它优选的具体实施方式。
氨基酸序列分析揭示在一方面来自醋酸钙不动杆菌和另一方面来自鲍曼不动杆菌的野生型s-GDH中发现的序列基元(motives)似乎在与本发明识别的与提高葡萄糖特异性主要相关的位点附近非常保守，所述位点即对应于来自醋酸钙不动杆菌的野生型s-GDH的位点428和429附近的插入位点。
包含氨基酸序列AGNXaaVQK(SEQ ID NO：2)的PQQ-依赖性s-GDH的变体代表了本发明的优选具体实施方式。SEQ ID NO：2对应于醋酸钙不动杆菌野生型s-GDH的位点426-431或鲍曼不动杆菌野生型s-GDH的位点427-432，但分别包含了在位点428和429(醋酸钙不动杆菌)或429和430(鲍曼不动杆菌)之间的一个氨基酸(Xaa)插入。
在一种优选具体实施方式中，本发明涉及包含了序列G-N-Xaa-V-Q-K-D(SEQ ID NO：11)的变体s-GDH。优选地，包含了SEQ ID NO：11的s-GDH变体的进一步的特征在于所述插入的氨基酸Xaa选自以下氨基酸：亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，更优选地，Xaa是脯氨酸残基。
如以上进一步解释的，可以对野生型s-GDH的位点428的氨基酸天冬酰胺进行氨基酸取代。在这种情况下，SEQ ID NO：11将包含被取代的氨基酸而非P428。
本领域已知产生突变体蛋白的大量可能性。基于本发明公开了位点428和429之间的氨基酸插入的关键重要性的重要发现，技术人员现在可以容易地进一步生成s-GDH的合适变体。例如这些变体可以通过被称作随机突变(Leung，D.W.，等，Technique 1(1989)11-15)和/或定点突变(Hill，D.E.，等，Methods Enzymol.155(1987)558-568)的方法获得。生成具有理想性质的蛋白的其它方法是提供嵌合构建体，该构建体包含来自至少2个不同来源的序列元件，或完全合成合适的s-GDH基因。本领域的此类已知方法可与本发明公开的信息组合使用以提供s-GDH的突变体或变体，该突变体或变体包含例如其它的氨基酸取代以及公开的SEQ ID NO：2的位点428和429之间的插入。
本发明的s-GDH变体可通过例如以从醋酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41分离的s-GDH基因作为起始以及以同源序列作为起始进行制备。在该申请的上下文中，术语“同源的”指包含与SEQ ID NO：2相比具有至少90％一致性的s-GDH氨基酸序列。换句话说，在使用PileUp程序合适比对后，这样的同源s-GDH的至少90％的氨基酸与在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸相同。
人们将理解DNA和氨基酸序列的变化天然存在，或可使用本领域已知方法有意引入。由于与SEQ ID NO：2相比所述序列中的一或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入、倒置或添加，这些变化可造成在整个序列中多达10％的氨基酸差异。这些氨基酸取代可以例如以涉及的残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性为基础进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似的亲水性数值的具有不带电荷的极性头部基团或非极性头部基团的氨基酸包括以下：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。其它涵盖的变化包括此前所述的多肽的盐和酯，以及此前所述的多肽的前体，例如具有N-末端取代的前体，如甲硫氨酸、N-甲酰甲硫氨酸被用作引导序列。这些变化可在不必背离本发明的范围和精神的情况下进行。
根据本领域目前已知的方法或根据在实施例部分中给出的方法，获得编码以上讨论的任何s-GDH突变体的多核苷酸序列是可能的。本发明因此也包含编码如上所述s-GDH蛋白质的分离的多核苷酸序列。
本发明进一步包括包含本发明核酸序列的表达载体，该序列可操作地连接能够在宿主细胞内引导序列表达的启动子序列。
本发明进一步包括包含本发明核酸序列的表达载体，该序列可操作地连接能够在宿主细胞内引导序列表达的启动子序列。优选的载体是质粒，如在图2和3中显示的pACSGDH。
用于本发明的表达载体典型包含了复制起点、用于选择的抗生素抗性、表达启动子和s-GDH基因变体的全部或部分。表达载体也可包括本领域已知的其它DNA序列，例如信号序列(为了更好的折叠、转运至周质或分泌)、为了更好地调节表达的诱导子、或用于克隆的切割位点。
选定的表达载体的特征必须与将被使用的宿主细胞相容。例如，当在大肠杆菌细胞系统中克隆时，表达载体应当包括从大肠杆菌细胞基因组中分离出的启动子(例如lac或trp)。可以使用合适的复制起点如ColE1质粒复制起点。合适的启动子包括例如lac和trp。同样优选地，表达载体包括了编码选择标记的序列如抗生素抗性基因。作为选择性标记，氨苄青霉素抗性或卡那霉素抗性可方便地使用。所有的这些材料是本领域已知的且是商业上可获得的。
含有理想的编码和控制序列的合适的表达载体可以使用本领域已知的标准重组DNA技术构建，在Sambrook等，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”(1989)Cold Spring Harbor，NY，Cold SpringHarbour Laboratory Press一书中描述了多种此类技术。
本发明还涉及含有下述表达载体的宿主细胞，所述载体包含编码突变体s-GDH的全部或部分的DNA序列。该宿主细胞优选地含有下述表达载体，该载体包含了实施例2-8中显示的具有一或多个突变的一DNA序列的全部或部分。合适的宿主细胞包括例如可从Pomega(2800Woods Hollow Road，Madison，WI，美国)获得的大肠杆菌HB101(ATCC33694)，可从Stratagene(11011 North Torrey Pine Road，La Jolla，CA，美国)获得的XL1-Blue MRF’。
表达载体可通过本领域已知的各种方法被引入宿主细胞。例如，表达载体对宿主细胞的转化可通过聚乙二醇介导的原生质转化法(Sambrook等，1989，同上)进行。但是，将表达载体引入宿主细胞的其它方法例如电穿孔法、基因枪注射或原生质融合也可使用。
一旦包含了s-GDH的表达载体已被引入合适的宿主细胞，可在允许理想的s-GDH变体表达的条件下培养宿主细胞。通过例如抗生素选择，含有理想的表达载体的宿主细胞可被轻易鉴定出，该表达载体具有编码突变体s-GDH的全部或部分的DNA序列。s-GDH变体的表达可通过不同的方法鉴别，例如测量s-GDH mRNA转录子的产生、免疫检测基因产物或检测基因产物的酶活性。优选地，使用酶实验。
本发明还教导了s-GDH变体的产生和筛选。如本领域所知进行随机突变和饱和突变。针对对葡萄糖的底物特异性(对葡萄糖相比于麦芽糖的活性)和KM值对变体进行筛选。调节选择的实验条件以确保例如通过单个氨基酸取代带来的预期的小的增强可被测量。实施例3中给出了选择或筛选合适突变体的一种模式。采用这种方法，较之野生型酶的任何变化或改进可被清楚地检测到。
当然，应当理解不是所有的表达载体和DNA调节序列将同样好地行使功能以表达本发明的DNA序列。也不是所有的宿主细胞对相同的表达系统同样好地行使功能。但是，本领域的普通技术人员使用在此提供的指导，在无不当实验的情况下将可对表达载体、DNA调节序列和宿主细胞作出合适的选择。
本发明还涉及生产当前发明的s-GDH变体的方法，该方法包括在适于本发明的突变体s-GDH产生的条件下培养本发明的宿主细胞。对于细菌宿主细胞而言，典型的培养条件是含有碳和氮源、合适的抗生素和诱导试剂(根据所使用的表达载体)的液体培养基。典型的合适的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素等。典型的诱导试剂包括IPTG、葡萄糖、乳糖等。
优选地，通过在表达编码突变体s-GDH的DNA序列的宿主细胞中进行生产来获得本发明的多肽。也可以通过由编码突变体s-GDH的DNA序列编码的mRNA的体外翻译获得本发明的多肽。例如，DNA序列可如上所述被合成并被插入合适的表达载体中，该载体随后可被用于体外转录/翻译系统。
包含如上定义和说明的分离的多核苷酸的表达载体代表了本发明的另一优选具体实施方式，该多核苷酸与能够促进其在无细胞的肽合成系统中的表达的启动子序列可操作地连接。
随后可使用各种常规的蛋白纯化技术，对例如通过以上说明的步骤产生的多肽进行分离纯化。例如，层析步骤如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析可被使用。
本发明的改良的s-GDH变体的主要应用之一是用于测试条以监测糖尿病患者的血液葡萄糖水平。如以上讨论的，PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶对氧的不敏感性是其相比葡萄糖氧化酶的巨大优势。更重要地，由于s-GDH变体具有对葡萄糖的提高的特异性和对其它糖显著降低的酶活性，可能存在于待分析样品中的麦芽糖、半乳糖和/或其它相关糖引起的干扰被显著减少。当然可以研究很多类型的样品。体液如血清、血浆、肠道流体或尿液是这些样品的优选来源。
本发明还包含使用本发明的s-GDH突变体检测、测定或测量样品中的葡萄糖的方法。特别优选的是，检测样品中葡萄糖的改进的方法的特征在于所述的葡萄糖的检测、测定或测量是使用感应器或测试条装置进行的。
同样在本发明的范围之内的是用于检测或测量样品中葡萄糖的装置，该装置包含本发明的s-GDH突变体以及所述测量需要的其它试剂。
本发明的具有改进的底物特异性的s-GDH变体也可被非常有益地用于生物感应器(D′Costa，E.J.，等，Biosensors 2(1986)71-87；Laurinavicius，V.，等，Analytical Letters 32(1999)299-316；Laurinavicius，V.，等，Monatshefte fuer Chemie 130(1999)1269-1281；Malinauskas，A.等，Sensors and Actuators，B：Chemical 100(2004)395-402)对样品或反应器中的葡萄糖进行在线监测。为达到此目的，例如，s-GDH变体可被用于包被氧不敏感的玻璃电极以对葡萄糖浓度进行更精确的确定，该电极具锇络合物，该络合物含有氧化还原导电环氧网络(Ye等，1993，同上)。
本发明的具有改进的底物特异性的s-GDH变体还有其它可能的应用。例如，这些s-GDH变体可被用于醛糖酸的制备过程。野生型s-GDH在底物氧化生成葡萄糖酸和其它醛糖酸中具有高的转化(turnover)。通过使用对葡萄糖更专一的s-GDH变体，葡萄糖酸的制备将生成少得多的副产物。使用具有不同底物特异性的其它s-GDH变体，可能根据需要生成不同的醛糖酸。
在以下实施例中，除非指明其它商业来源，所有的试剂、限制性酶和其它材料都获自Roche Diagnostics德国，且根据供应商提供的说明进行使用。用于DNA的纯化、表征和克隆的操作和方法是本领域公知的(Ausubel，F.，等，在“Current protocols in molecular biology”(1994)一书中Wiley Verlag)且技术人员可以根据需要进行调整。
以下实施例进一步阐述了本发明。这些实施例不旨在限制本发明的范围，但提供了对发明的进一步理解。
实施例1
在大肠杆菌中克隆与表达野生型醋酸钙不动杆菌可溶PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶
根据标准流程从醋酸钙不动杆菌菌株LMD 79.41中分离出s-GDH基因。野生型s-GDH基因被亚克隆进含有用于可调节表达的mgl启动子的质粒(参考专利申请WO88/09373)。新的构建体被称作pACSGDH(见图2和3)。重组质粒被引入选自大肠杆菌组的宿主生物体。随后在合适的条件下培养这些生物体，呈现s-GDH活性的菌落被选出。
使用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)根据生产商的方法从上述克隆的200ml过夜培养物中分离出质粒pACSGDH。将质粒重悬在1ml bidest水中。使用Beckman DU 7400光度计测定质粒的浓度。
产量为600μg。随后使用琼脂糖凝胶电泳测定质粒的质量。
实施例2
产生突变体T348G
作为产生插入变体的重要的起始模板，具有突变T348G的突变体s-GDH被制造出来。选择s-GDH的该突变体因为已知该突变体具有较之对葡萄糖而言对麦芽糖降低的活性(见WO02/34919)。
使用QuickChange定点突变试剂盒(Stratagene，目录号200518)用甘氨酸取代位点348的苏氨酸由。设计合适的引物。
用于突变的5’-和3’-引物彼此互补且在中心位置包含了用于将苏氨酸替换成甘氨酸的经修饰的密码子(ACA到GGG)。这些核苷酸在各端侧翼有12至16个核苷酸。核苷酸的序列与侧翼于氨基酸交换的密码子的正义和反义DNA链相同。不同于正义链的密码子ACA＝苏氨酸和反义链的TGT，取而代之的是引物包含了正义链的GGG＝甘氨酸和反义链的CCC(见SEQ ID NO：3和4)。
根据手册进行PCR反应和DpnI消化。此后，1μl的样品被用于XL-MRF’-细胞的电穿孔。电穿孔通过使用BioRad大肠杆菌脉冲仪(BioRad)用2.5KV在0.2cm的比色皿中实现。在于37℃在1mL LB中培养1小时后，将细菌涂布于LB-氨卡青霉素琼脂平板(100μg/ml氨苄青霉素)上且在37℃对细菌进行过夜培养。使用以下的筛选法检查突变的s-GDH克隆。
实施例3
筛选
上述在琼脂盘上的突变体菌落被挑入含有200μl LB-氨卡青霉素-培养基/孔的微滴定平板(MTPs)中且在37℃过夜培养。这些平板被称作母平板。
从各母平板中，5μl样品/孔被转移至含有5μl每孔B(B＝细菌蛋白提取试剂；Pierce No.78248)的MTP中进行细胞破碎且加入240μl用于活化s-GDH的0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ)；50mM Hepes；15mM CaCl2 pH7.0/孔。为了实现全酶(holoenzyme)的形成，将MTP在25℃培养2小时且在10℃培养过夜。该平板被称作工作平板。
从工作平板上将3×10μl样品/孔转移至三个空MTP。此后，一个平板用葡萄糖的标准浓度测试，第二个平板用降低的葡萄糖浓度(1.9mM而非30mM)测试且第三个平板用麦芽糖或另一选定的糖分子作为底物测试。所有选定的其它糖分子以等摩尔标准浓度即30mM被使用。对于所有实验而言，已经含有待分析糖的90μl介体溶液(见实施例7)被使用。
计算dE/min且将使用30mM葡萄糖作为底物的值设定为100％活性。将从其它糖获得的值与葡萄糖值比较且计算百分比活性((例如对于麦芽糖：dE/min麦芽糖/dE葡萄糖)×100)。这等价于(变体)酶的交叉反应活性。
将从1.9mM葡萄糖获得的值与30mM葡萄糖值进行比较并计算百分比活性((dE/min 1.9mM葡萄糖/30mM葡萄糖)×100)。这给出了％值，该值提供了对被分析的变体的KM值的间接指示。根据该计算，更高的％值表示更低的(＝更好的)KM值。
以下突变体已经被鉴定出：
  酶      M/G(30mM糖％)   1.9/30mM葡萄糖活性％  氨基酸交换
  WT     105     70％     -
  突变体     25-30％     21％   T348G
实施例4
对通过定点突变得到的突变体s-GDH基因的测序
含有突变体s-GDH T348G的基因的质粒被分离(高纯度质粒分离试剂盒，Roche Diagnostics GmbH，No.1754785)且使用ABI Prism染料终止测序试剂盒和ABI 3/73和3/77测序仪(Amersham PharmaciaBiotech)进行测序，该突变体具有25-30％麦芽糖/葡萄糖交叉反应活性。
使用以下引物：
正义链：GDH 1：5’-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3’(＝SEQ IDNO：5)
GDH 2：5’-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3’(＝SEQ ID NO：6)
结果：
已经获得了理想的DNA突变和氨基酸水平，产生了在位点348的T至G的改变(成熟酶)。没有发现基因上的其它突变。
实施例5
在T348G的基础上产生插入变体
通过使用QuickChange定点突变试剂盒(Stratagene，目录号200518)产生插入变体。设计了用于在氨基酸位点428和429(见序列ID NO：2)之间进行插入的合适引物，且根据生产商的说明进行PCR，其中使用s-GDH突变体(突变体T348G，见实施例4)。
对于引物而言，在插入位点的相应的密码子被随机合成以得到所有可能的20种氨基酸交换。这些密码子核苷酸在两端侧翼有11至13个核苷酸。
正义链：
in429X_F：5’-CTGCCGGAAATNNNGTCCAAAAAGATG-3’(＝SEQID NO：7)
反义链：
in429X_R5’-CATCTTTTTGGACNNNATTTCCGGCAG-3’(＝SEQ IDNO：8)
根据手册进行PCR反应和DpnI消化。此后，如上所述使用1μl的各反应物进行XL1F-细胞的电穿孔。在37℃在1ml LB中培养1小时后，将细菌涂布于LB-氨卡青霉素琼脂平板上(100μg/ml氨苄青霉素)，在37℃过夜培养细菌。对突变的s-GDH克隆进行所述的筛选步骤。为了在统计学上确保具有20种可能的氨基酸插入的变体被筛选，测试了200个克隆。如上所述对具有改变的底物特异性的克隆进行质粒分离和测序。
结果：
表1
   酶   M/G(30mM糖％)   1.9/30mM葡萄糖活性％    氨基酸交换
   WT     105     70％       -
   突变体A     25％     21％    T348G
   A/2     36％     33％ T348G+ins429G
   A/3     34％     21％ T348G+ins429K
   A/4     19％     23％ T348G+ins429F
   A/5     26％     24％ T348G+ins429V
   A/6     22％     24％ T348G+ins429L
   A/7     16％     17％ T348G+ins429M
   A/8     18％     31％ T348G+ins429P
实施例6
产生对葡萄糖相对于麦芽糖具有更高底物特异性的进一步的插入突变体
在WO02/34919中，已经鉴定出了在s-GDH不同位点的若干氨基酸交换以提高对葡萄糖相比于例如麦芽糖的底物特异性。氨基酸交换T348G与在其它位点例如在位点169、171、245、341和/或349的氨基酸取代的组合进一步提高了底物特异性。其中说明的对麦芽糖/葡萄糖的底物特异性分别为3，5和7％的两个突变体被选定以根据本发明在位点428和429之间进行插入(在该例中插入脯氨酸)。通过使用SEQID NO：9和10的引物完成插入。
SEQ ID NO：9    insP429_F：
5’-GATACTGCCGGAAATCCAGTCCAAAAAG-3’
SEQ ID NO：10 insP429_R：
5’-CTTTTTGGACTGGTCCTCCGGCAGTATC-3’
按照上文所述来进行下述操作：模板的质粒DNA分离、定点突变PCR、电穿孔、筛选、选定的突变体的DNA测序。
结果：
酶 M/G(30mM糖)％ 1.9/30mM葡萄糖活性％ 氨基酸交换
WT 105 70％ -
模板C/0 7％ 9％ Y171G+E245D+M341V+T348G
插入突变体C/1 4％ 14％ Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P
模板D/0 3.5％ 10％ L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G
插入突变体D/1 2％ 9％ L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P
从上表中可以清楚地看出，底物特异性麦芽糖/葡萄糖已经极大地改变。已发现和野生型s-GDH的麦芽糖/葡萄糖转化相比，麦芽糖的转化从105％减少到2-4％。突变体C/1和D/1被详细检测。
实施例7
对野生型或变体s-GDH的分别纯化和酶活性分析
收获生长的细胞(LB-Amp.37℃)并将其重悬在磷酸钾缓冲液pH7.0中。通过French Press细胞破碎仪(700-900巴)进行细胞破碎。离心后，将上清液上样到用10mM磷酸钾缓冲液pH7.0平衡过的S-琼脂糖(AmershamBiosciences)柱上。洗涤后，使用盐梯度0-1M NaCl将s-GDH洗脱。显示出s-GDH活性的片段被收集，用磷酸钾缓冲液pH7.0进行透析并在重新平衡的S-琼脂糖柱上再次进行层析。活性片段被收集且使用Superdex200柱(Amersham Biosciences)对其进行凝胶过滤。活性片段被收集并储存在20℃。
对纯化的野生型和变体s-GDH分别进行的酶实验和蛋白测定
使用来自Pierce的蛋白分析试剂号23225进行蛋白测定(用BSA的校准曲线，30分钟，37℃)。
用0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ)；50mM Hepes；15mM CaCl2pH7.0将GDH样品稀释至1mg蛋白/ml，并将其在25℃放置30分钟进行恢复或活化。
在活化后，用50mM Hepes；15mM CaCl2 pH7.0将样品稀释至大约0.02U/ml，且将50μl的各稀释样品加入1000μl的0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH5.8；在25℃)，该缓冲液含有0.315mg/ml作为介体的(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亚硝基苯基)-胺(见美国专利5,484,708)和30mM糖。
在25℃下在最初5分钟中检测在620nm的消光。
在以上实验条件下，1单位酶活性对应于1mMol介体/分钟的转化。
计算：活性＝(总体积×dE/min[U/ml])∶(ε×样品体积×1)
(ε＝消光系数；ε620nm＝30[1×mmol-1×cm-1])
分别用葡萄糖和麦芽糖(Merek，德国)进行实验。
结果：
酶 M/G(30mM糖％) U/mg蛋白 氨基酸交换
WT 105 800 -
C/1 4％ 106 Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P
D/1 1,5％ 109 L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P
从上表中明显看出，包含在s-GDH的位点428和429之间的插入的新变体C/1和D/1在麦芽糖/葡萄糖交叉反应性上呈现出进一步的改进。尽管有各种氨基酸取代且尽管有插入，酶活性(针对葡萄糖每毫克/蛋白质)仍然多于相应的野生型酶活性的10％。
实施例8
在麦芽糖存在或不存在的情况下对葡萄糖的测定
在麦芽糖存在或不存在的情况下分别将野生型s-GDH和s-GDH的变体C/1和D/1用于葡萄糖测定。对照样品含有50mg葡萄糖/dl。“测试”样品分别含有50mg葡萄糖/dl和100或200mg/dl麦芽糖。相同量的GDH活性(U/ml；见以上的酶实验)被用于各实验。
在比色皿中混合：
1ml 0.315mg(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亚硝基苯基)-胺ml/0.2M柠檬酸盐pH5.8
0.033ml对照或测试样品
通过向比色皿中加入0.050ml s-GDH(其对于葡萄糖的转化所需的s-GDH而言是过量的)开始实验。监测在620nm的吸收变化。在2-5分钟后，观察到恒定值且计算dE/5min。用野生型s-GDH测量对照样品获得的值被设定为100％。其它值与该对照值进行比较并计算为％。
结果：
当使用新变体时，在测试样品中观察到明显更少的麦芽糖干扰。明显地，为以最佳效果将样品中的葡萄糖与麦芽糖区分，可以进一步优化s-GDH的浓度。过多的酶将增加麦芽糖的转化，太少的酶将不能转化所有的葡萄糖且因此将无法达到吸收的终点。
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                             序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
     F.Hoffmann-La Roche AG
<120>包含氨基酸插入的遗传改造的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶
<130>22669 WO
<150>EP 04017069
<151>2004-07-20
<160>11
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1362
<212>DNA
<213>醋酸钙不动杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1362)
<400>1
gat gtt cct cta act cca tct caa ttt gct aaa gcg aaa tca gag aac    48
Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn
1               5                   10                  15
ttt gac aag aaa gtt att cta tct aat cta aat aag ccg cac gcg ttg    96
Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu
            20                  25                  30
tta tgg gga cca gataat caa att tgg tta act gag cga gca aca ggt    144
Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly
        35                  40                  45
aag att cta aga gtt aat cca gag tcg ggt agt gta aaa aca gtt ttt    192
Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe
    50                  55                  60
cag gta cca gag att gtc aat gat gct gat ggg cag aat ggt tta tta    240
Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu
65                  70                  75                  80
ggt ttt gcc ttc cat cct gat ttt aaa aat aat cct tat atc tat att    288
Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile
                85                  90                  95
tca ggt aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aac    336
Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn
            100                 105                 110
caa acg att att cgt cgt tat acc tat aat aaa tca aca gat acg ctc    384
Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu
        115                 120                 125
gag aag cca gtc gat tta tta gca gga tta cct tca tca aaa gac cat    432
Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His
    130                 135                 140
cag tca ggt cgt ctt gtc att ggg cca gat caa aag att tat tat acg    480
Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr
145                 150                 155                 160
att ggt gac caa ggg cgt aac cag ctt gct tat ttg ttc ttg cca aat    528
Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn
                165                 170                 175
caa gca caa cat acg cca act caa caa gaa ctg aat ggt aaa gac tat    576
Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln G1n Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr
            180                 185                 190
cac acc tat atg ggt aaa gta cta cgc tta aat ctt gat gga agt att    624
His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile
        195                 200                 205
cca aag gat aat cca agt ttt aac ggg gtg gtt agc cat att tat aca    672
Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr
    210                 215                 220
ctt gga cat cgt aat ccg cag ggc tta gca ttc act cca aat ggt aaa    720
Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys
225                 230                 235                 240
tta ttg cag tct gaa caa ggc cca aac tct gac gat gaa att aac ctc    768
Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu
                245                 250                 255
att gtc aaa ggt ggc aat tat ggt tgg ccg aat gta gca ggt tat aaa    816
Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys
            260                 265                 270
gat gat agt ggc tat gct tat gca aat tat tca gca gca gcc aat aag    864
Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys
        275                 280                 285
tca att aag gat tta gct caa aat gga gta aaa gta gcc gca ggg gtc    912
Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val
    290                 295                 300
cct gtg acg aaa gaa tct gaa tgg act ggt aaa aac ttt gtc cca cca    960
Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro
305                 310                 315                 320
tta aaa act tta tat acc gtt caa gat acc tac aac tat aac gat cca   1008
Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro
                325                 330                 335
act tgt gga gag atg acc tac att tgc tgg cca aca gtt gca ccg tca   1056
Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser
            340                 345                 350
tct gcc tat gtc tat aag ggc ggt aaa aaa gca att act ggt tgg gaa    1104
Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu
        355                 360                 365
aat aca tta ttg gtt cca tct tta aaa cgt ggt gtc att ttc cgt att    1152
Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile
    370                 375                 380
aag tta gat cca act tat agc act act tat gat gac gct gta ccg atg    1200
Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met
385                 390                 395                 400
ttt aag agc aac aac cgt tat cgt gat gtg att gca agt cca gat ggg    1248
Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly
                405                 410                 415
aat gtc tta tat gta tta act gat act gcc gga aat gtc caa aaa gat    1296
Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp
            420                 425                 430
gat ggc tca gta aca aat aca tta gaa aac cca gga tct ctc att aag    1344
Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys
        435                 440                 445
ttc acc tat aag gct aag                                            1362
Phe Thr Tyr Lys Ala Lys
    450
<210>2
<211>454
<212>PRT
<213>醋酸钙不动杆菌
<400>2
Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn
1               5                   10                  15
Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu
            20                  25                  30
Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly
        35                  40                  45
Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe
    50                  55                  60
Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu
65                  70                  75                  80
Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile
                85                  90                  95
Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn
            100                 105                 110
Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu
        115                 120                 125
Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His
    130                 135                 140
Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn
                165                 170                 175
Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr
            180                 185                 190
His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile
        195                 200                 205
Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr
    210                 215                 220
Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys
225                 230                 235                 240
Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu
                245                 250                 255
Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys
            260                 265                 270
Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys
        275                 280                 285
Ser Ile Lys Asp Leu A1a Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val
    290                 295                 300
Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro
305                 310                 315                 320
Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro
                325                 330                 335
Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser
            340                 345                 350
Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu
        355                 360                 365
Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile
    370                 375                 380
Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Va1 Pro Met
385                 390                 395                 400
Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly
                405                 410                 415
Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp
            420                 425                 430
Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys
        435                 440                 445
Phe Thr Tyr Lys Ala Lys
    450
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>T348G有义链的引物序列
<400>3
catttgctgg ccaggggttg caccgtcat                                       29
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>T3486反义链的引物序列
<400>4
atgacggtgc aacccctggc cagcaaatg                                       29
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>测序引物GDH 1
<400>5
ttaacgtgct gaacagccgg                                                 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>测序引物GDH 2
<400>6
atatgggtaa agtactacgc                                                 20
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>摆动插入引物in429X_F正义链
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(14)
<223>n是a、c、g或t
<400>7
ctgccggaaa tnnngtccaa aaagatg                                         27
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>摆动插入引物in429X_R反义链
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(16)
<223>n是a、c、g或t
<400>8
catctttttg gacnnnattt ccggcag                                         27
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>insP429
<400>9
gatactgccg gaaatccagt ccaaaaag                                        28
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>insP429_R
<400>10
ctttttggac tggtcctccg gcagtatc                                        28
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>11
Gly Asn Xaa Val Gln Lys Asp
1               5

Claims (22)

1、可溶形式的EC1.1.99.17的一种变体，所述可溶形式的EC1.1.99.17也被称作PQQ-依赖性可溶葡萄糖脱氢酶(s-GDH)，所述变体包含在对应于从醋酸钙不动杆菌获知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：2)的位点428和429的氨基酸位点之间的至少一个氨基酸残基的插入以及可选地还包含一或多个氨基酸取代。
2、根据权利要求1所述的变体，其进一步的特征在于所述的插入的氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸构成的组。
3、根据权利要求1或2所述的变体，其中所述的插入的氨基酸是脯氨酸。
4、根据权利要求1至3中任一项所述的变体，其进一步的特征在于该变体包含在对应于位点348的氨基酸位点的氨基酸残基的取代。
5、根据权利要求4所述的变体，其进一步的特征在于在位点348的苏氨酸由选自以下氨基酸构成的组的氨基酸取代：丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
6、根据权利要求1至3中任一项所述的PQQ-依赖性s-GDH的变体，其进一步的特征在于该变体包含至少一个在对应于位点428的氨基酸位点的氨基酸残基的取代。
7、根据权利要求6所述的PQQ-依赖性s-GDH的变体，其进一步的特征在于在位点428的天冬酰胺由选自以下氨基酸残基构成的组的氨基酸残基取代：亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸。
8、根据权利要求1至7中任一项所述的变体，包含在位点348和428的取代。
9、根据权利要求1至8中任一项所述的变体，还包含在位点171的取代。
10、根据权利要求1至8中任一项所述的变体，还包含在位点245的取代。
11、根据权利要求1至8中任一项所述的变体，还包含在位点341的取代。
12、根据权利要求1至8中任一项所述的变体，还包含在位点169的取代。
13、根据权利要求1至8中任一项所述的变体，还包含在位点349的取代。
14、一种编码根据权利要求1至13中任一项所述的s-GDH变体蛋白的分离的多核苷酸。
15、一种表达载体，包含权利要求14中定义的分离的多核苷酸，该多核苷酸与能够促进所述多核苷酸在宿主细胞中表达的启动子序列可操作地连接。
16、一种宿主细胞，包含权利要求15所述的表达载体。
17、一种制备s-GDH变体的方法，包含在适于制备酶变体的条件下培养权利要求16所述的宿主细胞。
18、一种表达载体，包含权利要求14中定义的分离的多核苷酸，该多核苷酸与能够促进所述多核苷酸在无细胞肽合成系统中表达的启动子序列可操作地连接。
19、一种方法，用于：使用权利要求18所述的构建体在无细胞肽合成系统中在适于制备所述酶变体的条件下制备s-GDH变体。
20、一种方法，用于：使用根据权利要求1-13中任一项权利要求所述的s-GDH变体检测、测定或测量样品中的葡萄糖，所述的改进包括将样品与所述变体接触。
21、根据权利要求20所述的方法，其进一步的特征在于所述的葡萄糖的检测、测定或测量通过使用感应器或测试条装置进行。
22、一种检测或测量样品中葡萄糖的装置，包含根据权利要求1至13中任一项权利要求所述的s-GDH变体和所述测量所需的其它试剂。
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