NO340499B1 - Variant av den løselige formen av pyrrolokinolinkinonavhengig glukosedehydrogenase som omfatter én aminosyre insersjon og minst én aminosyre substitusjon, et isolert polynukleotid som koder for varianten, en ekspresjonsvektor som omfatter det isolert polynukleotidet, en vertscelle som omfatter ekspresjonsvektoren, en fremgangsmåte for fremstilling av s-GDH-varianter som omfatter dyrking av vertscellen, en fremgangsmåte for fremstilling av s-GDH-varianter i et cellefritt peptidsyntesesystem, en fremgangsmåte for påvisning, bestemmelse eller måling av glukose i en prøve ved å anvende en variant, samt en innretning for påvisningen eller målingen av glukose i en prøve. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbedrede varianter av løselige, pyrrolokinolinkinon (PQQ)-avhengige glukosedehydrogenaser (s-GDH) som omfatter en aminosyre insersjon mellom posisjonene 428 og 429 som tilsvarer aminosyresekvensen som er kjent fra Acinetobacter calcoaceticus i gener som koder for slik variant-s-GDH, til proteiner av slike s-GDH-varianter med forbedret substratspesifisitet for glukose, og forskjellige applikasjoner av disse s-GDH-variantene, spesielt for å bestemme konsentrasjoner av sukker, spesielt glukose i en prøve.

Oppfinnelsens område

Bestemmelsen av glukosekonsentrasjon i blod er ekstremt viktig ved klinisk diagnose og i håndteringen av diabetes. Omtrent 150 millioner mennesker verden over lider av den kroniske sykdommen diabetes mellitus, et tall som kan bli doblet ved år 2025 ifølge WHO. Selv om diabetes enkelt kan diagnostiseres og behandles, så krever vellykket langtids håndtering lavkost diagnostiske verktøy som raskt og nøyaktig rapporterer glukosekonsentrasjoner i blod. PQQ-avhengige glukosedehydrogenaser (EC 1.1.99.17) katalyserer en reaksjon der glukose oksideres til glukonolakton. Følgelig blir denne enzymtypen anvendt for å måle blodsukker. Én av disse verktøyene er en diagnostisk strimmel basert på den løselige glukosedehydrogenasen (s-GlucDOR, EC 1.1.99.17), som er et pyrrolokinolin kinon-inneholdende enzym som opprinnelig stammer i fra Acinetobacter calcoaceticus.

Kinoproteiner anvender kinon som kofaktor for å oksidere alkoholer, aminer og aldoser til deres tilsvarende laktoner, aldehyder og aldolsyrer (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in 'The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press, Duine, J. A., Eur J Biochem 200

(1991) 271-284, Davidson, V. L, in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker, Anthony, C, Biochem. J. 320 (1996) 697-711, Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727, Anthony, C, Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417, Anthony, C. and Ghosh, M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69

(1998) 1-21. Blant kinoproteiner utgjør de som inneholder den ikke-kovalent bundne kofaktoren 2,7,9-trikarboksy-lH-pyrrolo[2,3-f]kinolin-4,5-dion (PQQ) den største undergruppen (Duine 1991, ovenfor). Alle bakterielle kinonglukosedehydrogenaser som er kjent hittil tilhører denne undergruppen med PQQ som kofaktor (Anthony og Ghosh 1997, ovenfor, Goodwin, P.M. og Anthony, C, Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80, Anthony, C, Adv. in Phot. and Resp. 15 (2004) 203-225).

To typer PQQ-avhengig glukosedehydrogenase (EC 1.1.99.17) har blittkarakteriserti bakerier: Én er membranbundet (m-GDH), den andre er løselig (s-GDH). Begge typer deler ikke noen signifikant sekvenshomologi (Cleton-Jansen, A. M., et al. Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436, Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79, Oubrie, A., et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 96 (1999) 11787-11791. De er også forskjellige både når det gjelder deres kinetiske, så vel som deres immunologiske egenskaper (Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnol. & Biochem. 59 (1995) 1548-1555). m-GDH er utbredte i gramnegative bakterier, s-GDHer har imidlertid bare blitt funnet i det periplasmatiske rommet i Acinetobacter-stammer, slik som A. calcoaceticus (Duine, J.A., 1991a, Cleton-Jansen, A.M. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125, Matsushita og Adachi, 1993) og A. baumannii (JP 11243949).

Gjennom å søke i sekvensdatabaser har to sekvenshomologer til fullengde-A calcoaceticus s-GDH blitt identifisert i E. coli K-12 og i Synechocystis sp. I tillegg ble to ufullstendige sekvenshomologer for A. calcoaceticus s-GDH også funnet i genomet til henholdsvis P. aeruginosa og Bordella pertussis (Oubrie et al. 1999 a, b, c) og Enterobacter intermedium (Kim, C. H. et al., Current Microbiol. 47 (2003) 457-461). De utledede aminosyresekvensene til disse fire ukarakteriserte proteinene er nært beslektet med A. calcoaceticus- s- GDH med mange rester i det antatte, aktive setet absolutt konservert. Disse homologe proteinene har sannsynligvis en tilsvarende struktur og katalyserer tilsvarende PQQ-avhengige reaksjoner (Oubrie et al., 1999 a, b, c, Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151, Reddy, S., og Bruice, T. C, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438, Yamada, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192).

Bakterielle s-GDHer og m-GDHer har blitt funnet å inneha ganske forskjellige sekvenser og forskjellig substratspesifisitet. For eksempel inneholder A calcoaceticus to forskjellige PQQ-avhengige glukosedehydrogenaser, én m-GDH som er aktiv in vivo, og den andre som er betegnet s-GDH, for hvilken kun in wtro-aktivitet kan bli vist. Cleton-Jansen et al., 1988, 1989 a, b klonet genene som koder for de to GDH-enzymene og bestemte DNA-sekvensene for begge disse GDH-genene. Det er ingen åpenbar homologi mellom m-GDH og s-GDH, noe som bekrefter det faktumet at m-GDH og s-GDH representerer to helt forskjellige molekyler. (Laurinavicius, V., et al., Biologija (2003) 31-34).

Genet for s-GDH fra A. calcoaceticus har blitt klonet i E. coli. Etter å ha blitt produsert i cellen, blir s-GDH translokert gjennom den cytoplasmiske membranen inn i det periplasmiske rommet (Duine, J. A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter \ n 'The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press, Matsushita, K. og Adachi, O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker). Slik som nativ s-GDH fra A. calcoaceticus, er rekombinant s-GDH som blir uttrykt i E. coli en homodimer, med ett PQQ-molekyl og tre kalsiumioner pr. monomer (Dokter, P. et al., Biochem. J. 239 (1986) 163-167, Dokter, P. et al., FEMS Microbiol. Lett. 43 (1987) 195-200, Dokter, P. et al., Biochem. J. 254 (1988) 131-138, Olsthoorn, A. og Duine, J. A. Biochem. Biophys. 336

(1996) 42-48, Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333, Oubrie, A., et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 96 (1999) 11787-11791, Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194). s-GDH oksiderer et bredt utvalg av mono- og disakkarider til de tilsvarende ketonene som videre hydrolyseres til aldonsyrene, og den er også i stand til å donere elektroner til PMS (fenazin metosulfat), DCPIP (2,6-diklor-fenolindofenol), WB (Wursters blått) og kortkjede ubikinoner, slik som ubikinon-Ql og ubikinon-Q2 (Matsushita, K., et al., Biochem. 28 (1989) 6276- 6280, Matsushita, K., et al. Antonie Van Leeuwenhoek 56

(1989) 63-72), flere kunstige elektron-akseptorer, slik som N-metylfenazonium-metyl-sulfat (Olsthoorn, A. J. og Duine. J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48, Olsthoorn, A. J. og Duine, J. A., Biochem. 37 (1998) 13854-13861) og elektroledende polymerer (Ye, L, et al., Anal. Chem. 65 (1993) 238-241). I lys av s-GDHers høye, spesifikke aktivitet mot glukose (Olsthoorn, A. J. og Duine, J. A., (1996) ovenfor) og dens brede, kunstige elektronakseptor-spesifisitet er enzymet godt egnet til analytiske applikasjoner, spesielt til å bli anvendt i (bio)sensor- eller teststriper til glukosebestemmelse i diagnostiske applikasjoner (Kaufmann, N. et al. Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH, Malinauskas, A., et al., Sensors and Actuators, B: Chemical B100 (2004) 395-402).

Glukoseoksidering kan bli katalysert av minst tre helt distinkte grupper av enzymer, dvs. av NAD/P-avhengige glukosedehydrogenaser, av flavoproteinglukose-oksidaser eller av kinoprotein-GDHer (Duine, J. A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23). En ganske sakte autooksidering av redusert s-GDH har blitt observert, noe som viser at oksygen er en svært dårlig elektronakseptor for s-GDH (Olsthoorn og Duine, 1996). s-GDH kan effektivt donere elektroner fra det reduserte kinonet til mediatorer, slik som PMS, DCPIP, WB og kortkjede-ubikinoner, slik som Ql og Q2, men den kan ikke effektivt donere elektroner direkte til oksygen.

Tradisjonelle teststrips og sensorer for å monitorere glukosenivå i blod, serum og urin, f.eks. fra diabetespasienter, anvender glukoseoksidase. Ytelsen til enzymet er avhengig av oksygenkonsentrasjonen. Glukosemålinger ved forskjellige høyder over havet med forskjellige oksygenkonsentrasjoner i luften kan føre til falske resultater. Den store fordelen med PQQ-avhengige glukosedehydrogenaser er deres uavhengighet av oksygen. Denne viktige egenskapen blir f.eks. diskutert i US 6 103 509 der noen egenskaper med membranbundet GDH har blitt undersøkt.

Et viktig bidrag til fagområdet har vært anvendelsen av s-GDH sammen med egnede mediatorer. Analysefremgangsmåter og teststri pi nn retn inger basert på s-GDH er beskrevet i detalj i US 5 848 708. Dette patentet inneholder detaljert informasjon om oppsett av analyser og produksjonen av s-GDH-baserte teststrips for måling av glukose.

Andre patenter eller søknader som vedrører fagområdet og som omfatter spesifikk informasjon om forskjellige måter for anvendelse av enzymene med glukosedehydrogenaseaktivitet, er US 5997 817, US 6 057 120, EP 0 620 283 og JP 11-243949-A.

Et kommersielt system som anvender s-GDH, og en indikator som frembringer en fargeendring når reaksjon foregår (Kaufmann et al. 1997 ovenfor), er «Glucotrend»-systemet som blir distribuert av Roche Diagnostics GmbH.

Til tross for de ovenfor diskuterte fortrinnene ved anvendelse av en PQQ-avhengig s-GDH i bestemmelse av glukose, så må også en ulempe bli overveid. Enzymet har et heller bredt substratspektrum sammenlignet med m-GDH. Det betyr at s-GDH oksiderer ikke bare glukose, men også flere andre sukkertyper, inkludert maltose, galaktose, laktose, mannose, xylose og ribose (Dokter et al. 1986 a, Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151). Reaktiviteten mot sukkertyper som er forskjellige fra glukose, kan i visse tilfeller ødelegge nøyaktigheten ved bestemmelse av blodglukose-nivåer. Pasienter på peritoneal dialyse som er behandlet med ikodekstrin (en glukose-polymer) kan i deres kroppsvæsker, f. eks. i blodet, ha høye nivåer av andre sukkertyper, spesielt maltose (Wens, R., et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609).

Derfor kan kliniske prøver, slike som f. eks. er tatt fra diabetespasienter, spesielt fra pasienter med nyrekomplikasjoner og spesielt fra pasienter under dialyse, inneholde signifikante nivåer av andre sukkertyper, spesielt maltose. Glukosebestemmelser i prøver tatt fra slike kritiske pasienter, kan bli forstyrret av maltose (Davies, D., Perit. Dial. Int.

14 (1994) 45-50, Frampton, J. E. og Plosker, G.L., Drugs 63 (2003) 2079-2105).

Det er sjeldent rapporter i litteraturen om forsøk på å produsere modifiserte, PQQ-avhengige-s-GDHer med endret substratspesifisitet. Igarashi, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824 rapporterer at introduksjon av en punktmutasjon i posisjon Glu277 fører til mutanter med endret substratspesifisitetsprofil.

Sode, EP 1 176 202, rapporterer at visse aminosyresubstitusjoner inne i s-GDH fører til mutant s-GDH med en forbedret affinitet for glukose. I EP 1 167 519 rapporterer samme forfatter om mutant s-GDH med forbedret stabilitet. Dessuten rapporterer den samme forfatteren i JP20041173538 om andre s-GDH-mutanter med forbedret affinitet for glukose.

Kratzsch. P. et al., WO 02/34919 rapporterer at spesifisiteten til s-GDH for glukose sammenlignet med andre sukkersubstrater, spesielt sammenlignet med maltose, kan bli forbedret ved aminosyresubstitusjoner i visse posisjoner i s-GDH.

Takeshima, S., et al. (EP 1 367 120) rapporterer om mutert s-GDH som omfatter visse aminosyresubstitusjoner eller en aminosyre insersjon mellom posisjon 427 og 428, tilsvarende aminosyresekvensen kjent fra Acinetobacter calcoaceticus.

Men mens ganske mange forbedringer har blitt rapportert for generering av mutanter eller varianter av s-GDH med forbedrede egenskaper, er likevel alternative og/eller ytterligere forbedringer fortsatt nødvendig.

En stor etterspørsel og et klinisk behov eksisterer derfor for ytterligere mutant-eller variantformer av s-GDH som alene eller i kombinasjon med allerede kjente mutasjoner, frembringer en forbedret spesifisitet for glukose som substrat.

Det var oppgaven for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye mutanter eller varianter av s-GDH som enten alene eller i kombinasjon med allerede kjente mutasjoner, fører til en signifikant forbedret substratspesifisitet for glukose sammenlignet med andre valgte sukkermolekyler, f. eks. galaktose eller maltose.

Overraskende ble det funnet at det er mulig å signifikant forbedre substratspesifisiteten til s-GDH for glukose sammenlignet med andre sukkertyper, ved å gjøre en aminosyre insersjon mellom posisjonene 428 og 429 i s-GDH som tilsvarer aminosyresekvensen kjent fra Acinetobacter calcoaceticus og slik, i det minste delvis, overvinne de ovenfor beskrevne problemene som er kjent på fagområdet.

Substratspesifisiteten for glukose sammenlignet med andre valgte sukkermolekyler har blitt signifikant forbedret ved å tilveiebringe insersjonsvariantene av s-GDH ifølge foreliggende oppfinnelse, og som er beskrevet nedenfor her og i de tilhørende kravene.

På grunn av den forbedrede substratspesifisiteten for de nye formene av s-GDH er signifikante tekniske fremskritt for glukosebestemmelser i forskjellige områder for anvendelser mulig. De forbedrede s-GDH kan bli anvendt med stor fordel til den spesifikke påvisningen eller målingen av glukose i biologiske prøver, spesielt i teststrip-innretninger eller i biosensorer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører en variant av den løselige formen av EC 1.1.99.17, som også er kjent som PQQ-avhengig, løselig glukosedehydrogenase (s-GDH), der nevnte variant kjennetegnes ved at den omfatter insersjonen av én aminosyrerest mellom aminosyreposisjonene tilsvarende posisjonene 428 og 429 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A. calcoaceticus (SEKV. ID. NR.: 2), hvor nevnte, innsatte aminosyre er prolin, en substitusjon av treonin i posisjon 348 med en aminosyrerest valgt fra gruppen som består av alanin, glysin og serin, og eventuelt i tillegg omfatter én eller flere ytterlige aminosyresubstitusjoner, hvor nevnte variant er minst 90 % identisk med

SEKV ID NR. 2.

Foretrukne varianter av s-GDH som oppviser forbedrede egenskaper, spesielt økt spesifisitet for glukose så vel som polynukleotid-sekvenser som koder for slike varianter, en ekspresjonsvektor som omfatter en slik polynukleotidsekvens og en vertcelle som omfatter nevnte ekspresjonsvektor, er også tilveiebrakt.

Oppfinnelsen vedrører ytterligere anvendelsen av en variant ifølge foreliggende oppfinnelse i en fremgangsmåte for måling av glukose, spesielt ved en teststripinnretning eller med en biosensor.

De følgende eksemplene, referansene, sekvenslistene og figurene blir tilveiebrakt for å hjelpe til i forståelsen av foreliggende oppfinnelse, der det sanne omfanget av denne blir fremlagt i de tilhørende kravene.

Beskrivelse av figurene

Figur 1: Proteinsekvens for A ca/coacet/cus-PQQ-avhengig s-GDH (topp) og A

baumannii- s- GDH (bunn) sammenstilt ifølge sekvenshomologi.

Figur 2: Illustrasjon av pACSGDH-vektor referert til i eksempel 1, inneholdende henholdsvis villtype- eller mutert DNA-sekvenser for løselig PQQ-avhengig glukosedehydrogenase. Figur 3: Nukleotid (DNA)-sekvens for pACSGDH-vektoren referert til i eksempel 1,

inneholdende villtype-DNA-sekvensen for løselig PQQ-avhengig glukosedehydrogenase.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som diskutert ovenfor blir to fullstendig forskjellige kinoprotein-enzymtyper med glukosedehydrogenaseaktivitet (membranbundet og løselig) gruppert sammen under EC 1.1.99.17. Disse to typene ser ut til å ikke være beslektet med hverandre.

For formålet med denne oppfinnelsen er bare den løselige formen av GDH (s-GDH) relevant, og forbedrede varianter derav blir diskutert her nedenfor.

I en første utførelsesform vedrører oppfinnelsen en variant av den løselige formen av EC 1.1.99.17, også kjent som PQQ-avhengig, løselig glukosedehydrogenase (s-GDH), der nevnte variant omfatter minst én aminosyrerest-insersjon mellom aminosyreposisjonene som tilsvarer posisjonene 428 og 429 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) og som eventuelt ytterligere omfatter én eller flere aminosyre substitusjoner.

Fortrinnsvis er kun én aminosyre satt inn mellom aminosyreposisjonene som tilsvarer posisjonene 428 og 429 i s-GDH-villtypesekvensen kjent fra A calcoaceticus

(SEQ ID NO: 2).

Det er ytterligere foretrukket at s-GDH-varianten som omfatter en aminosyre insersjon mellom aminosyreposisjonene som tilsvarer posisjonene 428 og 429 i s-GDH- villtypesekvensen kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) er kjennetegnet ved at nevnte, innskutte aminosyre er valgt fra gruppen som består av leucin, fenylalanin, metionin og prolin. Fortrinnsvis er den innsatte aminosyren prolin.

På fagområdet er det kjent at villtype-DNA-sekvensen til en løselig PQQ-avhengig glukosedehydrogenase kan bli isolert fra stammer av Acinetobacter. Mest foretrukket er isoleringen fra Acinetobacter calcoaceticus- type stamme LMD 79.41. Sekvensen til denne villtype-s-GDH (det modne proteinet) er gitt i SEQ ID NO: 2. Andre LMD-stammer av Acinetobacter kan også bli anvendt som kilde til villtype-s-GDH. Slike sekvenser kan bli sammenstilt med sekvensen som er fremskaffet fra A. calcoaceticus, og sekvenssammenligninger kan bli gjort. Det ser også ut til å være mulig å screene DNA-biblioteker fra andre bakteriestammer, slik som for eksempel beskrevet for E. coli K-12 (Oubrie, A., et al. J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333) og for å identifisere sekvenser som er beslektet med s-GDH i slike genomer. Slike sekvenser og enda ikke-identifiserte homologe sekvenser kan bli anvendt for generere s-GDH-varianter med forbedret substratspesifisitet.

Uttrykket "variant" i betydningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen vedrører s-GDH-protein som sammenlignet med en tilsvarende villtypesekvens, har en aminosyre insersjon mellom aminosyreposisjonene som tilsvarer posisjonene 428 og 429 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Uttrykket "mutant" i betydningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen vedrører et s-GDH-protein som sammenlignet med en tilsvarende villtypesekvens, har minst én aminosyresubstitusjon sammenlignet med s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Uttrykket "variant" eller "mutant" gjelder begge for et s-GDH-protein som sammenlignet med en tilsvarende villtypesekvens har en aminosyre insersjon mellom aminosyreposisjonene som tilsvarer posisjonene 428 og 429 i s-GDH-villtypesekvensen kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) og som i tillegg til dette har minst én aminosyresubstitusjon.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform blir de enzymatiske eller funksjonelle egenskapene til en forbedret variant av s-GDH sammenlignet henholdsvis med villtypeenzymet eller med mutanter uten en aminosyre insersjon mellom posisjonene 428 og 429.

En foretrukket variant ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at den relativt i forhold til det tilsvarende villtypeenzymet har minst en to gangers forbedret substratspesifisitet for glukose sammenlignet med minst ett annet valgt sukkersubstrat.

For å kunne beregne substratspesifisiteten eller kryssreaktiviteten er én enkel måte å fastsette aktiviteten som er målt med glukose som substrat til 100 %, og så sammenligne aktivitet som er målt med det andre valgte sukkeret med glukoseverdien. Noen ganger, for ikke å være ordrik, blir ganske enkelt uttrykket spesifisitet anvendt uten å gjøre spesielle henvisning til glukose på den ene siden og et valgt annet sukkersubstrat på den andre siden.

Eksperten på fagområdet vil være på det rene med at sammenligningen av enzymatiske aktiviteter best blir utført ved ekvimolare konsentrasjoner av substrat-molekylene som blir undersøkt ved anvendelse av veldefinerte analysebetingelser. Ellers må korreksjoner for forskjelligheter i konsentrasjoner bli gjort.

Standardiserte og veldefinerte analysebetingelser må bli valgt for å vurdere (forbedringer i) substratspesifisitet. Den enzymatiske aktiviteten til s-GDH for glukose som substrat så vel som for andre valgte sukkersubstrater blir målt som beskrevet i eksempel 7.

Basert på disse målingene av enzymatisk aktivitet for glukose eller et valgt annet sukker, fortrinnsvis maltose, blir kryssreaktivitet (og forbedringer derav) vurdert. s-GDH (kryss)-reaktivitet for et valgt sukker i prosent blir beregnet som

kryssreaktivitet [%] = (aktivitet for valgt sukker/aktivitet for glukose) x 100 %.

(Kryss)-reaktivitet for maltose for villtype s-GDH ifølge formelen ovenfor har blitt bestemt til omtrent 105 %. Villtype s-GDH (kryss)-reaktivitet for galaktose har blitt målt til omtrent 50 % (se tabell 1).

(Forbedret) spesifisitet blir beregnet ifølge den følgende formelen:

Sammenlignet med villtypeenzymet har en s-GDH-form med en minst 10-ganger forbedring i spesifisitet for glukose i forhold til maltose (maltose/glukose) følgelig med maltose som substrat, høyst 10,5 % av aktiviteten som er målt med glukose som substrat. Eller, hvis for eksempel en mutant-s-GDH har en kryssreaktivitet for maltose på 20 % (bestemt og beregnet som beskrevet ovenfor), så har denne mutanten sammenlignet med villtype s-GDH derfor en 5,25 gangers forbedret substratspesifisitet (maltose/glukose).

Uttrykket "spesifikk aktivitet" for et substrat er velkjent på fagområdet, og det blir fortrinnsvis anvendt for å beskrive den enzymatiske aktiviteten per mengde av protein. Forskjellige fremgangsmåter er kjent på fagområdet for å bestemme spesifikk aktivitet for GDH-molekyler ved å anvende glukose eller andre sukkertyper som substrater (Igarashi, S., et al., (1999) ovenfor). Én av fremgangsmåtene som er tilgjengelige for slike målinger er beskrevet i detalj i eksempeldelen.

Mens det er mulig å velge mange forskjellige sukkermolekyler og undersøke glukosespesifisiteten for s-GDH i sammenligning med ethvert slik valgt sukkermolekyl, så er det foretrukket å velge et klinisk relevant sukkermolekyl for en slik sammenligning. Foretrukne, valgte sukkertyper er valgt fra gruppen bestående av mannose, allose, galaktose, xylose og maltose. Fortrinnsvis blir maltose eller galaktose valgt, og mutant s-GDH er testet for forbedret substratspesifisitet for glukose sammenlignet med galaktose eller maltose. I en ytterligere foretrukket utførelsesform er det valgte sukkeret maltose.

Det har blitt funnet at forbedringene i glukosespesifisitet for s-GDH-varianten ifølge denne oppfinnelsen, f. eks. for maltose vs. glukose, er ganske omfattende. Det blir derfor ytterligere foretrukket at nevnte substratspesifisitet for glukose sammenlignet med substratspesifisiteten for minst ett av de valgte andre sukkersubstratene er forbedret minst tre ganger. Andre foretrukne utførelsesformer omfatter s-GDH-mutanter som er kjennetegnet ved en forbedret substratspesifisitet for glukose, som er minst fem ganger høyere eller også foretrukket minst ti ganger høyere, sammenlignet med de andre sukkermolekylene som er valgt.

Mutasjoner i s-GDH fører i mange tilfeller til enzymvarianter med dramatisk redusert spesifikk aktivitet for substratet glukose. En mer enn ti ganger reduksjon i (absolutt eller samlet) spesifikk aktivitet for substratet glukose, kan imidlertid være kritisk for rutine applikasjoner. Det er derfor foretrukket at s-GDH med forbedret spesifisitet mot substratet glukose oppviser minst 10 % av den spesifikke aktiviteten for glukose som målt med villtypeenzymet. Det er selvfølgelig mer foretrukket at slike muterte enzymer oppviser minst 20 % eller mer foretrukket, minst 30 % av den respektive glukoseaktiviteten for villtype-s-GDH.

Ytterligere foretrukket er slike mutanter for hvilke den maltosespesifikke aktiviteten er 10 % eller mindre, eller til og med bare 5 % eller mindre av den maltosespesifikke aktiviteten som målt for det tilsvarende villtypeenzymet på teststrips eller flytende tester, mens den spesifikke aktiviteten for glukose er >10 % sammenlignet med spesifisiteten for glukose for det tilsvarende villtypeenzymet.

Det har blitt funnet at det er mulig å ytterligere forbedre substratspesifisiteten for en s-GDH-variant som omfatter en insersjon mellom posisjonene 428 og 429 ved ytterligere å modifisere en slik variant for ytterligere å omfatte én eller flere aminosyresubstitusjoner på visse veldefinerte aminosyreposisjoner.

Prestasjonen ved foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj ved å henvise til aminosyreposisjoner som er kjent fra SEQ ID NO: 2, villtype sekvensen til s-GDH slik den er isolert fra Acinetobacter calcoaceticus- stamme LMD 79.41. Aminosyreposisjoner i forskjellige s-GDH-isolater som tilsvarer posisjoner ifølge SEQ ID NO: 2 kan lett identifiseres ved hensiktsmessige sekvenssammenligninger.

Den multiple sammenstillingen og sammenligningen av en s-GDH-sekvens med villtypesekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 utføres med PileUp-programmet til GCG Package Version 10,2 (Genetics Computer Group, Inc.)- PileUp danner en multiple sekvens-sammenstilling ved å anvende en forenkling av den progressive sammenstillings-fremgangsmåten til Feng, D.F. og Doolittle, R. F., J. Mol. Evol 25 (1987) 351-360, og skåringsmatriksene for identiske, lignende eller forskjellige aminosyrerester defineres ut fra dette. Denne prosessen begynner med den parvise sammenstillingen av de to mest like sekvensene, som frembringer en klynge av to sammenstilte sekvenser. Denne klyngen kan deretter bli sammenstilt med den nest mest beslektede sekvensen eller klyngen av sammenstilte sekvenser. To klynger av sekvenser kan sammenstilles ved en enkel forlengning av den parvise sammenstillingen av to individuelle sekvenser. Den endelige sammenstillingen oppnås ved en serie progressive, parvise sammenstillinger som inkluderer stadig mer forskjellige sekvenser og klynger, inntil alle sekvensene har blitt inkludert i den endelige parvise sammenstillingen. På denne måten kan posisjoner på andre, homologe s-GDH-molekyler enkelt identifiseres som tilsvarer posisjonene gitt for A. calcoaceticus s-GDH i SEQ ID NO: 1 og 2. Dette er grunnen til at aminosyreposisjonene som angis her skal være forstått som aminosyreposisjonene ifølge SEQ ID NO: 2 eller som posisjonene som tilsvarer denne i andre, homologe s-GDH-molekyler.

Mutanter av s-GDH som omfatter en aminosyresubstitusjon i posisjonen som tilsvarer posisjon 348 i kombinasjon med en aminosyre insersjon mellom posisjonene 428 og 429 i s-GDH har blitt funnet å oppvise en slående positiv effekt med hensyn til spesifisitet for glukose. Som vist i tabell 1 har et mangfold av s-GDH-varianter med forbedret spesifisitet for glukose blitt identifisert og generert. Forbedring av glukosespesifisitet for en variant s-GDH ses så lenge aminosyren i posisjon treonin-348 er substituert med en egnet annen aminosyre, og en egnet aminosyre er satt inn mellom posisjonene 428 og 429. En svært foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse vedrører derfor et variantprotein av PQQ-avhengig s-GDH som omfatter en insersjon mellom aminosyrene 428 og 429 i s-GDH villtypesekvensen kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) og som i tillegg omfatter en aminosyresubstitusjon på aminosyreposisjonen som tilsvarer posisjon 348.

Det har også blitt funnet at ytterligere substitusjoner på aminosyreposisjon som tilsvarer posisjon 169, 171, 245, 341, 349 og/eller 428 ifølge SEQ ID NO: 2 er fordel-aktige i arbeidet med ytterligere forbedring av spesifisiteten for glukose for en s-GDH-variant som omfatter en insersjon mellom aminosyrene 428 og 429 og en aminosyre-restsubstitusjon i posisjon 348.

Verken treoninresten i posisjon 348 eller insersjonen av en aminosyre mellom posisjonene 428 og 429 i s-GDH som isolert fra Acinetobacter calcoaceticus- type stamme LMD 79.41, er kjent fra fagområdet for å bidra til substratbindingen av s-GDH (Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194, Oubrie, A. og Dijkstra, B. W., Protein Sei. 9

(2000)1265-1273). Ingen kjemisk eller fysisk forklaring foreligger på hvorfor spesielt disse to modifiseringene av s-GDH forbedrer substratspesifisiteten for glukose sammenlignet med andre sukkermolekyler av interesse, spesielt sammenlignet med maltose.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform er varianten av s-GDH kjennetegnet ved at aminosyreresten treonin ved posisjon 348 er substituert med en aminosyrerest som er valgt fra gruppen som består av alanin, glysin og serin. I en mer foretrukket utførelsesform blir glysin anvendt for å substituere for treonin i posisjon 348. Terminologien T348G er kjent for fagpersoner og indikerer at treonin i posisjon 348 er erstattet med glysin.

En ytterligere foretrukket utførelsesform er en variant av den løselige formen av EC 1.1.99.17 også kjent som PQQ-avhengig løselig glukosedehydrogenase (s-GDH), der nevnte variant omfatter minst én aminosyrerest-insersjon mellom aminosyreposisjonene som tilsvarer posisjonene 428 og 429 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) og minst én aminosyrerest-substitusjon på en aminosyreposisjon som tilsvarer posisjon 428. Fortrinnsvis er substitusjonen av asparagin i posisjon 428 er med leucin, prolin og valin. Mest foretrukket er substitusjonen i posisjon 428 er med prolin. Én gruppe av foretrukne s-GDH-varianter ifølge denne oppfinnelsen omfatter en substitusjon av aminosyrerester i posisjon 348 og/eller en aminosyresubstitusjon i posisjon 428, og en aminosyre insersjon mellom posisjonene 428 og 429. Disse variantene kan eventuelt ytterligere bli modifisert til å omfatte én eller flere aminosyresubstitusjoner i aminosyreposisjoner som tilsvarer posisjonene 169, 171, 245, 341 og/eller 349 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

I tilfellet der aminosyren som tilsvarer posisjon 169 på s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) er substituert i en variant av foreliggende oppfinnelse, så er det foretrukket at den naturlig forekommende aminosyren leucin substitueres med fenylalanin, tyrosin eller tryptofan. Mer foretrukket er substitusjonen i posisjon 169 med fenylalanin.

I tilfellet der aminosyren som tilsvarer posisjon 171 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), er substituert i en variant av foreliggende oppfinnelse, så er det foretrukket at den naturlig forekommende aminosyren tyrosin blir substituert med en aminosyre som er valgt fra gruppen som består av alanin, metionin, glysin. Mer foretrukket er substitusjonen i posisjon 171 med glysin.

I tilfellet der aminosyren som tilsvarer posisjon 245 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) er substituert i en variant av foreliggende oppfinnelse, så er det foretrukket at den naturlig forekommende aminosyren glutaminsyre er substituert med asparaginsyre, asparagin eller glutamin. Mer foretrukket er substitusjonen i posisjon 245 med asparaginsyre.

I tilfellet der aminosyren som tilsvarer posisjon 341 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) er substituert i en variant av foreliggende oppfinnelse, så er det foretrukket den naturlig forekommende aminosyren metionin er substituert med valin, alanin, leucin eller isoleucin. Mer foretrukket er substitusjonen i posisjon 341 med valin.

I tilfellet aminosyren som tilsvarer posisjon 349 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) er substituert i en variant av foreliggende oppfinnelse, så er det foretrukket at den naturlig forkommende aminosyren valin er substituert med alanin, glysin. Mer foretrukket er substitusjonen i posisjon 349 med alanin.

Som beskrevet i WO 02/34919, kan en substitusjon av aminosyren i posisjon 348 i s-GDH-sekvensen som tilsvarer villtypesekvensen som er isolert fra A calcoaceticus, bli anvendt til signifikant å forbedre glukosespesifisiteten til s-GDH. Fagpersoner vil i WO 02/34919 finne andre egnede posisjoner som kan bli substituert og kombinert med insersjonene ifølge foreliggende oppfinnelse.

I en foretrukket utførelsesform omfatter s-GDH-varianten ifølge foreliggende oppfinnelse i tillegg til insersjonen mellom aminosyrerestene 428 og 429 minst to aminosyresubstitusjoner som er valgt fra gruppen som består av posisjonene 171, 245, 341, 348 og 349 som tilsvarer aminosyreposisjonene på s-GDH-villtypesekvensen kjent fra A calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

I nok en annen foretrukket utførelsesform omfatter s-GDH-varianten ifølge foreliggende oppfinnelse i tillegg til insersjonen mellom aminosyrerestene 428 og 429 minst tre aminosyresubstitusjoner som er valgt fra gruppen som består av posisjonene 171, 245, 341, 348 og 349 som tilsvarer aminosyreposisjonene på s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A calcoaceticus ( SEKV. ID. NR.: 2).

Som fagpersonen vil forstå er det mulig å foreta aminosyresubstitusjoner, f.eks. stille mutasjoner, som ikke påvirker egenskapene til s-GDH i en signifikant grad. Varianten ifølge foreliggende oppfinnelse vil imidlertid ikke ha mer enn 45 aminosyreendringer sammenlignet med SEKV. ID. NR.: 2. Fortrinnsvis vil varianten omfatte 20 eller færre aminosyresubstitusjoner, mer foretrukket bare 10 aminosyresubstitusjoner eller færre substitusjoner, vil være tilstede. s-GDH-varianter ifølge den foreliggende oppfinnelsen blir gitt i eksempeldelen. Disse variantene representerer også foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen. Variantene med minst glukose interferens som er funnet til nå, omfatter insersjonen mellom aminosyrene 428 og 429, fortrinnsvis med prolin, og mutasjonene Y171G, E245D, M341V og T348G eller mutasjonene L169F, Y171G, E245D, M341V og T348G. Disse to variantene er også ytterligere foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

Aminosyre-sekvensanalyse avslørte at sekvensmotivene funnet i villtype s-GDH fra A calcoaceticus på den ene siden og A baumannii på den andre siden, ser ut til å være svært konservative rundt posisjonene av vesentlig betydning for forbedring av spesifisiteten for glukose slik den er identifisert i foreliggende oppfinnelse, dvs. insersjonssetet rundt posisjonene 428 og 429 som tilsvarer villtype-s-GDH fra A calcoaceticus.

En variant av PQQ-avhengig s-GDH som omfatter aminosyresekvensen med AGNXaaVQK (SEKV. ID. NR.:2), representerer en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse. SEKV. ID. NR.: 2 tilsvarer posisjon 426-431 f ra A calcoaceticus-villtype-s-GDH eller til posisjon 427-432 i A Zjauma/7/7/7-villtype-s-GDH, men omfatter insersjonen av én aminosyre (Xaa) mellom posisjonene 428 og 429 (A calcoaceticus) eller mellom 429 og 430 (A baumannii).

I en foretrukket utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en variant-s-GDH som omfatter sekvensen G-N-Xaa-V-Q-K-D (SEKV. ID. NR.: 11). Fortrinnsvis er s-GDH-varianten som omfatter SEKV. ID. NR.: 11 ytterligere kjennetegnet ved at nevnte innskutte aminosyre Xaa er valgt fra gruppen som består av leucin, prolin, fenylalanin og metionin, mer foretrukket er Xaa en prolinrest.

Som ytterligere forklart ovenfor kan aminosyren asparagin i posisjon 428 i villtype s-GDH være utsatt for en aminosyresubstitusjon. I dette tilfellet vil SEKV. ID. NR.: 11 omfatte den substituerte aminosyren istedenfor P428.

Utallige muligheter er kjent på fagområdet for å fremstille mutantproteiner. Basert på de viktige funnene i foreliggende oppfinnelse som beskriver den kritiske viktigheten av en aminosyre insersjon mellom posisjonene 428 og 429 så kan fagpersonen nå lett fremstille ytterligere egnede varianter av s-GDH. Slike varianter kan for eksempel bli fremskaffet ved fremgangsmåtene som er kjent som tilfeldig mutagenese (Leung, D. W., et al., Technique 1 (1989) 11-15) og/eller rettet mutagenese (Hill, D. E., et al. Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568). En alternativ fremgangsmåte for å fremstille et protein med de ønskede egenskapene er å tilveiebringe kimære konstrukter, som inneholder sekvenselementer fra minst to forskjellige kilder eller å fullstendig syntetisere et egnet s-GDH-gen. Slike prosedyrer som er kjent på fagområdet, kan bli anvendt i kombinasjon med informasjoen som er beskrevet i foreliggende oppfinnelse for å tilveiebringe mutanter eller varianter av s-GDH som omfatter f. eks. ytterligere aminosyresubstitusjoner i kombinasjon med den beskrevne insersjonen mellom posisjonene 428 og 429 ifølge SEKV. ID. NR.: 2.

En s-GDH-variant ifølge foreliggende oppfinnelse kan f. eks. fremstilles ved å starte fra et s-GDH-gen som isolert fra Acinetobacter calcoaceticus- type stamme LMD 79,41 så vel som å starte fra en homolog sekvens. I konteksten av denne søknaden er uttrykket "homolog" ment å omfatte en s-GDH-aminosyresekvens med minst 90 % identitet sammenlignet med SEKV. ID. NR.: 2. Med andre ord, etter hensiktsmessig sammenstilling ved anvendelse av PileUp-programmet er minst 90 % av aminosyrene i slik homolog s-GDH identisk med aminosyrene beskrevet i SEQ ID NO: 2.

Det vil bli forstått at variasjoner i DNA- og aminosyresekvenser eksisterer naturlig, eller kan med hensikt bli introdusert ved å anvende fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. Disse variasjonene kan resultere i opptil 10 % aminosyreforskjeller i den totale sekvensen, noe som skyldes delesjoner, substitusjoner, insersjoner, inversjoner eller addisjoner av én eller flere aminosyrerester i nevnte sekvens sammenlignet med SEKV. ID. NR.: 2. Slike aminosyresubstitusjoner kan bli gjort for eksempel på basis av likhet i polaritet, ladning, løselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller den amfipatiske naturen til restene som er involvert. Foreksempel inkluderer negativt ladde aminosyrer asparaginsyre og glutaminsyre, positivt ladde aminosyrer inkluderer lysin og arginin, aminosyrer med uladde, polare hodegrupper eller ikke-polare hodegrupper som har lignende hydrofilisititetsverdier inkluderer de følgende: leucin, isoleucin, valin, glysin, alanin, asparagin, glutamin, serin, treonin, fenylalanin, tyrosin. Andre forutsette variasjoner inkluderer salter og estere av de tidligere nevnte polypeptidene, så vel som forløpere for de tidligere nevnte polypeptidene, for eksempel forløpere som har N-terminal substitusjon, slik som metionin, N-formylmetionin anvendt som ledersekvenser.

Ifølge prosedyrer som er kjent på fagområdet eller ifølge prosedyren som er gitt i eksempeldelen, så er det mulig å fremskaffe polynukleotidsekvenser som koder for enhver av s-GDH-mutantene som er diskutert ovenfor. Oppfinnelsen omfatter derfor også isolerte polynukleotidsekvenser som koder for s-GDH-mutantproteiner som beskrevet ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse inkluderer ytterligere en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleinsyresekvens ifølge foreliggende oppfinnelse som er operativt bundet til en promotorsekvens som er i stand til å styre dens ekspresjon i en vertcelle.

Foreliggende oppfinnelse inkluderer ytterligere en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleinsyresekvens ifølge foreliggende oppfinnelse som er operativt bundet til en promotorsekvens som er i stand til å styre dens ekspresjon i en vertcelle. Foretrukne vektorer er plasmider, slik som pACSGDH som er vist i figurene 2 og 3.

Ekspresjonsvektorer som er hensiktsmessige i foreliggende oppfinnelse, inneholder typisk et replikasjonsorigo, en antibiotikaresistens til seleksjon, en promotor for ekspresjon og den hele eller en del av s-GDH-genvarianten. Ekspresjonsvektorene kan også inkludere andre DNA-sekvenser som er kjent på fagområdet, slik som signal-sekvenser (for en bedre folding, transportering inn i periplasma eller sekresjon), indusere for en bedre modulering av ekspresjonen, eller kløyvingsseter for kloning.

Egenskapene til den valgte ekspresjonsvektoren må være kompatible med vertcellen, som skal anvendes. For eksempel når man kloner i et E. coli -cellesystem, bør ekspresjonsvektoren inneholde promotorer isolert fra genomet til E. coli -celler (f. eks. lac eller trp). Egnede replikasjonsorigoer, slik som ColEl-plasmidreplikasjonsorigoet, kan anvendes. Egnede promotorer inkluderer for eksempel lac og trp. Det er også foretrukket at ekspresjonsvektoren inkluderer en sekvens som koder for en seleksjonsmarkør, slik som et antibiotikaresistensgen. Som selekterbare markører kan ampicillinresistens eller ka na mycin resistens hensiktsmessig bli anvendt. Alle disse materialene er kjent på fagområdet og er kommersielt tilgjengelige.

Egnede ekspresjonsvektorer som inneholder de ønskede kodende- og kontroll-sekvensene kan konstrueres ved å anvende standard, rekombinant DNA-teknikker som er kjent på fagområdet, der mange av dem er beskrevet i Sambrook et al., i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1980) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Foreliggende oppfinnelse vedrører i tillegg vertceller som inneholder en ekspresjonsvektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for hele eller en del av mutant-s-GDH. Vertcellene inneholder fortrinnsvis en ekspresjonsvektor som omfatter hele eller en del av DNA-sekvensene som har én eller flere mutasjoner som vist i eksemplene 2-8. Egnede vertceller inkluderer for eksempel E. coli HB101 (ATCC 33694) tilgjengelige fra Pomega (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA9, XLl-Blue MRF' tilgjengelige fra Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) og lignende.

Ekspresjonsvektorer kan introduseres inn i vertceller ved fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. For eksempel kan transformasjon av vertceller med ekspresjonsvektor bli utført ved polyetylenglykol-mediert protoplast-transformasjonsfremgangsmåte (Sambrook et al. 1989 ovenfor). Andre fremgangsmåter for å introdusere ekspresjonsvektorer inn i vertceller for eksempel elektroporering, biolistisk injeksjon eller protoplast-fusjon kan imidlertid også bli anvendt.

Så snart en ekspresjonsvektor som inneholder en s-GDH-variant har blitt introdusert inn i en egnet vertcelle, kan vertcellen bli dyrket ved betingelser som tillater ekspresjon av de ønskede s-GDH-variantene. Vertceller som inneholder den ønskede ekspresjonsvektoren med DNA-sekvensen som koder for hele eller en del av den mutante s-GDH, kan enkelt bli identifisert ved f. eks. antibiotika-seleksjon. Ekspresjonen av s-GDH-variantene kan bli identifisert ved forskjellige fremgangsmåter, slik som å måle produksjon av s-GDH-mRNA-transkripter, deteksjon av genprodukt immunologisk eller deteksjon av den enzymatiske aktiviteten til genproduktet. Fortrinnsvis blir en enzymatisk analyse anvendt.

Foreliggende oppfinnelse beskriver også fremstillingen og screeningen av s-GDH-varianter. Tilfeldig mutagenese og metningsmutagenese blir utført slik det er kjent på fagområdet. Varianter blir screenet for substratspesifisitet (aktivitet med glukose sammenlignet med maltose) og KM-verdien for glukose. Analysebetingelsene som velges tilpasses for å sikre at de forventede, små forbedringene som frembringes f. eks. ved en enkelt aminosyresubstitusjon, kan bli målt. Én måte for seleksjon eller screening av egnede mutanter er gitt i eksempel 3. Enhver endring eller forbedring sammenlignet med villtypeenzymet kan på denne måten tydelig påvises.

Det bør naturligvis forstås at ikke alle ekspresjonsvektorer og DNA-regulatoriske sekvenser vil fungere like godt for å uttrykke DNA-sekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse. Heller ikke vil alle vertceller fungere like godt med det samme ekspresjons-systemet. Fagpersonen vil imidlertid gjøre et hensiktsmessig valg blant ekspresjonsvektorene, DNA-regulatoriske sekvenser og vertceller ved å anvende rettledningen som er tilveiebrakt her uten unødvendig eksperimentering.

Oppfinnelsen vedrører også en prosess for å fremstille s-GDH-varianter ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter å dyrke en vertcelle ifølge oppfinnelsen ved betingelser som er egnede for fremstilling av de mutante-s-GDH ifølge oppfinnelsen. For bakterievertceller er typiske dyrkingsbetingelse flytende medium som inneholder karbon-og nitrogenkilder, det egnede antibiotikum og induksjonsmiddel (avhengig av ekspresjonsvektoren som blir anvendt). Typisk egnede antibiotikum inkluderer ampicillin, canamycin, kloramfenikol, tetrasyklin og lignende. Typiske induksjonsmidler inkluderer IPTB, glukose, laktose og lignende.

Det er foretrukket at polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er fremskaffet ved produksjon i vertceller som uttrykker en DNA-sekvens som koder for den mutante s-GDH. Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli fremskaffet ved in wtro-translasjon av mRNA som er kodet for av en DNA-sekvens som koder for den mutante s-GDH. DNA-sekvensene kan foreksempel bli syntetisert som beskrevet ovenfor og satt inn i en egnet ekspresjonsvektor, som i sin tur kan bli anvendt i et in vitro-transkripsjons/translasjonssystem.

En ekspresjonsvektor som omfatter et isolert polynukleotid som definert og beskrevet ovenfor operativt bundet til en promotorsekvens som er i stand til å fremme dens ekspresjon i et cellefritt peptidsyntesesystem, representerer en annen foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

Polypeptidene som er fremstilt f. eks. ved prosedyrer som er beskrevet ovenfor, kan deretter bli isolert og renset ved å anvende forskjellige, rutinemessige protein- ren sete kn ikke r. For eksempel kan kromatog raf i prosedyrer, slik som ionebytter-kromatografi, gelfiltreringskromatografi og affinitetskromatografi bli anvendt. Én av de viktigste anvendelsene av de forbedrede s-GDH-variantene ifølge denne oppfinnelsen er anvendelsen i teststrips for å monitorere blodg lu kosen ivå i diabetespasienter. Insensiviteten til PQQ-avhengig glukosedydrogenase mot oksygen er, som beskrevet ovenfor, en stor fordel i forhold til glukoseoksidase. Mer viktig, i og med at s-GDH-varianten har forbedret spesifisitet mot glukose og signifikant redusert enzymatisk aktivitet mot andre sukkertyper, så er interferensen som skyldes maltose, galaktose og/eller andre beslektede sukkertyper som kan være tilstede i en prøve som skal bli analysert, signifikant redusert. Selvfølgelig kan mange typer prøver bli undersøkt. Kroppsvæske, slik som serum, plasma, tarmsaft eller urin er foretrukne kilder for slike prøver.

Oppfinnelsen omfatter også fremgangsmåte for å påvise, bestemme eller måle glukose i en prøve ved å anvende en s-GDH-mutant ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er spesielt foretrukket at den forbedrede fremgangsmåten for påvisning av glukose i en prøve er kjennetegnet ved at nevnte påvisning, bestemmelse eller måling av glukose blir utført ved å anvende en sensor eller en teststri pinn retn ing.

Også innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse er en innretning for påvisningen eller målingen av glukose i en prøve som omfatter en s-GDH-mutant ifølge denne oppfinnelsen, i tillegg til andre reagenser som er nødvendige for nevnte måling.

s-GDH-variantene med forbedret substratspesifisitet ifølge denne oppfinnelsen kan også bli anvendt med stor fordel i biosensorer (D'Costa, E. J., et al., Biosensors 2

(1986) 71-87, Laurinavicius, V., et al., Analytical Letters 32 (1999) 299-316, Laurinavicius, V., et al. Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281, Malinauskas, A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100 (2004) 395-402) til online-overvåkning av glukose i en prøve eller en reaktor. For dette formålet kan s-GDH-variantene for eksempel bli anvendt for å belegge en oksygeninsensitiv glasselektrode med et osmium-kompleks inneholdende et redoks ledende epoksynettverk (Ye et al., 1993 ovenfor) til mer nøyaktig bestemmelse av glukosekonsentrasjonen.

Det finnes også andre mulige anvendelser for s-GDH-variantene med den forbedrede substratspesifisiteten ifølge denne oppfinnelsen. Disse s-GDH-variantene kan foreksempel bli anvendt i en aldonsyre produksjonsprosess. Villtype-s-GDH haren høy omsetning i substrat oksidasjon som produserer glukonsyre og andre aldonsyrer. Ved å anvende s-GDH-variantene, som er mer spesifikke for glukose, vil fremstillingen av glukonsyre føre til mye færre biprodukter. Med andre s-GDH-varianter med forskjellige substratspesifisiteter er det mulig å fremstille forskjellige aldonsyrer som påkrevd.

I de følgende eksemplene ble alle reagenser, restriksjonsenzymer og andre materialer fremskaffet fra Roche Diagnostics, Tyskland, hvis ikke en annen kommersiell kilde er spesifisert, og anvendt i overensstemmelse med instruksjonene som er gitt av produsentene. Operasjoner og fremgangsmåter som er anvendt til rensingen, karakteriseringen og kloning av DNA er innenfor det som er kjent på fagområdet (Ausubel, F, et al., i "Current protocols in molecular biology" (1994) Wiley Verlag) og kan bli tilpasset som nødvendig av fagpersonen.

De følgende eksemplene illustrerer ytterligere foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Kloning og ekspresjon av villtype-A. calcoaceticus løselig PQQ-avhengig glukosedehydrogenase i E. coli.

s-GDH-genet ble isolert fra Acinetobacter calcoaceticus stamme LMD 79.41 ifølge standardprosedyrer. Villtype s-GDH-genet ble subklonet inn i et plasmid inneholdende mgl-promotoren for justerbar ekspresjon (jfr. patentsøknad WO 88/09373). Det nye konstruktet ble kalt pACSGDH (se figurene 2 og 3). De rekombinante plasmidene ble introdusert inn i en vertsorganisme valgt fra E. coli -gruppen. Disse organismene ble deretter dyrket ved egnede betingelser og kolonier som viste s-GDH-aktivitet, ble valgt.

Plasmidet pACSGDH ble isolert fra en 200 ml overnatt kultur av klonen nevnt ovenfor ved å anvende Qiagen Plasmid Maxi Kit (Quiagen) ifølge produsentens protokoll. Plasmidet ble resuspendert i 1 ml dobbeltdestillert vann. Konsentrasjonen av plasmidet ble bestemt ved å anvende et Beckman DU 7400 Photometer.

Utbyttet var 600 ug. Deretter ble kvaliteten til plasmidet bestemt ved agarosegel-elektroforese.

Eksempel 2

Generering av mutant T348g

Som et viktig utgangstemplat for fremstillingen av insersjonsvarianter ble en mutant-s-GDH med mutasjon T348G fremstilt. Denne mutanten av s-GDH ble valgt fordi den er kjent for å ha redusert aktivitet for maltose sammenlignet med glukose (se WO 02/34919).

QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Kat.nr. 200518) ble anvendt for å substituere treoninet i posisjon 348 med et glysin. De egnede primerne ble designet.

5'-primeren og 3'-primeren som ble anvendt til mutagenese var komplementære med hverandre og inneholdt det modifiserte kodon for byttingen fra treonin til glysin (ACA til GGG) i en sentral posisjon. Disse nukleotidene var flankert av 12 til 16 nukleotider ved hver ende. Sekvensene av nukleotidene var identiske med sens- og antisens-DNA-tråden som flankerer kodonet for aminosyreendringen. Istedenfor kodon ACA = treonin for sens-

og TGT for antisenstråden inneholdt primerne GGG = glysin for sens- og CCC for antisenstråden (se SEKV. ID. NR.: 3 og 4).

PCR-reaksjonen og DpnJ-spaltingen ble utført i overensstemmelse med manualen. Etter dette ble 1 ul med prøve anvendt til elektroporeringen av XL-MRF'-celler. Elektroporering ble oppnådd med 2,5 KV i 0,2 cm kyvetter ved å anvende en BioRad-E. coli -pulser (BioRad). Etter vekst i 1 ml LB ved 37 °C i én time ble bakterier platet ut på LB-ampicillin-agarplater (100 ug/ml ampicillin) og dyrket over natt ved 37 °C. De muterte s-GDH-klonene ble undersøkt ved å anvende den følgende screeningsfremgangsmåten.

Eksempel 3

Screening

Mutantkoloniene på agarplatene som er beskrevet ovenfor ble plukket inn i mikrotiterplater (MTP) inneholdende 200 ul LB-ampicillin-medium/brønn og inkubert over natt ved 37 °C. Disse platene kalles masterplater.

Fra hver masterplate ble 5 ul prøve/brønn overført til en MTP inneholdende 5 ul pr. brønn med B (B = Bacterial Protein Extraction Reagent, Pierce No. 78248) for celleoppbrytning og 240 ul 0,0556 mM pyrollokinolinkinon (PQQ), 50 mM hepes, 15 mM CaCI2, pH 7,0/brønn for aktivering av s-GDH ble tilsatt. For å fullføre dannelsen av holoenzymet ble MTPen inkubert ved 25 °C i 2 timer og ved 10 °C over natt. Denne platen kalles arbeidsplaten.

Fra arbeidsplaten ble 3 x 10 ul prøve/hull overført til tre tomme MTPer. Etter dette ble én testet med glukose ved standardkonsentrasjon, den andre med en redusert glukosekonsentrasjon (1,9 mM istedenfor 30 mM) og den tredje med maltose eller et annet valgt sukkermolekyl som substrat. Alle valgte andre sukkermolekyler ble anvendt i ekvimolar standardkonsentrasjon, det vil si med 30 mM. Til alle analyser ble 90 ul med mediatorløsning (se eksempel 7) som allerede inneholdt sukkeret som skulle bli analysert, tilsatt.

dE/minutt ble beregnet, og verdien ved å anvende 30 mM glukose som substrat ble satt til 100 % aktivitet. Verdien som ble oppnådd med det andre sukkeret, ble sammenlignet med glukoseverdien og beregnet i prosentvis aktivitet ((f.eks. for maltose som: dE/minutt maltose/dE glukose)<*>100). Dette er ekvivalent med kryssreaktiviteten til (variant) enzymet.

Verdien som er fremskaffet med 1,9 mM glukose ble sammenlignet med verdien for 30 mM glukose og beregnet til prosentvis aktivitet ((dE/min 1,9 mM glukose/30 mM glukose)<*>100). Dette gir en %-vis verdi som er en indirekte indikator på KM-verdien for varianten som er analysert. Ifølge denne beregningen tyder en høyere %-verdi på en lavere (= bedre) KM-verdi.

Den følgende mutanten har blitt identifisert:

Eksempel 4

Sekvensering av mutant s-GDH-gen fra seterettet mutagenese

Plasmidet som inneholder genet for mutant S-GDH-T348G, der den mutanten har en 25-30 % maltose/glukosekryssreaktivitet ble isolert (High Pure Plasmid Isolation Kit, Roche Diagnostics GmbH, nr. 175478) og sekvensert ved å anvende et ABI Prism Dye Terminator Sequencing Kit og ABI 3/73 og 3/77 sekvensator (Amersham Pharmacia Biotech).

De følgende primerne ble anvendt:

Resultat:

Ønsket mutasjon på DNA- og aminosyrenivå har blitt oppnådd, noe som førte til endring fra Ttil G i posisjon 348 (modent enzym). Ingen ytterligere mutasjon på genet har blitt funnet.

Eksempel 5

Fremstilling av insersjonsvarianter på basis av mutant T348G

Insersjonsvarianter ble fremstilt ved å anvende QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, kat. nr. 200518). De egnede primerne for insersjonen mellom aminosyreposisjonene 428 og 429 (se sekvens: ID NR. 2) ble designet og en PCR med en mutant av s-GDH (mutant T348G, se eksempel 4) ble utført ifølge produsentens beskrivelse.

For primerne ble de respektive kodon på insersjons-posisjonen syntetisert tilfeldig for å få alle mulige 20 aminosyreendringer. Disse kodon-nukleotidene ble flankert av 11 til 13 nukleotider ved hver ende.

Sens-tråd:

Antisens-tråd:

PCR-reaksjonen og DpnJ-spaltingen ble utført ifølge manualen. Etter dette ble

1 ul fra hver reaksjon anvendt i elektroporeringen av XLlF-celler som beskrevet ovenfor. Etter vekst i 1 ml LB ved 37 °C i 1 time ble bakterier platet ut på LB-ampicillin-agarplater (100 ug/ml ampicillin) og dyrket over natt ved 37 °C. De muterte s-GDH-klonene ble

utsatt for den beskrevne screeningsprosedyren. For å sikre statistisk at varianter med de 20 mulige aminosyre insersjonene ble screenet, ble 200 kloner testet. Kloner med endret substratspesifisitet ble underkastet plasmidisolering og sekvensert som beskrevet ovenfor.

Resultater:

Eksempel 6:

Fremstilling av ytterligere insersjonsmutanter med høy substratspesifisitet for glukose sammenlignet med maltose

I WO 02/34919 har flere aminosyreendringer på forskjellige posisjoner av s-GDH blitt identifisert til å forsterke substratspesifisiteten for glukose sammenlignet med f. eks. maltose. Kombinasjoner av aminosyreendring T348G med aminosyresubstitusjoner på andre posisjoner, for eksempel i posisjonene 169, 171, 245, 341 og/eller 349 forsterket substratspesifisiteten ytterligere. To av mutantene som er beskrevet der med substratspesifisiteter for maltose/glukose på henholdsvis 3,5 og 7 %, ble valgt for å motta insersjonen (i dette tilfellet prolin) ifølge foreliggende oppfinnelse mellom posisjonene 428 og 429. Insersjonen ble utført ved å anvende primerne ifølge SEKV. ID. NR.: 9 og 10.

Plasmid-DNA-isoleringen av templatene, seterettet mutagenese-PCR, elektroporering, screening, DNA-sekvensering av valgte mutanter ble utført som beskrevet ovenfor.

Resultater:

Det kan tydelig sees fra tabellen ovenfor at substratspesifisiteten maltose/- glukose har endret seg dramatisk. Maltosekonverteringen har blitt funnet å være minsket fra 105 % til 2-4 %, sammenlignet med maltose/glukosekonverteringen til villtype-s-GDH. Mutantene C/l og D/l ble undersøkt i detalj.

Eksempel 7

Rensing og analyse av enzymatisk aktivitet for villtype- eller variant s-GDH

De dyrkede cellene (LB-Amp., 37 °C) ble høstet og resuspendert i kaliumfosfatbuffer, pH 7,0. Celleoppbrytning ble utført ved hjelp av French-Press-passering (700-900 bar). Etter sentrifugering ble supernatanten satt på en S-Sefarose-kolonne (Amersham Biosciences) ekvilibrert med 10 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,0. Etter vasking ble s-GDH eluert ved å anvende en saltgradient 0-1 M NaCI. Fraksjonene som viser s-GDH-aktivitet ble slått sammen, dialysert mot kaliumfosfatbuffer, pH 7,0, og kromatografert på nytt på en ny-ekvilibrert S-Sefarose-kolonne. De aktive fraksjonene ble slått sammen og underkastet en gelfiltrering ved anvendelse av en «Superdex»-200-kolonne (Amersham Biosciences). De aktive fraksjonene ble slått sammen og lagret ved -10 °C.

Enzymanalyse og proteinbestemmelse for renset henholdsvis villtype- og variant-s-GDH.

Proteinbestemmelse ble utført ved anvendelse av Protein Assay Reagent nr. 23225 fra Pierce (kalibreringskurve med BSA, 30 minutter, 37 °C).

GDH-prøvene ble fortynnet til 1 mg protein/ml med 0,0556 mM pyrollokinolinkinon (PQQ), 50 mM hepes, 15 mM CaCI2, pH 7,0, og inkubert ved 25 °C i 30 minutter for rekonstituering eller aktivering.

Etter aktivering ble prøvene fortynnet med 50 mM hepes, 15 mM CaCI2, pH 7,0 til omtrent 0,02 U/ml og 50 ul av hver fortynnet prøve ble tilsatt til 1000 ul av en 0,2 M citratbufferløsning (pH 5,8; ved 25 °C) inneholdende 0,315 mg (4-(dimetylfosfinylmetyl)-2-metylpyrazolo[l,5a]imidazol-3-yl)(4-nitrosofenyl)-amin (se patent US 5 484 708)/ml som en mediator og 30 mM sukker).

Ekstinksjon ved 620 nm blir overvåket i løpet av de første 5 minuttene ved 25 °C.

Én enhet enzymaktivitet tilsvarer konverteringen av 1 mMol mediator/min ved analysebetingelsene ovenfor.

Beregning: Aktivitet = (totalt volum<*>dE/min [U/ml]) : (e<*>prøvevolum<*>l)

(e = ekstinksjon-koeffisient, e62onm = 30[l<*>mmor<1*>cm"<1>]).

Denne analysen ble utført med henholdsvis glukose og maltose (Merck, Tyskland).

Resultater:

Det er åpenbart fra tabellene ovenfor at de nye variantene C/l og D/l, som omfatter en insersjon mellom posisjonene 428 og 429 i s-GDH, representerer ytterligere forbedringer med hensyn til maltose/glukose-kryssreaktiviteten. På tross av de forskjellige aminosyresubstitusjonene og på tross av insersjonen, så er den enzymatiske aktiviteten for glukose pr. mg/protein fremdeles mer enn 10 % av den tilsvarende villtype enzymatiske aktiviteten.

Eksempel 8

Bestemmelse av glukose i nærvære eller fravær av maltose.

Henholdsvis villtype-s-GDH og variantene C/l og D/l av s-GDH kan bli anvendt for glukosebestemmelse i nærvær eller fravær av maltose. Referanseprøven inneholder 50 mg glukose/dl. "Testprøven" inneholder henholdsvis 50 mg glukose/dl og 100 eller 200 mg/dl maltose. De samme mengdene av GDH-aktivitet (U/ml, se enzymanalysen ovenfor) blir anvendt i hver analyse.

I en kyvette blir det blandet:

1 ml 0,315 mg (4-(dimetylfosfinylmetyl)-2-metylpyrazolo-[l,5a]-imidazol-3-yl)-(4-nitrosofenyl)-amin ml/0,2 M citrat pH 5,8.

0,033 ml referanse eller testprøve

Analysen startes ved å tilsette 0,050 ml s-GDH (som er et overskudd av s-GDH for konvertering av glukose) til kyvetten. Endringen i absorpsjon ved 620 nm overvåkes. Etter 2-5 minutter observeres konstante verdier og dE/5 minutter beregnes. Verdien som fremskaffes ved å måle referanseprøven med villtype-s-GDH settes til 100 %. De andre verdiene sammenlignes med denne referanseverdien og beregnet i %.

Resultater:

Klart mindre maltose-interferens blir påvist i testprøvene når man anvender de nye variantene. Det er åpenbart at konsentrasjonen av s-GDH for best mulig å skille glukose fra maltose i en prøve kan ytterligere bli optimalisert. For mye enzym vil øke maltosekonverteringen, for lite enzym vil ikke konvertere all glukosen, og slik vil ikke noe endepunkt for absorpsjon bli nådd.

Liste over referanser

Anthony C, Biochem. J. 320 (1996) 697-711

Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727

Anthony, C. and Ghosh, M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69 (1998) 1-21

Anthony, C, Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417

Anthony, C, Adv. in Phot. and Resp. 15 (2004) 203-225

Ausubel, F., et al., in "Current protocols in molecular biology" (1994), Wiley Verlag Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79

Cleton-Jansen, A. M., et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125

Cleton-Jansen, A. M., et al., Mol. Gen. Genet 217 (1989) 430-436

Davidson, V. L. in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole book,

New York, Marcel Dekker

Davies, D., Perit. Dial. Int. 14 (1994) 45-50

D'Costa, E. J., et al., Biosensors 2 (1986) 71-87

Dokter, P., et al., FEMS Microbiology Letters 43 (1987) 195-200

Dokter, P., et al., Biochem J. 239 (1986) 163-167

Dokter, P., et al., Biochem J. 254 (1988) 131-138

Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter

in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press Duine, J. A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23

Duine, J. A., Eur. J. Biochem. 200 (1991) 271-284

EP 0 620 283

EP 1 167 519

EP 1 176 202

EP 1 367 120

Feng, D. F. and Doolittle, R. F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351-360

Frampton, J. E.. and Plosker, G. L., Drugs 63 (2003) 2079-2105

Goodwin, P. M. and Anthony, C, Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80

Hill, D. E., et al., Methods Enzymol. 155 (1987) 558-568

Igarashi, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824

JP 11243949

JP2004173538

Kaufmann, N., et al. Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised venous blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Mannheim, Boehringer Mannheim GmbH

Kim, C. H. et al., Current Microbiology 47 (2003) 457-461

Laurinavicius, V., et al., Analytical Letters 32 (1999) 299-316

Laurinavicius, V., et al., Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281

Laurinavicius, V. et al, Biologija (2003) 31-34

Leung, D. W., et al., Technique 1 (1989) 11-15

Malinauskas, A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100 (2004) 395-402 Matsushita, K. and Adachi, O. Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63,

New York, Marcel Dekker

Matsushita, K., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72

Matsushita, K., et al., Biochemistry 28 (1989) 6276-6280

Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555 Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48

Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-13861

Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151

Oubrie, A. and Dijkstra, B. W., Protein Sei. 9 (2000) 1265-1273

Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194

Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333

Oubrie, A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A 96 (1999) 11787-11791

Reddy S, and Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438

Sambrook, J., et al., in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989) -, Cold Spring

Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press

US 5,484,708

US 5,997,817

US 6,057,120

US 6,103,509

Wens, R., et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609

WO 02/34919

WO 88/09373

Yamada, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192

Ye, L., et al., Anal. Chem. 65 (1993) 238-241

Claims (18)

1. Variant av den løselige formen av EC 1.1.99.17 som også er kjent som PQQ-avhengig, løselig glukosedehydrogenase (s-GDH), karakterisert vedat nevnte variant omfatter insersjonen av én aminosyrerest mellom aminosyreposisjonene tilsvarende posisjonene 428 og 429 i s-GDH-villtypesekvensen som er kjent fra A calcoaceticus (SEKV. ID. NR.: 2), hvor nevnte, innsatte aminosyre er prolin, en substitusjon av treonin i posisjon 348 med en aminosyrerest valgt fra gruppen som består av alanin, glysin og serin, og eventuelt i tillegg omfatter én eller flere ytterlige aminosyresubstitusjoner, hvor nevnte variant er minst 90 % identisk med SEKV ID NR. 2.

2. Variant av PQQ-avhengig s-GDH ifølge krav 1, hvor den omfatter minst én aminosyresubstitusjon i aminosyreposisjonen som tilsvarer posisjon 428.

3. Variant av PQQ-avhengig s-GDH ifølge krav 2, hvor asparagin i posisjon 428 er substituert med en aminosyrerest valgt fra gruppen som består av leucin, prolin og valin.

4. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor den omfatter substitusjoner i begge posisjonene 348 og 428.

5. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor den ytterligere omfatteren substitusjon i posisjon 171.

6. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor den ytterligere omfatteren substitusjon i posisjon 245.

7. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor den ytterligere omfatteren substitusjon i posisjon 341.

8. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor den ytterligere omfatteren substitusjon i posisjon 169.

9. Variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor den ytterligere omfatteren substitusjon i posisjon 349.

10. Isolert polynukleotid, karakterisert vedat det koder for s-GDH-variantproteinet ifølge et hvilket som helst av kravene av kravene 1 til 9.

11. Ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den omfatter et isolert polynukleotid ifølge krav 10, operativt koblet til en promotorsekvens som er i stand til å fremme ekspresjon av nevnte polynukleotid i en vertcelle.

12. Vertcelle, karakterisert vedat den omfatter ekspresjonsvektoren ifølge krav 11.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av s-GDH-varianter, karakterisert vedat den omfatter dyrking av vertcellen ifølge krav 12 ved betingelser som er egnet for fremstilling av enzymvariantene.

14. Ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den omfatter et isolert polynukleotid ifølge krav 10, operativt koblet til en promotorsekvens som er i stand til å fremme dens ekspresjon i et cellefritt, peptidsyntesesystem.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av s-GDH-varianter, karakterisert vedat den foregår med konstruktet ifølge krav 14 i et cellefritt peptidsyntesesystem ved betingelser som er egnet for fremstilling av nevnte enzymvarianter.

16. Fremgangsmåte for påvisning, bestemmelse eller måling av glukose i en prøve ved å anvende en s-GDH-variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9,karakterisert vedat forbedringen omfatter å kontakte prøven med nevnte variant.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, hvor nevnte påvisning, bestemmelse eller måling av glukose blir utført ved å benytte en sensor eller en teststrippinnretning.

18. Innretning for påvisningen eller målingen av glukose i en prøve,karakterisert vedat den omfatter en s-GDH-variant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 og andre reagenser som er nødvendige for nevnte måling.