KR101854602B1 - 아스페르길루스 니게르로부터 유도된 신규한 글루코오스 옥시다아제 - Google Patents

아스페르길루스 니게르로부터 유도된 신규한 글루코오스 옥시다아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가로 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서 폴리펩타이드 서열에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가지는 신규한 글루코오스 옥시다아제 변이체를 개시한다. 이에 따라 최적화된 글루코오스 옥시다아제 변이체는 글루코오스에 대한 특이성 및 현저하게 감소된 산소 소비율을 나타낸다. 다른 측면에서, 본 발명은 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 전자 매개체에 대한 증가된 효소 활성을 가지는 글루코오스 옥시다아제 변이체를 제공한다. 본 발명은 개선된 혈당 측정을 위해 본원에 개시된 하나 이상의 GOx 변이체를 포함하는 어세이 장치를 또한 제공한다.

Description

아스페르길루스 니게르로부터 유도된 신규한 글루코오스 옥시다아제 {NOVEL GLUCOSE OXIDASES DERIVED FROM ASPERGILLUS NIGER}
본 발명은 신규한 글루코오스 옥시다아제 변이체에 관한 것이다. 본원에서 제공된 글루코오스 옥시다아제는 글루코오스 기질에 대해 특이적이고, 이에 따라 현저하게 감소된 산소 소비율을 나타낸다. 다른 측면에서, 본 발명은 글루코오스 기질에 대해 특이적이고, 이에 따라 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 전자 매개체에 대한 현저하게 증가된 효소 활성을 나타내는 글루코오스 옥시다아제를 제공한다. 추가로, 본 발명은 글루코오스의 측정을 위한 센서 및 키트에서 사용하기 위한 상기 글루코오스 옥시다아제에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가로 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 로부터 유도된 글루코오스 옥시다아제에 관한 것이다.
진성 당뇨병은 전세계에서 광범위하게 발견될 수 있는 대사성 질환을 반영한다. 당뇨병 환자는 혈당 수준을 조절하는 인슐린 호르몬의 손상 또는 누락 생산을 가지고, 이에 따라 이들 환자는 부적절한 인슐린 적용의 경우에서 고혈당증 뿐만 아니라 저혈당증의 위험을 가진다 [ Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycaemia. WHO , and IDF (2006); WHO Document Production service ISBN 9241594934].
인슐린의 올바른 적용을 보장하기 위해서, 자가 측정 시스템과 임상적 규모의 고처리량 측정 시스템 둘 다를 위한 매우 특이적이고 정확하고 조작하기 쉬운 글루코오스 측정 시스템이 필요하다.
혈중 글루코오스 농도의 적절한 측정을 가능하게 하고 측정을 매우 특이적으로 하기 위해서, 효소 반응이 관여한다. 요즘, 당뇨병 분석학에서 사용되는 2 가지 유형의 효소는 데하이드로게나아제 (이하, GDH) 및 글루코오스 옥시다아제에 의해 반영된다 [ Hones , J., Muller , P., and Surridge , N. (2008). The Technology Behind Glucose Meters : Test Strips . DIABETES TECHNOLOGY & THERAPEUTICS 10, 10-26].
GDH 의 주요 장점은 글루코오스의 산소-비의존적 산화이지만, 이 효소는 특정한 다른 임상적 관련 당에 대해 약간의 부수적 활성을 나타내고, 이에 따라 GDH 는 비특이적이다 [Olsthoorn, A.J., and Duine , J.A. (1998). On the mechanism and specificity of soluble, quinoprotein glucose dehydrogenase in the oxidation of aldose sugars . Biochemistry 37, 13854-13861]. 이와 대조적으로, GOx 는 글루코오스에 대해 매우 특이적이지만, 이의 산화는 강력한 산소-의존적이다 [ Bankar , S.B., Bule , M.V., Singhal , R.S., and Ananthanarayan , L. (2009). Glucose Oxidase -- an overview . Biotechnology Advances 27, 489-501; Bentley , R., and Neuberger , A. (1949). The mechanism of the action of notation . Biochem J 45, 584-590].
보다 상세하게, 플라빈단백질로서의 GOx 는 옥시도리덕타아제 (즉, β-D-글루코오스: 산소 1-옥시도리덕타아제) 의 계열에 속한다. 천연 또는 야생형 (이하, WT) GOx 는 분자 산소를 전자 수용체로서 이용함으로써 β-D-글루코오스를 D-글루코노-δ-락톤 및 H2O2 로 산화하는 것을 촉매한다 (예를 들면, 문헌 [ Pazur , J.H., and Kleppe , K. (1964). The Oxidation of Glucose and Related Compounds by Glucose Oxidase from Aspergillus Niger . Biochemistry 3, 578-583] 참조). 상기 반응은 하기 식으로 묘사된다:
D-글루코오스 + O2 → 글루코노락톤 + H2O2
GOx 의 기질은 2 개의 군으로 나누어 질 수 있다: i) 산화 반쪽 반응의 전자 수용체 및 ii) 환원 반쪽 반응의 전자 공여체 (예를 들면, 문헌 [ Leskovac , V., Trivic , S., Wohlfahrt, G., Kandrac , J., and Pericin , D. (2005). Glucose Oxidase from Aspergillus niger : the mechanism of action with molecular oxygen , quinones , and one-electron acceptors . Int J Biochem Cell Biol 37, 731-750] 참조). 당업자는 D-글루코오스 이외에 D-글루코오스의 각종 유도체가 GOx 의 환원 반쪽 반응에 대한 잠재적 기질인 것으로 알고 있다.
다양한 기원으로부터의 GOx 가 지금까지 기술되었다. 예를 들면, 해조류 콘드루스 크리스푸스 (Chondrus crispus) 로부터의 GOx 는 US 7,544,795 및 US 6,924,366 에 기재되어 있고; 사상 진균 클라도스포리움 속 (Cladosporium spec.) 으로부터의 GOx 는 WO 95/29996; WO 1998/020136 에 기재되어 있고; 탈라로마이세스 플라부스 (Talaromyces flavus) 로부터의 GOx 는 US 6,054,318 에 기재되어 있다.
문헌 중에서 가장 잘 기재되어 있는 GOx 는 아스페르길루스 니게르로부터의 것이다 [Hecht, H.J., Schomburg , D., Kalisz , H., and Schmid , R.D. (1993). The 3D structure of glucose oxidase from Aspergillus niger . Implications for the use of GOD as a biosensor enzyme . Biosensors & Bioelectronics 8, 197-203; Wohlfahrt , G., Witt , S., Hendle , J., Schomburg , D., Kalisz , H.M., and Hecht , H.J. (1999). 1.8 and 1.9 A resolution structures of the Penicillium amagasakiense and Aspergillus niger glucose oxidases as a basis for modelling substrate complexes . Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 55, 969-977].
W0 89/126675 는 재조합 시스템에서 아스페르길루스 니게르로부터의 GOx 의 생산을 기재하고 있으며, WO 2008/079227 A1 은 향상된 저장 안정성을 부여하는 조성물로 제형화된 아스페르길루스 니게르로부터 수득된 GOx 에 관한 것이다.
이것은 160 kDa 크기의 이량체를 형성하는 잘 특성화된 단백질이며, 결정 구조는 이로부터 해결되었다 [ Hecht , H.J., et al ., Crystal - Structure Of Glucose - Oxidase From Aspergillus - Niger Refined At 2.3 Angstrom Resolution . Journal Of Molecular Biology, 1993. 229(1): p. 153-172].
특히, 아스페르길루스 니게르의 야생형 GOx (이하, GOx-WT) 는 현저한 온도 안정성 및 글루코오스 기질에 대한 특이성을 나타내는 것으로 또한 공지되어 있다. GOx 는 10-16% 의 높은 만노오스 유형 탄수화물 함량을 가지는 당단백질이다 [ Hayashi , S., and Nakamura, S. (1981). Multiple forms of glucose oxidase with different carbohydrate compositions . Biochim Biophys Acta 657, 40-51; Pazur , J.H., Kleppe , K., and Cepure , A. (1965). A glycoprotein structure for glucose oxidase from Aspergillus niger . Arch Biochem Biophys 111, 351-357].
요즘, GOx 는 산업용 용액에서 또는 피험자의 체액에서, 예를 들면, 혈액 및 소변에서 글루코오스를 검출하기 위한 바이오센서에 일반적으로 사용된다.
현재 이용가능한 자가 측정 장치의 대부분은 원칙적으로 하기로 이루어진 전기화학 센서이다:
a) 생물학적 성분, 즉, 글루코오스를 기질로서 가지는 각각의 효소,
b) 지시약 (전자 성분), 및
c) 신호 변환기.
측정 장치에서, 글루코오스로부터의 전자는 생물학적 성분 (a) 에 의해 매개체를 통해 전극 (b) 으로 이동한다. 이어서, 신호 변환기 (c) 는 전기 신호를 실시간 글루코오스 농도로 변환하는데, 이것은 이동 전자의 양에 비례한다.
상기에서 기재된 전기화학 센서 이외에, 이용가능한 측광 센서도 있다. 여기서의 차이점은 글루코오스로부터의 전자가 산화환원-지시 염료 (지시약으로서 역할을 함) 로 이동한다는 것이다. 환원된 염료의 생성된 색 변화를 측광학적으로 측정한다.
다른 주요 적용은 혈류로부터의 글루코오스를 연소하고 이로 인해 소형 진단 장치 또는 펌프를 작동시키는 이식된 소형화 바이오연료 전지의 애노드 구획에서의 GOx 의 사용이 될 수 있다.
더욱이, 식품 산업에서의 GOx 적용은 많은데, 이는 항균 효과를 가지는 과산화수소를 생성하는 이의 능력을 이용하여, 예를 들면, 치즈, 버터 및 과일 쥬스를 포함한 특정 식료품의 저장 안정성을 향상시킬 수 있기 때문이다.
화장용 조성물에서의 GOx 의 적용도 또한 항균 특성을 이용할 수 있다. 약제학적 조성물 및 화장용 조성물에서의 헥소오스 옥시다아제에 대한 잠재적 사용이, 예를 들면, US 6,924,366; US 6,251,626 및 WO 2007/045251 A2 에서 제안되었다.
또한, GOx 의 사용은 해충 또는 질환에 대해 감수성이 감소하거나 내성이 증가한 형질전환 식물 및 기타 유기체의 제조에서 제안된다 (예를 들면, WO 1995/021924 참조).
그러나, 글루코오스-바이오센서에서의 GOx 의 사용은 본 발명에 따른 중요한 관심 대상이다. 이와 관련하여, WO 2009/104836 A1 은 금속 표면에 대한 부착을 위해 개선된 유전자 조작 GOx 변이체를 포함하는 글루코오스 센서를 기재하고 있다.
Zhu 등은 2006 년 및 2007 년에 T30V 및/또는 I94V 에서 돌연변이되어 있는 아스페르질루스 니게르로부터 유도된 GOx 의 돌연변이체를 기재하였다. 따라서, 상응하는 이중 돌연변이체 T30V; I94V 도 또한 기술되었다 [ Zhu , Z., Momeu , C., Zakhartsev , M., and Schwaneberg, U. (2006). Making glucose oxidase fit for biofuel cell applications by directed protein evolution . Biosensors and Bioelectronics 21, 2046-2051; Zhu , Z., Wang , M., Gautam , A., Nazor , J., Momeu , C., R, P., and U, S. (2007). Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus niger for ferrocenemethanol -mediated electron transfer . Biotechnology Journal 2, 241-248] (이하, Zhu 등 (2006/2007)).
구체적으로, 치환 T30V 및 I94V 를 가지는 상기에서 기재된 이중 돌연변이체는 GOx-WT 와 비교하여 효소 활성이 약간 증가하고 (69.5/s 내지 137.7/s 의 kcat), 58℃ 내지 62℃의 범위의 증가된 열 안정성 및 8 내지 11 의 범위의 향상된 pH 안정성을 나타낸다. 그러나, 아스페르질루스 니게르로부터 유도된 상기 이중 돌연변이체는 GOx-WT 와 비교하여 동등한 산소 소비율을 나타낸다.
EP 2 415 863 A1 은 GOx 활성을 가지지만 아미노산 위치 2, 13, 30, 94 및 152 중 3 개 이상에서 돌연변이되어 있는 핵산 분자 및 이의 폴리펩타이드를 기재하고 있다. 특히, 치환 N2Y, K13E, T30V, I94V 및 K152R 을 가지는 EP 2 415 863 A1 의 M12 변이체는, 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 에서의 증가된 발현 수준 이외에도, 전자 수용체로서의 산소에 대한 2 배 증가된 활성을 보여준다.
Horaguchi 등 [ Horaguchi , Y., Saito , S., Ferri , S., Mori , K., Kojima , K., Tsugawa , W., and Sode , K. (2012). Turning Glucose Oxidase into Essentially Dehydrogenase. Meet . Abstr ., Volume MA2012 -02, Issue 18, Pages 2057] 은 2012 년에 여기서 기재된 GOx 변이체의 산화 반쪽 반응에 관여하고 있는 하나의 아미노산 잔기 위치를 확인하였으며, 상기 GOx 변이체는 페니실리움 아마가사키엔세 (Penicillium amagasakiense) 의 GOx 및 아스페르질루스 니게르의 GOx 변이체이다. 상기 하나의 위치는 페니실리움 아마가사키엔세의 GOx 변이체의 S114 및 아스페르질루스 니게르 변이체의 상응하는 T110 이다. 둘 다의 위치는 전자 수용체로서의 산소에 대한 활성의 감소를 초래하는 아미노산 알라닌으로 대체되었다. 예를 들면, 아스페르질루스 니게르의 GOx 변이체는 6.6 배 감소된 산소 소비율을 나타냈고, 이에 따라 363% 의 매개체 활성 이외에 30.4% 의 잔류 산소 활성을 가지고 있었다.
글루코오스에 비특이적인 GDH 및 산소-의존적 GOx 는 현재 글루코오스 측정 시스템의 열쇠 효소에 해당한다.
본 개시내용의 문맥에서, 표현 "글루코오스에 비특이적인", "산소-의존적" 및 "산소-의존성" 이란, 정의 섹션에서 제시된 의미를 가진다.
본 발명의 근본적인 문제에 대한 해결책은 진균 아스페르질루스 니게르로부터 유도된 특이적으로 변형되고, 이에 따라 최적화된 GOx 변이체의 제공이다.
놀랍고도 예기치 않게, 본 발명자들은 글루코오스에 대해 특이적이지만, 글루코오스 산화를 위한 산소로부터 비의존적이고, 이에 따라 글루코오스 측정에 보다 정확한 아스페르질루스 니게르로부터 유도된 신규한 GOx 변이체를 찾아 냈다.
더욱이, 본 발명은, 놀랍고도 예기치 않게, 글루코오스에 대해 특이적이고, 이로 인해 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 전자 매개체에 대한 현저하게 증가된 매개체 활성을 나타내는 신규한 GOx 변이체를 제공한다.
본 발명의 주제는 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가로 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 신규한 GOx 변이체이다.
본 개시내용의 맥락에서, 표현 "글루코오스에 대한 효소 특이성" 또는 "글루코오스에 대해 특이적인" 이란, 항목 ff) 하의 재료 및 방법에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, > 99.5% 또는 > 99.9%, 특히 100% 의 글루코오스 기질에 대한 본원에서 제공된 GOx 의 활성을 의미한다. 함축적으로, 글루코오스 이외의 당, 예를 들면, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스 및 말토트리오스에 대한 본원에서 제공된 GOx 의 잔류 활성은, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, < 6% 이다.
본 개시내용의 맥락에서, 표현 "현저하게 감소된 산소 소비율" 이란, 산소-의존성이 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이에 따라 발색성 기질 ABTS 의 산화에 의해 간접 측정될 때, 본원에서 제공된 GOx 변이체에 대해 3 분의 시간에 걸쳐 > 95% 의 잔류 산소 함량을 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 표현 "현저하게 감소된 산소 활성" 또는 "전자 수용체로서의 산소에 대한 현저하게 감소된 활성" 이란, 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 측정할 때, ≤ 30% 또는 < 25% 또는 < 20%, 특히 < 15% 또는 ≤ 10% 의 잔류 산소 활성을 특징으로 하는 GOx 활성을 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 표현 "현저하게 증가된 매개체 활성" 또는 "산소 이외의 전자 매개체에 대한 현저하게 증가된 활성" 이란, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 것의 산소 이외의 전자 매개체에 대한 1.5 배 이상의 증가 활성을 특징으로 하는 GOx 활성을 의미한다.
이렇게 최적화된 본 발명의 GOx 변이체는 개선된 혈당 측정 시스템에서 실시하기에 적합하다.
도 1
도 1 은 본원에서 제공된 GOx 변이체를 위한 산소에 대한 활성 측정의 원리를 도시한 것이다: GOx 및 HRP 의 환원 반쪽 반응 동안 생성된 H2O2 를 발색성 기질 ABTS 를 산화하는데 사용한다. ABTS 의 색 변화를 414 nm 에서의 흡수에 의해 모니터링한다. 이러한 원리는 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이의 기초를 형성한다.
도 2
도 2 는 매개된 전자 이동의 검출을 위한 매개체 어세이 또는 PMO-어세이 (포스포몰리브덴산) 를 도시한 것이다. 매개 화합물은 GOx 의 환원 반쪽 반응 동안 2 단계로 환원된다. 매개체는 2 개의 전자를 산화환원 지시약 PMO 에 전달하고, PMO 는 후속적으로 환원된다. 환원 동안 PMO 의 색 변화를 700 nm 에서의 흡수에 의해 모니터링한다.
도 3
도 3 은 본 발명에 따른 단백질 구조에서의 아미노산 치환을 위한 6 개의 위치의 뚜렷한 장소를 도시한 것이다.
도 4
도 4 는 본 발명에 따른 다양한 GOx-변이체의 산소 소비율을 도시한 것이다: a) 시간의 함수로서의 상대적 산소 농도의 진행; b) 분 당 상대적 산소 소비율. 어세이 실시는 항목 hh) 하의 재료 및 방법 섹션에서 기재되어 있다. 효소를 2 U/L 로 표준화하였다.
도 5
도 5 는 본 발명에 따른 다양한 GOx-변이체의 Michaelis-Menten 반응속도를 도시한 것이다. 활성 측정을 위해서, 특성화를 위한 매개체 어세이를 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 바와 같이 적용하였다. 파선은 최소 자승법을 적용하여 Microsoft Excel 에서 산출하였다.
도 6
도 6 은 본 발명에 따른 다양한 GOx-변이체의 열 안정성 특성을 도시한 것이다. 어세이는 항목 ii) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 바와 같이 수행하였다. 추가의 대조군으로서, 탈글리코실화 및 과글리코실화 GOx 를 사용하였다.
도 7
도 7 은 GOx-WT, GOx-T30V; I94V 및 본 발명의 GOx-변이체 V (즉, 치환 T30V; I94V 이외의 A173V; A332S; F414I; V560T) 의 상대적 산소 소비율을 도시한 것이다. 어세이 실시는 항목 hh) 하의 재료 및 방법 섹션에서 기재되어 있다. 효소 농도는 1.7 mg/L 로 표준화하였다.
도 8
도 8 은 글루코오스와 비교하여 다양한 당에 대한 GOx-WT, GOx-T30V; I94V 및 GOx 변이체 EX07 의 잔류 활성을 도시한 것이다. 잔류 활성의 측정을 위해서, 특성화를 위한 매개체 어세이를 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 기재된 바와 같이 적용하였다. 기질 농도는 반응 혼합물에서 181.8 mM 이었다.
도 9
도 9 는 GOx-WT, GOx-T30V; I94V 및 GOx 변이체 EZ07 에 대한 효소 파라미터를 도시한 것이다. 상기 파라미터는 Microsoft Excel 에서 최소 자승법을 적용하여 Michaelis-Menten 반응속도에 따라 산출하였다. 활성 측정을 위해서, 특성화를 위한 매개체 어세이를 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 기재된 바와 같이 적용하였다.
도 10
도 10 은 25℃ 와 67℃ 사이의 다양한 온도에서의 15 분 항온처리 후의 GOx-WT, GOx-T30V; I94V 및 GOx 변이체 EZ07 의 잔류 활성을 도시한 것이다.
놀랍고도 예기치 않게, 본 발명자들은, 글루코오스 기질에 대한 특이성을 유지하면서 현저하게 감소된 옥시다아제 활성 및 부수적으로 현저하게 증가된 데하이드로게나아제 활성을 가지는 산소-비의존적 GOx 변이체를 수득하기 위한 추가의 특이적 아미노산 치환(들)에 대한 기초로서 적합한 Zhu 등 (2006; 2007) 에서 기재된 GOx 이중 돌연변이체 T30V; I94V (이하, GOx-T30V; I94V 로 약기함) 를 찾아 냈다. 추가로, 본 발명자들은 산소 이외의 전자 매개체에 대한 현저하게 증가된 매개체 활성을 추가로 또는 단독으로 나타내는 본 발명에 따른 GOx 변이체를 찾아 냈다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 또한 전자 이동을 위한 산소 이외의 특정 전자 매개체를 수용하는 본 발명에 따른 GOx 변이체를 찾아 냈다. 따라서, 본 발명에 따른 GOx 변이체는 글루코오스 측정 개선, 특히 혈당 측정 개선에 적합하다.
본 개시내용의 문맥에서, 표현 "전자 이동을 위한 산소 이외의 특정 전자 매개체를 수용함" 이란, 매개된 전자 이동을 위한 니트로소아닐린 및 이의 유도체, 아조-화합물, 페나진 및 이의 유도체, 페노티아진 및 이의 유도체, 페녹사진 및 이의 유도체, 페로센 및 이의 유도체, 칼륨 페리시아나이드, Ru- 및 Os-착물, 퀴논 및 이의 유도체, 인도페놀, 비올로겐, 테트라티아풀발렌 및 이의 유도체, 및 프탈로시아닌과 상호작용하고, 이에 따라 이들을 수용하는 본원에서 제공된 GOx 변이체의 능력을 의미한다.
본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가로 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 아스페르질루스 니게르로부터 유도된 GOx 변이체에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가로 위치 A173; A332; F414; 및 V560 의 군으로부터 선택된 4 개의 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 아스페르질루스 니게르로부터 유도된 GOx 변이체에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 산소 소비율의 현저한 감소를 초래하는, 서열 번호: 1 에 따른 GOx 의 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 2 개 이상 또는 3 개 이상 또는 4 개 이상 또는 5 개 이상 또는 심지어 6 개 이상의 협력적이고, 따라서 다양한 아미노산 치환을 가지는 GOx 변이체에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 산소 소비율의 현저한 감소 및/또는 산소 이외의 특정 전자 매개체에 대한 매개체 활성의 현저한 증가를 초래하는, 서열 번호: 1 에 따른 GOx 의 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 2 개 이상 또는 3 개 이상 또는 4 개 이상 또는 5 개 이상 또는 심지어 6 개 이상의 협력적이고, 따라서 다양한 아미노산 치환을 가지는 GOx 변이체에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 옥시다아제 활성이 서열 번호: 1 에 따른 GOx-30V; I94V 및 GOx-WT 와 비교하여 현저하게 감소되고 동시에 효소의 데하이드로게나아제 활성이 GOx-WT 및 GOx-T30V; I94V 와 비교하여 현저하게 증가된 GOx 변이체를 제공할 수 있었다.
이와 관련하여, 위치 F414 및 V560 에서의 특정 아미노산 치환이, 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 GOx-WT 및 GOx-T30V; I94V 와 비교할 때, 본원에서 제공된 GOx 변이체의 산소 소비율을 현저하게 감소시키는 것은 추가로 예기치 않고도 놀라운 발견이다. 상기 치환에 적합한 아미노산은 모든 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산이다. 특히, 적합한 아미노산은 위치 F414 에 대한 Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, His, Met, Ile, Leu, Ser, Thr, Tyr 및 Val, 및 위치 V560 에 대한 Ala, Ile, Leu, Met, Pro, Tyr, Thr 및 Val 이다.
또 다른 예기치 않고도 놀라운 발견으로서, 두 위치 F414 및 V560 의 조합에 대한 특정 아미노산 치환은, 본원에서 제공된 GOx 변이체에서의 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, GOx-T30V; I94V 와 비교하여 산소 이외의 전자 매개체에 대한 매개체 활성을 현저하게 증가시킨다. 상기 치환에 적합한 아미노산은 모든 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산이다. 특히, 적합한 아미노산은 위치 F414 에 대한 Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Tyr 및 Val, 및 위치 V560 에 대한 Ala, Ile, Leu, Met, Pro, Thr, Tyr 및 Val 이다.
추가의 발견으로서, 본 발명은 위치 A173 및 A332 의 각각이, 본원에서 제공된 GOx 변이체에서의 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 일반적으로 GOx-WT 및 GOx-T30V; I94V 와 비교하여 GOx 활성의 증가를 초래한다. 상기 치환에 적합한 아미노산은 모든 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산이다. 특히, 적합한 아미노산은 위치 A173 에 대한 Ile, Thr 및 Val, 및 위치 A332 에 대한 Ser 및 Asn 이다.
그러므로, 본 발명은 당업자가 현저하게 감소된 산소 소비율을 가지는 GOx 변이체를 수득할 수 있게 한다.
또한, 본 발명은 당업자가 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 특정 전자 매개체에 대한 현저하게 증가된 매개체 활성을 특정 아미노산 치환(들)을 통해 개별적으로 또는 두 특징의 조합으로 가지는 GOx 변이체를 수득할 수 있게 한다.
당뇨병 환자는 일상 생활 동안 정확한 혈당 측정을 필요로 한다. 과학적 배경기술 섹션에서 개략적으로 서술된 바와 같이, 기존 효소 측정 시스템은 글루코오스에 대해 비특이적인 산소-의존적 GOx 및 GDH 를 기반으로 한다.
아스페르질루스 니게르로부터의 GOx-WT 에서, 옥시다아제 활성은 데하이드로게나아제 활성 보다 약 3 배 내지 4 배 높다. 따라서, 용존 산소가 혈당 어세이 시스템에 존재하는 경우, 글루코오스 기질의 산화 동안 생성된 전자는 또한 산소로 이동할 것이다. 따라서, 전자 매개체의 존재 하에 측정된 효소 활성은 용존 산소의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 그러나, 아스페르질루스 니게르로부터의 GOx-WT 는 글루코오스에 대해 특이적이고, 충분한 온도 안정성을 나타낸다.
이와 대조적으로, GDH(들)은 혈액 샘플 중의 용존 산소에 대해 내성이 있지만, 글루코오스에 대해 충분히 특이적이지 않고, 이에 따라 또한 혈액 샘플에 존재하는 기타 당 유형, 예를 들면, 말토오스, 갈락토오스, 자일로오스 및 말토트리오스에 의해 영향을 받을 수도 있다.
본 발명의 목적은 GOx 에 기반하는 혈당 측정 동안 용존 산소의 영향을 제거하면서, 이의 유리한 특성을 보존하고 추가로 증가시키는 것이었다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 옥시다아제 활성이 서열 번호: 1 에 따른 GOx-30V; I94V 및 GOx-WT 와 비교하여 현저하게 감소되고 동시에 효소의 데하이드로게나아제 활성이 GOx-WT 및 GOx-T30V; I94V 와 비교하여 현저하게 증가된 GOx 변이체를 제공할 수 있었다.
본원에서 사용되는 "옥시다아제 활성" 이란, 전자 수용체로서 산소를 이용하면서 글루코오스의 산화를 촉매하여 글루코노락톤을 생성하는 본원에서 제공된 GOx 변이체의 효소 활성이다. "옥시다아제 활성" 은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 생성된 H2O2 의 양을 측정함으로써 분석할 수 있다. 예를 들면, "옥시다아제 활성" 은 H2O2 검출을 위한 시약, 예를 들면, 4AA/TODB/POD (4-아미노안티피린(N,N-비스(4-설포부틸)-3-메틸알라닌 이나트륨 염/서양고추냉이 퍼옥시다아제) 로 또는 Pt 전극으로 분석할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 상대적 또는 양적 활성의 맥락에서, 옥시다아제 활성은 구체적으로 10mM PPB, pH 7.0, 1.5 mM TODB, 2 U/mL 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (POD), 및 1.5 mM 4-아미노안티피린 (4AA) 중에서 25℃에서 생성된 H2O2 의 양으로 측정된 단위 시간 당 산화된 기질 (글루코오스) 의 몰 양으로 정의된다. 퀴논이민 염료의 형성은 546 nm 에서 분광광도법으로 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 "데하이드로게나아제 활성" 이란, 전자 수용체로서 산소 이외의 전자 매개체를 이용함으로써 글루코오스의 산화를 촉매하여 글루코노락톤을 생성하는 본원에서 제공된 GOx 변이체의 효소 활성이다. "데하이드로게나아제 활성" 은 산소 이외의 사용된 매개체로 이동된 전자의 양을 측정함으로써 분석할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 상대적 또는 양적 활성의 맥락에서,"데하이드로게나아제 활성" 은 구체적으로 10 mM PPB (pH 7.0), 0.6 mM 메톡시 PMS (mPMS) 중에서 25℃에서 산소 이외의 매개체로 이동된 전자의 양으로 측정된 단위 시간 당 산화된 기질 (글루코오스) 의 몰 양으로 정의된다.
본 개시내용의 문맥에서, 표현 "전자 매개체(들)" 및 "산소 이외의 매개체(들)" 이란, 산화 형태와 환원 형태 둘 다로 존재할 수 있고 신속히 반응하여 전자를 공여하거나 수용하는 소형 유기 또는 무기 화학물질을 의미한다. 특히, 표현 "전자 매개체(들)" 및 "산소 이외의 매개체(들)" 이란, 글루코오스에 대한 전자 수용체이고, 이에 의해 산화 형태에서 환원 형태로 전환되는 소형 유기 또는 무기 화학물질을 의미한다. 이에 따라, 상기 매개체는 환원 형태의 전자를 전기화학 글루코오스 측정을 위한 작용 전극으로 또는 혈당 어세이 시스템에서 비색 측정을 위한 지시 분자로 전달한다. 일부 전자 수용체는 저절로 지시 분자로서 역할을 하고, 글루코오스의 비색 측정을 위해 직접 사용될 수 있다 (예를 들면, EP 8 313 27 참조).
본 발명의 한 구체적인 측면에서, 산소 이외의 전자 매개체 또는 매개체는 니트로소아닐린 및 이의 유도체, 아조-화합물, 페나진 및 이의 유도체, 페노티아진 및 이의 유도체, 페녹사진 및 이의 유도체, 페로센 및 이의 유도체, 칼륨 페리시아나이드, Ru- 및 Os-착물, 퀴논 및 이의 유도체, 인도페놀, 비올로겐, 테트라티아풀발렌 및 이의 유도체, 및 프탈로시아닌을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 보다 구체적인 측면에서, 산소 이외의 전자 매개체 또는 매개체는 퀴논, 예를 들면, 페난트렌디온, 1,4 디아미노 안트라퀴논 및 페난트렌디온의 금속착물, 및 니트로소아닐린, 예를 들면, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린 또는 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-메톡시-4-니트로소아닐린을 포함하는 군으로부터 선택된다. 후자의 2 개의 니트로소아닐린 중 하나는 이하에서 "니트로소아닐린 매개체" 로서 지칭될 것이다.
상기에서 언급된 이러한 전자 매개체는, 예를 들면, US 5,393,615; US 5,498,542; US 5,520,786; WO 2009/129108; US 2009/0095642; WO 93/25898; JP 57-128678; EP 0 441 222; 및 문헌 [Prevoteau , A. et al ., Electrochemistry Communications (2010), 12(2), 213-215; Berchmans , S. et al ., Materials Chemistry and Physics (2003), 77(2), 390-396] 에 완전히 기재되어 있다.
FADH2 에 의해 신속히 환원되지만 아스코르브산에 의해 느리게 환원되거나 환원되지 않는 전자 매개체가 본 개시내용의 주제에 특히 적합하며; 이러한 매개체는, 예를 들면, 2-[4-(디메틸아미노)페닐]-디아젠카복스아미드의 유도체이다.
"맞춤형" 산소-비의존적 GOx 변이체를 생성하기 위한 본원에서 기재된 방법의 다른 용도는 각각의 GOx 변이체를 고정 매개체에 적응시키는 것이다.
이와 관련하여, 용어 "맞춤형" 이란, 본 발명의 각각의 GOx 변이체의 폴리펩타이드 서열이 GOx 를 특정 고정 매개체와 상호작용하게 하고, 이에 따라 이로부터 전자를 수용하는 것을 의미한다.
표현 "특정 고정 매개체" 란, 니트로소아닐린 및 이의 유도체, 아조-화합물, 페나진 및 이의 유도체, 페노티아진 및 이의 유도체, 페녹사진 및 이의 유도체, 페로센 및 이의 유도체, 칼륨 페리시아나이드, Ru- 및 Os-착물, 퀴논 및 이의 유도체, 인도페놀, 비올로겐, 테트라티아풀발렌 및 이의 유도체, 및 프탈로시아닌을 포함하는 군으로부터 선택된 산소 이외의 전자 매개체 또는 매개체를 의미한다.
본 개시내용의 다른 매우 구체적인 측면에서, 니트로소아닐린의 군으로부터, 특히 p-니트로소아닐린 또는 이의 유도체의 군으로부터의 매개체, 특히 니트로소아닐린 매개체 또는 이의 유도체는 본 발명에 따른 전자 매개체로서 바람직하다. 일반적으로, 니트로소아닐린의 군으로부터의 매개체는 동일 자리에서, 예를 들면, 글루코오스 및 GOx 와 테스트 스트립 상에서 반응하여 전자 매개체로서 역할을 하는 종을 형성한다. 글루코오스 측정 및 매개체 활성의 맥락에서의 니트로소아닐린은 문헌 [ Hones , J., Muller , P., and Surridge , N. (2008). The Technology Behind Glucose Meters : Test Strips . Diabetes Technology & Therapeutics 10, 10-26; and in EP 0 354 441] 에 상세히 기재되어 있다.
당업자에게 공지되어 있는 시판되는 다른 전자 매개체도 또한 본 개시내용에 완전히 포함되기 때문에, 상기 목록은 본 발명에 따른 산소 이외의 매개체에 한정되지 말아야 한다.
본 개시내용의 다른 매우 구체적인 측면에서, 서열 번호: 2 내지 서열 번호: 9 의 서열에 따른 GOx 변이체는, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, 서열 번호: 1 에 따른 GOx-T30V; I94V 의 각각의 매개체 활성과 비교하여, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린 매개체에 대해 150% 이상의 매개체 활성을 나타낸다.
본 개시내용의 다른 매우 구체적인 측면에서, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가의 아미노산 치환
● A173V; A332S; F414Y; 및 V560A 또는
● A173V; A332S; 및 F414Y
를 가지는 GOx 변이체는, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, 서열 번호: 1 에 따른 GOx-T30V; I94V 의 각각의 매개체 활성과 비교하여, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-메톡시-4-니트로소아닐린 매개체에 대해 150% 이상의 매개체 활성을 나타낸다.
상기 치환
● A173V; A332S; F414Y; 및 V560A 또는
● A173V; A332S; 및 F414Y
는, 또한 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 본원에서 제공된 GOx 변이체의 다른 특징, 즉, 전자 이동을 위한 산소 이외의 특정 전자 매개체, 본 경우에서는 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-메톡시-4-니트로소아닐린 매개체를 수용하는 능력을 반영한다.
본 맥락에서, 표현 "산소 이외의 특정 전자 매개체(들)" 이란, 니트로소아닐린 및 이의 유도체, 아조-화합물, 페나진 및 이의 유도체, 페노티아진 및 이의 유도체, 페녹사진 및 이의 유도체, 페로센 및 이의 유도체, 칼륨 페리시아나이드, Ru- 및 Os-착물, 퀴논 및 이의 유도체, 인도페놀, 비올로겐, 테트라티아풀발렌 및 이의 유도체, 및 프탈로시아닌을 포함하는 군으로부터 선택된 산소 이외의 전자 매개체 또는 전자 매개체들을 의미한다.
제 1 측면에서, 본 발명은
하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 주제에 관한 것이다:
a) 2 개의 아미노산 치환 T30V 및 I94V 이외에, 상기 서열 번호: 1 에서 S53; A137; A173; A332; F414; V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가지는, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제; 또는
b) a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제와 70% 이상, 특히 80% 이상 또는 > 90% 의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 글루코오스 옥시다아제로서, 단, b) 의 글루코오스 옥시다아제는, 2 개의 아미노산 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 1 에 따른 S53; A137; A173; A332; F414; V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가지고 있고,
단, b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제는 a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 효소 활성의 70% 이상, 특히 80% 이상 또는 > 90% 를 나타내고, a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 글루코오스에 대한 효소 특이성의 70% 이상, 특히 80% 이상 또는 > 90% 를 나타내고,
단, b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제는 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 전자 수용체로서의 산소에 대한 5 배 이상의 감소 활성을 나타내거나, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 산소 이외의 전자 매개체에 대한 1.5 배 이상의 증가 활성을 나타내거나, 둘 다를 나타내는 것인 글루코오스 옥시다아제;
c) a) 또는 b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 활성 단편으로서, 단, c) 에 따른 활성 단편에서, a) 또는 b) 하에 개략적으로 서술된 아미노산 치환은 a) 또는 b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제와 비교할 때 보존되고,
단, c) 에 따른 글루코오스 옥시다아제는 a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 효소 활성의 70% 이상, 특히 80% 이상 또는 > 90% 를 나타내고, a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 글루코오스에 대한 효소 특이성의 70% 이상, 특히 80% 이상 또는 > 90% 를 나타내고,
단, c) 에 따른 글루코오스 옥시다아제는 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 전자 수용체로서의 산소에 대한 5 배 이상의 감소 활성을 나타내거나, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 산소 이외의 전자 매개체에 대한 1.5 배 이상의 증가 활성을 나타내거나, 둘 다를 나타내는 것인 a) 또는 b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 활성 단편.
본 명세서의 맥락에서, 표현 "아미노산 서열에서의 추가의 변형(들)" 및 "추가의 아미노산 치환(들)" 이란, 서열 번호: 1 에 따른 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산 중 어느 것에 의해 하나 이상의 아미노산의 치환을 의미한다. 추가로, 상기 표현은 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산 또는 이의 화학적 균등물 중 어느 것에 의한 협력적 아미노산 치환을 또한 포괄하고, 단, 2 개 이상 또는 3 개 이상 또는 4 개 이상 또는 5 개 이상 또는 심지어 6 개 이상의 위치는 서열 번호: 1 에 따른 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 의 군으로부터 선택된 임의의 위치에서 치환된다.
본 발명의 GOx 변이체와 관련한 용어 "효소 활성" 은 베타-D-글루코오스를 D-글루코노-1,5-락톤으로 산화하는 것 (D-글루코오스 + O2 → 글루코노락톤 + H2O2) 을 촉매하는 단백질을 명시하고, 이것은 이후 글루콘산으로 가수분해될 수 있다.
제 2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 측면을 구체화하고 있는 하기 실시형태의 주제에 관한 것이다:
하나의 실시형태에서, 본 발명의 주제는 본 발명의 제 1 측면에 따른 GOx 변이체로서, 여기서,
● 전자 수용체로서의 산소에 대한 상기 활성은 하기 단계를 포함하는 ABTS 어세이에 의해 측정되고:
a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 100 μL 의 포스페이트 버퍼 (pH 7) 를 함유하는 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
b) 하기 농도에서 생성된 20 μL 의 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하는 단계: 0.91 U/mL HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제); 2.3 mM ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산))
c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 30 초 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 414 nm 에서 ABTS 의 산화를 반응속도론적으로 측정하는 단계;
● 산소 이외의 전자 매개체에 대한 상기 활성은 하기 단계를 포함하는 매개체 어세이에 의해 측정된다:
a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
b) 100 μL 의 매개체 용액 (19.05 mM N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린); 5% (w/w) 폴리비닐피롤리돈, pH 7 및 20 μL 의 25 mM 포스포몰리브덴산을 첨가하는 단계
c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 1 분 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 700 nm 에서 포스포몰리브덴산 환원의 반응속도를 모니터링하는 단계.
상기 측면과 관련한 다른 측면에서, 산소 이외의 전자 매개체는 니트로소아닐린 및 이의 유도체, 아조-화합물, 페나진 및 이의 유도체, 페노티아진 및 이의 유도체, 페녹사진 및 이의 유도체, 페로센 및 이의 유도체, 칼륨 페리시아나이드, Ru- 및 Os-착물, 퀴논 및 이의 유도체, 인도페놀, 비올로겐, 테트라티아풀발렌 및 이의 유도체, 및 프탈로시아닌을 포함하는 군으로부터 선택된다.
상기 측면과 관련한 다른 측면에서, 본 발명의 주제는, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 1 에 따른 S53; A137; A173; A332; F414; V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 추가의 2 개 또는 3 개 또는 4 개 또는 5 개 또는 6 개의 아미노산 치환을 가지는 GOx 변이체이다.
상기 측면과 관련한 다른 측면에서, 본 발명은 상기 추가의 치환(들)에 대한 아미노산이 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 의 군으로부터 선택된 GOx 변이체를 제공하는 것으로서, 단, 상기 치환기 아미노산은 서열 번호: 1 에 따른 각각의 위치에서 존재하는 것과 다르다.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은 상기 추가의 치환(들)에 대한 아미노산이 Ala, Ile, Thr, Tyr, Val, Ser, Asn, Arg, Asp, Cys, Gly, His, Met, Leu, Phe, Met 및 Pro 의 군으로부터 선택된 GOx 변이체를 제공하는 것으로서, 단, 상기 치환기 아미노산은 서열 번호: 1 에 따른 각각의 위치에서 존재하는 것과 다르다.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은 상기 추가의 치환(들)에 대한 아미노산이 하기로부터 선택된 GOx 변이체를 제공한다:
위치 S53 에 대한 Phe; 및/또는
위치 A137 에 대한 Ser, Leu; 및/또는
위치 A173 에 대한 Ile, Thr, Val; 및/또는
위치 A332 에 대한 Ser, Asn, Val; 및/또는
위치 F414 에 대한 Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, His, Ile, Met, Ser, Thr, Tyr, Val; 및/또는
위치 V560 에 대한 Ala, Ile, Leu, Met, Pro, Thr, Tyr 및 Val.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 치환 T30V 및 I94V 이외에, 위치(들) F414 및/또는 V560 에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환이 위치(들) A137 및/또는 A173 및/또는 A332 에서의 하나 이상의 아미노산 치환과 조합되는 GOx 변이체를 제공한다.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가의 아미노산 치환 A173I; A332S; 및 F414L 을 가지는 서열 번호: 4 에 따른 GOx 변이체를 제공한다.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가의 아미노산 치환 A173V; A332S; F414I; 및 V560T 를 가지는 서열 번호: 3 에 따른 GOx 변이체를 제공한다.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가의 아미노산 치환 A173V; A332N; F414V; 및 V560L 을 가지는서열 번호: 6 에 따른 GOx 변이체를 제공한다.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 ABTS 어세이에 의해 아스페르질루스 니게르의 야생형 GOx 와 비교하고/하거나 서열 번호: 1 에 따른 GOx 와 비교할 때, 전자 수용체로서의 산소에 대한 5 배 이상의 감소 활성을 가지는 GOx 변이체를 제공한다:
a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 100 μL 의 포스페이트 버퍼 (pH 7) 를 함유하는 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
b) 하기 농도에서 생성된 20 μL 의 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하는 단계: 0.91 U/mL HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제); 2.3 mM ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산))
c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 30 초 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 414 nm 에서 ABTS 의 산화를 반응속도론적으로 측정하는 단계.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은 GOx 변이체를 제공하는 것으로서, 여기서, 상기 GOx 변이체는, 하기 단계를 포함하는 매개체 어세이로 측정할 때, 서열 번호: 1 에 따른 GOx 와 비교하여 산소 이외의 매개체에 대한 1.5 배 이상의 증가 활성을 나타낸다:
a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
b) 100 μL 의 매개체 용액 (19.05 mM N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린); 5% (w/w) 폴리비닐피롤리돈, pH 7 및 20 μL 의 25 mM 포스포몰리브덴산을 첨가하는 단계
c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 1 분 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 700 nm 에서 포스포몰리브덴산 환원의 반응속도를 모니터링하는 단계.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 매개체 어세이로 측정할 때, 99.9% 이상의 글루코오스 특이성 및/또는 < 4% 의 갈락토오스 특이성 및/또는 < 0.3% 의 말토오스 특이성 및/또는 < 6% 의 자일로오스 특이성 및/또는 < 0.1% 의 말토트리오스 특이성을 나타내는 GOx 변이체를 제공한다:
a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
b) 100 μL 의 매개체 용액 (19.05 mM N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린); 5% (w/w) 폴리비닐피롤리돈, pH 7 및 20 μL 의 25 mM 포스포몰리브덴산을 첨가하는 단계
c) 25 μL 의 각각의 당 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 1 분 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 700 nm 에서 포스포몰리브덴산 환원의 반응속도를 모니터링하는 단계.
본 개시내용의 맥락에서, 표현 "글루코오스에 대해 특이적인 또는 글루코오스 기질에 대해 특이적인" 이란, 하기의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, 100% 의 글루코오스 기질에 대한 본원에서 제공된 GOx 의 활성을 의미한다. 함축적으로, 글루코오스 이외의 당, 예를 들면, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스 및 말토트리오스에 대한 본원에서 제공된 GOx 의 잔류 활성은, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, < 6% 이다.
상기 측면 중 어느 것과 관련된 다른 측면에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 매개체 어세이에 의해 서열 번호: 1 에 따른 GOx 의 니트로소아닐린 매개체 활성과 비교할 때, 전자 이동을 위한 니트로소아닐린 매개체에 대해 > 400% 또는 > 500% 또는 > 600% 의 활성을 나타내고:
a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
b) 100 μL 의 매개체 용액 (19.05 mM N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린); 5% (w/w) 폴리비닐피롤리돈, pH 7 및 20 μL 의 25 mM 포스포몰리브덴산을 첨가하는 단계
c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 1 분 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 700 nm 에서 포스포몰리브덴산 환원의 반응속도를 모니터링하는 단계;
하기 단계를 포함하는 ABTS 어세이에 의해 서열 번호: 1 에 따른 GOx 의 산소 활성과 비교할 때, ≤ 30% 또는 < 25% 또는 < 20%, 특히 < 15% 또는 ≤ 10% 의 산소 활성을 나타내는 GOx 변이체를 제공한다:
a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 100 μL 의 포스페이트 버퍼 (pH 7) 를 함유하는 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
b) 하기 농도에서 생성된 20 μL 의 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하는 단계: 0.91 U/mL HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제); 2.3 mM ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산))
c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 30 초 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 414 nm 에서 ABTS 의 산화를 반응속도론적으로 측정하는 단계.
다른 측면에서, 본 발명의 주제는 상기 측면 중 어느 것에 따른 GOx 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 GOx 변이체의 활성 (기능성) 균등물/단편을 제공한다.
용어 "이의 활성 균등물(들)/단편(들)" 또는 동의어 "이의 기능성 균등물(들)/단편(들)" 이란, 본 발명에 따른 임의의 변형되고, 이에 따라 최적화된 GOx 변이체를 의미하고, 여기서, 하나 이상의 아미노산은 서열 번호: 1 에 따른 상응하는 서열에서와 같이 누락되거나 다른 아미노산으로 치환되고, 단, 이러한 균등물(들)/단편(들)은, 서열 번호: 1 에 따른 존재하는 적어도 치환 T30V 및 I94V 를 가지고, 추가로 서열 번호: 1 에 따른 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가짐으로써, 여전히 효소 활성, 효소 특이성 및 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 특정 매개체에 대한 현저하게 증가된 활성에 관한 필수 특성을 나타낸다.
본 발명의 한 구체적인 측면에서, 본 발명에 따른 GOx 변이체의 기능성 균등물(들)/단편(들)은 서열 번호: 2 내지 서열 번호: 9 에 따른 서열과 70% 이상의 상동성, 특히 80% 이상의 상동성 또는 > 90% 의 상동성인 아미노산 서열(들)을 포괄한다.
다른 측면에서, 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 GOx 변이체 또는 이의 활성 단편에 의해 생체외 샘플에서 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 검출, 결정 또는 측정은 생체외 샘플을 상기 GOx 또는 이의 활성 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 측면과 관련한 다른 측면에서, 상기 글루코오스의 검출, 결정 또는 측정은 센서 또는 테스트 스트립 장치를 사용하여 수행된다.
본 발명은 또한 본 발명의 GOx 변이체의 제조 방법, 상기 효소를 암호화하는 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 상기 효소를 사용하여 샘플에서 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법, 및 또한 상기 효소를 포함하는 장치에 관한 것이다.
한 구체적인 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 GOx 변이체 및 산소 이외의 전자 매개체를 포함하는 샘플에서 글루코오스를 분석하는 장치를 제공한다.
본 발명의 한 구체적인 측면에서, 산소 이외의 전자 매개체 또는 매개체는 니트로소아닐린 및 이의 유도체, 아조-화합물, 페나진 및 이의 유도체, 페노티아진 및 이의 유도체, 페녹사진 및 이의 유도체, 페로센 및 이의 유도체, 칼륨 페리시아나이드, Ru- 및 Os-착물, 퀴논 및 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
상기 측면 중 어느 것의 주제에 관한 본 발명의 다른 구체적인 측면은, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 1 의 A173; A332; F414; V560 의 군으로부터 선택된 4 개의 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가지는 GOx 변이체이다.
본 발명에 의해 의도되는 본원에서 제공된 GOx 변이체의 주요 적용 중 하나는 당뇨병 환자의 생체외 샘플에서 혈당 수준을 모니터링하기 위한 테스트 스트림에서의 이의 사용이다. 물론 수많은 종류의 샘플을 조사할 수 있다. 특히, 혈액, 혈청 및 혈장과 같은 체액은 이러한 샘플에 대한 공급원이다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 효소 전극 상에 고정되어 있는 하나 이상의 본 발명의 GOx 변이체를 포함하는 효소 전극을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 작용 전극으로서 본 발명의 효소 전극을 포함하고, 이에 따라 하나 이상의 본 발명의 GOx 변이체를 포함하는 글루코오스를 분석하기 위한 효소 센서를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 GOx 변이체 및 산소 이외의 전자 매개체를 포함하는 샘플에서 글루코오스를 분석하기 위한 키트를 제공한다.
글루코오스의 측정을 위한 키트는 하나 이상의 본 발명의 GOx 변이체를 사용하여 제작할 수 있다. 본 발명의 GOx 변이체 이외에, 키트는 측정에 필요한 버퍼, 적절한 산소 이외의 전자 매개체, 특히 니트로소아닐린 매개체, 필요한 경우, 퍼옥시다아제와 같은 효소, 및 보정 곡선의 제조를 위한 글루코오스의 표준 용액 및 사용 설명서를 포함한다.
샘플 중 글루코오스의 농도는 효소 반응에 의해 생성된 전자의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 각종 센서 시스템은 탄소 전극, 금속 전극 및 백금 전극을 포함하여 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 GOx 변이체는 전극 상에 고정되어 있다. 고정을 위한 수단의 예는 가교결합, 고분자 매트릭스 내로의 캡슐화, 투석 막에 의한 코팅, 광학 가교결합성 폴리머, 전기전도성 폴리머, 산화-환원 폴리머 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
어세이 장치는 혈당 수준을 모니터링하기 위한 임의의 통상의 시판 전류측정 바이오센서 테스트 스트립과 유사한 구조를 가질 수 있다. 이러한 장치의 하나의 예는 절연 기판, 시약 포트 및 샘플 리시버 상에 위치된 2 개의 전극 (작용 전극 및 기준 또는 상대 전극) 을 가진다. 시약 포트는 본 발명의 GOx 변이체 및 산소 이외의 매개체를 포함한다. 혈액 샘플과 같은 샘플을 샘플 리시버에 첨가할 때, 샘플에 함유된 글루코오스는 GOx 변이체와 반응할 것이고, 이로 인해 전자 이동은 샘플 중 글루코오스의 양을 나타낸다. 효소 기질의 측정에 적합한 전기화학 센서의 대표적인 예는, 예를 들면, WO 2004/113900 및 US 5,997,817 에서 공지되어 있다. 전기화학 센서에 대한 대안으로서, 광학 검출 기술을 사용할 수 있다. 전형적으로, 이러한 광학 장치는 효소, 전자 매개체 및 지시약을 포함하는 시약 시스템에서 일어나는 색 변화를 기반으로 한다. 색 변화는 형광, 흡수 또는 방출 측정을 사용하여 정량화할 수 있다. 효소 기질의 측정에 적합한 광학 장치의 대표적인 예는, 예를 들면, US 7,008,799; US 6,036,919 및 US 5,334,508 에서 공지되어 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 GOx 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 GOx 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는, 본원에서 형질전환체로서도 또한 지칭되는 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 GOx 변이체 또는 이의 활성 단편의 제조 방법을 제공하는 것으로서, 상기 제조 방법은 상기에서 기재된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기에서 기재된 방법에 의해 수득될 수 있는 본 발명에 따른 GOx 변이체 또는 이의 활성 단편을 제공한다.
다른 구체적인 측면에서, 본원에서 제공된 발현 벡터는 바람직하게는 본 발명의 GOx 변이체를 암호화하는 DNA 서열 중의 하나의 모두 또는 일부를 포함한다.
본원에서 제공된 GOx 변이체의 목적하는 암호 서열 및 제어 서열을 함유하는 적합한 발현 벡터는, 당업계에 공지되어 있는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제될 수 있으며, 이들의 다수는 문헌 [Sambrook et al ., in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989), Cold Spring Habor, NY Cold Spring Habor Laboratory Press] 에 기재되어 있다.
적합한 숙주 세포는, 예를 들면, Promega 사 (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA) 로부터 시판되는 에세리키아 콜라이 (E. coli) HB101 (ATCC33694), Stratagene 사 (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) 로부터 시판되는 XL1-Blue MRF' 등을 포함한다. 적합한 피키아 숙주 세포는, 예를 들면, Invitrogen 사 (5791 Van Allan Way, Carlsbad, CA 92008, USA) 로부터 시판되는 피키아 파스토리스 (P. pastoris) X33 또는 피키아 파스토리스 KM71H 를 포함한다.
본 발명에 따른 GOx 변이체의 재조합 생산은 당업계에 공지되어 있는 숙주에서 작제될 수 있다. 적합한 숙주는, 예를 들면, 아스페르질루스 니게르, 아스페르질루스 소자에 (Aspergillus sojae) 및 아스페르질루스 오리자에 (Aspergillus oryyzae) 와 같은 사상 진균의 균주로부터 선택될 수 있다. 적합한 숙주는, 예를 들면, 피키아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 및 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) 와 같은 효모의 균주로부터 선택될 수 있다.
다른 구체적인 측면에서, 본 발명에 따른 GOx 변이체 또는 이의 기능성 균등물은 효모에서, 특히 사카로마이세스 세레비지아에에서 상기 GOx 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 수득될 수 있다.
발현 벡터는 당업계에서 공지되어 있는 각종 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터에 의한 숙주 세포의 형질전환은 폴리에틸렌 글리콜 매개된 원형질체 형질전환 방법으로 수행될 수 있다 [Sambrook et al . 1989, 상기 참조]. 그러나, 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 다른 방법, 예를 들면, 전기천공, 탄도학 DNA 주입 (ballistic DNA injection) 또는 원형질체 융합도 또한 이용할 수 있다.
일단 본 발명에 따른 GOx 변이체를 함유하는 발현 벡터가 적절한 숙주 세포에 도입되면, 숙주 세포는 목적하는 본 발명에 따른 GOx 변이체의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 목적하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 (이에 따라, 본 발명에 따른 GOx 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 가짐) 는, 예를 들면, 항생제 선별 또는 영양요구성 돌연변이체의 상보성 및 최소 배지로부터의 선별에 의해 용이하게 확인될 수 있다 [J. Sambrook , D. W. Russell : " Molecular Cloning : a laboratory manual", 3 rd edition , Cold Spring Harbor , New York (2001)]. 본원에서 제공된 GOx 변이체의 발현은 GOx mRNA 전사물의 생성 측정, 유전자 산물의 면역학적 검출 또는 당업자에게 공지되어 있는 유전자 산물의 효소 활성의 검출과 같은 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다. 특히, 효소 어세이는 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 매개체 어세이 하에 개략적으로 서술된 바와 같이 적용되어야 한다. 또한, 본원에서 제공된 GOx 변이체는, 항목 gg) 하에 시작된 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 측정할 때, 본 발명에 따른 현저하게 감소된 산소 소비율에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에서 기재된 본 발명의 GOx 변이체에 대한 폴리펩타이드는 본 발명의 GOx 변이체의 하나를 암호화하는 DNA 서열을 발현하는 숙주 세포에서 생산함으로써 수득가능하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 본 발명의 GOx 변이체의 하나를 암호화하는 DNA 서열에 의해 암호화된 mRNA 의 시험관내 번역에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, DNA 서열은 차례로 시험관내 전사/번역 시스템에서 사용될 수 있는 적합한 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
무세포 펩타이드 합성 시스템에서 이의 발현을 촉진할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 상기에서 정의되고 기재된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터는 본 발명의 다른 구체적인 측면을 나타낸다.
예를 들면, 상기에서 기재된 바와 같은 절차에 의해 생산된 폴리펩타이드는 이후 각종 일상적인 단백질 정제 기술을 사용하여 단리되고 정제될 수 있다. 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 절차를 이용할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명에 따른 GOx 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 GOx 변이체는 글루코오스 기질에 대해 특이적인 고유 특성을 유지하지만, 서열 번호: 1 에 따른 치환 T30V 및 I94V 이외에 특정 위치의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환으로 인해, 최대 잔류 산소 활성은, 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 측정할 때, ≤ 30% 로 감소한다. 부수적으로, 본원에서 제공된 GOx 는, 항목 ff) 하의 하기 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, 산소 이외의 전자 매개체에 대한 > 400% 또는 > 500% 또는 > 600% 의 효소 활성을 나타낸다.
상기를 고려하여, 본 발명은 본원에서 제공된 GOx 변이체에서
i) GOx 의 글루코오스 특이성 특성을
ii) 옥시다아제 활성으로부터 데하이드로게나아제 활성으로의 이동을 통한 GDH 의 산소-비의존적 효소 활성 특성 및
iii) 임의로, 산소 이외의 특정 전자 매개체에 대한 증가 활성과
조합하여 정확한 글루코오스 측정, 특히 정확한 혈당 측정을 달성한다.
본 발명에 따른 GOx 변이체의 맥락에서, 표현 "옥시다아제 활성으로부터 데하이드로게나아제 활성으로의 이동" 이란,
● 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 측정할 때, 기준으로서의 1.0 의 GOx-T30V; I94V 의 잔류 산소 활성으로부터 ≤ 0.3 또는 < 0.25 또는 < 0.2, 특히 < 0.15 또는 ≤ 0.1 의 본 발명에 따른 GOx 변이체의 잔류 산소 활성으로의 산소 활성의 감소, 및
● 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, 기준으로서의 1.0 의 GOx-T30V; I94V 의 매개체 활성으로부터 1.5 이상의 본 발명에 따른 GOx 변이체의 매개체 활성으로의 데하이드로게나아제 활성의 부수적 감소.
상기 값은 산소 활성 및 매개체 활성의 면에서 본 발명의 GOx 변이체의 효소 활성과 기준으로서의 GOx-T30V; I94V 의 각각의 효소 활성 사이의 비율 (몫) 을 의미한다. 비율 (몫) 은, 항목 ee) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ELISA 로 측정할 때, 2 개의 GOx 활성 (산소 활성 및 매개체 활성 [U/mg]) 을 기초로 한다.
본 발명에 따른 서열 번호: 11 내지 서열 번호: 17 의 서열에 따른 각각의 핵산 분자는 서열 번호: 1 에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 번호: 10 (GOx-T30V; I94V) 으로부터 유도된 변형 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화한다.
본원에서 사용되는 용어 "GOx-T30V; I94V" 란, 서열 번호: 2 에 따른 아스페르질루스 니게르 야생형 (WT) 서열을 기본으로 하고, 추가로 이의 폴리펩타이드 서열, 즉, 서열 번호: 1 에서 2 개의 치환 T30V 및 I94V 를 가지는 GOx 를 의미한다.
본원에서 동일하게 사용되는 용어 "GOx 이중 돌연변이체" 란, 서열 번호: 2 에 따른 아스페르질루스 니게르 WT 서열을 기본으로 하고, 추가로 이의 폴리펩타이드 서열, 즉, 서열 번호: 1 에서 2 개의 치환 T30V 및 I94V 를 가지는 GOx 를 의미한다. 상기 GOx 이중 돌연변이체는 Zhu 등 (2006; 2007) 으로부터 유도된다.
본 발명에 따르면, 서열 번호. 1 에 상응하는 핵산 분자 (즉, 서열 번호: 10) 는, 옥시다아제 활성으로부터 데하이드로게나아제 활성으로의 이동을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 GOx 효소의 반응속도 특성을 추가로 향상시키기 위해 사용되었다. 이것은 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 의 하나 이상에서 아미노산 치환을 초래하는 특정 뉴클레오타이드 서열의 변형을 통해 본 발명자들에 의해 달성된 반면, 2 개의 치환 T30V 및 I94V 는 서열 번호: 1 에 따라 이미 존재하고 있었다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 1 의 S53; A137; A173; A332; F414; V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 추가의 2 개 또는 3 개 또는 4 개 또는 5 개 또는 6 개의 아미노산 치환을 가지고, 이에 의해 GOx 효소 활성에 대한 협력 효과를 나타내는 GOx 변이체를 제공한다.
본 발명의 문맥에서 표현 "GOx 효소 활성에 대한 협력 효과" 란, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, GOx 산소 소비율 감소의 면에서 GOx 효소 활성에 대한 효과를 가지는, 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서의 2 개 이상의 추가의 아미노산 치환을 의미한다.
추가로, 본 발명의 문맥에서 "GOx 효소 활성에 대한 협력 효과" 란, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, GOx 산소 소비율 감소 및/또는 산소 이외의 전자 매개체에 대한 GOx 매개체 활성 증가의 면에서 GOx 효소 활성에 대한 효과를 가지는, 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서의 2 개 이상의 추가의 아미노산 치환을 의미한다.
또한, 본 발명의 문맥에서 표현 "GOx 효소 활성에 대한 협력 효과" 란, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 전자 이동을 위한 산소 이외의 특정 전자 매개체 수용의 면에서 GOx 효소 활성에 대한 효과를 가지는, 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서 2 개 이상의 추가의 아미노산 치환을 의미한다. 한 구체적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산 중 어느 것에 의한 위치 A137; A173; 및 A332 에서의 아미노산 치환과 조합된, 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산 중 어느 것에 의한 위치 F414 및 V560 에서의 추가의 아미노산 치환을 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
한 구체적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산 중 어느 것에 의한 위치 F414 및 V560 에서의 추가의 조합된 아미노산 치환을 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
본 발명의 추가의 구체적인 측면은 상기 측면과 관련되며, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 추가의 조합된 아미노산 치환 F414M 또는 F414V 와 V560P 또는 V560L 을 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
추가의 구체적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 아미노산 치환(들) V560P 또는 V560L 및/또는 A137L 및/또는 A173I 또는 A173V 및/또는 A332S 또는 A332V 또는 A332T 와 조합된, 추가의 아미노산 치환 F414M 또는 F414V 를 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
추가의 구체적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 아미노산 치환(들) V560P 또는 V560L 및/또는 A137L 및/또는 A173I 또는 A173V 및/또는 A332S 또는 A332V 또는 A332T 와 조합된, 추가의 아미노산 치환 F414M 또는 F414V 를 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
본 발명의 추가의 구체적인 측면은 상기 측면과 관련되며, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 상기에서 언급된 치환 중 어느 것으로부터 선택된 2 개 이상의 조합된 아미노산 치환을 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
산소 이외의 전자 매개체에 대한 GOx 특이성은 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정될 수 있다.
다른 구체적인 측면에서, 본 발명은, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정될 때, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린 전자 매개체에 대한 > 400% 또는 > 450% 또는 > 500% 초과 > 550% 또는 심지어 > 600% 의 매개체 활성을 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
다른 구체적인 측면에서, 본 발명은, 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이에 의해 서열 번호: 1 에 따른 GOx-T30V; I94V 와 비교하거나 GOx-WT 와 비교할 때, 전자 수용체로서의 산소에 대한 5 배 이상의 감소 활성, 또는 전자 수용체로서의 산소에 대한 6 배 이상의 감소 활성, 또는 전자 수용체로서의 산소에 대한 7 배 이상의 감소 활성을 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
다른 구체적인 측면에서, 본 발명은, 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 측정할 때, GOx WT 옥시다아제 활성 또는 서열 번호: 1 에 따른 GOx-T30V; I94V 옥시다아제 활성의 ≤ 30% 의 잔류 옥시다아제 활성을 가지거나, 특히 GOx-WT 옥시다아제 활성 또는 서열 번호: 1 에 따른 GOx-T30V; I94V 옥시다아제 활성의 < 20% 또는 < 15% 의 잔류 옥시다아제 활성을 가지거나, 훨씬 보다 특히 GOx-WT 옥시다아제 활성 또는 서열 번호: 1 에 따른 GOx-T30V; I94V 옥시다아제 활성의 < 10% 의 잔류 옥시다아제 활성을 가지는 GOx 변이체를 제공한다.
본 발명의 보다 구체적인 측면에서, 서열 번호: 11 내지 서열 번호: 17 에서 제공된 뉴클레오타이드 분자의 기능성 균등물/단편은 서열 번호: 11 내지 서열 번호: 17 의 서열과 실질적으로 상보적인 서열 또는 상기 DNA 서열에 의해 암호화된 상응하는 RNA 분자이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA 분자" 란, 단일 가닥이고 본원에서 제공된 서열 번호: 3 내지 서열 번호: 9 에 따른 GOx 변이체의 단백질 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하는 리보뉴클레오타이드 분자의 선형 폴리머를 지칭하는 것을 의미한다.
본 발명의 추가의 구체적인 측면에서, 상동성의 정도 또는 백분율은 서열 번호: 3 내지 서열 번호: 9 에 대해 70% 이상 또는 80% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 또는 99% 이상 또는 100% 이고; 단, 이들은 본 명세서를 통해 개략적으로 서술된 바와 동일한 치환을 나타내고, 추가로 본 발명에 따른 GOx 변이체와 동일한 특성을 필수적으로 나타내고, 이러한 필수 특성은 효소 활성, 글루코오스에 대한 효소 특이성 및 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 특정 매개체에 대한 현저하게 증가된 활성이다.
서열 동일성은 BLAST 알고리즘, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 로 측정할 수 있다 [A ltschul , S.F. et al . 1990. J. Mol . Biol . 215:403; Altschul , S.F. et al . 1997. Nucleic Acid Res . 25:3389-3402]. 본원에서 언급된 아미노산 서열 동일성의 백분율이란, 상기 BLAST 알고리즘에 의한 서열 동일성의 결정을 의미하고, 여기서, 상동성이 결정되는 영역은 본 발명의 GOx 변이체의 전체 서열이다. 서열 동일성은 서열 정렬 및 비교의 목적을 위해 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법으로 측정할 수 있다.
당업자는 본원에서 제공된 GOx 변이체가 변이체의 필수 특성, 즉, 본 발명의 의미에서와 같은 글루코오스에 대한 특이성, 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 특정 매개체에 대한 현저하게 증가된 활성을 변경하지 않고 이전에 언급된 치환과 상이한 추가의 변형을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있는 것을 이해한다.
본 발명의 다른 구체적인 양태는 본 발명에 따른 GOx 변이체 또는 이의 활성 균등물/단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드이다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 섹션에서 명시적으로 열거된 하기 서열 - 서열 목록, 즉, 서열 번호: 11 내지 서열 번호: 17 을 암호화하는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 상응하는 유전자일 수 있다.
다른 구체적인 측면에서, 본 발명에 의해 제공된 GOx 변이체는, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, 30℃ 내지 47℃ 의 범위에서 70% 이상, 특히 80% 이상의 잔류 효소 활성을 가짐으로써 온도 안정성을 나타낸다.
다른 구체적인 측면에서, 본 발명에 의해 제공된 GOx 변이체는, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, 48℃ 내지 60℃ 의 범위에서 10% 이상의 잔류 효소 활성을 가짐으로써 온도 안정성을 나타낸다.
본 발명의 GOx 변이체는 각종 형태로, 예를 들면, 동결건조 시약으로서 또는 적절한 저장 용액 중의 용액으로서 제공된다.
본원에서 제공된 GOx 변이체는 주로 보다 정확한 당뇨병 혈당 테스트 장치에서의 적용을 위해 의도된다. 구체적으로, 본 발명의 산소-비의존적 GOx 변이체는 현저하게 감소된 산소 소비율로 전자 이동을 위해서만 산소를 이용하고, 이것은 산소에 대한 잔류 GOx 활성이, 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 측정할 때, ≤ 30% 또는 < 25% 또는 < 20%, 특히 < 15% 또는 ≤ 10% 인 것을 의미한다. 따라서, 현저한 양의 글루코오스는 보다 적절한 혈당 측정을 위한 매개체 관련 반응에서 반응하는 반면, 혈액 샘플 중 용존 산소 함량과의 반응은 현저하게 감소한다. 이것은, 동맥, 정맥 또는 모세관 혈액이 측정을 위한 공급원일 때 또는 해수면 초과의 다양한 높이에서 혈당 농도를 측정하는 경우, 당뇨병 환자에게 유리하다.
다른 측면에서, 본 발명은 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 전자 매개체에 대한 현저하게 증가된 매개체 활성을 나타내고, 이것은 또한 당뇨병 환자가 혜택을 받는 보다 정확한 혈당 측정을 초래한다.
정의
본 명세서의 맥락에서, 표현 "산소-의존적" 및 "산소-의존성" 이란, 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 측정할 때, > 30% 의 잔류 산소 활성을 특징으로 하는 GOx 활성을 의미한다.
이와 대조적으로, 표현 "산소-비의존적" 및 "산소-비의존성" 이란, 항목 gg) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 ABTS 어세이로 측정할 때, ≤ 30% 또는 < 25% 또는 < 20%, 특히 < 15% 또는 < 10% 의 잔류 산소 활성을 특징으로 하는 GOx 활성을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "글루코오스에 대해 비특이적인" 이란, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, < 100% 또는 < 99.9% 또는 < 99.5% 의 글루코오스 기질에 대한 GOx 활성을 의미한다. 함축적으로, "글루코오스에 대해 비특이적인" GOx 는, 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이로 측정할 때, > 6% 의 글루코오스 이외의 당, 예를 들면, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스 및 말토트리오스에 대한 GOx 활성을 나타낸다.
본 발명의 GOx 변이체와 관련한 용어 "변형된" 또는 "변형" 이란, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 아미노산 치환 T30V 및 I94V 이외에, 위치(들) S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서 서열 번호: 1 에 따른 폴리펩타이드 서열에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 함유하는 GOx 단백질을 의미한다. 상기 용어는 또한 이러한 "변형된" GOx 변이체를 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 서열-보존적 변이를 의미한다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 "서열-보존적 변이" 는 주어진 코돈 위치에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변화가 그 위치에서 암호화된 아미노산에서 어떠한 변경도 초래하지 않는 것들이다.
용어 "GOx 변이체(들)" 이란, 글루코오스 기질에 대한 효소 특이성, 및 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 특정 매개체에 대한 현저하게 증가된 활성을 특징으로 하는, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 아미노산 치환 T30V 및 I94V, 및 위치(들) S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서 서열 번호: 1 에 따른 폴리펩타이드 서열에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가지는 본 발명에 따른 글루코오스 옥시다아제를 의미한다.
본 명세서를 통한 아미노산 서열의 번호지정은 서열 번호: 1 에 따른 성숙 GOx-T30V; I94V 단백질에서와 같이 첫글자 S (Ser, Serine) 로 "1 개" 로 시작하는 것을 이해해야 한다.
본 발명에 따른 용어 "효소" 란, 하나 이상의 화학 또는 생화학 반응(들)을 거의 특이적으로 촉매하거나 촉진시키는 단백질 또는 폴리펩타이드로 전적으로 또는 주로 구성된 임의의 물질을 의미한다. 용어 "효소" 는 또한 촉매적 폴리뉴클레오타이드 (예를 들면, RNA 또는 DNA) 를 의미할 수 있다.
용어 "산화 반응" 이란, 일반 용어로 산소화 또는 산화 기질 또는 생성물을 형성하기 위해 기질에 대한 산소의 첨가를 포함하는 화학 또는 생화학 반응을 의미한다. 산화 반응은 전형적으로는 환원 반응을 수반한다 (이런 이유로, 용어 "산화환원" 반응은 산화와 환원 둘 다를 포괄한다). 화합물은 산소를 수용하거나 전자를 잃을 때 "산화된다". 화합물은 산소를 잃거나 전자를 얻을 때 "환원된다". GOx 는 전형적으로는 1 차 알코올기를 알데하이드로 산화하는 것을 촉매한다.
본 명세서를 통해 사용되는 용어 "글루코오스 옥시다아제(들)" 는 베타-D-글루코오스를 D-글루코노-1,5-락톤으로 산화하는 것 (D-글루코오스 + O2 → 글루코노락톤 + H2O2) 을 촉매하는 단백질을 명시하고, 이것은 이후 글루콘산으로 가수분해될 수 있다. 따라서, 글루코오스 옥시다아제는 효소이다. 추가로, 용어 "글루코오스 옥시다아제의 활성을 가지는 폴리펩타이드" 란, 상기에서 언급된 활성을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 글루코오스 옥시다아제(들)은 "GOx(들)" 또는 "E.C. 1.1.3.4." 로 약기할 수 있다. 본 명세서를 통해 사용되는 용어 "GOx-WT 또는 WT" 란, 아스페르질루스 니게르 진균의 야생형 GOx 를 의미한다. 용어 "GOx-T30V; I94V; 또는 T30VI94V; 또는 이중 돌연변이체; 또는 부모 돌연변이체" 란, Zhu 등 (2006; 2007) 에서 기재된 바와 같이 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 를 가지는 GOx 변이체를 의미한다.
본 발명에 따른 GOx 변이체(들) 모두는 공통적으로 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V, 및 본 발명에 따른 대체에 적합한 나머지 19 개의 단백질생성 아미노산의 하나에 의한 위치(들) S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 중 어느 것에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가진다. 각각의 "EZ" 숫자는 본 명세서 텍스트를 통해 본 발명에 따른 GOx 변이체(들) 를 약기할 수 있다. "EZ" 는 효소를 나타낸다.
따라서, 효소 "글루코오스 옥시다아제" 는, 공급원 또는 공여체로부터의 산소를 기질에 첨가, 삽입, 기여 또는 이동시킴으로써, 산화 반응을 촉매하는 산화 효소의 부류의 구성원이다. 이러한 효소는 또한 옥시도리덕타아제 또는 산화환원 효소로서 호칭되며, 옥시게나아제, 하이드로게나아제 또는 리덕타아제, 옥시다아제 및 퍼옥시다아제를 포괄한다.
이와 관련하여, 용어 "산소 공여체", "산화제" 및 "옥시던트" 란, 산화 반응에서 산소를 기질에 공여하는 물질, 분자 또는 화합물을 의미한다. 전형적으로, 산소 공여체는 환원된다 (전자를 수용한다). 예시적인 산소 공여체는, 예를 들면, 분자 산소 또는 이산소 (O2) 를 포함하고, 퍼옥사이드는, 예를 들면, t-부틸 퍼옥사이드, 가장 바람직하게는 과산화수소 (H2O2) 와 같은 알킬 퍼옥사이드를 포함한다. "퍼옥사이드(들)" 는 서로 결합된 2 개의 산소 원자를 가지는 임의의 화합물(들)이다.
언급된 바와 같이, 본원에서 사용되는 글루코오스 옥시다아제 또는 GOx 변이체의 "활성" 또는 "효소 활성" 은 산화 반응 D-글루코오스 + O2 → 글루코노락톤 + H2O2 를 촉매하는 이의 능력의 척도에 관한 것이며, 반응 생성물이 생성되는 속도로 표현될 수 있다. 예를 들면 글루코오스 옥시다아제 활성은 단위 시간 당 또는 단위 글루코오스 옥시다아제 (예를 들면, 농도 또는 중량) 당 생성된 생성물 (글루코노락톤 및/또는 H2O2) 의 양으로서 표시될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드(들)은 또한 본원에서 제조되었거나, 변경되었거나, 유도되었거나, 어떤 방식으로든 아스페르질루스 니게르 자체의 GOx-WT 및 서열 번호: 1 에 따른 GOx-T30V; I94V 와 상이하거나 이들로부터 변화되는 것을 의미하는, "돌연변이", "돌연변이단백질" 또는 "변이체" 또는 "변형 GOx" 또는 "변형" 인 것으로 지칭될 수 있다.
아스페르질루스 니게르의 GOx-WT 단백질은 서열 번호: 2 에 따른 아미노산의 천연 서열을 포함한다. 따라서, "부모 돌연변이체" 또는 "이중 돌연변이체" 는, 본원에서 기재된 임의의 방법, 도구 또는 기술을 사용하여, 임의의 다른 본원에서 제공된 GOx 폴리펩타이드가 유도되거나 제조되는 GOx 폴리펩타이드이다. 본 발명에 따르면, "부모 돌연변이체" 또는 "이중 돌연변이체" 는 서열 번호: 1 에 따른 폴리펩타이드이다.
결과적으로, "부모 폴리뉴클레오타이드" 는 부모 폴리펩타이드를 암호화하는 것, 즉, 서열 번호: 10 에 따른 폴리뉴클레오타이드이다.
용어 "돌연변이" 또는 "변이" 또는 "변형" 이란, 유전 물질, 예를 들면, DNA 또는 RNA, 또는 임의의 공정, 매커니즘에서의 임의의 검출가능한 변화, 또는 이러한 변화의 결과를 의미한다. 이것은 유전자의 구조 (예를 들면, DNA 또는 RNA 서열) 가 변경된 유전자 돌연변이, 임의의 돌연변이 과정에서 발생하는 임의의 유전자 또는 DNA 또는 RNA, 및 변형된 유전자 또는 DNA 서열에 의해 발현된 임의의 발현 산물 (예를 들면, 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드) 을 포함한다. 이러한 변화는 또한 프로모터, 리보솜-결합 부위 등에서의 변화를 포함한다.
본 개시내용의 문맥에서, 표현 "산소 이외의 특정 매개체", "산소 이외의 특정 전자 매개체", "특정 고정 매개체" 및 "산소 이외의 특정 전자 수용체" 란, 니트로소아닐린 및 이의 유도체, 아조-화합물, 페나진 및 이의 유도체, 페노티아진 및 이의 유도체, 페녹사진 및 이의 유도체, 페로센 및 이의 유도체, 칼륨 페리시아나이드, Ru- 및 Os-착물, 퀴논 및 이의 유도체, 인도페놀, 비올로겐, 테트라티아풀발렌 및 이의 유도체, 및 프탈로시아닌을 포함하는 군으로부터 선택된 매개체/전자 매개체를 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 표현 "산소 이외의 특정 매개체", "산소 이외의 특정 전자 매개체", "특정 고정 매개체" 및 "산소 이외의 특정 전자 수용체" 란, 또한 FADH2 에 의해 신속히 환원되지만 2-[4-(디메틸아미노)페닐]-디아젠카복스아미드의 유도체와 같은 아스코르브산에 의해 느리게 환원되거나 환원되지 않는 전자 매개체를 의미한다.
약어
AA - 아미노안티피린
HRP - 서양고추냉이 퍼옥시다아제(들)
GOx - 글루코오스 옥시다아제(들)
GOx-WT 또는 WT - 아스페르질루스 니게르 진균의 야생형 GOx
GDH - 글루코오스 데하이드로게나아제
ABTS - 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)
PMO - 포스포몰리브덴산
서열 설명
폴리펩타이드 서열
Figure 112015072745768-pct00001
Figure 112015072745768-pct00002
Figure 112015072745768-pct00003

뉴클레오타이드 서열
Figure 112015072745768-pct00004
Figure 112015072745768-pct00005
Figure 112015072745768-pct00006
Figure 112015072745768-pct00007
Figure 112015072745768-pct00008

하기 실시예 섹션에서, 모든 시약, 제한 효소 및 기타 재료는, 시판되는 다른 출처가 명시되지 않는다면, Roche Diagnostics Germany 사로부터 수득되었으며, 공급자에 의해 주어진 설명서에 따라 사용되었다. DNA 의 정제, 특성화 및 클로닝에 적용되는 작업 및 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며 [ Ausubel , F., et al ., in " Current protocols in molecular biology " (1994), Wiley ], 당업자에 의해 필요에 따라 개조될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 걸쳐 상세히 설명될 것이지만, 본 발명은 이러한 특정 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 핵심은 혈당 측정 분야에서 공지된 GOx 에 비해 향상된 특성을 나타내는, 즉, 이의 글루코오스 기질에 대한 특이성을 유지하고 옥시다아제 활성으로부터 데하이드로게나아제 활성으로의 이동을 통해 산소 소비율을 현저하게 감소시키고/거나 산소 이외의 특정 전자 매개체에 대한 감소 활성을 가지는 특정 GOx 변이체의 예기치 않고도 놀라운 발견이다.
본 발명에 따른 GOx 변이체의 GOx 특성을 증명하기 위해서, 본 발명자들은 분자 산소의 과산화수소로의 환원을 나타내는 이용가능한 활성 어세이의 대부분에 의존하지 않을 수 있었다. 구체적으로, 매개된 전자 이동을 위해서, Zhu 등 (2006; 2007) 은 생성물 기반 GOx 검출 어세이 (이하, GODA) 를 확립하였다 [ Zhu , Z., Momeu , C., Zakhartsev , M., and Schwaneberg , U. (2006). Making glucose oxidase fit for biofuel cell applications by directed protein evolution . Biosensors and Bioelectronics 21, 2046-2051; Zhu , Z., Wang , M., Gautam , A., Nazor , J., Momeu , C., R, P., and U, S. (2007). Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus niger for ferrocenemethanol-mediated electron transfer . Biotechnology Journal 2, 241-248]. 상기 어세이는 실제로 글루코노락톤의 산소 비의존적 검출을 고려하지만, 여전히 산소의 존재 하에서, 산소 이외의 매개체에 의해 매개된 전자 이동을 특이적으로 검출하는 것은 가능하지 않은데, 이것은 실시간 혈당 분석 장치의 경우에 크게 관련되어 있다.
그러므로, 하기 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 핵심을 증명하기 위해서 이의 매개된 전자 이동, 산소에 의한 전자 이동 및 이의 글루코오스 특이성에 대해 별도로 본 발명의 특정 GOx 변이체를 테스트하였다. 추가로, 열 안정성의 면에서의 특성도 또한 테스트하였다.
결과적으로, 본 발명자들은 잘 공지되어 있는 ABTS 어세이 [ Sun , L., Bulter , T., Alcalde, M., Petrounia , I.P., and Arnold , F.H. (2002). Modification of galactose oxidase to introduce glucose 6- oxidase activity . Chembiochem 3, 781-783] 를 사용하여 산소에 대한 GOx 변이체의 활성을 검출하였다. 도 1 은 산소에 대한 활성 측정의 원리를 도시한다.
GOx 변이체에 대한 테스트
글루코오스 특이성, 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 특정 매개체에 대한 증가 활성의 면에서 GOx 특성에 대한 이의 향상에 적절한 아미노산 치환을 테스트하기 위해서, 본 발명의 특정 GOx 변이체를 하기에 대해 테스트하였다:
(i) 이의 산소 소비율, 즉, 비색 ABTS 어세이에서 전자 수용체로서의 산소를 사용하는 효소 활성에 대해
(ii) 예시적 매개체로서의 니트로소아닐린 매개체에 의한 매개된 전자 이동에 대해
(iii) 기질로서의 다양한 당, 즉, 글루코오스, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스, 말토트리오스의 존재 하에 예시적 매개체로서의 니트로소아닐린 매개체에 의한 매개된 전자 이동에 대해.
상기 매개된 전자 이동을 위해서, p-니트로소아닐린 화합물을 사용하였다 [Becker, O. (2005). Die Glucose - Dye - Oxidoreduktase in der klinischen Diagnostik . DISSERTATION thesis , Technische Universitat Kaiserslautern , Kaiserslautern ]. 도 2 는 니트로소아닐린 매개체 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린을 적용한 매개체 어세이, 즉, PMO (포스포몰리브덴산)-어세이의 원리를 도시한다.
상기 어세이에서, 매개체 반응으로부터 나온 2 개의 전자는 PMO 로 이동한다. PMO 는 후속적으로 환원된다. 산화된 PMO 의 옅은 황색으로부터 환원된 PMO 의 짙은 청색으로의 색 변화를 700 nm 의 흡수에 의해 모니터링하였다.
본 발명에 따른 특정 GOx 변이체를 증명하기 위해서, 상기에서 기재된 매개체 어세이는 칼륨 포스페이트 버퍼 (0.2 M, pH 7.0) 중에서 0.65 U/L 내지 22 U/L 의 넓은 선형 검출 범위를 나타내는 효모 세포 상청액에서의 낮은 GOx 활성으로 개조하였다. 10.2% 의 96-웰 플레이트에 대한 표준 편차는 상기 조건 하에서 도달하였다. 표준 편차의 산출을 위해서, 배경은 음성 대조군의 값을 뺀 것 (진정 표준 편차) 으로 간주하였다.
글루코오스 옥시다아제 변이체
본 발명에 따르면, Zhu 등 (2006; 2007) 에서 기재된 바와 같은 이중 돌연변이체를 본원에서 제공된 특정 아미노산 치환을 위한 출발 물질로서 선택하였다. 이러한 이중 돌연변이체는 본래 존재하는 2 개의 치환 T30V 및 I94V (서열 번호: 1) 를 가지고 있다. GOx-T30V; I94V 는 향상된 열 안정성, 향상된 pH-안정성 뿐만 아니라, 증가된 kcat 값 (69.5/s 내지 137.7/s) 을 나타낸다 [ Zhu , Z., Wang , M., Gautam , A., Nazor , J., Momeu, C., R, P., and U, S. (2007). Directed evolution of glucose oxidase from Aspergillus niger for ferrocenemethanol - mediated electron transfer . Biotechnology Jounal 2, 241-248].
저글리코실화 사카로마이세스 세레비지아에 균주를 발현 숙주로서 선택하였다 [ Lehle , L., Eiden , A., Lehnert , K., Haselbeck , A., and Kopetzki , E. (1995). Glycoprotein biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae : ngd29 , an N- glycosylation mutant allelic to och1 having a defect in the initiation of outer chain formation . FEBS Lett 370, 41-45].
본 발명에 따른 특정 아미노산 치환을 보유하는 세포 클론의 배양 후, 매개체 어세이 및 ABTS-어세이를 병행하여 적용하였다. 매개체 활성 증가, 산소 활성 감소 또는 둘 다를 나타낸 클론을 추가의 조사를 위해 선택하였다. 그러므로, 선택된 클론 및 대조군을 배양하고, 12 회 스크리닝하였다. 후속적으로, 본 발명에 따른 향상된 변이체의 GOx-유전자를 단리하고, 서열분석하였다. 이후, 선택된 변이체의 상기 유전자는 추가의 특정 아미노산 치환을 위한 주형으로서의 역할을 하였다.
아미노산 위치의 특성화
본 발명자들은 본원에서 제공된 GOx 변이체의 특정 아미노산 위치, 즉, S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 을 추가로 특성화하였다. 이들 위치는 도 3 에 도시되어 있다.
사전 특성화 ( Pre - characterization )
특정 GOx 변이체를 추가로 조사하기 위해서, 본 발명자들은 하기 특성을 고려하여 사전 특성화를 수행하였다:
1) 산소 소비
2) 기질로서의 글루코오스에 대한 특이성
3) Michaelis-Menten 반응속도 (매개체 활성/글루코오스 친화도) 및
4) 열 안정성.
상응하는 세포 클론의 배양은 통상적인 진탕 플라스크에서 수행하였다. 상청액을 농축하고, 0.2 M 칼륨 포스페이트, pH 7 중에서 완충시켰다.
1) 산소 소비율
하기 재료 및 방법 섹션에서 항목 gg) 하에 개략적으로 서술된 발색성 기질 ABTS 의 산화에 의해 산소 소비를 간접적으로 측정하였다. 이러한 데이터를 증명하기 위해서, 광학 산소 프로브를 사용하여 산소 소비를 직접 측정하였다. GOx-변이체는 반응 접근법으로 2 U/L 로 표준화하였다.
2) 특이성
상기에서 이미 개략적으로 서술된 바와 같이, 글루코오스 기질에 대한 GOx 특이성은 효소적 글루코오스 측정에서 중요한 역할을 하는데, 이는 글루코오스 바로 옆의 임상적 관련 당, 예를 들면, 4 개의 당, 즉, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스 및 말토트리오스가 존재하기 때문이다. 그러므로, 본원에서 제공된 GOx 변이체의 특이성을 증명하기 위해서, 상기 당을 선택하고, 글루코오스와 비교하였다. 이들 연구를 위해서, 매개체 어세이를 사용하였으며, 181.8 mM 의 각각의 당을 적용하였다.
3) 매개체 활성 / 글루코오스 친화도
매개체 활성에 대한 보다 상세한 연구 및 글루코오스 친화도의 측정을 위해서, 본 발명자들은 Michaelis-Menten 반응속도를 위한 본원에서 개시된 변이체의 테스트를 적용하였다.
4) 열 안정성
선택된 본 발명의 GOx 변이체의 열 안정성은 항목 ff) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 매개체 어세이를 적용하여 분석하였다. 추가의 대조군으로서, 아스페르질루스 니게르에서 발현된 과글리코실화 GOx 및 탈글리코실화 GOx-WT 를 또한 분석하였다.
GOx 변이체 GOx - EZ07 의 최종 특성화
최종 특성화를 위해서, 각각의 GOx-EZ07 발현 사카로마이세스 세레비지아에 (S. cerevsiae) 균주를 10 L 발효기에서 배양한 후, 수득된 GOx-EZ07 을 정제하였다. 최종 효소 제제의 순도는 50 mM 칼륨 포스페이트 버퍼 pH 7 중에서 90% 초과이었다. 사전 특성화 단계에서와 같이, 산소 소비, 특이성, 활성 및 글루코오스 친화도를 연구하였다. GOx 농도의 구체적인 측정을 위해서, ELISA 를 적용하였다 (항목 ee) 하의 재료 및 방법 참조).
변이체 GOx-EZ07 는 하기의 면에서 특성화하였다:
1a) 산소 소비
2a) 기질로서의 글루코오스에 대한 특이성
3a) Michaelis-Menten 반응속도 (매개체 활성/글루코오스 친화도) 및
4a) 열 안정성.
1a) GOx - EZ07 의 산소 소비
측정은 1) 에서 기재된 바와 같이 실시하였다. 모든 테스트된 효소 (GOx-WT; GOx-T30V; I94V 및 GOx-EZ07) 를 항목 dd) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 바와 같은 표준 프로토콜에 따라 정제하고, 5 μg/mL 의 단백질 농도로 조정하였다.
하기 산소 소비율을 검출하였다 [%/분]: GOx-WT: 17.44; GOx- T30V; I94V: 24.22, 및 본 발명의 GOx-EZ07: 3.86. GOx-EZ07 의 잔류 산소 활성은 GOx-T30V;I94V 와 비교하여 15.9% 이고, GOx-WT 와 비교하여 22.13% 이다.
2a) GOx - EZ07 의 특이성
측정은 2) 에서 기재된 바와 같이 실시하였다.
3a) GOx - EZ07 의 Michaelis - Menten 반응속도
측정은 3) 에서 기재된 바와 같이 실시하였다.
4a) 열 안정성
측정은 4) 에서 기재된 바와 같이 실시하였다.
결과
본 발명자들은 6 개의 뚜렷한 아미노산 위치 S53; A137; A173; A332; F414; 및 V560 을 찾아 냈으며, 이들은 산소 소비율 감소 및/또는 산소 이외의 매개체에 대한 매개체 활성 증가를 담당한다. 추가로, 본 발명자들은 당업자가 글루코오스 특이성, 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 산소 이외의 매개체에 대한 현저하게 증가된 활성의 면에서 GOx 변이체를 디자인할 수 있도록 하는 6 개의 아미노산 위치 중에서 협력 효과를 찾아 냈다.
특히, 본 발명자들은 단독으로 또는 조합으로 산소 소비율을 현저하게 감소시키는 것을 담당하고/하거나 매개체 활성을 현저하게 증가시키는 것을 담당하는 위치 V560 및 F414 를 찾아 냈다. 또한, 위치 A173 및 A332 는 조합으로 둘 다, 즉, 본원에서 제공된 GOx 변이체의 매개체 활성에서의 현저한 증가 및 부수적으로 산소 소비율에서의 현저한 감소를 담당하는 것으로 밝혀졌다. 위치 S53 및 A137 는 산소 이외의 특정 매개체에 대한 매개체 활성을 현저하게 증가시키는 것을 담당하는 것으로 밝혀졌다.
추가로, 본 발명자들은 본 발명에 의해 제공된 GOx 변이체에 적합한 특정 아미노산을 밝혀 냈다.
Figure 112015072745768-pct00009
테스트된 본 발명에 따른 GOx 변이체의 특이적 활성은 각각의 EZ 번호지정에 의해 표 2 에 나타나 있다. 본 표는 매개체 어세이를 통한 매개체 활성 및 ABTS 어세이를 통한 산소 소비 특성과 관련하여 테스트된 본 발명에 따른 GOx 변이체의 비교이다.
그 결과는 본 발명에 따른 GOx 변이체와 부모 돌연변이체, 즉, 출발 물질로서의 GOx-T30V; I94V 사이의 비율 (몫) 의 형태로 나타나 있다. 다양한 마이크로타이터 플레이트의 결과는 비교할 만하였다. 비율은 항목 ee) 하의 재료 및 방법 섹션에서 개략적으로 서술된 통상적인 ELISA 로 측정한 특이적 활성 [U/mg] 을 기반으로 한다. 본 표는 또한 본 발명에 따른 테스트된 아미노산 위치의 정확한 치환을 나타낸다.
Figure 112015072745768-pct00010
상기 결과는 다양한 특정 변이체 (EZ03, EZ05, EZ12, EZ06, EZ07, EZ08, EZ10, EZ11, EZ15) 가 본 발명에 따른 필수 특성, 즉, 부모 돌연변이체 GOx-T30V; I94V 와 비교하여 현저하게 감소된 산소 소비율 및/또는 증가된 매개체 활성을 초래하는 산소 친화도 감소를 가지는 것을 나타낸다. 변이체 EZ03, EZ05, EZ07, EZ08 및 EZ10 은 추가의 연구를 수행하였다.
예를 들면, 본 발명자들은 GOx-EZ07 및 EZ10 이 부모 돌연변이체와 비교하여 증가된 매개체 활성에 대한 현저한 향상 뿐만 아니라 산소 어세이에서의 현저한 감소 둘 다를 나타내는 것을 밝혀냈다.
특히 본 발명자들은 변이체 EZ07 이 현저하게 향상된 본 발명에 따른 GOx 변이체이고 상기 변이체의 상응하는 특정 아미노산 치환에 대한 어떠한 제한도 없는 것을 밝혀냈다. EZ07 은 부모 돌연변이체와 비교하여 매개체 어세이에서 4.4 배의 증가를 나타내고, ABTS-어세이에서 부모 돌연변이체의 산소 활성의 0.1 배의 산소 활성을 나타낸다. 이와 대조적으로, GOx 변이체 EZ12 및 EZ15 는 부모 돌연변이체와 비교하여 매개체 활성과 산소 활성 둘 다에 대한 부수적 증가를 나타낸다. EZ12 는 부모 돌연변이체와 비교하여 위치 S53 에서 추가의 치환을 보유한다 (표 2 참조). 추가로, EZ15 는 아미노산 치환 A137L 로 인해 매개체 활성에서 6 배의 증가를 가지는 것으로 밝혀졌다.
아미노산 위치의 특성화
위치 A173 및 A332 은 활성 부위와 멀리 떨어져 있다. A173 은 표면 위치이고; A332 는 기질 입구 채널과 가깝게 위치하고 있다. 산소 활성에 영향을 미치는 2 개의 위치 F414 및 V560 은 활성 부위와 가깝게 위치하고 있다. F414 는 글루코오스-결합 부위 위에 있고, V560 은 글루코오스 및 FAD 의 바로 옆에 위치하고 있다. 2 개의 활성 위치 A137 와 S53 둘 다는 FAD 와 가까운 표면 위치이다.
사전 특성화
선택된 사전 특성화된 변이체에 대한 결과는 하기와 같다:
1) 산소 소비율
도 4 는 시간의 함수로서 반응 혼합물 중 산소 함량의 진행 (a) 및 분 당 산소 소비율 (b) 을 도시한다. 대조군으로서, GOx-T30V; I94V, GOx-WT 및 음성 대조군 균주의 상청액을 또한 분석하였다.
GOx-WT 및 GOx-T30V; I94V 는 유사한 거동을 나타낸다. 따라서, 여기서 테스트된 모든 GOx 변이체 (EZ03, EZ05, EZ07, EZ08, EZ10) 는 현저하게 감소된 산소 소비율을 가진다. 더욱이, 놀랍고도 예기치 않은 본 발명의 발견으로서, 테스트된 변이체는 음성 대조군과 명확히 구별될 수 없고, 모두는 각각의 산소 활성이 선택된 조건 하에서 심지어 어세이의 검출 범위 아래에 있는 것을 나타낸다.
2) 특이성
표 3 은 글루코오스를 기준으로 한 잔류 GOx 효소 활성을 도시한다.
Figure 112015072745768-pct00011
GOx-WT 및 서열 번호: 1 에 따른 부모 돌연변이체 GOx-T30V; I94V 와 비교하여, 본 발명의 GOx 변이체의 어떠한 것도 말토오스 또는 말토트리오스의 현저한 방해를 나타내지 않는다. EZ07 및 EZ10 은 모든 테스트된 당에 대해 가장 양호한 결과를 가진다.
3) 매개체 활성 / 글루코오스 친화도
Michaelis-Menten 반응속도는 도 5 에 제시된다. 표 4 는 Vmax 및 KM 에 대한 계산치를 나타낸다.
Figure 112015072745768-pct00012
표 4 는 EZ07 이 부모 돌연변이체 GOx-T30I; I94V 와 비교하여 한편으로는 대략 7.5 배 더 높은 Vmax 값, 다른 한편으로는 거의 2 배 더 높은 KM 값을 가지는 것을 나타낸다. 그러나, 높은 KM 값은 높은 Vmax 값의 결과이다. 도 5 에서, 낮은 기질 농도에서의 GOx-EZ07 의 성능이 WT 및 부모 돌연변이체 T30V, I94V 에 필적할 만하다는 것을 명확히 볼 수 있다. GOx-EZ10 은 유사한 결과에 도달했지만 더 낮은 Vmax 값에 도달했다.
4) 열 안정성
도 6 에서, 잔류 활성을 8 개의 다양한 온도에 대해서 도식화한다.
테스트된 본 발명에 따른 GOx 변이체, GOx-WT 및 GOx-T30V; I94V 부모 돌연변이체는 유사한 결과를 나타낸다. 열 안정성에서의 현저한 저하는 탈글루코실화 GOx-WT 에 대해서 관찰될 수 있고; 그러나, 과글루코실화 분자는 보다 높은 열 안정성을 나타낸다.
결론
모든 사전 특성화 연구 동안의 특정 테스트 1) 내지 4) 의 결론으로, GOx-EZ07 및 GOx-EZ10 변이체는 가장 현저한 결과를 나타냈다. 산소 활성에서의 현저한 저하 뿐만 아니라, 매개체 활성에서의 현저한 증가는 사전 특성화 결과에 따라 달성되었다. GOx-EZ07 및 GOx-EZ10 의 특이성은 거의 변하지 않았으며, 자일로오스에 대한 약간의 활성 변화만이 검출되었다. EZ07 의 활성은 EZ10 의 활성 보다 대략 1.7 배 더 높기 때문에, 최종 특성화를 위해 GOx-EZ07 을 선택하였다.
정제되지 않은 본 발명의 GOx 변이체를 사용하여 상기 결과를 생성하였다는 것은 강조되어야 한다. 따라서, 당업자는 상기 결과가 유사한 정제된 GOx 변이체를 사용한 후 달라질 수 있다는 것을 알고 있다. 또한, ELISA 를 적용하는 세포 상청액에서의 특정 단백질 측정은 불순물에 의해 영향을 받을 수 있다.
변이체 GOx - EZ07 의 최종 특성화
최종 특성화를 위해서, 정제된 GOx-EZ07 변이체를 선택하였다.
1a) GOx - EZ07 의 산소 소비
GOx-WT, GOx-T30V; I94V, 및 GOx-EZ07 의 상대적 산소 소비율을 도 7 에 도시한다.
선택된 조건 하에서, GOx-EZ07 의 산소 소비율은 GOx-WT 와 비교하여 10 배 보다 더 감소하고, 모두는 사전 특성화 연구의 데이터를 확인한다.
2a) GOx EZ07 의 특이성
도 8 은 글루코오스 (100%) 를 기준으로 한 GOx-WT, GOx-T30V; I94V 및 GOx-EZ07 의 잔류 활성을 도시한다. 도 8 은 GOx-T30V; I94V 및 GOx-WT 와 비교하여 GOx-EZ07 의 특이성에서 현저한 변화가 없는 것을 나타낸다.
3a) GOx 변이체 EZ07 의 Michaelis - Menten 반응속도
도 9 는 매개체 어세이에서의 GOx-WT, GOx-T30V; I94V 및 GOx-EZ07 의 반응속도를 비교한다.
도 9 에 따르면, GOx 변이체 EZ07 은 37 배 감소된 옥시다아제 활성을 초래하는 GOx-WT 와 비교하여 641.5% 의 매개체 어세이에서의 잔류 활성 및 17.5% 의 ABTS 어세이에서의 잔류 활성을 나타낸다.
4a) GOx - EZ07 의 열 안정성
도 10 은 GOx-EZ07 의 열 안정성이 GOx-WT 및 GOx-T30V; I94V 와 비교할 때 각각의 치환에 의해 유지되었다는 것을 나타낸다.
GOx 변이체의 요약
6 개의 아미노산 위치를 부모 돌연변이체 GOx-T30V, I94V 에서 확인하였는데, 이들은 본원에서 제공된 GOx 변이체의 글루코오스 특이성, 매개된 전자 이동을 위한 효소 활성 및 산소 활성에 대한 효과를 나타낸다. 모든 위치를 개별적으로 포화시켰다. 협력 효과를 연구하기 위해서, 활성 부위 주위에서 무리를 이루는 위치들 (S53; A137; A173; A332; F414; V560) 을 동시에 포화시켰다. 부모 돌연변이체 특성과 비교하여 향상된 매개체 활성 및/또는 감소된 산소 소비율에 대해 가장 현저한 변이체를 사전 특성화를 위해 선택하였다. GOx-EZ07 변이체 (추가의 치환 A173V; A332S; F414I; 및 V560T 를 가짐) 는 테스트된 특성, 즉, 본 발명의 의미에서 글루코오스 특이성, 매개체 활성 및 산소 소비율에 대해 가장 현저한 결과를 나타낸다.
따라서, GOx- EZ07 를 이의 매개체 활성, 옥시다아제 활성, 글루코오스 특이성 뿐만 아니라, 이의 열 안정성 특성에 대해 집중적으로 연구하였다. 상기 변이체는 매개된 전자 이동을 위한 특이적 활성에서의 6.4 배의 증가 (GOx-WT: 7.4; GOx-EZ07: 47.5 U/mg), 및 36.5 배 감소된 옥시다아제 활성을 초래하는 ABTS 어세이에서의 5.7 배의 감소 활성 (GOx-WT: 451.1 U/mg; GOx-EZ07: 78.86 U/mg) 을 나타낸다. GOx-EZ07 은 열 안정성 또는 특이성에서 현저한 변화를 가지지 않는다.
재료 및 방법
모든 화학물질은 분석 등급이며, Sigma-Aldrich 사 (Taufkirchen, Germany), Applichem 사 (Darmstadt, Germany) 또는 Carl Roth 사 (Karlsruhe, Germany) 로부터 구입하였다. 모든 효소는 New England Biolabs 사 (UK) 및 Sigma-Aldrich 사 (Taufkirchen, Germany) 로부터 구입하였다. pYES2 셔틀 벡터 및 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli) 균주 DH5a 는 Invitrogen 사 (Karlsruhe, Germany) 로부터 구입하였다. 사카로마이세스 세레비지아에 균주 7087 (ngd29mnn1) 은 Roche diagnostics 사에 의해 제공되었다 [ Lehle , L., Eiden , A., Lehnert , K., Haselbeck , A., and Kopetzki , E. (1995). Glycoprotein biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae : ngd29 , an N- glycosylation mutant allelic to och1 having a defect in the initiation of outer chain formation . FEBS Lett 370, 41-45]. NanoDrop 광도계 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) 를 사용하여 DNA 를 정량화하였다. 서열분석 및 올리고뉴클레오타이드 합성을 Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany) 에 의해 수행하였다. 사용된 프라이머는 표 5 에서 언급한다 (지원 정보).
aa ) 다중 및 단일 부위 포화 돌연변이유발
다중 부위 포화 돌연변이유발을 위해서, Omnichange 프로토콜을 적용하였다 [ Dennig , A., Shivange , A.V., Marienhagen , J., and Schwaneberg , U. (2011). OmniChange : The Sequence Independent Method for Simultaneous Site - Saturation of Five Codons . PLoS ONE 6, e26222 ]. 400 μl 의 PCR 반응 혼합물은 1 ng/μl 의 플라스미드 주형, 1x Phusion 버퍼 (New England Biolabs, Frankfurt, Germany), 1 U 의 Phusion 폴리머라아제 및 200 μM dNTP 를 함유하였다. 반응 혼합물을 4 개의 동일 용적으로 나누고, 단편 증폭을 위해 250 nM 의 특정 부위를 표적화하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 첨가하였다. 벡터 백본 증폭을 위한 혼합물에서, 추가의 dNTP 를 300 μM 의 최종 농도에 도달하도록 첨가하였다. A173 을 포적화하는 단편 1 을 위해서, 프라이머 P7 및 프라이머 P8 을 마스터 믹스에 첨가하였다. 이에 반해, A332 포화 동안, P9 및 P10 을 사용하였다. P11 및 P12 를 사용하여 F414 부위를 표적화하였다. V560 부위는 벡터 백본에 포함되어 있는데, 이는 이것이 P13 및 P14 에 의해 증폭되었기 때문이다. 단편의 증폭을 위한 PCR 프로그램은 45 초 동안 98℃ (1 사이클); 15 초 동안 98℃; 30 초 동안 65℃; 30 초 동안 72℃ (20 사이클); 5 분 동안 72℃ (1 사이클) 이었다. 벡터 백본 증폭을 위해서, 4 분의 연장 시간을 적용하였다. 모든 단편을 컬럼 정제하고, 농도를 NanoDrop 광도계 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) 상에서 측정하였다. 이어서, PCR 생성물을 하룻밤 DpnI 소화를 수행하였다 (각각 5 U).
단편의 소화 및 리게이션: 삽입 단편의 농도를 0.06 pmol/μl 로 조정하였다. 이에 반해, 벡터 백본 농도를 0.02 pmol/μl 로 조정하였다 (DpnI 소화에 의한 희석 인자도 또한 고려하였다). 1 μl 의 절단 용액 (50% (500 mM Tris pH 9.0, 30% (에탄올 중의 100mM 요오드) 및 20% dH2O) 을 4 μl 의 각각의 단편에 첨가하였다. 이어서, 반응물을 70℃ 에서 5 분 동안 항온처리하였다. 절단된 단편을 함께 혼합하고, 라이브러리 증폭을 위한 화학 적격 에세리키아 콜라이 DH5a 의 형질전환 전에 실온 (RT) 에서 5 분 동안 항온처리하였다. 효모 형질전환을 위해서, 플라스미드 단리 키트 "NucleoSpin® Plasmid" (MACHERY-NAGEL, Duren, Germany) 를 사용하여 유전자 라이브러리를 에세리키아 콜라이 DH5a 로부터 단리하였다.
개별적 부위 포화 돌연변이유발 (site saturation mutagenesis: SSM) 을 위해서, 2 단계 PCR 프로토콜을 따랐다 [ Sambrook , J., and Russel , D. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual , Volume 2 ( Cold Spring Harbor Laboratory Press )]. 50 μl 의 PCR 반응 혼합물은 1 ng/μl 의 플라스미드 주형, 1x Phusion 버퍼 (New England Biolabs, Frankfurt, Germany), 1 U 의 Phusion 폴리머라아제 및 300 μM dNTP 를 함유하였다. 반응 혼합물을 2 개의 동일 용적으로 나누고, 반응 혼합물을 분리하기 위해 400 nM 의 표적화 부위의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 첨가하였다. PCR 프로그램은 45 초 동안 98℃ (1 사이클); 15 초 동안 98℃; 30 초 동안 65℃; 4 분 동안 72℃ (5 사이클); 5 분 동안 72℃ (1 사이클) 이었다. 제 1 단계 후, 두 반응물을 모으고, 증폭 사이클 동안 동일 프로그램을 15 회 초과로 반복 수행하였다. 하기 프라이머를 사용하였다: 위치 173 에 대한 P15/P16, 위치 332 에 대한 P17/P18, 위치 414 에 대한 P19/P20, 및 위치 560 에 대한 P21/22. PCR 생성물을 컬럼 정제한 후, DpnI 소화를 수행하였다.
bb ) 유전자 클로닝 및 효모 세포 형질전환
재조합 매개된 무 리가아제 방법에 따라, 돌연변이된 GOx-유전자를 pYES2 벡터 백본으로 클로닝을 수행하였다 [ Oldenburg , K.R., Vo , K.T., Michaelis , S., and Paddon , C. (1997). Recombination - mediated PCR - directed plasmid construction in vivo in yeast . Nucleic Acids Research 25, 451-452]. 첫째로, 2 μg 의 pYES2-GOx T30V, I94V 이중 돌연변이체를 SalI/BamHI 소화 (10 U/μg 의 DNA, 6 시간, 37℃) 에 의해 선형화한 후, NucleoSpin® Extract II - 키트 (MACHERY-NAGEL, Duren, Germany) 를 이용하여 겔-추출에 의해 정제하였다. 전체 프라이머 서열이 선형화된 벡터 백본과 상보적으로 되도록 하는 방식으로, 라이브러리 증폭을 위해 사용된 프라이머를 소화시켰다.
둘째로, 선형화된 pYES2-벡터와 증폭된 유전자 라이브러리를 1:3 (250 ng/750 ng) 의 비율로 혼합하였다. 리튬 아세테이트 방법을 이용하여 이러한 DNA-믹스를 사카로마이세스 세레비지아에 7087 의 형질전환을 위해 사용하였다 [ Gietz , R.D., and Schiestl , R.H. (2007). High - efficiency yeast transformation using the LiAc / SS carrier DNA / PEG method . Nature Protocols 2, 31-34]. 2% 글루코오스를 함유하는 SC-U 선택적 플레이트 상에서 형질전환체를 성장시켰다. 원형 플라스미드의 형질전환을 위해서, 300 ng 의 DNA 를 사용하였다.
cc ) 96-웰 플레이트에서의 배양 및 발현
2% 글루코오스를 함유하는 SC-U 선택적 한천 플레이트 상에서 성장한 단일 클론을, 웰 당 100 μL 의 SC-U 배지 (1% 글루코오스) 를 함유하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (PS-F-바닥, 그라이너 바이오-온) 로 투스픽 (toothpick) 을 사용하여 옮겼다. 사전 배양물의 배양은 하기 조건 하에 플레이트 진탕기 (Infors GmbH, Eisenach, Germany) 에서 수행하였다: 900 rpm, 30℃, 70% 습도, 24 시간. 일정량의 사전 배양물을 각각의 웰로부터 ‹K 웰 플레이트 (리플레이트-사각형, 리터) 중의 500 μL 의 SC-U 자가-유도 배지 (0.5% 글루코오스 / 2% 갈락토오스) 로 옮겼다. 72 시간 이외에는 사전 배양과 동일한 조건 하에서 본 배양물을 배양하였다. 플레이트를 4000 rpm 및 RT 에서 20 분 동안 원심분리하였다. 수득된 상청액을 활성 측정에 사용하였다.
dd ) 재조합 GOx 의 제조 및 정제
사전 배양: Sc7087/pYES2-GOx 의 하룻밤-배양물을 사용하여 500 mL 의 SynY 배지 (2% 글루코오스) 에 OD 600 = 0.2 로 접종하고, 배양은 5L 진탕 플라스크에서 12 시간 동안 30℃ 및 250 rpm 에서 수행하였다. 본 배양: 10 L 의 SynY 배지 (1% 글루코오스) 에 500 mL 사전 배양물을 접종하였다. 배양을 위해서, 다음 조건을 적용하여 10 L 의 발효기를 사용하였다: 온도: 30℃; 교반기: 400 rpm; 공기 흐름: 1 vvm; 시간: 48 시간.
세포 분리 및 버퍼 교환: GOx 함유 상청액을 미세-여과로 회수하였다. 이러한 목적을 위해서, 1 개의 필터 카세트 (SARTOCON Slice, Hydrosart 0.45 μm, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Gottingen, Germany) 를 가지는 십자류 여과 장치 SartoJet (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Gottingen, Germany) 를 사용하였다. 공급물 압력을 2.0 bar 로, 잔류물 압력을 1.0 bar 로 조정하였다. 다음 조건 하에 한외 여과 카세트 (SARTOCON Slice, Hydrosart 10 kDa, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Gottingen, Germany) 를 적용하여 동일한 여과 시스템을 버퍼 교환 및 샘플 농축에 사용하였다: 버퍼 50 mM NaH2PO4, pH 6; 버퍼 교환 용적: 7; 공급물 압력: 2.0 bar; 잔류물 압력: 1.0 bar; 최종 용적 0.5 L.
효소 정제를 위해서, AKTA 파일럿 시스템 및 FinLine Pilot 35 컬럼 (GE Healthcare, Munich, Germany) 을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 적용하였다. 컬럼을 220 mL 의 수지 (Fractogel TSK DEAE-650s Merck) 로 패킹하고, 62.5 cm/시간의 유속을 선택하였다. 평형화: 440 mL 의 50 mM 나트륨 포스페이트 버퍼 pH6; 샘플 부하량: 0.5 L 의 잔류물; 세척: 440 mL 의 50 mM 나트륨 포스페이트 버퍼 pH6; 용리액: 95% 의 50 mM 나트륨 포스페이트 버퍼 pH6 / 5% 의 1M NaCl (단계 구배). GOx 함유 분획을 모은 후, 50 mM 칼륨 포스페이트 버퍼 pH 7 에 대한 최종 버퍼 교환을 수행하였다 (Amicon® Ultracel-30k Millipore, Cork, Ireland).
ee ) 단백질 농도의 정상화
효소-결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 을 GOx 농도의 특이적 측정에 사용하였다. 스트렙타아비딘 코팅된 마이크로타이터 플레이트 (Roche - Material No. 11643673001) 의 각각의 웰을 100 μL 의 일차 항체 용액 (2 μg/mL; Rabbit PAK GOD-Biotin Acris R1083B) 으로 충전하고, 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 후속적인 세척 단계 (4 배의 350 μL 9 g/L NaCl_0.1% Tween 20) 후, 100 mL 의 효소 샘플을 웰에 피펫팅하고, 이어서 제 2 항온처리 단계를 수행하였다. 세척 단계를 반복하고, 상기 플레이트를 100 μL 의 이차 항체 용액 (10 μg/mL; Rabbit PAK GOD-HRP Acris R1083HRP) 으로 충전하였다. 제 3 항온처리 및 세척 단계 후, 상기 플레이트를 100 μL 의 ABTS/H2O2 용액 (11684302001 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 으로 충전하였다. 405 nm 에서의 흡수를 측정하기 전에, 상기 플레이트를 실온에서 30 분 동안 항온처리하였다. 아스페르질루스 니게르로부터의 글루코오스 옥시다아제를 내부 표준으로서 사용하였다 (G7141-50KU SIGMA-ALDRICH).
ff ) 매개체 어세이
액체 조작을 위해서, Brand 사 (Transferpette S-8) 및 Eppendorf 사 (Research pro) 로부터의 다중 채널 피펫을 사용하였다. 75 μL 의 샘플 (조제 상청액 / 효소 용액) 을 96-웰 평저 마이크로플레이트 (그라이너 바이오-온) 로 옮겼다. 100 μL 의 매개체 용액 (19.05 mM N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린 [Becker, O. (2005). Die Glucose - Dye - Oxidoreduktase in der klinischen Diagnostik. DISSERTATION thesis , Technische Universitat Kaiserslautern , Kaiserslautern], Roche - Material No. 100088314; 5% (w/w) 폴리비닐피롤리돈, Roche - 10003476964; pH 7) 및 20 μL 의 25 mM 포스포몰리브덴산 (Roche, Genisys-nr.: 11889893001) 을 첨가하였다. 25 μL 의 기질 용액을 첨가한 후, 플레이트를 1000 rpm 에서 1 분 동안 진탕시켜 반응을 시작하였다. 마이크로플레이트 판독기 Tecan Sunrise (Tecan Trading AG, Switzerland) 를 사용하여 포스포몰리브덴산 환원의 반응속도를 700 nm 에서 모니터링하였다. 반응속도 분석을 위해서, > 0.99 의 선형 상관 계수를 가지는 기질 농도의 함수로서 플롯팅된 초기 속도 데이터로부터 Vmax 및 KM 값을 결정하였다.
gg ) ABTS 어세이
액체 조작을 위해서, Brand 사 (Transferpette S-8) 및 Eppendorf 사 (Research pro) 로부터의 다중 채널 피펫을 사용하였다. 75 μL 의 샘플 (조제 상청액 / 효소 용액) 을, 100 μL 의 포스페이트 버퍼 (pH 7) 를 함유하는 96-웰 평저 마이크로플레이트 (그라이너 바이오-온) 로 옮겼다. 하기 농도에서 생성된 20 μL 의 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다: 0.91 U/mL HRP; 2.3 mM ABTS. 25 μL 의 기질 용액을 첨가한 후, 플레이트를 1000 rpm 에서 30 초 동안 진탕시켜 반응을 시작하였다. 마이크로플레이트 판독기 FLUOstar Omega (BMG LABTECH) 를 사용하여 414 nm 에서 ABTS 의 산화를 반응속도론적으로 측정하였다. 반응속도 분석을 위해서, > 0.99 의 선형 상관 계수를 가지는 기질 농도의 함수로서 플롯팅된 초기 속도 데이터로부터 Vmax 및 KM 값을 결정하였다.
hh ) 산소 소비율 어세이
산소 소비율의 직접 측정을 위해서, 광학 산소 프로브 "Fibox3 - Minisensor Oxygen Meter" (Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany) 를 사용하였다. 1540 μL 의 반응 혼합물은 840 μL 의 포스페이트 버퍼 (0.2 M / pH 7), 175 μL 의 기질 용액 및 525 μL 의 GOx-용액으로 이루어졌다. 산소 소비율 (%/분) 을 반응속도론적으로 측정하였다.
ii ) 열 안정성
100 μL 의 효소 용액을 상응하는 온도에서 15 분 동안 항온처리한 후, 얼음 상에서 5 분 동안 냉각시켰다. 75 μL 를 활성 측정에 사용하였다. 다음 온도를 연구하였다: 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 65℃.
Figure 112015072745768-pct00013
<110> Roche Diagnostics GmbH F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> Novel glucose oxidases derived from Aspergillus niger <130> R75001WO <140> PCT/EP2014/051602 <141> 2014-01-28 <150> EP13152935.6 <151> 2013-01-28 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 583 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 1 Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser 1 5 10 15 Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Val Gly Leu 20 25 30 Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val 35 40 45 Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp 50 55 60 Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr 65 70 75 80 Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Val Arg Ser 85 90 95 Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr 100 105 110 Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn 115 120 125 Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu 130 135 140 Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe 145 150 155 160 Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg 165 170 175 Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala 180 185 190 Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp 195 200 205 Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val 210 215 220 Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro 225 230 235 240 Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser 245 250 255 Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His 260 265 270 Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala 275 280 285 Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly 290 295 300 Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu 305 310 315 320 Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser 325 330 335 Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala 340 345 350 Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu 355 360 365 Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly 370 375 380 Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp 405 410 415 Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr 420 425 430 Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe 435 440 445 Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln 450 455 460 Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr 485 490 495 Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg 500 505 510 Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met 515 520 525 Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu 530 535 540 Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val 545 550 555 560 Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu 565 570 575 Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln 580 <210> 2 <211> 583 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 2 Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser 1 5 10 15 Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu 20 25 30 Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val 35 40 45 Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp 50 55 60 Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr 65 70 75 80 Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser 85 90 95 Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr 100 105 110 Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn 115 120 125 Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu 130 135 140 Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe 145 150 155 160 Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg 165 170 175 Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala 180 185 190 Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp 195 200 205 Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val 210 215 220 Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro 225 230 235 240 Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser 245 250 255 Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His 260 265 270 Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala 275 280 285 Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly 290 295 300 Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu 305 310 315 320 Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser 325 330 335 Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala 340 345 350 Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu 355 360 365 Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly 370 375 380 Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp 405 410 415 Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr 420 425 430 Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe 435 440 445 Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln 450 455 460 Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr 485 490 495 Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg 500 505 510 Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met 515 520 525 Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu 530 535 540 Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val 545 550 555 560 Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu 565 570 575 Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln 580 <210> 3 <211> 583 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 3 Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser 1 5 10 15 Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Val Gly Leu 20 25 30 Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val 35 40 45 Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp 50 55 60 Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr 65 70 75 80 Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Val Arg Ser 85 90 95 Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr 100 105 110 Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn 115 120 125 Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu 130 135 140 Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe 145 150 155 160 Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Val Gly Pro Arg 165 170 175 Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala 180 185 190 Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp 195 200 205 Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val 210 215 220 Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro 225 230 235 240 Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser 245 250 255 Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His 260 265 270 Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala 275 280 285 Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly 290 295 300 Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu 305 310 315 320 Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser 325 330 335 Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala 340 345 350 Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu 355 360 365 Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly 370 375 380 Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Ile Leu Asp 405 410 415 Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr 420 425 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gagaccgtgg agctcgctac caacaatcaa accgcgctgg tccgctccgg aaatggtctc 300 ggtggctcta ctctagtgaa tggtggcacc tggactcgcc cccacaaggc acaggttgac 360 tcttgggaga ctgtctttgg aaatgagggc tggaactggg acaatgtgtt ggcctactcc 420 ctccaggctg agcgtgctcg cgcaccaaat gccaaacaga tcgctgctgg ccactacttc 480 aacgcatcct gccatggtgt taatggtact gtccatgccg gaccccgcga caccggcgat 540 gactattctc ccatcgtcaa ggctctcatg agcgctgtcg aagaccgggg cgttcccacc 600 aagaaagact tcggatgcgg tgacccccat ggtgtgtcca tgttccccaa caccttgcac 660 gaagaccaag tgcgctccga tgccgctcgc gaatggctac ttcccaacta ccaacgtccc 720 aacctgcaag tcctgaccgg acagtatgtt ggtaaggtgc tccttagcca gaacggcacc 780 acccctcgtg ccgttggcgt ggaattcggc acccacaagg gcaacaccca caacgtttac 840 gctaagcacg aggtcctcct ggccgcgggc tccgctgtct ctcccacaat cctcgaatat 900 tccggtatcg gaatgaagtc catcctggag ccccttggta tcgacaccgt cgttgacctg 960 cccgtcggct tgaacctgca ggaccagacc accgctaccg tccgctcccg catcacctct 1020 gctggtgcag gacagggaca ggccgcttgg ttcgccacct tcaacgagac ctttggtgac 1080 tattccgaaa 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<212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 20 ccggatcgga ctactagcag 20 <210> 21 <211> 43 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 21 gtgtgatggc gtgaggcagc ggcgtgaatg taagcgtgac ata 43 <210> 22 <211> 59 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 22 gtggtctccc tcgctgcggc cctgccacac tacatcagga gcaatggcat tgaagccag 59 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 23 attacatgat gcggccctct agatgcatgc tcgagcggcc gccagtgtga tggatatctg 60 60 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 24 ggtactgtcc atrytggacc ccgcgacac 29 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 25 ggtggtctgg tcctgcaggt tcaag 25 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 26 gaccagacca ccartaccgt ccgctccc 28 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 27 gagttccgag tacgcgacgt tgtgg 25 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n is a, c, g, or t <400> 28 tactcggaac tcndtctcga cactgcc 27 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 29 atgggacgac atttgcgtag gagg 24 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 30 atgtcgtccc atvykatgac ggtgttcta 29 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 31 atggacagta ccattaacac catg 24 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 ggtactgtcc atnnkggacc ccgcgacac 29 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 gtgtcgcggg gtccmnnatg gacagtacc 29 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 34 gaccagacca ccnnkaccgt ccgctccc 28 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 gggagcggac ggtmnnggtg gtctggtc 28 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 36 tactcggaac tcnnkctcga cactgcc 27 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 ggcagtgtcg agmnngagtt ccgagta 27 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 38 atgtcgtccc atnnkatgac ggtgttcta 29 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Aspergillus niger <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 tagaacaccg tcatmnnatg ggacgacat 29

Claims (15)

  1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제로서:
    a) 2 개의 아미노산 치환 T30V 및 I94V 이외에, 상기 서열 번호: 1 에서 S53; A137; A173; A332; F414; V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가지는, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제; 또는
    b) a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제와 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 글루코오스 옥시다아제로서, 단, b) 의 글루코오스 옥시다아제는, 2 개의 아미노산 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 1 에 따른 S53; A137; A173; A332; F414; V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 가지고 있고,
    단, b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제는 a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 효소 활성의 70% 이상을 나타내고, a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 글루코오스에 대한 효소 특이성의 70% 이상을 나타내고,
    단, b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제는 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 전자 수용체로서의 산소에 대한 5 배 이상의 감소 활성을 나타내거나, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 산소 이외의 전자 매개체에 대한 1.5 배 이상의 증가 활성을 나타내거나, 둘 다를 나타내는 것인 글루코오스 옥시다아제;
    c) a) 또는 b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 활성 단편으로서, 단, c) 에 따른 활성 단편에서, a) 또는 b) 하에 개략적으로 서술된 아미노산 치환은 a) 또는 b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제와 비교할 때 보존되고,
    단, c) 에 따른 글루코오스 옥시다아제는 a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 효소 활성의 70% 이상을 나타내고, a) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 글루코오스에 대한 효소 특이성의 70% 이상을 나타내고,
    단, c) 에 따른 글루코오스 옥시다아제는 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 전자 수용체로서의 산소에 대한 5 배 이상의 감소 활성을 나타내거나, 서열 번호: 1 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 산소 이외의 전자 매개체에 대한 1.5 배 이상의 증가 활성을 나타내거나, 둘 다를 나타내는 것인 a) 또는 b) 에 따른 글루코오스 옥시다아제의 활성 단편,
    상기 추가의 치환(들)에 대한 아미노산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 글루코오스 옥시다아제:
    위치 S53 에 대한 Phe;
    위치 A137 에 대한 Leu;
    위치 A173 에 대한 Ile, Thr, Val;
    위치 A332 에 대한 Ser, Val, Thr;
    위치 F414 에 대한 Ile, Met, Leu, Val; 및
    위치 V560 에 대한 Leu, Pro, Thr.
  2. 제 1 항에 있어서,
    ● 전자 수용체로서의 산소에 대한 상기 활성은 하기 단계를 포함하는 ABTS 어세이에 의해 측정되고:
    a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 100 μL 의 포스페이트 버퍼 (pH 7) 를 함유하는 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
    b) 하기 농도에서 생성된 20 μL 의 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하는 단계: 0.91 U/mL HRP; 2.3 mM ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산))
    c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 30 초 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
    d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 414 nm 에서 ABTS 의 산화를 반응속도론적으로 측정하는 단계;
    ● 산소 이외의 전자 매개체에 대한 상기 활성은 하기 단계를 포함하는 매개체 어세이에 의해 측정되는 것인, 글루코오스 옥시다아제:
    a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
    b) 100 μL 의 매개체 용액 (19.05 mM N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린); 5% (w/w) 폴리비닐피롤리돈, pH 7 및 20 μL 의 25 mM 포스포몰리브덴산을 첨가하는 단계
    c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 1 분 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
    d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 700 nm 에서 포스포몰리브덴산 환원의 반응속도를 모니터링하는 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 산소 이외의 전자 매개체는 니트로소아닐린 및 이의 유도체, 아조-화합물, 페나진 및 이의 유도체, 페노티아진 및 이의 유도체, 페녹사진 및 이의 유도체, 페로센 및 이의 유도체, 칼륨 페리시아나이드, Ru- 및 Os-착물, 퀴논 및 이의 유도체, 인도페놀, 비올로겐, 테트라티아풀발렌 및 이의 유도체, 및 프탈로시아닌을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 글루코오스 옥시다아제.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열 번호: 1 에 따른 2 개의 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 1 에 따른 S53; A137; A173; A332; F414; V560 의 군으로부터 선택된 6 개의 위치 중 어느 것에서 추가의 2 개 또는 3 개 또는 4 개 또는 5 개 또는 6 개의 아미노산 치환을 가지는 것인, 글루코오스 옥시다아제.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열 번호: 1 에 따른 치환 T30V 및 I94V 이외에, 위치(들) F414, V560, 또는 F414 및 V560 에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환은 위치(들) A137, A173 및 A332 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환과 조합되는 것인, 글루코오스 옥시다아제.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 4 에 따른 추가의 아미노산 치환 A173I; A332S; 및 F414L 을 가지는 것인, 글루코오스 옥시다아제.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 3 에 따른 추가의 아미노산 치환 A173V; A332S; F414I; 및 V560T 를 가지는 것인, 글루코오스 옥시다아제.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 치환 T30V 및 I94V 이외에, 서열 번호: 6 에 따른 추가의 아미노산 치환 A173V; A332N; F414V; 및 V560L 을 가지는 것인, 글루코오스 옥시다아제.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 매개체 어세이로 측정할 때, 99.9% 이상의 글루코오스 특이성, < 4% 의 갈락토오스 특이성, < 0.3% 의 말토오스 특이성, < 6% 의 자일로오스 특이성 및 < 0.1% 의 말토트리오스 특이성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 나타내는 것인, 글루코오스 옥시다아제:
    a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
    b) 100 μL 의 매개체 용액 (19.05 mM N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린); 5% (w/w) 폴리비닐피롤리돈, pH 7 및 20 μL 의 25 mM 포스포몰리브덴산을 첨가하는 단계
    c) 25 μL 의 각각의 당 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 1 분 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
    d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 700 nm 에서 포스포몰리브덴산 환원의 반응속도를 모니터링하는 단계.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 매개체 어세이에 의해 서열 번호: 1 에 따른 GOx 의 니트로소아닐린 매개체 활성과 비교할 때, 전자 이동을 위한 니트로소아닐린 매개체에 대해 > 400% 의 활성을 나타내고:
    a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
    b) 100 μL 의 매개체 용액 (19.05 mM N,N-비스(2-하이드록시에틸)-4-니트로소아닐린); 5% (w/w) 폴리비닐피롤리돈, pH 7 및 20 μL 의 25 mM 포스포몰리브덴산을 첨가하는 단계
    c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 1 분 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
    d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 700 nm 에서 포스포몰리브덴산 환원의 반응속도를 모니터링하는 단계;
    하기 단계를 포함하는 ABTS 어세이에 의해 서열 번호: 1 에 따른 GOx 의 산소 활성과 비교할 때, ≤ 30% 의 산소 활성을 나타내는 것인, 글루코오스 옥시다아제:
    a) 75 μL 의 샘플 효소 용액을 100 μL 의 포스페이트 버퍼 (pH 7) 를 함유하는 96-웰 평저 마이크로플레이트로 옮기는 단계
    b) 하기 농도에서 생성된 20 μL 의 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하는 단계: 0.91 U/mL HRP; 2.3 mM ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산))
    c) 25 μL 의 글루코오스 기질 용액을 첨가한 후 상기 플레이트를 1000 rpm 에서 30 초 동안 진탕시켜 반응을 시작하는 단계
    d) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 414 nm 에서 ABTS 의 산화를 반응속도론적으로 측정하는 단계.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코오스 옥시다아제 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 글루코오스 옥시다아제 또는 이의 활성 단편에 의해 생체외 샘플에서 글루코오스를 검출, 결정 또는 측정하는 방법으로서,
    상기 검출, 결정 또는 측정은 생체외 샘플을 상기 글루코오스 옥시다아제 또는 이의 활성 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 글루코오스의 검출, 결정 또는 측정은 센서 또는 테스트 스트립 장치를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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