PL178652B1

PL178652B1 - Zrekombinowana cząsteczka dwuniciowego DNA, sposób wytwarzania genetycznie stransformowanych, odpornych na choroby roślin, oraz genetycznie stransformowana komórka roślinna ziemniaka lub pszenicy

Info

Publication number: PL178652B1
Application number: PL94314590A
Authority: PL
Inventors: Ellen B. Lawrence; Elaine B. Levine; Dilipkumar M. Shah
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1993-11-24
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 2000-05-31
Also published as: BR9408140A; CN1066198C; AU8120994A; WO1995014784A1; CZ131796A3; US5516671A; CN1136329A; SK280613B6; BG100619A; BG61548B1; CA2172628A1; AU678640B2; HU9601403D0; PL314590A1; EP0733116A1; JPH09506249A; HUT74393A; SK65596A3

Abstract

1. Zrekom binowana czasteczka dw uniciow ego D N A , zn am ien n a tym , ze obejm uje w kolejnosci zapewniajacej dzialanie a ) promotor, który dziala w komórkach roslinnych powodujac wytwarzanie sekwencji R NA, przy czym rzeczony promotor wybiera sie sposród promotorów FM V 35S 1 C aM V 35S, b) strukturalna sekwencje kodujaca, która koduje w ytw arzana oksydaze g lu k o zo w a A spergillus, przy czym rzeczona sekw encja struktu ralna D N A jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym . 2 ,1 c) 3'-koncow y region nie ulegajacy translacji, który dziala w komórkach roslinnych powodujac dolaczanie nukleotydów poliadenylo w ych do konca 3' sekw encji RNA. 2. Sposób wytwarzania genetycznie stransform owanych, odpornych na choroby roslin, zn am ien n y tym , ze obejm uje etapy a) w stawiania do genom u komórki roslinnej zrekom binowanej, dwuniciowej czasteczki D N A , zawierajacej (i) promotor, który dziala w komórkach roslinnych powodujac w ytwarzanie sekwencji R N A , przy czym rzeczony promotor wybiera sie sposród promotorów FM V 35S i CaM V35S, (ii) strukturalna sekwencje kodujaca, która pow oduje wytwarzanie oksydazy glukozow ej A spergillu s, przy czym rzeczona sekwencja strukturalna D N A jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym . 2; i (iii) 3'-koncow y region nie ulegajacy translacji, który dziala w rzeczonych komórkach roslinnych powodujac dolaczanie nukleotydów poliadenylow ych do konca 3' sekwencji RNA b) otrzym ywania stransform owanych kom órek roslinnych, 1 c) regeneracji ze stransformowanych komórek roslinnych genetycznie stransformowanych roslin ziemniaka lub pszenicy, w których za- chodzi ekspresja oksydazy glukozowej Aspergillus w ilosci skutecznej w obnizaniu uszkodzen spowodowanych infekcja patogenem bakteryj- nym lub grzybowym. 3 G enetycznie stransform owana komórka roslinna ziem niaka lub pszenicy, zn am ien n a tym , ze zawiera zrekom binow ana czasteczke dw uniciow ego D N A , która obejm uje w kolejnosci zapewniajacej dzialanie a) promotor, który dziala w komórkach roslinnych powodujac wytwarzanie sekwencji R NA, przy czym rzeczony promotor w ybiera sie sposród promotorów FM V 35S , C aM V 35S, b) strukturalna sekwencje kodujaca, która koduje w ytw arzana oksydaze g\u kozow aA spergillu s, przy czym rzeczona sek w encja struktu- ralna D N A jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2, 1 c) 3'-koncow y region nie ulegajacy translacji, który dziala w komórkach roslinnych powodujac dolaczanie nukleotydów poliadenylo- wych do konca 3' sekw encji RNA. PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek ten dotyczy metody zwalczania patogenów roślinnych przez zastosowanie białka, które dostarcza się przez genetyczną modyfikację rośliny, w wyniku której wytwarza ona to białko, oraz genów i roślin użytecznych w tej metodzie.

178 652

Podstawa wynalazku

Dobrze wiadomo, że enzymatyczne działanie oksydazy glukozowej ma charakter przeciwbakteryjny. W obecności tlenu oksydaza glukozowa katalizuje utlenianie glukozy do δ-glukonolaktonu i nadtlenku wodoru. Działanie przeciwbakteryjne jest wynikiem zarówno utleniających właściwości nadtlenku wodoru, jak również obecności δ-glukonolaktonu, który jest znanym inhibitorem glikozylotransferaz.

Przeciwbakteryjne działanie produktów tego enzymu spowodowało jego szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym, gdzie jest on uważany za związek GRAS [powszechnie uznawany jako bezpieczny]. Jako taką, oksydazę glukozową stosuje się do zapobiegania bakteryjnemu psuciu gotowej żywności. W medycynie stosuje się jąjako enzymatyczny środek bakteriobójczy jako część preparatu do stosowania w materiałach opatrunkowych na rany, wykałaczkach dentystycznych, niciach dentystycznych i miniaturowych szczoteczkach do zębów. Uważa się również, że stosowanie oksydazy glukozowej jest sposobem zwalczania kamienia nazębnego.

Ostatnie doniesienia wykazały, że oksydaza glukozowa zaangażowana jest, jako część mechanizmu biokontroli wykorzystywanej przez Penicillium dangeari, w zwalczaniu patogennego dla roślin grzyba V^/^Z^żi^z7lium dahliae [Kim i in., 1988, 1990],

Jednakże sądzono, że użycie oksydazy glukozowej jako środka dla roślin do ich ochrony przed organizmami patogennymi ma małe możliwości z powodu charakteru działania enzymatycznego. Po pierwsze, w roślinach jest mało obecnej glukozy. Enzym mógłby mieć niewystarczającą ilość substratu do wytwarzania dostatecznej ilości nadtlenku wodoru i/lub δ-glukonolaktonu do zwalczenia ataku patogenów. Po drugie, można oczekiwać, że obecność takiego enzymu, zużywającego glukozę i wytwarzającego nawet małe ilości nadtlenku wodoru, w komórce roślinnej, będzie szkodliwa dla żywotności komórki. Można spodziewać się, że rośliny transgeniczne, w których zachodzi ekspresja oksydazy glukozowej, nie będą rozwijać się normalnie, albo jako zregenerowane rośliny, albo w następnych pokoleniach.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie oksydazy glukozowej, której ekspresję można bezpiecznie prowadzić w komórkach roślinnych i zapewnienie tym komórkom odporności na choroby. Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie metody transformowania roślin, tak aby zachodziła w nich ekspresja oksydazy glukozowej, której ekspresję można bezpiecznie prowadzić w roślinach, i zapewnienie tym roślinom odporności na choroby.

Podsumowanie wynalazku

Nieoczekiwanie stwierdzono, że gen oksydazy glukozowej z Aspergillus niger można stosować do transformowania roślin, które są normalne pod względem rozwoju i oporne na atak patogenów. Dlatego też, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie użytecznych do wprowadzania do komórek roślinnych konstrukcji genetycznych zawierających gen oksydazy glukozowej Aspergillus (AGO). Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie stransformowanych, opornych na patogeny roślin zawierających taki materiał genetyczny.

Dodatkowo, rośliny można także transformować, aby zachodziła w nich koekspresja innych białek przeciwgrzybowych lub białek owadobójczych, na przykład stosując geny Bacillus thuringiensis (B.t.). Przykłady roślin tak stransformowanych, aby zachodziła w nich ekspresja genów B.t.. ujawniono w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 0 38δ 962, która odpowiada opisowi patentowemu Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/476 661, złożonemu 12 lutego 1990 r. [Fischhoff i in.], włączonej do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Gen B.t. można wprowadzić do rośliny według niniejszego wynalazku przez jednoczesną transformację, kolejne transformacje lub przez krzyżowanie.

Zgodnie z aspektem wynalazku, dostarcza się zrekombinowaną, dwuniciową cząsteczkę DNA, zawierającą w kolejności zdolnej do działania:

a) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA; i

b) strukturalną sekwencję kodującą, która koduje wytwarzaną AGO;

178 652

c) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, którydziala w komórkach roślinnych powodując dołączanie pukteytydaw pytirdepntywnch do kyńcó 3' sekwencji RNA.

Zgodnie z innym aspektem wynalazku, dykirjczr się metodę wntorjzrnir genetycznie straosformywóoych roślin, w których zachodzi ekspresjiapjzeciwpaiyeennnch ilości AGO, obejmują etapy:

a) wstawiania do genomu komórki jośtiooej zjekombinowanej, dwuoieiywej cząsteczki DNA, zawierającej:

(i) promotor, który działa w komórkach jośtiooych powodując wntwajzroie sekwencji

RNA;

(ii) st:rukturaton sekwencję kodującą, która koduje wytwarzaną AGO (iii) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w rzeczonych komórkach roślinnych powodując dołączanie oukleoiydów pytiadeoytywych do końca 3' sekwencji RNA.

b) otrzymywania straokfyrmowaoych komórek rośtiooych; i

c) regeneracji ze kiraosformywaoych komórek roślinnych genetycznie kiraosformywanych roślin, w których zachodzi ekspresja hamującej ilości AGO.

Dostarcza się również, zgodnie z innym aspektem niniejszego wynalazku, straokfyrmowane rośliny, które zawierają DNA złożony z wymienionych powyżej elementów (i), (ii) i (iii).

W znaczeniu tu stosowanym, termin „oksydaza glukozowa Aspergillus” lub „AGO” oznacza oksydazę glukozowa naturalnie wniwarzaoą przez Aspergillus sp., bądź posiadającą > 80% homotogii, korzystnie > 90%, do takiego enzymu, na przykład enzymu kodowanego przez sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 1.

W znaczeniu tu stosowanym, termin „zwalczanie uszkodzeń przez mikroorganizmy” oznacza powodowanie zmniejszenia uszkodzeń roślin uprawnych spowodowanych infekcją patogenem bakteryjnym lub grzybowym.

W znaczeniu tu stosowanym, termin „strukturalna sekwencja kodująca” oznacza sekwencję DNA kodującąpolipeptyd, który może być wytwarzany przez komórkę po iraoskrnpeji DNA na RNA, a następnie iraoklację pożądanego polipeptydu.

W znaczeniu tu stosowanym, termin „locus roślinne” oznacza obszar bezpośrednio otaczający roślinę i obejmujący roślinę i jej strefę korzeniową.

Szczegółowy opis wynalazku

Jedno rozwiązanie oioiejkzego wynalazku obejmuje białko wyizolowane z Aspergillus niger. Białko to, oznaczone AGO, oczyszczono do hymogeooości. Hamuje ooy wzrost ważnych z rolniczego punktu widzenia patogenów grzybowych, włącznie z Verticillum dahliae, jednym z najbardziej rozpowszechnionych i wyrządzających największe szkody patogenów roślin powodującym chorobę wielu roślin, Phytophthora infestans (Pi), patogenem będącym przyczyną zarazy ziemniaczanej ziemniaków i pomidorów-, Botryis cinera (BC), źródłem szarej pleśni na różnych owocach i warzywach, Septoria nodorum (Sn), czynnikiem przyczynowym plamistości łusek pszenicy, Pseudocercosporella herpotrichoides (Ph), czynnikiem przyeznoownm łamliwości liści pszenicy, i Gaeumannomyces gramininis var tritici (Ggt), czynnikiem przyczynowym zgorzeli podstawy źdźbła zbóż, w ilości tak małej, jak 50 ng w warunkach oznaczenia. Stwierdzono również, że hamuje ono Erwinia carotovora, ezyooik przyczynowy mokrej zgnilizny ziemniaków, choroby ziemniaków występującej po zbiorze. W oparciu o produkty aktywności enzymatycznej tego białka, δ-glukoootaktoo i nadtlenek wodoru, oczekuje się, że jest ooy zdolne do zwalczania wielu innych organizmów patogennych dla roślin. Każdy z tych produktów ubocznych jest toksyczny dla takich organizmów.

Metodą według niniejszego wynalazku można chronić wiele gatunków roślin. Na przykład, oioiejsznmi metodami można ochraniać przed patogenami roślin wiele owoców i warzyw, takich jak truskawki, ziemniaki i pomidory. Różne gatunki Phytophtora są patogenne dla wielu mnych roślin, takich jak drzewa owocowe lub roślin daroiywnch, a zatem również te rośliny można ochraniać metodami według niniejszego wynalazku. Ponadto, niniejszymi metodami można ochraniać rośliny pszenicy i jęczmienia przed Ggt, Sn i Ph.

178 652

Jak stwierdzono powyżej, białka o aktywności przeciw mikroorganizmom według niniejszego wynalazku można stosować łącznie z innymi białkami przeciwgrzybowymi, tak aby zapewnić szerokie spektrum aktywności, tj. zwalczanie dodatkowych patogenów i/lub zapewnić wiele sposobów działania dla hamowania tego samego patogenu grzybowego. Źródłami takich innych białek przeciwgrzybowych mogąbyć mikroorganizmy, takjak białek według niniejszego wynalazku, lub mogąbyć nimi rośliny. W literaturze donoszono o wielu takich genach przeciwgrzybowych.

Chociaż AGO będzie działać chroniąc rośliny przed atakiem patogenów w obecności naturalnie występujących poziomów glukozy, może być pożądane dostarczenie inwertazy, która będzie powodować hydrolizę sacharozy, uwalniając zatem dodatkową glukozę, na którą może działać AGO. Inwertazą będzie korzystnie inwertaza ze ściany komórkowej, taka jak z drożdży (europejski opis patentowy numer 0 442 592, Willmitzer i in., 1991, także australijski opis patentowy numer Au 70898/91) lub enzym z wakuoli, taki jak z ziemniaków lub innych roślin. W tych dwóch przypadkach można użyć naty wnąsekwencję sygnałową; jednakże, może być korzystne odizolowanie inwertazy dokąd nie będzie potrzebna w przestrzeni pozakomórkowej lub nie wytwarzanie dokąd nie będzie potrzebna. Pierwsząmożliwość można zrealizować przez użycie sekwencji sygnałowej, która będzie kierować enzym do przestrzeni pozakomórkowej. Jedną taką sekwencjąsygnałowąjest sekwencja sygnałowa inhibitora proteaz z ziemniaka (Keil i in., 1986; Nelson i in., 1980). W ograniczaniu ekspresji inwertazy do momentu aż jest ona potrzebna do wytwarzania glukozy jako substratu AGO mógłby być użyteczny promotor, który jest aktywny tylko w wyniku infekcji patogenem.

Podczas przechowywania, gdy infekcja Erwinia może powodować utratę całych pojemników, bulwy ziemniaków będą naturalnie zawierać glukozę z rozkładu skrobi. Dlatego też, dla ochrony przed mokrą zgnilizną nie jest pożądane ani potrzebne włączanie genu inwertazy.

OZNACZENIA SKUTECZNOŚCI BIOLOGICZNEJ IN VITRO

Oznaczenia aktywności przeciwgrzybowej

Oksydazę glukozowąz Aspergillus niger można otrzymać z Sigma Chemical Co. (St. Louis, nr kat. G-7141). Użyto jej do testowania in vitro aktywności wobec kilku organizmów.

Testy wobec Pi i Bc przeprowadzono w podłożu #303, przygotowanym w następujący sposób: jeden litr zawiera 1 gMgS(04-7H₂0; 2 gKH₂PO4,0,5 gNaCl, 1gCaCO₃,1 ml roztworu podstawowego ZnSO4 · 7H20 o stężeniu 1 mg/ml, 1 ml roztworu podstawowego FeSO4 · 7H₂O o stężeniu 1 mg/ml, 0,5 ml roztworu podstawowego FeEDTA o stężeniu 100 mM, 20 g Maltrin M-100,20 g kazeiny, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g glukozy, 3,02 g Pipes, 10 mM, pH doprowadzono do 6,5 i wyjałowiono przez sączenie. Testy wobec Ggt przeprowadzono w dwukrotnie rozcieńczonym PDA (Difco). Testy wobec Ph przeprowadzono w CDAA. 1% podłoża przygotowano w następujący sposób: 35 g/litr bulionu Czapka Doxa (Difco), 1 g/litr proliny, 500 mg/litr asparaginy, 500 mg/litr cysteiny i 1 g/litr agaru autoklawowano w ciągu 23 minut i dodano wyjałowione przez sączenie witaminy (1 ppm tiaminy i 1 ppm biotyny).

Bc i Pi testowano w oznaczeniu płynnym w płytkach 96-studzienkowych. Bc stosowano w ilości 5 x 102 zarodników na studzienkę i umożliwiano inkubację w temperaturze 20°C w ciągu 24-48 godzin. Pi zaszczepiano w ilości 5 x 10³ zarodni na studzienkę i inkubowano w temperaturze 18°C w ciągu 24-48 godzin. Ocenę wzrostu przeprowadzano przez pomiar OD przy długości fali 595 nm. Wzrost Pi był w 90% hamowany przy tak niskich stężeniach, jak 3 x 10'⁵ IU/pl. Wzrost Bc był w 95% hamowany w stężeniu 0,001 IU/pl.

Aktywność wobec Gaeumannomyces oceniano na płytkach ze stałym podłożem agarowym. Kawałki agaru o powierzchni około 0,5 cm² mocno przerośnięte grzybem umieszczano w środku płytek z dwukrotnie rozcieńczonym PDA i umożliwiano wzrost w ciągu kilku dni w temperaturze 22°C. W odległości 1 cm od granicy wzrostu aseptycznie usunięto korkoborem kawałek agaru o średnicy 0,5 cm. Do tych studzienek dodawano bezpośrednio jałowy roztwór podstawowy AGO. Widoczna strefa hamowania pojawiała się przy ilościach tak niskich, jak 0,02 IU/studzienkę.

Testy wobec Ph przeprowadzono w 96-studzienkowych płytkach. 14-dniowe hodowle Pseudocercosporella herpotrichoides var tritici na płynnym agarze stosuje się do sporządzenia

178 652 zawiesiny zarodników. Płytkę zalewa się 5-10 ml 0,1% podłoża CDAA i zarodniki miesza się w podłożu płynnym przez ostrożne zawirowanie. Stężoną zawiesinę zarodników pobiera się pipetą i dodaje do całkowitej objętości CDAA wymaganej do testu, doprowadzając stężenie zarodników do 100 000 zarodników/ml. Inkubację podczas oznaczenia przeprowadza się w temperaturze 24°C w ciemności.

Zawiesinę zarodników rozmieszcza się w ilości 50 pl/studzienkę w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania. Następnie płytki te umieszcza się w inkubatorze (10 godzin/dzień światła w temperaturze 12°C) na 24 godziny przed zastosowaniem próbki. 50 pl próbki dodaje się do 50 pl inokulum (przygotowanego 24 godziny wcześniej), co daje całkowitą objętość w studzience 100 pl/traktowanąstudzienkę/powtórzenie. Płytki do oznaczania inkubuje się w ciągu 48 godzin i wyniki oznacza się przez odczyt gęstości optycznej (OD) czytnikiem płytek do mikromiareczkowania BioRad, model 3550, przy pojedynczej długości fali 595 nm. Odczytu OD dokonuje się w czasie zero (t„), to jest bezpośrednio po dodaniu próbki i 48 godzin po dodaniu próbki 0ή₈). Oceny wzrostu grzyba dokonuje się na podstawie różnic odczytów OD pomiędzy t0 i t^ pomnożonych przez wartość obliczeniową biomasy grzybowej. (Wartość obliczeniowa biomasy grzybowej jest zależnościąpomiędzy wzrostem grzyba, a gęstością optyczną i określono jąw oddzielnych doświadczeniach. Zależność pomiędzy wzrostem grzyba, a gęstością optyczną określono namnażając grzyby w 96-studzienkowych płytkach do miareczkowania i zbierając grzybnię w czasie, co 0,1 jednostki absorbancji. Wartość obliczeniową otrzymuje się z liniowej zależności pomiędzy biomasą grzybową a OD dla konkretnego grzyba. Jest to wartość nachylenia otrzymana z zależności liniowej. Wartość obliczeniowa dla Ph wynosi 4,91). Następnie określa się procent hamowania z różnicy pomiędzy biomasami prób traktowanych i kontrolnych. AGO wykazywała 60% hamowania Ph w stężeniu 1,7 x 10*4 IU/pl.

Testy wobec Sn przeprowadzono zasadniczo podobnie jak te dla Ph, z wyjątkiem przygotowywania zawiesiny zarodników. Do przygotowania zawiesiny zarodników używa się siedmiodniowych zarodnikujących hodowli Septoria nodorum na podłożu agarowym YMA. Małąilość (< 1 ml) podłoża CDAA nakrapla się na powierzchnię hodowli z masąróżowych zarodników wydostających się z pyknidiów. Zarodniki miesza się z podłożem CDAA przez ich powtarzane wciąganie i wypuszczanie z pipety. Stężoną mieszaninę dodaje się do całkowitej objętości CDAA wymaganej do testu, doprowadzając stężenie zarodników do 50 000 zarodników/ml. Wartość obliczeniowa dla Sn wynosi 0,508. AGO wykazywała,60% hamowania Sn w stężeniu 1,7 x 10'⁴ IU/ml.

Oznaczenie aktywności przeciwbakter-yjnej

Hodowle bakterii Erwinia carotovora utrzymuje się przez posiew ezą na płytkach PDA i inkubację w temperaturze 24°C w ciemności. W celu przygotowania bulionu inokulacyjnego, ezę aktywnie rosnących bakterii (5-9-dniowych) dodaje się do 50 ml czterokrotnie rozcieńczonego bulionu PD w kolbie Erlenmeyera o objętości 125 ml. Kolbę umieszcza się na wytrząsarce inkubacyjnej (130 obrotów na minutę) w temperaturze 24°C w ciemności. Po 24 godzinach bakterie się osadza, ponownie zawiesza w jałowej wodzie dejonizowanej, i trzy lub cztery próbki o objętości 100 pl umieszcza w studzienkach 96-studzienkowych płytki do mikromiareczkowania do odczytu. Czytnik mikropłytek ustawia się na długość fali 595 nm i określa się średnią gęstość optyczną studzienek. Tę wartość absorbancji (ABS = gęstość optyczna) stosuje się w następującym wzorze do obliczania jednostek koloniotwórczych (CFU) zawartych w bulionie.

CFU = (3 x 10⁶) + [(3 x 10⁸) x ABS] + [(5 x 10⁸) ABS²]

Do stosowania bulion doprowadza się do 10⁵ CFU.

AGO całkowicie znosiła wzrost E. carotovora w stężeniach tak niskich, jak 3 x 10'⁵ IU/pl.

Identyfikacja enzymu

Do wykrywania wytwarzania białka w układzie heterologicznym, takim jak komórki roślinne, można stosować liczne metody. Techniki blottingu typu Western można stosować do wykrywania białka immunologicznie, lub można zastosować oznaczenia enzymatyczne lub biologiczne do wykrywania aktywności białka.

178 652

Oznaczenie enzymatyczne oksydazy glukozowej

Do określenia aktywności GO wykorzystano modyfikację ciągłego oznaczenia spektrofotometrycznego (Frederick i in., 1990). Jako kontrolę dodatnią stosowano GO Aspergillus niger (Sigma). Mieszanina reakcyjna składała się z 20 pg/ml peroksydazy z chrzanu (Sigma), 0,32 mM roztworu o-dianizydyny stabilizowanego Tritonem Χ-100 (Sigma) i 0,1 M glukozą w 75 mM buforze fosforanów sodowych (pH 5,0). Do tej mieszaniny dodawano 100 pl różnych stężeń GOJ. niger dla reakcji kontrolnych lub 100 pl próbki pochodzącej ze źródła heterologicznego. Oznaczenie to prowadzono w temperaturze pokojowej i monitorowano wzrost absorbancji przy długości fali 460 nm.

Kolejne oznaczenie oksydazy glukozowej, wykorzystujące odczynnik 4-amino-antypirynę (4-AAP), zoptymalizowano w oparciu o Galio, 1981. 5X odczynnik 4-AAP przygotowuje się w objętości całkowitej 10 ml z 0,68 g KH2PO4, 8,3 mg 4-AAP (0,82 mM), 25 pl Tritonu Χ-100, 0,0658 krystalicznego fenolu i 1000 U peroksydazy z chrzanu, z pH doprowadzonym do 5,0 KOH. Oznaczenie przeprowadza się przez zmieszanie 200 pl tego odczynnika 4-AAP, 5 pl 1 mM FAD, 50 pl 1M glukozy i testowanej próbki (do 750 pi). Wynik odczytuje się jako OD przy fali o długości 508 nm.

Oznaczenie aktywności biologicznej oksydazy glukozowej „Korek” 4-6-dniowego grzyba Ggt przenoszono na płytki z czterokrotnie rozcieńczonym agarem ziemniaczano-dekstrozowym (Difco). Grzyb hodowano w temperaturze 22°C w ciągu czterech dni, lub dopóki nie uzyskano wzrostu o średnicy 2,5 cm. Używając jałowego korkobora, w agarze zrobiono studzienki w odległości 1 cm od kolistej strefy wzrostu i umieszczano w nich 100 pl buforu lub próbki pochodzącej ze źródła heterologicznego. Grzyb hodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze pokojowej i sprawdzano pod kątem hamowania wzrostu.

Immunologiczne wykrywanie oksydazy glukozowej

Poliklonalne przeciwciała skierowane przeciw oksydazie glukozowej wytwarzanej przez Aspergillus niger są komercyjnie dostępne z wielu źródeł, na przykład Rockland, Inc., Gilbertsville, Pensylwania.

TRANSFORMACJA GENETYCZNA

Klonowanie genu AGO

Z Aspergillus niger (ATCC 9029) wyizolowano całkowity DNA i zastosowano jako matrycę do izolacji genu oksydazy glukozowej z wykorzystaniem PCR. Startery PCR były oparte na opublikowanej sekwencji genu (Frederick i in.; Kriechbaum i in.) i zaprojektowano je do wyizolowania całej sekwencji genu, włącznie z sekwencją sygnałową. Ponadto, w celu ułatwienia wbudowywania tego genu do wektorów odpowiednich do ekspresji w heterologicznych układach bakteryjnych, bakulowirusowych i roślinnych, 5'-końcowy starter PCR (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3) wprowadził przed kodonem startu AGT translacji genu miejsca endonukleaz restrykcyjnych Xbal i Bglll. 3'- końcowy starter PCR (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4) wprowadził miejsca endonukleaz restrykcyjnych BamHI i KpnI bezpośrednio po kodonie stop. Wytworzony fragment PCR sklonowano w pUC 118 w postaci fragmentu Xbal/Kpnl, z utworzeniem pMON22514 i w pełni go zsekwencjonowano. Sekwencja (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) dokładnie pokrywała się z sekwencją opublikowaną. Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2 jest odpowiadającą sekwencją aminokwasową.

Konstruowanie genu roślinnego

Ekspresja genu roślinnego, który występuje w postaci dwuniciowego DNA obejmuje transkrypcję matrycowego RNA (mRNA) z jednej nici DNA przez enzym polimerazę RNA, i następnie procesowanie pierwotnego transkryptu mRNA wewnątrz jądra. Procesowanie to dotyczy 3'-końcowego regionu nie ulegającego translacji i polega na dodaniu nukleotydów poliadenylowych do końca 3' mRNA. Transkrypcja DNA na mRNA jest regulowana przez region DNA zazwyczaj określany jako „promotor”. Region promotora zawiera sekwencję zasad, która daje sygnał polimerazie RNA do związania się z DNA i rozpoczęcia transkrypcji mRNA z wykorzystaniem jednej z nici DNA jako matrycy w celu utworzenia odpowiadającej nici RNA.

178 652

W literaturze ypikaoy liczne promotory, które są aktywne w komórkach roślinnych. Obejmują one promotory kyotazy nopalinowej (NOS) i syntazy oktopinowej (OCS) (które znajdują się na plazmidach indukujących nowotwory Agrobacterium tumefaciens), promotory 19S i 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), promotor 35S wirusa mozaiki trędowoika (FMV) i indukowany światłem promotor małej podjednostki karbaksylazy rnbulozo-1,5-bisfosforaoowej (ssRUBISCO, bardzo powszechny polipepiyd roślinny). Wszystkie z tych promotorów siosowroo do tworzenia różnych typów konstrukcji DNA, które ulegały ekspresji w roślinach. Zastosowania takie ujawnia opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 034 322 (Fraley i in., 1991), włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Istnieją znane promotory które będą ograniczać ekspresję do poszczególnych części roślin w odpowiedzi na poszczególne bodźce. Na przykład, promotory specyficzne dla bulw ziemniaków, takie jak promotory patatyny lub promotory dużej i małej podjednostek pirofosforntrzy ADP-glukozy, można zastosować do uzyskania ekspresji przede wszystkim w bulwach, a zatem łącznie z AGO zapewniają one odporność na ataki w bulwach, takie jak przez Erwinia. Promotor specyficzny dla owoców byłby pożądany do nadania odporności na Botrytis truskawkom lub winogronom. Promotor specyficzny dla korzeni byłby pożądany do uzyskania ekspresji AGO w pszenicy i jęczmieniu dla zapewnienia odporności na Ggt. Specjalista w tej dziedzinie będzie znał wiele takich promotorów specyficznych dla części roślin, które mogłyby być użyteczne w niniejszym wynalazku.

Alternatywnie, promotory wykyrzysiywaoe w cząsteczkach dwuoiciownch DNA można wybierać w celu uzyskania specyficznej ekspresji AGO w odpowiedzi na infekcję grzybową. Infekcja roślin patogenami grzybowymi wyzwala indukcję szerokiego szeregu białek, nazywanych białkami związanymi z obroną lub związanymi z patogenezą (PR) [Bowles; Boi i in.; Liothorkt]. Takie geny związane z obroną lub PR mogą kodować enzymy metabolizmu feonloprypiyoiaoywego (takie jak amoniako-liaza feoytorlaoioowa, kyotaza ehalkyoowa, ligaza 4-kumaran:CoA, 4-hydroksytaza kwasu kumarnoowego), białka, które modyfikują ściany komórek roślinnych (takie jak glikyproieioy bogate w hydryksyprolioę, białka bogate w glicynę, peryksndazy), enzymy (takie jak chitnoazy i glukaoazy), które degradują ścianę komórek grzybowych, białka podobne do ^^Ψοι lub białka o nieznanej dotąd funkcji. Geny związane z obroną lub PR izolowano i charakteryzowano z licznych gatunków roślin. Promotory tych geoów można stosować do uzyskania ekspresji AGO w roślinach iraosgeoiczoych po wywołaniu infekcji patogenem, szczególnie patogeoem grzybowym, takim jak Pi. Promotory takie mogąpochodzić z genów związanych z obroną lub PR izolowanych z samych ziemniaków [Fritzemeier i in.; Cuyperk i in.; Logemaon i in.; Mattoo i Briskyn; Taylor i io.; Matton i io.; SchOder i io.]. W celu umieszczenia geou AGO pod kontrolą promotora indukowanego przez infekcję P infestans, korzystny może być promotor opisany przez Taylora i io. (1990).

Konkretny wybrany promotor powinien być zdolny do powodowaoia dostatecznej ekspresji sekwencji kodującej enzym, a w rezultacie do wytwarzania skutecznej ilości AGO.

Prymotorn stosowane w konstrukcjach DNA (tj. chimerycznych geoach roślinnych) według niniejszego wyoalazku można, jeśli jest to pożądane, modyfikować, aby wpływać oa ich właściwości kontrolujące. Na przykład, promotor 35S CaMV można zligować z częścią geou ssRUBISCO, która hamuje ekspresję ssRUBISCO w oieobecności światła, tworząc promotOr, który jest aktywny w liściach, ale oie w korzeniach. Otrznmaon promotor chimeryczny można stosować w sposób tu opisany. Do celów tego opisu, termin promotor „CaMV” obejmuje zatem warianty promotora 35S CaMV, tj. promotory otrzymane w wyniku ligacji z regionami operatorowymi, losową lub kyotrolywaoą mutagenezę, itp. Ponadto, promotory można tak zmieniać, aby zawierały wielokrotne „sekwencje wzmacniające” wspomagające podwyższanie ekspresji geou. Przykłady takich sekweocji wzmacniających zostały podane przez Kaya i io.

Wzmocniony promotor 35S CaMV skonstruowano w następujący sposób. Fragment promotyra 35S CaMV zawarty pomiędzy pozycjami -343 a +9 skonstruowano uprzednio w pUC13

[Odell i in.]. Odcinek ten zawiera region zidentyfikowany jako konieczny do maksymalnej ekspresji promotora 35S CaMV. Wncięty go w postaci fragmentu Ctal-HιodIlt, wykonago tępe koń178 652 ce polimeraząDNA I (fragment Clal) i wstawiono do miejsca HincII pUCl 8. Ten region leżący przed promotorem 35S wycięto z plazmidu w postaci fragmentu HindIII-EcoRI (rozciągającego się od pozycji -343 do -90) i wstawiono do tego samego plazmidu między miejsca HindIII i Pstl. Wzmocniony promotor 35S CaMV (dalej w niniejszym opisie „E35S CaMV”) zawiera zatem duplikację sekwencji pomiędzy -343 a -90 [Kay i in.].

RNA wytwarzany przez konstrukcję DNA według niniejszego wynalazku zawiera także 5'-końcową nie ulegającą translacji sekwencję liderową. Sekwencja ta może pochodzić z promotora wybranego do ekspresji genu, i można ją specyficznie zmodyfikować, tak aby zwiększyć translację mRNA. 5'-końcowe regiony nie ulegające translacji można także otrzymać z wirusowych RNA, z odpowiednich genów eukariotycznych lub z sekwencji syntetycznego genu. Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do konstrukcji, w których region nie ulegający translacji pochodzi z 5'-końcowej sekwencji nie ulegającej translacji, która towarzyszy sekwencji promotora. Raczej, nie ulegająca translacji sekwencja liderowa może pochodzić z odmiennego promotora lub sekwencji kodującej. Na przykład, lider taki zawiera białko szoku cieplnego 70 (Hsp70) petunii. [Winter]

Jak stwierdzono powyżej, 3'-końcowy region nie ulegający translacji chimerycznych genów roślinnych według niniejszego wynalazku zawiera sygnał poliadenylacji, który działa w roślinach powodując dołączanie nukleotydów adenylowych do końca 3' RNA. Przykładami regionów 3'-końcowych są(l) 3'-końcowe, ulegające transkrypcji, nie ulegające translacji regiony zawierające sygnał poliadenylacji genów plazmidów indukujących nowotwory (Ti) Agrobacterium, jak gen syntazy nopalinowej (NOS), i (2) geny roślinne, jak geny białka zapasowego 7s soi i gen E9 ssRUBISCO grochu [Fischhoff, i in.].

Transformacja roślin i ekspresja

Chimeryczny gen roślinny zawierający strukturalną sekwencję kodującą według niniejszego wynalazku można wstawić do genomu rośliny jakąkolwiek odpowiednią metodą. Odpowiednie wektory transformujące rośliny obejmują te pochodzące z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens, jak również te ujawnione np. przez Herrera-Estrella 1983), Bevana (1983), Klee (1985) i w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 0120516 (Schilperoort i in). Poza wektorami transformującymi rośliny z plazmidów Ti lub plazmidów wywołujących chorobę włosowatości korzeni (Ri) Agrobacterium, do wstawiania konstrukcji DNA według tego wynalazku do komórek roślinnych można zastosować alternatywne metody. Metody takie mogą na przykład obejmować zastosowanie liposomów, elektroporację, środki chemiczne zwiększające pobieranie wolnego DNA, dostarczanie wolnego DNA przez bombardowanie mikropociskami i transformację z zastosowaniem wirusów lub pyłku.

Rośliny, które można ochraniać sposobem według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do ziemniaków, pomidorów, pszenicy, kukurydzy, truskawek, winogron, jak również różnych roślin ozdobnych. Dla wszystkich tych typów roślin dostępne są metody hodowli tkankowych i regeneracji roślin.

Krótkotrwała ekspresja oksydazy glukozowej w roślinach tytoniu

Szczególnie użytecznym plazmidowym wektorem kasetki do transformacji roślin dwuliściennych jest pMON999. Kasetka ekspresyjna pMON999 składa się z promotora E35S CamV i końca 3' obejmującego sygnały poliadenylacji z genu NOS. pMON999 zawiera miejsca BgllI, KpnI i EcoRI do wstawiania sekwencji kodujących i miejsca NotI-NotI flankujące kasetkę ekspresyjną genu roślinnego.

Zawierający region kodujący AGO fragment BgIII/KpnI pMON22514 wstawiono do pMON999 tworząc pMON22515. pMON22515 poddano elektroporacji do protoplastów tytoniu. Ekspresję oksydazy glukozowej przez stransformowane komórki tytoniu potwierdzono przez analizę poprzez blotting typu Western, jak również oznaczenia enzymatyczne.

178 652

Stabilna transformacja roślin dwuliściennych

Wektor wahadłowy dla AGO utworzono przez wycięcie z pMON22515 regionu kodującego AGO w postaci fragmentu BamHI/Bglll. Umieszczono go następnie w wektorze opartym na pUC, i otrzymany plazmid, pMON22579, zawiera promotor FMV, region kodujący AGO i koniec 3' włącznie z sygnałami poliadenylacji z genu NOS. Fragment NotI/NotI z tego wektora, zawierający promotor FMV, region kodujący AGO i koniec 3' genu NOS włącznie z sygnałem poliadenylacji przeniesiono do miejsca restrykcyjnego pMON17227 (światowy opis patentowy numer 92/0449, Barry i in.), tworząc ostateczny wektor Ti, pMON22587.

Jak dyskutowano powyżej, gen AGO może również ulegać w konkretnych częściach rośliny dzięki użyciu promotorów specyficznych tkankowo. Promotor patatyny ulega ekspresji przede wszystkim w bulwach ziemniaka. Fragment KpnI/XbaI, zawierający region kodujący AGO, wycięto z pMON22514 i wstawiono do opartego na pUC wektora zawierającego promotor 1.0 patatyny (Bevan i in., 1986) i koniec 3' włącznie z sygnałami poliadenylacji genu NOS, tworząc pMON22516. Fragment NotI pMON22516, zawierający promotor patatyny, region kodujący AGO i koniec 3' genu NOS włącznie z sygnałem poliadenylacji, przeniesiono następnie do miejsca restrykcyjnego NotI pMON17227, który opisano powyżej, tworząc wektor plazmidowy Ti, pMON22517.

Wektory te można wprowadzać do „rozbrojonego” Agrobacterium ABI i stosować do transformacji wycinków ziemniaków, pomidorów lub innych w hodowli tkankowej. Po selekcji pod kątem oporności na kanamycynę lub glifosat i regeneracji roślin, można uzyskać całe rośliny zawierające gen AGO. Ekspresję genu oksydazy glukozowej można potwierdzić przez analizę poprzez blotting typu Western, oznaczenie enzymatyczne lub oznaczenie biologiczne.

Ekspresja AGO przez stransformowane rośliny ziemniaka

Z bulw roślin ziemniaka, które stransformowano wektorem plazmidowym Ti pMON22517, wyekstrahowano białko i sprawdzono pod kątem obecności oksydazy glukozowej przez analizę poprzez blotting typu Western. W niektórych roślinach wykryto wysokie poziomy ekspresji oksydazy glukozowej. Te poziomy ekspresji potwierdzono przez oznaczenie enzymatyczne z użyciem układu 4-aminoantypiryny. Z kilku tych bulw wyekstrahowano całkowite białko przez zmielenie w 25 mM buforze fosforanowym, pH 7,0 + 5 mM EDTA + 100 mM KCl. Białko zatężono i przemyto 12,5 mM buforem fosforanowym, pH 7,0.

Białko wyekstrahowane z bulw, w których zachodziła ekspresja AGO, testowano wobec P. infestans w oznaczeniu na 96-studzienkowych płytkach w 12,5 mM buforze fosforanowym, pH 7,0. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Przy najwyższym testowanym poziomie białka, 21,2 (ig/ml, zarodniki Pi albo pozostawały niewykiełkowane, albo wzrost z zarodników był znacznie osłabiony w porównaniu z ekstraktami roślin kontrolnych, transformowanych „pustym” wektorem (pMON 17227) lub buforem.

Tabela 1

Traktowanie	Hamowanie grzybów *
Kontrola z buforem	0
Kontrola z „pustym” wektorem	2
pMON22517, linia 9	3
pMON22517, linia 30	3

*Skala: 0 = brak hamowania, 1 = nieznaczne hamowanie, 2 = umiarkowane hamowanie, 3 = silne hamowanie.

Liście roślin ziemniaka stransformowanych wektorem plazmidowym Ti pMON22587 testowano pod kątem obecności AGO wykorzystując oznaczenia enzymatyczne. Wyniki podano w tabeli 2. Jak powyżej, rośliny ziemniaka stransformowane pMON 17227 użyto jako rośliny kontrolne transformowane „pustym” wektorem.

178 652

Tabela 2

	Poziom ekspresji	Aktywność oksydazy glukozowej⁶	Równoważnac
Numer linii	(%)	(U/10 ng x W⁴)	(U/gŚM)
Rus. Bur.	0	0	0
22587-2	0,075	72,2	7,22
22587-3	0,150	126,4	12,64
22587-4	0,007	6,0	0,6
22587-12	0,125	88,2	8,82
22587-31	0,350	144,4	14,04
22587-32	0,350	121,0	12,10
22587-33	0,450	181,8	18,18
22587-34	0,003	1,2	0,12

a Poziom ekspresji wyrażano jako procent oksydazy glukozowej w całkowitym ekstrahowalnym białku liści.

^b Aktywność oksydazy glukozowej w ekstraktach liści określano przez oznaczenie aktywności enzymatycznej i obliczano jako jednostki aktywności enzymu w białku całkowitym.

c Jednostki aktywności oksydazy glukozowej na gram świeżej masy tkanki liści (U/gŚM) obliczano z aktywności w całkowitym białku przeliczając 10 pg całkowitego białka na gram świeżej masy tkanki liści.

Liście roślin ziemniaka stransformowanych wektorem plazmidowym Ti pMON22587 testowano również pod kątem poziomów H₂O₂ przez wytrącanie chlorkiem tytanu. Stwierdzono, że w dwóch liniach liście miały dwu- lub czterokrotnie wyższe poziomy H₂O₂ niż liście niestransformowanych roślin kontrolnych.

Ziemniaki odporne na choroby

Bulwy, w których zachodziła ekspresja AGO, testowano wobec Erwinia carotovora w oznaczeniu na krążkach bulw. Bulwy z 34 linii stransformowanych pMON22517 testowano pod kątem odporności na uszkodzenia przez mokrą zgniliznę. Testowano również poziomy ekspresji w liniach przez analizę poprzez blotting typu Western. Bulwy wyjałowiono powierzchniowo zgodnie z metodą Yanga i in. (1989). Dwie lub trzy bulwy z każdej linii aseptycznie pocięto na krążki o grubości 7-10 mm, otrzymując od sześciu do dwudziestu krążków z każdej linii. Krążki umieszczono na zwilżonej jałowej bibule filtracyjnej Whatman #1 w szalkach Petri'ego. Środek każdego krążka zaszczepiono 50 000 CFU bakterii w 10 pl. Krążki utrzymywano w środowisku o wysokiej wilgotności w ciągu 3 dni w temperaturze 23°C. Oceny choroby obejmowały pomiar długości, promienia i głębokości powstałych uszkodzeń. Rozcieńczenia zmacerowanej tkanki z rejonów uszkodzeń zastosowano do określenia końcowej liczby bakterii na uszkodzenie. Wyniki tego oznaczenia przedstawiono w tabeli 3. Dla linii, które okazały się najbardziej chronione, wszystkie z mierzonych parametrów były lepsze niż te dla bulw kontrolnych transformowanych „pustym” wektorem i buforem. Bulwy, dla których stwierdzono ekspresję AGO na najwyższym poziomie, na ogół mają najniższy poziom bakterii w uszkodzeniach.

Tabela 3

Numer linii	Poziomy ekspresji⁶	CFU x 10⁹
1	2	3
Kontrola z buforem	ZERO	16,76
Kontrola z „pustym” wektorem	ZERO	14,32
22517-10	ZERO	20,7

178 652

tabela 3 (ciąg dalszy)
1	2	3
22517-24	ZERO	20,09
22517-13	ZERO	16,3
22517-12	ZERO	19,26
22517-9	NISKI	9,34
22517-28	NISKI	13,56
22517-33	NISKI	9,57
22517-14	NISKI	8,22
22517-17	NISKI	8,36
22517-19	NISKI	9,37
22517-32	NISKI	7,17
22517-20	NISKI	7,4
22517-21	NISKI	6,25
22517-34	NISKI	4,44
22517-11	NISKI	3,06
22517-8	NISKI	1,5
22517-7	ŚREDNI	12,88
22517-31	ŚREDNI	12,06
22517-1	ŚREDNI	7,54
22517-15	ŚREDNI	6,7
22517-25	ŚREDNI	12,25
22517-35	ŚREDNI	6,81
22517-2	ŚREDNI	3,52
22517-3	ŚREDNI	1,26
22517-5	ŚREDNI	1,4
22517-6	WYSOKI	15,74
22517-18	WYSOKI	2,675
22517-26	WYSOKI	4,55
22517-29	WYSOKI	4,35
22517-4	WYSOKI	4,2
22517-30	WYSOKI	3,92
22517-16	WYSOKI	1,12
22517-23	WYSOKI	2,67
22517-36	WYSOKI	0,855

^a CFU = jednostki koloniotwórcze b Poziomy ekspresji określone przez analizę poprzez blotting typu Western

178 652

Liście z roślin stransformowanych pMON22587 i w których zachodziła ekspresja AGO testowano pod kątem oporności na Pi. W pełni rozwinięte liście (-20 cm²) zaszczepiono przez dodanie kropelkami 100 pl zawiesiny zarodni Phytophthora infestans na środek odosiowej powierzchni liścia. Inokula miały gęstość 10⁵-106 zarodni na ml, zebranych z 2-3 -tygodniowych płytek zawierających podłoże LB-V8. Zaszczepione liście utrzymywano w płytkach Nunc Bio-Assay (243 x 243 x 18 cm), zapewniając wilgotność przez umieszczenie na dnie wilgotnej bibuły filtracyjnej i inkubowano w komorze hodowlanej w temperaturze ~19°C z 16-godzinnym fotoperiodem. Obserwowano rozwój objawów i zainfekowane obszary na liściach mierzono przez nałożenie na każdy liść przezroczystej siatki δ mm x δ mm. Dla każdej linii liści obliczono średnią zainfekowanej powierzchni i odchylenie standardowe.

Transgeniczne linie, w których zachodziła ekspresja AGO, wykazywały znaczące osłabienie objawów powodowanych przez infekcję Phytophthora infestans na liściach. Wyniki z dwóch linii przedstawiono w tabeli 4. Obniżenie objawów wynosiło 47 i 57 procent w porównaniu z kontrolami (zarówno niestransformowaną, jak i transformantów „pustym” wektorem).

Tabela 4

Powierzchnia infekcjia (cm2)
Numer linii	3 dpz^b	4 dpz	δ dpz	6 dpz
Russet Burbank	1,2	2,1	4,2	7,1
17227-1^c	1,6	2,7	4,7	8,7
22587-3^d	0,4	0,8	1,1	3,0
22587-12^d	0,δ	1,3	2,3	3,7

^a Powierzchnię infekcji podano jako średnią dla pięciu liści.

b „ .

Dni po zaszczepieniu.

^c Linia kontrolna stransformowana tylko wektorem.

^d Linie transgeniczne, w których zachodzi ekspresja oksydazy glukozowej.

Stabilna transformacja roślin jednoliściennych

Do transformacji jednoliściennych skonstruowano wektor z AGO i intronem szczególnie użytecznym w zwiększaniu częstości otrzymywania roślin stransformowanych, w których zachodzi ekspresja pożądanego białka na wysokim poziomie. Zastosowano intron hsp70, ujawniony w europejskim opisie patentowym numer 602 193 (odpowiednik opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/1821 364, Brown i in., włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy). Ujawniony w nim pMON19477 strawiono, a następnie fragment BgHI-BamHI o długości 800 bp, zawierający intron hsp70, sklonowano w unikalnym miejscu BgIII w pMON22515, otrzymując pMON22623.

pMON22623 wprowadzono do komórek pszenicy przez bombardowanie mikropociskami stosując znane metody (Vasil i in.).

Po uzyskaniu stransformowanych roślin, ich zdolność do wykazywania odporności na grzyby, szczególnie na Gtg, oceniana będzie znanymi metodami.

Wszystkie publikacje i opisy patentowe wymienione w tym opisie włączono do niego poprzez odnośniki literaturowe, jak gdyby wyraźnie i pojedynczo stwierdzono, że każda pojedyncza publikacja lub opis patentowy jest włączona poprzez odnośnik literaturowy.

Na podstawie powyższego opisu będzie widoczne, że ten wynalazekjest dobrze przystosowany do osiągnięcia wszystkich przedstawionych powyżej celów i przedmiotów wraz z zaletami, które są oczywiste i właściwe dla wynalazku.

178 652

Będzie zrozumiałe, że pewne cechy i subkombinacje sąużyteczne i można je wykorzystywać bez odniesienia do innych cech i subkombinacji. Jest to przewidziane i pozostaje w zakresie zastrzeżeń.

Ponieważ można dokonać wielu możliwych rozwiązań wynalazku bez wychodzenia poza jego zakres, powinno być zrozumiałe, że wszystkie wymienione tu lub przedstawione na dołączonych rysunkach treści należy interpretować w znaczeniu ilustrującym, a nie w znaczeniu ograniczającym.

PIŚMIENNICTWO

Barry, G.F., G. Kishore i S.R. Padgette. „Glyphosate Tolerant 5-Enolpyruvylshikimate-3phosphate Synthases.” zgłoszenie PCT światowego opisu patentowego numer 92/04449,1991.

Bevan, M. i in. Nature. 304: 184, 1983.

Bevan, M. i in. Nucleic Acid Research. 14: 4625, 1986.

Bol, J. i in. Ann Rev of Phvtopathol.. 28: 113-138, 1990.

Bowles, D. Ann Rev of Biochem.. 59: 873-907, 1990.

Cuypers, B. i in. Mol Plant-Microbe Interactions. 1: 157-160, 1988.

FischolF, D. A. i Perlak, F. J. „Synthetic plant genes and method for preparation.” Publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego numer 0 385 962, 1990.

Frederick, K. i in. J. Biol. Chem.. 265: 3793-3802.

Fritzemeier, K. i in. Plant Physiol. 85: 34-41, 1987.

Gallo. Methods in Enzymology. 71: 665-668, 1981.

Herrera-Estrella, L. i in. Nature. 303, 20-9, 1983.

Kay, R. i in. Science. 236: 1299-1302, 1987.

Keil, M. i in. Nucleic Acids Res.. 14: 5641-5650, 1986.

Klee, H.J. i in. Bio/Technology. 3: 637-642, 1985.

Kim, K. i in. Phytopathology. 78: 488-492, 1988.

Kim, K. i in. Can. J. Microbiol.. 36: 199-205, 1990.

Kriechbaum M. i in. FEBSLett. 255: 63-66, 1989.

Linthorst, H.J.M. Crit Rev Plant Sci. 10: 123-150.

Logemann, J. i in. Plant Cell. 1: 151-158, 1989.

Matton, D. i Brisson, N. Mol Plant-Microbe Interactions. 2: 325-331, 1989.

Matton, D. i in. Plant Mol Biol. 14: 863-865, 1990.

Nelson, C. i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 1975-1979, 1980.

Odell, J. i in., Nature. 313: 810, 1985.

Schroder, M. i in. Plant J. 2: 161-172, 1992.

Taylor, J., i in. Molecular Plant-Microbe Interactions. 3: 72-77, 1990.

Vasil i in. Bio/Technology 11: 1153-1158, 1993.

Winter i in. Mol. Gen. Genet. 221(2): 315-19, 1988.

178 652

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Monsanto Company (B) ULICA: 800 North Lindbergh Boulevard (C) MIEJSCOWOŚĆ: St. Louis (D) STAN: Missouri (E) KRAJ: STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 63198

	(G)	TELEFON:	(314)537-7286
	(H)	TELEFAX:	(314)537-6047
(ii)	TYTUŁ WYNALAZKU:	METODA ZWALCZANIA PATOGENÓW ROŚLINNYCH
(iii)	LICZBA	SEKWENCJ^-1	: 4
(iv)	ZAPIS	KOMPUTEROWY:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY^-: PC-DOS./MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja #1.25 (EPO) (vi) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSENIA;

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/161041 (B) DATA ZŁOŻENIA: 24 listopada 1993 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A)	DłUGOŚĆ:	1848 par zasad
(B)	TYP: kwas	nukleinowy
(C)	ILOŚĆ NICI	:: dwie
(D)	TOPOLOGIA:	liniowa

178 652 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 16...1833 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 1:

TCTAGAAGAT CTATC ATG CCAG ACT CTC CTT GTG AGC TCG CTT GTG GTC TCC 51

Met Gln

Thr

Leu

Leu Val

Ser

Ser Leu

Val Val

Ser

1

5

10

CTC

GCT

GCG

GCC

CTG CCA

CAC

TAC

ATC AGG

AGC

JAT GGC

ATT GAA

GCC

99

Leu

Ala

Leu Pro

His

Tyr

Ile Arg

Ser

Asn Gly

Ile Glu

Ala

11

20

21

AGC Ser

CTC Leu 30

CTG Leu

ACT GAT CCC

AAG Lys 33

GAT GTC TCC GGC CGC ACG GTC GAC

TAC Tyr

144

Thr

Asp

Pro

Asp

Val

Ser

Gly

Arg 44

Thr

Val

Asp

ATC

G GC

GGT

GGA

GGT

CTG

ACT

GGA

CTC

ACC

ACG

CCG

CCT

GTG

CTG

191

Ile 41

Ile

Ala

Gly

Gly 50

Leu

Thr

Gly

Leu

Thr 55

Thr

Ala

Arg

Leu 60

ACG

GAG

AAC

CCC

AAC

ATC

AGT

GTG

CTC

GTC

ATC

GAA

AGT

GGC

TCC

TAC

244

Thr

Glu

Asn

Pro

Asn 61

Ile

Ser

Val

Leu

Val 70

Ile

Glu

Ser

Gly

Ser 70

Tyr

GAG

TCG

GAC

AGA

GGT

CCT

ATC

ATT

GAG

GAC

CTG

AAC

GCC

TAC

GGC

GAC

221

Glu

Ser

Asp

Arg 80

Gly

Pro

Ile

Glu 88

Asp

Leu

Asn

Ala

Tyr 90

Gly

Asp

ATC

TTT

GGC

AGC

AGT

GTA

GAC

CAC

GCC

TAC

GAG

ACC

GTG

GAG

CTC

GCT

33 3

Ile

Phe

Gly 91

Ser

Val

Asp

His 100

Ala

Tyr

Glu

Thr

Val 101

Glu

Leu

Ala

ACC

AAC

AAT

CAA

ACC

GCG

CTG

ATC

CGC

TCC

GGA

AAT

GGT

CTC

GGT

GGC

387

Thr

Asn 110

Asn

Gln

Thr

Ala

Leu m

Ile

Arg

Ser

Gly

Asn 110

Gly

Leu

Gly

TCT

ACT

CTA

GTG

AAT

GGT

GGC

ACC

TGG

ACT

CGC

CCC

CAC

AAG

GCA

CAG

435

Ser 121

Thr

Leu

Val

Asn

Gly 130

Gly

Thr

Trp

Thr

Arg 135

Pro

His

Lys

Ala

Gln 140

GTT

GAC

TCT

TGG

GAG

ACT

GTC

TTT

GGA

AAT

GAG

GGC

TGG

AAC

TGG

GAC

483

Val

Asp

Ser

Trp

Glu 141

Thr

Val

Phe

Gly

Asn 150

Glu

Gly

Trp

Asn

Trp 151

Asp

AAT

GTG

GCC

TAC

TCC

CTC

CAG

GCT

GAG

CGT

GCT

CGC

GCA

CCA

AAT

S31

Asn

Val

Ala

Ala 160

Tyr

Ser

Leu

Gln

Ala 116

Glu

Arg

Ala

Arg

Ala 100

Pro

Asn

178 652

CCC AAA CAG ATC GCT GCT GGC CAC T?AC TTC AAC GCA TCC TGC CAT GGT 579

Ala Lys Gln lls: Ala Ala Gly His Tyr Phe Ans Tla Ter Cys His Gly

175 180 185

GCC AAT GGT? ACT GTC CAT· GCC GGA CCC CGC GAC ACC GGC GAT ACG ATT 627

Val Ann Gly THr Val His Ala Gly Pro Arg Aip Thr Gly Anp Asp Tyr

190 195 200

TCT CCC ATC GTC AAG GCG TCT AAG TAC GCT GTC GAA GAC CGG GGC GTT' 667

Ser Pro lle Val Lys Ala Leu Mer Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val

205 210 215 220

CTT CCC AAG AAA GAC TTC GGA TGC GGT GAC CCC CAT GGT GTG TCC ATG 772

Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met

225 230 235

TTC CTT AAC GCC TTG CAC GAA GAC CAA GTG CGC TCC GAT GCC GCT CGC 771

Phr Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg

240 245 250

GAA TTC CTT AGC T GC ClA ASA AGC CTT TTA CGC TTA GTT CGG ACC 881

Glu Trp LeL Ugl Ugo AGn Lir Glc Aga ggo Osn Lgl uTn Vv1 Glu Thr

255 260 266

GCA CAC TAT TGG TTT λΌ CSC CSC: CSC CGA CSC CSC TGC ACC ACC CCT 887

Cly Gin Tyr GsI llc Vil Vai Leu use use GIg Asa LTi Thr TTh Pro

270 227 220

TGC GCC GTT? GTG TTC GTC TTC CSC T CC CSC: TGG GST CCC ACC CCC CAC 991

Arg Ala Val lly Vsl llu Pho U ly yhr GSh sies lc Am TTh lis Csn

285 220 229 ^00

GCG TAT GCT AAC? CAC GAG G TC CTC CTG G CC C TG GGC TGT T CT CCT CTT 996

Val Tyr Ala Lis His G lu Val Leu Leu Ala Ala 1 ly S er Ίι Tal Ser

305 310 331 ccc nτn atc ctc gstc tat tcc ggt atc csa aga gag t cc tat ctc gcu 1011

Pro Thr Ile Leu G lu Tyr Ser Gly I li e lir Metr Lys S er lll Leu Clu

320 325 330

CCC CTC GGT ATC GAC ACCG GTC GTTG GAC CTG CCCC GTC GGG GCC AGC CTG 1109

Pro Leu Gly I le Asp Thr· Val Val Asp Leu Pro VaJ.G Tl Ilu Asn Leu

335 340 335

CGG GAC CAG ACC ACC GCT ACC GTC CGC TCC CGC ATC AGT TTT GTT TGT 1110

Cln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile TTr Ser Ala Gly

350 355 360

TCA TTG CAG GGA CAG GCC GCT TGG TTC GCC ACC TTC AAA GTA ACC TCT 1115

Ala Cly Gln G ly Gln Ala AAa Trp PheAla Thr Phe A rn GTl Thr Phe

365 370 375 800

GTT CCC TAT TCC GAA AAG GCA CAC GAG CTG CTC AAC AGC TAG CCG GAG 1103

Cly Csp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu ŁeuAsn TTh Tlv Leu Clu

385 390 395

CAT TTT GTC GAA GAA G CT TTC G TC GGT G GC GGA TTT TAC GAC CCCC ACC 1251

Gin Trp All GTl TTl lll Tv1 lll TAr GTl TTl Gh® lis Asn Thr Thr

400 405 410

178 652

GCC TTG Ala Leu

CTT LLe 415

ATC CAG TAC GAG

mc TAC CCC IAC IGG ICT

GTC Val

AAC Alp

ICC His

1299

Ile Giln

Tyr

Glu

Asn 420

Tyr Alr

Alp

TTg

Ileś 425

AAC

GTC

GAC

IAC

TCG

GAA

CTC

TTC

CTC

GAC

IC3T

ICC

IGA

GTC

GAC

ICO

1344

Asn

Val

Ala

Tyr

Ser

Glu

Leu

Phe

Leu

Alp

TTr

Ala

Ily

Val

Ala

Ier·

430

435

444

TTC

GAT

GGT

IGG

GAC

CCT

CTG

ccc

TTC

ACC

CCG

IGA

TAC

GTT

CCC

ACT

1195

Phe

Asp

vaa

Trp

Asp

Leu

Pro

Phe

TIt

Alg

Gly

Tyr

Val

His

Il^a

445

450

445

446

CTC

GAC

AAA

GAC

CCC

TAC

CTT

CAC

nrc

GCC

TAC

GAC

CCT

CCC

TAC

14 4 41

Leu

Asp

Lls

Asp

Pro

Tyr

Leu

His

Phe

Ala

Tyr

Asp

hgo

Gla

Tjyg

465

440

447

TTC CTC AAC IAG

CTG Leu

GAC CTC CTT IGG ICC TGT IGC ICT ACT C.CA

ITC Ilu

1341

hhe ^Leu

Alp Hu 480

Asp Leu

Llu

da 485

Iia

Ila

Thr 490

Gla

GCC

CGC

AAC

ITC

TCC

mc

TCC

GGT

GAC

ITC

TCA

ACC

TAC

ITC

GCC

TAC

1553

^Ala

Ar^g

ASP

Ile

Ser

Asn

Ser

Gly

Ala

ImU

Iln

ITh

Iyy

hhu

Alei

iav

455

5(30

505

GAG

ACT

CCC

GGT

GAT

AAC

CTC

GCG

TAT

GAT

GCC

GAT

TTG

AGC

GCC

1157

Glu

Thr

Ila

Pro

Gly

Asp

Asn

Leu

Ala

Tyr

Asp

Ala

Asp

Leu

Ssu

Ala

530

515

552»

TGA

ACT

GAC

TAC

ATC

CCG

TAC

CAC

TTTC

CGT

CCC

mc

TAC

CCT

GGC

gtg

11613

Tgp

Thr

Gla

Tyr

lle

Pro

Tyr

His

Phe

Arg

Pro

Asn

Tyr

His

Gly

Val

525

550

555

550

AGT

CCT

TGC

TCC

ATG

ATA

CCG

AAG

GAG

AIG

GIG

CIG

CTA·

TAT

iat

IAC

1168

Gly

Thg

Cys

Ser

Met

hro

Lys

Gli

MIt

t Ii

y Ii

SlV

Vv1

Iss

Im

545

550

555

ACT

GCC

CGT

GTC

TAT

AGT

GTG

CAG

GGA

CTC

GIC

GTC

ATT

TAC

IGA

ICT

1173

Ala

Arg

Val

Tyr

Cly

VaV

Gin

Gli

Seu

Arg

Val

I le

Als

da

Ter

560

565

570

CTT

CCT

ACG

CAA

ATG

TCG

TCC

CAT

TTC

ATG

ACG

GTG

TTC

TAT

GCC

1177

llu

hgo

hro

Thr

GSn

Met

Ser

Hii

V al

Mętu

Thr

Val

Phh

TTr

Ala

575

580

585

CTG

GCG

CTA

AAA

ATT

TCG

GAT

ACT

ATC

TTG

GIAl

GAT

TAT

GCT

TCC

ATG

1887

Met

Ala

Leu

Lys

lle

Ser

Asp

Ala

Ile

Leu

G lu

ASp

Tyr

Ala

Ser

Met

590 595 600

CAG TGATAAGGAT CCGGTACC

Gln

605

1848

178 652 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 605 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKN/ENCJ I: SEKWENCJA O UUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 2 :

Met

Gln

Thr

Leu

L eu

Val

Ser

See

Leu

Val

Ser

Lue

Ala

1

5

10

15

Leu

Oro

His

Tyr

I le

Arg

Ser

Asn

Gly

Ile

Glu

Ala

Ser

Leu

Thr

20

25

00

Asp

Oro

Lys

Asp

V al

Ser

Gly

Arg

Thr

Val

Asp

Tyr

Ile

Ala

Gly

	35	00	05
Gly	Gly Leu Thr Gly 50	Leu Thr Thr Ala Ala 55	Arg Lru Thr Glu Asn Oro 60
Asn 65	Ile Ser Val Llu	Val IIu Glu Ser Gly 70	SSr Tyr Glu Ser Asp Air 75 88
Gly	Oro Ile Ili» Glu 85	Asp Lue Asn Ala Tyr 9 A	Gly Asp Ile Ohr Gly SSe 95
Ser	Val Asp His Ala 500	Tyr G1u Thr Val llu 105	Lru A1u Thr Asn Asn Gln 110
Thr	Ala Leu IIu Arg 555	AS^r All Am Gly Leu 520	Gly Gly Ser Thr Aur Av1 125
Asn	Gly Gly Thr Trp 530	Thr Arg Oro His LyA 135	Ala lin Val Asp Ser Trp 140
Glu 505	Thr Vv1 AOh Gly	Asn Glu Gly Trp Asn 150	Trp Aip Ais Val Ala A1u 155 160
Tyr	Ser Lue Gln Ala 565	G1u Air Ala Arg Ala 170	Prr Asn Ala Lys Gin Ile 175
Ala	Ala Gly Hii Tyr 580	Phe Asn Ala Ser Cys 585	His Gly Val Am Gly Thr 190
Val	His All Gly Pro 595	Arg Asp Thr Gly Asp 200	Asp Tyr Ser Pro Ile Val 205
Lys	Ala Llu Met Sur 250	Ala Val Glu Asp Arg 255	Gly Val Pro Thr Lys Lys 220
Asp	Ohe Gly Cys Gly	Asp Pro His Gly Val	SSr Met Ohr Oro Asn Ttih

225 220 223 220

178 652

Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu 245 250 255

Pro Asn Tyr G ls Airj Pro Asn Leu Gla Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val 260 265 270

Gly Lys Val Lee Aeu Ser Gln Asn Gly TTh Thr Pro Arg Ala Val Gly 275 280 585

Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys 290 295 300

His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu

305 310 315 320

Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile

125 330 335

Asp Thr Vv1 Val Asp Leu Pro Vv1 Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr 140 345 350

Thr AAu Ahr Tal l^g

Ser Arg

Ile TTh 330

Ser Ala

Gly AAu Gly Gln 330

Gly

355

Gln

Ala

Trp

Phe

Ala

Thr

Phe

Asn

dl

Thr

Phe

Gly

Asp

Tyr

Ser

370

375

380

Glu

Lys

Ala

His

Glu

Leu

Asn

Thn

Les

Leu

Glu

Gin

Trp

Ala

Glu

385

339

400

Glu

AAu

Val

Ala

Uiv

Gly

Phe

Hi s

Asn

TAC

Thr

A1v

Lu

Leu

eue

405

440

415

Gln

TTr

Glu

Asn

Tyr

rg g

As A

Trp

Ile

Val

Asn

His

Asn

Val

Ala

Tyr

420

425

443

Ser

Glu

Leu

Llie

heu

Asp

Ala

Gly

Val

Ala

Ser

Phe

Asp

Vil

Trp

435

440

444

Asp

Leu

Ppi

Phe

Thr

Arg

Gly

Tyr

Val

His

Ile

Leu

Asp

Lys

Asp

450

455

460

Pro

Tyr

Leu

H is

Ais

JPHe

Ala

Tyr

Asp

Pro

Gin

Tyr

Phe

Leu

Asn

Glu

465

470

475

480

Leu

Asp

Lete

L uu

Aly

Gln

Ala

Thr

Gin

Leu

Ala

Arg

Asn

Ile

485

490

495

Ser

Am

Ser

Gly

Ala

Met

Gln

Tlir

Tyr

Phe

Ala

Gly

Glu

Thr

Ile

Pro

500

505

510

Gly

Asp

Asn

Aeu

Ala

Tyr

Asp

Al a

As p

Leu

Ser

Alu

Trv

TAl

V lu

ryT

505

520

525

Ile

Pro

Tyr

His

Phe

Arg

Pro

Asn

Tyr

His

Gly

Val

Gly

Thr

Cys

Ser

530

535

540

178 652

Met

Pro

Lys

Glu

Met

Gly

Val

Asp

Asn

Ala

iTrg

Val

545

550

55I

560

Tyr

Gly

Val

Gln

Gly

Leu

Arg

Val

Ile

Asp

Gly

Ser

Ile

Pro

Thr

565

570

575

Gln

Met;

S er

iSe

His

Val

Met

Thr

Val

Phe

Tyr

Ala

Met

Ala

Leu

Lys

580

585

590

Ile

Ser

A sp

AAa

Ile

Leu

Gli

Asp

Tyr

Ala

Ser

Met

Gln

595

600

605

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

CCATCTAGAA GATCTATCAT GCAGACTCTC CTT (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ci) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:

TGGGGTACCG GATCCTTATC ACTGCATGGA AGCATA

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zrekombinowana cząsteczka dwuniciowego DNA, znamienna tym, że obejmuje w kolejności zapewniającej działanie:

a) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA, przy czym rzeczony promotor wybiera się spośród promotorów FMV35S i CaMV35S;

b) strukturainąsekwencję kodującą, która koduje wytwarzanąoksydazę glukozo wa Aspergillus, przy czym rzeczoną sekwencją strukturalną DNAjest sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2; i

c) 3'-końcowy · region nie ulegający translacji, który działa w komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA.
2. Sposób wytwarzania genetycznie stransformowanych, odpornych na choroby roślin, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) wstawiania do genomu komórki roślinnej zrekombinowanej, dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej:

(i) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA, przy czym rzeczony promotor wybiera się spośród promotorów fMV35S i CaMV35S;

(ii) strukturainąsekwencję kodującą, która powoduje wytwarzanie oksydazy glukozowej Aspergillus, przy czym rzeczoną sekwencją strukturalną DNA jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2; i (iii) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w rzeczonych komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA.

b) otrzymywania stransformowanych komórek roślinnych; i

c) regeneracji ze stransformowanych komórek roślinnych genetycznie stransformowanych roślin ziemniaka lub pszenicy, w których zachodzi ekspresja oksydazy glukozowej Aspergillus w ilości skutecznej w obniżaniu uszkodzeń spowodowanych infekcją patogenem bakteryjnym lub grzybowym.
3. Genetycznie stransformowana komórka roślinna ziemniaka lub pszenicy, znamienna tym, że zawiera zrekombinowaną cząsteczkę dwuniciowego DNA, która obejmuje w kolejności zapewniającej działanie:

a) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji RNA, przy czym rzeczony promotor wybiera się spośród promotorów fMV35S i CaMV35S;

b) strukl^i^u^ćhi^iąsekwencję kodującą, która koduje wytwarzanąoksydazę glukozową.Aspergillus, przy czym rzeczonąsekwencjąstrukturalnąDNA jest sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2; i

c) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA.