BR112018001122B1 - Molécula de dna recombinante compreendendo elementos reguladores de planta e método de expressão de uma molécula de dna passível de transcrição - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a moléculas de dna recombinante e construções, bem como as suas sequências nucleotídicas, úteis para a modulação da expressão de gene em plantas. a invenção também fornece plantas transgênicas, células de planta, partes de planta e sementes que compreendem as moléculas de dna recombinante operacionalmente ligadas a moléculas de dna heterólogo passível de transcrição, bem como os métodos para seu uso.

Description

REFERÊNCIA AO PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dosEstados Unidos N.° 62/306.790, depositado em 11 de março de 2016 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] A listagem de sequência que está contida no arquivochamado "MONS417WO-sequence listing", que é de 29,4 KB (conforme medições da Microsoft Windows®) e foi criado em 6 de Março de 2017, está arquivada em anexo por apresentação eletrônica, e é aqui incorporada por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A invenção refere-se ao campo da biologia molecular deplantas; e engenharia genética de plantas. Mais especificamente, a invenção refere-se a moléculas de DNA úteis para a modulação da expressão de genes em plantas.

ANTECEDENTES

[004] Os elementos reguladores são elementos genéticos queregulam a atividade do gene através da modulação da transcrição de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada. Tais elementos podem incluir promotores, líderes, íntrons e regiões não traduzidas 3' e são úteis no campo da biologia molecular de plantas e da engenharia genética de plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A invenção fornece novos elementos reguladores de genespara uso em plantas. A invenção também fornece construções de DNA que compreendem os elementos reguladores. A presente invenção também fornece células de plantas transgênicas, plantas e sementes que compreendem os elementos reguladores. Em uma modalidade, os elementos reguladores estão operacionalmente ligados a uma molécula de DNA passível de transcrição. Em certas modalidades, a molécula de DNA passível de transcrição pode ser heteróloga em relação à sequência reguladora. Assim, uma sequência de elemento regulador fornecida pela invenção pode, em modalidades particulares, ser definida como operativamente ligada a uma molécula de DNA heterólogo passível de transcrição. A presente invenção também fornece métodos para produzir e utilizar os elementos reguladores, as construções de DNA que compreendem os elementos reguladores, e as células de plantas transgênicas, as plantas e sementes que compreendem os elementos reguladores operacionalmente ligados a uma molécula de DNA passível de transcrição.

[006] Assim, em um aspecto, a invenção fornece uma molécula deDNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência com, pelo menos, cerca de 85 porcento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-15; (b) uma sequência que compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-15; e (c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-15, em que o fragmento tem uma atividade reguladora de gene; em que a sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de DNA heterólogo passível de transcrição. Por "molécula de DNA heterólogo passível de transcrição", entende-se que a molécula de DNA passível de transcrição é heteróloga em relação à sequência de polinucleotídeo ao qual está operativamente ligada. Em modalidades específicas, a molécula de DNA recombinante compreende uma sequência de DNA possuindo pelo menos cerca de 90 porcento, pelo menos, 91 porcento, pelo menos, 92 porcento, pelo menos, 93 porcento, pelo menos, 94 porcento, pelo menos, 95 porcento, pelo menos, 96 porcento, em identidade de pelo menos 97 porcento, pelo menos, 98 porcento, ou, pelo menos, 99 porcento de sequência com a sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-15. Em modalidades particulares, a sequência de DNA que compreende um elemento regulador. Em algumas modalidades o elemento regulador compreende um promotor. Em ainda outras modalidades, a molécula de DNA heterólogo passível de transcrição compreende um gene de interesse agronômico, tal como um gene capaz de fornecer resistência a herbicidas em plantas, ou um gene capaz de fornecer resistência a pragas de plantas em plantas. Em ainda outras modalidades, a invenção fornece uma construção que compreende uma molécula de DNA recombinante tal como aqui fornecido.

[007] Em outro aspecto, são fornecidas aqui células de plantastransgênicas compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência com, pelo menos, cerca de 85 porcento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-15; (b) uma sequência que compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-15; e (c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 115, em que o fragmento tem uma atividade reguladora de gene; em que a sequência de DNA está operacionalmente ligada a uma molécula de DNA heterólogo passível de transcrição. Em certas modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta monocotiledônea. Em outras modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta monocotiledônea ou uma célula de planta dicotiledônea.

[008] Em ainda outro aspecto, são ainda fornecidas aqui célulasde plantas transgênicas, ou partes das mesmas, compreendendo uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência com, pelo menos, 85 porcento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-15; b) uma sequência que compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-15; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-15, em que o fragmento tem uma atividade reguladora de gene; em que a sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de DNA heterólogo passível de transcrição. Em modalidades específicas, a planta transgênica é uma planta descendente de qualquer geração que compreende a molécula de DNA recombinante. A semente transgênica compreendendo a molécula de DNA recombinante que produz uma planta transgênica tal, quando cultivada é também aqui fornecida.

[009] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método deprodução de um produto básico, compreendendo a obtenção de uma planta transgênica ou parte da mesma, contendo uma molécula de DNA recombinante da invenção e produzir o produto básico a partir da mesma. Em uma modalidade, o produto básico são sementes, grãos, partes de plantas, óleos e farelo processados.

[0010] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método deprodução de uma planta transgênica que compreende uma molécula de DNA recombinante da presente invenção que compreende transformar uma célula de planta com a molécula de DNA recombinante da presente invenção para produzir uma célula de planta transformada e regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transformada. BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0011] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de DNA de um grupo deelementos de expressão reguladora (EXP), que compreende um promotor derivado de um gene de proteína putativa Ferredoxina 2 (Fe2) de Cucumis melo operativamente ligada 5' ao seu líder nativo.

[0012] SEQ ID NO: 2 é uma sequência de promotor derivada a partirde um gene de proteína putativa Ferredoxina 2 (Fe2) de Cucumis melo.

[0013] SEQ ID NO: 3 é uma sequência líder derivada de um genede proteína putativa Ferredoxina 2 (Fe2) de Cucumis melo.

[0014] SEQ ID NO: 4 é uma sequência de DNA de uma EXPcompreendendo um promotor derivado de um gene da proteína 13 de ligação à clorofila a-b de Cucumis melo operacionalmente ligado 5' ao seu líder nativo.

[0015] SEQ ID NO: 5 é uma sequência de promotor derivada a partirde um gene da proteína 13 de ligação à clorofila a-b de Cucumis melo.

[0016] SEQ ID NO: 6 é uma sequência de comando derivada de umgene da proteína 13 de ligação à clorofila a-b de Cucumis melo.

[0017] SEQ ID NO: 7 é uma sequência de DNA de um EXPcompreendendo um promotor derivado de um gene semelhante ao da proteína 24 com dedo de zinco em B-box de Cucumis melo operacionalmente ligado 5' ao seu líder nativo.

[0018] SEQ ID NO: 8 é uma sequência de promotor derivada a partirde um gene semelhante ao da proteína 24 com dedo de zinco em B-box de Cucumis melo.

[0019] SEQ ID NO: 9 é uma sequência lider derivada a partir de umgene semelhante ao da proteína 24 com dedo de zinco em B-box de Cucumis melo.

[0020] SEQ ID NO: 10 é uma sequência de DNA de um EXPcompreendendo um promotor derivado de um gene de proteína b2 Medicago truncatula do complexo de coleta de luz operacionalmente ligado 5' ao seu líder nativo.

[0021] SEQ ID NO: 11 é uma sequência de promotor derivada apartir de um gene de proteína b2 Medicago truncatula do complexo de coleta de luz.

[0022] SEQ ID NO: 12 é uma sequência líder derivada de um genede proteína b2 Medicago truncatula do complexo de coleta de luz.

[0023] SEQ ID NO: 13 é uma sequência de DNA de um EXP compreendendo um promotor derivado de um gene precursor Medicago truncatula fotossistema II de cloroplasto operacionalmente ligado 5' ao seu líder nativo.

[0024] SEQ ID NO: 14 é uma sequência de promotor derivada apartir de um gene precursor Medicago truncatula fotossistema II de cloroplasto.

[0025] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de promotor de sequêncialíder derivada de um gene precursor Medicago truncatula fotossistema II de cloroplasto.

[0026] SEQ ID NO: 16 é uma sequência potenciadora derivada apartir do promotor do gene de proteína b2 Medicago truncatula do complexo de coleta de luz.

[0027] SEQ ID NO: 17 é uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS) com um íntron processável.

[0028] SEQ ID NO: 18 é uma sequência 3' UTR derivada a partir dogene E6 Gossypium barbadense.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] A presente invenção fornece moléculas de DNA que têmatividade gene-regulação em plantas. As sequências nucleotídicas destas moléculas de DNA são fornecidas como SEQ ID NOs: 1-15. Estas moléculas de DNA são capazes de afetar a expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada em tecidos da planta, e, por conseguinte, regular a expressão de genes de um transgene operacionalmente ligado em plantas transgênicas. A invenção também fornece métodos de modificar, produzir e utilizar a mesma. A invenção também fornece composições que incluem células de plantas transgênicas, as plantas, partes de plantas e sementes contendo as moléculas de DNA recombinante da invenção, e métodos para preparação e uso da mesma.

[0030] As seguintes definições e métodos são fornecidos para definir melhor a presente invenção e guiar aqueles versados ordinariamente na técnica na prática da presente invenção. A menos que indicado em contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles de conhecimento comum na técnica relevante.

Moléculas de DNA

[0031] Tal como aqui utilizado, o termo "DNA" ou "molécula deDNA" refere-se a uma molécula de DNA de cadeia dupla de origem genômica ou sintética, por exemplo, um polímero de bases de desoxirribonucleotídeos ou uma molécula de DNA, lidas a partir de 5' (a montante) para terminar a (a jusante) extremidade 3'. Tal como aqui utilizado, o termo "sequência de DNA" refere-se à sequência nucleotídica de uma molécula de DNA. A nomenclatura utilizada aqui àquela de Título 37 do Código de Regulamentos Federais dos Estados Unidos §1.822 e estabelecida nas tabelas no Padrão WIPO ST.25 (1998), Apêndice 2, Tabelas 1 e 3.

[0032] Tal como aqui utilizado, uma "molécula de DNArecombinante" é uma molécula de DNA que compreende uma combinação de moléculas de DNA que não ocorrem naturalmente em conjunto sem intervenção humana. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante pode ser uma molécula de DNA que é composta por pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas em relação umas as outras, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que se desvia das sequências de DNA que existem na natureza, ou uma molécula de DNA que foi incorporada no DNA de uma célula hospedeira por transformação genética ou edição de gene.

[0033] Como usado aqui, o termo "identidade de sequência" refere-se à extensão em relação na qual duas sequências polinucleotídicas idealmente alinhadas ou duas sequências polipeptídicas idealmente alinhadas são idênticas. Um alinhamento de sequência ideal é criado pelo alinhamento manual de duas sequências, por exemplo, uma sequência de referência e outra sequência, para maximizar o número de correspondências de nucleotídeo no alinhamento da sequência com inserções, deleções ou lacunas de nucleotídeo internas apropriadas. Tal como aqui utilizado, o termo "sequência de referência" refere-se a uma sequência de DNA fornecida a uma sequência de DNA apresentada como SEQ ID NOs: 1-15.

[0034] Como usado aqui, o termo "identidade de sequênciapercentual" ou "identidade percentual" ou "% de identidade" é a fração de identidade multiplicada por 100. A "fração de identidade" para uma sequência idealmente alinhada com uma sequência de referência é o número de correspondências de nucleotídeos no alinhamento ideal, dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência, por exemplo, o número total de nucleotídeos no comprimento total da sequência de referência inteira. Assim, uma modalidade da invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência que, quando otimamente alinhada com uma sequência de referência, aqui fornecida como SEQ ID NOs: 1-15, tem, pelo menos, cerca de 85 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 86 porcento de identidade, pelo menos cerca de 87 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 88 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 89 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 90 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 91 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 92 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 93 porcento de identidade, em menos cerca de 94 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 95 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 96 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 97 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 98 porcento de identidade, pelo menos, cerca de 99 porcento de identidade, ou pelo menos cerca de 100 porcento de identidade com a sequência de referência.

Elementos Reguladores

[0035] Elementos reguladores, tais como promotores, líderes(também conhecido como 5' UTRs), intensificadores, íntrons e regiões de terminação da transcrição (ou 3' UTRs) desempenham um papel fundamental na expressão global de genes em células vivas. O termo "elemento regulador", tal como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de DNA que possui atividade reguladora de gene. O termo "atividade gene-regulação", tal como aqui utilizado, refere-se à capacidade para afetar a expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada, por exemplo, que afeta a transcrição e/ou tradução da molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada. Os elementos reguladores, tais como promotores, líderes, íntrons, intensificadores e 3'UTRs que funcionam em plantas são por isso úteis para a modificação de plantas através da engenharia genética de fenótipos.

[0036] Tal como aqui utilizado, um "grupo de elemento deexpressão reguladora" ou sequência "EXP" pode referir-se a um grupo de elementos reguladores ligados de forma operacional, tais como intensificadores, promotores, líderes e íntrons. Assim, um grupo de elementos de expressão reguladora pode ser constituído, por exemplo, de um promotor operacionalmente ligado a uma sequência líder 5'. EXP’s úteis na prática da presente invenção incluem 1, 4, 7, 10, e 13.

[0037] Os elementos reguladores podem ser caracterizados peloseu padrão de expressão do gene, por exemplo, efeitos positivos e negativos ou tal como a expressão constitutiva ou temporal, espacial, de desenvolvimento, tecido, ambientais, fisiológicas, patológicas, do ciclo celular e/ou expressão quimicamente responsiva, e qualquer combinação dos mesmos, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas. Tal como aqui utilizado, um "padrão de expressão de gene" é qualquer padrão de transcrição de uma molécula de DNA ligada operativamente a uma molécula de RNA transcrita. A molécula de RNA transcrita pode ser traduzida para produzir uma molécula de proteína ou pode fornecer um antissenso ou outra molécula de RNA reguladora, tal como um RNA de cadeia dupla (dsRNA), um RNA de transferência (tRNA), um RNA ribossomal (rRNA), um microRNA (miRNA), e semelhantes.

[0038] Tal como aqui utilizado, o termo "expressão de proteína" équalquer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrita para uma molécula de proteína. A expressão da proteína pode ser caracterizada pelas suas qualidades temporais, espaciais, de desenvolvimento, ou morfológicas, bem como por indicações quantitativas ou qualitativas.

[0039] Um promotor é útil como um elemento de regulação paramodulação da expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada. Tal como aqui utilizado, o termo "promotor" refere-se geralmente a uma molécula de DNA que está envolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase II e outras proteínas, tais como fatores de transcrição que atuam em trans, para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser inicialmente isolado a partir de região 5' não traduzida (5‘ UTR) de uma cópia genômica de um gene. Alternativamente, os promotores podem ser produzidos sinteticamente ou podem ser moléculas de DNA manipuladas. Os promotores podem também ser quiméricos. Promotores quiméricos são produzidos por meio da fusão de duas ou mais moléculas de DNA heterólogas. Promotores úteis na prática da presente invenção incluem elementos promotores incluídos em qualquer das SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 e 14, ou fragmentos ou variantes dos mesmos. Em modalidades específicas da invenção, as moléculas de DNA reivindicadas e quaisquer variantes ou derivados dos mesmos, como aqui descritos, são ainda definidos como compreendendo a atividade promotora, por exemplo, são capazes de atuar como um promotor em uma célula hospedeira, tal como em uma planta transgênica. Em modalidades ainda mais específicas, um fragmento pode ser definido como exibindo atividade promotora possuída pela molécula de promotor a partir do qual é derivado, ou um fragmento pode compreender um "promotor mínimo", que fornece um nível basal de transcrição e é composto de um TATA box, outro motivo de sítio de ligação ao fator de transcrição conhecido, ou sequência de DNA equivalente para reconhecimento e ligação da RNA polimerase II para o complexo de iniciação da transcrição.

[0040] Em uma modalidade, os fragmentos de uma sequênciapromotora aqui revelada são fornecidos. Fragmentos do promotor podem compreender a atividade do promotor, tal como descrito acima, e pode ser útil por si só ou em combinação com outros promotores e fragmentos do promotor, tais como na construção de promotores quiméricos, ou em combinação com outros fragmentos EXPs e EXP. Em modalidades específicas, os fragmentos de promotor são fornecidos compreendendo, pelo menos, cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 175, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 225, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 275, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 750, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, ou pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos contíguos, ou mais, de uma atividade do promotor de molécula de DNA que possui, como aqui divulgado. Em certas modalidades, a invenção fornece fragmentos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-15, tendo a atividade da sequência de comprimento completo. Os métodos para a produção de tais fragmentos a partir de uma molécula de promotor de partida são bem conhecidos na técnica.

[0041] As composições derivadas de qualquer um dos elementospromotores incluídos em qualquer das SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, e 14, tais como deleções internas ou 5'-, por exemplo, podem ser produzidas utilizando métodos conhecidos na técnica para melhorar ou alterar a expressão, incluindo através da remoção de elementos que têm tanto efeitos positivos ou negativos na expressão; duplicação de elementos que têm efeitos positivos ou negativos na expressão; e/ou duplicar ou remover elementos que têm efeitos específicos em tecido- ou células em expressão. As composições derivadas de qualquer um dos elementos promotores incluídos em qualquer das SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 e 14 composta de deleções 3', em que o elemento do TATA box ou sequência equivalente do mesmo e a sequência a jusante é removida pode ser usada, por exemplo, para fazer elementos intensificadores. Outras supressões podem ser feitas para remover quaisquer elementos que têm efeitos específicos positivos ou negativos; específicos de tecido; específicos de célula; ou específicos de tempo (tais como, mas não limitado a, ritmo circadiano) sobre a expressão. Qualquer um dos elementos promotores incluídos em qualquer das SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 e 14 e os fragmentos ou intensificadores derivados dos mesmos podem ser usados para fazer composições de elementos reguladores da transcrição quiméricos.

[0042] De acordo com a invenção, um fragmento de promotor oupromotor pode ser analisado para a presença de elementos promotores conhecidos, por exemplo, características da sequência de DNA, tais como um TATA box e sítio de ligação de outros motivos de fator de transcrição conhecido. A identificação de tais elementos promotores conhecidos pode ser utilizada por um versado na técnica para a concepção de variantes do promotor com um padrão de expressão semelhante ao promotor inicial.

[0043] Tal como aqui utilizado, o termo "líder" refere-se a uma molécula de DNA isolados da região a 5' não traduzida (5' UTR) e um gene definido geralmente como um segmento de nucleotídeos entre o sítio de início da transcrição (TSS) e o sítio de início da sequência de codificação da proteína. Como alternativa, os líderes podem ser produzidos sinteticamente ou elementos de DNA manipulados. Um líder pode ser usado como um elemento regulador 5' para modular a expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada. Moléculas de comando podem ser utilizadas com um promotor heterólogo ou com o seu promotor nativo. Líderes úteis na prática da presente invenção incluem SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, e 15 ou qualquer um dos elementos líder incluídos em qualquer das SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, e 13 ou fragmentos ou variantes dos mesmos. Em modalidades específicas, tais sequências de DNA podem ser definidas como sendo capaz de atuar como um líder de uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, uma célula de planta transgênica. Em uma modalidade, tais sequências são decodificadas como compreendendo atividade líder.

[0044] As sequências líder (também referida como 5' UTR)apresentada como SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, e 15 ou qualquer um dos elementos líder incluídos em qualquer das SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, e 13 pode ser constituída por elementos de regulação, ou podem adotar estruturas secundárias que podem ter um efeito na transcrição ou tradução de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada. As sequências líder apresentadas como SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, e 15 ou qualquer um dos elementos líder incluídos em qualquer das SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, e 13 pode ser utilizado de acordo com a invenção para fazer elementos reguladores quiméricos que afetam a transcrição ou tradução de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada.

[0045] Tal como aqui utilizado, o termo "íntron" refere-se a uma molécula de DNA que pode ser isolada ou identificada a partir de um gene e podem ser definidos geralmente como uma região longitudinalmente para fora durante o RNA mensageiro (mRNA) de processamento antes da tradução. Alternativamente, um íntron pode ser um elemento de DNA produzida sinteticamente ou manipuladas. Um íntron pode conter elementos intensificadores que tem efeito na transcrição de genes ligados operacionalmente. Um íntron pode ser utilizado como um elemento de regulação para modulação da expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada. A construção pode compreender um íntron, e o íntron pode ou não ser heterólogo em relação à molécula de DNA passível de transcrição. Exemplos de íntrons na técnica incluem o íntron da actina do arroz e o íntron HSP70 de milho.

[0046] Nas plantas, a inclusão de alguns íntrons em construções degenes conduz a um aumento da acumulação de mRNA e proteína relativamente às construções que faltam no íntron. Este efeito tem sido denominado "melhoramento de íntron mediado" (IME) da expressão do gene. Os íntrons conhecidos para estimular a expressão em plantas foram identificados nos genes do milho (por exemplo, tubA1, Adh1, Sh1, e Ubi1), em genes de arroz (por exemplo, tpi) e em genes de plantas dicotiledôneas como aqueles de petúnia (por exemplo, rbcS), batata (por exemplo, st-ls1) e da Arabidopsis thaliana (por exemplo, Gene ubq3 e pat1). Tem sido mostrado que mutações ou deleções dentro dos sítios de splicing de um íntron reduzem a expressão do gene, indicando que splicing pode ser necessário para IME. No entanto, IME em plantas dicotiledôneas foi demonstrado por mutações pontuais nos sítios de splice do gene de pat1 A. thaliana. Vários usos do mesmo íntron em uma planta exibiram desvantagens. Nesses casos, é necessário dispor de um conjunto de elementos de controle de base para a construção de elementos de DNA recombinante apropriados.

[0047] Tal como aqui utilizados, os termos "molécula de terminaçãoda transcrição 3'", "região não traduzida 3'" ou "3' UTR" refere-se a uma molécula de DNA que é usada durante a transcrição com a região não traduzida 3' da porção de uma molécula de mRNA. A região não traduzida 3' de uma molécula de mRNA pode ser gerada por clivagem específica e 3' poliadenilação, também conhecida como uma cauda poliA. A 3' UTR pode ser operativamente ligada a e localizada a jusante de uma molécula de DNA passível de transcrição e pode incluir um sinal de poliadenilação e outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição, processamento de mRNA, ou a expressão do gene. Caudas poliA são pensadas para funcionar na estabilidade do mRNA e na iniciação da tradução. Exemplos de moléculas de terminação de transcrição 3' na técnica são a região 3' da nopalina sintase; região hsp17 3' de trigo, região rubisco pequena subunidade 3' de ervilha, região E6 3' de algodão, e a coixin 3' UTR.

[0048] 3' UTRs tipicamente encontram uso benéfico para aexpressão recombinante de moléculas de DNA específicas. Uma 3' UTR chata tem o potencial de gerar “read-through”, que podem afetar a expressão da molécula de DNA localizadas nos cassetes de expressão vizinhos. Controle adequado de terminação da transcrição pode impedir “read-through” em sequências de DNA (por exemplo, outros cassetes de expressão) localizadas a jusante e podem permitir ainda mais a reciclagem eficiente de RNA polimerase para melhorar a expressão do gene. Terminação eficiente da transcrição (liberação de RNA polimerase II do DNA) é um pré-requisito para a reiniciação da transcrição e assim afeta diretamente o nível global de transcrição. Na sequência de terminação da transcrição, o mRNA maduro é liberado do sítio de síntese e molde transportado para o citoplasma. mRNAs eucarióticos são acumulados como as formas (A) poli in vivo, tornando difícil de detectar sítios de terminação da transcrição, por métodos convencionais. No entanto, a previsão de 3' UTRs funcionais e eficientes por métodos de bioinformática é difícil na medida em que não há sequências de DNA conservados que permitam fácil previsão de uma 3' UTR eficaz.

[0049] De um ponto de vista prático, é geralmente benéfico que uma3' UTR utilizada em um cassete de expressão possua as seguintes características. A 3' UTR deve ser capaz de terminar de forma eficiente e eficaz a transcrição do transgene e prevenir “read-through” através da transcrição em qualquer sequência de DNA vizinha, que pode ser composta de um outro cassete de expressão, como no caso de vários cassetes de expressão que residem em uma transferência de DNA (T- DNA), ou o DNA cromossômico vizinho em que o T-DNA foi inserido. A 3’ UTR não deve causar uma redução na atividade de transcrição transmitida pelo promotor, líder, intensificadores e íntrons que são utilizados para dirigir a expressão da molécula de DNA. Em biotecnologia de plantas, a 3’ UTR é frequentemente utilizada para o condicionamento de reações de amplificação de RNA transcrito de forma inversa extraída da planta transformada e usada para: (1) avaliar a atividade de transcrição ou expressão do cassete de expressão, uma vez integrada no cromossomo da planta; (2) avaliar o número de cópias de inserções de DNA no interior da planta; e (3) avaliar zigosidade da semente resultante após o acasalamento. A 3’ UTR também é utilizada em reações de amplificação de DNA extraído a partir da planta transformada para caracterizar se o cassete inserido está intacto.

[0050] Tal como aqui utilizado, o termo "intensificador" ou "elementoestimulador" refere-se a um elemento regulador de ação cis, aka elemento cis, que confere um aspecto do padrão de expressão no geral, mas geralmente é insuficiente por si só para dirigir a transcrição de uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada. Ao contrário de promotores, elementos intensificadores não costumam incluir um sítio de início da transcrição (TSS) ou TATA box ou sequência de DNA equivalente. Um fragmento do promotor ou promotor pode, naturalmente, compreender um ou mais elementos intensificadores que afetam a transcrição de uma sequência de DNA operacionalmente ligada. Um elemento intensificador pode também estar fundido com um promotor para produzir um promotor quimérico elemento cis, que confere um aspecto da modulação global da expressão do gene. Um exemplo de um elemento intensificador derivado do gene promotor precursor da proteína b2 Medicago truncatula do complexo de coleta de luz é fornecido como SEQ ID NO: 16.

[0051] Muitos elementos promotores intensificadores sãoacreditados como ligando proteínas de ligação de DNA e/ou afetando a topologia do DNA, produzindo conformações locais que permitem seletivamente ou restringir o acesso da polimerase do RNA ao molde do DNA ou que facilitam a abertura seletiva da dupla hélice no sítio de iniciação da transcrição. Um elemento intensificador pode funcionar para ligar a fatores de transcrição que regulam a transcrição. Alguns elementos intensificadores se ligam a mais do que um fator de transcrição, e fatores de transcrição podem interagir com diferentes afinidades com mais de um domínio intensificador. Elementos intensificadores podem ser identificados por um número de técnicas, incluindo análise de deleção, por exemplo, excluindo um ou mais nucleotídeos a partir da extremidade 5' ou interna a um promotor; de ligação ao DNA de análise de proteína utilizando footprinting de DNase I, interferência da metilação, ensaio de alteração de mobilidade eletroforética, footprinting genômico in vivo por reação em cadeia da polimerase mediada por ligação (PCR), e outros ensaios convencionais; ou por análise da sequência de DNA usando conhecida semelhança de motivos de elemento cis ou elementos intensificadores como uma sequência alvo ou motivo alvo com métodos de comparação de sequências de DNA convencionais, tais como BLAST. A estrutura fina de um domínio do intensificador pode ser ainda estudada através de mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou por outros métodos convencionais conhecidos na técnica. Elementos intensificadores podem ser obtidos por síntese química ou por isolamento a partir de elementos de regulação que incluem tais elementos, e podem ser sintetizados com os nucleotídeos que flanqueiam adicionais que contêm sítios para enzimas de restrição úteis para facilitar a manipulação subsequente. Assim, o desenho, construção e uso de elementos intensificadores de acordo com os métodos aqui descritos para modular a expressão de moléculas de DNA passíveis de transcrição operacionalmente ligadas são abrangidos pela invenção.

[0052] Tal como aqui utilizado, o termo "quimérico" refere-se a umaúnica molécula de DNA produzida por fusão de uma primeira molécula de DNA com uma segunda molécula de DNA, onde nem a primeira molécula de DNA nem a segunda será normalmente encontrada naquela configuração, por exemplo, fundida à outra. A molécula de DNA quimérico é, portanto, uma nova molécula de DNA que não é normalmente encontrada na natureza. Tal como aqui utilizado, o termo "promotor quimérico" refere-se a um promotor produzido através de tal manipulação de moléculas de DNA. Um promotor quimérico pode combinar dois ou mais fragmentos de DNA; por exemplo, a fusão de um promotor de um elemento intensificador. Assim, o desenho, construção e uso de promotores quiméricos de acordo com os métodos aqui descritos para modular a expressão de moléculas de DNA passíveis de transcrição operacionalmente ligadas são abrangidas pela presente invenção.

[0053] Elementos reguladores quiméricos podem ser concebidospara compreender vários elementos constitutivos que podem ser operacionalmente ligados através de vários métodos conhecidos na técnica, tais como digestão com enzima de restrição e de ligação, a ligação de clonagem independente, montagem modular de produtos de PCR durante a amplificação, ou a síntese química direta do elemento de regulação, bem como outros métodos conhecidos na técnica. Os vários elementos reguladores quiméricos resultantes podem ser constituídos dos mesmos, ou variantes dos mesmos, elementos constituintes, mas diferem nas sequências de sequências de DNA ou de DNA que compreendem a sequência de DNA que liga ou sequências que permitem que as partes constituintes sejam operativamente ligadas. Na invenção, uma sequência de DNA apresentada como SEQ ID NOs: 115 pode fornecer uma sequência de referência de elemento de regulação, em que os elementos constitutivos que compreendem a sequência de referência podem ser unidos por meio de métodos conhecidos na técnica e podem compreender substituições, deleções, e/ou inserções de um ou mais nucleotídeos ou mutações que ocorrem naturalmente na transformação de células de bactérias e de plantas.

[0054] Tal como aqui utilizado, o termo "variante" refere-se a umasegunda molécula de DNA, tal como um elemento regulador, que está em composição semelhante, mas não idêntico, uma primeira molécula de DNA, e em que a segunda molécula de DNA ainda mantém a funcionalidade geral, por exemplo, o mesmo ou semelhante padrão de expressão, por exemplo, através de mais ou menos equivalente a atividade transcricional, da primeira molécula de DNA. Uma variante pode ser uma versão mais curta ou truncada da primeira molécula de DNA e/ou uma versão alterada da sequência da primeira molécula de DNA, tal como um com diferentes sítios de enzimas de restrição e/ou deleções internas, substituições e/ou inserções. Uma "variante" também pode incluir um elemento de regulação que tem uma sequência nucleotídica que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos de uma sequência de referência, em que o elemento regulador derivado tem mais ou menos ou equivalente atividade transcricional ou de tradução da correspondente molécula reguladora pai. "Variantes" de elementos reguladores também englobarão variantes decorrentes de mutações que ocorrem naturalmente em transformação de bactérias e plantas. Na presente invenção, uma sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID NOs: 1-15 podem ser utilizadas para criar variantes que estão em uma composição semelhante, mas não idêntico, a sequência de DNA do elemento regulador original, enquanto ainda mantendo a funcionalidade geral, por exemplo, o mesmo ou semelhante padrão de expressão, do elemento regulador original. A produção de tais variantes da invenção está bem dentro do conhecimento comum da técnica à luz da descrição e são englobados dentro do escopo da invenção.

[0055] Referência neste pedido a uma "molécula de DNA isolada",ou um termo ou frase equivalente, destina-se a significar que a molécula de DNA é uma que esteja presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro do seu ambiente natural. Por exemplo, elementos de ácidos nucleicos, tais como uma sequência de codificação, sequência de íntron, sequência principal não traduzida, sequência do promotor, sequência de terminação da transcrição, e semelhantes, que são encontradas naturalmente no DNA do genoma de um organismo não são considerados como "isolado "desde que o elemento esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. No entanto, cada um destes elementos, e subpartes destes elementos, seria "isolado" no escopo da presente divulgação, desde que o elemento não esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do genoma em que se encontra naturalmente. Para os fins da presente divulgação, qualquer sequência de nucleotídeos transgênicos, por exemplo., a sequência nucleotídica do DNA inserida no genoma das células de uma planta ou bactéria, ou presente em um vetor extracromossômico seria considerada ser uma sequência nucleotídica isolada se estiver presente no interior do plasmídeo ou estrutura semelhante utilizada para transformar as células, dentro do genoma da planta ou bactéria, ou presente em quantidades detectáveis em tecidos, descendência, as amostras biológicas ou produtos de base derivados da planta ou bactéria.

[0056] A eficácia das modificações, duplicações ou deleções aquidescritas nos aspectos de expressão desejados de um transgene particular pode ser testada empiricamente em ensaios de plantas estáveis e transientes, tais como os descritos nos exemplos de trabalho aqui descritos, de modo a validar os resultados, que podem variar dependendo das alterações feitas e o objetivo da mudança na molécula de DNA de partida.Construções

[0057] Tal como aqui utilizado, o termo "construção" significaqualquer molécula de DNA recombinante, tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, fago, ou DNA linear ou circular ou molécula de RNA, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de DNA, onde pelo menos uma molécula de DNA tem sido associada a uma outra molécula de DNA de uma forma funcionalmente operativa, por exemplo, operativamente ligado. Tal como aqui utilizado, o termo "vetor" entende- se qualquer construção que pode ser utilizada para efeitos de transformação, por exemplo, a introdução de DNA ou RNA heterólogo para uma célula hospedeira. Uma construção inclui, tipicamente, ua ou mais cassetes de expressão. Tal como aqui utilizado, um "cassete de expressão" refere-se a uma molécula de DNA compreendendo pelo menos uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada a um ou mais elementos reguladores, tipicamente, pelo menos, um promotor e uma 3’ UTR.

[0058] Tal como aqui utilizado, o termo "operativamente ligado"refere-se a uma primeira molécula de DNA unida a uma segunda molécula de DNA, em que a primeira e segunda moléculas de DNA estão dispostas de tal modo que a primeira molécula de DNA afeta a função da segunda molécula de DNA. As duas moléculas de DNA podem ou não ser parte de uma única molécula de DNA contígua e podem ou não estar adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma molécula de DNA passível de transcrição se o promotor modular a transcrição da molécula de DNA passível de transcrição de interesse em uma célula. Um líder, por exemplo, está operativamente ligado à sequência de DNA quando é capaz de afetar a transcrição ou a tradução da sequência de DNA.

[0059] As construções da invenção podem ser fornecidas, em umamodalidade, como construções de borda de plasmídeo indutor de tumor duplo (Ti) que têm as regiões de borda direita (RB ou AGRtu.RB) fronteira esquerda (LB ou AGRtu.LB) do plasmídeo Ti isoladas a partir de Agrobacterium tumefaciens compreendendo um T-DNA que, juntamente com moléculas de transferência fornecida pelas células A. Agrobacterium, permite a integração do T-DNA no genoma de uma célula de planta (ver, por exemplo, Patente US 6603061). As construções podem também conter os segmentos de DNA de plasmídeo de esqueleto que fornecem a função de replicação e a seleção de antibióticos em células bacterianas, por exemplo, a Escherichia coli origem de replicação tal como ori322, uma ampla gama de hospedeiros origem de replicação tal como oriV ou oriRi, e uma região que codifica para um marcador selecionável, tal como Spec/Strp que codifica para a aminoglicosídeo adeniltransferase Tn7 (aadA) que confere resistência a espectinomicina ou estreptomicina, ou uma gentamicina (Gm, Gent) gene marcador selecionável. Para a transformação de plantas, a estirpe bacteriana hospedeira é muitas vezes A. tumefaciens ABI, C58, ou LBA4404; no entanto, outras estirpes conhecidas dos versados na técnica da transformação de plantas podem funcionar na presente invenção.

[0060] Os métodos são conhecidos na técnica para a montagem ea introdução de construções em uma célula de tal modo que a molécula de DNA passível de transcrição é transcrita em uma molécula de mRNA funcional que é traduzida e é expressa como uma proteína. Para a prática da invenção, as composições e métodos para a preparação e uso de construções e as células hospedeiras convencionais são bem conhecidas para um versado na técnica. Vetores típicos úteis para expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens e o controle de transferência de vetor pCaMVCN.

[0061] Vários elementos reguladores podem ser incluídos em umaconstrução, incluindo qualquer um dos aqui fornecidos. Tais elementos reguladores podem ser fornecidos em combinação com outros elementos reguladores. Tais combinações podem ser concebidas ou modificadas para produzir características desejáveis reguladoras. Em uma modalidade, as construções da invenção compreendem pelo menos um elemento regulador operacionalmente ligado a uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada a uma 3’ UTR.

[0062] Construções da invenção podem incluir qualquer promotorou líder aqui fornecido ou conhecido na técnica. Por exemplo, um promotor da presente invenção pode ser operacionalmente ligado a um líder 5' não traduzido heterólogo tal como um derivado de um gene da proteína de choque térmico. Alternativamente, um guia da presente invenção pode ser operativamente ligado a um promotor heterólogo, tal como o promotor da transcrição do Vírus do Mosaico da Couve-flor 35S.

[0063] Os cassetes de expressão também podem incluir umasequência de peptídeo de trânsito que codifica um peptídeo que é útil para direcionamento subcelular de uma proteína operacionalmente ligada, em especial para um cloroplasto, leucoplasto, ou outras organelas dos plastos de codificação; mitocôndria; peroxissoma; vacúolo; ou uma localização extracelular. Muitas proteínas cloroplasto- localizadas são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são direcionadas para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito do cloroplasto (CTP). Exemplos de tais proteínas de cloroplastos isolados incluem, mas não estão limitados a aqueles associados com a subunidade pequena (SSU) da ribulose-1,5, carboxilase-bisfosfato, ferredoxina, ferredoxina oxidorredutase, o complexo proteína de colheita I e proteína II, tioredoxina F, e enolpiruvil chiquimato fosfato sintase (EPSPS). Peptídeos de trânsito dos cloroplastos são descritos, por exemplo, na Patente US N.° 7.193.133. Tem sido demonstrado que as proteínas não cloroplastos podem ser direcionadas para o cloroplasto pela expressão de uma CTP heteróloga ligada operacionalmente ao transgene que codifica uma proteína não cloroplasto.Moléculas de DNA passíveis de transcrição

[0064] Tal como aqui utilizado, o termo "molécula de DNA passívelde transcrição" refere-se a qualquer molécula de DNA capaz de ser transcrita em uma molécula de RNA, incluindo, mas não limitados a aqueles que possuem sequências de codificação de proteínas e os que produzem moléculas de RNA que possuem sequências úteis para a supressão do gene. O tipo de molécula de DNA pode incluir, mas não está limitado a uma molécula de DNA a partir da mesma planta, uma molécula de DNA de outra planta, uma molécula de DNA de um organismo diferente, ou uma molécula de DNA sintética, tal como uma molécula de DNA contendo uma mensagem antissenso de um gene, ou uma molécula de DNA que codifica um artificial, sintético, ou uma outra versão modificada de um transgene. Exemplos de moléculas de DNA passíveis de transcrição para incorporação nas construções da invenção incluem, por exemplo, moléculas de DNA ou genes de uma outra espécie que não a na qual a molécula de DNA está incorporada ou genes que se originam a partir de, ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporados em células receptoras através de métodos de engenharia genética em vez de técnicas de reprodução clássicas de espécies.

[0065] Um "transgene" refere-se a um transcrito de molécula deDNA heterólogo para uma célula hospedeira, pelo menos no que diz respeito à sua localização no genoma da célula hospedeira e/ou uma molécula de DNA passível de transcrição incorporada artificialmente no genoma de uma célula hospedeira na corrente ou em qualquer geração anterior da célula.

[0066] Um elemento regulador, tal como um promotor da presenteinvenção, pode ser operacionalmente ligado a uma molécula de DNA passível de transcrição que é heteróloga em relação ao elemento regulador. Tal como aqui utilizado, o termo "heterólogo" refere-se à combinação de duas ou mais moléculas de DNA, quando uma tal combinação não é normalmente encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de espécies diferentes e/ou as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de genes diferentes, por exemplo, os genes diferentes da mesma espécie, ou os mesmos genes de espécies diferentes. Um elemento regulador é assim heterólogo no que diz respeito a uma molécula de DNA passível de transcrição operacionalmente ligada se uma tal combinação não for normalmente encontrada na natureza, por exemplo, a molécula de DNA passível de transcrição não ocorre naturalmente operativamente ligado ao elemento regulador.

[0067] A molécula de DNA passível de transcrição pode geralmenteser qualquer molécula de DNA para a qual é desejada a expressão de um transcrito. Tal expressão de um transcrito pode resultar na tradução da molécula de mRNA resultante, e, assim, a expressão de proteína. Alternativamente, por exemplo, uma molécula de DNA passível de transcrição pode ser concebida para, em última instância causar a diminuição da expressão de um gene ou proteína específica. Em uma modalidade, isto pode ser conseguido utilizando uma molécula de DNA passível de transcrição que está orientada na direção antissenso. Um versado na técnica está familiarizado com o uso de tal tecnologia antissenso. Qualquer gene pode ser regulado negativamente deste modo, e, em uma modalidade, uma molécula de DNA passível de transcrição pode ser concebida para a supressão de um gene específico, através da expressão de uma molécula de dsRNA, siRNA ou miRNA.

[0068] Assim, uma modalidade da invenção é uma molécula deDNA recombinante que compreende um elemento de regulação da presente invenção, tais como os fornecidos como SEQ ID NOs: 1-15, operacionalmente ligado a uma molécula de DNA heterólogo passível de transcrição, de modo a modular a transcrição da molécula de DNA passível de transcrição molécula a um nível desejado ou em um padrão desejado quando a construção é integrada no genoma de uma célula de planta transgênica. Em uma modalidade, a molécula de DNA passível de transcrição compreende uma região de codificação da proteína de um gene e noutra modalidade a molécula de DNA passível de transcrição antissenso compreende uma região de um gene.Genes de Interesse Agronômico

[0069] Uma molécula de DNA passível de transcrição pode ser umgene de interesse agronômico. Tal como aqui utilizado, o termo "gene de interesse agronômico" refere-se a uma molécula de DNA passível de transcrição que, quando expressa em um tecido de planta, célula ou tipo de células particular, confere uma característica desejável. O produto de um gene de interesse agronômico pode atuar dentro da planta de modo a causar um efeito sobre a morfologia, fisiologia, crescimento, desenvolvimento, rendimento, composição dos grãos, o perfil nutricional, doenças ou pragas de resistência e/ou tolerância ambiental ou química ou pode atuar como um agente pesticida na dieta de uma praga que se alimenta da planta. Em uma modalidade da invenção, um elemento de regulação da presente invenção é incorporado em uma construção de tal modo que o elemento regulador está ligado operativamente a uma molécula de DNA passível de transcrição que é um gene de interesse agronômico. Em uma planta transgênica contendo uma tal construção, a expressão do gene de interesse agronômico pode conferir uma característica agronômica benéfica. Uma característica agronômica benéfica pode incluir, por exemplo, mas não se limita a, tolerância a herbicidas, para controle de insetos, rendimento modificado, resistência a doenças, da resistência de agentes patogênicos, o crescimento e desenvolvimento de planta modificada, o teor de amido modificado, o teor de óleo modificado, teor de ácidos graxos modificados, conteúdo modificado de proteína, de amadurecimento do fruto modificado, alimentação animal e humana reforçada, produções de biopolímeros, resistência ao estresse ambiental, peptídeos farmacêuticos, melhores qualidades deprocessamento, sabor melhorado, utilitário de produção de sementes híbridas, a melhoria da produção de fibra e produção debiocombustíveis desejável.

[0070] Exemplos de genes de interesse agronômico conhecidos natécnica incluem aqueles para resistência a herbicidas (Patentes US N.° 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775;5.804.425; 5.633.435; e 5.463.175), aumento do rendimento (Patentes US N.° USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277;6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; e 5.716.837), controle de insetos (US Patent Nos 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293;6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523;6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241;6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695;6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658,5.880.275, 5.763.245 e 5.763.241), resistência a doenças fúngicas (US Patent Nos 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; e 6.506.962), a resistência ao vírus (Patentes US N.° 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; e 5.304.730), resistência a nematódeos (Patente US N.° 6.228.992), a resistência à doença bacteriana (a Patentes US N.° 5.516.671), crescimento e desenvolvimento da planta (Patentes US N.° 6.723.897 e 6.518.488), a produção de amido (Patentes US N.° 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), a produção de óleos modificados (Patentes US N.° s 6.444.876; 6.426.447; e6.380.462), a produção de óleo elevado (US Patent Nos 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008 e 6.476.295), teor de ácidos graxos modificados (US Patent Nos 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; e 6.459.018), altaprodução de proteína (patente US N.° 6.380.466), o amadurecimento dos frutos (Patente U.S. Nos 5.512.466), nutrição animal e humana melhorada (Patente U.S. Nos. 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59;5.985.605; e 6.171.640) biopolímeros (Patente U.S. Nos. USRE37.543; 6.228.623; e 5.958.745, e 6.946.588), resistência à estresse ambiental (Patente US N.° 6.072.103), os peptídeos secretáveis e peptídeos farmacêuticos (Patentes US N.° 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; e 6.080.560), características de processamento melhoradas (Patente US N.° 6.476.295), digestibilidade melhorada (Patente US N.° 6.531.648) de baixa rafinose (Patente US N.° 6.166.292), produção industrial de enzimas (Patente US n° 5.543.576), sabor melhorado (Patente US N.° 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente US N.° 5.229.114), aprodução de semente híbrida (Patente US N.° 5.689.041), produção de fibras (Patentes US N.° 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; e 5.869.720) e produção de biocombustíveis (Patente US N.° 5.998.700).

[0071] Alternativamente, um gene de interesse agronômico podeafetar as características de plantas mencionadas acima ou fenótipos através da codificação de uma molécula de RNA que faz a modulação da expressão do gene alvo de um gene endógeno, por exemplo, antissenso (ver, por exemplo, Patente US 5.107.065); RNA inibitória ("RNAi", incluindo a modulação da expressão gênica por miRNA-, siRNA-, siRNA- de ação trans e mecanismos mediados sRNA faseados, por exemplo, como descrito nos pedidos publicados US 2006/0200878 e US 2008/0066206, e no pedido de patente US 11/974.469); ou mecanismos mediados por co-supressão. O RNA poderia ser também uma molécula de RNA catalítica (por exemplo, uma ribozima ou uma riboswitch; ver, por exemplo, US 2006/0200878) concebida para clivar um produto de mRNA endógeno desejado. São conhecidos métodos na técnica de construir e introduzir construções em uma célula de tal modo que a molécula de DNA passível de transcrição é transcrita para uma molécula que é capaz de provocar a supressão do gene.Marcadores Selecionáveis

[0072] Marcadores transgenes selecionáveis também podem serusados com os elementos reguladores da invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "marcador transgene selecionável" refere-se a qualquer molécula de DNA passível de transcrição cuja expressão em uma planta transgênica, tecido ou célula, ou a falta da mesma, pode ser triada ou pontuada de alguma maneira. Genes de marcador selecionável, e as suas técnicas de seleção e de triagem associadas, para uso na prática da invenção são conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a moléculas de DNA passíveis de transcrição que codificam beta-glucuronidase (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), proteínas que conferem resistência a antibióticos, e proteínas que conferem tolerância a herbicida. Um exemplo de um marcador transgene selecionável é fornecido como SEQ ID NO: 17.Transformação de Célula

[0073] A invenção é também dirigida a um método de produção decélulas transformadas e plantas que compreendem um ou mais elementos reguladores operacionalmente ligados a uma molécula de DNA passível de transcrição.

[0074] O termo "transformação" refere-se à introdução de umamolécula de DNA em um hospedeiro receptor. Tal como aqui utilizado, o termo "hospedeiro" refere-se a bactérias, fungos ou plantas, incluindo todas as células, tecidos, órgãos ou progênie das bactérias, fungos ou plantas. Tecidos e células de particular interesse incluem os protoplastos de plantas, calos, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, rebentos, embriões e pólen.

[0075] Tal como aqui utilizado, o termo "transformado" refere-se auma célula, tecido, órgão ou organismo no qual uma molécula de DNA estranha, tal como uma construção, tenha sido introduzida. A molécula de DNA introduzida pode ser integrada no DNA genômico da célula receptora, tecido, órgão ou organismo de modo que a molécula de DNA introduzida é herdada pela progênie subsequente. Uma célula ou organismo "transgênico" ou "transformado" também pode incluir a progênie da célula ou organismo e progênie produzida de um programa de acasalamento empregando um tal organismo transgênico como um progenitor em um cruzamento e apresentando um fenótipo alterado resultante da presença de uma molécula de DNA estranha. A molécula de DNA introduzida pode também ser transientemente introduzida na célula receptora de modo que a molécula de DNA introduzida não é herdada pela progênie subsequente. O termo "transgênico" refere-se a uma bactéria, fungo, ou planta contendo uma ou mais moléculas de DNA heterólogas.

[0076] Existem muitos métodos bem conhecidos para aquelesversados na técnica para a introdução de moléculas de DNA em células de planta. O processo compreende geralmente as etapas de seleção de uma célula hospedeira adequada, transformando a célula hospedeira com um vetor, e a obtenção da célula hospedeira transformada. Métodos e materiais para a transformação de células vegetais através da introdução de uma construção de planta no genoma de uma planta na prática da presente invenção pode incluir qualquer um dos métodos bem conhecidos e demonstrados. Os métodos adequados incluem, mas não estão limitados a. infecção, bacteriana (por exemplo, Agrobacterium), vetores BAC binários, distribuição direta de DNA (por exemplo, por transformação mediada por PEG, absorção de DNA mediada por dessecação/inibição, eletroporação, agitação com fibras de carboneto de silício e aceleração de partículas revestidas com DNA), edição de gene (por exemplo, sistemas CRISPR-Cas), entre outros.

[0077] As células hospedeiras podem ser qualquer célula ouorganismo, tais como uma célula de planta, célula de alga, algas, célula de fungo, fungos, célula de bactéria, ou célula de inseto. Em modalidades específicas, as células hospedeiras e células transformadas podem incluir células de cultura de plantas.

[0078] Uma planta transgênica, subsequentemente, pode serregenerada a partir de uma célula de planta transgênica da invenção. Usando técnicas de acasalamento convencional ou autopolinização, semente pode ser produzida a partir desta planta transgênica. Tais sementes, e a planta descendente resultante cultivada a partir de sementes tal, irão conter a molécula de DNA recombinante da invenção, e, por conseguinte, vai ser transgênica.

[0079] As plantas transgênicas da presente invenção podem serautopolinizadas para fornecer sementes de plantas transgênicas homozigóticas da invenção (homozigóticos para a molécula de DNA recombinante) ou cruzadas com plantas não transgênicas ou diferentes plantas transgênicas para fornecer sementes de plantas transgênicas heterozigóticas da invenção (heterozigótico para a molécula de DNA recombinante). Ambas essas plantas transgênicas homozigóticas e heterozigóticas são aqui referidas como "plantas descendentes." Plantas da progênie são plantas transgênicas descendentes da planta transgênica original e contendo a molécula de DNA recombinante da invenção. As sementes produzidas utilizando uma planta transgênica da invenção podem ser colhidas e usadas para cultivar gerações de plantas transgênicas, por exemplo, plantas descendentes da invenção, que compreendem a construção da presente invenção e que expressam um gene de interesse agronômico. As descrições dos métodos de criação de animais que são normalmente utilizados para diferentes culturas podem ser encontradas em um dos diversos livros de referência, ver, por exemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep andHendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376, (1987).

[0080] As plantas transformadas podem ser analisadas quanto àpresença do gene ou genes de interesse e o nível de expressão e/ou perfil conferido pelos elementos reguladores da invenção. Os versados na técnica estão cientes dos numerosos métodos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Por exemplo, métodos para a análise de plantas incluem, mas não estão limitados à transferência de Southern ou Northern blots, abordagens baseadas em PCR, análises bioquímicas, métodos de triagem fenotípica, avaliações de campo e ensaios de imunodiagnóstico. A expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição pode ser medida utilizando TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA), reagentes e métodos como descrito pelo fabricante e os tempos de ciclo de PCR determinados utilizando a matriz Ensaios TaqMan ®. Alternativamente, o Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) Os reagentes e métodos como descrito pelo fabricante podem ser utilizados para avaliar a expressão do transgene.

[0081] A invenção também fornece para partes de uma planta dainvenção. Partes de plantas incluem, mas não estão limitadas a, folhas, caules, raízes, tubérculos, sementes, endosperma, óvulo e pólen. Partes de planta podem ser viáveis, não viáveis, regeneráveis, ou não regeneráveis. A invenção também inclui e fornece células de plantas transformadas compreendendo uma molécula de DNA da invenção. As células de planta transformadas ou transgênicas da presente invenção incluem células de plantas regeneráveis e/ou não regeneráveis.

[0082] A invenção também fornece um produto básico que éproduzido a partir de uma planta transgênica ou parte desta contendo a molécula de DNA recombinante da invenção. Produtos de base da invenção contêm uma quantidade detectável de DNA que compreende uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1-15. Tal como aqui utilizado, um "produto básico" refere- se a qualquer composição ou um produto que é composto de material derivado de uma planta transgênica, sementes, célula de planta, ou parte da planta que contém a molécula de DNA recombinante da invenção. Produtos de base incluem, mas não estão limitados a sementes processadas, cereais, partes de plantas e farelo. Um produto básico da invenção irá conter uma quantidade detectável de DNA que corresponde à molécula de DNA recombinante da invenção. A detecção de um ou mais deste DNA em uma amostra pode ser utilizada para a determinação do teor ou a fonte do produto básico. Qualquer método de detecção padrão para moléculas de DNA pode ser usado, incluindo métodos de detecção divulgados aqui.

[0083] A invenção pode ser mais facilmente compreendida atravésde referência aos exemplos seguintes, que são fornecidos a título de ilustração, e não se destinam a ser limitativos da invenção, a menos que especificado. Deve ser apreciado pelos versados na técnica, que as técnicas divulgadas nos exemplos seguintes representam técnicas que os inventores descobriram funcionar bem na prática da invenção. No entanto, indivíduos versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda assim obter um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espírito e escopo da invenção, portanto, toda a matéria estabelecida ou mostrada nos desenhos anexos deve ser interpretada como ilustrativa e não em sentido limitativo.EXEMPLOSExemplo 1Identificação e Clonagem de Elementos Reguladores

[0084] Elementos reguladores da transcrição e novos grupos deelementos reguladores de expressão (EXP) foram identificados e clonados a partir de DNA genômico de espécies de dicotiledóneas Cucumis melo (WSH-39-1070AN) e Medicago truncatula.

[0085] Elementos reguladores da transcrição foram selecionados com base em dados de microarranjos privados e públicos derivadas de experiências de perfil transcricional realizados em soja (Glycine max) e Arabidopsis, bem como pesquisas com base em homologia com sequências de dicotiledôneas conhecidas como consultas contra Cucumis melo privadas e de propriedade pública e sequências Medicago truncatula.

[0086] Utilizando as sequências identificadas, uma análisebioinformática foi realizada para identificar elementos reguladores no DNA amplificado. Por exemplo, a análise bioinformática foi realizada para identificar o sítio de início da transcrição (TSS) e qualquer bidirecionalidade, íntrons, ou sequência que codifica a montante presente na sequência. Usando os resultados desta análise, os elementos reguladores foram definidos dentro das sequências de DNA e iniciadores concebidos para amplificar os elementos reguladores. A molécula de DNA correspondente a cada elemento regulador foi amplificada usando as condições de reação em cadeia de polimerase padrão com iniciadores contendo sítios de enzimas de restrição únicas e o DNA genômico isolado a partir de Cucumis melo e Medicago truncatula. Os fragmentos de DNA resultantes foram ligados em vetores de expressão de plantas de base usando o padrão de digestão com enzimas de restrição dos sítios de restrição compatíveis e métodos de ligação do DNA.

[0087] Análise do elemento TSS regulador e junções spliceíntron/éxon podem ser realizados utilizando tecido de planta transformada. Resumidamente, as plantas são transformadas com os vetores de expressão de plantas que compreendem os fragmentos de DNA clonados operacionalmente ligados a uma molécula de DNA heterólogo passível de transcrição. Em seguida, o sistema 5' RACE para Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA, Versão 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia 92008) é usado para confirmar o elemento regulador TSS e junções splice de íntron/éxon através da análise da sequência de DNA dos transcritos de mRNA produzidos.

[0088] As sequências de DNA que codificam os grupos deelementos de expressão de transcrição regulatória Cucumis e Medicago ou sequências EXP que são constituídas por um elemento promotor, operacionalmente ligado a um elemento líder são apresentadas na Tabela 1, juntamente com os seus promotores e líderes correspondentes.Tabela 1. Grupos de elementos de expressão de transcrição regulatória, promotores, líderes e íntrons isolados de Cucumis melo e Medicago truncatula

Exemplo 2Análise de Elementos Regulatórios Dirigindo Expressão GUS emPlantas de Soja Transformadas de Forma Estável

[0089] As plantas de soja foram transformadas com os vetores,especificamente plantar vetores de expressão, que contém um elemento regulador de teste dirigindo a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas quanto à expressão de proteína GUS, para avaliar o efeito dos elementos reguladores selecionados em expressão.

[0090] As plantas de soja foram transformadas com as construçõesde expressão de plantas GUS listadas na Tabela 2. Os elementos reguladores foram clonados em um vetor de expressão de planta base, utilizando métodos padrão conhecidos na técnica. Os vetores de expressão de plantas resultantes continham uma região de borda desde Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borda direita), um primeiro cassete de seleção do transgene utilizado para seleção de células de plantas transformadas que confere resistência quer ao herbicida glifosato ou ao antibiótico, espectinomicina; um segundo cassete de transgene para avaliar a atividade do elemento regulador, que compreendia uma sequência EXP operativamente ligada 5' a uma sequência de codificação para beta-glucuronidase (GUS, GOI- Ec.uidA+St.LS1:1:1, SEQ ID NO: 17) contendo um íntron processável derivado do gene ST-LS1 específico de tecido da batata de luz-indutível (Acesso no Genbank: X04753), operacionalmente ligado 5' para uma 3' a região de terminação a partir do gene Gossypium barbadense E6 (T- Gb.E6-3b: 3b: 1, SEQ ID NO: 18); e uma região de borda esquerda Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borda esquerda).Tabela 2. Elementos reguladores e construções de plasmídeos de expressão GUS correspondentes

[0091] Células de plantas de soja foram transformadas com as construções de vetor de transformação binário descritas acima pela transformação mediada de Agrobacterium, utilizando métodos conhecidos na técnica. As células de plantas transformadas resultantes foram induzidas a formar plantas de soja integrais.

[0092] Análise histoquímica de GUS foi utilizada para análise deexpressão qualitativa e quantitativa de plantas transformadas. Secções de tecido inteiras foram incubadas com GUS solução de coloração com X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucurônido) (1 mg/ml) durante um período adequado de tempo, lavadas, e inspecionadas visualmente para a coloração azul. A atividade de GUS foi qualitativamente determinada por inspeção visual direta ou inspeção sob um microscópio utilizando órgãos das plantas selecionadas e tecidos.

[0093] Para a análise quantitativa da expressão de GUS, a proteínatotal foi extraída a partir de tecidos selecionados de plantas de soja transformadas. Um micrograma de proteína total foi usado com o substrato fluorogênico 4-metileumbeliferil-β-D-Glucuronido (MUG), em um volume total de reação de 50 microlitros. O produto da reação, 4- metiliumbelliferona (4-MU), é no máximo de fluorescência a um pH elevado, onde o grupo hidroxila é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio para simultaneamente o ensaio e ajusta o pH para a quantificação do produto fluorescente. A fluorescência foi medida com excitação a 365 nm, emissão a 445 nm, utilizando um Fluoromax-3 com Micromax Reader, com largura de abertura fixado em 2 nm de excitação e 3nm de emissão. Valores são fornecidos em unidades de nmol GUS/hora/mg de proteína total.

[0094] Os seguintes tecidos foram amostrados para a expressão deGUS em R0 geração; folha dreno estágio Vn5, folha fonte, e raiz; pecíolo estágio R1, folha fonte, flor e cotilédone; cápsula estágio R3 e semente imatura; e embrião estágio de cápsula amarela e cotilédone. As Tabelas 3 e 4 abaixo mostram a expressão de GUS quantitativa significativa para cada um dos tecidos amostrados acionados pelos elementos reguladores apresentados na Tabela 2.Tabela 3. A média de expressão de GUS quantitativo em plantas de soja transformadas estavelmente acionadas por elementos reguladores derivados de Cucumis melo

Tabela 4. A média de expressão de GUS quantitativa em plantas de soja transformadas estavelmente acionadas por elementos reguladores derivados de Medicago truncatula

[0095] Como pode ser visto nas Tabelas 3 e 4, cada um doselementos de regulação tem um padrão único de expressão nos tecidos amostrados. Ambos EXP-CUCme.Fe2:1 (SEQ ID NO: 1) e EXP- CUCme.CipLhcb: 1 (SEQ ID NO: 4) expressam altamente na cápsula R3 e mostram o nível mais baixo de expressão na semente imatura R3, raiz Vn5, cotilédone R5, e o embrião em estágio de cápsula amarela e cotilédone. Expressão de GUS dirigido por EXP-CUCme.Fe2:1 também foi elevada no dreno Vn5 e folha fonte e estágio pecíolo R1, folha fonte, e flor. O elemento regulador EXP-CUCme.Bbz: 1 (SEQ ID NO: 7) demonstrou maior expressão no estágio dreno Vn5 e folha fonte e cápsula estágio R3. Expressão de GUS conduzida por EXP- Mt.Lhcb2:1:1 (SEQ ID NO: 10) foi mais elevada no estágio folha fonte Vn5 e pecíolo R1. EXP-Mt.PSII-T: 1:1 (SEQ ID NO: 13) demonstrou maior expressão no estágio folha fonte R1.

[0096] Cada elemento regulador fornece um padrão único deexpressão que pode ser usado para conduzir a expressão de forma ótima de diferentes transgenes, dependendo da preferência do tecido desejado, para expressão.Exemplo 3Elementos Intensificadores derivados de Elementos Reguladores

[0097] Os intensificadores são derivados a partir dos elementospromotores apresentados como SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, e 14. O elemento intensificador pode ser composto por um ou mais cis elementos de regulação que, quando ligado operativamente 5 'ou 3' para um elemento promotor, ou operativamente ligado a 5 'ou 3'elementos intensificadores adicionais que estão operacionalmente ligados a um promotor, podem aumentar ou modular os níveis de expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição, ou fornecem expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição em um tipo de célula ou órgão específico da planta ou em um momento determinado do desenvolvimento ou do ritmo circadiano. Os intensificadores são feitos através da remoção do TATA box ou elementos funcionalmente similares e qualquer sequência a jusante a partir dos promotores que permitem a transcrição ser iniciada a partir de uma sequência de promotor, por exemplo, as sequências apresentadas como SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, e 14 ou fragmentos dos mesmos.

[0098] O TATA box em promotores de plantas não é tão altamenteconservado como em alguns outros organismos eucarióticos. Por conseguinte, a fim de definir um fragmento como um intensificador, um primeiro tem de identificar o sítio de início da transcrição (TSS) do gene, em que a UTR 5' é primeiro transcrito. Por exemplo, o elemento regulador da transcrição, EXP-Mt.Lhcb2:1:1 (SEQ ID NO: 10) é constituído pelo elemento promotor, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11), operativamente ligado ao elemento UTR 5' ou líder, L-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 12). Dentro do elemento promotor de 1837 bp, P- Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11), o elemento semelhante a núcleo putativo TATA é encontrado dentro de nucleotídeos 1798 a 1803. Um fragmento intensificador derivado da P-Mt.Lhcb2-1:2:1 pode compreender nucleotídeos 1 a 1797 de SEQ ID NO: 11, resultando na sequência apresentada como SEQ ID NO: 16 (E-Mt.Lhcb2). Intensificadores derivados a partir do promotor, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11) pode ainda compreender fragmentos menores de E- Mt.Lhcb2 (SEQ ID NO: 16). A eficácia dos elementos intensificadores derivados a partir do promotor, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11) é empiricamente determinada por construção de um elemento regulador da transcrição quimérico compreendendo um intensificador derivado a partir do promotor, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11), que está operativamente ligado a um promotor e líder e usado para dirigir a expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição de GUS tal como no ensaio de planta estável ou transiente.

[0099] Adicionalmente, o refinamento do elemento intensificadorpode ser necessário e é validado empiricamente. Além disso, a posição do elemento intensificador em relação a outros elementos dentro de um elemento regulador da transcrição quimérico também é determinada empiricamente, uma vez que a ordem de cada elemento dentro do elemento regulador da transcrição quimérico pode conferir efeitos diferentes, dependendo das posições relativas de cada elemento. Alguns elementos promotores terão múltiplos quadros TATA ou elementos semelhantes a TATA box e, potencialmente, vários sítios de início da transcrição. Nestas circunstâncias, poderá ser necessário primeiro identificar onde o primeiro TSS é localizado e então começar a designar intensificadores usando o primeiro TSS para impedir que a iniciação potencial de transcrição ocorra dentro de um elemento intensificador putativo.

[00100] Elementos intensificadores, derivados de elementos promotores apresentados como SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, e 14 são clonados utilizando métodos conhecidos na técnica para ser ligado operativamente 5 'ou 3' para um elemento promotor, ou 5' operativamente ligado ou 3' para elementos intensificadores adicionais que estão operacionalmente ligados a um promotor. Alternativamente, elementos intensificadores podem ser clonados, utilizando métodos conhecidos na técnica, para fornecer um elemento intensificador maior do que é composta de duas ou mais cópias do intensificador e clonados utilizando métodos conhecidos na técnica para ser ligado operativamente 5' ou 3' de um elemento promotor, ou operativamente ligado a 5' ou 3' elementos intensificadores adicionais que estão operacionalmente ligados a um promotor de produção de um elemento regulador da transcrição quimérico. Elementos intensificadores também podem ser clonados utilizando métodos conhecidos na técnica para ser operacionalmente ligado a um 5' elemento promotor derivado de um organismo de gênero diferente, ou operativamente ligado a 5 'ou 3'elementos intensificadores adicionais derivados a partir de outros organismos do gênero que estão ligados de forma operacional a um promotor derivado a partir de qualquer organismo diferente ou mesmo gênero, resultando em um elemento regulador da transcrição quimérico. Um vetor de transformação de planta de expressão de GUS pode ser construído utilizando métodos conhecidos na técnica semelhante para as construções descritas no Exemplo 2 acima, em que os vetores de expressão de plantas resultantes contêm uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borda direita), um primeiro cassete de seleção do transgene utilizado para seleção de células vegetais transformadas que confere resistência ao antibiótico, espectinomicina; e um segundo cassete de transgene para testar o elemento intensificador composto pelo elemento intensificador ligado operativamente 5 'ou 3' de um elemento promotor operacionalmente ligado ou 5'- ou 3'- de elementos intensificadores adicionais, que são por sua vez, operacionalmente ligados a um promotor que é operacionalmente ligado a um elemento 5' líder, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação para beta-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1: 1: 1, SEQ ID NO: 17) contendo um íntron processável derivado do gene ST-LS1 de batata específico do tecido indutível por luz (Acesso Genbank: X04753), operacionalmente ligado a uma região de terminação 3' do gene E6 Gossypium barbadense (T-Gb.E6-3b: 3b: 1, SEQ ID NO: 18), e uma região de borda esquerda de A. tumefaciens (B-AGRtu.borda esquerda). Os plasmídeos resultantes são utilizados para transformar plantas de soja ou outras plantas do gênero pelos métodos descritos acima. Alternativamente, as células de protoplastos derivados de soja ou de outras plantas do género são transformadas utilizando métodos conhecidos na técnica para realizar ensaios transientes.

[00101] Expressão GUS controlada por um elemento de regulação compreendendo um ou mais intensificadores é avaliada em ensaios de plantas estáveis ou transientes para determinar os efeitos do elemento intensificador sobre a expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição. Modificações a um ou mais elementos intensificadores ou a duplicação de um ou mais elementos intensificadores podem ser realizadas com base na experimentação empírica e a regulação da expressão do gene resultante, que é observada utilizando cada composição de elemento regulador. A alteração das posições relativas de um ou mais intensificadores nos elementos reguladores ou reguladores ou quiméricos resultantes podem afetar a atividade de transcrição ou especificidade do elemento regulador ou regulador quimérico e é determinado empiricamente para identificar os melhores intensificadores para o perfil de expressão do transgene desejado na planta de milho ou outra planta gênero.

[00102] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para as pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser modificada no arranjo e nos detalhes, sem se desviar de tais princípios. Foram reivindicadas todas as modificações que estão dentro do espírito e do escopo das reivindicações. Todas as publicações e documentos de patentes publicadas aqui são aqui incorporados por referência na sua totalidade como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente ou individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (5)

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que consiste em um polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO:4 ou 5; em que a referida molécula de DNA é operacionalmente ligada a uma molécula de DNA heteróloga passível de transcrição.

2. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA heterólogo passível de transcrição compreende um gene de interesse agronômico.

3. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere tolerância a herbicidas em plantas.

4. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere resistência a pragas em plantas.

5. Método de expressão de uma molécula de DNA passível de transcrição, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) transformar uma célula vegetal com a molécula de DNA como definida na reivindicação 1 para produzir uma célula vegetal transgênica, em que a referida molécula de DNA é integrada no genoma da referida célula vegetal;b) regenerar uma planta transgênica a partir da referida célula vegetal transgênica; ec) cultivar a referida planta transgênica compreendendo a molécula de DNA da reivindicação 1, em que o DNA passível de transcrição é expresso.