UA126792C2 - Регуляторний елемент рослин і його застосування - Google Patents

Регуляторний елемент рослин і його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA126792C2
UA126792C2 UAA201810103A UAA201810103A UA126792C2 UA 126792 C2 UA126792 C2 UA 126792C2 UA A201810103 A UAA201810103 A UA A201810103A UA A201810103 A UAA201810103 A UA A201810103A UA 126792 C2 UA126792 C2 UA 126792C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
dna molecule
sequence
gene
specified
plant
Prior art date
Application number
UAA201810103A
Other languages
English (en)
Inventor
Джаішрі М. Чіттоор
Джаишри М. Читтоор
Станіслав Фласінскі
Станислав Фласински
Мохаммед Оуфаттоле
Майкл В. Петерсен
Original Assignee
Монсанто Текнолоджі Елелсі
МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Монсанто Текнолоджі Елелсі, МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЭлЭлСи filed Critical Монсанто Текнолоджі Елелсі
Publication of UA126792C2 publication Critical patent/UA126792C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

функціонально пов'язані з гетерологічними транскрибованими молекулами ДНК, а також стосується способів їх застосування.
ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНУ ЗАЯВКУ
ІО0О0О1) Дана заявка претендує на пріоритет на підставі попередньої заявки на патент США Мо 62/306790, поданої 11 березня 2016 року, зміст якої повністю включений в даний опис за допомогою посилання.
ВКЛЮЧЕННЯ ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
І0002| Перелік послідовностей, який міститься у файлі з назвою "МОМ5417/МО- зедицепсе Іісііпд", розмір якого становить 29,4 кБ (виміряно в Місго5ой УмМіпдом/єФ) й який був створений 6 березня 2017 року, поданий разом з даною заявкою в електронному вигляді та включений в даний опис за допомогою посилання.
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ
0003) Даний винахід відноситься до області молекулярної біології рослин і генної інженерії рослин. Більше конкретно, даний винахід відноситься до молекул ДНК, що підходять для модуляції експресії генів у рослинах.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
І0004| Регуляторні елементи являють собою генетичні елементи, які регулюють активність генів шляхом модуляції транскрипції функціонально зв'язаної транскрибованої молекули ДНК.
Такі елементи можуть включати промотори, лідери, інтрони і 3'- нетрансльовані області, та їх можна застосовувати в області молекулярної біології рослин і генної інженерії рослин.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
ІЇ0005| Даний винахід забезпечує нові генні регуляторні елементи для застосування в рослинах. Даний винахід також забезпечує конструкції ДНК, що містять регуляторні елементи.
Даний винахід також забезпечує трансгенні рослинні клітини, рослини та насіння, що містять регуляторні елементи. В одному варіанті реалізації регуляторні елементи функціонально пов'язані з транскрибованою молекулою ДНК. У деяких варіантах реалізації транскрибована молекула ДНК може бути гетерологічною стосовно регуляторної послідовності. Таким чином, послідовність регуляторних елементів відповідно до даного винаходу, у конкретних варіантах реалізації можна визначити як функціонально пов'язану з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. Даний винахід також забезпечує способи одержання та застосування регуляторних елементів, конструкцій ДНК, що містять регуляторні елементи, і трансгенних
Зо рослинних клітин, рослин і насіння, що містять регуляторні елементи, функціонально пов'язані з транскрибованою молекулою ДНК. 0006) Таким чином, в одному аспекті даний винахід забезпечує рекомбінантну молекулу
ДНК, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи, що складається з: (а) послідовності з щонайменше приблизно 85 95 ідентичністю послідовності з будь-якої з ЗЕО ІЮ Мо: 1-15; (Б) послідовності, що містить будь-яку з послідовностей ЗЕО ІЮ Мо: 1-15; і (с) фрагмента будь-якої з послідовностей ЗЕО І Ме: 1-15, причому зазначений фрагмент має регулюючу генну активність; при цьому зазначена послідовність функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. Під "гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК" мається на увазі що транскрибована молекула ДНК є гетерологічною стосовно полінуклеотидної послідовності, з якою вона функціонально пов'язана. У конкретних варіантах реалізації рекомбінантна молекула ДНК містить послідовність ДНК, що має щонайменше приблизно 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності до послідовності ДНК будь-якої з послідовностей 5ЕО ІЮ Мо: 1- 15. У деяких варіантах реалізації послідовність ДНК містить регуляторний елемент. У деяких варіантах реалізації регуляторний елемент містить промотор. В інших варіантах реалізації гетерологічна транскрибована молекула ДНК містить ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії, як, наприклад, ген, що має здатність обумовлювати стійкість рослин до гербіцидів, або ген, що має здатність обумовлювати стійкість рослин до шкідників рослин. В інших варіантах реалізації даного винаходу запропонована конструкція, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, запропоновану в даному документі.
І0007| В іншому аспекті даний винахід забезпечує трансгенні рослинні клітини, які містять рекомбінантну молекулу ДНК, що містить послідовність ДНК, вибрану з групи, що складається з: (а) послідовності з щонайменше приблизно 85 95 ідентичністю послідовності з будь-якої з ФЕО
ІЮ Ме: 1-15; (5) послідовності, що містить будь-яку з послідовностей ЗЕО ІЮ Мо: 1-15; ії (с) фрагмента будь-якої з послідовностей 5ЕО ІЮ Мо: 1-15, причому зазначений фрагмент має регулюючу генну активність; при цьому зазначена послідовність ДНК функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. У деяких варіантах реалізації трансгенна рослинна клітина являє собою клітину однодольної рослини. В інших варіантах реалізації 60 трансгенна рослинна клітина являє собою клітину однодольної рослини або клітину дводольної рослини. 0008) В іншому аспекті даний винахід додатково забезпечує трансгенну рослину або її частину, які містять рекомбінантну молекулу ДНК, що містить послідовність ДНК, вибрану з групи, що складається з: (а) послідовності з щонайменше приблизно 8595 ідентичністю послідовності з будь-якої з ЗЕО ІЮО Ме: 1-15; (Б) послідовності, що містить будь-яку з послідовностей ЗЕО ІЮ Мо: 1-15; і (с) фрагмента будь-якої з послідовностей 5ЕО ІЮО Мо: 1-15, причому зазначений фрагмент має регулюючу генну активність; при цьому зазначена послідовність функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. У конкретних варіантах реалізації трансгенна рослина являє собою рослину-нащадок будь-якого покоління, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК. Трансгенна насінина, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, з якої утворюється така трансгенна рослина при вирощуванні, також запропонована в даному описі.
І0009| В ще іншому аспекті даного винаходу запропонований спосіб одержання продукту споживання, який включає одержання трансгенної рослини або її частини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК згідно з даним винаходом, й одержання з нього зазначеного продукту споживання. В одному варіанті реалізації зазначений продукт споживання являє собою оброблене насіння, зерна, частини рослин, олії та шрот (птеаї). 0010) В ще одному аспекті даного винаходу запропонований спосіб одержання трансгенної рослини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК згідно з даним винаходом, який включає трансформацію рослинної клітини молекулою рекомбінантної ДНК згідно з даним винаходом для одержання трансформованої рослинної клітини та регенерацію трансгенної рослини із зазначеної трансформованої рослинної клітини.
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
00111 5ЕО ІО Мо: 1 являє собою послідовність ДНК групи регуляторних елементів експресії (ЕХР), що містить промотор, отриманий з гена білка фередоксину 2 (Еег) дині (Сиситів тео), функціонально пов'язаний з 5'-кінцем свого нативного лідера.
І0012| 5ЕО ІЮ Мо: 2 являє собою промоторну послідовність, отриману з передбачуваного гена білка фередоксину 2 (Бе2) Сиситів тео.
Ї0013| 5ЕО ІЮО Мо: З являє собою лідерну послідовність, отриману з передбачуваного гена
Зо білка фередоксину 2 (ЕБе2) Сиситів тео. 0014) 5ЕО ІО Мо: 4 являє собою послідовність ДНК ЕХР, що містить промотор, отриманий з гена білка 13 Сиситіб тео, зв'язуючого хлорофіл а-б, функціонально пов'язаний з 5'-кінцем свого нативного лідера.
ІЇ0015| 5ЕО ІО Мо: 5 являє собою промоторну послідовність, отриману з гена білка 13
Сиситів теїо, зв'язуючого хлорофіл а-р. 0016) 5ЕО ІО Мо: 6 являє собою лідерну послідовність, отриману з гена білка 13 Сиситів тео зв'язуючого хлорофіл а-р. 00171) ЗЕО ІО Мо: 7 являє собою послідовність ДНК ЕХР, що містить промотор, отриманий з гена білка, білку 24, що містить домен "цинкові пальці" типу В-рох, Сиситів те, функціонально пов'язаний з 5-кінцем свого нативного лідера. 0018) 5ЕО ІО Мо: 8 являє собою промоторну послідовність, отриману з гена білка, білку 24, що містить домен "цинкові пальці" типу В-Бох, Сиситів тео.
І0019| 5ЕО ІО Мо: 9 являє собою лідерну послідовність, отриману з гена білка, білку 24, що містить домен "цинкові пальці" типу В-бох, Сиситів тео. (00201) 5ЕО ІО Мо: 10 являє собою послідовність ДНК ЕХР, що містить промотор, отриманий з гена білка 02 світлопоглинаючого комплексу люцерни усіченої (Меаїісадо ігипсайціа), функціонально пов'язаний з 5'"-кінцем свого нативного лідера.
І0021| 5ЕО ІО Мо: 11 являє собою промоторну послідовність, отриману з гена білка р2 світлопоглинаючого комплексу Медісадо Ігипсаїша. (0022 5ЕБЕО ІЮО Мо: 12 являє собою лідерну послідовність, отриману з гена білка р2 світлопоглинаючого комплексу Меадісадо Ігипсаїша. 00231) 5ЕО ІО Мо: 13 являє собою послідовність ДНК ЕХР, що містить промотор, отриманий з гена попередника хлоропластів фотосистеми І! Медісадо ігипсаїша, функціонально пов'язаний з 5-кінцем свого нативного лідера. (0024) 5ЕО ІЮО Ме: 14 являє собою промоторну послідовність, отриману з гена попередника хлоропластів фотосистеми ІІ Медісадо ігипсаїша.
І0025| 5ЕО ІЮО Мо: 15 являє собою лідерну послідовність, отриману з гена попередника хлоропластів фотосистеми ІІ Медісадо ігипсашіа.
І0026| 5ЕО ІЮО Мо: 16 являє собою енхансерну послідовність, отриману з промотору гена бо білка р2 світглопоглинаючого комплексу Медісадо ігипсаїша.
І0027| 5ЕО ІО Мо: 17 являє собою кодуючу послідовність для ВД-глюкуронідази (ЗИ), що містить процесований інтрон. (0028) 5ЕО ІО Мо: 18 являє собою послідовність 3'-НТО, отриману з гена Еб бавовняника барбадоського (Со55урішт Баградепзе).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
І0029| Даний винахід забезпечує молекули ДНК, які мають активність в рослинах, що регулює гени. Нуклеотидні послідовності таких молекул ДНК представлені у вигляді «ЕЕ ІЮ Мо: 1-15. Ці молекули ДНК мають здатність впливати на експресію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК у тканинах рослин і, отже, регулювати експресію гена функціонально пов'язаного трансгена в трансгенних рослинах. Даний винахід також забезпечує способи модифікації одержання та застосування таких молекул. Даний винахід також забезпечує композиції, які містять трансгенні рослинні клітини, рослини, частини рослин і насіння, що містять рекомбінантні молекули ДНК згідно з даним винаходом, а також способи їх одержання та застосування.
ІЇ0О30| Наступні визначення та способи запропоновані для кращого визначення даного винаходу та для забезпечення керівництва для фахівців у даній області техніки при здійсненні даного винаходу. Якщо не зазначено інше, терміни слід розуміти відповідно до звичайного їх застосування фахівцями у відповідній області техніки.
Молекули ДНК
Ї0031| У даному описі термін "ДНК" або "молекула ДНК" відноситься до дволанцюгової молекули ДНК геномного або синтетичного походження, тобто до полімеру дезоксирибонуклеотидних основ, або молекули ДНК, що читається від 5'-кінця (розташованому вище) до 3-кінця (розташованому нижче). У даному описі термін "послідовність ДНК" відноситься до нуклеотидної послідовності молекули ДНК. Застосована у даному документі номенклатура відповідає номенклатурі Розділу 37 5 1.822 Зводу федеральних нормативних актів США та викладеним у таблицях стандартам ВОЇВ 51.25 (1998), Додаток 2, Таблиці 1 і 3. 0032) У даному описі термін "рекомбінантна молекула ДНК" являє собою молекулу ДНК, що містить комбінацію молекул ДНК, які у природі не зустрічаються спільно без втручання людини.
Наприклад, рекомбінантна молекула ДНК може являти собою молекулу ДНК, яка складається з щонайменше двох молекул ДНК, гетерологічних відносно одна одної, молекулу ДНК, яка містить послідовність ДНК, відмінну від послідовностей ДНК, що існують у природі, або молекулу ДНК, яку ввели в ДНК клітини-хазяїна шляхом генетичної трансформації або редагування генома.
Ї0О33| У даному описі термін "ідентичність послідовності" відноситься до ступеня ідентичності двох оптимально вирівняних полінуклеотидних послідовностей або двох оптимально вирівняних поліпептидних послідовностей. Оптимальне вирівнювання послідовностей створюється шляхом вирівнювання вручну двох послідовностей, наприклад, референсної послідовності й іншої послідовності, для максимізації числа нуклеотидних збігів при вирівнюванні послідовності з відповідними внутрішніми нуклеотидними вставками, делеціями або гепами (пропусками). У даному описі термін "референсна послідовність" відноситься до послідовності ДНК, запропонованої у вигляді послідовності ДНК, представленої у вигляді БЕО ІЮО Мо: 1-15. 0034 У даному описі термін "процент ідентичності послідовності" або "процент ідентичності" або «95 ідентичності" являє собою частку ідентичності, помножену на 100. "Частка ідентичності" для послідовності, оптимально вирівняної з референсною послідовністю, являє собою число нуклеотидних збігів при оптимальному вирівнюванні, поділене на загальне число нуклеотидів у референсній послідовності, наприклад, загальна кількість нуклеотидів цілої повнорозмірної референсної послідовності. Таким чином, в одному варіанті реалізації даного винаходу запропонована молекула ДНК, що містить послідовність, яка при оптимальному вирівнюванні з референсною послідовністю, представленою у даному документі у вигляді 5Е0
ІО Мо: 1-15, має щонайменше приблизно 85-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 86- процентну ідентичність, щонайменше приблизно 87-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 88-процентну ідентичність щонайменше приблизно 89-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 90-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 91-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 92-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 93- процентну ідентичність щонайменше приблизно 94-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 95-процентну ідентичність щонайменше приблизно 96б-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 97-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 98-процентну ідентичність, щонайменше приблизно 99-процентну ідентичність або щонайменше приблизно 100-процентну ідентичність до референсної послідовності. бо Регуляторні елементи
І0035) Регуляторні елементи, такі як промотори, лідери (також відомі як 5-НТО), енхансери, інтрони й області термінації транскрипції (або 3'-НТО), відіграють невід'ємну роль у загальній експресії генів у живих клітинах. У даному описі термін "регуляторний елемент" відноситься до молекули ДНК, яка має активність, що регулює гени. У даному описі термін "активність, що регулює гени" відноситься до здатності впливати на експресію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК, наприклад, шляхом впливу на транскрипцію та/або трансляцію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. Таким чином, регуляторні елементи, такі як промотори, лідери, енхансери, інтрони і 3-НТО, які функціонують у рослинах, є підходящими для модифікації фенотипів рослин за допомогою генної інженерії.
І0036| У даному описі термін послідовність "групи регуляторних елементів експресії" або "ЕХР" може відноситись до групи функціонально пов'язаних регуляторних елементів, таких як енхансери, промотори, лідери й інтрони. Таким чином, група регуляторних елементів експресії може включати, наприклад, промотор, функціонально пов'язаний з 5'-кінцем лідерної послідовності. ЕХР, що підходить для здійснення даного винаходу, включає 5ЕО ІЮ Мо: 1, 4, 7, 10 ї 13.
І0037| Регуляторні елементи можна охарактеризувати за їх профілем експресії гена, наприклад, за позитивними і/або негативними ефектами, такими як конститутивна експресія або транзієнтна, просторова, що відноситься до розвитку, тканинна, екологічна, фізіологічна, патологічна, що відноситься до клітинного циклу та/або чутлива до хімічного впливу експресія, і будь-якої їх комбінації, а також за кількісними або якісними показниками. У даному описі термін "профіль експресії генів" являє собою будь-який профіль транскрипції функціонально пов'язаної молекули ДНК у транскрибовану молекулу РНК. Можна здійснити трансляцію транскрибованої молекули РНК з одержанням молекули білка або можна одержати антисенсову або іншу регуляторну молекулу РНК, таку як дволанцюгова РНК (длРНК), транспортна РНК (тРНК), рибосомальна РНК (рРНК), мікроРНК (міРНК) й їм подібні. 0038) У даному описі термін "експресія білка" являє собою будь-який профіль трансляції транскрибованої молекули РНК у молекулу білка. Експресію білка можна охарактеризувати за її транзієнтними, просторовими, що відносяться до розвитку або морфологічними якостями, а також за кількісними або якісними показниками.
Зо ІЇ0039| Промотор можна застосовувати в якості регуляторного елемента для модуляції експресії функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. У даному описі термін "промотор" в цілому відноситься до молекули ДНК, яка бере участь в розпізнаванні та зв'язуванні РНК-полімерази ІІ й інших білків, таких як транс-діючі фактори транскрипції, для ініціації транскрипції. Промотор можна спочатку виділити з 5'-чсетрансльованої області (5'-НТО) геномної копії гена. В якості альтернативи, промотори можуть являти собою отримані синтетично або піддані маніпуляціям молекули ДНК. Промотори також можуть бути химерними.
Химерні промотори одержують в результаті злиття двох або більше гетерологічних молекул
ДНК. Промотори, що підходять для здійснення даного винаходу, включають промоторні елементи, що містяться у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ Мо: 2, 5, 8, 11 ї 14, або їх фрагменти або варіанти. У конкретних варіантах реалізації даного винаходу заявлені молекули
ДНК і будь-які їх варіанти або їх похідні, описані у даному документі, також визначають як ті, що мають промоторну активність, тобто мають здатність діяти в якості промотору в клітині-хазяїні, як, наприклад, у трансгенній рослині. В інших конкретних варіантах реалізації фрагмент може бути визначений як такий, що проявляє промоторну активність, яку мала вихідна промоторна молекула, з якої він був отриманий, або фрагмент може містити "мінімальний промотор", який забезпечує основний рівень транскрипції та складається з ТАТА-боксу, іншого відомого мотиву сайту зв'язування фактора транскрипції або еквівалентної послідовності ДНК для розпізнавання та зв'язування комплексу РНК-полімерази ІІ для ініціації транскрипції.
І0040)| В одному варіанті реалізації запропоновані фрагменти промоторної послідовності, описаної у даному документі. Промоторні фрагменти можуть мати промоторну активність, як це описано вище, і можуть бути підходящими окремо або в комбінації з іншими промоторами та промоторними фрагментами, як, наприклад, при створенні химерних промоторів, або в комбінації з іншими ЕХР й ЕХР-фрагментами. У конкретних варіантах реалізації запропоновані фрагменти промотору, що містять щонайменше приблизно 50, щонайменше приблизно 75, щонайменше приблизно 95, щонайменше приблизно 100, щонайменше приблизно 125, щонайменше приблизно 150, щонайменше приблизно 175, щонайменше приблизно 200, щонайменше приблизно 225, щонайменше приблизно 250, щонайменше приблизно 275, щонайменше приблизно 300, щонайменше приблизно 500, щонайменше приблизно 600, щонайменше приблизно 700, щонайменше приблизно 750, щонайменше приблизно 800, 60 щонайменше приблизно 900 або щонайменше приблизно 1000 суміжних нуклеотидів або більше нуклеотидів молекули ДНК, що мають промоторну активність, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації даний винахід забезпечує фрагменти будь-якої однієї з послідовностей ЗЕО ІЮ Мо: 1-15, що мають активність повнорозмірної послідовності. Способи одержання таких фрагментів з вихідної промоторної молекули добре відомі в даній області техніки. 0041) Композиції, отримані з будь-яких промоторних елементів, що містяться у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮО Мо: 2, 5, 8, 11 і 14, як, наприклад, внутрішні або 5'-делеції, можна одержати із застосуванням способів, відомих в даній області техніки, для поліпшення або зміни експресії, у тому числі шляхом видалення елементів, які мають або позитивний, або негативний вплив на експресію; дуплікації (подвоєння числа) елементів, які мають позитивний або негативний вплив на експресію; і/або дуплікації або видалення елементів, які мають тканино- або клітинноспецифічний вплив на експресію. Можна застосовувати композиції, отримані з будь-яких промоторних елементів, що містяться у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ Мо: 2, 5, 8, 11 ї 14, що складаються з 3'-делеції в яких видалений елемент ТАТА-боксу або його еквівалентна послідовність та розташована нижче послідовність, наприклад, для створення енхансерних елементів. Додаткові делеції можна здійснити для видалення будь-яких елементів, які мають позитивний або негативний; тканиноспецифічний; клітинноспецифічний або специфічний за часом (такий як, циркадіанний ритм, але не обмежуючись ним, ) вплив на експресію. Будь-який з промоторних елементів, що міститься у будь-якій з послідовностей 5ЕО
ІО Мо: 2, 5, 8, 11 ї 14, і фрагменти або енхансери, отримані з них, можна застосовувати для одержання композицій химерних транскрипційних регуляторних елементів.
І0042| Відповідно до даного винаходу промотор або промоторний фрагмент можна проаналізувати на визначення присутності відомих промоторних елементів, тобто на визначення характеристик послідовності ДНК, таких як ТАТА-бокс, й інших відомих мотивів сайту зв'язування фактора транскрипції. Ідентифікацію таких відомих промоторних елементів може застосовувати фахівець в даній області техніки для розробки варіантів промотору, що мають аналогічний з вихідним промотором профіль експресії.
Ї0043| У даному описі термін "лідер" відноситься до молекули ДНК, виділеної з нетрансльованої 5'-області (5-НТО) гена, і в цілому його визначають, як нуклеотидний сегмент
Зо між сайтом початку транскрипції (Т55) та сайтом початку кодуючої послідовності білка. В якості альтернативи, лідери можуть являти собою отримані синтетично або піддані маніпуляціям елементи ДНК. Лідер можна застосовувати в якості 5'-регуляторного елемента для модуляції експресії функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. Лідерні молекули можна застосовувати з гетерологічним промотором або зі своїм нативним (власним) промотором.
Лідери, що підходять для здійснення даного винаходу, включають послідовності ЗЕО ІО Мо: 3, 6, 9, 12 і 15 або будь-який лідерний елемент, що міститься у будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ Мо: 1, 4, 7, 10 ї 13, або їх фрагменти або варіанти. У конкретних варіантах реалізації такі послідовності ДНК можна визначити як такі, що мають здатність діяти в якості лідера в клітині- хазяїні, включаючи, наприклад, трансгенну рослинну клітину. В одному варіанті реалізації такі послідовності розшифровані як такі, що мають лідерну активність.
І0044| Лідерні послідовності (також називані 5'-НТО), представлені у вигляді ЖЕО ІЮ Мо: 3, 6, 9, 12 і 15 або будь-якого лідерного елемента, що міститься у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ
Мо: 1, 4, 7, 10 ї 13, можуть складатися з регуляторних елементів або можуть приймати вторинні структури, які можуть впливати на транскрипцію або трансляцію функціонально пов'язаної транкрибованої молекули ДНК. Лідерні послідовності, представлені у вигляді ЗЕО ІО Мо: 3, 6, 9, 12 ї 15 або будь-якого лідерного елемента, що міститься у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ
Мо: 1, 4, 7, 10 ї 13, можна застосовувати відповідно до даного винаходу для одержання химерних регуляторних елементів, які впливають на транскрипцію або трансляцію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. 00451 У даному описі термін "інтрон" відноситься до молекули ДНК, яку можна виділити або ідентифікувати з гена, і в цілому його можна визначити, як область, сплайсовану під час процесингу матричної РНК (мРНК) перед трансляцією. В якості альтернативи, інтрон може являти собою отриманий синтетичний або підданий маніпуляціям елемент ДНК. Інтрон може містити енхансерні елементи, які впливають на транскрипцію функціонально пов'язаних генів.
Інтрон можна застосовувати в якості регуляторного елемента для модуляції експресії функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. Конструкція може містити інтрон, і зазначений інтрон може бути або може не бути гетерологічним відносно транскрибованої молекули ДНК. Приклади інтронів у даній області техніки включають інтрон актину рису й інтрон
НЗР7О кукурудзи. бо 0046) У рослинах включення деяких інтронів у генні конструкції призводить до збільшення накопичення мРНК і білка у порівнянні з конструкціями без інтрона. Цей ефект був названий "опосередковане інтроном посилення" (ІМЕ) експресії гена. Інтрони, про яких відомо, що вони стимулюють експресію в рослинах, ідентифіковані в генах кукурудзи (наприклад, їшБА!т, лан,
ЗП1 і Обрії), у генах рису (наприклад, ірі) і в генах дводольних рослин, таких як гени, отримані з петунії (наприклад, гос5), картоплі (наприклад, 51-І51) й Агарідорзіз (айіапа (наприклад, ибаЗз і рай). Було показано, що делеції або мутації в сайтах сплайсингу інтрона знижують експресію гена, що свідчить про те, що для ІМЕ може бути необхідний сплайсинг. Однак, у дводольних рослинах було продемонстровано ІМЕ при мутаціях у сайтах сплайсингу гена ра з А. ІПаїіапа.
Було показано, що множинне застосування того самого інтрона на одній рослині має недоліки. У таких випадках необхідна наявність набору основних контрольних елементів для створення відповідних елементів рекомбінантних ДНК.
І0047| У даному описі терміни "З'-ємолекула термінації транскрипції", "З'-нетрансльована область" або "3-НТО" (3-ОТ) відносяться до молекули ДНК, яка застосовується під час транскрипції для одержання нетрансльованої області З'-ділянки мРНК. 3'-нетрансльована область молекули мРНК може бути утворена специфічним розщепленням і жБЧ3- поліаденілюванням, також відомим як поліА-хвіст. 3-НТО може бути функціонально пов'язана з і розташовуватися нижче транскрибованої молекули ДНК, і може містити сигнал поліаденілювання й інші регуляторні сигнали, що мають здатність впливати на транскрипцію, процесинг мРНК або експресію гена. Вважається, що полідА-хвости задіяні в стабільності мРНК й ініціації трансляції. Прикладами 3'-молекул термінації транскрипції в даній області техніки є 3'- область нопалінсинтази; 3'єобласть п5р17 пшениці, невелика субодиниця 3'-області гороху, 3'- область Еб бавовни і 3'-НТО коїксину.
І0048| 3-НТО зазвичай знаходять корисне застосування для рекомбінантної експресії специфічних молекул ДНК. Слабка 3-НТО має потенціал для створення наскрізного прочитання, що може впливати на експресію молекули ДНК, розташованої в сусідніх касетах експресії. Відповідний контроль за термінацією транскрипції може перешкоджати наскрізному прочитанню у послідовностях ДНК (наприклад, в інших касетах експресії), розташованих нижче, і може також сприяти ефективному рециклінгу РНК-полімерази для поліпшення експресії генів.
Ефективна термінація транскрипції (вивільнення РНК-полімерази ІІ із ДНК) є передумовою для
Зо повторної ініціації транскрипції та, таким чином, безпосередньо впливає на загальний рівень транскрипта. Після термінації транскрипції зріла мРНК вивільняється із сайту синтезу та переноситься в цитоплазму. Еукаріотичні мРНК накопичуються у вигляді полі(А)-форм іп мімо, що утрудняє виявлення сайтів термінації транскрипції звичайними способами. Проте, прогнозування функціональних й ефективних 3-НТО за допомогою біоінформаційних способів утруднене внаслідок відсутності консервативних послідовностей ДНК, які б дозволили легко прогнозувати ефективну 3-НТО.
ІЇ0049| З практичної точки зору зазвичай корисно, щоб 3-НТО, застосовувана в касеті експресії, мала наступні характеристики. 3-НТО повинна мати можливість ефективно та результативно термінувати транскрипцію трансгена та запобігати наскрізному прочитанню транскрипта у будь-якій сусідній послідовності ДНК, яка може містити іншу касету експресії, як у випадку декількох касет експресії, розташованих в одній транспортній ДНК (Т-ДНК), або в сусідній хромосомній ДНК, в яку вбудована Т-ДНК. 3-НТО не повинна викликати зниження транскрипційної активності, обумовленої промотором, лідером, енхансером й інтронами, які застосовуються для опосередкування експресії молекули ДНК. У біотехнології рослин 3-НТО часто застосовують для праймування реакцій ампліфікації зворотньо транскрибованої РНК, виділеної з трансформованої рослини, і застосовують для: (1) оцінки транскрипційної активності або експресії касети експресії після інтегрування в хромосому рослини; (2) оцінки числа копій вставок у ДНК рослини; й (3) оцінки зиготності отриманого насіння після селекції. 3'-НТО також застосовують в реакціях ампліфікації ДНК, виділеної з трансформованої рослини, для характеристики збереженості вбудованої касети. 0050) У даному описі термін "енхансер" або "енхансерний елемент" відноситься до цис- діючого регуляторного елемента, також відомого як цис-елемент, який обумовлює аспект загального профілю експресії однак який сам по собі зазвичай не є достатнім для опосередкування транскрипції функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. На відміну від промоторів, енхансерні елементи зазвичай не містять сайт початку транскрипції (755) або ТАТА-бокс або еквівалентну послідовність ДНК. Промотор або промоторний фрагмент у природі може містити щонайменше один енхансерний елемент, який впливає на транскрипцію функціонально пов'язаної послідовності ДНК. Енхансерний елемент також може бути злитий з промотором для одержання цис-елемента химерного промотору, який обумовлює 60 аспект загальної модуляції експресії гена. Приклад енхансерного елемента, отриманого з промотору гена попередника білка 602 світлопоглинаючого комплексу Меаїісадо Іігипсашіа, представлений у 5ЕО ІО Мо: 16.
І0О51| Вважається, що багато промоторних енхансерних елементів зв'язують ДНК-сполучні білки та/або впливають на топологію ДНК, роблячи локальні конформації, які вибірково дозволяють здійснити доступ або обмежують доступ РНК-полімерази до ДНК-матриці, або які полегшують селективне розкриття подвійної спіралі на сайті ініціації транскрипції. Енхансерний елемент може діяти, зв'язуючи фактори транскрипції, які регулюють транскрипцію. Деякі енхансерні елементи зв'язують більше одного фактора транскрипції, і фактори транскрипції можуть взаємодіяти з різними афінностями з більше ніж одним енхансерним доменом.
Енхансерні елементи можна ідентифікувати з використанням ряду методів, включаючи аналіз на визначення делецій, тобто на визначення делецій (видалення) щонайменше одного нуклеотиду з 5-кінця або з середини в напрямку промотору; аналіз на визначення ДНК- зв'язуючих білків із застосуванням футпринтингу з ДНКазою І!, інтерференцію ділянок метилування, аналіз зрушення електрофоретичної рухомості, геномний футпринтинг іп мімо шляхом опосередкованої лігуванням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) й інші традиційні аналізи; або шляхом аналізу подібності послідовності ДНК з використанням відомих мотивів цис-елементів або енхансерних елементів як послідовності-мішені або мотиву-мішені за допомогою звичайних способів порівняння послідовностей ДНК, таких як ВІА5Т. Тонку структуру енхансерного домена можна також вивчати шляхом мутагенезу (або заміщення) щонайменше одного нуклеотиду або за допомогою інших традиційних способів у даній області техніки. Енхансерні елементи можна одержати шляхом хімічного синтезу або шляхом виділення з регуляторних елементів, які містять такі елементи, та їх можна синтезувати за допомогою додаткових фланкуючих нуклеотидів, які містять підходящі сайти для ферментів рестрикції, що полегшує маніпуляції з підпослідовністю. Таким чином, розробка, конструювання та застосування енхансерних елементів згідно з описаними у даному документі способами для модуляції експресії функціонально пов'язаних транскрибованих молекул ДНК охоплюються даним винаходом. 0052) У даному описі термін "химерний" відноситься до окремої молекули ДНК, отриманої шляхом злиття першої молекули ДНК з другою молекулою ДНК, при цьому ні зазначена перша,
Зо ні зазначена друга молекула ДНК зазвичай не зустрічаються в такій конфігурації, тобто вони злиті одна з одною. Таким чином, молекула химерної ДНК являє собою нову молекулу ДНК, яка зазвичай не зустрічається у природі. У даному описі термін "химерний промотор" відноситься до промотору, отриманого в результаті такої маніпуляції з молекулами ДНК. Химерний промотор може поєднувати два або більше фрагментів ДНК; наприклад, злиття промотору з енхансерним елементом. Таким чином, розробка, конструювання та застосування химерних промоторів згідно з описаними у даному документі способами для модуляції експресії функціонально пов'язаних транскрибованих молекул ДНК охоплюються даним винаходом. 0053) Химерні регулюючі елементи можуть бути виконані таким чином, щоб вони містили різні складові елементи, які можуть бути функціонально пов'язані різними способами, відомими в даній області техніки, такими як розщеплення ферментами рестрикції та лігування, клонування, незалежне від лігування, модульне складання продуктів ПЛР під час ампліфікації або прямий хімічний синтез регуляторного елемента, а також іншими способами, відомими в даній області техніки. Різні химерні регуляторні елементи, що утворюються в результаті, можуть складатися з одного і того самого або варіантів одних і тих самих складових елементів, але відрізняються у послідовності ДНК або у послідовностях ДНК, які містять сполучну ДНК- послідовність або послідовності, які сприяють тому, щоб складові частини були функціонально пов'язані. У даному винаході послідовність ДНК, представлена у вигляді 5ЕО ІЮО Мо: 1-15, може забезпечувати референсну послідовність регуляторного елемента, при цьому складові елементи, які містять зазначену референсну послідовність, можуть бути з'єднані способами, відомими в даній області техніки, і можуть містити заміни, делеції та/або вставки щонайменше одного нуклеотиду або мутації, які у природі відбуваються при трансформації бактеріальних і рослинних клітин. 0054) У даному описі термін "варіант" відноситься до другої молекули ДНК, як, наприклад, регуляторного елемента, яка за своїм складом подібна, але не ідентична першій молекулі ДНК, і при цьому зазначена друга молекула ДНК все ще зберігає загальну функціональність, тобто той самий або близький профіль експресії, наприклад, в результаті більшої або меншої еквівалентної транскрипційної активності, першій молекулі ДНК. Варіант може являти собою вкорочену або усічену версію зазначеної першої молекули ДНК і/або змінений варіант послідовності зазначеної першої молекули ДНК, як, наприклад, з різними сайтами ферментів бо рестрикції тал"або внутрішніми делеціями, замінами і/або вставками. Термін "варіант" також включає регуляторний елемент, що містить нуклеотидну послідовність, що містить заміни, делецію та/або вставку щонайменше одного нуклеотиду референсної послідовності, при цьому похідна регуляторного елемента має більшу або меншу або еквівалентну транскрипційну або трансляційну активність, ніж відповідна батьківська регуляторна молекула. "Варіанти" регуляторного елемента також охоплюють варіанти, пов'язані з мутаціями, які у природі відбуваються при трансформації бактеріальних і рослинних клітин. У даному винаході полінуклеотидну послідовність, представлену у вигляді зЕО ІЮ Мо: 1-15, можна застосовувати для створення варіантів, які подібні за складом, але не ідентичні послідовності ДНК вихідного регуляторного елемента, зберігаючи при цьому загальну функціональність, тобто один і той самий або аналогічний профіль експресії, вихідного регуляторного елемента. Одержання таких варіантів згідно з даним винаходом добре відоме фахівцям в даній області техніки у світлі опису даного винаходу та входить в його обсяг.
Ї0О55| У даній заявці "виділеної молекули ДНК" або еквівалентний термін або фразу означає, що молекула ДНК являє собою таку молекулу ДНК, яка присутня окремо або в комбінації з іншими композиціями, але не у своєму природньому середовищі. Наприклад, елементи нуклеїнової кислоти, такі як кодуюча послідовність, інтронна послідовність, нетрансльована лідерна послідовність, промоторна послідовність, послідовність термінації транскрипції та їм подібні, які зустрічаються у природі в ДНК генома організму, не вважаються "виділеними", якщо зазначений елемент присутній в геномі організму та знаходиться в ділянці генома, в якій він зустрічається у природі. Однак кожний з таких елементів і частина таких елементів будуть "виділеними" в обсязі даного опису, якщо зазначений елемент не присутній у геномі організму й у ділянці генома, в якій він зустрічається у природі. Для цілей даного опису будь-яка трансгенна нуклеотидна послідовність, тобто нуклеотидна послідовність ДНК, вбудована в геном рослинних або бактеріальних клітин, або присутня у позахромосомному векторі, буде вважатися виділеною нуклеотидною послідовністю незалежно від того, чи присутня вона у плазміді або подібній структурі, яку застосовують для трансформації клітин, у геномі зазначеної рослини або бактерії, або чи присутня вона у виявлених кількостях в тканинах, потомстві, біологічних зразках або товарних продуктах, отриманих із зазначеної рослини або бактерії.
Зо І0056| Ефективність модифікацій, дуплікацій або делецій, описаних у даному документі, відносно бажаних аспектів експресії конкретного трансгена, можна досліджувати емпірично в аналізах на визначення стабільної та транзієнтної експресії у рослин, як, наприклад, тих, які описані у робочих прикладах даного документа, для підтвердження результатів, які можуть варіюватися залежно від зроблених змін і мети зміни у вихідній молекулі ДНК.
Конструкції 0057) У даному описі термін "конструкція" означає будь-яку рекомбінантну молекулу ДНК, таку як плазміда, косміда, вірус, фаг, або молекулу лінійної або кільцевої ДНК або РНК, отриману з будь-якого джерела, що має здатність до інтеграції в геном або автономної реплікації, включаючи молекулу ДНК, в якій щонайменше одна молекула ДНК пов'язана з іншою молекулою ДНК функціонально оперативним чином, тобто пов'язана функціонально. У даному описі термін "вектор" означає будь-яку конструкцію, яку можна застосовувати для цілей трансформації, тобто введення гетерологічної ДНК або РНК у клітину-хазяїна. Конструкція зазвичай містить щонайменше одну касету експресії. У даному описі "касета експресії" відноситься до молекули ДНК, що містить щонайменше транскрибовану молекулу ДНК, функціонально пов'язану з щонайменше одним регуляторним елементом, зазвичай з щонайменше промотором і 3-НТО. 0058) У даному описі термін "функціонально пов'язаний" відноситься до першої молекули
ДНК, приєднаної до другої молекули ДНК, при цьому зазначена перша та друга молекули ДНК розташовані так, що зазначена перша молекула ДНК впливає на функцію зазначеної другої молекули ДНК. Дві молекули ДНК можуть бути або можуть не бути частиною єдиної безперервної молекули ДНК, і можуть бути або можуть не бути суміжними. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК у випадку, якщо зазначений промотор модулює транскрипцію транскрибованої молекули ДНК у клітині, що представляє інтерес. Лідер, наприклад, функціонально пов'язаний з послідовністю ДНК у випадку, коли він має здатність впливати на транскрипцію або трансляцію послідовності ДНК. 0059) Конструкції згідно з даним винаходом можуть бути представлені в одному варіанті реалізації у вигляді конструкцій з індукуючими пухлину (Ті) подвійними плазмідними межами, які мають області правої межі (ЕВ або АСЕИи.КВ) і лівої межі (В або АС. В) Ті-плазміди, виділеної з Адгобасієегішт їшптетасієп5, що містить Т-ДНК, які поряд з молекулами переносу, бо забезпечуваними клітинами А. ішптегїасіеп5, забезпечують інтеграцію Т-ДНК у геном рослинної клітини (див., наприклад, патент США Мо 6603061). Конструкції можуть також містити плазмідні каркасні сегменти ДНК, які забезпечують функцію реплікації та селекцію за антибіотиком у бактеріальних клітинах, наприклад, точка початку реплікації в Е5сПегіспіа соїї, така як огі322, точка початку реплікації широкого кола хазяїнів, така як огім або огікі, і кодуюча область для селектованого (відібраного) маркера, як, наприклад, Зрес/бігр, яка кодує /Тп7- аміноглікозидаденілтрансферазу (аадА), яка обумовлює стійкість до спектиноміцину або стрептоміцину, або для селектованого маркерного гена гентаміцину (Ст, сСепі). Для трансформації рослин бактеріальний штам-хазяїн часто являє собою А. ішптеїасіеп5 АВІ, С58 або І ВА4404; однак інші штами, відомі фахівцям в області трансформації рослин, можна використовувати у даному винаході. 0060) У даній області техніки відомі способи для складання та введення конструкцій у клітину так, що молекула транскрибованої ДНК транскрибується у функціональну молекулу
МРНАК, яка транслюється й експресується у вигляді білка. Для здійснення даного винаходу традиційні композиції та способи одержання та застосування конструкцій та клітин-хазяїнів добре відомі фахівцям в даній області техніки. Типові вектори, які є підходящими для експресії нуклеїнових кислот у вищих рослинах, добре відомі в даній області техніки і включають вектори, отримані з Ті-плазміди Адгобасієегічт їштегасієп5, і вектор контролю переносу рсаммсм. 0061) У конструкцію можуть бути включені різні регуляторні елементи, включаючи будь-які з представлених у даному документі елементів. Будь-які такі регуляторні елементи можна забезпечити в комбінації з іншими регуляторними елементами. Такі комбінації можна розробити або модифікувати для одержання потрібних регуляторних характеристик. В одному варіанті реалізації конструкції згідно з даним винаходом містять щонайменше один регуляторний елемент, функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК, функціонально пов'язаною з 3-НТО. 00621 Конструкції згідно з даним винаходом можуть містити будь-який промотор або лідер, запропонований у даному документі або відомий в даній області техніки. Наприклад, промотор згідно з даним винаходом може бути функціонально пов'язаний з гетерологічним нетрансльованим 5'-лідером, як, наприклад, таким, який отриманий з гена білка теплового шоку.
В якості альтернативи, лідер згідно з даним винаходом може бути функціонально пов'язаний з
Зо гетерологічним промотором, таким як промотор транскрипта 355 вірусу мозаїчного вірусу кольорової капусти.
І0063) Касети експресії також можуть містити кодуючу транзитний пептид послідовність, яка кодує пептид, що підходить для націлювання всередину клітини функціонально пов'язаного білка, зокрема, націлювання на хлоропласт, лейкопласт або іншу пластидну органелу; мітохондрії; пероксисому; вакуоль або позаклітинний простір. Багато локалізованих в хлоропластах білків експресуються з ядерних генів як попередники і націлюються на хлоропласт за допомогою транзитного пептиду хлоропластів (СТР). Приклади таких виділених білків хлоропластів включають, але не обмежуються ними, ті білки, які асоційовані з малою субодиницею (55) рибулозо-1,5-бісфосфаткарбоксилази, фередоксином, фередоксиноксидоредуктазою, білком І і білком ІЇ світлопоглинаючого комплексу, тіоредоксином
Е й енолпірувілшикіматфосфатсинтазою (ЕРБР5). Транзитні пептиди хлоропластів описані, наприклад, у патенті США Мо 7193133. Було продемонстровано, що білки, які не відносяться до хлоропластів, можуть націлюватися на хлоропласт шляхом експресії гетерологічного СТР, функціонально пов'язаного з трансгеном, кодуючим білки, які не відносяться до хлоропластів.
Транскрибовані молекули ДНК
І0064| У даному описі термін ""ранскрибована молекула ДНК" відноситься до будь-якої молекули ДНК, яка може транскрибуватися в молекулу РНК, включаючи, але не обмежуючись ними, ті молекули, які містять кодуючі білок послідовності, і ті молекули, які утворюють молекули РНК, що містять послідовності, які підходять для супресії (пригнічення) гена. Тип молекули ДНК може включати, але не обмежуватися ними, молекулу ДНК, отриману з тієї ж рослини, молекулу ДНК, отриману з іншої рослини, молекулу ДНК, отриману з іншого організму, або синтетичну молекулу ДНК, таку як молекулу ДНК, що містить антисенсову область гена, або молекулу ДНК, що кодує штучну, синтетичну або іншим способом модифіковану версію трансгена. Приклади транскрибованих молекул ДНК для введення в конструкції згідно з даним винаходом включають, наприклад, молекули ДНК або гени, отримані з виду, відмінного від виду, в який включені зазначена молекула ДНК, або гени, які присутні або походять від одного і того самого виду, але які введені в клітини-реципієнти за допомогою способів генної інженерії, а не класичними методами селекції. 0065) "Трансген" відноситься до транскрибованої молекули ДНК, гетерологічної для клітини- 60 хазяїна, щонайменше, відносно її положення в геномі зазначеної клітини-хазяїна, і/або молекули транскрибованої ДНК, штучно введеної в геном клітини-хазяїна у поточному або будь- якому попередньому поколінні клітини.
І0066| Регуляторний елемент, такий як промотор згідно з даним винаходом, може бути функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК, яка є гетерологічною стосовно регуляторного елемента. У даному описі термін "гетерологічний" відноситься до комбінації двох або більше молекул ДНК у випадку, коли така комбінація зазвичай не зустрічається у природі.
Наприклад, дві молекули ДНК можна одержати з різних видів і/або дві молекули ДНК можна одержати з різних генів, наприклад, різних генів одного і того самого виду або одних і тих самих генів різних видів. Таким чином, регуляторний елемент є гетерологічним стосовно функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК у випадку, якщо така комбінація зазвичай не зустрічається у природі, тобто молекула транскрибованої ДНК у природі може бути функціонально не пов'язана з регуляторним елементом.
І0067| Транскрибована молекула ДНК в цілому може являти собою будь-яку молекулу ДНК, для якої потрібна експресія транскрипта. Така експресія транскрипта може призводити до трансляції отриманої молекули мРНК і, таким чином, до експресії білка. В якості альтернативи, наприклад, транскрибовані молекули ДНК можуть бути виконані таким чином, щоб в остаточному підсумку викликати зниження експресії конкретного гена або білка. В одному варіанті реалізації цього можна досягти із застосуванням транскрибованої молекули ДНК, яка орієнтована в антисенсовому напрямку. Фахівець в даній області техніки добре знайомий із застосуванням такої антисенсової технології. Будь-який ген можна негативно регулювати таким чином, і в одному варіанті реалізації транскрибовану молекулу ДНК можна розробити для супресії (пригнічення) специфічного гена за допомогою експресії молекули длРНК, міРНК або мікроРНК.
Ї0О68| Таким чином, в одному варіанті реалізації даного винаходу запропонована рекомбінантна молекула ДНК, що містить регуляторний елемент відповідно до даного винаходу, як, наприклад, та, яка представлена у вигляді БЕО ІЮ Мо: 1-15, функціонально пов'язаний з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК таким чином, щоб модулювати транскрипцію зазначеної транскрибованої молекули ДНК на потрібному рівні або з потрібним профілем у випадку, коли конструкція інтегрована в геном трансгенної рослинної клітини. В одному варіанті
Зо реалізації зазначена транскрибована молекула ДНК містить область гена, що кодує білок, а в іншому варіанті реалізації зазначена транскрибована молекула ДНК містить антисенсову область гена.
Гени, що представляють інтерес з точки зору агрономії
І0069| Транскрибована молекула ДНК може являти собою ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії. У даному описі термін "ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії" відноситься до транскрибованої молекули ДНК, яка при експресії в конкретній тканині рослини, клітині або типі клітин, обумовлює необхідну характеристику. Продукт гена, що представляє інтерес з точки зору агрономії, може діяти всередині рослини, виявляючи вплив на морфологію, фізіологію, ріст, розвиток, врожайність, склад зерна, живильні характеристики, стійкість до захворювань або шкідників і/або несприйнятливість до впливу навколишнього середовища або хімічних речовин у рослин, або може діяти в якості пестицидного агента в раціоні шкідника, який харчується на зазначеній рослині. В одному варіанті реалізації даного винаходу регуляторний елемент даного винаходу вводять у конструкцію таким чином, що зазначений регуляторний елемент функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК, яка являє собою ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії. У трансгенній рослині, що містить таку конструкцію, експресія гена, що представляє інтерес з точки зору агрономії, може обумовлювати наявність сприятливої з точки зору агрономії ознаки. Сприятлива з точки зору агрономії ознака може включати, наприклад, але не обмежуватися ними, несприйнятливість до гербіцидів, боротьбу з комахами-шкідниками, модифіковану врожайність, стійкість до захворювань, стійкість до патогенів, ріст і розвиток модифікованих рослин, вміст модифікованого крохмалю, вміст модифікованої олії, вміст модифікованих жирних кислот, вміст модифікованого білка, дозрівання модифікованих плодів, поліпшене харчування тварин і людини, одержання біополімерів, стійкість до екологічного стресу, фармацевтичні пептиди, поліпшені характеристики обробки, поліпшений смак, технологію одержання гібридного насіння, поліпшене одержання волокна й одержання потрібного біопалива.
І0070| Приклади генів, що представляють інтерес з точки зору агрономії, відомих в даній області, включають ті гени, які забезпечують стійкість до гербіцидів (патенти США МоМо 6803501, 6448476, 6248876, 6225114, 6107549, 5866775, 5804425, 5633435 і 5463175), підвищену врожайність (патенти США МоМоео 0538446, 6716474, 6663906, 6476295, 6441277, 6423828, 60 6399330, 6372211, 6235971, 6222098 і 5716837), боротьбу з комахами-шкідниками (патенти
США МоМо 6809078, 6713063, 6686452, 6657046, 6645497, 6642030, 6639054, 6620988, 6593293; 6555655; 6538109; 6537756; 6521442; 6501009; 6468523; 6326351; 6313378; 6284949; 6281016; 6248536; 6242241; 6221649; 6177615; 6156573; 6153814; 6110464; 6093695; 6063756; 6063597; 6023013; 5959091; 5942664; 5942658, 5880275 5763245 і 5763241), стійкість до грибкових захворювань (патенти США МоМо 6653280, 6573361, 6506962, 6316407, 6215488, 5516671, 5773696, 6121436, 6316407 і 6506962), стійкість до вірусів (патенти США МоМо 6617496; 6608241; 6015940; 6013864; 5850023 і 5304730), стійкість до нематод (патент США Мо 6228992), стійкість до бактеріальних захворювань (патент США Мо 5516671), ріст і розвиток рослин (патенти США
МоМо 6723897 і 6518488), одержання крохмалю (патенти США МоМо 6538181 і 6538179; 6538178, 5750876, 6476295), одержання модифікованих олій (патенти США МоМо 6444876, 6426447 і 6380462), одержання підвищеного вмісту олії (патенти США МоМо 6495739, 5608149, 6483008 і 6476295), вміст модифікованих жирних кислот (патенти США МоМо 6828475, 6822141, 6770465, 6706950, 6660849, 6596538, 6589767, 6537750, 6489461 і 6459018), одержання підвищеного вмісту білка (патент США Мо 6380466), дозрівання плодів (патент США Мо 5512466), поліпшене харчування тварин і людини (патенти США МоМо 6723837, 6653530, 6541259, 5985605 і 6171640), біополімери (патенти США МоМо ОБКЕЗ37543, 6228623 і 5958745, і 6946588), стійкість до екологічного стресу (патент США Мо 6072103), фармацевтичні пептиди та секретовані пептиди (патенти США МоМо 6812379; 6774283; 6140075 і 6080560), поліпшені характеристики обробки (патент США Мо 6476295), поліпшене перетравлення (патент США Мо 6531648), знижений вміст рафінози (патент США Мо 6166292), одержання ферментів у промислових масштабах (патент США Мо 5543576), поліпшений смак (патент США Мо 6011199), фіксацію азоту (патент США Мо 5229114), одержання гібридного насіння (патент США Мо 5689041), одержання волокон (патенти США МоМо 6576818, 6271443, 5981834 і 5869720) й одержання біопалива (патент США Мо 5998700). 0071) В якості альтернативи, ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії, може впливати на вищезгадані характеристики рослин або фенотипи шляхом кодування молекули
РНК, яка викликає спрямовану модуляцію генної експресії ендогенного гена, наприклад, за допомогою антисенсової (див., наприклад, патент США Ме5107065); інгібуючої РНК ("РНК- інтерференція" включаючи модуляцію експресії гена за допомогою механізмів, опосередкованих мікроРНК, міРНК, транс-діючих міРнНК ії фазової СРНК, наприклад, як це описано в опублікованих заявках на патент США МоМо 2006/0200878 і 2008/0066206, а також у заявці на патент США Мо 11/974469); або за допомогою механізмів, опосередкованих косупресією. РНК також може являти собою каталітичну молекулу РНК (наприклад, рибозимом або рибосвітч, див., наприклад, патент США Мо 2006/0200878), модифіковану для розщеплення необхідного ендогенного мРНК-продукту. У даній області техніки відомі способи для конструювання та введення конструкцій у клітину таким чином, щоб транскрибована молекула
ДНК транскрибувалася в молекулу, яка має здатність викликати супресію гена.
Селектовані маркери
ІЇ0072| Селектовані маркерні трансгени можуть також застосовуватися з регуляторними елементами відповідно до даного винаходу. У даному описі термін "селектований маркерний трансген" відноситься до будь-якої транскрибованої молекули ДНК, експресію якої (або її відсутність) у трансгенній рослині, тканині або клітині можна виявити (за допомогою скринінгу) або оцінити яким-небудь чином. Селектовані маркерні гени й асоційовані з ними методи відбору та скринінгу для застосування при здійсненні даного винаходу відомі в даній області техніки і включають, але не обмежуються ними, транскрибовані молекули ДНК, що кодують В|- глюкуронідазу (5305), зелений флуоресцентний білок (СЕР), білки, які обумовлюють стійкість до антибіотиків, і білки, які обумовлюють стійкість до гербіцидів. Прикладом селектованого маркерного трансгена є трансген, представлений у вигляді 5ЕО ІЮ Мо: 17.
Трансформація клітин
І0073| Даний винахід також відноситься до способу одержання трансформованих клітин і рослин, які містять щонайменше один регуляторний елемент, функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК. (0074) Термін "трансформація" відноситься до введення молекули ДНК у реципієнта-хазяїна.
У даному описі термін "хазяїн" відноситься до бактерій, грибів або рослин, включаючи будь-які клітини, тканини, органи або потомство бактерій, грибів або рослин. Рослинні клітини та тканини рослин, що представляють особливий інтерес, включають протопласти, калуси, коріння, бульби, насіння, стебла, листи, саджанці, зародки і пилок. 0075) У даному описі термін ""трансформований" відноситься до клітини, тканини, органа або організму, в який була введена чужорідна молекула ДНК, як, наприклад, конструкція. бо Зазначена введена молекула ДНК може бути інтегрована в геномну ДНК реципієнтної клітини,
тканини, органа або організму, так що введена молекула ДНК успадковується наступним потомством. "Трансгенна" або "трансформована" клітина або організм може також включати потомство зазначеної клітини або організму та потомство, отримане в результаті програм селекції з використанням такого трансгенного організму як батька при схрещуванні, і проявляє змінений фенотип, що виникає в результаті присутності чужорідної молекули ДНК. Зазначену молекулу ДНК, що вводиться, можна також транзієнтно вводити в клітину-реципієнт таким чином, щоб молекула ДНК, що вводиться, не успадковувалася наступним потомством. Термін "грансгенний" відноситься до бактерії, гриба або рослини, що містить щонайменше одну гетерологічну молекулу ДНК. 0076) Існує багато способів, добре відомих фахівцям в даній області техніки, для введення молекул ДНК у рослинні клітини. Зазвичай цей процес включає стадії відбору підходящої клітини-хазяїна, трансформації клітини-хазяїна вектором й одержання трансформованої клітини-хазяїна. Способи та матеріали для трансформації рослинних клітин шляхом уведення рослинної конструкції в геном рослини при здійсненні даного винаходу можуть включати будь- який з добре відомих і продемонстрованих способів. Підходящі способи включають серед інших, але не обмежуються ними, бактеріальну інфекцію (наприклад, Адгобасіегіцт), бінарні
ВАС-вектори, безпосередню доставку ДНК (наприклад, за допомогою ПЕГ-опосередкованої трансформації, опосередкованого висиханням/інгібуванням поглинання ДНК, електропорації, перемішування з карбід-кремнієвими волокнами та прискоренням покритих ДНК частинок), редагування геному (наприклад, СКІЗРЕ-Сав-системи).
І0077| Клітини-хазяїни можуть являти собою будь-яку клітину або організм, як, наприклад, рослинну клітину, клітину водоростей, водорості, клітини грибів, гриби, бактеріальну клітину або клітину комах. У конкретних варіантах реалізації зазначені клітини-хазяїни і трансформовані клітини можуть включати клітини, отримані з сільськогосподарських культур.
І0078| Трансгенну рослину згодом можна регенерувати з трансгенної рослинної клітини відповідно до даного винаходу. Використовуючи традиційні методи селекції або самозапилення, можна одержати насіння з такої трансгенної рослини. Така насінина й отримане потомство, вирощене з такого насіння, буде містити рекомбінантну молекулу ДНК відповідно до даного винаходу й, отже, будуть трансгенними.
І0079| Трансгенні рослини відповідно до даного винаходу можуть самозапилюватися, забезпечуючи насіння для гомозиготних трансгенних рослин відповідно до даного винаходу (гомозиготні за рекомбінантною молекулою ДНК), або можуть схрещуватися з рослинами, що не є трансгенними, або різними трансгенними рослинами, забезпечуючи насіння для гетерозиготних трансгенних рослин відповідно до даного винаходу (гетерозиготні за рекомбінантною молекулою ДНК). Обидві такі гомозиготні та гетерозиготні трансгенні рослини згадуються у даному винаході як "рослини-нащадки". Рослини-нащадки являють собою трансгенні рослини, які походять від вихідної трансгенної рослини і містять рекомбінантну молекулу ДНК відповідно до даного винаходу. Насіння, отримане із застосуванням трансгенної рослини відповідно до даного винаходу, можна збирати і застосовувати для вирощування поколінь трансгенних рослин, тобто рослин-нащадків відповідно до даного винаходу, що містять конструкцію згідно з даним винаходом й експресують ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії. Опису способів селекції, які зазвичай застосовуються для різних культур, можна знайти в одному з декількох довідників, див., наприклад, Аїіага, Ргіпсіріез ої Ріапі Вгеєдіпо, Чопп
Муйеу 6 Боп5, МУ, ШО. ої СА, Оаміз, СА, 50-98 (1960); біттопав, Ргіпсіріє5 ої Стор Ітргоуетепі,
Гопдтап, Іпс., ММ, 369-399 (1979); Зпеер апа НепаіКвеп, Ріапі Бгеєдіпд Регзресіїмев,
М/адепіпдеп (єд), Сепіег їТог Адгісийига! Рибіїзпіпд апа Ооситепіайоп (1979); Ренг, зоуреєапв:
Ітргометепі, Ргодисіоп апа Обев5, 2пй Едйіоп, Моподгари, 16:249 (1987); Ренг, Рііпсіріе5 ої
Магіегу ОемеІортепі, Тпеогу апа Тесппідие, (Мої. 1) ї Стор 5ресіез 5оуреап (Мої. 2), ІОжа еаге
Опім., МастіПап Риб. Со., МУ, 360-376 (1987). (0080| Трансформовані рослини можна досліджувати на наявність гена, що представляє інтерес, або генів і рівня та/або профілю експресії, забезпечуваного регуляторними елементами відповідно до даного винаходу. Фахівцям в даній області техніки відомі численні способи, доступні для аналізу трансформованих рослин. Наприклад, способи аналізу рослин включають, але не обмежуються ними, саузерн-блоти або нозерн-блоти, підходи на основі ПЛР, біохімічні аналізи, фенотипові способи скринінгу, оцінки полів й імунодіагностичні тести. Експресію транскрибованої молекули ДНК можна виміряти із застосуванням реагентів і способів ТадаМапФ (Арріїед Віозузіетв5, Фостер Сіті, штат Каліфорнія), описаних виробником, і за допомогою часів
ПЛР-циклу, які визначаються із застосуванням матриці тестування ТадМапт?т). В якості альтернативи, для оцінки експресії трансгена можна застосовувати реагенти та способи 60 Іплмадеге (Тпіга Уумаме Тесппоодіе5, Медісон, штат Вісконсін) і способи, описані виробником.
І0081| Даний винахід також забезпечує частини рослини відповідно до даного винаходу.
Частини рослин включають, але не обмежуються ними, листи, стебла, коріння, бульби, насіння, ендосперм, насінний зачаток і пилок. Частини рослин відповідно до даного винаходу можуть бути життєздатними, не життєздатними, регенерованими і/або не регенерованими. Даний винахід також включає та забезпечує трансформовані рослинні клітини, які містять молекулу
ДНК відповідно до даного винаходу. Зазначені трансформовані або трансгенні рослинні клітини відповідно до даного винаходу включають регенеровані та/(або не регенеровані рослинні клітини.
І0082| У даному винаході також запропонований продукт споживання, який одержують з трансенної рослини або її частини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК відповідно до даного винаходу. Товарні продукти відповідно до даного винаходу містять виявлену кількість
ДНК, що містить послідовність ДНК, вибраної з групи, що складається з БЕО ІЮ МоМо: 1-15. У даному описі термін "продукт споживання" відноситься до будь-якої композиції або продукту, який складається з матеріалу, отриманого з трансгенної рослини, насіння, рослинної клітини або частини рослини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК відповідно до даного винаходу.
Товарні продукти включають, але не обмежуються ними, оброблені насінини, зерна, частини рослин і шрот. Продукт споживання відповідно до даного винаходу буде містити виявлену кількість ДНК, що відповідає рекомбінантній молекулі ДНК відповідно до даного винаходу.
Виявлення щонайменше однієї з таких ДНК у зразку можна застосовувати для визначення вмісту продукту споживання або його джерела. Можна застосовувати будь-який стандартний спосіб виявлення молекул ДНК, включаючи способи виявлення, описані у даному документі.
І0083| Винахід буде більше зрозуміло за рахунок посилання на наступні приклади, які наведені як приклад і не призначені для обмеження даного винаходу, якщо не зазначено інше.
Фахівцям в даній області техніки буде зрозуміло, що методи, описані у наступних прикладах, являють собою методи, розкриті авторами даного винаходу для гарного функціонування при здійсненні даного винаходу. Однак фахівцям в даній області техніки у світлі даного опису буде зрозуміло, що багато змін можуть бути зроблені у конкретних варіантах реалізації, описаних у даному документі, й як і раніше можуть бути отримані аналогічні або подібні результати без відступу від сутності й обсягу винаходу, тому всю інформацію, викладену або показану на
Зо прикладених кресленнях, слід інтерпретувати як ілюстративну, а не як обмежуючу.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1
Ідентифікація та клонування регуляторних елементів (0084) Нові транскрипційні регуляторні елементи та групи регуляторних елементів експресії (ЕХР) були ідентифіковані та клоновані з геномної ДНК дводольних рослин видів Сиситів тео (МИ5Н-39-1070АМ) і Медісадо ігипсаїціа. (0085) Транскрипційні регуляторні елементи були вибрані на основі запатентованих і даних мікроматриць, що знаходяться у публічному доступі, отриманих із експериментів з визначення профілю транскрипції, проведених на соєвих бобах (Сіусіпе тах) й Агабідорзі5, а також на основі пошуків гомології із застосуванням відомих послідовностей дводольних рослин при запиті на пошук даних про запатентовані послідовності Сиситі5 тео та запатентовані і послідовності Медісадо ігипсайціа, що знаходяться у публічному доступі. (0086) Застосовуючи ідентифіковані послідовності, провели біоїінформаційний аналіз для ідентифікації регуляторних елементів в ампліфікованій ДНК. Наприклад, біоінформаційний аналіз проводили для ідентифікації сайту початку транскрипції (Т55) та будь-якої двонаправленої, інтронної або розташованої вище кодуючої послідовності, присутньої у зазначеній послідовності. Застосовуючи результати даного аналізу, регуляторні елементи були визначені у послідовностях ДНК і праймерах, розроблених для ампліфікації регуляторних елементів. Відповідну молекулу ДНК для кожного регуляторного елемента ампліфікували із застосуванням стандартних умов полімеразної ланцюгової реакції з праймерами, що містять унікальні сайти ферментів рестрикції та геномну ДНК, виділеними з Сиситів тео та Медісадо їгипсаїша. Отримані ДНК-фрагменти лігували у базові рослинні вектори експресії із застосуванням стандартних способів розщеплення ферментом рестрикції сумісних сайтів рестрикції та лігування ДНК.
І0087| Аналіз регуляторного елемента 155 й інтрон/«екзонних границь сплайсингу можна здійснити із застосуванням тканини трансформованої рослини. Коротко, зазначені рослини трансформують рослинними векторами експресії, що містять фрагменти клонованої ДНК, функціонально пов'язані з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. Далі, 5'-ВАСЕ систему для швидкої ампліфікації кКДНК-кінців версії 2.0 (Іпмігодеп, Карлобад, штат Каліфорнія, бо 92008) застосовують для підтвердження регуляторного елемента Т55 й інтрон/екзонних границь сплайсингу шляхом аналізу послідовності ДНК, отриманих транскриптів мРНК. (0088) Послідовності ДНК, кодуючі групи транскрипційних регуляторних елементів експресії
Сиситієх і Медісадо, або послідовності ЕХР, які складаються з промоторного елемента, функціонально пов'язаного з лідерним елементом, представлені в Таблиці 1 разом з їх відповідними промоторами та лідерами.
Таблиця 1
Групи транскрипційних регуляторних елементів експресії, промотори, лідери й інтрони, виділені з Сиситів тео та Медісадо ігипсаїціа -бОСтеСірійсри | 7106 0 |БілокіЗ, щозв'язуєхлорофілаю./-://:
Р.СОСтеВра! 77777777 | 77118 77 Білок, подібний В-рох цинкпальцевому білку24 -бОСтеВраї 77777717 |77119 7 Білок, подібний В-рох цинкпальцевому білку24
Приклад 2
Аналіз регуляторних елементів, опосередковуючих експресію (ЗИ5 в стабільно трансформованих рослинах сої
І0089| Рослини сої трансформували векторами, зокрема, рослинними векторами експресії, що містять досліджуваний регуляторний елемент, опосередковуючий експресію трансгена б- глюкуронідази (505). Отримані рослини аналізували на визначення експресії білюьа ОЗ для оцінки впливу вибраних регуляторних елементів на експресію.
ЇО090| Рослини сої трансформували рослинними конструкціями експресії (505, перерахованими в Таблиці 2. Регуляторні елементи клонували у базовий рослинний вектор експресії, застосовуючи стандартні способи, відомі в даній області техніки. Отримані рослинні вектори експресії містили область правої межі від Адгобасіегішт ішптеїасіеп5 (межа В-
АсРШ.гіднО), першу трансгенну селекційну касету, застосовувану для відбору трансформованих рослинних клітин, яка обумовлює стійкість або до гербіциду гліфосату, або до антибіотика спектиноміцину; другу трансгенну касету для оцінки активності регуляторного елемента, який містить послідовність ЕХР, функціонально пов'язану з 5-кінцем кодуючої послідовності ВД- глюкуронідази (505, (ЗО1І-Ес.цідАжеІ 51:1:1, 5ЕО ІЮ Ме: 17), що містить процесований інтрон, отриманий з тканиноспецифічного гена 51-І51, індукованого світлом (СепрапкК Ассевзвіоп: хХО4753), функціонально пов'язаного 5-кінцем з З3'-кінцевою областю гена Еб Сюо55урійт
Браградепзе (Т-С20.Еб6-3Б:3р01, 5ЕО ІЮ Ме: 18); й область лівої межі від Адгобасіегішт ішптегасіеп5 (межа В-АС Р Ш.ІЄЙ).
Таблиця 2
Регуляторні елементи і відповідні плазмідні конструкції експресії 305
Зо І0091|| Рослинні клітини сої трансформували із застосуванням бінарних трансформаційних векторних конструкцій, описаних вище, шляхом Адгобасіегішт-опосередкованої трансформації,
із застосуванням способів, відомих в даній області техніки. Отримані трансформовані рослинні клітини індукували з утворенням цільних рослин сої. (0092) Гістохімічний аналіз 505 застосовували для якісного та кількісного аналізу експресії трансформованих рослин. Цільні ділянки тканини інкубували із забарвлюючим 505 розчином х-Сійс о (5-бром-4-хлор-3-індоліл-б-глюкуронід) (1 міліграм/мілілітр) протягом відповідного відрізка часу, промивали і візуально перевіряли на наявність синього забарвлення. Активність
Ии5 якісно визначали шляхом безпосереднього візуального огляду або огляду під мікроскопом із застосуванням вибраних органів і тканин рослин.
І0093| Для кількісного аналізу експресії (05 загальний білок екстрагували з вибраних тканин трансформованих рослин сої. Один мікрограм загального білка застосовували з флюорогенним субстратом 4-метилумбеліферил-В-ЮО-глюкуронідом (МОСС) у загальному об'ємі реакції 50 мкл. Продукт реакції, 4-метилумбеліферон (4-МІ)), проявляв максимальний рівень флуоресценції при високому рн, коли була іонізована гідроксильна група. Додавання основного розчину карбонату натрію одночасно зупиняє аналіз і регулює рН для кількісного визначення флуоресцентного продукту. Флуоресценцію вимірювали за допомогою збудження при 365 нм, випромінюванні при 445 нм, застосування РіІпоготах-3 з рідером Місготах, з шириною щілини, встановленої при збудженні 2 нм і при емісії З нм. Значення представлені в одиницях нмоль вИЗ/год./мг загального білка.
Ї0094| Наступні зразки тканини були відібрані для визначення експресії (305 у поколінні КО; на стадії Мп5 у листі з улоговинкою (5іпК Ієаї), вихідному листі та корені; на стадії К1 у черешку, вихідному листі, квітці та сім'ядолі; на стадії КЗ у бобі та незрілих насінинах; і на стадії жовтого бобу в зародку та сім'ядолі. Нижче в Таблицях З і 4 показані середні значення кількісної експресії ЗИО5 для кожного з відібраного зразка тканин, опосередкованої регуляторними елементами, представленими в Таблиці 2.
Таблиця З
Середні значення кількісної експресії (305 в стабільно трансформованих рослинах сої, опосередкованої регуляторними елементами, отриманими з
Сиситів тео
Лист із
ВІ 111100 |Вихіднийлисто | 6007 | 777777717357. | 7 АС
ВЗ 0 |Боб///// | 77778... | 4199, | .ЮЙЮЙЮюЮ.85 Ж Ж2
Таблиця 4
Середні значення кількісної експресії ОЗ в стабільно трансформованих рослинах сої, опосередкованої регуляторними елементами, отриманими з Медісадо ігипсайшіа
Вб 77777771 |Сімядоляї7////// | 13 Ї11111111911сСс21С у
ВЗ 77777711 (Боб Ї771717171717171785.Й.Щ |. ЮЙИьр з 2 ЖК;щфК
ВЗ 77/70 |Незріланасінинчаїд//// | 7777/7577 Ї71111111911сС21С у
Жовтийбоб |Зародок///////|Ї77777777417Ї1111111101111сСс1 у (Жовтийбоб 0 |Сімядолл/: | 477777 Ї77777711011сСсС1
0095) Як видно з Таблиць З і 4, кожний з регуляторних елементів має унікальний профіль експресії у відібраних зразках тканин. Як ЕХР-СОСте.Ре2:1 (ЗЕБО ІО Мо: 1), так й ЕХР-
СОСте.Сірі псбБ:1 (5ЕБО 10 Мо: 4) експресуються на високому рівні на стадії КЗ у бобі та показують найнижчий рівень експресії на стадії КЗ у незрілій насінині, на стадії Мп5 у корені, на стадії К5 у сім'ядолі та на стадії жовтого бобу в зародку та сім'ядолі. Експресія И5, опосередкована ЕХР-СОСте.Ре2:1, також була високою на стадії Мп5 у листі з улоговинкою та вихідному листі, і на стадії К1 у черешку, вихідному листі та квітці. Регуляторний елемент ЕХР-
СуСте.ВЬ2::1 (5ЕО ІО Ме: 7) продемонстрував найвищий рівень експресії на стадії Мп5 у листі з улоговинкою та вихідному листі, а також на стадії КЗ у бобі. Експресія БОБ, опосередкована
ЕХР-МІ пор2:1:1 (5ЕО ІЮ Ме: 10), була найвищою на стадії Мп5 у вихідному листі та на стадії К1 у черешку. ЕХР-МІ.РОП-Т:1:1 (ЗЕО ІЮ Ме: 13) продемонстрував найвищий рівень експресії на стадії К1 у вихідному листі. (0096) Кожний регуляторний елемент забезпечує унікальний профіль експресії, який можна застосовувати для оптимального опосередковування експресії різних трансгенів залежно від переважної експресії у потрібних тканинах.
Приклад З
Енхансерні елементи, отримані з регуляторних елементів
І0097| Енхансери отримують з промоторних елементів, представлених у вигляді зЕО ІЮ Мо: 2, 5, 8, 11 ії 14. Енхансерний елемент може складатися щонайменше з одного цис-регуляторного елемента, які при функціональному зв'язуванні з 5'- або 3"--кінцем промоторного елемента або при функціональному зв'язуванні з 5- або 3-кінцем додаткових енхансерних елементів, які функціонально пов'язані з промотором, можуть поліпшувати або модулювати рівні експресії транскрибованої молекули ДНК або забезпечувати експресію транскрибованої молекули ДНК у певному типі клітин або органі рослини, або у певний момент часу розвитку або циркадіанного ритму. Енхансери одержують шляхом видалення ТАТА-боксу або функціонально схожих елементів і будь-якої розташованої нижче послідовності з промоторів, які сприяють ініціації транскрипції з промоторної послідовності, наприклад, послідовності, представленої у вигляді
ЗЕО ІЮО Мо: 2, 5, 8, 11 і 14 або їх фрагментів.
Зо 0098) ТАТА-бокс у промоторах рослин не є настільки високо консервативним, як у деяких інших еукаріотичних організмах. Тому для визначення фрагмента в якості енхансера для початку необхідно ідентифікувати сайт початку транскрипції (Т55) гена, при цьому спочатку транскрибується 5-НТО. Наприклад, транскрипційний регуляторний елемент, ЕХР-МІ.І поб2:1:1 (ЗЕБЕО ІЮО Мо: 10) складається з промоторного елемента, Р-МІІ пор2-1:2:1 (5ЕБО ІЮ Мо: 11), функціонально пов'язаного з 5-НТО, або лідерного елемента, І -МІ.І пер2-1:2:71 (З5ЕО ІЮ МО: 12).
У промоторному елементі 1837 Бр Р-МІ Неб2-1:2:1 (ЗЕО ІЮО Мо: 11) передбачуваний основний
ТАТА-подібний елемент виявляється в нуклеотидах з 1798 по 1803. Енхансерний фрагмент, отриманий з Р-МІ.І пор2-1:2:1, може містити нуклеотиди з 1 по 1797 послідовності 5ЕО 10 Мо: 11, що в результаті призводить до послідовності, представленої у вигляді ЗЕО ІЮО Мо: 16 (Е-
МІ пср2). Енхансери, отримані з промотору, Р-МІІ Псер2-1:2:1 (5БО ІЮО Мо: 11), можуть додатково містити більше дрібні фрагменти Е-МЕЇйпср2 (5БО ІС Мо: 16). Ефективність енхансерних елементів, отриманих із промотору Р-МІІ пер2-1:27 (5ЕО ІЮО Ме: 11), визначають емпірично шляхом створення химерного транскрипційного регуляторного елемента, що містить енхансер, отриманий з промотору, Р-МІ пор2-1:2:1 (5БО ІО Мо: 11), який функціонально пов'язаний з промотором і лідером й який застосовують для опосередковування експресії транскрибованої молекули ДНК, такої як Об, в аналізах на визначення стабільної або транзієнтної експресії у рослин.
Ї0099| Може знадобитися подальше вдосконалення енхансерного елемента, і це підтверджують емпірично. Крім того, положення енхансерного елемента щодо інших елементів у химерному транскрипційному регуляторному елементі також визначають емпірично, оскільки порядок кожного елемента в химерному транскрипційному регуляторному елементі може впливати залежно від відносного положення кожного елемента. Деякі промоторні елементи будуть містити множину ТАТА-боксів або подібних ТАТА-боксу елементів і, можливо, множину сайтів початку транскрипції. У цих обставинах спочатку може знадобитися ідентифікація місця розташування першого Т55, а потім початок розробки енхансерів із застосуванням першого
Т55 для запобігання можливої ініціації транскрипції у передбачуваному енхансерному елементі. 00100) Енхансерні елементи, отримані з промоторних елементів, представлених у вигляді
ЗЕО ІЮ Мо: 2, 5, 8, 11 їі 14, клонують із застосуванням способів, відомих в даній області техніки, для функціонального зв'язування з 5-або 3-кінцем промоторного елемента або бо функціонального зв'язування з 5- або 3-кінцем додаткових енхансерних елементів, які функціонально пов'язані з промотором. В якості альтернативи, енхансерні елементи можна клонувати із застосуванням способів, відомих в даній області технікию, для забезпечення більшого за розміром енхансерного елемента, який складається з двох або більше копій енхансера, і клонувати із застосуванням способів, відомих в даній області техніки, для функціонального зв'язування з 5'- або 3'-кінцем промоторного елемента або функціонального зв'язування з 5'- або 3'-кінцем додаткових енхансерних елементів, які функціонально пов'язані с промотором, що призводить до одержання химерного транскрипційного регуляторного елемента. Енхансерні елементи також можна клонувати із застосуванням способів, відомих в даній області техніки, для функціонального зв'язування з 5'-кінцем промоторного елемента, отриманого з організму іншого роду, або для функціонального зв'язування з 5'- або 3'-кінцем додаткових енхансерних елементів, отриманих з організмів іншого роду, які функціонально пов'язані з промотором, отриманим або з організму одного або того самого роду, або організму іншого роду, що призводить до одержання химерного транскрипційного регуляторного елемента. Рослинний трансформаційний вектор експресії 5ЗИО5 можна сконструювати із застосуванням способів, відомих в даній області техніки, аналогічно конструкціям, описаним вище у Прикладі 2, в якому отримані рослинні вектори експресії містять область правої межі від
Адгорасієегішт їшптеїасіеєп5 (межа В-АСЕчи.гідйпО, першу трансгенну селекційну касету, застосовувану для відбору трансформованих рослинних клітин, яка обумовлює стійкість до антибіотика, спектиноміцину; і другу трансгенну касету для дослідження енхансерного елемента, що складається з енхансерного елемента, функціонально пов'язаного з 5'- або 3- кінцем промоторного елемента або функціонально пов'язаного з 5'- або 3'-кінцем додаткових енхансерних елементів, які, у свою чергу, функціонально пов'язані з промотором, який функціонально пов'язаний з 5-кінцем лідерного елемента, функціонально пов'язаного з кодуючою послідовністю для ВД-глюкуронідази (405, СОІ-Ес.цідА ж 51 51:11, 5ЕО ІЮО Мо: 17), що містить процесований інтрон, отриманий з тканиноспецифічного гена картоплі 5Т-І 51, індукованого світлом (Сепрапк Ассез5іоп: Х04753), функціонально пов'язаний з 3'-кінцневою областю гена Еб Со5зурішт Баградепвзе (Т-С6.Е6-3Б:3р0:1, 5ЕО ІО Мо: 18), й область лівої межі від А. їштеїасіеп5 (межа В-АСКИиШ. ей). Отримані плазміди застосовують для трансформації рослин сої або інших родів рослин способами, описаними вище. В якості альтернативи,
Зо протопластичні клітини, отримані з рослини сої або інших родів рослин, трансформують із застосуванням способів, відомих в даній області техніки, для проведення транзієнтних аналізів. (00101) Експресія ЗбО5, опосередкована регуляторним елементом, що містить щонайменше один енхансер, оцінюють в аналізах на визначення стабільної або транзієнтної експресії у рослин для визначення впливу зазначеного енхансерного елемента на експресію транскрибованої молекули ДНК. Модифікації щонайменше одного енхансерного елемента або дуплікації щонайменше одного енхансерного елемента можна здійснити на основі емпіричного експерименту та регуляції отриманої в результаті експресії генів, яка спостерігається при застосуванні кожної композиції регуляторних елементів. Зміна відносного положення щонайменше одного енхансера в отриманих регуляторних або химерних регуляторних елементах може впливати на транскрипційну активність або специфічність регуляторного або химерного регуляторного елемента, і його визначають емпірично для визначення найкращих енхансерів для потрібного профілю експресії трансгена в рослині кукурудзи або рослині іншого роду.
ІО100) На підставі ілюстрації й опису принципів даного винаходу фахівцям в даній області техніки буде зрозуміло, що даний винахід можна модифікувати у варіанті реалізації та деталях без відступу від таких принципів. У даній заявці заявлені всі модифікації, які відповідають сутності та входять в обсяг формули винаходу. Всі публікації й опубліковані патентні документи, які процитовані у даному документі, включені у даний опис за допомогою посилання тією самою мірою, як якби кожна окрема публікація або заявка на патент була би прямо або побічно зазначена для включення за допомогою посилання.
прошити тутеи ті пшітани ший пЕвКлІК ТОСТІВ КИи ап Мазда Пд у че РОТИ
А дит Мопазаго тесппоісаУу БО су туру ГІ ттуУЕВ ОПІАЮІЧТЯ тич тІЮВТ то ІЗ ОТЮТ уІтЯ Ж ке нриче РІ ХР лій» БЕГБУЛЯЖОВНІ БЛЕМЕНТИЯ вБОСлЛиНОї БАВТАМНТМ їх ЗАСТОСУВАННЯ рух задуми й стих хи 00 КАЛІ З ГИ шт шле й дозво хх лю ше ЛІ ГИ зійшов пкт я
ОД БКут НУ ть гі діжу Вт пет я пр ОО ет» Басепйсій, втриїя 5.
Фр щі
ХА М А
«их зт шк хвя мюокии
Ох, т пед Мит АК
Ко АХ МиЯслЯНЬя пет туту ня сел і ацетат хек кі івША Ззапвакд туту 1 зу Уту т дея п А ХІ ятюх гу примі виз ЛИЖ КпИжчІЛЬНІВІВІЯ (5 рЕзУчкЗ КП хІМ щити тихІві 1 піц
Мини РОКІВ ВН УКХ ХЕ я лип ММІ ВІ с псебСедсОН Указ» Ххевв о ОКА дукутчаватефст ви бала рі шо сні шЕредОожосмнНМ до СЛАВА ОО АЮ, цех можете прамоигтияз, пувкласнанленс пйсжо АпщниМ Зо кАВрпев о семиро нахивншге мридернх
ОМ ч у о А ях вер етвилввВ сни віІ чад сода Ід зад'идив щ:щщті ких поча сттгатдоїа заговтасто сСсавабдідз азазховцсх взасос ве гтаввійдовч Бзавапипта спосо випадання справних копав о Есе ввсосаивсо їси Зола в воли вих спасе їз 1850 плавки тки претьок я В вита диповур жилу вух дея лопор о крцв У
Часіоспічо чес впсосавозац соссвявае сою псаззадаця ЯК СЕБЕ ло шо
ЖЖ дв Я су Ву сор у Ну пу уч вк ин дже ж АВК ноут вв
Статі в зоспасгід Фах плавний дл авайкк пах чих чаї
ЗО скали Пиво рив ух жі асхадппвогя стос вх повазпшїн
Же повтрддлгтрерлию о щи 3 узи З ду вима Же осцізіутуч В ссрдевое двери сю у прик зпочалисих мих холі Ме Бест жил КО а КО ОП И КАЙИТТІВ али ай ува сив кову С фан щити зи ЕВ а Вовна лутути завдлуузазяк спаду бавітвд ша яса доле їз тосту з як
БО вівса кпих тов Опе Кс оо валох чола сах діда пвапвиашн пап тату свт і лих, пет ср Ко ху ев щи и с Кс Кок пу изирлу в вои,уих х КО ахсу Дт чачеКгіглищ флот оч Бавво совка В кр лу вс вет оВ соту
БО лу лрю хоч свекор прК уч іу в жі Буча В во им в фумух суєти слот єха зЗхміЗзосичате щисллхиу пичаиВиииКо есурсоуЄтьихля треухвапаса ен роли вини ув а в ви пиву ут дир вових причину фугу лю учи в ик у
Фавст рес Ко ве ссоиае ую звати Ярош сов воша без
Фрфокчия ту о фзополюВО рифи свовсм жу сусутуль: о моляліяиво уч опору тю Корсвсив і фроичито один уж оч зиспосвзикає сасвалйлІй вааваппшаші сасратизаонах поза их Бест ення 7ви "во кад вд в о вищу ттту Клен єстацвв века тчкшиИ сечі в водо Ві детрит діл сзапазаває прог зовзожха соасоставсе кет загстас боса Коза т ва лк я прИЛЬЮТТТАВОЮМ ЗРО «Вста хлів алкноя срупьвовх ноу вувоезаВиго зІісспсІвсца сатавзівус свсссатасаи савтвсстис сег вЗізааку вста
За
Брід віщо ер ручитетівовсяю с лю Варв КЕ о описово Віті са виро лурри В ж павиманимпе оррллоуца лелек Є Дачне пап чато свои 102 ж воуд в лучке ва цтккетху пава во восудк ик ста В дит грою сівалок КЗззЗзоасисствВ лазчтаїхві базис с зачісвізавЗ зба зЗакишто яна ше щорцвщет жнив фаза гддиви Кщшесвщевкщім ВЗайзігадедо ще зЗзіпдідпева щвчЩоиутхиУ Сава сос увести пазиівичвсщ дюни піп птаг ллапт
АВО шт Зі дрів о зх тултухав рив о олущев ово осюетьмом 4 Я 00осжту су і итртулулухщо ЖЕ прю льно кни пвівсанпкаеає СтТадвотї тсвазссоаст авсссавацвт чаїазчаано падала зи 120 прйфих лють дов ово озу пибЕ ців є Мч тити повоб вору уз сь тики вих и т пи цу айви вс зп зожиаслт часа вУКодшачося Файлова вого вютих яосид ши ше ту о сзгзфуе одитихво ріці ю люттю ВОЮ о фіуєчсудідави о цльпрраті учи о вВсувуузлп піц всастат захапрачо свист Злозазавно пальвотеї папоадзаади тост оз гризуть рр уро фурор у при В Кос уретриту фетр завастсанес софори ринг осесоваАЛи З цу ї чн сси спол. 13288 випити па фей попри лькутл дув Во дп оциу ти ледтг й скл: задала здІрцльсшт а далтатадкт ддоищнцпько зГчазсосатив спос Е т вватацаток зЗвчншокола впаадовсзавеє засни ал кажи тачки заведе див ук ри пуд как ВК о тре дл сазавлааїс звапингасх «тстатакдщлив зосавапоптесяа гли кЕ Завидассоя пита шо пк лпуьпіз сказдацето Віру чче вою а Виявити си ВО о дру в дух
ВІсВвОоплова бонпаввасоя ї. чо т пли а «сором БЕ уА
З подтзим Кир лрисльстом пюріучмІВІВ сти тіки ВО (хор пурф от о спузутеуд в опдрію о ль путь и ух зараз ка ворс ОН КЕ З гащі ві вас ва лах
За али руч ря ни щ в чкрв ин не и І и НН айдвсттатєтьаз зач опавчс балатссва зЗвоссосастла вівса попу сяох лит ово пу КЕ кріт ие дод мив раси их НО дово до БНО хх зпдазвлиадині свист вош ссвозЗавопак епосі свт акия КО ла зааазааапа пд
КІ сзсуузсісусасязифги СВО пут хом вх орали СМ соцсусм ит о тв фур рив ху СКК ВОК и су й ту засзЗзазге Сол ушлерт амери САДУ Ор ї чистову
Вип спри ик Я жмут здо из ит фл з икіоміик ин слу сту мис; Д зкуия Дн их Вир м гуси им в алюростлостю Зхміцапнчастфи если мен осви го пов лсалитх вес па аби зе Бгтщостилрдрии доедили вики Бар косу фе вд о дреди додати
ВсоКеозильшу пла хихахи ик КЕ У г пи Міо З Со лую тити аа и тилокї. авт тАХ зара зи вози що срочно лу силу Мокииив окоту Мих их фихир;ро дя ит учи спини ааашо свще стилі ох волопопИина бтесвіла попозееКоя степ їв звела гц геллУТУ У запвсввазав сват тій
КАМЮ
«1 15 «кал УщЕ жк я МГ
Іл буті ооо и ді тт шими оте я люгу асани «ше Інд свнакд туту тла гра ля у) 1235, лк ГПрецчвяєуте препа пгзщмі т супи ки о до пер: й тк тупих отой А плн жи Щоюмотеорна послідовність, отримана а перивдбеачуваново гтенд білка гепедоксинУу й бцдоепила ме1о «Ап т тки кл же еко в Я у З сіні ит вл: ил ум ЯР Я фо свсусу й су гри піл лулре чом су и вони сіро свита нац а Фрипераїу В сиза ак влив тлихху але гжи о ве пвх пут ВО ро в вовку у жу щи ко м щогли се ут в пу и их пкзазпасат Сваавссікв о сипоІстасес вітзавававсй згода стславаюацо з
КМ пов вводи Во Вобоуурюориию ся сук утруднити брюки
Зала гін сщссу власть я ста са Мом КО КІ я олу застосо ЗЕцозЗапоКК зиссадтаво писзсвавнко ставтванпа ЯЗИК зай шу ев ацщвевл ку ув мстити спуввевавии дви вада ккЕзчЗЕЕшІд дес иттд Чидоссага її саавсттївдтза ЗзгссзиЗї свалосаАтадї по тету ту ну пріопим КБ фр утт о свсуівосувизієньм о вою чині фл и ичі ВО притчу тя свапнсосзваас Себе їЕї пвпатпазнолеч зазна свіпопецаК Ферум зво абсо и чи пре их орних викори и тури ви ов ере рю тугих зіззаваоаї сзвстссств ївасісовеЗз гобзазісат здазсвізКксе Стус астх
ОК яке праяжкохооалоВУ бита мали аа пої їв о зввозавизвоч зоба їв пови ва де що прі ще учлуорі ув ВО усу ви ух си в дручлутув о фу иттвут ть их срок грав ори; Же сс БК опруд с св св сх авкавошачсто ГЕтсвзсаслкс зола сан Фсвлиа кл Ззаачаи бла гГаасладава
Зап два ріг ця списи древо воду у фучиє ву води ца вості г. х п же г я я ГК ях. ит дл: ОК яд, У топи дИ т ХЕ Т.З МОМ ЯРЯ чаватшууваи фас х ласо старого вою УВА Бвс вот тщхл
Боб прес віово Зз дурити рі ботів вЗучудоіув Вів дива ветвтв фБузе пів ддц всчощоуєта ззавзолешащ жи пслт педа тниии чесну Болсовзипада шо трусики скуті вих пущі ут сдуд вих оце іл сут учух в уки явки рт Вау БО ассовивиое пазазивтоєс вс та вопосспогог фреон щі кр зу притух пртибяо поцодоцою колу спректуититвиня во Бо одлоррвсю вит пути ВО ев зуіссзісвтї ватосваавпцоз ззаніїсищйі патадстзазу повацеттос волосок
Ки 2. гу су стутуєу тро крб спро ють фе и ту тив Я ово і рю с иричи В ВОМ ОВ ОВО й ур турист з"ввазацавс чстлслсви блок аасс брався тав КО пло 4 пає ши лю В СВО во узгжероріизихитий о при тую кю с Ж туз луці лульйо тлульУ й спи у сф огрухсзтлу вих щшивщотх міх ЗпазсІссНос систе опе з'дзнициана башт ЗзиноСзаНио
КА щовоацюв ою одю нелу геоуитсу и ори уз ці дит є дивних вв вкл о ун мс А зптввасоацос снсосАК її Сад паттьоко КЕ ід ЕХ д Я ал сер чим поазисанспа зії товза лдипапаписг дасть ов папи ва се Слів. пз
А й ЩО ув вини дор ою світу пет дво в одщрквию в гудривв В ОМ ди до удодо вн чівасттини взасос столв латучасатв гав сс зва тавдо зва лпоаа
БМ аджики в пзлвачес гаслафтовицєс паза пааса дао єиве чппвлаасих вай тррй те врюст, - ва ва друці пулу их ор луурттилу ть З с пи зчатакчесас СтТачассткт севаЗзоссошо лацісававкї дзклаляижо піваасодов зи ке грифи водо при при ху саля о уж ом оузттлікри у ИН уч Косик тех лутких і из о прив лтриуу вини уві твуІ спор цчимх свои смак саиа не отих їв петунія и ою ку лок м роту у му я вия Фо м дрлтулю тю зтваташстяки звкопильас дадттвтиіт ппоизадайсса дзвалтютлат папчадапаль ат
Яожик КА. прщерк мису Конт диво Бере уцуіттев о учив осздире ве до броги и ня щих оо ї рус с Попова слетавапиа чу с Зешщеса Сава зви и КУА зазпдаплоакча стро зваЕЗ ваваплазчапсос влжжатаїсв заппвзпше плавав, зла по КА я слу є вва и им у пу. при и позі три Кор ужити Во рих в проду ру савзацазкс зазвгсггоаог ялтахтаївссвз зсвавгОсоаса ССО азам топ пово шию віч тх еф сусутту дити Вачеччив єю вах ужив ом сич сиве пи ОО Вова пу звісвзсвожщаи сівзазваосв сзсзчоЗїїа запа ЗКа ссваавуЕ пІвсопадц
АЗИ чого ль о пусте тин вв утри осел п вия Згрер гу сь зи Ки В заоспзагста вчлатозавсвв базис зпстазативт зчуцизелхн возами зало ши русичі у ми Кури Воіуучіу Мовчи пута ци що пу оз ивовитпиих Вис Кг вавоспатеви Кеш това щесюуюича ес ща пт со Е СОКИ хх ща 16 статева спсзоадеспск ас їв пк ЗзиКаккса ІВ киз зааазааас тай 1740 приді що ех Как атуєд дети цк дек дю ккд Кк п ведекссуюиа вел дд дих ззсвззазичЯ СЄсастазцс сасіваакасос ссазвасоцей ЗЕ овЗя сова 1 винну: заапекинІм: долсраетщинтв дпомемдидд агат ді гелиддгд Бадені ох запише Ін псцщс А мисом сМІ Ост хоХ фмМупаемУцечі пк су пай приоф ох луєту рити пу ит поварити М ль приритихтьипричек о супу т асісвсовасос зосзозессс гас лсвопо госзосУтаї адссовсасоа соссжнама у чосулугу
Оле пика пра дим пек. холі Дея сих я дрчи їз «ЕЛ х пу М де бу М КОХ «чі ПНЕ су м піуузіаЯ що жна их па ДК Уй Ух Слива шо
ФО поки у
Желе АЙ БІО «КПІ а Кох холу ях вищі я лю 1 шцх и тлі іп) ши пІідерня псесжллвнасжв, скрОйвважі спо тредоваеваногт фер сл тювВ. причи фляги но цим у плима ЦІ В У ок МАРОК повії» та пгт зл. вки футуту і нив о Ванну ву вив о ух фу им их рем путьучтьимту усу сртвух тріть сит атіет ппвЗвипесаК Клесів Е спа пипОоса Вагссгвацсвтв впазааа що чав ї3З кожна 4 зе ит У «лох боті м А чн ших мМ - Лют тре пи А4нк ху лит тпазихьіуної о тий, и хо АК МАРОК: ту туту тр лпЕФ отут, Я кір жк поки Мн яв
ТИ ТЕ їх ар
Бош: хх, МИ шу ух Тіні пемзроічйи Ж фипкихмиуц сх тезидо мі плащ З част них па Вих апа Іза гг, СМИФЕОМІНІЮ Ї5 БеВНлЛ ФЛ а бат ХНУ
ТЕО НУК Ж МО і Я о, ММ Ммоєлив». гомо сОоМ, чзУучКЕмМЕсиилвНО примі прудсв хіх
ТОЖ яСВаАНУИ
ЩО ке Труси х пдв івлезедтег те Фі желяухсх в'з' ежквицтлтм свого наявного ДЕД ста йврчу 4 «рих З ддлда и плц пор цес (з адедияде о ввели серии в опи секцію конт гтет зазвассодадз газах чихазвиуваат пуссаасвАЄ чого а га чЧостоюусєсх
Бо серии от пи кдд ни нн не и а оре ухм на паорацс во їх ща Е ли ООП ас саслсилвло чини
КМ кави В учити детих р цоцл ру пу Морзе М одричитітия стер Котів фуги ці сао ге стсСацчю фа чит мули со стт твопславЙптаає вп їй тиж гу су лритритею у му ту умо сет иа ОВ ОВОНЯВО он и Я фи ржооржлуту онук роихи, пу опр тив псевлодасм стстваєтиьх свапейкннЕ геол Єх завокоабсв вагіна. пай
ОСИ пе води щиве ут лу лу дух дю я ин вади гру а в вва аїдвавіїаї гСкзозотаа заваслостск ктазааВвесо атпвіссвавї повзає
Зо вевсеващіпши дібебдіити сфе щи Тк додттий дощів тТих сег діддді
СКК ствижна зітоапавпоєся есеїв С сзосзЗлИаса давства ссівізадік оо сіли о вв ріж о фжівуиуи В вого и сум унів СВО фев сіни пери Ві зваззапео пес СМхлК маша шли цММ ї часник ще ютту пий росу зт мьнси хидлиутунихллоу завис КИСТІ см ОсІОко
Кг
Же сиве Во зе вав вирити ичу Вуд ве ви вве ичтиВ фут кІВ вв вав шсрощицатх аз З сх уки КЕ хі г ше ХВ М З КАТЮ дур КК. чай спазвпсоппос псоугтічкЕ плюса дасте зіпзазвапкст спав с вис всетаки вв щуюик кайпауивввияв о щитка пакевавде о векиаціуицюких вспдуакоту тв просто зшио та чати ж ЗСДуТТ УТ їаавсстабве ГЕ а
БОС флрохиуникАТ позЗаиКеммРг серпльалькто їв їазгагоацей ссссввсвсу аваплхаакик хі
БО кв чіава заслсвавівак ЗишсснавиЕ бах левів ЕКЗ асесоо вовЕ то 7 сич пи Вбоизлувац аю вого тин нирці утепусці учи юр ф и др ВО ци жу сила пахм солимо Ко пиши босі сві З ча Ба ши щу пай ша завттатсіцьї сззазЗосра востлакває слецдвЕЧаК ТЕЗ аза пичесЕ гол зо тецфрЕ юки ВКМ авіснеєцо Бара ую лем су Мучирититв и Бура по м ичитуціі ін сьо тттвнні ПИВ ПІП В КЕ шрот лмх МІ лміме боро виох ризи
В трі ворів рвову: фонду фс ую стих он тулілувово дув лу 34-00 сту сій вв, Женя А пзісвпгакка боса возпзланК агостайевит зазваласбВ посуд о їз поп «крав ти дацдеьквекав саван дешева викид опе дич сіл завккоа завіс стаї зватаклсао зе свачоосс павссскоз засо взасо иа гл ро ситсвсвиисза чЧбававалоло свити дв повз ааВвиаго ор века зазадапшатшо тла от.
Фофефриюі іже их ак фу уже дя дили чні що о луж иу о щовиво фролущту в фах пив сскс са івіЗ попозсагсов вужі дівЗ аз Тс акеЕ Едадуківщ
ВО са втги т ВЕ прогрперцик о ву гдлди ВВЕ де заБбд слот зах ттє поацучт їв осока чеалс сао оста встазвиаа ка Є УЗ чо пок
МА авт уквав ч особа асист в кг капота тасосіа ва З пипИЧчастас 1358 ох кв щкщкьМ вай Вощреоюю ауві Мов суди вбогі М де пт сових аа сво вав Гнів пу пов р По сві и дтга папа зап ри я ие фев і кри о прути хс в; тв ІК НОМ Оп І шия ит ртуть в веж ре екс НН А спкіїзвпичакос габаттваск звідвоанпаа догстсват заваппавикк чаші тла
Дол зіва ав аноиин ведена дадшекнеаии сасуить аво сііщо регі т ду заззаїтьаав зов ссАТЕ шо схаватх взазЗИКо вера Бу ДАХИ Я чив опт ори троє и дв во Бан исцоциьвоввох су воауводиєв опо сор в фихту 8 З дув дує здавав зєе са пивакк Бссоювалаї: вІсвпзцкад навотссіва пеіаоаииа тал
АЛІ тфсіузлілзезкр ВО круту ж фо они кни Міхов осв СВО оф ср ния тфілрици кі КЕ засяє сли ух, воли пише сСплАлІмА паконшащео «сла Ми
ЗЕ
А пу рем жі фо оівсзилвд;и, рю им св я супу су вв а у сов Ні ак иввихи хауса бал еюлеи дрохизанлимхх пополам Ка викид аодЕ мови как зказаддадиддо спите свати пщттрьтізВМ ВК ададпих ви овІ во зотазвзвзалищ и щелеп ТВИВІА У ЛИ Се екЗЗ Кі лат
ШО; ласі сусіл и пи лук ост Бозі нити ил пуріууютьух ек окусзу Ковокр и; еру учи тут т зазчаззавсс конуса пада апачадавлао зЗпазвакопта чабосавл 180 давав фдяви о додолу Юи віє фра цу св дачну кан суВ фодучкчичиеди оц доц оц Кут авотшитвоя засво Еней засивниє заспокоює дев во чено такп
БИ
Кор и ит яз Би оту и ер пи и В ну і низи ву лу Бодрир;рф пуф ов ухучуз о гзузльихі в ензими? вва сі лов о стоспопсаосса сих, МІОМИ болю х. Ше ХІІІ ККУ
РО лих М тест стсве дсавбстсга вдодстасрос седійсявсї аЕфсгетсово петастихед треш сво дова зозекшшол ши пишу я тегу тре
АОМІ столі рдіер Ви свв схув зовано Ес І МХА ОХ И сут ші шлю км, Б сит ВК А
Уста Та
МеОЛЮ я, трон тими ДА ж КАНОН па З ле отут, утро утк ту тю тин би зна см а сТШй» 131..11899) ситах Браміуворнка пестулешнасттви стчремава лю реа пив 17 шШисишьш пес, ЗВ'язуючосго хХалюся
А річ Кк, чари з прут учених ццо Вопоцор увів ст суху дуг Кк іт сжичижиит доця ие Кожух звавссозава Гежнівсвиа зчиітвайвивЕ стбсптщає запа Ка Я спек у во дерасєсті сої зсгпадидко Бесадйієно піз БЕопаро свої едомя подив пиво ухелея «во нагінк портормух ти шкаф амівкоо спивсиітоле ри АЮ ОО
ТИ
Ева БЕ следои зад чеащи в бесід ше вто диск стд птах ст сссвос оазис та сссвівсаКс Зола гвопссаслак
Її гл тизер с ух іврит Кут МОМ М ув ово вових мщоу ко Кв и ров суті йсветсуста ти товпслвнатчос ссстіваківо сззисвЕшЕ ста Ззавосзнесса азлисвтаватх, «за
Ба росу пуд вв О Ввае риецисюклуту сульсууч вики во ово В суижу мими ВО о атаззайтта"м грав тва зайвслетипи орви З аЙпишшосациг сгльцихх ші зспо ткЕста)а ЗЕ Бпгдгеи сита иа БвЕдодтІй давати їл зок дедадЕе слини З лІрЦЯпеУмО: диф фкхиви пекла попала
ЗО дощик о ака вень о срцучи клея ВК в даа ВкЕедще щи деле ті втц вачів Вагоме свососхлу лева восв м г швів Маля и чатлІнМмМрисовпсвоусланств левописпгс бив бори свист а гг зо зебр ддадйв о пір луюи вії б дутлдивищо вже ву Буре водити о Бур уарю ап тпїсвааванк ваугпасвоїа ївососапопов Ето татка «р пу АУ ша
ЗМ педодою тю от пери ВВ яВВО Бважичкитв лу ву а и и ня яд сезтссшос оазис сег ссісотга ваті овай о собзазатіз пісавалаци п руху вози Бек лулив ий З сууюту МОБ причиною во суужуу о су ну водорвопевО оан селу лу дю Яну
Вова росте а пух ос пит мавпу Каже перли з п о пулу в сжтвсе ож лі роко учити яхту ку вия водо луйиреревтуо призи джу в оху пдрнлазволвки авасстазвах соввипссог згадає тів пззпагечев поставок випа е кеш, сива дулю ов ов ви водо вод ливу Мавки
МА ЗУ Мидпнмх у ще ик ро мех ТУ МОН Е р 5 апа ох тв
Ти спбазапно: Бсосабазчвлі посли лопаКе ссоващіслтві вічзсабак ПЕВ то зап вай я вав че дищ вої пеки дит вве: ниВ вве ацдазідо сти вт завтітаїтлах сопзчВотіа діссисотаці гепдсоат їпазавігз Фо овль зпо сащжіссізав КЕ висгов Гозсвівав воспісЗзспсе бува пісовиангга
ЗК ерщраію що ух пак вки о в таь цлувою вок В оо рпридопри юю от, уч гуд их чат каста Ссатттссвт асани вістатьякІ дзазаавУсох Тако з осхеуті
Ем 11 фея дну ну 1 т ик лу СК у пи вия фе итрик о лива к иуиум Мия еуюх ф: иурих од тори яки ізааиш тихого ї дата ТЦ ол пулу си Ковач Бе вас о
Мо г й еф рчмоту их ту ті тей критися усу лу жи мжообутжтутюлу лу і тут о пжуж ух лу пу петуту сур тую стстласавла зов азаса спазчасллпво пуувцайлдавдт Ффуйалив ква зазай чини 1145 ввіз су вдо ер инціни тн ЗвавеВеЕдвиид ваввеешнУух ваззаМвеадЕ
Вишка пд зчспсвсвісв абаптутатяа Каррі Ві бвзатьпаяд я шен; трі вових о. Фу фбтфретльрехит ВОВК 344 у пауз сус щі вол; ов ириєтьи вух пайок сеть слтозплацасо бат яЕтв зсзваазаакия стулку. ї2ей застав гккосссоа асо оєз Кк ассога састустайав зугподааз леза по ев фосусужиттзиєм поро Борелрюв жилу сфсуф суди: вв опо уековюоювиеиув пух сухі рих оце ц пика сїааздпасадав БЄзсвсуващча Твоввоачика чолов вліалдааця 1559 хе воволужояртр кох спа суичуттиє в их сх в рируту си уи о ци у ехощсу В ох сЕхЕвечасої сїаївасолвоко засузаптах всптсвзЕс завис К лади
НЕ пров в опт дура М ву дае прут уковців та зааавлтсава рсвіу їх сила за осув лапа Ст я жи 1и е вжи сади ущ й жа аК салат тв вки дсаиди плат пд тує дало пет наКК сооальихихтяих «папера плюс кима папи нпиахує та аОБи що ци звик до вечори Мав до Ведуть таза ва ззсззочат бававасіка стопа зочЇ ссазасавтяа КЗ сзазиасо сааакстстах. закса - її ях а хх тутьйуіирир во НН а види в УК кова В ВО хитро ВН ЮК де очицучии В с2звоапачака састшватсвави ВоашшолаЧає собі завапавеапа апп псували цлуУтих суль корито ув олутульсі ле сусуєт в гл вудок коциулеться пу зіатавківкиз зкараивиала давачів огоЗзчаацад авлідваваак сесінашах не приртржтупьсьмоче ультра итіль щіток очвля судив палили вра Глава аз паза люстри суха емімеарпиаииг 2 З вах У а 3 чл алея 2 Б їх оди мери лю виб юКоічо сугууєу до дов уро Вир ую су сугуухичию вивих ПК руни твия усу иіих лих мі авсзвзвлтаглои г КИ Ки її а ВАМ А у гла вааапштиано туї ів око т Ж уми умун т В в и им и Ин ку зпанпспксод сфе ссвлсв сло папен сопло 185 лю тую «- я Мт о «азс ел пл дя Ак
А 0 САС я «и «Еаім іншв озваки ит ЕН тя у жі вк Ар ших, я; х : у лу тя ТО ІТК У ла пот ЗВО фрі; ку 1 РИ, узіптьій вис лососеві ча З лей о пІдернз посліковніств, сзимзЗна вогаечна БІД гтаелатя оостиеу их тео! ддкладтітчи; Ж опеучейи я ді шШасакж шеіс, ЗзвВ'ояБвуєтюює клон ща шт щ
Сх о осві учичи пух хз вухвунфинит; ев имум пгух цих в опи вир и имя зпзаланшисМмІ специ СПЕ саше х ЗМІ МИ ВИ ши пи жаркий и ув ве у ут В уч ел ее шт стскЗогосо датсттасавчвоа стос А є ся тп
МЕ
«гр ТЕ
А : як ях, чий и Аа шт тил
Ми чик ик я гтізизта ту т ти ти и спосо о пйшКо гр ях шия хнша «суваМа сля 1 гірплах скит тіж А ША шлють тю Гриця п) несемо УМО осчевулідхульсту о поту РА м ся окре и
Мои пПеслідсовніость ХЕ як штТрИиМманш ов о рена балЕз, пПпОоДЕОБсороО шекстх ї. яті керує жо ших ЙО йти : ер три ух Уч гли тя тещі Моз ре сій утіВИИ Бр яти 7 ОО тт о т гу тре ха ил кутка, цинЕк-пчльцшЕшШМУ ФІЛЕ У жк СИЛ піша, ЩО маслифь прокиикиуу поема бе пі де ск ші яв см о 2 б. мл діру сті тмтуУ МІ тут С пек
Уві вЗВьвнОа поводу У ківншмосшваро напиши Зхс ваЙдеа «ап 7 щрертр и ОВО Мом утлуф ин суттю кхфричи корком специ В о вВосзімв ся сут дупу путі рвати ит вазон Еишос ассіІванват спосо ашйс апреля ЗМІН х ВИКО лох г
ФЕВ проц оциєклуту в ж лу вв вв вжвинчик пити Ва фіи в випр о лрвисв сриухутуть ет ВО чо а сли вуса ха жк: мить Ре СС ТА 120 вики сс зрив гри ВО жде ліфт вересу сере тую же роде сте ва зоепіппадам гоатасавха встуаЗзлоапввай соус та пивна пасик 180 ввсаоіщатх влаасовс ви состав т пава чу г що лсаа лат ЦУЄ тай свищ вщо етеру сг спдадевки випити ВВ авЕК де еще сти хи ко КАХ, ся примнІйЛИ Те Облік и пори и Мох Киця МЕМ п ІА 300 аВацівИав оди ри ки в яВ вкиедекиь во азів вовеєтечовп Жду десдпртио порцію в щі зузастнтиопад ово бповосбасгц баси лиу саван рН дже
БИ кріт юл сви В ов дидо Бач доц во яд до пед окаєпит спр лпівавпи сбевчгвоаса сватіплпвав Ббоазнвавосио їаовдаслвовз зсазестсдвав відаацтазе и гріха их в фор труси учи твту мир вро риб цею Ноги ви слрудю вел, лу ру
Зло ге я полку х. хіп тр о жоутльстохух УТ ворота нуту ли
ЗА пе Бех сп дигдтгльщш пльбтде Ву зуб дроздийі срощрпте м ВК Бу БОБ Кучтухд, зала бл гоп заанИини падати віза оща І ЛИУ то пато содх ее кезтрк ще льлой спі тК до рек во в вчив в ув тиксудьто дидтц
ХМ їсавї сла гад чиЧчищтою пологи ги сля гшсствца сдававааца
А паши іосзижітзітиріулівр о лрлевб су льоту лай о отрути во; ВОК В Бод ужив с стих б лусулрв ВО дп лу ужити тут пап орпоурилну сралиспримиитт Ми петля М КЕ зи має лапа и вп дип ше й пт де в сла прита вчи В В оличиритуя В вир в рр ку завистаавспо засо сасву стататаавї зессгостсо сг ссосо СтЧЯ соуси хр о попу ту о Коси онов; ДИВ вини и в умію У чу уз лруих и Во оилу мими уж изузулд учи ших БЕН й шоста Як ка Кок КЕТІ КНИ КАКО КК,
Ме ву вки екв адкии бич ва де виживе Ек цри тити киш ри вими ши АН с ї-е ке ій савшиши пса їх и и ДК Ки х Ми дя
Кап приховує ие руюв вити зе ВО ОВО оіхи во вжи Курт у фі ихик вин Ко дуети актуа нє фпіосащілттй Зло пшишцо Кс ит лісосік сени запо ниж оир сю о и стук Ко нори В у луф ужутив вузі ваертю Ж очи ще тс ЕЕ тестів осока Отто псплопипак скін ул ка пора иа
ЗО вчутчччОот спало вастосв зсососаажот стапочЧиало Кров са ставу ту
АКА слу а чиїй 5 «Вії» 815 ну я паж бе МА «вік Шисишщій пизі «РИ як 4 низ ч«здех ст нНша снах
МЛМ тя, ле сх цУ
ЖехА хо ки рих г хв; х
ІКТ т при кт стат жі и у их, не кекс якесь тут п ти ті В рт.
Худо Преомоторна послідо»вніств, ожриманиа З йева бВілез, подішнОшго пихи рдетц полів УЮТ КАТІ Рон СУ утризізнву я о турка вт цинЕЗпеалвиеаомУу СІлКУ ше СОСОК про жд гр її зеТУ Се Ши тА дере ев рр лу В сту, рід зл пу буде Во ль еру тьт іх
Вас ппплє срака осві манль сплата Мі жі ЗзсЧч ис лес хлу сх
Ви ди во хв щен Веди ев ще щу У уж щоб щредулі то лу сатлсавстик зззасацта ТсСачсавЕтик зграя воза Таїзсааа з'іссзачадж век вовну сзу ти доц Бан цу пухуоттю суферз ирих допо зт ирутльрикотьивиї ж сзсув див оц ммс синий сома Кк зані вжтв вбавгоасади сода зла яп
АБИ здадидігапае дадостат вия мг дагщате Каші ї пф гінді видри В сти засеапкуачиас ласо по напасес Сл слхцмиОЄ Зако чацпивя а лиХ «М сем ОКУ сі Вер позиріиих рум В КІЗ сзухсв др вити; ВЖК Кф кіп диавімх жтливсщоота пукозениасо сосна еспзеЗвациоь тота ТЗ и ре онлувлу дииВ ВКВоО Бвисцивиую их тусув в одуритрпо йо блутиещічсвозіхт супі вурців
Фред мою ел ша Є М. г Ки мА, Валуа 1 ша МС с В ІЙЛЯ У АН, ср
Б вередує ламали Кука лу ми ддевоатри любпрардьиє в тя при пасткта сдатістчата поззазосви гдтаатіоа зпзапипеайа свати о при вн ичичд В ОВ да ців пихи дув пік дю в жі МВВ вія дір цу чи
Вр Яга ше С отазакстайо зок ДО Пана Я нота у зо жо пф лючевщій суп здадещший перли чсси т хх дібзосплоши тальк т пори коси даїзув сова нсщя льулеяенк І Влпвосписна раль Ул статика ка
Я зорю тку ль ту сетуту кн пук о те вк вності ФЕВ о вчу з у утри и шує бсавто ча 3 ПІЧ ще жо сзуссссла савааавиВиа сх ри форере хутір лусуєт о плул.УВ и ту луйсхажи су й б сутрув ху, ОБОВ ОВ ОВ сх жов ут уз учи пули ВО ди ий прю их засув ввсосщщщцо ЗЕВС овчл бос пипокЩнмио што ку
ВЕС дати пет линтут суди ддв сети ВВ вичучтичи Вовк тк ик ззваАссозвасца аоаосгсослосвл севсвоваас чососсолес сис пох то опр в и Я у уд рив о сою вну рр з хі хе СУК фі еВ узи ие спасе є ве зо агсгор пес копа вжхсписавВе «сала ством га дово ж вою жа и ни о ЕНН не ва ин ее ї ши В СХ В шк я пог вла
Юі ким їх а киїі» ва сту их тзхдли тиші МИЛЕ ж фра иєт ху весен УМАНЬ ДИВА клинки «КУ долютья Я ди: галулі ті чада З ВКОа МАН Ка шт 1 1 За
ОшІш Аг аєТАТУ, елодеї ТЯ остеУЄУ МО почате Я те м учи учет вит ту отих тр ка зи пут й нути со Ох паперкн полі деовнасстть, стпимиана З ' гена білка, поОодусноУугао уроч інж р поросгутуттюзкихі БОЇ пече СІЙ річ що раї ех ПипЕЗпПЗлЬьиИшЕОомМУ ФАДКУ да СКУ В по «аг З вив вавткщшо фета и вжи век о шви вив дом фут вве вЕ пшЕКеКОоМа бссссиКЕ ссопссьКоо дет лствв гасосспасе солити п щи уко учучих в рих прі юю итуніжія учету рив и Во чити ВВ фа дивися вче п сспинос зросту сдоусоастак стає БКбзаттвов спосо 1 ярлик зи ри пестити ик сур о Вовоезереве при ф ик пуяю ту су уко всртре сіра тсяо запас полова век зАбстсовалола вало пиас 18
Зоо ссвз апа вавац 1цц ел 5 ки М шлю, Мк ке ки Ки: «пій» ДУК шо 0 ВЕ уз щира Вокігереж вах пк КОХ кипЧрі В ПОП ціх
«тр шоу му іадриі сихлізіи хи ДЯ. смаку сив 11Р,.11887 обу Тут жк фуги тут сивкиихи І н узи БУЯ пчяль В. оитбмет яти сопел те бул лих йпосліловніств КАБ, стримана зх гена біяжЖже Ко свитлапосКаинаучета ока тт тіки и ут іожзіжрииимі Мій. МАЛ учет, трузсУуюА ЗМУ: фс утри суку 3-Х ксопмплежмсуу Ммайламимрз пичпслиша ід, пе мстить промсигпся:, пУнКМіСсвашьНО в пері пу с реа их у Ід ту гасу кіт, ре с пов'язвзавий з б'е-кінцем свомо нативневсУ Фідепва
Я 1 перев сціоу суікіув види ВВА ВК жна ци оз д фу тіКввоеваци
Васюта рути о сх пази али Ех вп 'пвлтушинтчиас шо пере ка катсввттлили гллпас КлУках слу пт слх пзасіавидиши жадає чих Сита Живим ил расу пЗзЗзопязацицпи жити льо 128 призи Во водщщкнк ві бесмуацеицу дещо ки кує са феєди р до дик кі влас Кая, ші ех сштавлцчняу женні ав с гаа цу 180 жу уки ще вив и фо єв в ощово вом щодо пилу и прі фо ух сину вок вих стазачєавнтас зЕзосгивеи гестоз звізикива златсашвив пополсвкє би у о ев овуяенучнЯ о учижиу фор о ре р и чеіівуч с супу ититив п изимльрпоцік вхо фу пи сс сслх ода салег опт воза ая ссоасатоми Ес озавсас зей рф гулісілу в ущ ВВиєухсх фони ОВО оту туру туво фол лук в ж су фбсзерді в род; вок ухилу рр
У г ММ ли ї ш ї шли о гесщащї Кі ши ЗЛАКИ Е шко А ла)ктекддиц сецопорюв лув л, япвадвввеВ о пики тиильт вади ви сирки звітсктазвоса т щас вт ї плоть Ззасосочнє хатою оо могу йо таці в вв адиди Бе сесвщитеєтищи пиззЗадлстиш львова пе Зола сальто х ФО ЗщхМмЬи хр Ссвхохихпа ваза шолти ско хм пхріфНсца
СН терен к окис жита во дере к ин Вуаля воувкщльштьсь о со оздатув в и сСеазочІсчи това ас чоу сова авиня пси зтуавтутцу ща сітвф ух туруюв ов блулутутосвумію й фу ринв ву юа вЯ ухірихт в ВоНачитво леву ую сь гтух ччплизаскноеа соц отатих боти пкоакс час своиани ЧК ул их вис подив вив Б тре грот прясти ее вел тре ль с Кеті е дуфк ворутеттую вівпухатав злак Гасатаввопа собпацссай ВІЇ патавн света форте учити В врвирвони ьо ери тим зсув Воосе сиру вх у фо еху в кв санвуховутм пп пекпег перли схочня тари паст сну ІКТ їв дере псувиаввидвдо ввоецучч іч Ка диричи див В вКекетки МВ е вві х пгчсттіа саслолеовва босзспісх соввайсовс Квіт спіа ПЕК Ко "во
Фея фен НЯ и и ву тут отв в ур оцрлуфв о лрльфолруєтує оці сзі сіли в ви дров Я поко ппоК стбстатаєв своп павс вавабвуниввія віЗзаЗспееБое аа. пи и - яд п оту рр прово фичуч в ух ви р ОО ВОВ Ов ововоунн ноя пе уфй и и т и пи що щи ль засл зЕа гачка дллоусвосЗсв Кто сг сагтазссав сзасаове зо ав о сві вв воро ристик ов сф ууучсірвивцирцо Ви ву юр сиру ог ц ши США шив Ка час їв шо опипозапавНня ке Бон вах спа шиись я порт, кл У ввів ве цувкуєулЬк о Вивчити пекло лу кл аизалпатов соді п со азчставтв спала Згори ша пава ацає ти
Ат ки ифумсцім и вух ви ново ичирво уми и и Ю ел ирсерир ци лі Клум Кужух Мо ліси тАпшНуе их КІ ОТО м КК рани ххх. фвептпидасчасят Са тува лапа пл орви потр цк оч Ку унизу их ут дур ви прис щк юовсве вух усу вид ". ЕМ АКА еВ ях ще ЧІМ за елкзк3 З рон З Спр МИ кої ваг ем тай
ОА р В ОВО ВО ие оч свок ост фору вивів КО БОБ тиру чу пси ру ВОК уч уки апттнкикакк спбосвасвоа сзалопкаст сСессдоісв сзоваптацо ППО 1200 пе: ва вади ем ав ц у кв па фев цу судак тлу, асатсадіск ЗзБазсгтесбо сазотатоосв осзЕстоВисо паблплсзов озпозаве сх от хо пупрере єю пуп суфууувосуцвви Брут ою узучучеуучуу и: лік ур фу из вити али попу Кос Бади Фіат слслопазвацзи варила Мої Тиса тот
АТМ кдд кт сфера Веди вве щи вті щодо фосвУж в ув ит пвостатво віза тега дионк ТІ В Ку їазксОсдввЕ базі сЗ -Зра нвеки агави ух щитові пе вуздов орто ач оо сарі Б уздучичичщо борту В Костя саплквпагас аБістввВі далися пащо яп чЧептщеу В Заепоашкмм помити : сит чу актори стара вк пуд Королю пк кими зіїадва ши засо тях частою звапЕноКАс сова вов пос ки пререзлусівсцу в пуп сусудуіуви і фо кою в онім уч ис гртрих или оц трі Іви сухі іт личсу цих
Вест днецулих вав Ва т Е ФоспНІіі св о спозазонос савсссжа спппоспааЦе
АТО кто панкнк стстєвань тпЗзпапвосс валося чибозоврс зсспттпклова за
Бо ад'дісттади сащичлдикрі ши вісФеєдотстлвд аздегевлисда в дтТдлетд ддтщетщид затасшстіззо сзвссзоаво датчсвисоз сзопчосхсда вававосоаос засво снои алла мо тедрибьсу в пре опе сте ин ців о ее п,рь пт вої скф Б речи паркуру фра сани вух сачаватнова зчссічччааК ссасвівств Ви овосасс пнів посла вОогиц
ТАТ чия
Беармидба вок и т осви пи ку вари В иитщутитів ут саги тег ди пьщи вус чОапнолічаосо пост япши ле шу Ке сити Б їж виш р 18 друтуичия В виводу в ууй ний види пово чали сти В ВУ дит ие оце гр литі,
Ватт ох Кк хуя І Е са сусту во пис ї сх З си ме иа ким хе Мом МИ сті Т пу ус акт
Маки сур ук зу дв рт ери я тів ХЛ ПОЯСИ «и 117 ії яв зе В ау ит г трущУ живо ми оно киш хясчии іоутаихтрву сили ЖИМ ЦІ ППО І ів ех клю стю дідо пд плеют
ЗлудуК вва авЗНнаКлх
Я т гів ох Кі АТ «ПИ Мох Пеосросевосвнв езстліповніть, суримщнищ с уезад о бВіпвщ Ко «ши пав еКорив втома На, Ср по х»ВвО Сула Юх шипи и НІ о си тлригіии і и квт ібуюу и у кОомспнлекои млі ласо писали А у я
Ох я пу о и су ему и мивиних ох ою Яр ифсулійліил;о пепуучим тую ср ожмівівіві их і ри азсвчкайлта пучки Коли Ккал сра Фа лих ЗКд;а саплпехацо
БО зЗгсвзс т гзосдоплипд Баоапсїїзіїцп йпвабайадтс садова длпавадийде 3 ЕК КІ Си тику хи И ЄЕС рег! тчехпріи Кі А і т «ЛІЯ ло зосзачпатчио Савассила їплоавапцач дсадталтктч саічалокила ваша, їв ту луй ріикия бу кв ці фест и вив ун це щу фс збу дн дру хвватанцю щу ил г її г жопа мк Фата ра ув Бевстст ПЕ ша же
Фари чи дідів зді стщя відвддІіміийпдщд сива ийдо в нидащк до плиту мч ин роль ме еісиал «моли вой ОМ ЦреКХ 30 сироті пт турок сну я сур се о я я мя Я Е фетру ту ноя оч 2 ки у ит тео зізазЗщвх СС свзодкв газ чЕВо тізваткова зга Сбуссволаєе
БИ закЕстнася ГФадаттака гас сЕсЕс датоттазас візвЕсоссо восбуолтво ази ваза авня о це лриуцучдує мот ел вини ал пубєцоп ль туту и ув спра річ см ль созасатаста агтовснття їстастесадл од чЧаичасва аввУуаавз га а ворс х Е алу
Зо спр вт мав дді ді шиттю дич Ба дадлеки о КОБи взаадитї зпеддцдщівтт шаль входів пика нпаЗиоНе пове пхати сом пе па ерерб цу юю сезону мон ДВ сце т вагах зчсзасое счазайадак Боско засн сасзггсозз астасвіво щ.ю зу суті іниріих м вою очну сту В ки ту в тр стуихихсті о и ие мет Я Я я и нон НЯ и уж их зізвоаикЧкпя роза бзоЗалавоса селу лтва из аапЕ пафосу еко я оту тки фор кр ст феод джу зу тро в ту и уми и и й ж сирих ит тааскцесво ско сК Слаластаяавя свопстсзсач ссавці свке секти то явори В і. зву низь В уз іі су сууризиєцимко дра узі невірних пт сіш кв свліслисаря осві соввоссаси во пп когоспкиоС ст свзасакв запис зЗас лабвааїзват зізапасосот водо, ває залисптивнна зак вососпоивоВво КЕКВ савбпопеса слесті вла по -і вона вв о урвоцадурюаоююої гулі виводив б узуч до ери нев а вв о доічач оці що істота агат спаластваза гоаосзвіпида осв Таб ов чув зас щретуротротту ту ухотимоу Но рних золу ж лю: фу суї ирихилуртих цк углуту пу фу ІМ і иклукі іх прцлювлюасатвих ЗІ го Ех перси во буяє Сас вужі зада почувати іп кю мрію титри ворс мив росу тися ужстистя фотрірлі рою тки г суихи й коЗдпзасско логи пдзооскосо авоспасвосЗ пузавосссаа сосок. імп
ІЛ иХВЯ. брусу косу пиво крб Бу селувюк чию субиуухитии в опо щих оц пусту: и из цу др єбу ци ел застала ФКгсусщохиа воли ровн бу вола но вени ти та дети то ВЕ пок ддикт бдадтия от БЕЕсСТІКосй свсщат тв КК КЕ) піехмем ки МІит иО З МР ти лу мих БОЖІ з мА СА АВК А ХК де жан притпре сю ую ою УК ому рих феєю юю ІМ уз КІНО ОКОКо схлу оч ож умі: стук види вет пази по се киком папки ча сифон е ОК їхой плюр спульи а СОТ ок е хх Гоасо пк. чеки Ми хихиУціліхічі пр ПІВ ши Та кя вх а ю і 53 ас
Воно лу ти жук Вон дюн ФК уж их тус Корі лу антуріум ую ит капопакасс вага еловата пплаапиаж готов зпапсадакг баса зва сту суч ирі дує дб кун щу о ту видов оддо да вінців во сус В сх ичичиєщо Би оці ша и ВК пЕпевиищ аксон цс жвастх вд ї свисосв сг фло лав
Вл
Щорс В реуя 2 с й ия ер ру В вуж сусутв ов опрвовояцво срволупульноужтьучттх оф ужечтві ворів
Ввига хи К вати пора сраки Ваз пплаии сролюалоуи скит
Ел я сети пли ту Фо фо уч вико ково вони их и упра пз им СИ ит их бу рив зУуслзичоши вдаЯвиш Ед шоу птІзвавскос сззвоссовчщати СОЇ тва яций
Аз
Фони в о фев Во фути В вини и фке виду В ви ту и в и иту кхшичпсш и СС ЕК чи чосо ода МОХУ тТсвасаКегс доти 189 дала вади ципи к сл инктии шпКррил сутріугіиєучи пи сп вущ кл, зав тацсИ сао о ва ссатоса сасчЧсщома вЧзавпсово щує 1680 кіпутщосвсв ов івсв о ухухі фо иїкзир ци; о дель освужйосх освібі ууспрузичтитих о проц освовуств ф гео бтжих і я пря і лах пе ма рк ри сьо ю пиття ХОМ КК п ЇВ лих Ех ш. піт 1740
Кузик доведи в доки аку М чук дити и ци Мор жди вва
Ясно застувсвах воску АК тато ше кис ачатосутьиавк я
ОА Є Ем гурту туихи хі В мив прю я |и Я усу ін июрофияч лій п, чити завсскипис аспек свинки вас їевл7 в пл й т хе МИХ хх тла А хі А А их я тре
Ми днк «ле Миміїс да бТбкимхат о 1 га
А ММ КслНуЄЮ САТ КО «ПУ шві Я пило гово м кю Інша зва а сх стату г х ща
Холл хи неп посту ви З пев) спец тезу Фі вит А учи я оту пляілу віття «ил заАдДвовна посплудеошність, стпимоаноО З о гона біяка вл спітспопоглинаквасюют піка ст дея Ми кити Коюадтичи я комплексу Мебїсзоаро пгзпсаєлів дл ях те Є рю ох ик аг Вод одо сисує т що іх ть гу тюівух їддид гофри ух адтегои їх хисефкухити мі ту КОКО ХАТА ТЯ ІА СИХ окжюа ук си Ат МО ЛИЗАТИ и о «ар Сх и Кт в тю сад теж І ах
Ст цНк сту Мем фідера Ко пі Меійісзнщо Сто пувіміа сур тю Я офі чит тут хай жвНщА озвака «лих 11,54 я лух тиме із ірі кни шОЖЕ кИпуИИМАІІІУ со гУЦ пути МотУУМ У М дети пох послідовні ске БМЖ, «спгримаца З о гОова пепетедника хлоропласти пеоквосвистеми 015 Мекісвл» їховосвтОаЗза, Мк омастищь промотор, шУнкиховинЕВУ пов'ядаздий с 5'-кінпоем свого нативної піде ав лЛІМЯНИУХ ОО Мав сБОКО дано АВ дк ях
Іри НЯ
Зеров ща вія М ера дви ав івивв пигтве ти
У Евитич я Ж Х «п Вл причи уст пап лІье в С з З Б Те : ау 53 ші їі дтриК око вижити в ких дотак прин (ве и вих сук Кути и утри вс ов од засггакгаКе всіссвЕвкс зоузизацео пасті свсоїе созссаоавия тїаваслтазата я зу
Ак гафаддодиьл о кепцрвиюй ин Нв онурияю о ужплувіуіи в ос с33 вира вити еВ Юа ух каїпвд Зк ен сраиК СхоВх, нежеиики Я Фавор їх Че КЕ Кор ах
Фриз сварити призу льпук єм в умов сен во Кік тив О Во онермдоовов ох сплави втшо виз опском сетадатттств о вавоиспакоскиг бебасовлкк плода пика чаї ша тпрерщрк сь пдв заддлитви да аЇ вгадеимицде о дев вакиу пд нАягивИи печену папи зЗЗаЗиа Ко хвата в їзалопаай ачеггагтщт зва копис мл сзсазаВЗие беасвтозолос спас вести из г па аву, : 2 з 25О пуф дрримт три у ре уегри пут ту лу гтичиити их тр рутини Вико сур В В ори р у ин иу т: зваїтавасавои сзсаазовІв щорлоссопсваЗ заосуатітї вав акоЗ зе сщкх зе хм спектри ви Ваги ви др ую свй ож Буудіудо лідери. ВБорар ст фр ху тихих дрезеченх, щісрусзаїтва співи чаКо апагсотіїна позопакласчи гак ЕКЗ ро аІ М ей сх цех ле они ису В Во я вч ву уцінка сети М фо чити тозозаадсочсо Ссостовікк из сбдіслевтви зиЕсвИшоКо спасти то а пут п ирпоих Бор злюттьком сулуи коди во ибецієцпу ють у вдихи ВВ прльсх звптавхшз ах хм Ки у Кит Її. ТОСТИ ати ші У пу н Я УА ТУ г М о щеале що й «р тд о А «115 ча яю ючи зх кож ха нт чит
ТТ я Млехиі почат бут мул і «ій Медйісзуз стипсаїція «а хх я ЕншА ознака тут тлх «што
Худ у не Ух мит пЕОМмМОотОорна послудсжниость, сбкгриманв о впогеящ попоОеудаика : - пе хи : 2313 спр прахом луух ІД уз те УКАТЯ Ко Мічгії сито Вул хлоропластів фоеластеви ТЕ Мейфтадо Схвпсатиія ст 74
ІДИ а сте пп деспва шпак то кп пабо бУгсозвсвва запаски
БИ шорт ощв у М пз как пот ду ; - : дон що В рчвинті : да рик ва КМ вену кари дав дет сх туєтеєв и ди ви чи пт завади засво астссзоако зузізааосо засстіовотс созісзЗчеоі заазвзсадаєа 12
А варфарин вуж у В НН они ут ку В о ВО вот ви ЦВК ЮК фе ие іх сайпваека сват сві КК Фев ЗОЗ Вип ії тп
ЯМ тдадастдквЕ Бзсасгнит вста дглви в сода ваг дглдивЕ век очруюь их саазвасакк гзсазсзсссва дтставакоковз азоті гаїв овоКЕ солод
ЗА
ОБО срерпрь речі В аг аддлдиви шапка задо дц дит утиаВ ядениякиввИи щіль пиши Кс огавцпатвкв візи оссаи Ве СсоЩедивет срака риео
Зо форуму В ВОЮ Кок дру ич в ититих рифи НВ МО сутуєю ув и В В ОБ В Кор и В у усу кл уч ів паса Стаса, «ЧІ фени ас тии КОВО сів овабтсасніт прик по адек лм же туту сверизит етику лу ту жук приді вии сд дре иттух заткавнопаас сабсадтвов п римимхиМщиа даттастксх зусаккакКксов астпоасктлаво а г зе гц ве ща іє загнав до куєцієькльми Казка дви вичинки ко шити ою ба ОО со вуівузапивн стано па пшрув Бод шк ль по
ВИ деуолрету ться фон ОО фрфеяу в еру оту рози рів щу Щури и ВО туту Кот итития ссання опо Бу Га порах ТВ. ткссвоиВве вів совок соо са
ТЕО вона т х чцо «пр 18
Я хх до
З ЗА туту пд уд РЕ т зх капи руси в клта и тьву:1 п МО шен Пл гол ларі екв атлюту я їни сусвлу ах бе АТ інша саизЕх
ФСИСВчи НН 47 зодоя «їй, туту пе пет тій супе сти севтямалащ що тара попаепепимид
Же МЬДеВня посліІшдовниУоюв, сТОИиМчНа З пека попепедникх гоп му при дип спе типи то Мем и дутеу Бо рвуркут вію: хУлашоглахуєв широ систиМми її МедЗісд чо пилок «дама - щ «ах ал претендує прин ту В віх вози зд вишита рю сере Масть оо ха 4 я дум «Е
ОМ 15 слАії» ТМ
УП м пак ик ДАК ух Мини тиж утіх их ти кі» Мейісвалао пІвпсвсція шт ою ки КК
Ул Я аюриі сжуівлх буди т лпщи смаки ди 2 расу
Хе жхі ки хі ра ті шу зі о щі : щі ще
Йо А ори доці тб поря ля зт вщ с ти д гул тидо вх «шкі» Ениансвриа послійпсзвнІсть, отримана З гева біли ре світнпопорливаютчато жшЖомпекосу Мейлодосг типо цій - ар иеию р Жов пірутА их бита м МД А В т пп «к сао о тиж італ ие ре и, вод Квас зер жи сут фр; яті ВІ р и т зро пасФффррль ро тро хаті а п Ялта пар Кт що КИ МИ ВІВОЯ
ВО тк орит т т Ебола тсти гдласива пдагтикщіць ставі ддптаді дгдцодіщеллн зас Екак Евссвассоащ Газласоога сзасчезЗзочо сазвзівзаовай зуааваацлл
За плив ння во фаза ниви о Бибвоєціюв тх сзузсі р у о иец вусі су ори вель вяєУ базами ге пав о веаапатЕте «заіїху лох ва з штук ї5О тс карти Как де о втреуєк цю кчк сутаквкапи циклові ту иави вки гозазкщатоас абавсогаае ч Бас пвіапобазво чес тв СЗШ Мі «ут «ІЛ пи уми чужу ово лрвОо ролу из жі сф су сзифририти литі о из пулу ус фрж офсет сли соусст сзаБаквалек чості зізавапспаа «ссаайацщісва біевзатно о щем Ева деиедви Берг лу зтедаввиди пет ка нед иців зав ища Сто вове ц и вва ства хо КО їв ссосовков зе гра вою зртяиі Воиелу со ог су кр фр МО лу им тк тя свт пф туриноо фо дві мно олу ню ще ую я люту ут занпкинавосй фсалпашк аа парні даптттадиає зладпгиспс в ДУПИ В а :засантатта вагон, 1 їпавупосяая в чив дабидіІна яд а утьиху зо во пелуслудетьуф лей геть уз З решті вовну ф о пюружучтн феЗегусіярірц вро феодева рію о стік вит палети ма порвали лип тла КВ чани оон сла тай
ТЕ пред ми паза вив ви врк кі ЕВ узщищккктик рова тує
Засн са гслазаталвї Готстесаую ЗО ЕВЕВ сс зв астасдізипу
ПО діда ьай вва дод дийа есте вела щи ев вивих позах свзозЗзовассв поси вттва Бо Чзсннос сло са пох щас
Кларк ди ик вик ке селери ло й прю рус соту суивву и ви и вкриті свасуадссво соц ї їблавАпапьдаз сазчсКсСльошу бувати спосте сети
М стати пзиспплосдкжя босаєсчкак пизавассе баса пили "ву и вив жк ддуєа вдо вдиккчкУВк ав задав о пе гички вка пото Ео ссссавсака гзагосттаз авсзвааказ?ї зозЗоач сто атасякиєх, рай зчипипака рух ОКвоасоппосдомиЕ МЕТ хай спас па ес
З В о в з в: запо
Кв сук еавЇ гктуєтя пою вику т лулиту Ми КА ЯоВО рферролит в тт ше че пса сазчасеіввац коса сопилх Те всткаК я чувати ги зо пера Кожух КОВО ОН ОВО ри: В дич віти фу до ериєдері РВК в ужівсптвсу:у ступу тітці прадлюауіщо Зм Е У г пану ЗМОВ г если Здав я пай
КО косзазассі Есе стз дастоокоге дабстацасв ппзаасточа песо. гу запив днои чт ві ло дидппспгпапйо саше зсивзаплопи щдісщивсв зас енано србссовх хи халепа ль браловтсраттот сб ас лосі я дт
Не ет ветавв ов угри щиті веж гав Бекон сід вгвдиш ж жерк от вс:їтостевЕс стос ах ЄзвапбзктасЕ состсчагса сатавсівзац сте ярих лу С м пачок лу о уж сві и рих при еВ уч унів Он ВВОВоО фуру іх в гжиуичсу п ви всеовстнву ле сало ос сечових ста сапки чо ствла плпосаавпгсьн я ди ря ля коли УЖ В ри я у До зорту ри коси уміти ужити свс св серрлілую у с ве чим Я жи паси о їх ВАТУ тип о пззаащипос сот бала за заз ш абсестде ак. оо як дк
Ки в влив еректильна рів оп в Ки ит паптошатни ЗОМ їв ства яи г СЕУ са ро пох з ап я пе ос оф свух с фо оібезоцрафлуво рив фо іхсх зу отуечлулу в вол; ру о фею учужуттх вол еяяві вових шафки Зх косвайщи саше викона ктвя пат атоисв пиши гао тиді зали сус оч фол оновила аж уж сту в ср вводу лутчижів ту ків кон щастю бак пещ рати житхххо зезпткакнклг «ропи лавин яопету
Бу згроедеюцит и давдпдгтигри евкдквккккоссь ут дддигам прут ельовиї су дод и сщ ол аа св кам, КЕ Мо м мисом лагами «сс оплинут сит шо
АЛ птскакакнкт «статеве раз пЗзипасосв вас кя чпбсзвосаКкс всежлстсства 1520 дви в лади цито сливи вити г М роту уерсут дит ви ЗМ 5 Бк затсастставо оззосачвос вастуслсатссвз сзічцсовсдяа зчапасосвос ззозсозшея оди оо сехущиулуИю уяв уж З изизитірліво ийзитлр му и в про юю фоузсвузихлуєтих о при; опоцоут ії ож ижстуи они
Сас лідер охфхзкіісЬ Кк и І Аа Хот МоКо піп г чу о їз и реко тат
А коду Кота ие засув и див пак в рк ра В ом утсичут ух рю скоринку ту их ух ппдсвивисс пасти асо в Мис тшисш пово сосщ Ве
Су
ВКМ: «віп 17 шля гра ою МА у вс пак чвійт ДНК шлю су Трієст утттд У ку КАТ штучхнд штютюгух зате я «Вал» Копдевуча доня хУвиість плин бепраесспюмутнзнійдім С пік: касі узі тедЕ КК ел УВиа пошжллаашНнать ДИН Села осДюЮКуУ НАВИ МО у КО МаАБиЮЧЬ пЕнзіасованит пабИКнимМ хапй» 17 дере ктрки с Кук вер вдих ки ит и и а У, НН акопкосессо сіасвовзаво сосзассос бддавісвазва ззоподасос спо патз яву
Пп воду вучвитих щпрбозуруччлтоуть азни ьо упр луєстиивов о сут фетр попі сетер косу пюгу лита та и фустльищ ла чес та її апа соч тЗв
ФСбафречесому лагів пек сис снуєстит пп ддІлраєо варто схв плпопидидне
Зате с ли: запи пси свист писана зрост ппосвопапашо і9у метра и му ки чеку ир их и в са квк иу жо к кури тихе сг и Всю цими су сут фути тека содетувнсох сталося состав поз чиосства дорос шаг тзизузижтуиричи во Бик ічи Я схо обу ріитричи (вени риф пуучиуитик ство пев рі ацосзоасозсв сус іт соакчос чЧровобевх зодасавнцк чо спа зас прі) их сзитет а ди Бу Бору стер иититих В оре цур у фору сит итити во ик у оцту заїсвзлазво зичу гстацлпсапе гЗзбзотесАХ Сблзазвасооа пчисвуФшл
ОО оцю ув овіж узучеруеуикі сце Бр пив вію В у вирив них Врач вою чів скін сувсувої ц шльЬч ло хх Орів Е Чинсерсникт скло пс оув ї втавсхавквта ап кодорк ов од купую воскову оз водо дкофлуві Фут ов вом В Кв окр пуф сварок в зззопасво ва шви сЗзвИЩНасшиий Со ссиаикяХ сс гсвив діода у. й дк ви вав ва воло чрицорю тт Кеди джур в авЕвевпа важ щаелутщии чхаптуатата Яся Ех зиаАплт печу па вх оква били 340 вал: сур щоці Беата деещо ечтерв вето гуппі ри са слав ої зчзповадак БО свое пиво чпа пев спо ГЗК Кий Іа МОЗМ
Я ярі сутички ут ую жу В один дір пси січе пози пи пір вастопвуєт властивос чості пишчвеевисе асо иоті спазвазаванУ ав стрерт т дет тис В ВОВО и ул кду печити З итирильгео зви сачіствсиї ксстаплайши согізавсуві зссопаавиосс зрос сто вапапсппилидао пи
ЗОВНІ ВОНИ у їх запвсаавпако чоссчіоола попа ва плац шли тай го прути ж вгрверщив с (зествірит сте муч щія секс ввели Ек Биддктет аватстсвдтастох спо чассо зстазлецасо осозассчооз асистанс повасиЧсте
Зла ау м и Ниви ши Ж о сяк уи ви наст вас пч Горослрв опа дез я чле ія лива др тло тросу озеру «и аж сим их жк жі тир ху ту Во ую свв км ри и ум пусти Мох аансосмриеос бспоалтставстс Фаза КАТ сттатоЯ засипав слоти о зассацасау я корки ії ше дити и ри ит ері титри и и тири роя зипссвиааовУ яку дело спосте са рів сви таза мс сини ин и и Ки НН нн НН ччслаасава гоесучастав сстатаавого пс вооа стадо пес ах ово хоп тити тт 3. Зою дити тя т триє ле сту Яоулучтої тусуєтчи і ирих ит уч и учи тату и им им ту ОВ лу склу м лемури рр ЩЕ в «рило песросровом сливу лай и кофе тилу керу С Вуж их жи и йти р пф тик ВО щу ви тю скуч чи в в лу ри тиху лиж рити зізчзекчаче фот СпсспвоснЄ вешроеивих зооссБодоєс Бод лиум зла 1200 веди вий т пір руль стевія ат верю крую ву ер ин шоу воипоапо сус крилух її запит ТК постася вас КЕ ше шУсеЧчУх
ТБ прпрретюєи ви орезизиз дб Берир СБ учирвсвітжю ту дере струсу соду диссл ії вчасне бос ббпзасласе сиульвлихиитлу рицини тя акт ки КА перли весен Бест смащи бас дод спати сег тдлс чзУчсчУсоа оз ввас поза сщииу паті асївио сус ср ацту
ГИ спла зосаащчи одсмульпсилнит сорти по депутат сезон Фест ух 1434 скит ери геї т іттроггідгь ту покурити уретри ль луги ря рик ри тстлчсавлоако сві аса БІллосгдопа сп сЧчавАо савстосу ва зосто аку та
КУСО деле сс Бозоссснн сад адші ЕБогоасмідент стсдсвисий бдоспаолсво лук тла тами ника ПМП спо улпюти Пемм гК ок
Мови прави кут ки тини и році т МУК дич рев церк нити пустих учи я зЗагстсотівз аіассаБт сстоезавсоте свісасаоак пого ссв аавазацотах тот ен пиччнавкмя сивих пло налоувткх. Я Ура ся «РН села ХИТ. ще; 168 водорості где в стр кто и щодо р ди тваслаатьв гоезгсозосзва вувсапеато зЗзасзвсчсаАа созостаса сосВвочощое 1740 вссласає здоазапаваці зпабсвоасяЕ Зевса споас вас свесов сопосоаипих ї500 рве трюк у теру и ие учи ВО зорі липу Віритп во вазу ферит лрич и т ча чсУсса сорому сусло тд члаавик косого ке 5 пейвосшсос іп палетки пусаоЗелоч сеча стиво авваапчаахок Бозстсстла сосповавоос
1920 вафісучио стопа доска пове цев Базі ст повазвасоц сзвосвапсн сросвавасвако в
2гсх
«ай» 18
«вір» ДНК єї? боввуріме Бахоаценвзо хай» о фжща савака
«дам Псослідоввість З'еєНТО, отримева зв огена ББ оселчуюаьма вакеваскате
«ап» 15 кзвісвосто Созовсаозка БбобсотствсвУж застати оа со слезла асаєствався т завсзациво Течії ваі виішалочанаа часі дпвіхваккня рес тлуюих
120 ставсваїбсва зсізазастЕК бабссаїтаз Зиокпчодев бавссшевко пово кове
189 тЕтскЕтАКЄ жТсосавсптав зозтацісо сопе го зазкустава За апау ра валиівпласке ЕКС сотозЕкогЕ КЕсСсвллі з'совсвочащ пеКроерюцьва
300 заведе вові

Claims (17)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Рекомбінантна молекула ДНК для ініціації транскрипції гетерологічної полінуклеотидної молекули, що транскрибується, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи, що складається 3: а) послідовності з щонайменше 95-відсотковою ідентичністю послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 1 або г; р) послідовності, що містить хЕО ІЮО МО: 1 або 2; і с) фрагмента, що містить щонайменше 150 суміжних нуклеотидів в ЗЕО ІЮ МО: 1 або 2, причому зазначений фрагмент має активність, що регулює гени; при цьому зазначена послідовність функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК.
2. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що зазначена послідовність має щонайменше 97-відсоткову ідентичність послідовності з послідовністю ДНК 5ЕО ІЮ МО: 1 або 2.
3. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 2, яка відрізняється тим, що зазначена послідовність має щонайменше 99-відсоткову ідентичність послідовності з послідовністю ДНК 5ЕО ІЮ МО: 1 або 2.
4. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 3, яка відрізняється тим, що зазначена послідовність містить послідовність ДНК ЗЕО ІЮО МО: 1 або 2.
5. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що зазначена послідовність ДНК має активність, що регулює гени.
6. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що зазначена гетерологічна транскрибована молекула ДНК містить ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії.
7. Рекомбінантна молекула ДНК за п. б, яка відрізняється тим, що зазначений ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії обумовлює несприйнятливість рослин до гербіцидів.
8. Рекомбінантна молекула ДНК за п. б, яка відрізняється тим, що зазначений ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії, обумовлює стійкість рослин до шкідників.
9. Трансгенна рослинна клітина, яка здатна ініціювати транскрипцію гетерологічної полінуклеотидної молекули, що транскрибується, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка містить послідовність, вибрану з групи, що складається з: а) послідовності з щонайменше 95-відсотковою ідентичністю послідовності з зЗЕО ІЮ МО: 1 або 2; р) послідовності, що містить 5ЕО ІО МО: 1 або 2; і с) фрагмента, що містить щонайменше 150 суміжних нуклеотидів в ЗЕО ІЮ МО: 1 або 2, причому зазначений фрагмент має активність, що регулює гени; при цьому зазначена послідовність функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК.
10. Трансгенна рослинна клітина за п. 9, яка відрізняється тим, що зазначена трансгенна рослинна клітина являє собою клітину однодольної рослини.
11. Трансгенна рослинна клітина за п. 9, яка відрізняється тим, що зазначена трансгенна рослинна клітина являє собою клітину дводольної рослини.
12. Трансгенна рослина або її частина, що здатна ініціювати транскрипцію гетерологічної полінуклеотидної молекули, що транскрибується, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК за п.
1.
13. Рослина-нащадок трансгенної рослини за п. 12 або її частина, причому зазначена рослина- нащадок або її частина містить зазначену рекомбінантну молекулу ДНК.
14. Трансгенна насінина для продукування рослини, яка здатна індукувати транскрипцію гетерологічної полінуклеотидної молекули, що транскрибується, причому зазначена насінина містить рекомбінантну молекулу ДНК за п. 1.
15. Спосіб одержання продукту споживання, який включає одержання трансгенної рослини або її частини за п. 12 й одержання з неї зазначеного продукту споживання.
16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що зазначений продукт споживання являє собою білковий концентрат, білковий ізолят, зерно, крохмаль, насіння, шрот, борошно, біомасу або олію насіння.
17. Спосіб експресії транскрибованої молекули ДНК, який включає одержання трансгенної рослини за п. 12 і культивування рослини з експресією зазначеної транскрибованої ДНК.
UAA201810103A 2016-03-11 2017-03-08 Регуляторний елемент рослин і його застосування UA126792C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662306790P 2016-03-11 2016-03-11
PCT/US2017/021310 WO2017156091A1 (en) 2016-03-11 2017-03-08 Plant regulatory elements and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126792C2 true UA126792C2 (uk) 2023-02-08

Family

ID=59786181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201810103A UA126792C2 (uk) 2016-03-11 2017-03-08 Регуляторний елемент рослин і його застосування

Country Status (27)

Country Link
US (5) US10443066B2 (uk)
EP (2) EP3988661A1 (uk)
JP (3) JP7123803B2 (uk)
KR (3) KR102633642B1 (uk)
CN (3) CN114807170A (uk)
AR (4) AR107868A1 (uk)
AU (1) AU2017229608B2 (uk)
BR (5) BR112018001122B1 (uk)
CA (1) CA2960502A1 (uk)
CL (4) CL2018002597A1 (uk)
CO (1) CO2018010900A2 (uk)
CR (3) CR20220378A (uk)
EA (1) EA039403B1 (uk)
ES (1) ES2900300T3 (uk)
IL (3) IL261507A (uk)
MX (2) MX2020011519A (uk)
NI (1) NI201800087A (uk)
NZ (1) NZ745763A (uk)
PE (1) PE20190125A1 (uk)
PH (1) PH12018501939A1 (uk)
PT (1) PT3426788T (uk)
SG (5) SG10202006261YA (uk)
SV (1) SV2018005741A (uk)
UA (1) UA126792C2 (uk)
UY (1) UY37151A (uk)
WO (1) WO2017156091A1 (uk)
ZA (1) ZA201805832B (uk)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10202006261YA (en) 2016-03-11 2020-08-28 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
US11377662B2 (en) 2018-01-10 2022-07-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Agrobacterium-mediated and particle bombardment transformation method for cowpea and dry bean meristem explants
CN114395022B (zh) * 2022-01-27 2023-06-13 河南农业大学 苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11及应用

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU588557B2 (en) 1984-12-10 1989-09-21 Monsanto Company Insertion of the bacillus thuringiensis crystal protein gene into plant-colonizing microorganisms and their use
US6774283B1 (en) 1985-07-29 2004-08-10 Calgene Llc Molecular farming
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
TR27832A (tr) 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US5229114A (en) 1987-08-20 1993-07-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants
DE68918494T2 (de) 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
BR9007159A (pt) * 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5689041A (en) 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
US6426447B1 (en) 1990-11-14 2002-07-30 Monsanto Technology Llc Plant seed oils
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
US5969214A (en) 1990-06-11 1999-10-19 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
EP0536293B1 (en) 1990-06-18 2002-01-30 Monsanto Technology LLC Increased starch content in plants
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
AU655197B2 (en) 1990-06-25 1994-12-08 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant plants
USRE38446E1 (en) 1990-07-20 2004-02-24 Calgene, Llc. Sucrose phosphate synthase (SPS), its process for preparation its cDNA, and utilization of cDNA to modify the expression of SPS in plant cells
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5512466A (en) 1990-12-26 1996-04-30 Monsanto Company Control of fruit ripening and senescence in plants
US5304730A (en) 1991-09-03 1994-04-19 Monsanto Company Virus resistant plants and method therefore
US5763245A (en) 1991-09-23 1998-06-09 Monsanto Company Method of controlling insects
US6015940A (en) 1992-04-07 2000-01-18 Monsanto Company Virus resistant potato plants
US5850023A (en) 1992-11-30 1998-12-15 Monsanto Company Modified plant viral replicase genes
US6011199A (en) 1992-12-15 2000-01-04 Commonwealth Scientific Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour
US6013864A (en) 1993-02-03 2000-01-11 Monsanto Company Plants resistant to infection by luteoviruses
US5322687A (en) 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
EP0670670A4 (en) 1993-09-30 1996-04-24 Agracetus HETEROLOGICAL PEROXIDASE PROCESSING TRANSGENIC COTTON PLANTS.
SK280613B6 (sk) 1993-11-24 2000-05-16 Monsanto Company Rekombinantná dvojvláknová molekula dna a spôsob p
US6828475B1 (en) 1994-06-23 2004-12-07 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism
US6140075A (en) 1994-07-25 2000-10-31 Monsanto Company Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells
US6080560A (en) 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US5750876A (en) 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
US5716837A (en) 1995-02-10 1998-02-10 Monsanto Company Expression of sucrose phosphorylase in plants
US6946588B2 (en) 1996-03-13 2005-09-20 Monsanto Technology Llc Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use
US6091002A (en) 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US5958745A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6166292A (en) 1996-04-26 2000-12-26 Ajinomoto Co., Inc. Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant
US5985605A (en) 1996-06-14 1999-11-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms
US5998700A (en) 1996-07-02 1999-12-07 The Board Of Trustees Of Southern Illinois University Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
US6063756A (en) 1996-09-24 2000-05-16 Monsanto Company Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor
US6093695A (en) 1996-09-26 2000-07-25 Monsanto Company Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP
CA2268263A1 (en) 1996-10-29 1998-05-07 Calgene Llc Plant cellulose synthase and promoter sequences
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
ID25530A (id) 1996-11-20 2000-10-12 Ecogen Inc δ-ENDOTOKSIN BERSPEKTRUM-LEBAR
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6171640B1 (en) 1997-04-04 2001-01-09 Monsanto Company High beta-conglycinin products and their use
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6372211B1 (en) 1997-04-21 2002-04-16 Monsanto Technolgy Llc Methods and compositions for controlling insects
US6380466B1 (en) 1997-05-08 2002-04-30 Calgene Llc Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat
ATE323768T1 (de) 1997-06-05 2006-05-15 Calgene Llc Fett acyl-coa: fettalkohol o-acyltransferasen
US6716474B2 (en) 1997-06-17 2004-04-06 Monsanto Technology Llc Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants
US6441277B1 (en) 1997-06-17 2002-08-27 Monsanto Technology Llc Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants
US6072103A (en) 1997-11-21 2000-06-06 Calgene Llc Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression
US6063597A (en) 1997-12-18 2000-05-16 Monsanto Company Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects
US6023013A (en) 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
US6060594A (en) 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6653530B1 (en) 1998-02-13 2003-11-25 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds
US6107549A (en) 1998-03-10 2000-08-22 Monsanto Company Genetically engineered plant resistance to thiazopyr and other pyridine herbicides
US6284948B1 (en) 1998-05-18 2001-09-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes and methods for control of nematodes in plants
EP1084256A2 (en) 1998-06-05 2001-03-21 Calgene LLC Acyl coa:cholesterol acyltransferase related nucleic acid sequences
CA2330024C (en) 1998-06-12 2012-01-24 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
WO2000001713A2 (en) 1998-07-02 2000-01-13 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
BR9912019A (pt) 1998-07-10 2002-02-19 Calgene Llc Expressão de peptìdeos de eucarióticos em plastìdeos de plantas
US6476294B1 (en) 1998-07-24 2002-11-05 Calgene Llc Plant phosphatidic acid phosphatases
BR9912745A (pt) 1998-08-04 2001-11-06 Cargill Inc Promotores da desnaturase de ácido graxo de plantas
US6723897B2 (en) 1998-08-10 2004-04-20 Monsanto Technology, Llc Methods for controlling gibberellin levels
US6365802B2 (en) 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
US6448476B1 (en) 1998-11-17 2002-09-10 Monsanto Technology Llc Plants and plant cells transformation to express an AMPA-N-acetyltransferase
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
AU776316B2 (en) 1999-04-15 2004-09-02 Monsanto Company Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis
EP1173578A2 (en) 1999-05-04 2002-01-23 Monsanto Company Coleopteran-toxic polypeptide compositions and insect-resistant transgenic plants
MXPA01011671A (es) 1999-05-13 2002-06-04 Monsanto Technologies Llc Genes de resistencia adquirida en plantas.
US6489461B1 (en) 1999-06-08 2002-12-03 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding proteins involved in fatty acid beta-oxidation and methods of use
US6770465B1 (en) 1999-06-09 2004-08-03 Calgene Llc Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity
US7105730B1 (en) 1999-07-12 2006-09-12 Monsanto Technology L.L.C. Nucleic acid molecules and other molecules associated with sterol synthesis and metabolism
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US6501009B1 (en) 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
CA2384967A1 (en) 1999-09-15 2001-03-22 Monsanto Technology Llc Lepidopteran-active bacillus thuringiensis .delta.-endotoxin compositions and methods of use
US6573361B1 (en) 1999-12-06 2003-06-03 Monsanto Technology Llc Antifungal proteins and methods for their use
PT1240340E (pt) * 1999-12-16 2012-08-01 Monsanto Technology Llc Construções de dna para expressão de polipéptidos heterólogos em plantas
US6657046B1 (en) 2000-01-06 2003-12-02 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory lipid acyl hydrolases
CN1411469A (zh) 2000-01-06 2003-04-16 孟山都技术有限公司 脱敏蛋白及置换蛋白的制备
DE60111613T2 (de) 2000-03-09 2006-05-18 Monsanto Technology Llc. Verfahren zum herstellen von glyphosat-toleranten pflanzen
US6518488B1 (en) 2000-07-21 2003-02-11 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules and other molecules associated with the β-oxidation pathway
CA2412400A1 (en) 2000-07-25 2002-01-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding beta-ketoacyl-acp synthase and uses thereof
ATE482281T1 (de) 2004-06-09 2010-10-15 Pioneer Hi Bred Int Plastiden transit peptide
AU2005289727B2 (en) * 2004-09-24 2010-09-02 Monsanto Technology Llc Promoter molecules isolated from Brassica napus for use in plants
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
AU2007290367B2 (en) 2006-08-31 2013-10-31 Monsanto Technology, Llc Phased small RNAs
AR070340A1 (es) 2008-01-31 2010-03-31 Nat Inst For Biolog Sciences Plantas que tienen crecimiento y/o desarrollo alterado mediante modulacion de la expresion de un acido nucleico que codifica una proteasa especifica de ubiquitina (ubp) proveniente de arabipdosis y oryza
US8168859B2 (en) 2008-08-27 2012-05-01 Pioneer Hi Bred International Inc Ubiquitin regulatory elements
US8846892B2 (en) * 2008-09-25 2014-09-30 Monsanto Technology Llc Chimeric plant promoters and their uses in plants
EP2491127B1 (en) 2009-10-22 2017-09-20 Dow AgroSciences LLC Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
CN103534267B (zh) 2011-03-25 2017-07-14 孟山都技术公司 植物调控元件及其用途
WO2012151071A2 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Plant Sensory Systems, Llc Regulatory sequences to control gene expression in plants
CA2997781C (en) * 2011-05-13 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
EP2935586B1 (en) * 2012-12-19 2018-07-18 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
CN116064536A (zh) * 2013-03-14 2023-05-05 孟山都技术公司 植物调控元件和其用途
SG10202006261YA (en) 2016-03-11 2020-08-28 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN108884474B (zh) 2022-05-31
US11053510B2 (en) 2021-07-06
CL2019002971A1 (es) 2020-02-07
BR112018001122B1 (pt) 2021-06-01
CL2018002597A1 (es) 2018-10-26
AR121010A2 (es) 2022-04-06
US20200080099A1 (en) 2020-03-12
PE20190125A1 (es) 2019-01-17
PH12018501939A1 (en) 2019-06-17
US20190024111A1 (en) 2019-01-24
JP7438253B2 (ja) 2024-02-26
BR122020004860B1 (pt) 2021-06-08
EP3426788B1 (en) 2021-09-08
CR20220378A (es) 2022-09-23
NI201800087A (es) 2018-10-24
US20170260541A1 (en) 2017-09-14
SV2018005741A (es) 2019-01-28
KR20180119661A (ko) 2018-11-02
MX2020011517A (es) 2020-12-09
EA201892043A1 (ru) 2019-01-31
EP3988661A1 (en) 2022-04-27
ES2900300T3 (es) 2022-03-16
US20200080098A1 (en) 2020-03-12
CN108884474A (zh) 2018-11-23
NZ745763A (en) 2022-08-26
CR20220377A (es) 2022-09-23
SG11201807333UA (en) 2018-09-27
CN115125253A (zh) 2022-09-30
JP7123803B2 (ja) 2022-08-23
US10557142B2 (en) 2020-02-11
US20210246461A1 (en) 2021-08-12
AR121009A2 (es) 2022-04-06
KR102430885B1 (ko) 2022-08-09
PT3426788T (pt) 2021-12-02
IL261507A (en) 2018-10-31
CO2018010900A2 (es) 2018-10-22
AU2017229608B2 (en) 2022-12-01
BR122020004896B1 (pt) 2021-04-20
US11851667B2 (en) 2023-12-26
AR121011A2 (es) 2022-04-06
BR112018001122A2 (pt) 2018-09-11
CL2019002972A1 (es) 2020-02-07
JP2022089862A (ja) 2022-06-16
UY37151A (es) 2017-10-31
JP2022089861A (ja) 2022-06-16
JP2019508047A (ja) 2019-03-28
AU2017229608A1 (en) 2018-09-20
KR102633642B1 (ko) 2024-02-06
CL2019002970A1 (es) 2020-02-07
KR20220116067A (ko) 2022-08-19
US10443066B2 (en) 2019-10-15
SG10202006263UA (en) 2020-08-28
EA039403B1 (ru) 2022-01-24
ZA201805832B (en) 2019-06-26
IL291431A (en) 2022-05-01
EP3426788A4 (en) 2019-10-30
BR122020004866B1 (pt) 2021-04-20
SG10202006261YA (en) 2020-08-28
EP3426788A1 (en) 2019-01-16
KR20220116066A (ko) 2022-08-19
CN114807170A (zh) 2022-07-29
CA2960502A1 (en) 2017-09-11
CR20180481A (es) 2019-01-09
AR107868A1 (es) 2018-06-13
MX2020011519A (es) 2020-12-09
US11046967B2 (en) 2021-06-29
WO2017156091A1 (en) 2017-09-14
BR122020022598B1 (pt) 2021-06-15
SG10202006253RA (en) 2020-08-28
SG10202006251PA (en) 2020-08-28
IL291429A (en) 2022-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6889302B2 (ja) 植物調節エレメントおよびその使用
CN103687950B (zh) 植物调控元件及其应用
JP6580027B2 (ja) 植物調節エレメントおよびその使用
CN106414746A (zh) 利用来自短柄草属泛素基因的调节元件的转基因表达用构建体
UA126792C2 (uk) Регуляторний елемент рослин і його застосування
CN104364370B (zh) 植物调控元件及其用途
CN106676106B (zh) 调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用
Butchar et al. New negative feedback regulators of Egfr signaling in Drosophila
CN106255749A (zh) 用于重组表达感兴趣多肽的新型脊椎动物细胞和方法
Suzaki et al. TRICOT encodes an AMP1-related carboxypeptidase that regulates root nodule development and shoot apical meristem maintenance in Lotus japonicus
CN107099548A (zh) 提高大豆转化效率的方法
CN102187845B (zh) 一种提高蚕丝产量的转基因方法
Behrens et al. Cloning of the αA-crystallin genes of a blind cave form and the epigean form of Astyanax fasciatus: a comparative analysis of structure, expression and evolutionary conservation
Miroshnichenko et al. Evaluation of plant-derived promoters for constitutive and tissue-specific gene expression in potato
SA112340163B1 (ar) طريقة وجزء منشأ لمعزز النبات scbv التخليقي ثنائي الاتجاه
Ayra et al. Control of the rhizobia nitrogen-fixing symbiosis by common bean MADS-domain/AGL transcription factors
Di et al. A novel type of phytosulfokine, PSK-ε, positively regulates root elongation and formation of lateral roots and root nodules in Medicago truncatula
CN101679968B (zh) 增强植物耐缺铁性的多肽及其应用
Wu et al. Promoter variation of the key apple fruit texture related gene MdPG1 and the upstream regulation analysis
CN102625834A (zh) 参与植物中镉的蓄积的基因的利用
CN106480069B (zh) 黄瓜CsERF025基因及其在促进黄瓜果实顺直发育中的应用
Lu et al. A study on the effect of host plants on Chinese gallnut morphogenesis
JP2019516388A (ja) 植物調節エレメント及びその使用
Kim et al. Accumulation of Leginsulin, a Hormone‐Like Bioactive Peptide, is Drastically Higher in Asian than in North American Soybean Accessions
Tahir et al. Shoot apical development during in vitro embryogenesis