CN102625834A - 参与植物中镉的蓄积的基因的利用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供鉴定参与植物中镉的蓄积的基因、及该基因的利用方法。本发明将以下多核苷酸导入到植物中以使其可表达：编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；编码包含通过SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸；编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；或编码包含通过SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸。

Description

参与植物中镉的蓄积的基因的利用
技术领域
本发明涉及参与植物中的镉的蓄积的基因的利用。
背景技术
已知镉作为痛痛病(イタイイタイ病)的原因物质，其为毒性强的重金属。镉是在矿物质中或土壤中等天然存在的重金属，与银、铜、锌等金属同时存在，因此，作为将这些金属开采、精炼时的副产物被排出到环境中且蓄积在土壤中。
镉经由在被镉污染的土壤中栽培的蔬菜、谷类等各种农作物而被摄入人体内，对我们的健康产生恶劣影响。因此，在我国限制来自农作物的镉摄取量，所以，根据食品卫生法来确定农作物中所含的镉浓度的基准值。例如，糙米中的镉的浓度为0.4ppm以上且小于1.0ppm的稻米禁止作为食用物被出售，镉的浓度为1ppm以上的稻米禁止出售或加工等，根据实际情况被焚烧处置。
为了将水稻等农作物中所含的镉浓度设定为基准值以下并确保食品的安全，目前尝试利用土壤清洗、填埋、客土等方法净化被镉污染了的土壤(例如，参照专利文献1及非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2004/037453号小册子(2004年5月6日公开)
非专利文献
非专利文献1：Calmano W，Mangold S，Stichnothe H，Thoming J：Clean-up and assessment of metal contaminated soils(金属污染土壤的净化与评估)；于Treatment of Contaminated soil(污染土壤治理)，R.Stegmann，G.Brunner，W. Calmano和G. Matz编辑，p.471-490，Springer，Berlin(2001)
发明内容
发明解决的问题
但是，如上所述的土壤清洗、填埋及客土的现有的方法具有成本高、难以保证用于填埋或客土的未污染土壤等问题。另外，由于化学或物理地处理土壤，生态系统有可能因此紊乱。所以，被镉污染的农业用地不被利用而放弃。
从有效地利用被镉污染的农业用地的观点出发，如果可以实现不易蓄积土壤中所含的镉的植物，则认为是非常有用的。但是，哪种基因参与植物中的镉的蓄积不清楚。
本发明是鉴于上述问题点而完成的发明，其目的在于，提供鉴定参与植物中的镉的蓄积的基因、该基因的利用方法。
解决问题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行了潜心研究。作为结果，本发明人首次发现，承载于水稻的7号染色体上的OsHMA3基因参与植物中镉的输送，从而完成了本发明。即，本发明包含以下的发明。
本发明所述的转基因植物的生产方法使镉的蓄积的位置变化，其特征在于，将下述(a)～(d)中任一种多核苷酸导入到植物中以使所述多核苷酸能够表达：
(a)编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码包含通过SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸；
(c)编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(d)编码包含通过在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸。
本发明所述的转化植物的特征在于，利用本发明所述的转基因植物的生产方法来生产。
本发明所述的试剂盒用于制备使镉的蓄积的位置变化的转基因植物，其特征在于，含有下述(a)～(d)中任一种多核苷酸：
(a)编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码包含通过SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸；
(c)编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(d)编码包含通过SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸。
本发明的进一步其它目的、特征及优点通过以下所示的记载而充分得知。另外，本发明的益处通过参照附图的以下说明而清楚。
发明效果
根据本发明所述的转基因植物的生产方法，起到可以生产使镉的蓄积的位置变化的转化植物的优异的效果。具体而言，与野生型的植物比较，可以生产使镉的蓄积的位置变化为在根部或使镉的蓄积的位置变化为在除根以外的植物体内的转基因植物。
使镉的蓄积的位置变化为在根部的转基因植物在除根以外的植物体内不易蓄积镉，因此，在含有镉的土壤中也可以栽培。另外，通过在含有镉的土壤中栽培使镉的蓄积的位置变化为在除根以外的植物体内的转基因植物，可以作为使土壤中的镉低成本且容易地除去的土壤净化用植物优选利用。
另外，如果使用本发明所述的试剂盒，则可以容易地制备使镉的蓄积的位置变化的转基因植物。
附图简述
图1是表示在没有被镉污染的农场中栽培的131个体系的水稻的谷粒中的镉浓度的图表。
图2是对于在没有被镉污染的农场中栽培的长香谷(アンジヤナ·ダ一ン，Anjana Dhan)和日本晴(日本晴，Nipponbare)，表示地上部及糙米中的镉浓度的图表。
图3是对于在镉污染土壤中栽培的长香谷和日本晴，表示地上部及糙米中的镉浓度的图表。
图4是表示将长香谷的地上部中所含的镉浓度设定为100时F2群体的地上部中所含的镉浓度的相对值的图表。图4中的A、H及B表示在每个数量基因座的附近检测的标记的基因型，“A”表示长香谷型，“H”表示杂合子型，“B”表示日本晴型。
图5是表示对谷粒中镉浓度高的7个体系的水稻进行了PCR的结果的图。第1泳道为Jarjan、第2泳道为长香谷(Anjana Dhan)、第3泳道为IR58、第4泳道为Bleiyo、第5泳道为IR36、第6泳道为PI312777。
图6是表示在日本晴和长香谷中将OsHMA3a蛋白质及OsHMA3n蛋白质的氨基酸序列相比的结果的图。图6中，TM1～TM8表示跨膜结构域。
图7是表示定量PCR的结果的图表。
图8是表示使用酵母的OsHMA3基因的功能分析的结果的图。
图9是表示对长香谷及日本晴定时地测定导管液(導管液)、地上部及根中所含的镉浓度的结果的图表。图9的(a)表示导管液中的测定结果，(b)表示地上部的测定结果，(c)表示根中的测定结果。
图10是表示长香谷及日本晴的根的镉吸收能力的图表。
图11是表示对长香谷及日本晴的导管液中所含的镉的浓度进行测定的结果的图表。
图12是表示互补性测试的结果的图，(a)表示在长香谷中导入有OsHMA3n的3种转化株及导入有空载体的对照株的地上部中的镉浓度，(b)表示根中的镉浓度。
图13是表示在长香谷中导入有OsHMA3n基因的3种转化株及导入有空载体的对照株中的微量营养素的浓度的图。
图14是表示在长香谷中导入有OsHMA3n基因的3种转化株及导入有空载体的对照株中的大量营养素的浓度的图。
图15是表示对在日本晴中利用RNAi敲低OsHMA3基因的表达的RNAi株及导入有空载体的对照株中的镉的蓄积量进行测定的结果的图，(a)表示日本晴中的3种RNAi株及对照株的地上部中的镉浓度，(b)表示根中的镉浓度。
图16是表示在日本晴中利用RNAi敲低OsHMA3基因的表达的RNAi株及导入有空载体的对照株中的微量营养素的浓度的图，(a)表示日本晴中的3种RNAi株及对照株中的OsHMA3基因的表达水平，(b)表示RNAi株及对照株的地上部及根中的微量营养素的浓度。
图17是表示OsHMA3基因的表达模式的图，(a)表示日本晴及长香谷的根及地上部的OsHMA3基因的2种等位基因的表达，(b)表示日本晴及长香谷的根的不同部分的2种等位基因的表达。
图18是表示水稻的根中的OsHMA3蛋白质的定位的图，(a)表示长香谷的根中的免疫染色的结果，(b)表示日本晴的根中的免疫染色的结果。
图19表示OsHMA3n蛋白质的细胞内的定位的图，(a)表示表达GFP-OsHMA3n蛋白质的洋葱表皮细胞中的GFP的荧光，(b)表示仅表达GFP蛋白质的洋葱表皮细胞中的GFP的荧光。
图20是表示蛋白免疫印迹分析的结果的图，(a)表示抗OsHMA3n抗体的特异性，(b)表示蔗糖密度梯度分析的结果。
图21是表示与镉有关的酵母中的功能分析的结果的图，(a)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3n基因、OsHMA3a基因、AtHMA3基因或2种嵌合体基因的任一种的野生型的酵母细胞(BY4741株)的葡萄糖存在下的生长，(b)表示半乳糖的存在下的生长。
图22是表示OsHMA3n蛋白质和OsHMA3a蛋白质的融合蛋白质的概略的图。
图23是表示与镉有关的酵母中的功能分析的结果的图，(a)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3n基因、OsHMA3a基因或AtHMA3基因的任一种的Δycf1酵母细胞的葡萄糖的存在下的生长，(b)表示半乳糖的存在下的生长。
图24是表示与金属有关的酵母中的功能分析的结果的图，(a)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3n基因、OsHMA3a基因或作为阳性对照的AtHMA3基因的任一种的Δzrc1酵母株的半乳糖及4mM ZnSO4的存在下的生长，(b)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3n基因、OsHMA3a基因或作为阳性对照的AtHMA3基因的任一种的Δcot1酵母株的半乳糖及2.5mM CoCl2的存在下的生长，(c)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3a基因、OsHMA3aH80R基因、OsHMA3aV638A基因、OsHMA3aH80R/V638A基因或OsHMA3n基因的任一种的野生型酵母细胞的半乳糖及20μMCdSO4的存在下的生长。
图25是表示与镉的蓄积及其它金属的蓄积有关的OsHMA3n基因的过表达的作用的图，(a)表示糙米中的镉的浓度，(b)表示糙米中的锌的浓度，(c)表示糙米中的铁的浓度。
图26是表示过表达株及载体对照株中OsHMA3n基因的表达水平的图。
图27是表示与镉的蓄积及其它金属的蓄积有关的OsHMA3n基因的过表达的作用的图，(a)表示地上部的镉的浓度，(b)表示地上部的锌的浓度，(c)表示地上部的铁的浓度。
发明的最佳实施方式
下面，对本发明的实施方式进行详细说明。但是，本发明并不限定于此，可以在记述的范围内加入各种变形的方式实施。另外，本说明书中所记载的学术文献及专利文献的全部在本说明书中作为参考被引用。另外，只要在本说明书中没有特殊说明，表示数值范围的“A～B”表示的是“A以上、B以下”。
[1.转化植物的生产方法]
本发明所述的转化植物的生产方法是使镉的蓄积的位置变化的转基因植物的生产方法，其包含将下述(a)～(d)中任一种多核苷酸导入到植物中以使所述多核苷酸能够表达的步骤：
(a)编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码包含通过SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸；
(c)编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(d)编码包含通过SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸。
本发明人通过水稻新近鉴定了参与镉向细胞内的输送的基因(OsHMA3n基因及OsHMA3a基因)。上述的SEQ ID NO：1及2所示的多肽分别为OsHMA3n基因及OsHMA3a基因的翻译产物。即，包含SEQ IDNO：1及2所示的氨基酸序列的多肽是由本发明人通过水稻新近鉴定的参与镉向细胞内的输送的蛋白质。即，可以说，包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽及包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽具有使镉的蓄积的位置变化的活性。另外，在本说明书中，有时将OsHMA3n基因及OsHMA3a基因简称为“OsHMA3基因”，将OsHMA3n蛋白质及OsHMA3a蛋白质简称为“OsHMA3蛋白质”。
作为上述(a)或(b)的多核苷酸，可以列举例如具有SEQ ID NO：3所示的碱基序列的多核苷酸。另外，作为上述(c)或(d)的多核苷酸，可以列举例如具有SEQ ID NO：4所示的碱基序列的多核苷酸。
在此，在本说明书中，上述“使镉的蓄积的位置变化”是指：与没有导入上述(a)～(d)中任一种多核苷酸的野生型的植物相比，使转化植物中的镉的蓄积的位置变化为在根部或使转基因植物中的镉的蓄积的位置变化为在除根以外的植物体内。另外，上述“除根以外的植物体”是指：包含例如茎、叶、谷粒等的植物体的根以外的部分。另外，在本说明书中，有时将上述“除根以外的植物体”称为“地上部”。
镉的蓄积的位置发生变化可以通过相同的条件下栽培野生型的植物和转基因植物、对栽培后的野生型的植物和转基因植物比较在根或除根以外的植物体内的镉的蓄积量来确认。镉的蓄积量可以通过例如利用后述的实施例所示的方法进行测定。
上述“镉”可以进行离子化，也可以形成盐。另外，上述“镉”表示镉及包含镉的化合物。
另外，上述“多肽”也可以换句话说是“肽”或“蛋白质”。上述“1个或数个氨基酸被取代、缺失、和/或添加”是指：利用位点特异性诱变等公知的变异多肽制备法可以取代、缺失或添加的程度的数目(例如20个以下，优选10个以下，更优选7个以下，进一步优选5个以下，特别优选3个以下)的氨基酸被取代、缺失和/或添加。这样的变异多肽并不限定于具有利用公知的变异多肽制备法人为地导入的变异的多肽，可以与天然存在的多肽同样地对变异多肽进行分离和纯化。
另外，上述“多核苷酸”也可以换句话说是“核酸”或“核酸分子”，是指核苷酸的聚合物。另外，“碱基序列”也可以换句话说是“核酸序列”或“核苷酸序列”，作为脱氧核醣核苷酸(省略为A、G、C、及T)的序列表示。另外，“包含SEQ ID NO：1所示的碱基序列的多核苷酸”表示包含由SEQ ID NO：1的各脱氧核苷酸A、G、C和/或T所示的序列的多核苷酸。
获得上述多核苷酸的方法没有特别限定，可以利用公知的技术来获得。例如，可以利用使用PCR等扩增方法的方法来获得。具体而言，关于上述(a)～(d)的多核苷酸，分别制备与5’侧及3’侧的序列(或其互补序列)相对应的引物，使用这些引物以基因组DNA(或cDNA)等为模板进行PCR等，将夹在两引物间的DNA区域进行扩增，由此可以大量地获得含有上述多核苷酸的DNA片段。
另外，可以基于公知的日本晴的序列信息，设计可以扩增OsHMA3基因区域的引物，使用该引物，以基因组DNA(或cDNA)或RT-PCR产物为模板，扩增OsHMA3基因区域，由此，也可以获得上述多核苷酸。
另外，也可以利用将包含上述多核苷酸或含有其一部分的序列的寡核苷酸的DNA片段进行分离、克隆的方法来获得多核苷酸。例如，为了制备与上述(a)～(d)的多核苷酸的碱基序列的一部分特异性杂交的探针，筛选基因组DNA文库或cDNA文库即可。作为这样的探针，只要是与上述多核苷酸的碱基序列或其互补序列的至少一部分特异性杂交的探针，任何序列和/或长度的探针均可以使用。
作为用于获得上述多核苷酸的供给源，没有特别限定，因为包含SEQID NO：1及SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽(OsHMA3蛋白质)来自作为水稻的日本晴，因此，优选使用禾本科植物(水稻、玉米等)。
作为导入于植物的上述“多核苷酸”的形式，只要能够可以表达地导入于植物，就没有特别限定，可以为RNA(例如，mRNA)的形式或DNA的形式(例如，cDNA或基因组DNA)。
作为导入上述多核苷酸的上述“植物”，没有特别限定，可以根据目的适当选择。可以列举例如：禾本科植物、茄科植物、豆科植物等。作为上述“禾本科植物”，可以列举例如：水稻、大麦、小麦、玉米、黑麦、高粱等。作为上述“茄科植物”，可以列举例如茄子等。作为上述“豆科植物”，可以列举例如大豆等。
使本发明所述的镉的蓄积的位置变化的转基因植物的生产方法，只要是导入上述(a)～(d)中任一种多核苷酸或含有该多核苷酸的重组表达载体、且表达具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的方法，就没有特别限定。另外，在本说明书中，上述“使镉的蓄积的位置变化的活性”是指：“与没有导入上述(a)～(d)中任一种多核苷酸的野生型的植物相比，使转化植物的镉的蓄积的位置变化为在根部的活性或使转化植物的镉的蓄积的位置变化为在除根以外的植物体内的活性”。
就上述“重组表达载体”而言，只要含有(a)～(d)中任一种多核苷酸，其种类没有特别限定。可以列举例如插入有SEQ ID NO：3或4所示的cDNA的重组表达载体。重组表达载体的制备可以使用质粒、粘粒等，但本发明并不限定于这些。
另外，上述“重组表达载体”只要可以在植物的细胞(以下，也称为“宿主细胞”)中使插入基因表达，就没有特别限定。例如，在利用使用土壤杆菌的方法(土壤杆菌感染法)在植物中导入重组表达载体时，作为重组表达载体，优选使用pBI系统等双元载体。作为双元载体，可以列举例如pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。
另外，上述“重组表达载体”优选为具有可以使基因在成为导入对象的植物(导入对象植物)的细胞内表达的启动子的载体。作为启动子，可以优选使用公知的启动子。可以列举例如：花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、泛素启动子或肌动蛋白启动子等。通过将这些启动子序列和上述(a)～(d)中任一种多核苷酸整合入质粒等重组表达载体，可以使导入的多核苷酸在植物的细胞内优选表达。其中，从使OsHMA3蛋白质高表达的观点考虑，优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子。例如，通过使OsHMA3n蛋白质高表达，可以生产地上部不易蓄积镉的转基因植物。另外，通过使OsHMA3a蛋白质高表达，可以生产地上部容易蓄积镉的转基因植物。
另外，发明人揭示，OsHMA3蛋白质主要在植物的根部表达。因此，从在转化植物中使OsHMA3蛋白质优选起作用的观点考虑，优选导入在上述植物的根部可以特异性表达的上述(a)～(d)中任一种多核苷酸。
例如，通过导入在已知控制基因在根部特异性地表达的启动子的控制下的上述(a)～(d)中任一种多核苷酸，可以使上述(a)～(d)中任一种多核苷酸在上述植物的根部特异性地表达。作为这样的启动子，可以使用例如OsHMA3启动子。
作为将上述多核苷酸或上述重组表达载体导入于植物的方法、即转化方法，没有特别限定。例如，既可以在染色体中整合入上述多核苷酸或上述重组表达载体，也可以在染色体的特定的位点利用同源重组整合入上述多核苷酸。另外，可以使上述多核苷酸或上述重组表达载体在植物内瞬时性表达。
作为上述转化方法，可以使用现有公知的基因工程学的方法(基因操作技术)。可以优选使用例如土壤杆菌感染法、电穿孔法(电穿孔法)、磷酸钙法、原生质体法、醋酸锂法及基因枪法等现有公知的方法。例如，作为上述“土壤杆菌感染法”，可以使用Plant，J.6：271-282(1994)中记载的方法。
另外，关于上述多核苷酸或上述重组表达载体是否被导入于宿主细胞、进而是否在宿主细胞内可靠地表达，可以使用各种标记进行确认。可以列举例如将赋予对诸如潮霉素的抗生素抵抗性的药物抗性基因用作标记，将含有该标记和上述(a)～(d)中任一种多核苷酸的质粒等作为表达载体导入于宿主细胞的方法。如果使用该方法，则可以通过药物筛选确认被导入的基因是否在宿主细胞内可靠地表达。
利用本发明所述的转基因植物的生产方法生产的转基因植物导入有上述(a)～(d)中任一种多核苷酸或上述重组表达载体，且表达具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽。即，利用本发明所述的转基因植物的生产方法生产的转基因植物与没有导入上述(a)～(d)中任一种多核苷酸(OsHMA3基因)的野生型的植物相比，镉的蓄积的位置发生变化。
具体地进行说明时，上述(a)或(b)的多核苷酸与来自日本晴的OsHMA3n基因相对应。因此，可以认为，导入有上述(a)或(b)的多核苷酸的转基因植物与没有导入这些多核苷酸的野生型的植物相比，根中的镉的蓄积性提高，且除根以外的植物体(例如谷粒等)中的镉的蓄积性降低。
另一方面，上述(c)或(d)的多核苷酸与来自长香谷的OsHMA3a基因相对应。因此，可以认为，导入有上述(c)或(d)的多核苷酸的转基因植物与没有导入这些多核苷酸的野生型的植物相比，根中的镉的蓄积性降低，且除根以外的植物体(例如谷粒等)中的镉的蓄积性提高。
因此，导入有上述(a)～(d)中任一种多核苷酸的转基因植物与没有导入这些多核苷酸的野生型的植物相比，镉的蓄积的位置发生变化。
根据本发明所述的转基因植物的生产方法，可以容易地制备使镉的蓄积的位置变化的转基因植物。
在本发明所述的转基因植物的生产方法中，上述植物优选为禾本科植物。
[2.转基因植物]
本发明所述的转基因植物的特征在于，是利用本发明所述的转基因植物的生产方法生产的。
关于上述“本发明所述的转基因植物的生产方法”，如在上述“1.转基因植物的生产方法”的项中说明的那样，在此省略。
本发明所述的转基因植物的范畴不仅包含植物体，也包含各种形式的植物细胞，例如悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。另外，利用本发明所述的转基因植物的生产方法一旦得到在植物的染色体上整合有上述(a)～(d)中任一种多核苷酸的转基因植物，则在由该植物得到的种子中也导入有上述多核苷酸。因此，本发明中也包含由转基因植物得到的种子。
就本发明所述的转基因植物而言，由于镉的蓄积的位置发生变化，因此，可以用于各种用途。例如，由于使镉的蓄积的位置变化为在根部的转基因植物在除根以外的植物体内不易蓄积镉，因此，在含有镉的土壤中也可以栽培。
另外，如果在含有镉的土壤中栽培使镉的蓄积的位置变化为在除根以外的植物体内的转基因植物，则可以使土壤中的镉在转基因植物内有效地蓄积。因此，赋予有所述的性质的转基因植物可以用于从含有镉的土壤除去镉。例如，通过重复在含有镉的土壤中栽培使镉的蓄积的位置变化为在除根以外的植物体内的转基因植物、收获栽培的转基因植物、利用焚烧等处置的步骤，可以有效地除去土壤中所含的镉。
[3.试剂盒]
本发明所述的试剂盒用于制备使镉的蓄积的位置变化的转基因植物，其中，含有下述(a)～(d)中任一种多核苷酸：
(a)编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码包含通过SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸；
(c)编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(d)编码包含通过SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸。
关于上述“多核苷酸”，如在上述“1.转基因植物的生产方法”的项中说明的那样，因此，在此省略。
本发明所述的试剂盒可以含有上述的多核苷酸以外的成分。可以含有例如用于制备包含上述多核苷酸的重组表达载体的质粒、为了制备该重组表达载体而需要的试剂、缓冲剂、为了进行植物的转化而需要的试剂等。
只要使用本发明所述的试剂盒，就可以容易地制备使镉的蓄积的位置变化的转基因植物。
本发明并不限定于上述的各实施方式，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，关于将在不同的实施方式中分别公开的技术的方法适当组合而得到的实施方式，也包含在本发明的技术的范围中。
实施例
以下，利用实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。
(镉浓度的测定方法)
在本发明的实施例中，就水稻的根、地上部及谷粒(糙米)中的镉浓度而言，将植物试样全部用浓硝酸(60％)分解，使用原子吸光光度计测定吸光度。
(1.参与对地上部的镉的蓄积的基因的鉴定)
首先，使用世界各国的各种品种的水稻(计131个体系)，对各品种的水稻研究谷粒中的镉的蓄积量。具体而言，在没有被镉污染的农场(土壤中的镉浓度小于1ppm)中栽培水稻，对所得的谷粒中的镉浓度进行测定。
图1是表示在没有被镉污染的农场中栽培的131个体系的水稻的谷粒中的镉浓度的图表。如图1所示，得知：谷粒中所含的镉的浓度在体系间有很大差异。其中，得知：作为籼稻(Indica)的体系之一的长香谷(AnjanaDhan)与作为粳稻(Japonica)的体系之一的日本晴(Nipponbare)相比，谷粒中所含的镉浓度高40倍以上。
因此，选择长香谷作为镉高蓄积品种，选择日本晴作为镉低蓄积品种，关于长香谷和日本晴，对镉的蓄积量进一步进行详细分析。图2是对于在没有被镉污染的农场中栽培的长香谷和日本晴、表示地上部及糙米中的镉浓度的图表。另外，在本实施例中，上述“地上部”是指露出于地上的部分、即包含水稻的茎、叶的部分，地上部不含有谷粒。如图2所示，得知：与日本晴相比，长香谷的地上部中所含的镉浓度高28倍，糙米中所含的镉浓度高15倍。
接着，在人工的镉污染土壤中，对使用1/5000公亩的瓦氏盆栽培179天时的长香谷及日本晴中的镉蓄积量进行分析。就使用的人工镉污染土壤而言，在0.1N盐酸萃取组分中，镉浓度为7.6ppm。图3是对于在镉污染土壤中栽培的长香谷和日本晴表示地上部及糙米中的镉浓度的图表。如图3所示，得知：与日本晴相比，长香谷的地上部中所含的镉浓度高6倍，糙米中所含的镉浓度高8倍。
接着，进行长香谷和日本晴的杂交，使用所得的F2群体研究参与镉的蓄积的数量性状。具体而言，使用含有50nM的镉的1/2木村B溶液将所得的F2群体栽培10天，对地上部中的镉浓度进行测定。另外，1/2木村B溶液为含有大量营养素(mM)即MgSO4(0.28)、(NH4)2SO4(0.18)、Ca(NO3)2(0.18)、KNO3(0.09)、KH2PO4(0.09)及微量营养素(mM)即Fe(II)SO4(10)、H3BO3(3)、MnCl2(0.5)、CuSO4(0.2)、ZnSO4(0.4)、(NH4)6Mo7O24(1)的培养基。使用1N NaOH来用于将1/2木村B溶液调整为pH5.4的溶液。
图4是表示将长香谷的地上部中所含的镉浓度设定为100时的F2群体的地上部中所含的镉浓度的相对值的图表。图4中的A、H、及B表示在每个数量基因座(QTL)的附近检测的标记的基因型，“A”表示长香谷型，“H”表示杂合子型，“B”表示日本晴型。如图4所示，F2群体中的地上部的镉浓度分离成3∶1。由该结果得知：在长香谷和日本晴中，在地上部中所含的镉浓度上存在差异，其是由一个基因的不同而产生的。
因此，为了检测限定上述F2群体地上部的镉的蓄积量的基因座，进行了QTL分析。QTL分析由qtl cartographer version 2.5(北卡罗莱纳州立大学的生物信息研究中心提供，使用http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WOTLCart.htm)进行。其结果得知：承载有参与对地上部的镉的蓄积的QTL。该QTL的LOD值为53.1，贡献率为72.5％。
而且，使用1000株以上的F2群体进行原因基因的定位，结果，将参与对地上部的镉的蓄积的QTL承载的候补区域挤入夹在标记RM21251和RM21275之间的500kb的范围内。使用作为刊登、公开水稻基因组的注释信息的数据库的RAP-DB(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)检索存在于该区域的基因。其结果得知，在标记RM21251和RM21275之间存在32个预测基因。其中，在长香谷和日本晴之间看到碱基序列的差异的OsHMA3认为是参与镉的输送的基因。
接着，由表1所示的谷粒中所含的镉浓度高的6个体系和日本晴制备cDNA，以所述的cDNA为模板进行PCR。
【表1】
Figure BDA0000142124120000151
具体而言，在OsHMA3的C末端侧、即日本晴中的PCR扩增产物的848bp的区域中设计引物，进行PCR。就PCR而言，使用Ex Taq(产品名，TaKaRa制造)制备PCR反应液，使用Mastercycler(产品名，Eppendorf制造)进行扩增。就PCR的反应条件而言，初期94℃变性20秒，98℃变性10秒，62℃退火30秒，72℃延伸60秒，重复35次变性至延伸的过程。
图5是表示对谷粒中的镉浓度高的7个体系的水稻进行了PCR的结果的图。第1泳道为Jarjan，第2泳道为长香谷(Anjana Dhan)，第3泳道为IR58，第4泳道为Bleiyo，第5泳道为IR36，第6泳道为PI312777。如图5所示，得知：就作为谷粒中所含的镉浓度高的前2个品种Jarjan和长香谷而言，PCR扩增产物的长度较短。
(2.OsHMA3基因的分离)
就OsHMA3基因而言，利用以下的方法分别从长香谷及日本晴进行分离。具体而言，来自日本晴的OsHMA3n基因的ORF以数据库(RAP-DB)的信息为基础，对N末端和C末端设计引物，利用PCR扩增基因。来自长香谷的OsHMA3a基因使用SMART RACE cDNA Amplification试剂盒(产品名，Clontech制造)进行5’-RACE及3’-RACE，分离ORF。
将来自日本晴的OsHMA3蛋白质(OsHMA3n蛋白质)的氨基酸序列以SEQ ID NO：1表示，将来自日本晴的OsHMA3基因(OsHMA3n基因)的碱基序列以SEQ ID NO：3表示。另外，将来自长香谷的OsHMA3蛋白质(OsHMA3a蛋白质)的氨基酸序列以SEQ ID NO：2表示，将来自长香谷的OsHMA3基因(OsHMA3a基因)的碱基序列以SEQ ID NO：4表示。
图6是表示在日本晴和长香谷中将OsHMA3a蛋白质及OsHMA3n蛋白质的氨基酸序列进行了比较的结果的图。在图6中，TM1～TM8表示跨膜结构域。如图6所示，来自长香谷的OsHMA3a蛋白质与来自日本晴的OsHMA3n蛋白质相比，在C末端侧的区域看到53氨基酸的缺失。由以上认为，来自长香谷的OsHMA3a蛋白质不能正常地起作用。另外，OsHMA3a蛋白质和OsHMA3n蛋白质的同源性为91.4％。
(3.OsHMA3基因的功能分析)
首先，就镉添加对于OsHMA3基因的表达的影响进行分析。具体而言，将播种后第11天的幼苗使用含有50nM的镉的1/2木村B溶液培养24小时。作为阴性对照，使用不含有镉的1/2木村B溶液进行培养。培养后，从地上部及根提取RNA。由所得的RNA利用逆转录反应合成cDNA，以合成的cDNA为模板进行定量PCR。
另外，使用Qiagen的植物RNA微量试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit，产品名，Qiagen制造)提取总RNA，使用Invitrogen的SuperScriptII逆转录酶(产品名，Invitrogen制造)合成cDNA。就定量PCR而言，使用ThunderbridSYBR qPCR Mix(产品名，东洋纺制造)制备PCR反应液，使用Mastercyclerep Realprex实时PCR(产品名，Eppendorf制造)进行扩增。就PCR的反应条件而言，初期95℃变性30秒、95℃变性30秒、62℃退火20秒、72℃延伸35秒，重复40次变性至延伸的过程。
图7是表示定量PCR的结果的图表。如图7所示，得知：OsHMA3基因主要在根部表达。镉的添加没有对OsHMA3基因的表达量产生影响。另外，在长香谷和日本晴之间，与镉的有无没有关系，在OsHMA3基因的表达量上没有看到明显的差异。由该结果得知，导致长香谷和日本晴的地上部中所含的镉浓度之间的差异的主要原因并不取决于OsHMA3基因的表达量的差异，是由OsHMA3蛋白质的功能的不同引起的。
接着，使分别从长香谷及日本晴分离的OsHMA3基因在酵母中表达，对OsHMA3蛋白质的镉的输送活性进行分析。具体而言，在酵母(BY4741株，从Euroscarf购入)中使用表达载体pYES2(Invitrogen制造)将分别来自日本晴及长香谷的OsHMA3利用现有公知的醋酸锂法导入。作为阴性对照，仅导入pYES2载体。
将所得的转化酵母在含有0μM、10μM、或20μM的镉的琼脂培养基上进行接种，在30℃下培养42小时。具体而言，首先，将转化酵母使用含有2％葡萄糖且不含有尿嘧啶的液体SC培养基培养至成为对数生长期(OD0.5～1.0)。以测定的OD为基础，制备5阶段的10倍稀释系列，使各株的密度为一定，将转化酵母用无菌水清洗3次后，将转化酵母在琼脂培养基上每5μL进行点样。上述琼脂培养基使用除去尿嘧啶的SC培养基。另外，为了利用GAL1启动子诱导OsHMA3基因的表达，使用半乳糖作为碳源。
OsHMA3蛋白质为排出型的转运蛋白，就表达OsHMA3蛋白质的酵母而言，由于细胞质内的镉集中于特定的细胞器，因此认为，利用镉的毒性抑制增殖，并且以酵母的增殖为指标，判断镉的输送活性的有无。
图8是表示使用酵母的OsHMA3蛋白质的功能分析的结果的图。如图8所示，使来自日本晴的OsHMA3n蛋白质表达的酵母与作为阴性对照导入有pYES2载体的酵母相比，在含有镉的培养基中抑制增殖。由该结果得知，来自日本晴的OsHMA3n蛋白质具有镉的输送活性。另一方面，使来自长香谷的OsHMA3a蛋白质表达的酵母的增殖与作为阴性对照导入有pYES2载体的酵母相同。由该结果得知，来自长香谷的OsHMA3a蛋白质不具有镉的输送活性。
而且，进行了对OsHMA3n蛋白质的生理学的分析。具体而言，将播种后第28天的长香谷及日本晴的幼苗使用含有1μM的镉的1/2木村B溶液进行栽培，随时间采集导管液、地上部及根部，对每个部位中所含的镉的浓度进行测定。另外，就导管液而言，从地上部和根的交界线将上部3～4cm的叶鞘使用剃刀沿水平切断，使用微量移液管采集从切断面渗出的液体。另外，由于切断后最初的1～2微升可能混入细胞质液，因此，作为导管液，没有采集。
图9是表示对长香谷及日本晴、定时地测定导管液、地上部及根中所含的镉浓度的结果的图表。图9的(a)表示导管液，(b)表示地上部，(c)表示根中的测定结果。如图9所示，得知：培养第5天时的长香谷的导管液及地上部中的镉浓度与日本晴中的各部位的镉浓度相比，在导管液中高6倍，在地上部高3倍。
另一方面，得知：在根中，日本晴与长香谷相比，镉浓度高2倍。该结果显示：与日本晴相比，长香谷将吸收的镉保留在根部的能力低。
因此，对日本晴及长香谷的根中的镉的吸收能力进行分析。具体而言，在含有0μM～5μM的镉的1/2木村B溶液中，暴露播种后第21天的长香谷及日本晴的幼苗的根，对暴露后30分钟后被根吸收的镉的浓度进行测定。
图10是表示长香谷及日本晴的根的镉吸收能力的图表。暴露于任一种镉浓度的培养液的情况，镉低蓄积性的日本晴与高蓄积性的长香谷相比，根的镉吸收能力均高。该结果显示：长香谷的地上部及谷粒中的镉高蓄积的主要原因不是因为从外部吸收镉的能力高。
因此，对日本晴及长香谷的导管液中的镉的浓度进行分析。具体而言，在含有0μM～5μM的镉的1/2木村B溶液中，将播种后第33天的长香谷及日本晴的幼苗的根培养3天，对培养后的导管液中的镉浓度进行测定。
图11是表示对长香谷及日本晴的导管液中所含的镉的浓度进行测定的结果的图表。在日本晴及长香谷的任一个品种中，培养液中所含的镉浓度为0.5μM时，导管液中所含的镉的浓度饱和。但是，长香谷的导管液中含有与日本晴相比8.5倍高的浓度的镉。
以上的生理学的分析结果显示：就长香谷的镉高蓄积性而言，不能将镉保留在根部，由此引起排出到导管的镉的量升高。即，可以认为，长香谷与日本晴相比，从根吸收镉的活性和将镉从根输送到地上部的活性高，因此，在长香谷的地上部及谷粒中高蓄积镉。
(4.转化株的功能分析)
对在长香谷中导入有OsHMA3n基因的转化株中的镉的蓄积进行研究。
使用日本晴的基因组DNA作为模板，将具有2.1kb的启动子和全长OsHMA3n基因的6.8kb的DNA片段利用PCR法进行扩增。为了扩增2个DNA片段而使用的一对引物分别为5’-atctagaAGCATAAAAGAATAGAGCCGTGGAC-3’(SEQ ID NO：5)及5’-GGATGCGTCAATCAGTTTACCA-3’(SEQ ID NO：6)；5’-GGCACAATGAACTTTGACGGT-3’(SEQ ID NO：7)及5’-CTCTTCTGGACAAGCTTCCTTAATC-3’(SEQ ID NO：8)。
首先，在pTA2载体中克隆2个DNA片段，其后，使用限制酶位点AflII连接。融合的6.8kb的DNA其后插入作为双元载体的pPZP2H-lac上。
制备的构建体通过使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，EHA101株)的方法转化来自长香谷的愈伤组织。
导入质粒之后，将转化植物在凝胶上进行预培养大约100天。将转化的小植物在营养溶液中栽培1～3周，其后，供于镉处理。就镉处理而言，在含有50nM CdSO4的营养溶液中将小植物暴露10天。处理溶液每2天进行更换。
图12是表示互补性测试的结果的图。图12的(a)表示在长香谷中导入有OsHMA3n的3种转化株及导入有空载体的对照株的地上部(Shoot)中的镉浓度，(b)表示根(Root)中的镉浓度。每个数据作为平均值±标准偏差表示(n＝3)。另外，使用邓奈特氏t检验(Dunnett’s t-test)进行统计分析。需要说明的是，图表中所示的“*”表示在危险率小于5％时在对照株和转化株之间存在显著差异，“**”表示在危险率小于1％时在对照株和转化株之间存在显著差异。
如图12的(a)所示，在长香谷中导入有OsHMA3n基因的转化株，其地上部中的镉的蓄积显著减少(p＜0.01)。与此相对，如图12的(b)所示，就在长香谷中导入有OsHMA3n基因的转化株而言，根中的镉的蓄积显著增加(p＜0.01)。
图13是表示在长香谷中导入有OsHMA3n基因的3种转化株及导入有空载体的对照株中的微量营养素(micronutrient)的浓度的图。将转化株及对照株在50nM镉中暴露10天。每个数据作为平均值±标准偏差表示(n＝4)。另外，使用邓奈特氏t检验进行统计分析。需要说明的是，图表中所示的“*”表示在危险率小于5％时在对照株和转化株之间存在显著差异。
图14是表示在长香谷中导入有OsHMA3n基因的3种转化株及导入有空载体的对照株中的大量营养素(macronutrient)的浓度的图。将转化株及对照株在50nM镉中暴露10天。每个数据作为平均值±标准偏差表示(n＝4)。
如图13及图14所示，关于根及地上部中的其它微量营养素或大量营养素的浓度，在对照和转化株之间存在差异。
由这些结果确认，OsHMA3基因为参与长香谷及日本晴的品种间中的镉蓄积的不同的基因。
(4.RNAi株的功能分析)
对在日本晴中利用RNAi敲低OsHMA3基因的表达的RNAi株中的镉的蓄积进行了研究。
为了制备发夹RNAi构建体，将OsHM 3n cDNA的511bp片段(从转录起始点893bp～1407bp)作为逆向重复(inverted repeat)克隆到pANDA载体中的玉米(maize)泛素启动子的控制下。为了制备具有泛素启动子的构建体，使用引物组5′-AGGATCCATGGCCGGAAAGGATGAGG-3′(SEQ IDNO：9)及5′-TGGATCCGCAACATCATCCTTTCACTTCACC-3′(SEQ IDNO：10)，利用PCR法由OsHMA3ncDNA扩增OsHMA3n基因及NOS终止子。将扩增的片段克隆到pANDA载体中，其后，与玉米的泛素启动子一起切下，亚克隆到pPZP2H-lac双元载体中。
制成的构建体利用土壤杆菌法导入于来自日本晴的水稻的愈伤组织。
图15是表示在日本晴中将利用RNAi敲低OsHMA3基因的表达的RNAi株及导入有空载体的对照株中的镉的蓄积量进行测定的结果的图。图15的(a)表示日本晴中的3种RNAi株及对照株的地上部中的镉浓度，(b)表示根中的镉浓度。将RNAi株及对照株在50nM镉中暴露10天。每个数据作为平均值±标准偏差表示(n＝3)。另外，使用邓奈特氏t检验进行统计分析。需要说明的是，图表中所示的“*”表示在危险率小于5％时、在对照株和RNAi株之间存在显著差异，“**”表示在危险率小于1％时、在对照株和RNAi株之间存在显著差异。
如图15的(a)所示，利用RNAi敲低OsHMA3基因的表达时，与对照株相比，RNAi株的地上部中的镉的浓度显著地上升为2.1～2.5倍(p＜0.05)。与此相对，RNAi株的根中的镉浓度与对照株相比，显著地降低至74～60％(p＜0.05)。
图16是表示在日本晴中利用RNAi敲低OsHMA3基因的表达的RNAi株及导入有空载体的对照株中的微量营养素的浓度的图。图16的(a)表示日本晴中的3种RNAi株及对照株中的OsHMA3基因的表达水平，(b)表示RNAi株及对照株的地上部及根中的微量营养素的浓度。
将RNAi株及对照株在50nM镉中暴露10天。图16的(a)表示相对于对照株中的OsHMA3基因的表达量的RNAi株中的OsHMA3基因的表达量。
每个数据作为平均值±标准偏差表示(n＝3)。另外，使用邓奈特氏t检验进行统计分析。需要说明的是，图表中所示的“*”表示在危险率小于5％时、在对照株和RNAi株之间存在显著差异，“**”表示在危险率小于1％时、在对照株和RNAi株之间存在显著差异。
如图16的(a)所示，与对照株相比，在RNAi株中，OsHMA3基因的表达量显著地减少。另外，如图16的(b)所示，关于根及地上部中的含有锌、铜、锰及铁的其它微量营养素的浓度，在RNAi株和对照株之间存在差异。
由这些结果可以进一步确认，OsHMA3基因为参与日本晴及长香谷的2种品种间中的镉的蓄积的不同的基因。
(5.OsHMA3基因的表达模式分析)
使用定量的实时定量RT-PCT法对2个品种不同的组织中的2种等位基因的表达水平进行分析。
就表达水平而言，使用以下的一对引物、使用ThunderbirdTM qPCR Mix(Toyobo制造)进行分析：
作为OsHMA3分析用，为5′-TCCATCCAACCAAACCCGGAAA-3′(SEQ ID NO：11)及5′-TGCCAATGTCCTTCTGTTCCCA-3′(SEQ ID NO：12)；作为内部标准的组蛋白H3分析用，为5′-GGTCAACTTGTTGATTCCCCTCT-3′(SEQ ID NO：13)及5′-AACCGCAAAATCCAAAGAACG-3′(SEQ ID NO：14)。
按照7500实时PCR系统(7500Real Time PCR System，AppliedBiosystems制造)收集数据。为了估计扩增产物的相对量，使用ΔCt法。实时定量PCR法的扩增效率利用将稀释的质粒DNA用作模板的标准曲线进行确认。OsHMA3n基因及OsHMA3a基因的扩增效率均为1.96。
图17是表示OsHMA3基因的表达模式的图。图17的(a)表示日本晴及长香谷的根及地上部中OsHMA3基因的2种等位基因的表达，(b)表示日本晴及长香谷的根的不同部分中2种等位基因的表达。
为了研究OsHMA3基因的表达模式，从日本晴及长香谷(分别12日龄)的地上部及根部提取RNA。另外，将日本晴及长香谷的苗在0μM CdSO4或1μM CdSO4中暴露24小时，其后，将根以0～1cm、1～2cm及2～3cm的部分切断，提取RNA。表达水平利用定量的RT-PCT法来实时确定。使用组蛋白H3作为内部标准。表达显示为相对于组蛋白H3的表达水平的表达量。数据作为平均值±标准偏差表示(n＝3)。另外，使用邓奈特氏t检验进行统计分析。需要说明的是，图表中所示的“*”表示在危险率小于5％时、在对照株和RNAi株之间存在显著差异。
如图17的(a)所示，在所比较的2个品种中，OsHMA3基因主要在根部表达，其表达水平与镉的蓄积相符。另外，如图17的(b)所示，利用空间的分析显示，OsHMA3基因的表达在根的不同部分间没有差异。而且表明，OsHMA3基因的表达不受镉暴露的影响。该结果显示，在2个品种中，OsHMA3基因组成型地表达。
(6.OsHMA3蛋白质的定位分析)
使用免疫染色及启动子-GFP转化水稻确认OsHMA3蛋白质的定位。
使用OsHMA3n蛋白质(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的第993位～第1004位合成肽免疫兔，获得针对OsHMA3蛋白质的抗体。在使用之前，对获得的抗血清通过肽亲和柱进行纯化。使用日本晴及长香谷(分别10日龄)的根进行OsHMA3蛋白质的免疫染色。二次抗体(Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG；Molecular Probes)的荧光利用共聚焦激光扫描显微镜(LSM700；Carl Zeiss制造)进行观察。
为了制备转化的pOsHMA3-GFP融合基因，使用引物组5′-ATCTAGAAGCATAAAAGAATAGAGCCGTGGAC-3′(SEQ ID NO：15)及5′-ATCTAGAATGCAAGTGGGGATCAAGGA-3′(SEQ ID NO：16)，利用PCR法从日本晴的基因组DNA扩增OsHMA3基因的2kb上游区域(自翻译起始密码子-34bp～-2094bp)。在pUC18载体(Takara)中，在GFP及NOS终止子的XbaI位点之间克隆启动子。将具有pOsHMA3n-GFP及NOS终止子的构建体亚克隆到pPZP2H-lac双元载体中。
制成的构建体利用土壤杆菌法导入于来自日本晴的水稻的愈伤组织。GFP信号利用共聚焦激光扫描显微镜(LSM700；Carl Zeiss制造)进行观察。
图18是表示水稻的根中的OsHMA3蛋白质的定位的图。图18的(a)表示长香谷的根中的免疫染色的结果，(b)表示日本晴的根中的免疫染色的结果。图中的比例尺相当于100μm。
如图18的(a)及(b)所示，利用使用抗OsHMA3多克隆抗体的免疫染色确认，OsHMA3蛋白质定位于根的全部细胞中。另外确认，在长香谷和日本晴中，OsHMA3蛋白质的定位没有差异。
图18的(c)表示转化有pOsHMA3n-GFP的日本晴的根中的GFP蛋白质的荧光，(d)表示野生型日本晴的根中的GFP蛋白质的荧光。图中的比例尺相当于100μm。
如图18的(c)所示，在OsHMA3n启动子的控制下连接有GFP的pOsHMA3n-GFP转化的日本晴在根的全部细胞中表达OsHMA3n蛋白质。与此相对，如图18的(d)所示，在野生型的日本晴中，没有观察到GFP信号。
虽然没有图示，但在使用抗OsHMA3抗体的过表达株的免疫染色中，OsHMA3蛋白质的信号显著增加。与此相对，在使用抗OsHMA3抗体的RNAi株的免疫染色中，OsHMA3蛋白质的信号显著降低。由这些结果确认用于免疫染色的抗OsHMA3抗体的特异性。
虽然没有图示，但在核外观察到OsHMA3蛋白质的信号。由此得知，OsHMA3蛋白质定位于液胞膜。
OsHMA3n基因的ORF及OsHMA3a cDNA片段使用引物组5′-ATCCGGAATGGCCGGAAAGGATGAGGC-3′(SEQ ID NO：17)及5′-TTCCGGATCCTTTCACTTCACCGGAG-3′(SEQ ID NO：18)进行扩增。将OsHMA3片段与具有接头序列(SGGGGGG)的GFP的3’末端连接，在pUC18(Takara)中置于CaMV35S启动子的控制下。将所得的质粒(pGFP-OsHMA3)或仅GFP通过使用有1100PSI压力盘的粒子轰击(PDS-1000/He粒子递送系统(PDS-1000/He particle delivery system)，Bio-Rad，http://www.bio-rad.com/)导入于洋葱表皮细胞中。GFP信号利用共聚焦激光扫描显微镜(LSM700；Carl Zeiss制造)进行观察。
图19是表示OsHMA3n蛋白质的细胞内定位的图。图19的(a)表示表达GFP-OsHMA3n蛋白质的洋葱表皮细胞中的GFP的荧光，(b)表示仅表达GFP蛋白质的洋葱表皮细胞中的GFP的荧光。图中的比例尺相当于100μm。
如图19的(a)所示，通过观察洋葱表皮细胞中的OsHMA3n-GFP融合蛋白质的瞬时性表达，得知OsHMA3n蛋白质定位于液胞膜中。虽然没有图示，但对OsHMA3a蛋白质也可得到同样的结果。而且，由GFP-OsHMA3n蛋白质或GFP-OsHMA3a蛋白质和作为内质网标记的DsRed-HDEL的共表达结果确认，OsHMA3蛋白质不是定位于内质网，而是定位于液胞膜中(没有图示)。
图20是表示蛋白免疫印迹分析的结果的图。从由日本晴(137日龄)制造出的OsHMA3n蛋白质的过表达株的根的全部提取微粒体，供于使用抗OsHMA3n抗体的免疫印迹分析。微粒体组分利用蔗糖密度梯度进行分级。作为一次抗体，使用抗OsHMA3多克隆抗体(100倍稀释)、抗γ-TIP多克隆抗体(液胞膜标记，1000倍稀释)及抗H+-ATP酶多克隆抗体(细胞膜标记)。作为二次抗体，使用ECL过氧化物酶标记抗兔抗体(10000倍稀释，GEHealthcare制造)，使用ECL Plus蛋白质印迹检测系统(ECL Plus westernblotting detection system，GE Healthcare制造)检测信号。
图20的(a)表示抗OsHMA3n抗体的特异性，(b)表示蔗糖密度梯度分析的结果。
如图20的(a)所示，利用使用针对OsHMA3蛋白质的抗体的免疫印迹分析，在所预测的大小观察到单一的条带，因此，确认该抗体的特异性。另外，如图20的(b)所示，利用蔗糖密度梯度分析，得知：OsHMA3蛋白质以与作为液胞膜标记的γ-TIP相同的分级存在。由这些结果得知：在水稻的根的细胞中，OsHMA3蛋白质定位于液胞膜中。
(6.酵母中的输送活性的分析)
为了分析长香谷和日本晴之间镉蓄积中的很大的不同，使每个基因在酵母中表达。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741株(Mat a；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)以及作为变异株的Δzrc1株(Mat a；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0；YMR243c::kanMX4)及Δcot1(Mat a；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0；YOR316c::kanMX4)由Euroscarf(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html)购入。
OsHMA3a基因及OsHMA3n基因利用PCR法进行扩增。将含有ORF的片段插入到作为酵母表达载体的pYES2中。
图21是表示与镉有关的酵母中的功能分析的结果的图。图21的(a)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3n基因、OsHMA3a基因、AtHMA3基因或2种嵌合体基因的任一种的野生型的酵母细胞(BY4741株)的葡萄糖存在下的生长，(b)表示半乳糖的存在下的生长。酵母在20μM CdSO4的存在下进行培养。
需要说明的是，N-OsHMA3n-C-OsHMA3a(OsHMA3na)及N-OsHMA3a-C-OsHMA3n(OsHMA3an)为在OsHMA蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)的第501位上表达融合有OsHMA3n蛋白质和OsHMA3a蛋白质的融合蛋白质(参照图22)的转化株。
图23是表示与镉有关的酵母中的功能分析的结果的图。图23的(a)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3n基因、OsHMA3a基因或AtHMA3基因的任一种的Δycf1酵母细胞的葡萄糖的存在下的生长，(b)表示半乳糖的存在下的生长。酵母在含有2μM镉的培养基中培养3天。
已知在pYES2载体中，来自在半乳糖的存在下被诱导的GAL1启动子的基因的表达在葡萄糖的存在下受到抑制。因此，为了抑制转导的基因的表达而将葡萄糖添加于培养基中，为了诱导转导的基因的表达而在培养基上添加半乳糖。
如图21的(a)所示，在葡萄糖的存在下，在具有含有OsHMA3n基因的质粒的酵母及具有含有OsHMA3a基因的质粒的酵母中，在对于镉的敏感性上存在差异。但是，如图21的(b)所示，在半乳糖的存在下，表达OsHMA3n基因的酵母对于镉的敏感性增强。另一方面，表达OsHMA3a基因的酵母显示与对照同样的生长。
另外，如图23的(a)及(b)所示，在作为镉敏感性变异体的Δycf1酵母中使OsHMA3a基因及OsHMA3n基因表达时，显示与图21相同的结果。由这些结果可以认为，OsHMA3n基因在酵母中作为镉转运蛋白起作用，OsHMA3a基因作为镉转运蛋白不起作用。
图24是表示与金属有关的酵母中的功能分析的结果的图。图24的(a)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3n基因、OsHMA3a基因、或作为阳性对照的AtHMA3基因的任一种的Δzrc1酵母株的半乳糖及4mM ZnSO4的存在下的生长，(b)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3n基因、OsHMA3a基因或作为阳性对照的AtHMA3基因的任一种的Δcot1酵母株的半乳糖及2.5mM CoCl2的存在下的生长，(c)表示转导有仅pYES2载体、OsHMA3a基因、OsHMA3aH80R基因、OsHMA3aV638A基因、OsHMA3aH80R/V638A基因或OsHMA3n基因的任一种的野生型酵母细胞的半乳糖及20μMCdSO4的存在下的生长。全部的酵母株在30℃下培养3天。
需要说明的是，OsHMA3aH80R、OsHMA3aV638A  及OsHMA3aH80R/V638A为OsHMA3a基因(SEQ ID NO：4)的碱基序列的第80位和/或第638位中的位点特异性突变体。
如图24的(a)所示，在转导有OsHMA3n基因的Δzrc1酵母株和转导有OsHMA3a基因的Δzrc1酵母株中，在对于锌的敏感性上存在差异。另外，如图24的(b)所示，在转导有OsHMA3n基因的Δcot1酵母株和转导有OsHMA3a基因的Δcot1酵母株中，在对于钴的敏感性上存在差异。与此相对，在转导有作为阳性对照的AtHMA3基因的Δcot1酵母株中，对于钴的敏感性增强。
OsHMA3蛋白质定位于水稻的根的液胞膜(图19的(a)及(b))。可以认为，在酵母中，只要OsHMA3蛋白质的定位相同，则有功能的OsHMA3蛋白质的表达使对于镉的耐性增强。但是，就表达OsHMA3n基因的酵母而言，对于镉的敏感性增强(图21的(b))。可以认为，该矛盾是由酵母中的OsHMA3蛋白质的定位错误引起的。具体可以认为，OsHMA3蛋白质在酵母中定位于内质网中(没有图示)。因此认为，有功能的OsHMA3蛋白质将镉输送到内质网，造成镉敏感性增强(图21的(b))。
为了分析成为OsHM 3a基因功能缺失的根本机制，制备2种OsHMA3a蛋白质及OsHMA3n蛋白质的嵌合体蛋白质。在OsHMA3a蛋白质和OsHMA3n蛋白质之间最不同部分位于C末端侧，在OsHMA3a蛋白质中，在被推定的金属结合结构域的重复内，53个氨基酸残基缺失(OsHMA3n蛋白质具有9个重复，OsHMA3a蛋白质具有6个重复)(参照图6)。
使用在OsHMA3a蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的第501位上将OsHMA3a蛋白质的N末端型与OsHMA3n蛋白质的C末端型融合的嵌合体蛋白质或在OsHMA3n蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的第501位上将OsHMA3n蛋白质的N末端型与OsHMA3a蛋白质的C末端型融合的嵌合体蛋白质(参照图22)，分析金属结合结构域重复在输送活性中的作用。
如在OsHMA3n蛋白质中所观察的那样，在N-OsHMA3n-C-OsHMA3a嵌合体蛋白质中，镉敏感性增强(图21的(b))。但是，在N-OsHMA3a-C-OsHMA3n嵌合体蛋白质中，镉敏感性没有变化(图21的(b))。这些结果显示，不是OsHMA3a蛋白质的C末端上的53残基的缺失，而是OsHMA3n蛋白质中的N末端区域在镉输送功能上是重要的。
将2种等位基因的N末端部分进一步进行比较。结果发现，使用跨膜结构域预测程序(SOSUI；http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)，OsHMA3a蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的第80位及第638位的氨基酸的变异导致所预测的跨膜结构域的数的不同。为了研究这些变异参与OsHMA3a蛋白质的功能的缺失，使用酵母表达系进行了位点特异性突变分析。
如图24的(c)所示，将OsHMA3a蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的第80位的组氨酸(His)取代为精氨酸(Arg)的蛋白质(H80R)，其对于镉的敏感性增强。但是，将第638位的缬氨酸(Val)取代为丙氨酸(Ala)的蛋白质(V638A)，其镉敏感性没有变化。该结果与嵌合体蛋白质的实验结果(图23的8b))一致。另外，第80位及第638位上的氨基酸取代体(H80R/V638A)，其对于镉的敏感性也增加(图24的(c))。由这些结果暗示：OsHMA3n蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的第80位的氨基酸有可能对OsHMA3n蛋白质的功能来讲是重要的。
(7.转化株的功能分析2)
为了研究通过操纵OsHMA3基因的表达水平的而降低谷粒中镉的蓄积的可能性，在作为镉低蓄积性品种的日本晴中，使OsHMA3n基因在玉米泛素启动子的控制下过表达。
图26是表示过表达株及载体对照株中的OsHMA3n基因的表达水平的图。表达水平作为相对于载体对照株的值表示。数据作为平均值±标准偏差表示(n＝3)。另外，使用邓奈特氏t检验进行统计分析。需要说明的是，图表中所示的“**”表示在危险率小于1％时、在载体对照株和过表达株之间存在显著差异。
如图26所示，确认：过表达株与载体对照株相比，OsHMA3基因的表达显著地增加。
将这些过表达株、载体对照株及没有转化的日本晴(非转化株)在中度镉污染的土壤(1.5mg Cd kg-1)中没有洪水淹没而栽培5个月。处理后，为了利用火焰原子吸收光谱法(Z-2000；日立制作所制造)测定镉及其它金属，对含有叶片(leafblade)及叶鞘的地上部、根以及糙米分开收获。
将结果示于图25。图25是表示与镉的蓄积及其它金属的蓄积有关的OsHMA3n基因的过表达的作用的图，(a)表示糙米中的镉的浓度，(b)表示糙米中的锌的浓度，(c)表示糙米中的铁的浓度。需要说明的是，数据作为平均值±标准偏差表示(n＝3)。另外，使用邓奈特氏t检验进行统计分析。需要说明的是，图表中所示的“**”表示在危险率小于1％时，在载体对照株和过表达株之间存在显著差异。
如图25的(a)所示，在镉污染土壤中进行栽培时，与载体对照株及非转化株相比，在过表达株中，糙米中的镉浓度显著地降低(p＜0.01)。另外，如图25的(b)及(c)所示，糙米中的锌及铁的浓度在载体对照株及过表达株之间没有差异。
图27是表示与镉的蓄积及其它金属的蓄积有关的OsHMA3n基因的过表达的作用的图，(a)表示地上部的镉的浓度，(b)表示地上部的锌的浓度，(c〕表示地上部的铁的浓度。需要说明的是，数据作为平均值±标准偏差表示(n＝3)。另外，使用邓奈特氏t检验进行统计分析。需要说明的是，图表中所示的“**”表示在危险率小于1％时、在载体对照株和过表达株之间存在显著差异。
如图27的(a)～(c)所示，在地上部中，也观察到与糙米相同的趋势。工业上应用的可能性
根据本发明，可以生产使镉的蓄积的位置变化的转化植物。所述的转化植物可以应用于各种用途。例如，使镉的蓄积的位置变化为在根部的转化植物在含有镉的土壤中也可以栽培。另外，使镉的蓄积的位置变化为在除根以外的植物体内的转化植物可以用于净化含有镉的土壤。因此，本发明可以在农业方面优选应用。
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Claims (4)

1.一种转基因植物的生产方法，其使镉的蓄积的位置变化，其特征在于，将下述(a)～(d)中任一种多核苷酸导入到植物中以使所述多核苷酸能够表达：
(a)编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码包含通过SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸；
(c)编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(d)编码包含通过SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列且编码具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的转基因植物的生产方法，其特征在于，所述植物为禾本科植物。
3.一种转基因植物，其特征在于，利用权利要求1或2所述的转基因植物的生产方法来生产。
4.一种试剂盒，其用于制备使镉的蓄积的位置变化的转基因植物，其特征在于，含有下述(a)～(d)中任一种多核苷酸：
(a)编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码包含通过SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸；
(c)编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(d)编码包含通过SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸的取代、缺失、和/或添加产生的氨基酸序列，且具有使镉的蓄积的位置变化的活性的多肽的多核苷酸。
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