CN102187845B

CN102187845B - 一种提高蚕丝产量的转基因方法

Info

Publication number: CN102187845B
Application number: CN 201010118072
Authority: CN
Inventors: 李胜; 马俐; 夏庆友; 徐汉福
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS; Southwest University
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS; Southwest University
Priority date: 2010-03-05
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2030-03-05
Also published as: CN102187845A

Abstract

本发明涉及一种提高蚕丝产量的转基因方法，可通过在家蚕后丝腺中特异性表达促细胞生长基因，获得后丝腺增大的家蚕，所述的家蚕高产蚕丝。本发明提供了促后丝腺生长的基因，还提供了适合的在家蚕后丝腺中特异性高表达促后丝腺生长的基因的表达系统。本发明为家蚕品种的产丝性状改良提供新的手段和方法。

Description

一种提高蚕丝产量的转基因方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高蚕丝产量的转基因方法。

背景技术

家蚕是一种重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物。在过去几千年中，家蚕的蚕丝产量的提高主要通过传统育种的方法来实现，存在着育种周期长，操作复杂，性状保持不稳定，优良性状难以整合等问题。随着家蚕基因组框架图(2004)及精细图谱(2008)绘制工作的陆续完成，标志人类对家蚕的研究和认识开始进入后基因组时代，利用高效稳定的遗传操作技术从基因组水平对家蚕的经济性状进行改良成为一种可能。

在现代生物学研究中，转基因技术发挥着日益重要的作用，它通过将人工分离或修饰过的基因有效导入生物体基因组中，实现同源的基因过表达或失活，异源基因的过表达，是一种强有力的遗传操作工具。以往的转基因技术中对外源基因的表达凋节主要有两种方法：第一种是将靶基因接入到特异性启动子的下游来调控靶基因的表达，可对靶基因信号转导通路中的具体功能进行系统研究；第二种是利用热休克蛋白启动子(Heat Shock Promotor，Hsp)调节靶基因的表达，可通过调节热休克时间和温度来控制调节靶基因表达的时间和表达水平。这两种方法已得到广泛的应用，但由于在这两种系统中都是启动子直接调节靶基因表达，因此存在一定的局限性。前者的靶基因表达水平只能通过插入点的位置效应和改变基因拷贝数来进行调节，操作上比较困难。此外，如果靶基因是致死基因，这种转基因系则无法建立。而热休克蛋白由于在生物体中普遍存在，可导致后者表达缺乏特异性，另外在表达量上也存在不足。

来源于鳞翅目昆虫细胞系的杆状病毒的转座子PiggyBac由于其较广的寄主范围及较高的转座效率自2000年开始被利用为转基因载体进行家蚕的转基因研究。通过国内外科学家的不懈努力，家蚕转基因技术日趋成熟稳定，并在基础科学及应用研究等方面发挥较大的作用。鉴于目前大部分家蚕生产性品种为滞育性品种，而针对滞育性品种的家蚕转基因技术也已建立(家蚕滞育品种的转基因方法，申请号200910103397.6)。

尽管目前通过转基因技术来改造家蚕以获得改良的品种在理论上完全可以实现，然而仍然缺乏可切实有效地通过转基因技术来获得高产蚕丝的家蚕的技术。因此，本领域还需要继续进行深入研究，以开发出方便有效的提高家蚕蚕丝产量的产品和方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高蚕丝产量的转基因方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备蚕丝产量高、蚕丝性能改善的家蚕的方法，在家蚕后丝腺表达促细胞生长基因。

在一个优选例中，所述的方法是转基因方法。

在另一优选例中，所述的促细胞生长基因促家蚕后丝腺增大。

在另一优选例中，所述的促细胞生长基因选自(但不限于)：GTP结合蛋白Ras1基因，PI3K基因(胰岛素信号通路相关基因)，InR基因(胰岛素信号通路相关基因)，Akt基因(胰岛素信号通路相关基因)，Yorkie基因(Hippo信号通路相关基因)。

较佳地，采用选用家蚕本身的GTP结合蛋白Ras1基因。更佳地，采用Ras1基因点突变后形成具持久活性的Ras1^CA，编码Ras1^v12。

在另一优选例中，所述蚕丝产量高、蚕丝性能改善包括：蚕茧体积增大，蚕茧重量增加，蚕丝增长，蚕丝强度增强或蚕丝韧性增加。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)提供一种构建物1，依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：家蚕后丝腺特异性表达启动子，半乳糖调节上游启动子元件(GAL4)；将所述构建物转化家蚕，获得家蚕转基因后代1；

(2)提供一种构建物2，依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：下游激活序列(UAS)，促进细胞生长的基因；将所述构建物转化家蚕，获得家蚕转基因后代2；和

(3)将家蚕转基因后代1和家蚕转基因后代2进行杂交，得到后丝腺表达促细胞生长基因的家蚕。

在另一优选例中，所述方法包括：

提供一种构建物，含有构建物1和构建物2；所述的构建物1依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：家蚕后丝腺特异性表达启动子，半乳糖调节上游启动子元件(GAL4)；所述的构建物2依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：下游激活序列(UAS)，促进细胞生长的基因；将所述构建物转化家蚕，得到后丝腺表达促细胞生长基因的家蚕。

在另一优选例中，所述方法包括：

(S1)提供一种构建物1，依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：家蚕后丝腺特异性表达启动子，半乳糖调节上游启动子元件(GAL4)；

(S2)提供一种构建物2，依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：下游激活序列(UAS)，促进细胞生长的基因；

(S3)将(S1)和(S2)的构建物转化家蚕，得到后丝腺表达促细胞生长基因的家蚕。

在另一优选例中，构建物1中，还含有：表达报告基因1的表达盒1；构建物2中，还含有：表达报告基因2的表达盒2；且所述的报告基因1不同于报告基因2；

选择同时呈现报告基因1相应表型和报告基因2相应表型的家蚕，该家蚕是后丝腺变大、蚕丝产量高、蚕丝性能改善的家蚕。

在另一优选例中，所述的报告基因1和报告基因2选自(但不限于)：绿色荧光蛋白(GFP)基因，增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因，红色荧光蛋白(DsRed2)基因。

在另一优选例中，所述的表达盒1依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：3XP3启动子，报告基因1，终止子(较佳地，所述终止子是SV40终止子)；或

所述的表达盒2依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：3XP3启动子，报告基因2，终止子(较佳地，所述终止子是SV40终止子)。

在另一优选例中，所述的家蚕后丝腺特异性表达启动子选自(但不限于)：丝心蛋白轻链启动子(Fil)，丝心蛋白重链启动子(Fih)，p25启动子。

在另一优选例中，构建物1中，半乳糖调节上游启动子元件(GAL4)下游还包括一终止子(较佳地，所述终止子是HSP70终止子)；或

构建物2中，促细胞生长基因下游还包括一终止子(较佳地，所述终止子是SV40终止子)。

在另一优选例中，所述的构建物是以转座子作为骨架的转基因表达载体。

在另一优选例中，所述的表达载体是：基于鳞翅目昆虫细胞系的杆状病毒的转座子PiggyBac的转基因载体。

在另一优选例中，所述的家蚕：

后丝腺重增加(或后丝腺增大)；

后丝腺中GTP结合蛋白Ras1表达水平增加；

后丝腺中bHLH(一种与产丝量正相关的转录因子)表达水平增加；

后丝腺中Ras-GTP表达水平增加；或

后丝腺中磷酸化MAPK(与细胞生长有关)、Akt(胰岛素信号传导下游重要调节因子)、S6K或4EBP(TOR信号途径中调控蛋白合成的重要因子)的含量增加。

在另一优选例中，所述的构建物中，各元件之间直接相连，或者，各元件之间还含有其它核苷酸序列。

另一方面，提供一种由所述的方法制备获得的家蚕，该家蚕是蚕丝产量高、蚕丝性能改善的家蚕。

另一方面，提供一种用于制备蚕丝产量高、蚕丝性能改善的家蚕的试剂盒，所述试剂盒中含有：

(1)一种构建物1，依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：家蚕后丝腺特异性表达启动子，半乳糖调节上游启动子元件(GAL4)；

(2)一种构建物2，依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：下游激活序列(UAS)，促细胞生长基因。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还含有家蚕(如一种野生型家蚕，如大造)的卵。

另一方面，提供一种促细胞生长基因或其编码的蛋白的用途，用于制备蚕丝产量高、蚕丝性能改善的家蚕。

在一个优选例中，所述的促细胞生长基因或其编码的蛋白还用于：增加家蚕后丝腺中bHLH表达水平；增加家蚕后丝腺中Ras-GTP表达水平；或增加家蚕后丝腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量。

在一个优选例中，所述的促细胞生长基因选自：GTP结合蛋白Ras1基因，PI3K基因，InR基因，Yorkie基因。较佳地，所述的促细胞生长基因是GTP结合蛋白Ras1基因。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了构建的转基因载体的示意图，其中图1A为载体Fil-GAL4/3XP3-DsRed的基本结构，图1B为转基因载体UAS-Ras1^V12/3XP3-EGFP的基本结构。

图2显示了两种转基因家蚕杂交试验获得的子代(E(-)D(-)，E(+)D(-)，E(-)D(+)，E(+)D(+))幼虫基因型的示意图。

图3A显示了两种转基因家蚕的杂交后代(E(-)D(-)，E(+)D(-)，E(-)D(+)，E(+)D(+))的后丝腺(左)，蚕茧(中)和蛹(右)的表型观察。在比较时，将四种基因型分为两组进行比较，其中一组为E-D-E+D-和E-D+，另一组为E+D+，这两组分别取一平均水平进行比较。

图3B显示了两种转基因家蚕的杂交后代(E(-)D(-)，E(+)D(-)，E(-)D(+)，E(+)D(+))的后丝腺、总丝腺、总虫重及之间比例的生物学统计。

图3C显示了两种转基因家蚕的杂交后代(E(-)D(-)，E(+)D(-)，E(-)D(+)，E(+)D(+))的后丝腺中的Ras1表达水平，以及bHLH表达水平的比较。

图4显示了两种转基因家蚕的杂交后代(E(-)D(-)，E(+)D(-)，E(-)D(+)，E(+)D(+))的Ras-GTP的表达水平检测和比较。

图5显示了两种转基因家蚕的杂交后代(E(-)D(-)，E(+)D(-)，E(-)D(+)，E(+)D(+))的丝腺中的磷酸化MAPK、Akt、S6K和4EBP含量比较。

图6显示了Olympus倒置荧光显微镜下观察家蚕后丝腺情况。a和b图为100倍视野下野生型与双阳性家蚕后丝腺的横切面比较。c和d图是在200倍视野下野生型与双阳性家蚕后丝腺的横切面比较。

图7上图显示了扫描电子显微镜下观察细胞核核区染色质。图7下图显示了扫描电子显微镜下观察细胞核四周粗面内质网、囊泡和线粒体的数量和分布。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，意外地发现增大家蚕后丝腺可以提高蚕丝产量，可通过在家蚕后丝腺中特异性高表达促细胞生长基因或促后丝腺增大基因，获得后丝腺增大(包括重量和体积增加)的家蚕，所述的家蚕高产蚕丝、且蚕丝性能改善。本发明人还找到了较佳的促后丝腺生长的基因——GTP结合蛋白Ras1(后文简称Ras1)。本发明人还设计了合适的在家蚕后丝腺中特异性高表达促细胞生长基因的表达系统。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。组织或器官特异型启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。

如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。“组织特异性”又称“器官特异性”，在一些调控元件的调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出其相关的发育调节的特性。本发明中，所述的“后丝腺特异性表达”是指在家蚕后丝腺中特异表达。通常，如果在家蚕后丝腺中mRNA以比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍水平被表达，则认为相关基因的表达是家蚕后丝腺特异性的。

如本文所用，所述的“蚕丝产量高的家蚕”是指一种转基因家蚕的后代，其在同样的生长条件下比野生型家蚕的蚕丝产量高10％或更高(较佳地高20％或更高；更佳地高40％或更高；如高50％，60％，80％，100％，200％或更高)。

如本文所用，所述的“后丝腺增大的家蚕”是指一种转基因家蚕的后代，其在同样的生长条件下比野生型家蚕的后丝腺大10％或更大(较佳地大20％或更高；更佳地大40％或更高；如大50％，60％，80％，100％，200％或更大)；或后丝腺重量增加10％或更多(较佳地增加20％或更多；更佳地增加40％或更多；如增加50％，60％，80％，100％，200％或更多)。

如本文所用，术语“含有”、“包括”或“具有”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。

如本文所用，所述“蚕丝产量高、蚕丝性能改善”包括：蚕茧体积增大，蚕茧重量增加，蚕丝增长，蚕丝强度增强或蚕丝韧性增加等。蚕丝属于天然高分子材料，分子与分子间是比较弱的范德华力，但因为含氢键，并且分子链间相互绞合，这种力还是很大的，所以具有一定的强度。强度与韧性是做为蚕丝纤维经济性状的重要衡量指标，强度与韧性的增强可扩大蚕丝的运用范围。

促细胞生长基因

为了提高蚕丝的产量，本发明人经过广泛研究，结果发现通过增大家蚕的后丝腺(即：促进家蚕的后丝腺生长)可以非常有效地提高蚕丝产量。后丝腺增大的家蚕其体重增加，且产生的蚕茧也明显增大。本发明人还意外地发现，促细胞生长基因可增大家蚕后丝腺，增加蚕丝产量，提高蚕丝品质。

因此，一类促细胞生长基因或后丝腺增大基因均包括在本发明中，作为对于提高蚕丝的产量有用的物质。所述的促细胞生长基因或后丝腺增大基因包括(但不限于)：促进细胞生长、增殖或分裂的基因，如和营养代谢相关的胰岛素信号通路重要基因PI3K、InR、Akt(参考文献Regulation of tissue growth throughnutrient sensing.Hietakangas V，Cohen SM.Annu Rev Genet.2009；43：389-410)以及参与细胞增长的Hippo信号通路中的Yorkie基因(参见Yorkie；Regulation ofOrgan Size：Insights From theDrosophila Hippo Signaling Pathway 2009 MadhuriKango-Singhl and Amit Singh2，3DEVELOPMENTAL DYNAMICS 238：1627-1637 Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila andmammals.Dong J，Feldmann G，Huang J，Wu S，Zhang N，Comerford SA，GayyedMF，Anders RA，Maitra A，Pan D.Cell.2007Sep 21；130(6)：1120-33)。这些促细胞生长基因的变体也可用于本发明的方法。

本发明人还找到了较佳的促后丝腺生长的基因Ras1，其对于家蚕的后丝腺的增大具有明显的促进作用，该基因在后丝腺中过表达后，家蚕的体重、后丝腺重均有明显增加，产生的蚕茧和蚕蛹也明显增大；也即：过表达Ras1基因使得家蚕的蚕丝产量有明显的提高。因此，作为本发明的优选方式，所述的促细胞生长基因或后丝腺增大基因是Ras1基因(参考文献Ras Activity in theDrosophila Prothoracic Gland Regulates Body Size and Developmental Rate viaEcdysone Release Philip E.Caldwell，Magdalena Walkiewicz，and Michael Stem2005 Current Biology 15 1785-1795)。Ras1基因编码一种小GTP结合蛋白，具有控制细胞增殖的重要作用，它主要是通过调节下游MAPK及PI3K/AKT信号通路来行使功能。其活性形式的体现是通过与GTP(三磷酸鸟苷)结合来激活下游通路，失活时则改为结合GDP(二磷酸鸟苷)并无法激活下游通路。

所述的Ras1基因编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(NCBI登录号BAD13777.1)的蛋白或其衍生蛋白。所述的衍生蛋白是：将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，该衍生蛋白也具有促进细胞生长或增大家蚕后丝腺功能。较佳地，所述的Ras1基因具有SEQ ID NO：1(Ab176555核苷酸序列中第212-790位)所示的核苷酸序列。本发明还涉及：严格条件下能够与Ras1基因的核苷酸序列杂交且编码的蛋白也具有促进细胞生长或增大家蚕后丝腺功能的核酸。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与所述Ras1基因或其突变体(如Ras1^v12)的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少80％，较佳地至少90％，更佳地至少95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的Ras1蛋白或其衍生蛋白也具有促进细胞生长或增大家蚕后丝腺的功能。

较佳地，本发明采用一种突变形式的Ras1基因(Ras1^CA，编码Ras1^v12蛋白)，其可保持持续活性表达形式。所述的突变形式的Ras1基因编码的蛋白的第12位氨基酸甘氨酸(Glycine，缩写G)突变为缬氨酸(Valine，缩写V)，其可持续性结合GTP，从而一直激活其下游信号通路。而在正常情况下Ras1与GTP或GDP的结合是由细胞根据需要维持在一个动态平衡的状态。

本发明还包括与本发明的Ras1基因序列具有80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上相同性的核酸，所述核酸编码的蛋白也具有促进细胞生长或增大家蚕后丝腺的功能。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。

所述的Ras1基因还用于：增加家蚕后丝腺中bHLH表达水平；增加家蚕后丝腺中Ras-GTP表达水平；或增加家蚕后丝腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量。

提高蚕丝产量的方法

在得知了所述的促细胞生长基因的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的促细胞生长基因的表达。比如，可通过本领域人员已知的途径将携带促细胞生长基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点(特别是家蚕后丝腺)上，并使之表达活性的促细胞生长蛋白。例如：可设计含有促细胞生长基因的表达盒，使该表达盒在家蚕(特别是家蚕后丝腺)中表达，从而使家蚕(特别是家蚕后丝腺)表达(或过表达)促细胞生长蛋白。所述的含有促细胞生长基因的表达盒通常含有促细胞生长基因以及与之操作性相连的其它元件，这些元件包括但不限于：启动子、增强子、终止子等。所述的启动子可以是组织或器官特异性的；当需要在家蚕后丝腺中特异性表达时，所述的启动子是后丝腺特异表达启动子。所述的表达盒通常可包含在表达载体中用于转化动物。

为了通过转基因方法提高蚕丝的产量，本发明人长期以来作过多方面的尝试，最终发现利用GAL4/UAS转基因系统在家蚕后丝腺中过表达Ras1对于提高家蚕蚕丝的产量是非常高效的。

GAL4(Galactose-Regulated Upstream Promoter Element 4，GAL4)是半乳糖调节上游启动子元件，是酵母中类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。下游激活序列UAS(upstream active sequence，UAS)是酵母中另一种类似高等真核生物增强子的序列。GAL4通过与UAS相结合，调节与半乳糖代谢相关基因的表达。GAL4/UAS系统的基本原理在于：GAL4-组织特异性启动子和UAS驱动靶基因分别存在于两个转基因系中。GAL4转基因系中有转录激活子，但没有靶基因；在UAS-靶基因系中，转录激活子不存在，因而靶基因处于沉默状态，只有将GAL4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交，才可能产生表达靶基因的后代。

因此，本发明提供一种制备蚕丝产量高的家蚕的方法，所述方法包括：

(2)提供一种构建物2，依次含有以下可操作性相连的元件(5’→3’)：下游激活序列(UAS)，促细胞生长基因；将所述构建物转化家蚕，获得家蚕转基因后代2；和

参照以上方法，还可以进行合理的变通，这是本领域人员在参考了以上方法后易于做到的。例如：也可以将两个构建物(较佳地还包括辅助质粒)一起转入到家蚕中，直接筛选阳性后代；以及将两个构建物直接接入到一个载体中，转入(较佳地还同时转入辅助质粒)到家蚕中，筛选阳性后代。

所述的家蚕后丝腺特异性表达启动子可以是任何特异性指导基因在家蚕后丝腺表达的基因。例如可选自(但不限于)：丝心蛋白轻链启动子(Fil)，丝心蛋白重链启动子(Fih)或p25启动子。启动子的变体也包括在本发明中，例如与所述启动子在严格条件下可杂交；或与所述启动子具有80％以上相同性，较佳地90％(更佳地95％以上，如98％，99％)以上序列相同性的变体。作为本发明的优选方式，所述的家蚕后丝腺特异性表达启动子是丝心蛋白轻链启动子，其核苷酸序列如GenBank登录号gi：289362中第378-1078位所示。在该片段内进行1-30bp(较佳地1-20bp；更佳地1-10bp)内核苷酸缺失或突变，不会影响该序列启动子活性。该启动子特别适合于与GAL4共同作用，驱动促细胞生长基因的表达。通过比较分析发现，丝心蛋白轻链启动子的非常适合于本发明的方法。蚕茧主要由在后丝腺分泌丝心蛋白和中丝腺分泌的丝胶蛋白两部分组成，其中丝心蛋白在蚕茧中比例达到70-80％。作为丝素蛋白的重要组成部分丝心蛋白轻链(Fibroin light chain)，其启动子具有很高的活性，且不同家蚕品种的丝心蛋白轻链同源性很高，核苷酸序列同源性可达到95.6％。

较佳地，步骤(1)的构建物中，半乳糖调节上游启动子元件(GAL4)下游还包括一终止子；较佳地，所述终止子是HSP70终止子。步骤(2)的构建物中，促细胞生长基因下游还包括一终止子；较佳地，所述终止子是SV40终止子。从效果来看，分别采用不同的终止子(HSP70终止子和SV40终止子)优于都用SV40终止子这一情况。

为了便于杂交后代的筛选，作为本发明的优选方式，可以在两种构建物中分别插入报告基因。当两种构建物分别被转入家蚕后，获得的转基因后代可显示出各自体内存在的报告基因的相关特性或表型。当分别携带各自的报告基因的转基因家蚕进行杂交获得杂交后代后，可通过鉴定报告基因的表达情况，从而选择到同时携带两种报告基因的杂交后代。

对于报告基因的选择没有特别的限制，只要其能够呈现出一种独特的、便于选择的特性或表型。所述的报告基因例如可选自(但不限于)：绿色荧光蛋白(GFP)基因，增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因，红色荧光蛋白(DsRed2)基因，β-半乳糖苷酶(lacZ)基因。如本文所用，“绿色荧光蛋白”是指一种标记蛋白，其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且见光不易淬灭。绿色荧光蛋白的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会。“增强的绿色荧光蛋白”为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白，例如，可克隆自质粒pEGFP-N1(购自Clontech)。如本文所用，“DsRed2”是指来源于珊瑚虫红色荧光蛋白，其内源荧光基团在受到黄光激发时高效发射清晰可见的红光，波长范围广且不易淬灭，经常与其它荧光蛋白配合使用进行多种标记。

本发明所述的报告基因的表达盒是指一套可表达报告基因的基因系统，通常在5’至3’方向上包括了元件：启动子、报告基因和终止子。

以上构建物中，各元件之间直接相连，或者，各元件之间还含有其它核苷酸序列，所述其它核苷酸序列的长度在1-500bp，较佳地1-200bp，更佳地1-50bp，更佳地1-30bp，更佳地1-15bp，如5bp，10bp。当然，其它长度(如更长)的间隔序列也是可以存在的，只要其存在不影响上述各元件之间的操作性相连，不抑制基因的转录和表达。

作为本发明的优选方式，所述的构建物是表达载体。“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可用的。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件，优选地还包含一个或多个选择性标记基因。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的重组表达载体。较佳地，所述的表达载体是以转座子作为骨架的转基因载体。多种转基因都是可用的，例如PiggyBac转基因载体或Minos转基因载体(参考文献Uchino K等；2008.Construction of a piggyBac-basedenhancer trap system for the analysis of gene function in silkworm Bombyx mori.Insect Biochem Mol Biol.38，1165-1173)。

较佳地，所述的表达载体是基于鳞翅目昆虫细胞系的杆状病毒的转座子PiggyBac的转基因载体。在基于PiggyBac的转化方法中，可以分别将两个构建物连同辅助质粒转入到家蚕中，筛选到阳性后代再进行杂交；也可以将两个构建物与辅助质粒一起转入到家蚕中，直接筛选阳性后代；以及将两个构建物直接接入到一个载体中，和辅助质粒转入到家蚕中。

将构建物转入家蚕的转化方法除显微注射法外，不排除用其他方法进行家蚕转基因，如精子介导法，参考文献：郭秀洋，周泽扬，冯丽春，汪琳，鲁成，向仲怀；2001；利用精子介导法向蚕卵导入外源基因的研究；生物化学与生物物理进展；28(3)423-425。

在本发明的较佳实施方式中，利用在后丝腺特异性表达的丝心蛋白轻链启动子驱动的GAL4系(Fil-GAL4)，而靶基因选用在多种模式动物进行广泛及深入研究的可有效促进细胞生长及增殖的GTP结合蛋白Ras1，将其突变为持续活性表达形式Ras1^V12连入到UAS后(UAS-Ras1^V12)，通过PiggyBac转基因载体以二化性生产品种大造为材料显微注射获得两种质粒的转基因家蚕后代后，进行杂交得到双阳性后代，发现其个体大小，后丝腺体积以及蚕茧大小与野生型或单阳性后代相比都有显著的提高，随后用表型观察，生物学统计，分子生物学方法进行了验证。

本发明还包括利用上述方法获得的体重增加、后丝腺增大、蚕丝产量高的转基因家蚕的后代。此外，相对于野生型家蚕，本发明的方法获得的家蚕还具有以下特性：后丝腺中GTP结合蛋白Ras1表达水平增加；后丝腺中bHLH表达水平增加；后丝腺中Ras-GTP表达水平增加；或后丝腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量增加。

本发明还包括利用上述方法获得的各种家蚕转基因后代，或者是它们的卵。

试剂盒

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于制备蚕丝产量高的家蚕的试剂盒，所述试剂盒中含有：

较佳地，每一构建物中还分别含有一报告基因。

上述的构建物1和构建物2可以存在于一个总的构建物中，用于转化家蚕；也可分别转化家蚕。

所述的试剂盒中还可含有家蚕(如一种野生型家蚕)卵。以便于人们将之作为转基因的受体。

所述的试剂盒中还可含有转基因操作中有用的试剂和材料，以便于人们进行转基因操作。例如含有：PBS注射缓冲液，注射用辅助质粒(含有PiggyBac转座酶的编码基因)，显微注射针等。

此外，所述的试剂盒中还可含有使用说明书。

本发明的主要优点在于：

1.与家蚕传统育种相比，首次直接在产丝的主要器官后丝腺表达(过表达)促细胞生长基因，从而促使后丝腺体积和重量增长，进而在产丝量上有了较为明显的提高。为家蚕品种的产丝性状改良提供一个新的手段和方法。

2.作为一种优选方法，本发明以GAL4/UAS双荧光转基因家蚕系统为平台，在家蚕后丝腺特异性过表达促细胞生长基因或促后丝腺生长的基因(Ras1^v12)，发现双阳性后代的后丝腺体积和重量与野生型相比增加近1倍，上蔟吐丝形成的蚕茧与野生型相比也有明显的增大，并且在个体总重量上与野生型相比也有一定的增加。为提高特定品种家蚕的产丝经济性状提供了有力的途径。

3.利用本发明的方法针对生产性品种进行蚕丝性状的改良，可以直接将生产品种作为遗传操作材料，避免烦琐而漫长的育种周期，直接利用转基因技术创造出高蚕丝产量的品种，大大缩短育种周期，也节省大量的人力和物力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、构建转基因载体

Fil-GAL4/3XP3-DsRed见图1A。UAS-Ras1^V12/3XP3-EGFP见图1B。上述两种载体均以Piggybac转座子为转基因基本骨架，其中GAL4系选用在后丝腺特异性表达的丝心蛋白轻链作为启动子，筛选标记选用在眼和神经节特异性表达的人工启动子3XP3驱动的红色荧光DsRed2。UAS系携带持续活性形式的Ras1^v12，筛选标记改为绿色荧光EGFP。

Fil-GAL4/3XP3-DsRed载体构建过程，其中原始载体为pBacA3-GAL4/3XP3-DsRed(获自日本国立农业科学研究院，参考文献AnjangTan，Hiromasa Tanaka，Toshiki Tamura，Takahiro Shiotsuki 2005.Precociousmetamorphosis in transgenic silkworms overexpressing juvenile hormone esterase.Proc Natl Acad Sci.102 11751-11756)，该载体A3启动子两端分别具有AscI与SacII位点，将Fil启动子利用引物上游5’-attGGCGCGCCtgc atattggaca tcc-3’(大写为AscI限制性酶切位点)，下游5’-attCCGCGGtaggcttcattttagtggtctgt-3’(大写为SacII限制性酶切位点)将Fil基因组序列上游692bp包含了TATA box的启动子序列用PCR方法从家蚕基因组中扩增出来连入T载体测序确认后，利用AscI酶与SacII酶将该片段与pBacA3-GAL4/3XP3-DsRed进行酶切连接，得到pBacFil-GAL4/3XP3-DsRed载体。

UAS-Ras1^V12/3XP3-EGFP载体构建利用pUAS-EGFP-N1载体(获自clontec公司；目录号6085-1)。将Ras1蛋白(GenBank登录号：ab176555)编码序列克隆入T载体，利用Overlapping PCR方法将Ras1蛋白第12位氨基酸对应的密码子GGA突变为GTA(甘氨酸→缬氨酸)，将突变后的Ras1^v12利用引物上游5’-cgcGAATTCatgaccgag tacaaattgg tggt-3’(大写为EcoRI限制性酶切位点)，下游5’-taaGCGGCCGCttaaaaaagggtgcaatctttaat-3’(大写为NotI限制性酶切位点)从包含该片段的T载体扩增出后，用EcoRI与NotI分别将Ras1^v12与pUAS-EGFP-N1进行酶切连接，得到UAS-Ras1^V12片段，再次利用该片段两端的NheI和AflII酶切位点进行酶切连入到包含同样位点的pBac3XP3-EGFP(获自南方模式动物研究中心，参考文献Dai H，Jiang R，Wang J，Xu G，Cao M，Wang Z，Fei J.2007.Development of a heat shock inducible and inheritableRNAi system in silkworm.Biomol Eng.24，625-630)中得到pBacUAS-Ras1^V12/3XP3-EGFP。

实施例2、转基因蚕获得及杂交后代的实验分析

在二化性品种大造(获自西南大学)上通过显微注射方法分别获得以上两种质粒的转基因家蚕。具体方法：待蚕蛹羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃弱光下交配4小时候拆对，将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每隔半小时收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃环境中保护。并在产卵3小时内用Eppendorf显微注射仪，将10-15nl，总浓度400ng/ul的Fil-GAL4/3XP3-DsRed或UAS-Ras1^V12/3XP3-EGFP携同辅助载体(pigA4，获自西南大学)，注射到蚕卵中，用无毒胶水封住注射口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，将孵化出的G0代蚁蚕用人工饲料饲养至化蛾，获得的G0代蚕蛾，通过自交或回交得到G1代蚕卵，用Olympus荧光显微镜筛选，分别得到绿色荧光及红色荧光阳性的蛾圈。

将前述分别转入两种质粒的转基因家蚕进行杂交试验，对获得的子代幼虫基因型进行荧光鉴定(共四种，1.无任何荧光E(-)D(-)，2.只有绿色荧光E(+)D(-)，3.只有红色荧光E(-)D(+)，4.既有红色荧光又有绿色荧光E(+)D(+))。待发育至5龄末期(从卵中孵化出后经4次蜕皮的家蚕)上蔟后，将蚕分别从总体重、总丝腺重、后丝腺重三方面进行称量并取出后丝腺进行后续试验，对上蔟后吐丝结成的蚕茧以及化蛹情况进行了初步观察。

两种转基因家蚕杂交试验获得的子代幼虫基因型鉴定结果见图2。

A.后丝腺，蚕茧和蛹的表型观察

在对四种基因型的家蚕后丝腺，蚕茧及蛹进行表型观察时发现，GAL4/UAS双色荧光阳性后代与单阳性及野生型后代相比均有较显著的增大，见图3A。初步证实，在后丝腺中过表达Ras1^v12可从后丝腺，虫重及蚕茧大小上对家蚕带来正面的增强效应。蚕茧变大也即表明蚕丝的产量增加。

进行比较时将四种不同基因型(包括双阳性单阳性及野生型)分成两大组，双阳性为一组，单阳性及野生型为一组，进行得组间比较。

B.后丝腺、总丝腺、总虫重及之间比例的生物学统计

通过对四种不同基因型家蚕的总体重，后丝腺重，以及后丝腺与总丝腺，后丝腺与总体重比例进行统计分析，结果见图3B，可发现GAL4/UAS双阳性蚕(E(+)D(+))的这四项指标与其它三种基因型相比具有显著的提高。重要的是，后丝腺的重量，尤其是后丝腺与总体重的比值的增幅达到近一倍，证明利用GAL4/UAS转基因系统确实能提高家蚕蚕丝的产量。

C.从分子生物学水平进行的相关验证

利用定时实量PCR(即RealtimePCR方法，试剂选用日本东洋纺公司的SYBR Green Realtime PCR Master mix，仪器选用Biorad公司IQ5实时定量PCR仪，Ras1引物为：

ras1-s：ggacgaatacgatcccacgat；

ras1-a：gacggcgaataccagcaaga。

内参基因选用Bmrp49引物为：

Rp49-s 5’-CGTCACCAGTCGGATCGTTAT-3’；

Rp49-a 5’-AGCATGTGACGGGTCTTCTTA-3’。

反应体系为：

模板 1.0μl；

Realtime Master Mix 10μl；

引物1(20μM) 0.5μl；

引物2(20μM) 0.5μl；

ddH₂O 至20μl。

反应条件选用三步法条件为：95℃预变性1min，95℃变性5s，55℃退火15s，2℃延伸15s，40个循环。以内参基因的循环数为标准，计算目的基因相对内参基因表达水平的变化，将最低相对值设为1，其它值分别与最低值进行比较即可。

检测Ras1在四种基因型后丝腺的转录水平变化，发现双阳性后代的后丝腺中的Ras1表达水平最高，可达到单阳性及野生型后代的9-10倍，图3C。

检测在高产丝家蚕品种高表达的转录因子bHLH基因转录水平，引物为bhlh3s：gacgactccaaccacgat；bhlh3a：tccaagtggcgaatgtaa。

也发现该基因在双阳性的后丝腺的表达水平比其它三种基因型的要高2-3倍。

实施例3、Ras1-GTP的表达水平检测

利用Ras1活性检测试剂盒(购自Millipore公司，目录号17-218)检测转基因家蚕杂交后代中活性形式的Ras即Ras-GTP的表达水平变化，分别将四种基因型蚕后丝腺称取50mg，利用试剂盒提供的MLB裂解液裂解后离心吸取上清，每0.5ml细胞提取液加入10ul含有活性形式Ras1结合底物Raf-1 RBD琼脂糖。在4℃孵育45分钟后，快速短暂离心，吸去上清，用MLB洗涤液洗三次，将琼脂糖重悬到40ul 2×Laemmli还原型上样缓冲液中，沸水煮5分钟，短暂离心取上清20ul进行SDS蛋白质电泳，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST进行封闭，按顺序上Ras1一抗比例1∶1000，4℃摇床过夜，洗涤，加入Hrp标记的二抗，比例1∶2000室温2小时，洗涤后用ECL发光检测试剂盒检测活性形式Ras的蛋白质表达水平。

结果见图4。结果发现，与单阳性及野生型后代相比，GAL4/UAS双色荧光阳性后代(E(+)D(+))的Ras1-GTP表达水平显著提高，证实Ras1^V12的过表达可以促进活性形式的Ras-GTP表达量提高，进而可对Ras下游的信号通路产生影响。

实施例4、家蚕后丝腺中的磷酸化MAPK、Akt、S6K和4EBP含量分析

以Ras1/MAPK信号通路下游的MAPK磷酸化水平作为指标，用Westernblot的方法检测四种基因型的后丝腺中的磷酸化MAPK含量。分别取四种基因型家蚕后丝腺组织，用碧云天公司的RIPA强裂解液抽提总蛋白，经BCA法测定蛋白量后，分别取20ug蛋白与5×蛋白上样缓冲液混合进行蛋白质电泳。其中磷酸化MAPK的兔源一抗购自Cell Signaling公司，内参Tublin鼠源一抗购自碧云天公司，抗鼠，抗兔二抗均购自Santa Cruz公司。ECLplus化学发光检测试剂盒购自美国GE公司。

结果见图5，发现GAL4/UAS双色荧光阳性后代(E(+)D(+))的磷酸化MAPK(P-MAPK)水平显著升高，说明Ras/MAPK信号通路得到激活。而该信号通路直接参与调控细胞的生长增殖，证明过表达的Ras1放大了下游的Ras/MAPK信号通路，促进了细胞的生长。

另外，就与营养调节相关的Ras1/PI3K信号通路下游重要因子Akt及S6K，4EBP磷酸化水平进行检测。其中磷酸化MAPK、AKT、S6K、4EBP的兔源一抗均购自Cell Signaling公司。

结果见图5，发现在GAL4/UAS双色荧光阳性后代(E(+)D(+))中，磷酸化Akt、4EBP及S6K(P-Akt，P-4EBP，P-S6K)的显著上升。说明该通路也得到激活，蛋白质合成增强，促进细胞产物的增加。

实施例5、显微镜观察不同基因型家蚕后丝腺的情况

对不同基因型家蚕后丝腺的横切面进行比较。取出各基因型家蚕的后丝腺后用石蜡切片，苏木精染色，在Olympus倒置荧光显微镜下观察，结果见图6。

a和b图为100倍视野下野生型与双阳性家蚕后丝腺的横切面比较，可看出双阳性转基因家蚕后丝腺的横截面粗明显于野生型家蚕，后丝腺为管腔状分泌器官，中间为分泌腔，外周为后丝腺分泌细胞，其中后丝腺分泌细胞在双阳性家蚕中的径宽是在野生型中的1.5倍以上。

c和d图是在200倍视野下野生型与双阳性家蚕后丝腺的横切面比较，由图中可看出双阳性转基因家蚕后丝腺分泌细胞的细胞核(蓝色箭头所指)在区域分布和分枝数上均高于野生型，后丝腺分泌细胞在家蚕整个生长周期中只存在染色体组的多次复制和细胞体积的增大，其DNA含量与分泌蛋白的能力密切相关，细胞核核区的体积增大，分枝数增多，说明其DNA含量增多，提示其细胞活力增强，代谢旺盛，分泌蛋白能力增强。

实施例6、显微镜观察不同基因型家蚕细胞器结构

(1)细胞核核区染色质数量的比较

取出各基因型家蚕的后丝腺，按照常规的电镜切片标准步骤处理后，置于扫描电子显微镜下，观察细胞核核区染色质，结果见图7上图。

由图中可看出双阳性家蚕后丝腺分泌细胞核区的区域(黑色箭头所指)面积明显大于野生型，核区内染色质(黑色小点)多倍化程度也大大提高，说明其DNA含量的增高，这与其分泌丝心蛋白的水平为正相关的。

(2)细胞核四周粗面内质网、囊泡和线粒体的数量和分布

取出各基因型家蚕的后丝腺，按照常规的电镜切片标准步骤处理后，置于扫描电子显微镜下，观察细胞核四周粗面内质网、囊泡和线粒体的数量和分布。结果见图7下图。

由图中可看出，在核区(黑色箭头所指)附近，双阳性家蚕后丝腺分泌细胞中线粒体(红色箭头所指)数量显著多于野生型，说明其细胞代谢相当的活跃。而在粗面内质网(绿色箭头所指)分布上，双阳性家蚕后丝腺分泌细胞的粗面内质网分布密度上也多于野生型。粗面内质网是细胞内分泌蛋白的主要细胞器，与细胞蛋白合成水平正相关。在囊泡大小和分布量上，双阳性家蚕后丝腺分泌细胞也显著多于野生型。细胞中蛋白的运输主要由从内质网中脱离出的囊泡来完成，其大小和分布量与蛋白合成和分布量正相关。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种提高蚕丝产量的转基因方法

<130>100614

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>579

<212>DNA

<213>Bombyx mori

<400>1

atgaccgagt acaaattggt ggttgtgggt gcgggaggcg ttggtaaatc cgcattgact 60

atacagctga tacagaatca cttcgtggac gaatacgatc ccacgataga ggattcgtac 120

cgtaaacaag tcgtgatcga cggtgagacg tgtttactcg acatcctgga cacggctggc 180

caggaagagt attcggcgat gagagaccaa tacatgcgga ccggggaagg attcttgctg 240

gtattcgccg tcaacagtgc taaaagtttc gaagacattg gctcgtatcg cgagcagatc 300

aagcgagtga aggacgcgga agaggtgccc atggtacttg tgggcaacaa gtgcgaccta 360

cagtcgtggg ccgtagacat ggcgcgagca cgagaggtgg cgcaaagcta taatgttccg 420

ttcgtcgaaa catcggccaa aacacgcatg ggagttgacg acgctttcta cacgcttgtg 480

agggagatac gcaaagataa agtcagccga gacaagaaat tcaaagggaa gaaaccacgt 540

cacgttcaca aaataattaa agattgcacc cttttttaa 579

<210>2

<211>192

<212>PRT

<213>Bombyx mori

<400>2

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr

50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Leu

65 70 75 80

Val Phe Ala Val Asn Ser Ala Lys Ser Phe Glu Asp Ile Gly Ser Tyr

85 90 95

Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ala Glu Glu Val Pro Met Val

100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Gln Ser Trp Ala Val Asp Met Ala

115 120 125

Arg Ala Arg Glu Val Ala Gln Ser Tyr Asn Val Pro Phe Val Glu Thr

130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Met Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val

145 150 155 160

Arg Glu Ile Arg Lys Asp Lys Val Ser Arg Asp Lys Lys Phe Lys Gly

165 170 175

Lys Lys Pro Arg His Val His Lys Ile Ile Lys Asp Cys Thr Leu Phe

180 185 190

Claims

1.一种制备蚕丝产量高的家蚕的方法，其特征在于，在家蚕后丝腺表达促细胞生长基因，其编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白，且其中第12位突变为Val。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的促细胞生长基因促家蚕后丝腺增大。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的促细胞生长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且其中第34-36位由GGA突变为GTA。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蚕丝产量高包括：蚕茧体积增大，蚕茧重量增加。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供一种构建物1，按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：家蚕后丝腺特异性表达启动子，半乳糖调节上游启动子元件；将所述构建物1转化家蚕，获得家蚕转基因后代1；

(2)提供一种构建物2，按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：下游激活序列，促进细胞生长的基因；将所述构建物2转化家蚕，获得家蚕转基因后代2；和

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

提供一种构建物，含有构建物1和构建物2；所述的构建物1按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：家蚕后丝腺特异性表达启动子，半乳糖调节上游启动子元件；所述的构建物2按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：下游激活序列，促进细胞生长的基因；将所述构建物转化家蚕，得到后丝腺表达促细胞生长基因的家蚕。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(S1)提供一种构建物1，按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：家蚕后丝腺特异性表达启动子，半乳糖调节上游启动子元件；

(S2)提供一种构建物2，按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：下游激活序列，促进细胞生长的基因；

8.如权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，构建物1中，还含有：表达报告基因1的表达盒1；构建物2中，还含有：表达报告基因2的表达盒2；且所述的报告基因1不同于报告基因2；

选择同时呈现报告基因1相应表型和报告基因2相应表型的家蚕，该家蚕是后丝腺变大、蚕丝产量高的家蚕。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的报告基因1和报告基因2选自：绿色荧光蛋白基因，增强的绿色荧光蛋白基因，红色荧光蛋白基因。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的表达盒1按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：3XP3启动子，报告基因1，终止子；或

所述的表达盒2按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：3XP3启动子，报告基因2，终止子。

11.如权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述的家蚕后丝腺特异性表达启动子选自：丝心蛋白轻链启动子，丝心蛋白重链启动子，p25启动子。

12.如权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，构建物1中，半乳糖调节上游启动子元件下游还包括一终止子；或

构建物2中，促细胞生长基因下游还包括一终止子。

13.如权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述的构建物1或构建物2是以转座子作为骨架的转基因表达载体。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家蚕后丝腺重增加。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家蚕后丝腺中GTP结合蛋白Ras1表达水平增加。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家蚕后丝腺中bHLH表达水平增加。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家蚕后丝腺中Ras-GTP表达水平增加。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家蚕后丝腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量增加。

19.一种用于制备蚕丝产量高的家蚕的试剂盒，所述试剂盒中含有：

(1)一种构建物1，按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：家蚕后丝腺特异性表达启动子，半乳糖调节上游启动子元件；

(2)一种构建物2，按照5’→3’依次含有以下可操作性相连的元件：下游激活序列，促细胞生长基因；

所述促细胞生长基因编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白，且其中第12位突变为Val。

20.一种编码SEQ ID NO:2所示且其中第12位突变为Val的氨基酸序列的促细胞生长基因或其编码的蛋白的用途，用于制备蚕丝产量高的家蚕。

21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述的促细胞生长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且其中第34-36位由GGA突变为GTA。