CN101331228A - 能够产生抗体的转基因家蚕及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明制备了一种转基因家蚕，其具有丝腺特异性表达的蛋白质的编码DNA的启动子和受该启动子直接或间接表达调控的重组抗体编码DNA，并且将所述重组抗体分泌到丝腺中。确认了从该转基因家蚕的丝腺产生的重组抗体具有活性。

Description

能够产生抗体的转基因家蚕及其制备方法
技术领域
本发明涉及利用家蚕的重组抗体制备方法，该方法能够大量生产与哺乳动物产生的抗体相近的抗体。本发明还涉及产生该抗体的转基因家蚕。
背景技术
近年来，在医药品和诊断试剂领域中，疾病的诊断和治疗需要大量特异性高的抗体。抗体一般是使用小鼠、大鼠、兔等哺乳动物制造的，但近年来开展了依赖于微生物或哺乳动物细胞、重组动物、重组植物等的抗体生产。重组抗体具有可大量生产相同品质的产品、不引入病毒等致病因素因而安全等特点，今后可能越来越重要。
然而另一方面，它也存在许多问题。在大肠杆菌等微生物中仅能生产抗体的一部分，此外，产生的抗体本身糖基化或磷酸化不充分，还不能说充分适合于医药品、诊断试剂用途。而且，还知道当使用大肠杆菌等制备人类抗体时，通常会出现不溶化的问题。因此，在纯化时，必须要有用SDS等变性剂以使蛋白可溶化的步骤、采用透析等方法缓慢除去溶液中的变性剂以使蛋白恢复活性的步骤。
此外，如果使用哺乳动物细胞，则生产成本提高，因此难以大量生产。因而，尝试了使用重组动物、植物等进行抗体生产，但都尚停留在研究阶段。当使用其它真核生物细胞等时，由于要将其分泌至细胞外，必须要有特殊的信号。
家蚕具有称作丝腺的器官，一只家蚕的最大蛋白生产能力为0.5g。近年来，开发出了重组家蚕的制备技术，外源基因导入方法、导入基因表达调控方法的开发也有所进展，因此，在丝腺表达外源基因从而生产重组蛋白成为可能。家蚕是真核生物，因此，与大肠杆菌等微生物或植物相比，可以生产更接近于哺乳动物类型的蛋白。此外，由于可以使用人工饲料进行洁净饲养，因而能够容易地进行数万只水平的大量饲养。
[专利文献1]特开2006-137739：Tamura T.et al.“Method of proteinproduction using a silkworm middle silk gland-specific gene expression system”，filed by National Institute of Agrobiological Sciences on March 15，2005
[非专利文献1]Tamura T.，Sezutsu H.，Kobayashi I.，Kojima K.，Kanda T.，andUchino K.(1999)“Methods for producing transformed silkworms using atransposon”Abstracts of the 7th Workshop on Insect Function，p.10-22
[非专利文献2]Tamura，T.，Thibert，C.，Royer，C.，Kanda，T.，Abraham，E.，Kamba，M.，Komoto，N.，Thomas，J.-L.，Mauchamp，B.，Chavancy，G.，Shirk，P.，Fraser，M.，Prudhomme，J.-C.，and Couble，P.(2000)“A piggyBacelement-derived vector efficiently promotes germ-line transformation in thesilkworm Bombyx mori L.”Nature Biotechnology 18，81-84
[非专利文献3]Tomita M，M.H.，Sato T，Adachi T，Hino R，Hayashi M，ShimizuK，Nakamura N，Tamura T，Yoshizato K.(2003)“Transgenic silkworms producerecombinant human type III procollagen in cocoons.”Nat Biotechnol 21，52-56
[非专利文献4]Tamura T.(2000)“Transgenic silkworms：Current status andprospects”J.Sericul.Sci.Japan，69，1-12
[非专利文献5]Tamura T.(2000)“Introduction of useful genes in silkwormdevelopment”Reports of the 21st Symposium on Basic Breeding：Advancementof developmental engineering in molecular breeding of animals and plants，p.23-29
[非专利文献6]Tamura，T.，Quan，G.X.，Kanda，T.，and Kuwabara，N.(2001)“Transgenic silkworm research in Japan：Recent progress and future”Proceedingof Joint International Symposium of Insect COE Research Program and InsectFactory Research Project.p.77-82
[非专利文献7]Imamura，M.，Nakai，J.，Inoue，S.，Quan，G-X.，Kanda T.，andTamura，T.(2003)“Targeted gene expression using the Gal4/UAS system in thesilkworm Bombyx mori.”Genetics，165，1329-1340
[非专利文献8]Tamura，T.(2004)“Development and prospect of a productionsystem for useful substances using transgenic silkworms”Bio Industry 20(3)，28-35
[非专利文献9]Tamura，T.，Uchino，K.，Kanda，T.，Kobayashi，I.，and Kojima，K.(2004)“Production of a middle silk gland-specific gene expression system thatuses the yeast GAL4/UAS system”Abstracts of the Meeting of the JapaneseSociety of Sericultural Science74，p.51
[非专利文献10]Tamura T.(2004)“Establishment of methods for producingtransgenic silkworms-expected to be applied to production of fibers with novelfunctions”Kagaku to Seibutsu(Chemistry and Biology)42，634-635
[非专利文献11]Tamura，T.(2004)“Production of transgenic silkworms anduseful substances”Biologics：Development of products using biologicalsubstances(The Society of Polymer Science，ed.)pp.45-68.
[非专利文献12]Ueda，K.(2004)“The forefront of antibody engineering”p.122.CMC Publishing，Tokyo.
[非专利文献13]Kiyokawa，I.，Kobayashi，I.，Uchino，K.，Sezutsu，H.，Kanda，T.，Tamura，T.，Miura，T.，Ohashi，T.，and Katayama K.(2006)“Production ofhexokinase and anti-human transferrin antibody for clinical diagnostic reagentusing transgenic silkworm”Abstracts of the 7th International Workshop on theMolecular Biology and Genetics of the Lepidoptera，p94
发明内容
本发明所要解决的问题
如上述，尽管重组载体的重要性与日俱增，但其制备中还存在许多问题。鉴于上述状况进行了本发明，本发明所要解决的问题是：提供一种利用重组家蚕大量制备与哺乳类产生的抗体相近的重组抗体的方法。
解决问题的手段
本发明人等为解决上述问题进行了创造性研究。具体而言是使用丝腺特异性表达的基因的上游作为启动子区，将其插入到GAL4基因的上游。进而，将该融合基因插入到重组家蚕制备用载体质粒中。重组家蚕的制备按Tamura等(2000)的方法进行。使所得的重组家蚕与UASFvaTf株系进行交配，该UASFvaTf株系是采用Imamura等(2003)的方法制备的，在GAL4目标序列UAS的下游具有与转铁蛋白(transferrin)反应的scFv型抗体基因。从交配得到的重组家蚕的吐丝期丝腺提取样品，对该样品进行Western印迹，结果确认了在丝腺中产生了抗体。此外，使同样提取的样品与抗原进行了反应，结果，随着丝腺提取物的量增加，与抗原反应的物质的量也增加，由此可见样品具有抗体的活性。
即，本发明涉及在家蚕的丝腺中制备重组蛋白的方法，其提供了以下项[1]～[49]。
1.重组抗体的制备方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备导入了下述DNA的转基因家蚕的步骤，所述DNA编码带有信号序列的重组抗体；
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体的步骤。
2.重组抗体的制备方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕的步骤，所述转基因家蚕具有
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子、以及
编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA，
且将重组抗体分泌至丝腺；
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体的步骤。
3.项2的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子的下游。
4.项2的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
5.项3或4的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
6.项2～5任一项的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
7.项6的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
7-1.项7的方法，其中，所述编码丝胶蛋白1蛋白的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：16的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：16的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
7-2.项7的方法，其中，所述编码丝胶蛋白2蛋白的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：17的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：17的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
8.项6的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
8-1.项8的方法，其中，所述编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：18的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：18的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
9.一种带有信号序列的重组抗体。
9-1.项9的抗体，其中所述信号序列来自动物。
9-2.项9的抗体，其中所述信号序列来自动物抗体。
9-3.项9的抗体，其中所述信号序列为人酸性磷酸酶的信号序列、小鼠免疫球蛋白L链κ的信号序列或者小鼠IgG1的信号序列。
10.项9的抗体，该抗体为全长抗体或低分子量抗体。
10-1.项10的抗体，其中，所述低分子量为scFv型抗体。
10-2.项10-1的scFv型抗体，其中，以单链多肽N末端侧为基准点，按信号序列、VH、接头、VL，或者信号序列、VL、接头、VH的顺序排列。
10-3.项10的scFv型抗体，其抗原为转铁蛋白、CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、白蛋白、前白蛋白、补体C3、补体C4、α-1微球蛋白、β-2微球蛋白、AFP、CA19-9、CA15-3、PSA、载脂蛋白、肿瘤坏死因子、白介素、干扰素、骨桥蛋白、HBs抗原、RF、HCG、胶原、Hb、HbAlc、HCV抗体、肌钙蛋白、肌红蛋白、FDP、CEA、c-erbB-2、触珠蛋白。
10-4.项10-3的scFv型抗体，其中，VH、接头、VL分别包含SEQ IDNO：6、9、12的氨基酸序列。
10-5.项10-3的scFv型抗体，其中，信号序列包含SEQ ID NO：3、21和29中任意一个的氨基酸序列。
10-6.包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的scFv型抗体。
10-7.包含L链和H链的抗体，所述L链具有SEQ ID NO：3、21和29中任意一个所示的氨基酸序列作为信号序列，所述H链具有SEQ ID NO：3、21和29中任意一个的氨基酸序列作为信号序列。
10-8.包含L链和H链的抗体，所述L链具有SEQ ID NO：3、21和29中任意一个所示的氨基酸序列作为信号序列、具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列作为L链可变区、具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列作为Jκ片段、具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列作为κ链恒定区；所述H链具有SEQ ID NO：3、21和29中任意一个所示的氨基酸序列作为信号序列、具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列作为H链可变区、具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列作为CH1、具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列作为铰链区、具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列作为CH2、具有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列作为CH3。
10-9.包含L链和H链的抗体，所述L链具有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，所述H链具有SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列。
11.编码项9～10-9中任一项的抗体的DNA。
11-1.编码scFv型抗体的DNA，其包含SEQ ID NO：2、20、28任意一个所示的碱基序列作为信号序列，包含SEQ ID NO：5所示的碱基序列作为VH，包含SEQ ID NO：8所示的碱基序列作为接头、包含SEQ ID NO：11所示的碱基序列作为VL。
11-2.编码scFv型抗体的DNA，其包含SEQ ID NO：1、20、28任意一个所示的碱基序列作为信号序列，包含SEQ ID NO：4所示的碱基序列作为VH，包含SEQ ID NO：7所示的碱基序列作为接头、包含SEQ ID NO：10所示的碱基序列作为VL。
11-3.编码scFv型抗体的DNA，其包含SEQ ID NO：14所示的碱基序列。
11-4.编码scFv型抗体的DNA，其包含SEQ ID NO：13所示的碱基序列。
11-5.一种DNA，其包含：
编码抗体L链的DNA，其具有SEQ ID NO：1、2、20、28任意一个所示的碱基序列作为信号序列；和
编码抗体H链的DNA，其具有SEQ ID NO：1、2、20、28任意一个所示的碱基序列作为信号序列。
11-6.一种DNA，其包含编码抗体L链的DNA和编码抗体H链的DNA，所述编码抗体L链的DNA具有SEQ ID NO：1、2、20和28中任意一个所示的碱基序列作为信号序列、具有SEQ ID NO：22所示的碱基序列作为L链可变区、具有SEQ ID NO：24所示的碱基序列作为Jκ片段、具有SEQ ID NO：26所示的碱基序列作为κ链恒定区；所述编码抗体H链的DNA具有SEQ ID NO：1、2、20和28中任意一个所示的碱基序列作为信号序列、具有SEQ ID NO：30所示的碱基序列作为H链可变区、具有SEQ ID NO：32所示的碱基序列作为CH1、具有SEQ ID NO：34所示的碱基序列作为铰链区、具有SEQ ID NO：36所示的碱基序列作为CH2、具有SEQ ID NO：38所示的碱基序列作为CH3。
11-7.一种DNA，其包含：
具有SEQ ID NO：48所示的碱基序列作为抗体L链的DNA，以及
具有SEQ ID NO：50所示的碱基序列作为抗体H链的DNA。
12.具有项11～11-7任一项的DNA的载体。
13.携带项12的载体的细胞。
14.分泌重组抗体的转基因家蚕的制备方法，该方法包括制备家蚕卵的步骤，其中所述家蚕卵具有编码带有信号序列的重组抗体的DNA。
15.将重组抗体分泌至丝腺的转基因家蚕的制备方法，该方法包括以下步骤：制备具有编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子、以及下述DNA的家蚕卵，所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控。
16.项15的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
17.项15的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
18.项16或17的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
19.项15～18任一项的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
20.项19的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
20-1.项20的方法，其中，所述编码丝胶蛋白1蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：16所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：16所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入所示的碱基序列的DNA。
20-2.项20的方法，其中，所述编码丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：17所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：17所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
21.项19的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
21-1.项21的方法，其中，所述编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：18所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：18所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
22.转基因家蚕，其具有编码带有信号序列的重组抗体的DNA，并且分泌所述重组抗体。
23.转基因家蚕，其具有：
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子、以及
编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA，
并且将所述重组抗体分泌至丝腺。
24.项23的转基因家蚕，其具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子的下游。
25.项23的转基因家蚕，是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕，所述DNA编码转录调控因子，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕，所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
26.项24或25的转基因家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
27.项23～26任一项的转基因家蚕，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
28.项27的转基因家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
28-1.项28的转基因家蚕，其中，所述编码丝胶蛋白1蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：16所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：16所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
28-2.项28的转基因家蚕，其中，所述编码丝胶蛋白2蛋白的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：17所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：17所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
29.项27的转基因家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
29-1.项29的转基因家蚕，其中，所述编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：18所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：18所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
30.转基因家蚕，其具有编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
31.项30的转基因家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
32.重组抗体的制备方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕的步骤，所述转基因家蚕具有：
编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子、以及
编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA，
并且将重组抗体分泌至脂肪体；
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体的步骤。
33.项32的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
34.项32的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
35.项33或34的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
35-1.项35的方法，其中，所述编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：19所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：19所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
36.一种制备将重组抗体分泌至脂肪体的转基因家蚕的方法，该方法包括制备家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有：
编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及
编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA。
37.项36的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
38.项36的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
39.项37或38的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
39-1.项39的方法，其中，所述编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：19所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：19所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
40.一种转基因家蚕，其具有：
编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及
编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA；
并且将所述重组抗体分泌至脂肪体。
41.项40的转基因家蚕，其具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
42.项40的转基因家蚕，其是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
43.项41或42的转基因家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
43-1.项43的方法，其中，所述编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：19所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：19所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
44.测定生物体中转铁蛋白的量的方法，该方法包括以下步骤(a)和(b)：
(a)使受试者来源的生物样品与项9～10-9中任意一项的抗体或者采用项1～8-1、32～35-1、50～57-1或76～79-1中任意一项的方法制备的抗体接触的步骤，
(b)检测生物样品中的转铁蛋白与抗体的结合的步骤。
45.诊断糖尿病性肾病的方法，该方法包括以下步骤(a)和(b)：
(a)使受试者来源的生物样品与项9～10-9中任意一项的抗体或者采用项1～8-1、32～35-1、50～57-1或76～79-1中任意一项的方法制备的抗体接触的步骤，
(b)检测与生物样品中的转铁蛋白结合的抗体的步骤；
其中，与正常对照相比，当转铁蛋白的量多时，判定为患有糖尿病性肾病、或者患病风险高。
46.诊断糖尿病性肾病的方法，该方法包括以下步骤(a)和(b)：
(a)使受试者来源的生物样品与项9～10-9中任意一项的抗体或者采用项1～8-1、32～35-1、50～57-1或76～79-1中任意一项的方法制备的抗体接触的步骤，
(b)检测与生物样品中的转铁蛋白结合的抗体的步骤；
其中，当与已确定患有糖尿病性肾病的对照相比，转铁蛋白的量程度相同时，判定为患有糖尿病性肾病、或者患病风险高。
47.评价营养状态的方法，该方法包括以下步骤(a)和(b)：
(a)使受试者来源的生物样品与项9～10-9中任意一项的抗体或者采用项1～8-1、32～35-1、50～57-1或76～79-1中任意一项的方法制备的抗体接触的步骤，
(b)检测与生物样品中的转铁蛋白结合的抗体的步骤；
其中，与正常对照相比，当转铁蛋白的量少时，判定为营养不良的风险高、或者处于营养不良状态。
48.糖尿病性肾病的诊断试剂，其含有项9～10-9中任意一项的抗体或者采用项1～8-1、32～35-1、50～57-1、76～79-1任意一项的方法制备的抗体作为有效成分。
49.用于评价营养状态的试剂，其含有项9～10-9中任意一项的抗体或者采用项1～8-1、32～35-1、50～57-1或76～79-1中任意一项的方法制备的抗体作为有效成分。
50.制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备导入了编码重组抗体的DNA的转基因家蚕的步骤；
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体的步骤。
51.制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕的步骤，所述转基因家蚕具有：
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子、以及
编码重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA，
且将重组抗体分泌至丝腺；
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体的步骤。
52.项51的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)编码重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
53.项51的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
54.项52或53的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
55.项51～54任一项的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
56.项55的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
56-1.项56的方法，其中，所述编码丝胶蛋白1蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：16所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：16所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
56-2.项56的方法，其中，所述编码丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：17所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：17所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
57.项55的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
57-1.项57的方法，其中，所述编码丝心蛋白的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：18所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：18所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
58.制备分泌重组抗体的转基因家蚕的方法，该方法包括制备具有编码重组抗体的DNA的家蚕卵的步骤。
59.制备将重组抗体分泌至丝腺的转基因家蚕的方法，该方法包括制备家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有：
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子、以及
编码重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA。
60.项59的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)编码重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
61.项59的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
62.项60或61的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
63.项59～62任一项的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
64.项63的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
64-1.项64的方法，其中，所述编码丝胶蛋白1蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：16所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：16所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入所示的碱基序列的DNA。
64-2.项64的方法，其中，所述编码丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：17所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：17所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
65.项63的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
65-1.项65的方法，其中，所述编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：18所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：18所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入所示的碱基序列的DNA。
66.具有编码重组抗体的DNA的转基因家蚕，其分泌所述重组抗体。
67.转基因家蚕，其具有：
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子、以及
编码重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA并且将重组抗体分泌至丝腺。
68.项67的转基因家蚕，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)编码重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
69.项67的转基因家蚕，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
70.项68或69的转基因家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
71.项67～70任一项的转基因家蚕，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
72.项71的转基因家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白或丝胶蛋白2蛋白的DNA的启动子。
72-1.项72的转基因家蚕，其中，所述编码丝胶蛋白1蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：16所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：16所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
72-2.项72的转基因家蚕，其中，所述编码丝胶蛋白2蛋白的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：17所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：17所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
73.项71的转基因家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
73-1.项73的转基因家蚕，其中，所述编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：18所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：18所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
74.转基因家蚕，其具有编码重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于转录调控因子的目标启动子下游。
75.项74的转基因家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
76.制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕的步骤，所述转基因家蚕具有：
编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子、以及
编码重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA；
并且将重组抗体分泌至脂肪体，
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体的步骤。
77.项76的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
78.项76的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
79.项77或78的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
79-1.项79的方法，其中，所述编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：19所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：19所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
80.制备将重组抗体分泌至脂肪体的转基因家蚕的方法，该方法包括制备家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有：
编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子、以及
编码重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA。
81.项80的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子的下游。
82.项80的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子的下游。
83.项81或82的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
83-1.项83的方法，其中，所述编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：19所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：19所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
84.一种转基因家蚕，其具有：
编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子、以及
编码重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA。
并将所述重组抗体分泌至脂肪体。
85.项84的转基因家蚕，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
86.项84的转基因家蚕，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
87.项85或86的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
87-1.项87的方法，其中，所述编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子是以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：19所示的碱基序列的DNA，
(b)包含在SEQ ID NO：19所示的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代、缺失、增加和/或插入的碱基序列的DNA。
88.采用项1～8-1、32～35-1、50～57-1或76～87-1中任意一项的方法制备的抗体。
附图说明
图1显示用于生产转基因家蚕的pUASFvaTF载体的结构及其构建程序。
图2显示通过Ser1GAL4株系与UASFvaTf株系的交配来生产抗体表达家蚕的程序。
图3显示具有GAL4基因的个体以及具有UAS的个体的荧光立体显微照片。
图4是显示通过RT-PCR验证在杂交株系中FvaTf基因的转录的照片。
图5是显示利用Western印迹鉴定抗体蛋白的照片。
图6显示利用ELISA测定重组抗体针对其抗原的活性的结果。
图7显示pBacN/lox p UAS IgL SV40质粒载体的结构以及构建程序，该质粒载体编码用于制造转基因家蚕的抗体基因的L链。
图8显示pDNA/UAS IgH SV40质粒载体的结构以及构建程序，该质粒载体编码用于制造转基因家蚕的抗体基因的H链。
图9显示pBacN/lox p UASIgH UASIgH载体结构以及构建程序，该载体用于制造具有抗体基因的转基因家蚕。
图10显示通过交配Ser1GAL4株系与UASIgL-UASIgH株系来生产抗体表达家蚕的程序。
图11显示具有GAL4基因的个体以及具有UAS的个体的荧光立体显微照片。
图12是显示通过RT-PCR验证在杂交株系中IgL基因和IgH基因转录的照片。
图13是显示下述内容的照片：杂交株系所表达的重组抗体是IgG1，并且作为L链的免疫原性为kappa。
图14显示利用ELISA测定重组抗体针对其抗原的活性的结果。
发明的具体实施方式
本发明涉及利用家蚕生产重组抗体的方法。本发明是基于活性重组抗体在本发明者所确立的转基因家蚕体内的成功生产。更具体的说，本发明提供用于生产重组抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备转基因家蚕，在该家蚕中导入了编码重组抗体的DNA；并且
(b)从制备的该转基因家蚕回收所述重组抗体。
此外，本发明提供了生产重组抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备一种转基因家蚕，在该家蚕中导入了编码重组抗体并具有信号序列的DNA；并且
(b)从制备的该转基因家蚕中回收重组抗体。
在本发明的生产重组抗体方法的一个具体实施方案中，重组抗体是在家蚕的丝腺中产生的。更具体的说，本发明涉及生产重组抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备转基因家蚕，该转基因家蚕包括编码在丝腺中特异性表达的蛋白的DNA的启动子和编码重组抗体的DNA，并且该家蚕将重组抗体分泌到丝腺中，其中，所述编码重组抗体的DNA的表达是由所述启动子直接或间接调控的；并且
(b)从制备的该转基因家蚕中回收所述重组抗体。
本发明还涉及包括以下步骤的生产重组抗体的方法：
(a)制备转基因家蚕，该转基因家蚕包括编码在丝腺中特异性表达的蛋白的DNA的启动子和编码具有信号序列的重组抗体的DNA，并且该家蚕将重组抗体分泌到丝腺中，其中所述重组抗体的编码DNA的表达是由所述启动子直接或间接调控的；并且
(b)从制备的该转基因家蚕中回收所述重组抗体。
在制备本发明的转基因家蚕的步骤中，首先制备家蚕卵，其包括编码在丝腺中特异表达的蛋白的DNA的启动子和编码具有信号序列的重组抗体的DNA，其中该重组抗体的编码DNA的表达是由该启动子直接或间接调控的(优选地，该重组抗体包含信号序列)。此后，从制备的家蚕卵所孵化的家蚕中挑选出将重组抗体分泌到丝腺中的转基因家蚕。
在本发明中，为了挑选转基因家蚕，可以利用例如选择标记。本发明的选择标记可以使用本领域技术人员所常规使用的标记，如CFP，GFP，YFP和DsRed等荧光蛋白。通过使用这些标记，仅利用荧光立体显微镜观察即可检测转基因家蚕。此外，由于荧光的颜色不同，可以同时使用多种标记。
利用本发明的方法所能生产的抗体既包括全长(whole antibody)的抗体(例如，完整IgG)也包括低分子量化(低分子化)的抗体。在本发明中，对于全长抗体的来源没有特殊限制，可以生产来源于例如人，小鼠，大鼠，兔，驴，山羊，马，鸟，狗，猫等的抗体。对于抗体的同种型也没有限制，并且例如在人源抗体的例子中，可以生产IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM同种型的抗体。本发明中的全长抗体指包含恒定区和可变区的抗体，其中，恒定区如图13所示具有补体依赖细胞毒活性或者抗体依赖细胞毒活性，可变区如图14所示可识别抗原。
另一方面，本发明中的低分子量化抗体包括全长抗体的一部分发生了缺失的抗体片段，并且对于低分子量抗体没有特殊限制，只要其具有抗原结合能力即可。对于本发明的抗体片段没有限制，只要是全长抗体的一部分即可，但是优选含有重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。VH或VL的氨基酸序列可以发生取代，缺失，增加和/或插入。此外，只要具有抗原结合能力，VH和/或VL可以缺失一部分。可变区可以嵌合化或者人源化。抗体片段的具体例子包括Fab，Fab’，F(ab’)2以及Fv等。低分子量抗体的具体例子包括Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，scFv(单链Fv)，双抗体以及sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。在本发明中低分子量抗体特别优选为scFv抗体。
在此处，“Fv”片段是指最小的抗体片段，并且其包含完整抗原识别位点和抗原结合位点。“Fv”片段是一个二聚体(VH-VL二聚体)，在该二聚体中一个VH和一个VL通过非共价键紧密地连接起来。每个可变区域上的三个互补决定区(CDRs)相互作用，在VH-VL二聚体表面上形成了抗原结合位点。六个CDR为抗体提供了抗原结合位点。然而，一个可变区(或者仅包含三个抗原特异性CDR的半个Fv)虽然亲和力比完整的结合位点要低，仍可以识别并结合抗原。
scFv包含抗体的VH和VL，并且这些区域存在于单一多肽链上。一般而言，Fv多肽进一步地包括位于VH和VL区域之间的多肽接头，这样使得scFv能够形成结合抗原的必要结构。(对于scFv的综述，可参见Pluckthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”Vol.113，Rosenburg and Mooreed.，Springer Verlag，New York，pp.269-315，1994)。本发明中对于接头没有特殊限制，只要该接头不抑制连接在其两端的抗体可变区的表达即可。
VH和VL的顺序不局限于上述的排列，并且可以按任意的顺序排列。例如下述的排列：
N-末端一信号序列-[VH]-接头-[VL]-C-末端
N-末端-信号序列-[VL]-接头-[VH]-C-末端
本发明的scFv抗体优选具有下述特征的抗体：在该抗体中，一个VH和一个VL以单链多肽的N端为基准点，按照VH、VL([VH]接头[VL])的顺序排列。本发明的scFv与全长抗体或者其它低分子量化抗体相比显示特别高的抗体活性。
用于连接抗体可变区的接头包括可以由基因工程导入的任意肽接头以及合成化合物接头(例如，在Protein Engineering，9(3)，299-305，1996中公开的接头)，但是本发明优选的是肽接头。肽接头的长度没有特殊限制，并且本领域技术人员可以根据目的来选择。典型地来说，长度为1到100个氨基酸，优选的是3到50个氨基酸，更加优选的是5到30个氨基酸，并且特别优选的是12到18个氨基酸(例如，15个氨基酸)。本发明中接头的例子包括含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的接头。
此外，本发明中重组抗体的优选实施方案包括人抗体，小鼠抗体以及修饰抗体例如人源化抗体、嵌合抗体和来自于除人和小鼠以外的抗体。
嵌合抗体是通过将来源于不同动物的序列加以组合而生产的，包括例如，含有小鼠抗体的重、轻链可变区和人源抗体的轻、重链恒定区的抗体。可以利用已知的方法获得嵌合抗体，例如，通过将编码抗体V区域的DNA与编码人源抗体C区域的DNA连接起来，并将该连接序列插入到表达质粒中，然后将该质粒导入到宿主中使其生产抗体，来获得抗体。
人源化抗体也称“重构(reshaped)人抗体”，该抗体是通过将非人哺乳动物例如小鼠的抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的CDR中获得的，用于此目的的常规基因工程技术也已为人所知(可见欧洲专利申请公报EP 125023以及WO 96/02576)。
具体地，通过PCR反应合成一段设计为将小鼠源抗体CDR连接到人源抗体框架区(FR)的DNA，该PCR利用制备为包含与CDR和FR末端区有重叠部分的几条寡核苷酸作为引物。(见WO98/13388中所述方法).
对于通过CDR连接的人源抗体框架区而言，选择互补决定区形成良好的抗原结合位点者。在必要的情况下，可以在使得重构人抗体的互补决定区能够形成合适的抗原结合位点的条件下，对抗体可变区的框架区的氨基酸进行取代(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌合抗体和人源化抗体的恒定区使用人源抗体的恒定区，例如，Cγ1，Cγ2，Cγ3或者Cγ4可以用于H链，而Cκ或者Cλ可以用于L链。此外，人源抗体恒定区可以被修饰来提高抗体的稳定性或抗体生产的稳定性。
通常来说，嵌合抗体是由来自非人哺乳动物的抗体可变区和人源抗体恒定区构成的。另一方面，人源化抗体是由来自非人哺乳动物的抗体的互补决定区和人源抗体的框架区和恒定区组成的。
在制备了嵌合抗体或人源化抗体后，可以用其它氨基酸取代可变区(例如，FR)或恒定区的氨基酸。
对于嵌合抗体中可变区的来源或者人源化抗体CDR的来源没有特殊限制，并且可以是来源于任何动物。例如，可以使用小鼠抗体，大鼠抗体，兔抗体以及骆驼抗体的序列。本发明中优选的抗体包括小鼠抗体，但不局限于此。
对于本发明生产的抗体(全长抗体和低分子量抗体)所结合的抗原，也没有特殊限制。本领域技术人员可以利用已知的技术来设计能够结合目的抗原的抗体。本发明涉及制备可以与目的抗原结合的抗体的方法，该抗体是利用已知技术这样地设计的。本发明也涉及利用这样的方法制备的抗体。
作为一个例子，本发明中制备了结合人转铁蛋白的抗体。scFv型抗人转铁蛋白抗体的H链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，而scFv型抗人转铁蛋白抗体L链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。此外，IgG1抗体H链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，并且IgG1抗体L链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。如后所述，该抗体能够用于诸如疾病的诊断等方面，例如作为糖尿病性肾病的诊断试剂以及用于测定活体中转铁蛋白的量以及进行营养评价，等等。
关于本发明所提供的抗体的其它实施方案的一个例子是结合癌胚抗原(CEA)的抗体。目前，CEA被广泛用作肿瘤标志。其肿瘤标志谱在各种脏器中表达，其中不仅包括胃癌、食道癌等消化系统肿瘤，还包括肺癌等呼吸循环系统肿瘤。因此，结合CEA的抗体可以用于检测肿瘤复发或者观察治疗过程。此外，还可以列举结合c-erbB-2的抗体。c-erbB-2在经过芽基发育(blastogenesis)的腺组织的肿瘤细胞中表达。能够结合c-erbB-2的抗体可以用于肿瘤的组织病理学检测。此外，还可以列举能够结合触珠蛋白的抗体。触珠蛋白是一类从肝脏分泌到血液中的蛋白。该种蛋白可以结合游离血红蛋白。因此，能够结合触珠蛋白的抗体可以用于测定血浆中的触珠蛋白。本发明所生产的抗体包括例如，针对CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、白蛋白、前白蛋白、补体C3、补体C4、α-1微球蛋白、β-2微球蛋白、AFP、CA19-9、CA15-3、PSA、载脂蛋白、肿瘤坏死因子、白介素、干扰素、骨桥蛋白、HBs抗原、RF、HCG、胶原、Hb、HbAlc、HCV抗体、肌钙蛋白、肌红蛋白、FDP的抗体，但不局限于本文列举的这些，对于抗体没有特殊限制，只要是结合能够应用于医药领域的抗体即可。此外，抗体不局限于那些结合蛋白的抗体，还包括针对诸如环境激素等小分子化合物的抗体。通过适当地改变在实施例中描述的结合人转铁蛋白的抗体的H链或L链的可变区或者高变区，可以生产能够结合目的抗原的抗体。
本发明中，优选使用分泌信号(信号序列)，以保持所生产的重组抗体的活性或者促进抗体的分泌来增加回收抗体的量。分泌蛋白或者膜整合蛋白在内质网膜结合性核糖体上合成后，必须通过脂质双分子层。信号序列是指此时必需的、位于蛋白N末端的氨基酸残基。
对于本发明中的信号序列，没有特别限制，只要该信号序列具有上述的功能即可。一个例子包括动物来源的信号序列。其它的例子有动物抗体来源的信号序列。此处，动物的例子包括人，小鼠，大鼠，兔，驴，山羊，马，鸟，狗，猫，酵母以及昆虫。
本发明优选的信号序列的例子包括酸性磷酸酶信号序列。对于酸性磷酸酶的来源没有特别限制，包括例如，人，小鼠，大鼠，兔，驴，山羊，马，鸟，狗，猫，酵母以及昆虫的酸性磷酸酶。
本发明中特别优选的信号序列是人酸性磷酸酶信号序列，小鼠免疫球蛋白L链κ的信号序列以及小鼠IgG1的信号序列。使用这些信号序列，可以促进表达的重组抗体向丝腺内腔中转移。相应地，本发明中优选使用信号序列。
当使用信号序列时，本发明中优选的人酸性磷酸酶信号序列的例子是含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白。本发明中优选的小鼠免疫球蛋白L链κ的信号序列的例子是包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的蛋白。本发明中优选的小鼠IgG1信号序列的例子是包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的蛋白。此外，还可以是在SEQ ID NO：3、21和29中任意一个所示的氨基酸序列中发生了一个或多个氨基酸的取代，缺失，增加和/或插入而得的氨基酸序列，只要其具有等同于SEQ ID NO：3，21和29中任意一种蛋白的活性即可。此处，术语“功能上等同”指目的蛋白与由SEQ ID NO：3、21和29中任意一种氨基酸序列组成的蛋白具有同样的生物学或生物化学活性。
优选本发明的信号序列连接于重组抗体的N末端，但不局限于此。
相应地，本发明的抗体的特别优选的实施方案包括结合转铁蛋白，CEA，c-erbB-2或触珠蛋白，并具有人酸性磷酸酶信号序列的抗体，小鼠免疫球蛋白L链或小鼠IgG1。其中含有人酸性磷酸酶信号序列并且结合转铁蛋白的scFv型小鼠抗体是本发明特别优选的抗体。该抗体含有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。本发明的优选抗体还包括：在SEQ ID NO：15的氨基酸序列中发生了一个或多个氨基酸的取代，缺失，增加和/或插入，并与包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的抗体具有等同活性的抗体。
在本发明中还特别优选这样的抗体：其结合转铁蛋白、CEA、c-erbB-2或触珠蛋白，并且包含带有小鼠免疫球蛋白L链κ的信号序列的L链和带有小鼠IgG1信号序列的H链。这样的抗体包含具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的L链和具有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的H链。此外，本发明特别优选的抗体是包含下述L链和下述H链的抗体：其中，所述L链在SEQID NO：49的氨基酸序列中发生了一个或多个氨基酸的取代，缺失，增加和/或插入、且具有等同于包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的抗体的活性；所述H链在SEQ ID NO：51的氨基酸序列中发生了一个或多个氨基酸的取代，缺失，增加和/或插入，且具有等同于包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的抗体的活性。
编码结合转铁蛋白并且包含人酸性磷酸酶信号序列的scFv型小鼠抗体的DNA的优选实施方案是包含SEQ ID NO：13的碱基序列的DNA，或者更优选的是包含SEQ ID NO：14的碱基序列的DNA。此外，还可以列举出下述DNA：其在SEQ ID NO：13(或更加优选的是SEQ ID NO：14)的碱基序列中发生了一个或多个氨基酸的取代，缺失，增加和/或插入，并且编码蛋白，且具有与SEQ ID NO：13(或更加优选的是SEQ ID NO：14)所示的DNA等同的功能。
编码结合转铁蛋白的抗体的L链，并且编码带有小鼠免疫球蛋白L链κ信号序列的L链的DNA的优选实施方案，包括包含SEQ ID NO：48的碱基序列的DNA。此外，还可以列举下述DNA：其在SEQ ID NO：48的碱基序列中发生了一个或多个氨基酸的取代，缺失，增加和/或插入，且具有与SEQID NO：48所示的DNA等同的功能。
编码结合转铁蛋白的抗体的H链，并且编码带有小鼠IgG1信号序列的H链的DNA的优选实施方案，包括具有SEQ ID NO：50的碱基序列的DNA。此外，还可以列举出下述DNA：所述DNA在SEQ ID NO：50的碱基序列中发生了一个或多个氨基酸的取代，缺失，增加和/或插入，且具有与SEQ IDNO：50的DNA等同的功能。
当设计本发明的编码抗体(优选的抗体包含信号序列)的DNA时，优选将这些密码子转换成昆虫型密码子。转换成昆虫型密码子能够增加重组抗体的表达水平。例如，包含人酸性磷酸酶信号序列的scFv小鼠源抗体，信号序列密码子转换之前的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，这些密码子转换之后的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。相似的，H链可变区(VH)的碱基序列在密码子转换前后分别如SEQ ID NO：4和5所示；L链可变区(VL)的碱基序列在密码子转换前后分别如SEQ ID NO：10和11所示；接头的碱基序列如SEQ ID NO：7所示并且在密码子转换之后其碱基序列如SEQ ID NO：8所示；全长抗体的碱基序列在密码子转换前后分别如SEQ ID NO：13和14所示。
在本发明的针对人转铁蛋白的scFv型小鼠抗体中，抗体的H链和L链区域的密码子从脊椎动物小鼠的密码子转换成昆虫中所使用的密码子。更具体的说，在本发明中，针对人转铁蛋白的scFv型小鼠抗体的密码子被转换成了在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)中常用的密码子，草地贪夜蛾在种属上与斜纹夜蛾(Spodoptera litura)近缘，并且和家蚕一样也是一种昆虫。此外，在草地贪夜蛾中常用的密码子也被用于scFv抗体的接头部分。
更具体的说，如表1所示，本发明中将人和动物来源的密码子中全部153个氨基酸和接头部分的密码子转换成种属上与斜纹夜蛾相关的草地贪夜蛾中常用的密码子(转换之前的序列对应于SEQ ID NO：13，转换之后的序列对应于SEQ ID NO：14。在表1中“第1个密码子”一栏是指该密码子的第一个碱基相当于SEQ ID NO：13的碱基序列中的第几个碱基。例如，在“第1个密码子”中的数值“13”表示在SEQ ID NO：13中，由从第13位到第15位的碱基构成的密码子发生了转换(在该例子中，第15位的G被转换成了C)。编码本发明抗体的DNA包括至少有一个这样的密码子被转换了的DNA。此外，在本发明中，密码子可以被转换成在果蝇、家蚕、蜜蜂中使用频率高的密码子，并且密码子已经被转换为在这些昆虫中使用频率高的密码子的DNA也包含在本发明中。在这些昆虫中使用频率高的密码子是公知的。相应地，在本发明中，在设计带有人酸性磷酸酶信号序列的scFv型小鼠抗体的编码DNA时，密码子转换成昆虫密码子的DNA也包括在其中。
表1
  1stCodon   BeforeConversion   AfterConversion   AminoAcid   1stCodon   BeforeConversion   AfterConversion   AminoAcid   1stCodon BeforeConversion AfterConversion   AminoAcid
  13   ACG   ACC   T   274   AGA   CGT   R   556   TAT   TAC   Y
  16   GCG   GCT   A   280   ACA   ACC   T   559   AGT   TCC   S
  34   GCC   GCT   A   304   CAG   CAA   Q   565   AAT   AAC   N
  37   TTG   CTG   L   307   TTG   CTG   L   568   CAA   CAG   Q
  40   TTG   CTC   L   313   TCT   TCC   S   580   TTG   CTG   L
  43   CTA   CTG   L   319   ACT   ACC   T   583   GCC   GCT   A
  58   CTC   CTG   L   322   ACT   ACC   T   592   CAG   CAA   Q
  61   GAG   GAA   E   325   GAG   GAA   E   595   CAG   CAA   Q
  64   GTC   GTG   V   32B   GAC   GAT   D   601   CCA   CCC   P
  67   CAG   CAA   Q   331   ACA   ACC   T   604   GGG   GGT   G
  73   CAG   CAA   Q   334   GCC   GCT   A   610   TCT   TCC   S
  76   GAG   GAA   E   337   ACA   ACC   T   613   CCT   CCC   P
  79   TCG   TCC   S   340   TAT   TAC   Y   616   AAA   AAG   K
  82   GGA   GGT   G   346   TGT   TGC   C   622   CTG   CTC   L
  B5   CCT   CCC   P   349   GCA   GCT   A   625   ATT   ATC   I
  88   GAC   GAT   D   352   AGG   CGT   R   634   GCA   GCT   A
  100   CCT   CCC   P   367   CCT   CCC   P   640   ACT   ACC   T
  103   TCT   TCC   S   373   TAT   TAC   Y   643   AGG   CGT   R
  106   CAG   CAA   Q   385   TAT   TAC   Y   649   TCT   TCC   S
  109   TCA   TCC   S   391   GGC   GGT   G   652   GGG   GGT   G
  112   CTT   CTG   L   397   GGG   GGT   G   655   GTC   GTG   V
  115   TCA   TCo   S   403   ACG   ACC   T   658   CCT   CCC   P
  118   CTC   CTG   L   406   GTC   GTG   V   664   CGC   CGT   R
  127   ACT   ACC   T   418   TCA   TCC   S   670   ACA   ACC   T
  130   GTC   GTG   V   421   GGT   GGC   G   673   GGC   GGT   G
  133   ACT   ACC   T   424   GGA   GGC   G   676   AGT   TCC   S
  136   GGC   GGT   G   430   GGT   GGC   G   679   GGA   GGT   G
  151   AGT   TCC   S   433   TCA   TCC   S   682   TCT   TCC   S
  157   TAT   TAC   Y   439   GGA   GGT   G   685   GGG   GGT   G
  160   AGC   TCC   S   448   TCT   TCC   S   688   ACA   ACC   T
  172   ATT   ATC   I   451   GGC   GGT   G   691   GAT   GAC   D
  175   CGG   AGG   R   457   GGC   GGT   G   697   ACT   ACC   T
  181   TTT   TTC   F   460   GGA   GGT   G   700   CTC   CTG   L
  184   CCA   CCC   P   463   TCG   TCC   S   709   AGC   TCC   S
  187   GAA   GAG   E   466   GAC   GAT   D   712   AGT   TCC   S
  193   AAA   AAG   K   469   ATT   ATC   I   724   GAA   GAG   E
  199   GAA   GAG   E   472   GAG   GAA   E   733   TCA   TCC   S
  208   GGC   GGT   G   475   CTC   CTG   L   736   GTT   GTG   V
  214   ATA   ATC   I   481   CAG   CAA   Q   739   TAT   TAC   Y
  223   AGT   TCC   S   484   TCT   TCC   S   745   TGT   TGC   C
  229   GCC   GCT   A   487   CCA   CCC   P   754   TAT   TAC   Y
  232   ACT   ACC   T   496   CTA   CTG   L   757   TAT   TAC   Y
  241   AGC   TCC   S   505   TCA   TCC   S   760   AGC   TCC   S
  244   CCA   CCC   P   508   GTT   GTG   V   763   TAT   TAC   Y
  247   TCT   TCC   S   511   GGA   GGT   G   766   CCT   CCC   P
  250   CTC   CTG   L   520   GTT   GTG   V   772   ACG   ACC   T
  253   AAA   AAG   K   523   ACT   ACC   T   778   GGC   GGT   G
  256   AGT   TCC   S   541   AGT   TCC   S   781   TCG   TCC   S
  259   CGA   CGT   R   547   AGC   TCC   S   784   GGC   GGT   G
  265   TCT   TCC   S   550   CTT   CTG   L   796   GAA   GAG   E
  271   ACT   ACC   T   553   TTA   CTC   L   802   AAA   AAG   K
在本发明中，上述的重组抗体被分泌到丝腺中。丝腺是在家蚕体内成对存在的一种器官，是丝蛋白的合成器官。丝腺可以分为后、中、前丝腺，丝蛋白是在后丝腺和中丝腺中合成的。本发明中优选的丝腺是中丝腺和后丝腺。
对于利用本发明方法生产的抗体没有特殊限制，只要是利用本发明的方法生产的即可，该抗体可含有也可不含有信号序列。更具体的说，利用本发明生产抗体的方法生产的抗体既包括含有信号序列的抗体也包括不含有信号序列的抗体。
在本发明中，含有特异性地在丝腺中表达的蛋白的编码DNA的启动子和受该启动子直接调控的重组蛋白的编码DNA的家蚕卵的例子包括含有下述DNA的家蚕卵，其中，在所述DNA中编码重组抗体的DNA可操作地连接到特异性地在丝腺中表达的蛋白的编码DNA的启动子下游。这样的家蚕卵可以通过将下述DNA导入到家蚕卵中来生产，其中，在所述DNA中编码重组抗体的DNA可操作地连接到特异性地在丝腺中表达的蛋白的编码DNA的启动子下游。
在本发明中，含有特异性地在丝腺中表达的蛋白的编码DNA的启动子和受该启动子间接调控的重组蛋白的编码DNA的家蚕卵的例子包括含有以下DNA的家蚕卵：(i)一种DNA，在该DNA中编码重组抗体的DNA可操作地连接到特异性地在丝腺中表达的蛋白的编码DNA的启动子下游，和(ii)一种DNA，在该DNA中编码重组抗体的DNA可操作地连接到转录调控因子的目标启动子的下游。
在本发明中，由编码丝腺特异性表达的蛋白的DNA的启动子直接或间接调控的重组抗体的编码DNA优选的是包含促进抗体分泌和增加回收量的信号序列的DNA。信号序列的具体实施方案如前所述。
术语“可操作连接”表示将启动子和DNA连接起来，以便定位在启动子下游的DNA的表达可以被转录调控因子与启动子的结合调控。因此，即使该DNA被连接到另一个基因上并且由连接的基因生产了融合蛋白，只要融合蛋白的表达被转录调控因子与启动子的结合所诱导，该DNA就可以认为是上述的“可操作连接”。
上述转录调控因子与目标序列的组合的例子包括GAL4与UAS以及TetR与TRE。通过利用GAL4与UAS或TetR与TRE，精确地调控目标基因的表达部位、时期以及表达量，并且该基因可以很容易地表达到多种组织中。此外，即使需要表达的基因是致死基因，也可以建立含有该基因的株系。
可以选择各种方法作为生产上述家蚕卵的方法。例如，可以将上述的(i)和(ii)中的DNA导入到各别的家蚕卵中。含有两种DNA的家蚕卵可以这样获得：从分别导入了单一DNA的家蚕卵孵化转基因家蚕，使这些转基因家蚕交配。在此情况下，可以通过转录调控因子来调整表达的组织，时期，表达量等等的因素，因此具有下述优点：通过与导入了需要表达的基因的株系杂交，即可以改变表达的组织、时期、表达量等指标，而不需制备很多株系。即使目标基因的表达会引起不育仍可以进行实验。另一个优点是：与使用单独的启动子相比，可以得到导入基因的产物的更高水平。此外，具有上述(i)和(ii)的DNA的家蚕卵可以通过下述方法获得：将其中一种DNA导入到由已经导入了另一种DNA的转基因家蚕所产的卵中。具有上述(i)和(ii)中的DNA的家蚕卵也可以通过将两种DNA导入到同一枚卵中的方法获得(Imamura，M.，Nakai，J.，Inoue，S.，Quan，G.-X.，Kanda，T.and Tamura，T.(2003)Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkwormBombyx mori.Fourth International Workshop on Transgenesis and Genomics ofInvertegrate Organisms，Asilomar，p.53)。
DNA可以导入到家蚕卵中，例如按照将转座子作为载体注射到发育早期的家蚕卵中的方法进行(Tamura，T.，Thibert，C.，Royer，C.，Kanda，T.，Abraham，E.，Kamba，M.，Komoto，N.，Thomas，J.-L.，Mauchamp，B.，Chavancy，G.，Shirk，P.，Fraser，M.，Prudhomme，J.-C.and Couble，P.，2000，Nature Biotechnology 18，81-84)。例如，将上述DNA插入到转座子的末端反向重复序列之间而成的载体(Handler AM，McCombs SD，FraserMJ，Saul SH.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(13)：7520-5)和包含转座酶编码DNA的载体(辅助载体)一起导入到家蚕卵中。辅助载体的一个例子是pHA3PIG(Tamura，T.，Thibert，C.，Royer，C.，Kanda，T.，Abraham，E.，Kamba，M.，Komoto，N.，Thomas，J.-L.，Mauchamp，B.，Chavancy，G.，Shirk，P.，Fraser，M.，Prudhomme，J.-C.and Couble，P.，2000，NatureBiotechnology 18，81-84)，但不局限于此。
本发明的转座子的优选实例是piggyBac，但不局限于此。可以使用例如MARINER和MINOS这样的转座子(Shimizu，K.，Kamba，M.，Sonobe，H.，Kanda，T.，Klinakis，A.G.，Savakis，C.and Tamura，T.(2000)Insect Mol.Biol.，9，277-281；Wang W，Swevers L，Iatrou K.(2000)Insect Mol Biol 9(2)：145-55)。
在本发明中，也可以利用杆状病毒载体来生产转基因家蚕(Yamao，M.，N.Katayama，H.Nakazawa，M.Yamakawa，Y.Hayashi et al.，1999，Genes Dev13：511-516)。
在中丝腺中，本发明的丝腺特异性表达蛋白的编码DNA的启动子有例如丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的编码DNA的启动子。丝胶蛋白1或者丝胶蛋白2的编码DNA的启动子的例子包括含有SEQ ID NO：16或17的碱基序列的DNA。包含SEQ ID NO：16或17碱基序列的DNA的例子有由SEQ ID NO：16或17所示的碱基序列构成的DNA、和包含由SEQ IDNO：16或17的碱基序列构成的DNA的上游区或下游区的DNA，但不局限于此。由SEQ ID NO：16或17所示的碱基序列所组成的DNA的上游区和下游区在参考文献中已有公开：Okamoto，H.，Ishikawa，E.and Suzuki，Y.(1982)Structural analysis of sericin genes.Homologies with fibroin gene in the5’flanking nucleotide sequences.J.Biol.Chem.，257，15192-15199；Garel，A.，Deleage，G.and Prudhomme，J.C.(1997)Structure and organization of theBombyx mori sericin 1 gene and of the sericins 1 deduced from the sequence ofthe Ser 1B cDNA.Insect Biochem.Mol.Biol.，27，469-477；Michaille，J.J.，Garel，A.and Prudhomme，J.C.(1990)Cloning and characterization of thehighly polymorphic Ser2 gene of Bombyx mori.Gene，86，177-184。
此外，在本发明中，在中丝腺中特异表达的蛋白的编码DNA的启动子的例子可以是在结构上与包含SEQ ID NO：16或17的碱基序列的DNA相近的DNA，并且该DNA与包含SEQ ID NO：16或17碱基序列的DNA相比，具有等同的或者更好的启动子活性。这样的DNA可以是例如，包含在SEQ ID NO：16或17的碱基序列中发生了一个或多个碱基的取代，缺失，增加和/或插入的碱基序列的DNA。该DNA可以通过例如杂交技术，聚合酶链式反应(PCR)技术，定点诱变以及DNA合成等方法制备。制备的DNA是否具有启动子活性可以由本领域技术人员通过利用公知的报道基因的报道分子分析法等方法来测定。
对于报道基因没有特殊限制，只要其表达是可检测的即可，报道基因包括CAT基因，lacZ基因，萤光素酶基因，β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)以及GFP基因等，这些基因为本领域技术人员所广泛使用。报道基因表达水平依照报道基因的类型可以使用本领域技术人员所熟知的方法来测量。例如，当报道基因是CAT基因时，可以通过测定基因产物催化的氯霉素乙酰化作用来确定报道基因的表达水平。报道基因的表达水平可以通过以下方法测量：当报道基因是lacZ基因时，测定该基因表达产物催化的色素化合物的生色反应；当报道基因是萤光素酶基因时，测定该基因表达产物催化的荧光化合物的荧光；当报道基因是β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)时，测定该基因表达产物催化的葡萄糖醛酸(ICN)的发光或测定5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖酸苷(X-Gluc)的生色反应；而当报道基因是GFP基因时，测定GFP蛋白的荧光。
另一方面，在本发明中，在后丝腺中特异表达的蛋白的编码DNA的启动子有，例如，丝心蛋白L链蛋白的编码DNA的启动子。丝心蛋白L链蛋白的编码DNA的启动子的例子包括包含SEQ ID NO：18所示碱基序列的DNA。包含SEQ ID NO：18所示碱基序列的DNA的例子有由SEQ ID NO：18所示碱基序列组成的DNA和包含由SEQ ID NO：18碱基序列组成的DNA的上游区或下游区的DNA，但不局限于此。由SEQ ID NO：18碱基序列组成的DNA的上游区和下游区在以下的参考文献中已有公开：KIKUCHI，Y.，K.MORI，S.SUZUKI，K.YAMAGUCHI and S.MIZUNO，1992 Structure ofthe Bombyx mori fibroin light-chain-encoding gene：upstream sequence elementscommon to the light and heavy chain.Gene 110：151-158)。
此外，在本发明中，在后丝腺中特异表达的蛋白的编码DNA的启动子的例子可以是在结构上与包含SEQ ID NO：18所示碱基序列的DNA相近的DNA，并且该DNA与包含SEQ ID NO：18所示碱基序列的DNA相比、具有等同的或者更好的启动子活性。这样的启动子可以通过上述方法制备。本发明生产重组抗体的方法包括回收在家蚕体内合成的抗体的步骤。合成的抗体没有不溶化，以其活性形式分泌到中丝腺或后丝腺中。因此，可以从中丝腺或后丝腺中回收重组抗体。以下举例说明从中丝腺或后丝腺中回收重组抗体的方法，解剖吐丝期的家蚕，在20mM Tris-HCl pH7.4中将中丝腺或后丝腺分离出来，然后利用镊子或者手术刀将丝腺切开以从丝腺中回收重组抗体。
本发明的重组抗体也可以从例如转基因家蚕所织的茧中回收。回收方法的例子包括本领域技术人员所熟知的方法，例如将茧溶解在60％LiSCN中、然后在含有20mM Tris和5M尿素的溶液中透析来回收的方法(Inoue，S.，Tsuda，H.，Tanaka，H.，Magoshi，Y.，and Mizuno(2001)Sericologia 4，157-163)。回收蛋白的其它方法包括使用表面活性剂的方法和用水溶液溶解的方法。
对于本发明的家蚕没有特殊限制。然而，为了生产大量的重组抗体，优选使用这样的家蚕，其中构成蚕丝的蛋白(例如丝心蛋白)的产量因编码构成蚕丝的蛋白的DNA区域(包括编码区，启动子区和非翻译区)的突变而受到抑制。这样的家蚕的例子包括突变的家蚕株系，在该突变株系的家蚕中，构成蚕丝的蛋白的产量因编码这些蛋白的DNA区域的突变而受到抑制；并且优选地包括这样的家蚕离蛹：其中构成蚕丝的蛋白的产量因该突变所抑制；或者更优选包括Nd-sD家蚕株系。然而，只要构成蚕丝的蛋白的产量被抑制，任何的家蚕都是合适的，不论该类蛋白产量的抑制是人工造成的，还是依赖于自然发生的突变。
该类家蚕的一个实施方案是本领域技术人员所熟知的家蚕如丝胶蛋白家蚕。通过丝胶蛋白家蚕的使用，可以在中丝腺大量生产重组抗体，并且由导入染色体中的编码重组抗体的DNA所合成的抗体的纯化变得更容易。此外，当在后丝腺中生产重组抗体时，从产量的观点来看优选丝胶家蚕。本发明的家蚕可以使用具有产非滞育卵的特性的家蚕，也可以使用具有产滞育卵的特性的家蚕(例如，实际应用中的家蚕种类包括Gunma，200，Shunrei，Shogetsu，Kinshu以及Showa)。此处，术语“滞育卵”是指在产卵之后胚胎发育短暂停止的卵，术语“非滞育卵”是指产卵之后胚胎发育没有停止并且孵化成幼虫的卵。
当使用具有产滞育卵的特性的家蚕时，产出非滞育卵后将DNA导入到该卵中。例如，可以诱导Gunma型家蚕产非滞育卵，所采用的方法可以为在15℃到21℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，优选的方法是在16℃到20℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，更优选的方法是在18℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，最优选的方法是在18℃培养滞育卵，并且在持续光照下饲养由滞育卵孵化出来的幼虫，来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵。可以诱导200型家蚕产非滞育卵，所采用的方法可以为在15℃到21℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，优选的方法是在16℃到20℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，更优选的方法是在18℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵或者在持续光照的情况下饲养由滞育卵孵化出来的幼虫来诱导被饲养的成虫产非滞育卵，最优选的方法是在25℃培养滞育卵，并且在持续光照下饲养由滞育卵孵化出来的幼虫，来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵。
可以例如在18℃到25℃的孵卵器或者恒温室中培养虫卵。可以在繁殖室在20℃到29℃条件下利用人工饲料饲养幼虫。
上述的本发明的滞育卵可以按照本领域技术人员常用的培养家蚕卵的方法来培养。例如，可以利用在“Monbusho(Ministry of Education)(1978)Sanshu Seizo(Production of silkworm varieties)p.193，Jikkyo Shuppan，Tokyo.”中描述的方法来进行培养。可以利用本领域技术人员所熟知的方法来饲养本发明的家蚕幼虫。例如，可以按照在“Monbusho(Ministry ofEducation)(1978)Sanshu Seizo(Production of silkworm varieties)p.193，Jikkyo Shuppan，Tokyo.”中描述的方法来饲养家蚕幼虫。
在本发明中，所产的卵是否是非滞育卵可以通过卵的颜色来确定。已公知的是滞育卵呈褐色，非滞育卵是黄白色。因此，在本发明中，如果所产的卵的颜色不是褐色(优选是黄白色)，则判定为非滞育卵。
在下文中，将会对将DNA导入家蚕卵的方法的例子进行详细的描述，但是本发明的将DNA导入家蚕卵的方法并不局限于此。例如，可以利用DNA注射管将DNA直接导入家蚕卵。在优选实施方案中，预先在卵壳上用化学或者物理学的方法打孔，然后通过该孔将DNA导入。在该例子中，可以通过调整DNA注射管插入的角度使DNA注射管基本上垂直于卵的腹侧面来将DNA注射管通过该孔插入到卵中。
在本发明中，在卵壳上打孔的物理学方法的例子包括利用针，显微激光等方法打孔。优选的是利用针在卵壳上所打的孔。对针的材质、强度等没有特殊限制，只要该针能够在家蚕卵壳上打孔即可。在本发明中的针通常是指具有锋利尖端的棒状针，但不局限于此形状。只要针能够在卵壳上打孔，对其整体形状没有特别的限制。例如，具有锋利尖端的金字塔形状的物体，或者具有锋利尖端的三角锥形的物体也包含在本发明的“针”的定义中。在本发明中，优选使用的是钨针。本发明的针具有足够的粗度(直径)以便于其打的孔能够允许以下描述的毛细管通过。通常来说针的厚度是2到20μm，优选的是5到10μm。另一方面，在卵壳上打孔的化学方法的例子包括使用化学试剂(例如，次氯酸)或诸如此类的打孔方法。
在本发明中，对孔的位置没有特殊限制，只要DNA注射管插入的角度使DNA注射管能以基本上垂直于卵的腹侧面的角度通过该孔插入到卵中即可。优选的是卵的腹侧面或者其对侧面；更优选的是腹侧面；进一步优选的是腹侧面中心部分微偏向后端的位置。
在本发明中，术语“基本上垂直”意味着70°到120°，优选的是80°到90°。在本发明中，术语“将来会成为生殖细胞的位置”通常指卵的腹侧面接近卵表面的位置(通常在卵表面以下0.01mm到0.05mm)，并且优选的位置是腹侧面中心部分微偏向后极并接近卵表面的位置。
在本发明中，对用于注射DNA的管子的材料、强度、内径等参数没有特殊限制。然而，当在插入DNA注射管之前通过物理学或者化学的方法在卵壳上打孔时，该管优选的是具有足够的粗度(外径)来穿过打出的孔。在本发明中，DNA注射管的例子包括玻璃毛细管等。
在本发明DNA导入方法的优选实施方案中，使用装备了DNA注射管和针的一体化操作装置来进行以下的步骤：物理地或者化学地在家蚕卵上打孔；通过该孔将DNA注射管插入到卵中，其插入角度为基本上垂直于卵的腹侧面；并且注射DNA。优选的是利用含有操作装置作为其构成要素之一的仪器来进行本发明。
这样的仪器由解剖显微镜、照明装置、可移动操作台、利用金属配件固定在显微镜上的粗动操作装置、该操作装置上附带的显微操作器、以及能够调节用于DNA注射的空气压力的注射器组成。该注射器所使用的压力是由氮气罐提供的，并且可以使用脚踩开关来控制压力的开关。注射是在固定在诸如载玻片这样的基片上的卵上进行的，并且可以使用可移动操作台来调节卵的位置。显微操作器的玻璃毛细管被连接到连有四个管子的操作部分并由该操作部分所操控。实际规程中，与钨针与卵的相对位置是由粗操作装置调整的，然后通过利用操作台杆在水平方向上移动卵来打孔。此后，操作部分的显微操作器的杆将玻璃毛细管的尖端引导到该孔的位置，并且利用操作台杆将毛细管插入到卵中。在该例子中，玻璃毛细管必须垂直地插入卵的腹侧面。然后开起脚踩开关来注射DNA，并且操作杠杆将毛细管从卵中拔出。利用瞬间粘合剂或诸如此类的物质将被打的孔封闭，并且将该卵保存在恒温恒湿的孵卵器中。在本发明中所使用的仪器优选的是在专利第1654050号中描述的仪器或者该仪器的改良版本。
此外，在本发明的一个实施方案中，用于导入DNA的家蚕卵优选固定在一个基片上。在本发明中所使用的基片的例子包括载玻片和塑料片材，但不局限于此。在本发明的该实施方案中，优选的是使卵方向一致之后再将它们固定，以便于将DNA准确地注射到家蚕卵上将来会成为生殖细胞的位置中。此外，在该实施方案中，对固定在基片上的家蚕卵的数目没有特殊限制。当使用多个家蚕卵时，优选的是将家蚕卵按背腹取向一定的方向固定在基片上。在本发明中，可以通过例如下述方法来将家蚕卵固定在基片上：诱导家蚕在预先涂有水性胶水的市售卡片(各种排卵卡片)上排卵，然后向卡片上加水来分离卵，并将湿的卵排列在基片上，然后风干。优选的是将这些卵以同一方向固定在玻璃片上。卵在基片上的固定也可以使用双面胶带，粘合剂等完成。
为了确认DNA是否已经被成功导入到家蚕卵中，可以使用例如从卵中重新提取注入的DNA并进行分析的方法(Nagaraju，J.，Kanda，T.，Yukuhiro，K.，Chavancy，G.，Tamura，T.and Couble，P.(1996)Attempt of transgenesisof the silkworm(Bombyx mori L)by egg-injection of foreign DNA.Appl.Entomol.Zool.，31，589-598)，或观察注入的DNA在卵中的表达的方法(Tamura，T.，Kanda，T.，Takiya，S.，Okano，K.and Maekawa，H.(1990)Transientexpression of chimeric CAT genes injected into early embryos of thedomesticated silkworm，Bombyx mori.Jpn.J.Genet.，65，401-410)。
此外，可以通过将药学上可接受的载体与用本发明的方法回收的重组抗体相组合来制备药物组合物。所述载体的例子包括表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、助悬剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流态化剂(fluidizing agent)以及矫味剂，但不局限于这些。其它的常规载体也可以适当地使用。特别是，可以使用轻质无水硅酸，乳糖，微晶纤维素，甘露醇，淀粉，羧甲纤维素钙，羧甲纤维素钠，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，二乙基氨基乙酸聚乙烯缩醛，聚乙烯吡咯烷酮，明胶，中链脂肪酸甘油三酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油60，蔗糖，羟甲基纤维素，玉米淀粉，无机盐以及诸如此类的物质。
在本发明另一个生产重组抗体的方法的具体实施方案中，重组抗体是在家蚕脂肪体中生产的。更具体的说，本发明涉及一种生产重组抗体的方法，该方法包括下述的(a)和(b)步骤：
(a)制备转基因家蚕，该转基因家蚕包括编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子和受该启动子直接或间接表达调控的、编码重组抗体的DNA，并且将重组抗体分泌到脂肪体中；和
(b)从制备的转基因家蚕中回收重组抗体。
本发明还涉及包括下述的(a)和(b)步骤的生产重组抗体的方法：
(a)制备转基因家蚕，该转基因家蚕包括编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子和受该启动子直接或间接表达调控的、编码含有信号序列的重组抗体的DNA，并且将重组抗体分泌到脂肪体中；和
(b)从制备的转基因家蚕中回收重组抗体。
在本发明中制备转基因家蚕的步骤中，首先制备家蚕卵，其包含编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子和编码重组抗体的DNA，该编码重组抗体的DNA受该启动子直接或间接的表达调控。此后，从家蚕卵孵化生产的家蚕中，挑选出将重组抗体分泌到脂肪体中的转基因家蚕。转基因家蚕的挑选可以通过前述方法进行。
在本发明中，含有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子和受该启动子直接调控的编码重组蛋白的DNA的家蚕卵的例子包括含有下述DNA的家蚕卵，其中在所述DNA中重组抗体的编码DNA可操作地连接到编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游。这样的家蚕卵可以通过将下述DNA导入到家蚕卵中来生产，其中在所述DNA中编码重组抗体的DNA可操作地连接到细胞质肌动蛋白的编码DNA的启动子下游。
此外，在本发明中，含有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子和受该启动子间接调控的重组蛋白的编码DNA的家蚕卵是例如含有以下DNA的家蚕卵：(i)一种DNA，在该DNA中编码重组抗体的DNA可操作地连接到编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子下游，(ii)一种DNA，在该DNA中编码重组抗体的DNA可操作地连接到转录调控因子的目标启动子的下游。术语“可操作地连接”如前述所定义。转录调控因子和目标序列的组合的例子包括前述的例子。
可以通过前述方法来生产家蚕卵。例如，可以将上述的(i)和(ii)中的DNA导入到独立的家蚕卵中。含有两种DNA的家蚕卵可以通过使下述转基因家蚕交配来获得，所述转基因家蚕是从分别导入了每种DNA的家蚕卵发育来的。或者，包含(i)和(ii)中的DNA的家蚕卵可以通过将其中一种DNA导入到由已经导入另一种DNA的转基因家蚕所排的卵来获得。此外，包含(i)和(ii)中的DNA二者的家蚕卵也可以通过将两种DNA导入到同一枚卵中的方法获得。
也可以通过前述的方法将DNA导入到家蚕卵中。此外，当在家蚕脂肪体中生产重组抗体时，也可以使用杆状病毒载体来生产转基因家蚕(Yamao，M.，N.Katayama，H.Nakazawa，M.Yamakawa，Y.Hayashi et al.，1999，Genes Dev.13：511-516)。
细胞质肌动蛋白的编码DNA的启动子的例子包括含有SEQ ID NO：19所示碱基序列的DNA。包含SEQ ID NO：19所示碱基序列的DNA的例子是由SEQ ID NO：19所示碱基序列组成的DNA和包含由SEQ ID NO：19所示碱基序列所组成的DNA的上游区或下游区的DNA，但不局限于此。
此外，在本发明中，编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的例子可以是在结构上与包含SEQ ID NO：19碱基序列的DNA相近，并且与包含SEQ ID NO：19碱基序列的DNA相比具有等同的或者更好的启动子活性的DNA。这样的启动子也可以通过前述的方法来制备。由SEQ ID NO：19所示的碱基序列组成的DNA的上游区和下游区在以下的参考文献中已有公开：MANGE，A.，E.JULIEN，J.C.PRUDHOMME and P.COUBLE，1997Astrong inhibitory element down-regulates SRE-stimulated transcription of the A3cytoplasmic actin gene of Bombyx mori.J.Mol.Biol.265：266-274。
转录调控因子和目标序列的组合可以使用上文所述的那些。基因组中插入了通过将GAL4基因连接到编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子下游所制备的基因(由具有上述(i)的DNA的家蚕卵制备的转基因家蚕)的转基因家蚕的制备方法的具体实施方案在如下的参考文献中已有公开：IMAMURA，M.，J.NAKAI，S.INOUE，G.X.QUAN，T.KANDA et al.，2003 Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkwormBombyx mori.Genetics 165：1329-1340。
在本发明中，受编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子直接或间接的表达调控、并编码重组抗体的DNA，优选含有信号序列。该信号序列的具体实施方案如前述。
可以从例如脂肪体中回收由上述方法制备的重组抗体。可以使用本领域技术人员所知的方法从脂肪体回收重组抗体，例如，从幼虫体内分离脂肪体、并在用于蛋白提取的缓冲液中匀浆该脂肪体，或者诱导脂肪体中的蛋白分泌到体液中，然后分级体液。
对通过本发明的方法所制备的抗体没有特殊限制，只要是通过本发明的方法制备的即可，并且该抗体可以包含也可以不包含信号序列。更具体的说，利用本发明生产抗体的方法生产的抗体既包括含有信号序列的抗体也包括不含有信号序列的抗体。
本发明还涉及编码重组抗体的DNA。本发明更优选的是涉及编码含有信号序列的重组抗体的DNA。更具体的说，本发明涉及编码含有人酸性磷酸酶的scFv抗体的DNA。该DNA包括例如SEQ ID NO：13或14所示的DNA。此外，还包括编码下述蛋白的DNA：所述蛋白由在严紧条件下与含有SEQ ID NO：13或14的碱基序列的DNA杂交的核酸编码，并且具有与含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的蛋白等同的功能。
本发明进一步涉及编码抗体的DNA，所述抗体包含具有小鼠免疫球蛋白L链κ信号序列的L链和具有小鼠IgG1信号序列的H链。包含小鼠免疫球蛋白L链κ信号序列的L链的编码DNA的例子是SEQ ID NO：48的DNA。此外，还包括编码下述蛋白的DNA，所述蛋白由在严紧条件下与含有SEQID NO：48所示碱基序列的DNA杂交的核酸编码，并且具有与含有SEQ IDNO：48的氨基酸序列的蛋白等同的功能。包含小鼠IgG1信号序列的H链的编码DNA的例子是SEQ ID NO：50所示的DNA。此外，还包括编码下述蛋白的DNA，所述蛋白由在严紧条件下与含有SEQ ID NO：50所示的碱基序列的DNA杂交的核酸编码，并且具有与含有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的蛋白等同的功能。
本发明提供含有编码重组抗体的DNA的载体以及转化细胞。本发明也提供包含编码具有信号序列的重组抗体的DNA的载体和转化细胞。在本发明中所使用的载体包括例如，M13系列载体，pUC系列载体，pBR322，pBluescript以及pCR-Script，但不局限于此。另外，在以cDNA的亚克隆和切出为目的的场合，除了以上的载体以外，还可以使用例如pGEM-T、pDIRECT，以及pT7等。当使用载体来制备本发明的抗体时，表达载体是特别有用的。当将例如JM109、DH5α，HB101或XL1-Blue等大肠杆菌作为宿主细胞时，除了上述用于大肠杆菌中扩增的性质以外，载体应该具有例如lacZ启动子(Ward et al.(1989)Nature 341：544-546；(1992)FASEB J.6：2422-2427)，araB启动子(Better et al.(1988)Science 240：1041-1043)或者T7启动子来保证目标基因在大肠杆菌中的高效表达。其它载体的例子包括pGEX-5x-1(Pharmacia)，“QIAexpress system”(QIAGEN)，pEGFP以及pET。
此外，载体优选包含用于多肽分泌的信号序列。在使多肽产生到大肠杆菌的周质中的场合，pelB信号序列(Lei，S.P.et al.J.Bacteriol.169：4379(1987))可以用作多肽分泌的信号序列。例如，可以使用氯化钙法或者电穿孔法来将载体导入到宿主细胞中。
除了大肠杆菌之外，来源于哺乳动物的表达载体(例如pCDNA3(Invitrogen)，pEGF-BOS(Nucleic Acids Res.(1990)18(17)，p.5322)，pEF，pCDM8)，来源于昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO-BRL)，pBacPAK8)，来源于植物的表达载体(例如pMH1，pMH2)，来源于动物病毒的表达载体(例如pHSV，pMV，pAdexLcw)，来源于逆转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)，来源于酵母的表达载体(例如“PichiaExpression Kit”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)以及来源于枯草杆菌的表达载体(例如pPL608，pKTH50)可以用作制备本发明的抗体的载体。
为了在CHO，COS以及NIH3T3等哺乳动物细胞中表达，具有启动子的载体对于在这样的细胞中表达是必需的，这样的启动子例如SV40启动子(Mulligan et al.(1979)Nature 277：108)，MMLV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima et al.(1990)Nucleic Acids Res.18：5322)以及CMV启动子。更优选的是还具有用于筛选细胞转化的基因(例如，可以利用诸如新霉素和G418等药物进行鉴定的抗药基因)的载体。具有此类特性的载体的例子包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV以及pOP13等。
可以使用诸如电穿孔法等本领域技术人员公知的方法来将编码重组抗体的DNA导入到细胞内。
此外，本发明涉及含有编码重组抗体的DNA、并分泌该重组抗体的转基因家蚕。更具体的说，本发明涉及将重组抗体分泌到丝腺中的转基因家蚕，在该家蚕中含有编码特异性地在丝腺中表达的蛋白的DNA的启动子以及编码重组抗体的DNA，其中该编码重组抗体的DNA的表达受该启动子直接或间接调控。或者，本发明提供包含下述DNA的转基因家蚕：(i)一种DNA，其中编码转录调控因子的DNA可操作地连接到特异性地在丝腺中表达的蛋白的编码DNA的启动子的下游，和(ii)一种DNA，其中编码重组抗体的DNA可操作地连接到转录因子的目标启动子的下游；以及包含下述DNA的转基因家蚕，在所述DNA中编码重组抗体的DNA可操作地连接到特异性地在丝腺中表达的蛋白的编码DNA的启动子下游。
在本发明中，受丝腺特异性表达蛋白的编码DNA的启动子直接或间接表达调控的、编码重组抗体的DNA，优选含有用于促进抗体分泌、增加回收量的信号序列。信号序列的具体实施方案如前述。
此外，本发明涉及下述转基因家蚕：其含有(i)编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子和(ii)受该启动子直接或间接表达调控的、编码重组抗体的DNA，并将重组抗体分泌到脂肪体中。更具体的说，本发明提供包含下述DNA的转基因家蚕：(i)一种DNA，其中转录调控因子的编码DNA可操作地连接到细胞质肌动蛋白的编码DNA的启动子的下游，和(ii)一种DNA，其中编码重组抗体的DNA可操作地连接到转录因子的目标启动子的下游。或者提供包含下述DNA的转基因家蚕：在该DNA中，编码重组抗体的DNA可操作地连接到编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游。
在本发明中，受细胞质肌动蛋白蛋白质的编码DNA的启动子直接或间接表达调控的、编码重组抗体的DNA，优选含有用于促进抗体分泌、增加回收量的信号序列。信号序列的具体实施方案如前述。
可以通过前述的方法来制备该转基因家蚕。此外，对于本发明中的转基因家蚕，没有特殊限制，并且可以是例如卵的形式。可以使用本发明中的转基因家蚕来生产大量的目的重组抗体。
本发明还提供这样的转基因家蚕，其包含可操作地连接到转录调控因子的目标启动子的下游的、编码重组抗体的DNA。转录调控因子和目标启动子的例子如前述。可以使用此类家蚕来制备带有上述(i)和(ii)的DNA的转基因家蚕，以及制备这些家蚕的卵。
在本发明中，受丝腺特异性表达蛋白的编码DNA的启动子直接或间接表达调控的、编码重组抗体的DNA，优选含有用于促进抗体分泌、增加回收量的信号序列。信号序列的具体实施方案如前述。
此外，本发明提供由本发明的转基因家蚕所织的茧。可以将此类茧作为含有大量的目标重组抗体的茧使用。本发明还提供由含有重组抗体的茧所制备的蚕丝。可以利用已知的方法生产含有本发明的蚕丝的丝织物，例如含有重组抗体的丝织物。本发明还提供此类丝织物。
本发明提供可用于本发明的方法的DNA。此类DNA包括(a)转录调控因子的编码DNA，该DNA可操作地连接到编码丝胶蛋白或丝芯蛋白的DNA的启动子的下游，(b)编码重组抗体的DNA，该DNA可操作地连接到所述转录调控因子的目标启动子的下游，以及(c)编码重组抗体的DNA可操作连接于丝胶蛋白或丝芯蛋白的编码DNA的启动子的下游的DNA等；并且还提供含有上述DNA的组合的试剂盒。本发明还提供这样的载体，其中(a)-(c)所述的DNA被插入到转座子的末端反向重复序列之间。此外，本发明提供含有该载体和含有转座酶的编码DNA的载体(辅助载体)的试剂盒。
可操作地连接到转录调控因子的目标启动子的下游的编码重组抗体的DNA，和编码重组抗体的DNA可操作连接于丝胶蛋白或丝芯蛋白的编码DNA的启动子的下游的DNA，优选含有促进抗体分泌、增加回收量的信号序列。该信号序列的具体例子如前述。
此外，本发明涉及糖尿病性肾病的诊断试剂以及营养状况评估试剂，其中含有利用本发明的抗体制备方法获得的抗转铁蛋白抗体作为有效成分。利用本发明的抗体制备方法获得的重组抗转铁蛋白抗体中既包括含有信号序列的抗体，也包括不含信号序列的抗体。当使用信号序列时，优选的例子如前述。
本发明的抗转铁蛋白抗体包括全长抗体和低分子量化抗体。全长抗体的具体例子包括具有如下所述的L链和H链的抗体，该L链具有SEQ ID NO：3，21和29中任意一个所示的氨基酸序列作为信号序列，SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列作为L链可变区，SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列作为Jκ片段，以及SEQ ID NO：27的氨基酸序列作为κ链恒定区；该H链具有SEQ ID NO：3，21和29中任意一个所示的氨基酸序列作为信号序列，SEQID NO：31的氨基酸序列作为H链可变区，SEQ ID NO：33的氨基酸序列作为CH1，SEQ ID NO：35的氨基酸序列作为铰链区，SEQ ID NO：37的氨基酸序列作为CH2，以及SEQ ID NO：38的氨基酸序列作为CH3。更具体的例子是包含这样的L链和H链的抗体：所述L链含有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，所述H链含有SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列。
另一方面，低分子量化抗体的具体例子，如前文所述的，包括例如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，scFv(单链Fv)，双抗体以及sc(Fv)2(单链(Fv)2)。本发明中特别优选的低分子量化抗体是scFv抗体。在scFv抗体中，优选的是以单链多肽的N端为基准点，按照信号序列、VL、接头以及VH这样的顺序排列。VL、接头以及VH的具体实施方案分别在SEQ ID NO：6、9和12中显示。因此，在本发明中，抗转铁蛋白抗体优选下述scFv抗体，该抗体包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列，且具有人酸性磷酸酶信号序列。
此外，本发明涉及测定从受试者获得的生物样品中的转铁蛋白的量的方法。转铁蛋白是一种存在于血，尿等样品中的分子量为79,000的蛋白，并且该蛋白是铁代谢和造血作用的重要指示物。活体中转铁蛋白的量可反映消化器官，肾等器官的疾病，还可反映肿瘤的病理生理学状态，发炎等现象；因此，通过测定转铁蛋白的量可以诊断这些疾病。
本发明的测定生物样品中转铁蛋白量的方法中，首先，从需要测定转铁蛋白的量的受试者获得生物样品。然后，使该生物样品接触本发明的抗转铁蛋白抗体。对用于本发明测定方法的生物样品没有特殊限制，例如包括血(血清)和尿。本发明的测定方法中的抗体的优选实施方案如前述。在本发明的测定方法中，接下来，测定抗体与生物样品中的转铁蛋白的结合。抗体与转铁蛋白的结合可以通过本领域技术人员所熟知的方法来测定，这些方法包括但不局限于ELISA和EIA。本发明的检测方法是通过测定抗体与样品中的转铁蛋白的结合来测定生物样品中转铁蛋白的量。即，如果完全检测不到抗体与转铁蛋白的结合，即可判断在生物样品中没有转铁蛋白。相反地，如果能够检测到抗体与转铁蛋白的结合，即可判断在生物样品中有转铁蛋白的存在。本领域技术人员可以依照所测定转铁蛋白与抗体的结合程度来确定生物样品中转铁蛋白的量。因此，在本发明中对于转铁蛋白的量的测定不仅包括确定在生物样品是否有转铁蛋白的存在，还包括依照结合的程度来对生物样品中的转铁蛋白进行定量。
本发明进一步涉及诊断糖尿病性肾病的方法。在本发明的诊断方法中，首先按照上述测定转铁蛋白的量的方法所述的方法来测定生物样品中转铁蛋白的量。此后，将测定的转铁蛋白的量与从知道没有患糖尿病性肾病的受试者所获得的生物样品进行比较。当测定的转铁蛋白的量比正常对照的量大时，提供该生物样品的受试者被判断为已患病或者在未来有更高的患糖尿病性肾病的风险。
在本发明的诊断糖尿病性肾病的方法中，将测定的转铁蛋白的量与从已知患糖尿病性肾病的受试者所获得的生物样品进行比较。作为比较的结果，如果转铁蛋白的量与从已知患有糖尿病神经病的受试者所获得的生物样品的程度等同，则提供该生物样品的受试者被判断为已患糖尿病性肾病。术语“程度等同”不仅包括转铁蛋白的量完全相等的情况，还包括实质上相等的情况。量是否实质上相等可由本领域技术人员按照受试者的病情及其它特征来进行适当的判断。描述用于此类判断的标准的参考文献的例子包括：
Yamaguchi，T.：Nippon Rinsho，53(supplementary issue)，227-229(1995)；
Ando，Y：Horumon to Rinsho(Clinical Endocrinology)，42(6)，91-95(1994)；
Konno，M：Igaku to Yakugaku，32(3)，555-565(1994)；
Ishibashi，F.：Tonyobyo(Diabetes)35(12)，949-954(1992)；
Aoki，Y.：Rinsho Yakuri Review(Reviews in Clinical Pharmacology)specialissue No.127，12-16，(2003，10)；
Sakurabayashi，I.and Yamada，T.：Gekkan(Monthly)Medical Technology，Supplement，Rinsho Kensako Jiten(Dictionary of Clinical Examination Items)，(2003)；and
Higashi，T.and Goto，H.：Medical Technology，Vol.30，906-911，No.8(2002.8).
本发明的用于检测糖尿病性肾病的方法可以单独使用，或者作为辅助方法与其它的各种诊断糖尿病性肾病的方法联合使用。将此类方法与其它的各种诊断糖尿病性肾病的方法联合使用使得对于糖尿病性肾病的诊断更加准确和有效。因此，优选将利用本发明的检测糖尿病性肾病的方法所获得的认识与各种对于糖尿病性肾病患者的特征性临床认识加以综合利用。
本发明还涉及评估受试者的营养状态的方法。在本发明的评估营养状态的方法中，当转铁蛋白的量比正常对照的量少的时候，受试者被判断为具有高的营养不良风险或者患有营养不良。在本发明中，转铁蛋白的量下降的程度越显著，则判断受试者患营养不良的风险越高，或者所患的营养不良越严重。本领域技术人员可以从转铁蛋白量的下降程度上来判断受试者患营养不良的风险或者营养不良的程度。例如，当受试者的转铁蛋白完全检测不到或者实质上检测不到时，受试者被判断为患有严重的营养不良。
在本发明的评估营养状态的方法中，首先测定生物样品中转铁蛋白的量。此后，将测定的转铁蛋白的量与正常对照进行比较。对生物样品中转铁蛋白的量的测定可以按照上述方法进行。本领域技术人员可以按照上述的通常使用的标准来判断受试者具有患营养不良的风险是否高，或者是否已经患有营养不良。
本发明的评估营养状态的方法可以与临床诊察、体检、饮食调查等检查方法联合使用来全面地评估和判断个人或者特殊人群的营养状况(nutrition assessment(“Rinsho Eiyo(Clinical Nutrition)”extra edition，volume99，No.5，“Jissen Eiyo Assessment(Practical Nutrition Assessment)”)。在本发明的评估营养状态的方法中，受试者可以是任意个体或者任意群体。通过实施本发明的评估营养状态的方法，可以测定个体或者群体的营养状态。如上所述，本领域技术人员可以通过测定的结果来确定受试者营养不良的有无或者程度。在本发明中，术语“营养不良”是指特定的或多种营养成分不足或过剩的状态，或者营养成分的相互平衡被扰乱的状态。
作为本发明评估营养状态的方法的一个实施方案，例如，本发明评估营养状态的方法可以用于已住院的受试者。例如，当受试者住院时所采的样品的转铁蛋白测定值低于该受试者在正常健康状态下的值(如果存在一定范围的波动应加以考虑)的时候，该受试者可以被确诊为有高的患营养不良的风险或者患有营养不良。
通过本发明的生产方法所生产的抗体，在重组抗体提取物中除了目标抗体以外，不可能含有其它抗体。因此，发生交叉反应的可能性低，并且可以精确地测定仅与目标抗原反应的抗体。这样，在本发明的生物样品中的转铁蛋白量测定方法、糖尿病性肾病诊断方法和营养状态评估方法中，可以正确地测定转铁蛋白的量。
所有上述引用的文献其全部内容并入本文作为参考。
实施例
以下，参考实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明不受这些实施例的限制。
[实施例1]
材料与方法
1.质粒载体的构建
在本研究中，构建了pUASFvaTf(图1)质粒载体，用来通过转基因家蚕生产scFv型抗体，该抗体是可与人转铁蛋白反应的小鼠抗人转铁蛋白抗体(scFv型抗-转铁蛋白抗体：在下文中记作aTf)。用于生产转基因家蚕的该载体是通过在piggyBac转座子反向末端重复序列之间插入融合了UAS启动子的抗体蛋白基因FvaTf来构建的，UAS启动子在酵母转录调控因子GAL4存在的情况下促进基因表达。
scFv型抗人转铁蛋白抗体是按照下述方法设计的。设计具有按照以下结构的DNA：抗体H链可变区(VH)、柔性接头肽(Linker)以及抗体L链可变区(VL)依次连接于人酸性磷酸酶分泌信号序列的下游。对于VH-接头-VL的氨基酸序列，包括各基因之间的连接序列(connection)，均使用已知的序列。本实验中所使用的scFv型抗体基因的碱基序列(密码子转换之前和之后)和由该碱基序列产生的氨基酸序列，及它们与SEQ ID NO的关系示于表2。将基因密码子转换成了适合于在昆虫中表达的密码子(pUC57/FvaTf)。
表2
Figure A20068004765800541
按照图1所示程序构建了GAL4/UAS系统中的基因质粒。更详细地说，利用限制性内切酶SpeI消化pUC57/FvaTf获得FvaTf片段，然后将其插入到经限制性内切酶Bln I消化的供体载体pBluescript II/UAS-SV40中(pBluescript II/UAS-FvaTf-SV40UTR)。
为了在目标部位表达该基因，使用了已经株系化的Ser1GAL4/3XP3DsRed株系的家蚕(Tamura等，2004)。已经确认：在该转基因家蚕中GAL4基因仅在中丝腺表达，并且导入基因的表达由UAS调控(Tamura等，2004)。为了表达导入的抗体基因，将获得的具有抗体基因的UASFvaTf株系与上述的GAL4株系进行了交配(图2)。
该质粒携带绿色荧光蛋白基因3XP3GFP作为用于鉴定转基因家蚕的标志基因，该绿色荧光蛋白基因具有能够促进在胚胎单眼、蛾类复眼以及神经来源组织中表达的启动子(Horn，C.，and E.A.Wimmer，(2000)Dev.GenesEvol.210：630-637；Murizio et al.(1994)Protein Science，3：1476-1484)。
2.Western印迹
Western印迹是按照下述方法进行的。将Ser1GAL4/3XP3DsRed株系与UASFvaTr株系进行交配获得了下一代的卵，产卵之后6天在荧光立体显微镜下观察所产的卵来鉴定GAL4/UAS个体(图3)。仅饲养兼有两种基因的个体，在5龄蚕吐丝的第0天、5龄蚕吐丝的第1天以及5龄蚕吐丝的第2天分离家蚕的丝腺；利用2％的十二烷基硫酸锂、5mM EDTA以及50mMTris-HCl(pH 7.4)从细胞层中提取了蛋白。相似地，作为阴性对照，在不携带UASFvaTf的Ser1GAL4株系的5龄蚕吐丝的第0天分离丝腺并提取了蛋白。向两倍体积的提取样品中加入一倍体积的SDS样品缓冲液(6％SDS、24％甘油、12％2-巯基乙醇以及0.1％BPB)，用Super Sep 5-20％(Wako PureChemical Industries)进行SDS-PAGE，然后按照下述方法进行Western印迹实验。在完成SDS-PAGE之后，以0.8mA/cm2的电流进行1小时的转膜，将蛋白转移到PVDF膜(Millipore)上，然后利用Block Ace(DainipponPharmaceutical)进行封闭。用PBS-T (0.05％Tween、150mM NaCl、10mM磷酸缓冲液、pH 7.4)洗膜，然后把膜放置在用Blcok Ace稀释100倍的HRP标记兔抗小鼠Ig抗体(Amersham Biosciences)的溶液中，在室温下振荡6小时。在HRP标记的兔抗小鼠Ig抗体反应之后，进行与上述相同的清洗操作，并且利用POD Immunostain Set(Wako Pure Chemical Industries)进行检测。
3.RT-PCR
RT-PCR是按照下述方法进行的。如前述，饲养同时具有GAL4/UAS两种基因的个体，并且在5龄蚕吐丝的第0天、5龄蚕吐丝的第1天以及5龄蚕吐丝的第2天分离了家蚕的中丝腺。相似地，作为阴性对照，对于不携带UASFvaTf的Ser1GAL4株系，同样在5龄蚕吐丝的第0天分离了丝腺。此后，将分离的中丝腺转移到玻璃匀浆器(WHEATON)中，并且利用ISOGEN(Nippon Gene)提取总RNA。利用DPEC水将总RNA调整到50μg/20μl，然后利用First-strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Biosciences)按照所附文件的说明将该RNA反转录为cDNA。利用该反转录产物作为模板，按照下述方法进行PCR。取KOD plus(TOYOBO)附带的10x PCR缓冲液5μl、150μM的引物(SEQ ID NO：16)、150μM的引物(SEQ ID NO：17)、1mM MgSO4、0.2mM dNTP以及2单位的KOD plus混合，并且将总体积调整到50μl。利用Eppendorf公司的DNA热循环仪进行PCR反应，反应条件为：一个循环的94℃2分钟，35个循环的94℃15秒，62℃15秒和72℃30秒，再进行一个循环72℃1分钟的延伸反应。以pUASFvaTf质粒载体作为PCR反应的阳性对照模板。
4.重组抗体活性的测定
按照下述程序通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了重组抗体对抗原的活性。在5龄蚕吐丝的第0天分离了Ser1GAL4/UASFvaTf株系以及不携带UASFvaTf的Ser1GAL4株系的家蚕的中丝腺，并且向每200mg的分离的组织中加入1ml Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4)。将该混合物利用玻璃匀浆器进行粉碎，并且14,000rpm离心20分钟，然后用Tris缓冲液将上清分别稀释5倍(40mg/ml)和10倍(10mg/ml)。将这些样品以及未稀释的样品(初始浓度：200mg/ml)用作ELISA测定的样品。此外，使用相似的操作制备了Ser1GAL4株系家蚕的样品作为ELISA测定的阴性对照。将这样制备的100μl ELISA样品分加到用100μg/孔的转铁蛋白(Biogenesis)预先致敏的微孔板中(NUNC)，并且将微孔板在室温下振荡2小时。此后，将ELISA测定用样品从孔中移出，然后以200μl PBS-T洗孔3次。向每个孔中分别加入100μl预先用PBS(150mM NaCl，10mM磷酸缓冲液，pH 7.4)稀释100倍的HRP标记兔抗小鼠Ig抗体，然后将微孔板在室温下振荡六小时。接着，清洗微孔板，并加入100μl的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Roche Japan)使其显色。在加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺之后准确计时3分钟，然后分别加入100μl的1N硫酸来终止显色反应。显色终止后，利用550型酶标仪(BioRad)测量了450nm处的吸光度。
结果与讨论
在家蚕卵发育的早期，将按照前述方法构建的质粒与编码转移酶基因的辅助质粒pA3PIG(Tamura et al.，2000)共同注射到大约1000枚家蚕卵中，检测了在下一代胚胎单眼中的GFP表达。结果如表3所示，在2窝蛾中发现了表达GFP的个体。
表3
  载体   n   注射的卵的数目   检查的蛾卵的数目   转基因的蛾窝数
  PBac UAS USN   1   960   98   2
饲养这些转基因家蚕的结果是：仅成功地建立了一个株系。将获得的UASFvaTf/3XP3GFP株系与Ser1GAL4/3XP3DsRed株系进行交配，在下一代中具有每种荧光蛋白基因的个体的分离比如表4所示。
表4
Figure A20068004765800571
由于这些值与两种基因均为杂合的个体相互交配时的理论值吻合，因此可知：两种基因是分别插入到不同染色体中并独立遗传的。在此情况下，可以很容易地鉴定兼具3XP3GFP和3XP3DsReD两种基因或仅具有其中一种基因的转基因家蚕，这是因为如图3所示，在荧光立体显微镜下观察处于胚胎期的家蚕时，可以观察到单眼或神经来源组织所显示的荧光。
此后，将如此获得的带有3XP3GFP和3XP3DsRed两种基因的个体作为兼具UASFvTr和Ser1GAL4两种基因的个体来饲养，并且用从吐丝期幼虫中丝腺中提取的样品进行Western印迹实验。结果如图5所示，确认了在丝腺中有抗体产生。此外，如图6所示，在对利用相同的方法获得的提取物进行抗体反应时，当丝腺提取物的量增加时，与抗原反应的物质的量也增加，由此可知该提取物具有抗体活性。
与Western印迹相似，从吐丝期的中丝腺中提取总RNA，进行了RT-PCR反应。结果如图4所示，可知：导入的基因的转录在5龄的第五天达到最大，并且随时间推移而受到抑制。因此可知：基因转录在5龄的第五天变得活跃，而蛋白在吐丝期被翻译并存在于中丝腺中。
[实施例2]
材料与方法
1.质粒载体的构建
在本研究中，构建了pBacN/lox p UASIgLUASIgH(图7到9)质粒载体，用于在转基因家蚕中生产与人转铁蛋白反应的小鼠抗人转铁蛋白IgG抗体。这种用于生产转基因家蚕的载体是通过在piggyBac转座子反向末端重复序列之间插入融合了UAS启动子的该抗体蛋白的L链和H链基因来构建的，该UAS启动子在酵母转录调控因子GAL4存在下促进基因的表达。
IgG型小鼠抗人转铁蛋白抗体的L链是按照下述方法设计的。首先，为抗体L链的设计具有以下结构(IgL)的DNA：在小鼠免疫球蛋白L链κ信号肽的下游依次连接抗人转铁蛋白抗体Lκ链可变区、小鼠L链J片段、和小鼠Lκ链恒定区。然后为IgG型小鼠抗人转铁蛋白抗体H链设计具有以下结构(IgH)的DNA：在小鼠IgG1的信号肽的下游依次连接抗人转铁蛋白抗体H链可变区、小鼠IgG1的H链恒定区1(CH1)、小鼠IgG1铰链区、小鼠IgG1的H链恒定区2(CH2)以及小鼠IgG1的H链恒定区3(CH3)。在本实验中所设计的IgG抗体的亚类是IgG1，并且具有κ链的抗原性，同时作为L链和H链连接的均是已知的氨基酸序列。本实验中所使用的基因的碱基序列和由该碱基序列产生的氨基酸序列，及它们与SEQ ID NO的关系示于表5。
表5
2.质粒载体的构建
按照图7到9所示的规程，构建了GAL4/UAS系统中的基因质粒。更详细地说，利用限制性内切酶Nhe I消化pUC57/IgL获得IgL片段，并且将其插入到已由限制性内切酶Bln I消化的供体载体pBluescript II/UAS-SV40中，从而获得了pBluescript II/UAS IgL SV40。然后，利用限制性内切酶SpeI酶切pBluescript II/UAS IgL SV40获得UAS IgL SV40UTR片段，将其插入到已由限制性内切酶Bln I酶切的供体载体pBacN/lox p中，从而获得了pBacN/lox p UAS IgL SV40(图7)。利用限制性内切酶Nhe I酶切pUC57/IgH获得IgH片段，将其插入到已由限制性内切酶Bln I酶切的供体载体pDNR/UAS-SV40中，从而获得了pDNR/UAS IgH SV40(图8)。此后，利用Cre重组酶将UAS IgH SV40UTR片段插入到pBacN/lox p UAS IgL SV40中(图9：pBacN/loxp UASIgL UASIgH)。
3.重组蛋白表达株系的确立
为了在目标部位表达该基因，使用了已经确立的Ser1GAL4/3XP3DsRed株系的家蚕(Tamura，et al.，2004)。已经确认了在该转基因家蚕中，仅在中丝腺表达GAL4基因，并且导入基因的表达受UAS调控(Tamura，et al.，2004)。为了表达导入的IgG型抗人转铁蛋白抗体，将获得的具有IgG型抗人转铁蛋白抗体基因的UASIgL-UASIgH株系与上述的GAL4株系进行了交配(图10)。
该质粒携带绿色荧光蛋白3xP3GFP作为用于鉴定转基因家蚕的标志基因，该绿色荧光蛋白具有能够促进在胚胎单眼、蛾复眼以及神经来源组织中表达的启动子(Horn，C.，and E.A.Wimmer，(2000)Dev.Genes Evol.210：630-637；Murizio et al.(1994)Protein Science 3：1476-1484)。
4.RT-PCR
RT-PCR是按照下述方法进行的。如前述，饲养同时具有GAL4/UAS两种基因的个体，并且从即将到5龄吐丝期的家蚕分离中丝腺。然后，将分离的中丝腺转移到玻璃匀浆器(WHEATON)中，并且利用ISOGEN(Nippon Gene)提取总RNA。利用DEPEC水将总RNA的浓度调整到50μg/20μl，然后利用First-strand cDNA Synthesis Kit(GE-Healthcare Bio-sciences)按照所附文件的说明将该RNA反转录为cDNA。以下描述的PCR反应是利用表6中所示的引物组合、以上述反转录产物为模板进行的，其目的是扩增IgL、IgH、GAL4以及细胞质肌动蛋白。添加TaKaRa Ex Taq Hot Start Version(TaKaRa Bio)附带的10x PCR缓冲液5μl、100μM正向引物(表6)，100μM反向引物(表6)、0.2μM的dNTP、以及2.5单位的TaKaRa Ex Taq Hot StartVersion，将总体积调整到50μl，利用eppendorf公司的DNA热循环仪进行PCR反应，反应条件为：一个循环的94℃2分钟，40个循环的94℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，再进行72℃1分钟的延伸反应。
表6
  引物  IgL   IgH   GAL4   肌动蛋白
  正向引物  SEQ ID NO：40   SEQ ID NO：42   SEQ ID NO：44   SEQ ID NO：46
  反向引物  SEQ ID NO：41   SEQ ID NO：43   SEQ ID NO：45   SEQ ID NO：47
5.IgG1抗体的检测
按照下述方法检测IgG型小鼠抗体。通过将Ser1GAL4/3xP3DsRed株系与UASIgL-UASIgH株系交配获得下一代的卵，在产卵后第6天，利用荧光立体显微镜对卵进行观察，鉴定GAL4/UAS个体(图11)。仅饲养兼具两种基因的个体，分离5龄吐丝期蚕的丝腺，用20mM Tris-HCl pH 7.4(Tris缓冲液)提取丝腺中的蛋白。利用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(GEHealthcare Bio-Sciences)来检测该蛋白溶液中的抗体。更具体地说，将分型棒(typing stick)浸入从家蚕丝腺中提取的蛋白溶液中，在室温下振荡18个小时。然后在按照说明书的清洗规程清洗，再加入过氧化物酶标记的抗小鼠抗体，在室温下振荡六小时。然后进行清洗操作，然后将棒浸入底物溶液中来确定条带。
6.测定重组抗体与抗原的反应性
按照下述程序通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了重组IgG抗体对抗原的活性。从Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH株系以及不携带UASIgL-UASIgH的Ser1GAL4株系的吐丝期家蚕分离中丝腺，并且加入3mlTris缓冲液。将该混合物利用玻璃匀浆器进行粉碎，并且用12,000rpm离心20分钟，然后将上清作为中丝腺提取样品的储备液。将该储备液用Tris缓冲液分别稀释2倍和4倍。将这些样品以及未稀释的样品(储备液)用作ELISA测定的样品。此外，通过类似的程序对Ser1GAL4株系家蚕制备ELISA测定样品作为阴性对照。利用Bradford法(Quick Start蛋白测定染色液：BIO-RAD)对Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH株系和Ser1GAL4株系储备液样品中的蛋白进行定量(表7)。
将如上述制备的ELISA样品100μl分别加到用1μg/孔转铁蛋白(Biogenesis)预先致敏的微孔板(NUNC)中，并且将微孔板在室温下振荡3小时。然后，从孔中弃去ELISA测定用样品，然后以200μl PBS-T洗涤孔3次。再分别加入100μl过氧化物酶标记山羊抗小鼠Ig多克隆抗体(Dako)，将微孔板在室温下振荡4小时。然后用200μl PBS-T洗涤孔5次。加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Roche Japan)使其显色。加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺准确计时4分钟后，分别加入100μl 1N硫酸来终止显色反应。此后，利用550型酶标仪(BioRad)测量450nm处的吸光度。
表7
  Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH   对照
  蛋白含量(mg/ml)   0.39   0.97
结果与讨论
将按照前述方法构建的质粒与编码转移酶基因的辅助质粒pA3PIG(Tamura et al.，2000)共同注射到大约700枚发育早期的家蚕卵中，检测了在下一代胚胎单眼中的GFP表达。结果如表8所示，在7窝蛾卵中发现了表达GFP的个体。
表8
  载体   n   注射的卵的数目   检测的蛾卵的数目   转基因的蛾卵窝数
  pBacN/loxp  UASIgLUASIgH   1   684   214   7
饲养这些转基因家蚕的结果是成功地建立了三个株系。此外，将建立的UASIgL-IgH株系中的一个与Ser1GAL4株系进行交配，在下一代中具有每种荧光蛋白基因的个体的分离比如表9中所示。
表9
Figure A20068004765800621
由于这些值与两种基因均为杂合的个体互相交配时的理论值吻合，因此可知：两种基因是分别插入到不同染色体中并独立遗传的。在此情况下，可以很容易地鉴定兼具3XP3GFP和3XP3DsRed两种基因或仅具有其中一种基因的转基因家蚕，这是因为如图11所示，在荧光立体显微镜下观察处于胚胎期的家蚕时，可以观察到单眼或神经来源组织所显示的荧光。
然后，将如此获得的带有3XP3GFP和3XP3DsRed两种基因的个体作为兼具UASIgL UASIgH和Ser1GAL4两种基因的个体来饲养，并且利用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit确认从吐丝期幼虫中丝腺中提取的样品中是否含有IgG1型抗体。结果如图13所示，可知在丝腺中产生了具有κ链的小鼠IgG1型抗体。此外，当使同样从丝腺中提取的样品与抗原反应时，如图14所示，转基因家蚕产生的重组蛋白发挥了抗体的作用。
与检测IgG1型抗体的方法相似地，从中丝腺中提取了总RNA并进行了RT-PCR反应。结果如图12所示，可知抗体L链和H链的基因均发生了转录。
工业实用性
本发明提供了用家蚕生产重组抗体的方法。昆虫并不具有抗体分子。因此，利用家蚕生产重组抗体的优势在于：例如，在重组抗体提取物中除了所需的抗体以外，不会有其它的抗体。这意味着，与如小鼠等哺乳动物不同，不需要制备敲除个体。当利用哺乳动物来源的培养细胞等时，哺乳动物细胞来源的抗体可能会包含在所生产的重组抗体的纯化产物中。这会导致交叉反应，并且干扰对抗原量的准确测定。当利用家蚕来源的重组抗体时，发生交叉反应的可能性小，并且可以仅针对与目标抗原反应的抗体进行准确测定。此外，利用家蚕可以大量生产抗体。本发明在需要大量高特异性的抗体的医药和诊断试剂领域很有价值。
序列表
<110>独立行政法人农业生物资源研究(NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES)
日东纺绩株式会社(NITTO BOSEKI CO.，LTD.)
优尼泰克株式会社(UNITECH CO.，LTD)
<120>产生抗体的转基因家蚕及其制备方法
<130>MOA-A0503P
<150>JP 2005-302906
<151>2005-10-18
<160>51
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>57
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
atggacatgt ggacggcgct gctcatcctg caagccttgt tgctaccctc cctggct    57
<210>2
<211>57
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>2
atggacatgt ggaccgctct gctcatcctg caagctctgc tcctgccctc cctggct    57
<210>3
<211>19
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
Met Asp Met Trp Thr Ala Leu Leu Ile Leu Gln Ala Leu Leu Leu Pro
1               5               10              15
Ser Leu Ala
<210>4
<211>363
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>4
ctcgaggtcc agctgcagga gtcgggacct gacctggtga aaccttctca gtcactttca  60
ctcacctgca ctgtcactgg ctactccatc accagtggtt atagctggca ctggattcgg  120
cagtttccag aaaacaaact ggaatggctg ggctacatac actccagtgg tgccactaac  180
tacagcccat ctctcaaaag tcgattctct atcactagag acacatccaa gaaccagttc  240
ttcctgcagt tgaactctgt gactactgag gacacagcca catattactg tgcaagggat  300
ggttactccc ctccctatgc tatggactat tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc  360
tca                                                                363
<210>5
<211>363
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>5
ctggaagtgc aactgcaaga atccggtccc gatctggtga aaccctccca atccctgtcc  60
ctgacctgca ccgtgaccgg ttactccatc acctccggtt actcctggca ctggatcagg  120
cagttccccg agaacaagct ggagtggctg ggttacatcc actcctccgg tgctaccaac  180
tactccccct ccctgaagtc ccgtttctcc atcacccgtg acacctccaa gaaccagttc  240
ttcctgcaac tgaactccgt gaccaccgaa gataccgcta cctactactg cgctcgtgat  300
ggttactccc ccccctacgc tatggactac tggggtcaag gtaccaccgt gaccgtctcc    360
tcc                                                                  363
<210>6
<211>121
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>6
Leu Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser
1               5                   10                  15
Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Glu Asn Lys Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Lcu Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>7
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggac   48
<210>8
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>8
ggcggcggcg gctccggcgg tggtggctcc ggtggtggtg gttccgat    48
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
1               5                   10                  15
<210>10
<211>339
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>10
attgagctca cccagtctcc atcctcccta gctgtgtcag ttggagagaa ggttactatg    60
acctgcaagt ccagtcagag ccttttatat agtaccaatc aaaagaacta cttggcctgg    120
taccagcaga aaccagggca gtctcctaaa ctgctgattt actgggcatc cactagggaa  180
tctggggtcc ctgatcgctt cacaggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc  240
agcagtgtga aggctgaaga cctgtcagtt tattactgtc agcaatatta tagctatcct  300
cccacgttcg gctcgggcac caagcttgaa atcaaataa                         339
<210>11
<211>339
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>11
atcgaactga cccaatcccc ctcctccctg gctgtgtccg tgggtgagaa ggtgaccatg  60
acctgcaagt cctcccagtc cctgctctac tccaccaacc agaagaacta cctggcttgg  120
taccaacaaa aacccggtca gtcccccaag ctgctcatct actgggcttc cacccgtgaa  180
tccggtgtgc ccgatcgttt caccggttcc ggttccggta ccgacttcac cctgaccatc  240
tcctccgtga aggctgagga cctgtccgtg tactactgcc agcaatacta ctcctacccc  300
cccaccttcg gttccggtac caagcttgag atcaagtaa                         339
<210>12
<211>112
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>12
Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr
            20                  25                  30
Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
                85                  90                  95
Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>13
<211>807
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>13
atggacatgt ggacggcgct gctcatcctg caagccttgt tgctaccctc cctggctctc    60
gaggtccagc tgcaggagtc gggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc    120
acctgcactg tcactggcta ctccatcacc agtggttata gctggcactg gattcggcag    180
tttccagaaa acaaactgga atggctgggc tacatacact ccagtggtgc cactaactac    240
agcccatctc tcaaaagtcg attctctatc actagagaca catccaagaa ccagttcttc    300
ctgcagttga actctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagggatggt    360
tactcccctc cctatgctat ggactattgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca    420
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat tgagctcacc    480
cagtctccat cctccctagc tgtgtcagtt ggagagaagg ttactatgac ctgcaagtcc  540
agtcagagcc ttttatatag taccaatcaa aagaactact tggcctggta ccagcagaaa  600
ccagggcagt ctcctaaact gctgatttac tgggcatcca ctagggaatc tggggtccct  660
gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtgtgaag  720
gctgaagacc tgtcagttta ttactgtcag caatattata gctatcctcc cacgttcggc  780
tcgggcacca agcttgaaat caaataa                                      807
<210>14
<211>807
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>14
atggacatgt ggaccgctct gctcatcctg caagctctgc tcctgccctc cctggctctg  60
gaagtgcaac tgcaagaatc cggtcccgat ctggtgaaac cctcccaatc cctgtccctg  120
acctgcaccg tgaccggtta ctccatcacc tccggttact cctggcactg gatcaggcag  180
ttccccgaga acaagctgga gtggctgggt tacatccact cctccggtgc taccaactac  240
tccccctccc tgaagtcccg tttctccatc acccgtgaca cctccaagaa ccagttcttc  300
ctgcaactga actccgtgac caccgaagat accgctacct actactgcgc tcgtgatggt  360
tactcccccc cctacgctat ggactactgg ggtcaaggta ccaccgtgac cgtctcctcc  420
ggcggcggcg gctccggcgg tggtggctcc ggtggtggtg gttccgatat cgaactgacc  480
caatccccct cctccctggc tgtgtccgtg ggtgagaagg tgaccatgac ctgcaagtcc  540
tcccagtccc tgctctactc caccaaccag aagaactacc tggcttggta ccaacaaaaa  600
cccggtcagt cccccaagct gctcatctac tgggcttcca cccgtgaatc cggtgtgccc  660
gatcgtttca ccggttccgg ttccggtacc gacttcaccc tgaccatctc ctccgtgaag  720
gctgaggacc tgtccgtgta ctactgccag caatactact cctacccccc caccttcggt    780
tccggtacca agcttgagat caagtaa                                        807
<210>15
<211>268
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>15
Met Asp Met Trp Thr Ala Leu Leu Ile Leu Gln Ala Leu Leu Leu Pro
1               5                   10                  15
Ser Leu Ala Leu Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val
            20                  25                  30
Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser
        35                  40                  45
Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Glu Asn
    50                  55                  60
Lys Leu Glu Trp Leu Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys
                85                  90                  95
Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Ash Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Pro Pro Tyr Ala Met Asp
        115                 120                 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met
                165                 170                 175
Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn
            180                 185                 190
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
        195                 200                 205
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
    210                 215                 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys
225                 230                 235                 240
Ala Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro
                245                 250                 255
Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            260                 265
<210>16
<211>1935
<212>DNA
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>16
gaaattctta gctacatcta gcccagactg taagagtttc ttaggagctt tagaagttaa    60
agaagtacct ttgtgttgct gatccttcta tatcatctgg tcctagtaaa ggtactctct    120
tataatctcc ttcctaattc cttacctgct atttatcgat tgtaggtcgt cttggaaacc    180
agtaccactg tacaaactcg cgccccatta gtaacgtgat ttgaacggcc aaccaattga    240
tgttttaatg caattaatat cgtatcttta accccaacgt ggttctgcgt taactaagtg    300
ctcaccgctg tcaacagcaa taaaaccatt tttgaaataa taacatcatt acactaacat    360
agtgagctag tcgcaaaatg tatgtagaga gaaaacaaac cttctttggg gtgttgagag    420
gaaatcgctg gattagaact atcgtgaaga ccattcactg atcctgtgta cttaaattcg    480
cggattcagc attaagcgcc ggatctcagt tccatcgtaa tcccagttaa agaggtgaaa    540
ttagctatca cttcgatatc tgttctgaaa gcaatgttcc acttgtaaaa gcataagcgg    600
tcagaaacct tgttaaccaa tagagccaaa tatagttaac acaatagaaa tttatccaaa    660
tattattcgt gtattgttta tagcctttgt caagtctttt acaaggcaag ataataagta    720
atattccgtg attggacgta acatttcccg gaagatcctt agccgataag tcgaagagcc    780
gcatgtggct agagagacgc gggtttccga ccactggctt aggcgcttat tccgccataa    840
tagatgtacg tgttcacaat tagcacccga aattcgtaat agctacgaga agtatcgaat    900
atcaaaaatc tatatattaa tacgtgaagc aaaaactttg tatccctttt tacgaaaatt    960
gcgaggacgg aggagtatga aatttcccac acttatagag aatacagaga agaagtgcac    1020
aatgctaata tttttttaaa ataatgcata aaagatactt taaatcaata aagaaaacag    1080
cacacacact acataccatg tatttgacgc acacacgcat gtatactatt tattgtcaaa    1140
cttttgttct tgacgtctgt gttcaaactg agaatagatt aaatattgtt tgtctttatt    1200
aatatttttt aatagtgtag tcttggcgaa atttgtgatt atagaagtat aaaatacaat    1260
cataatagtg tacaaactta caattcccaa ttaattatag tcgaatttcg actactgcgg    1320
gacctctagt attaataatt ctctttaaaa aaaaacagag catcaaatac tgtcacaaat    1380
gtcaagcggg tctcaacgag ccatgaataa attagaaatc aattaataac ataaaatagg    1440
caaacaaaat aaaaccattt acatagagaa cgtttgttga acaaaaacaa taacttgtat    1500
acattgtttg cacaaatgtt tgaaccgaaa atttattact ctctacgtaa gcttgatcaa  1560
acttcgtttt cgtataaaac gcgttggccc aaccactttg gcatagtcgt cttatcatcg  1620
ggtctctaag gatcaagcga tccaaagacc gccaacatgc gtttcgttct gtgctgcact  1680
ttgattgcgt tggctgtgag tatcattgct tcgttatcaa caatgacgta tttactaaga  1740
acactcttag atatgccttc aaattaaagc tttcaaagct ctgaagttca ccaaatgcga  1800
ctgttttagc gtaagcattt ctatccccca acagccattt agcgactacc cgaaaatcac  1860
tcgatttaac ttgggagttt ctgcaattta aaagttcaca ggtcgtctcc gattatactt  1920
ttaaacgctt cgcgc                                                   1935
<210>17
<211>2036
<212>DNA
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>17
cagaatctac cacgatcgga aacgcgaccc actgagaaga tccggcgaga aactcagtga  60
gctgtgtcta tgggttaatt tactcgtcga gccctgttta ctgtttaggg cgacgtcgac  120
tgttaccatt cggtctacag gatcgagtgt gcattcttgt atcatcgttc tattatcacg  180
agtcattttg cgttttttcg gatcccctgg aagtcgtcgt ggcctaagag ataagaagtc  240
cggtgcattc gtgttgagcg atgcacctgt gttcgaatcc taggcgggta ccaatttttc  300
taatgaatta cgtacccaac aaatgttcac gattgccttc cacggtgaag gaataacatc  360
gtgcaataaa agtgaaaccc gcaaaatccg gtgcttttaa gcttttcaag caccggtcac  420
catcctcgtt gaactcatcg atctacaagc gatctaatct atagacccaa tccactaaga  480
tctcaccgga tcttctcagt ggttcgcatt ccagtggtag attcaattcg ctgctcttgc  540
tagggctagt gttagcaaat tccttcgggt taagcccgag agctcaccta tccgtccgcg  600
ctaagctgga aaagcccctt aagctgtttt ttttttgtat agcctttatt gctaatacta  660
aacaataact aataatttta catacagtaa caaattgttt taacttaaat ctaatacatc    720
ggatttcccg gttcagtgat cagcgtgtcc tgtgacacat aggcctcttc cagctgcttt    780
catttttctc tattggtagc ttttcttgac cagattgtct ctccaatcat cttgatatcg    840
tctgtccatc ttctagcttg cctggctctt ttcctttaaa ccaggggtcg tgaattcaat    900
cctcacagga agccgggatt aggtgggaga atatagttcc gatgttttga atgctttata    960
ttttctgtgg tcgaaaatga tactagagct acgcgtcgac aattgaatat tatgctaact    1020
accctctatt tattaaaaga cttttacgat tcatttcgca cagaaccaat cgactgggtt    1080
tagaggttta gcagtttgtt gaatgaactc gttttcatct tcacgattag aggatcccag    1140
gtgttaggta aaggatattc tagattgcag gagatttttc ataaataatc acgcgatgga    1200
gcggtaatca gccaacatag tcgatcggca tcattattgg agaccaaaca acacttcagt    1260
tatccaagcg cgtcttaagt cgcattcgga taatcttgaa tagcctggaa gtgaattttt    1320
aaaaagtttg tctcgaacaa acatcaatta ctttgtaatt gaaccgaaaa aagaggataa    1380
acattattag cattcgttgt aatgaaatat aatgttgaca cagtttgacc gacgtgcact    1440
gtcttttgtg gcaccggcta tataaaggtg gtctgtccgt tctgagccac acgagtcatc    1500
atgaagatcc catacgtctt gctgttcctt gtggtgagtt gctttcgttt ttgatatgct    1560
ggttcctcag gagtctgtac taatgcttct gtttttattg tataaatgtg agcacttcac    1620
ggcctacgta accagctggt tacaatcacc gtccacgccg aaaaaatgag gcctgtatct    1680
aaattgtaac ataatttttg cacatttgat tctcatccca cgattttatt tatctttcat    1740
tcatttttac tggtggtagg acgtcttgtg agtccgcacg tgcaccacct cacctatttc    1800
agccgtgaag cagtaatgcg cttcggtttg aagggtgggg cagccgttgt actttataaa    1860
cggagacctt agaactcatg tcccgagatg ggtggcagca tttacgttgc agatgtctat    1920
gggctccggt aaccacttaa catttttttt ttttcttttt tttttttttt tatcacgcta    1980
cgttaattgg tcccgtgata agttcgtaaa gaacttgtgt tacaggtacc agataa        2036
<210>18
<211>1027
<212>DNA
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>18
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gattgagcgc gataataacg cagtactatt ggagagattc tatgtttaat atattaatga    240
tatgatataa aaaagggtgc gtgtacttat gtacgcgcgt aagaagttat actttatttt    300
cattaaattt atttcttttt ttttatttca attttaatca atttgaaaaa aaatcgaata    360
aacaacatcc tcaaacatgc atattggaca tcccttttct tgacatcgta taaattcggt    420
aattctcggt acggttcgta aagttcacct gcggctatat tccgactcgc caagttacgt    480
cagtcgtatt gtaatgagcg atttagtggg caacttcatt ctgttaattt tgtgtcacgg    540
tgcgcgcgca tcgtaaaact tcactctcat agatttttca taacgcgcct aaagaagtat    600
aacttcaata atttaaattt aaaaaaaaac atgcatagaa taattatatg aattatttaa    660
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ggaatcc                                                              1027
<210>19
<211>1892
<212>DNA
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>19
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<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>20
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<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>21
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ile Val Thr
1               5                   10                  15
Val
<210>22
<211>336
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>22
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<210>23
<211>112
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>23
Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr
            20                  25                  30
Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
                85                  90                  95
Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>24
<211>39
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>24
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<210>25
<211>13
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>25
Tyr Thr Phc Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1               5                   10
<210>26
<211>318
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>26
gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga  60
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cataacagct atacctgtga ggccactcac aagacatcta cttcacccat tgtcaagagc  300
ttcaacagga atgagtgt                                                318
<210>27
<211>106
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>27
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
            20                  25                  30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
        35                  40                  45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
    50                  55                  60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65                  70                  75                  80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
                85                  90                  95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
            100                 105
<210>28
<211>57
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>28
atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctct    57
<210>29
<211>19
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>29
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Val Leu Ser
<210>30
<211>357
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>30
gtccagctgc aggagtcggg acctgacctg gtgaaacctt ctcagtcact ttcactcacc  60
tgcactgtca ctggctactc catcaccagt ggttatagct ggcactggat ccggcagttt  120
ccagaaaaca aactggaatg gctgggctac atacactcca gtggtgccac taactacagc  180
ccatctctca aaagtcgatt ctctatcact cgagacacat ccaagaacca gttcttcctg  240
cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag ggatggttac  300
tcccctccct atgctatgga ctattggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca     357
<210>31
<211>119
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>31
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Glu Asn Lys Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Gly Tyr Ser Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>32
<211>291
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>32
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac    60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc    120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct ggagtctgac    180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagcc ctcggcccag cgagaccgtc    240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat t             291
<210>33
<211>97
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>33
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
    50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
                85                  90                  95
Ile
<210>34
<211>39
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>34
gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtaca              39
<210>35
<211>13
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>35
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
1               5                   10
<210>36
<211>321
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>36
gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt  60
actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc  120
cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag gtgcacacag ctcagacgca accccgggag  180
gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg  240
ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag  300
aaaaccatct ccaaaaccaa a                                            32l
<210>37
<211>107
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>37
Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
1               5                   10                  15
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
            20                  25                  30
Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
        35                  40                  45
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
    50                  55                  60
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp
65                  70                  75                  80
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro
                85                  90                  95
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
            100                 105
<210>38
<211>321
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>38
ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag  60
gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag  120
tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg  180
aatggctctt acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga  240
aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc  300
ctctcccact ctcctggtaa a                                            321
<210>39
<211>107
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>39
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
1               5                   10                  15
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
        35                  40                  45
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr
    50                  55                  60
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
                85                  90                  95
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
            100                 105
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>40
gcagattatc agcttcctgc t                             21
<210>4l
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>41
gacaggtctt cagccttcac a                             21
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>42
ggaactgcag gtgtcctctc                       20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>43
aggggagtaa ccatcccttg                       20
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>44
ctcgtccttc agtgatagca g                     21
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>45
cgcttaacat gatggagcat cg                22
<210>46
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>46
tacaatgagc tgcgtgtcg                    19
<210>47
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>47
cgggcgtgtt gaatgtttc                   19
<210>48
<211>744
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>48
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca ttgtcacagt cattgagctc  60
acccagtctc catcctccct agctgtgtca gttggagaga aggttactat gacctgcaag  120
tccagtcaga gccttttata tagtaccaat caaaagaact acttggcctg gtaccagcag  180
aaaccagggc agtctcctaa actgctgatt tactgggcat ccactaggga atctggggtc  240
cctgatcgct tcacaggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtgtg  300
aaggctgaag acctgtcagt ttattactgt cagcaatatt atagctatcc tcccacgttc  360
ggctcgggca ccaagctgga aatcaaatgg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc  420
aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc atcttcccac catccagtga gcagttaaca  480
tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg aacaacttct accccaaaga catcaatgtc  540
aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag  600
gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat  660
gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc actcacaaga catctacttc acccattgtc  720
aagagcttca acaggaatga gtgt                                         744
<210>49
<211>248
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>49
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ile Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
            20                  25                  30
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
        35                  40                  45
Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
    50                  55                  60
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ser Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
            100                 105                 110
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
        115                 120                 125
Lys Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp
    130                 135                 140
Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys
                165                 170                 175
Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly
            180                 185                 190
Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
        195                 200                 205
Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn
    210                 215                 220
Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val
225                 230                 235                 240
Lys Ser Phc Asn Arg Asn Glu Cys
                245
<210>50
<211>1386
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>50
atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgtc    60
cagctgcagg agtcgggacc tgacctggtg aaaccttctc agtcactttc actcacctgc    120
actgtcactg gctactccat caccagtggt tatagctggc actggatccg gcagtttcca    180
gaaaacaaac tggaatggct gggctacata cactccagtg gtgccactaa ctacagccca    240
tctctcaaaa gtcgattctc tatcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag    300
ttgaattctg tgactactga ggacacagcc acatattact gtgcaaggga tggttactcc    360
cctccctatg cta tggactattggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagccaaa    420
acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg    480
gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac    540
tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctggagtc tgacctctac    600
actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agccctcggc ccagcgagac cgtcacctgc    660
aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt    720
ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca    780
aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac    840
atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac    900
acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa    960
cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt    1020
gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct    1080
ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg    1140
acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg    1200
cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatga acacgaatgg ctcttacttc    1260
gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc    1320
tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct    1380
ggtaaa                                                               1386
<210>51
<211>462
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>51
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1               5                       10              15
Val Leu Ser Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro
            20                  25                  30
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
        35                  40                  45
Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Glu Asn Lys Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Leu Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ser Pro
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
                85                  90                  95
Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
145                 150                 155                 160
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
    210                 215                 220
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
225                 230                 235                 240
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
                245                 250                 255
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
            260                 265                 270
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
    290                 295                 300
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
305                 310                 315                 320
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
                325                 330                 335
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            340                 345                 350
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
        355                 360                 365
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
    370                 375                 380
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
385                 390                 395                 400
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn
                405                 410                 415
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
            420                 425                 430
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
        435                 440                 445
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460

Claims (63)

1.一种制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕，所述转基因家蚕中导入了编码带有信号序列的重组抗体的DNA；
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体。
2.一种制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕的步骤，所述转基因家蚕具有
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子，以及
编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA
并且将重组抗体分泌至丝腺；和
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体的步骤。
3.权利要求2的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子之下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，其可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
4.权利要求2的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子之下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
5.权利要求3或4的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
6.权利要求2～5任一项的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
7.权利要求6的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
8.权利要求6的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
9.一种带有信号序列的重组抗体。
10.权利要求9的抗体，该抗体为完整抗体或低分子量抗体。
11.编码权利要求9或10的抗体的DNA。
12.具有权利要求11的DNA的载体。
13.携带权利要求12的载体的细胞。
14.一种制备转基因家蚕的方法，所述转基因家蚕分泌带有信号序列的重组抗体，该方法包括制备包含编码所述重组抗体的DNA的家蚕卵的步骤。
15.一种制备将重组抗体分泌至丝腺中的转基因家蚕的方法，该方法包括制备家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有：
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子，以及
编码带有信号序列的重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA。
16.权利要求15的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子之下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，其可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
17.权利要求15的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制得的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子之下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
18.权利要求16或17的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
19.权利要求15～18任一项的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
20.权利要求19的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
21.权利要求19的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
22.一种转基因家蚕，其具有编码带有信号序列的重组抗体的DNA并且分泌该重组抗体。
23.一种转基因家蚕，其具有：
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子，以及
编码带有信号序列的重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA，
并且将所述重组抗体分泌至丝腺中。
24.权利要求23的转基因家蚕，其具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子之下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，其可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
25.权利要求23的转基因家蚕，其是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子的下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子下游。
26.权利要求24或25的转基因家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
27.权利要求23～26任一项的转基因家蚕，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
28.权利要求27的转基因家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
29.权利要求27的转基因家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
30.一种转基因家蚕，其具有编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于转录调控因子的目标启动子之下游。
31.权利要求30的转基因家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
32.一种制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕的步骤，所述转基因家蚕具有
编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子，以及
编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA
并且将重组抗体分泌至脂肪体中；和
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体的步骤。
33.权利要求32的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子之下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，其可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
34.权利要求32的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制得的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子之下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
35.权利要求33或34的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
36.一种制备将重组抗体分泌至脂肪体中的转基因家蚕的方法，该方法包括制备家蚕卵的步骤：所述家蚕卵具有：
编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及
编码带有信号序列的重组抗体，并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA。
37.权利要求36的方法，其中，所述转基因家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子之下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
38.权利要求36的方法，其中，所述转基因家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子之下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
39.权利要求37或38的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
40.一种转基因家蚕，其具有：
编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及
编码带有信号序列的重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA，
并且将所述重组抗体分泌至脂肪体中。
41.权利要求40的转基因家蚕，其具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，其可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子之下游；
(ii)编码带有信号序列的重组抗体的DNA，其可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
42.权利要求40的转基因家蚕，其是通过使以下(i)和(ii)所述的转基因家蚕交配而制备的：
(i)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码转录调控因子，并可操作地连接于编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子之下游；
(ii)具有下述DNA的转基因家蚕：所述DNA编码带有信号序列的重组抗体，并可操作地连接于所述转录调控因子的目标启动子之下游。
43.权利要求41或42的转基因家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
44.一种制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备导入了编码重组抗体的DNA的转基因家蚕；
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体。
45.一种制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕，所述转基因家蚕具有
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子、以及
编码重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA
并且将重组抗体分泌至丝腺中；和
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体。
46.权利要求45的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
47.权利要求46的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
48.权利要求46的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
49.一种制备分泌重组抗体的转基因家蚕的方法，该方法包括制备具有编码重组抗体的DNA的家蚕卵的步骤。
50.一种制备将重组抗体分泌至丝腺中的转基因家蚕的方法，该方法包括制备家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子，以及
编码重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA。
51.权利要求50的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
52.权利要求51的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
53.权利要求51的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
54.一种转基因家蚕，其具有编码重组抗体的DNA，并分泌所述重组抗体。
55.一种转基因家蚕，其具有
编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子、以及
编码重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA，
并且将所述重组抗体分泌至丝腺中。
56.权利要求55的转基因家蚕，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
57.权利要求56的转基因家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
58.权利要求56的转基因家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达蛋白的DNA的启动子是编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
59.一种转基因家蚕，其具有编码重组抗体的DNA，所述DNA可操作地连接于转录调控因子的目标启动子之下游。
60.一种制备重组抗体的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)：
(a)制备转基因家蚕，所述转基因家蚕具有
编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及
编码重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA
并且将所述重组抗体分泌至脂肪体中；和
(b)从所制备的转基因家蚕回收所述重组抗体。
61.一种制备将重组抗体分泌至脂肪体中的转基因家蚕的方法，该方法包括制备家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有：
编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及
编码重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA。
62.一种转基因家蚕，其具有：
编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及
编码重组抗体并直接或间接受所述启动子表达调控的DNA，
并且将重组抗体分泌至脂肪体中。
63.采用权利要求1～8、32～35、44～48或60中任一项的方法制备的抗体。
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