JP2004135528A - カイコを利用したタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法を提供することを課題とする。
【解決手段】フィブロインＬ鎖の遺伝子に異常があり、そのためフィブロインＨ鎖やＬ鎖が殆ど合成されないカイコの突然変異系統Ｎｄ−ｓＤに、フィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターにこの遺伝子のｃＤＮＡを繋ぎ、その下流にＧＦＰ遺伝子を繋いだ融合遺伝子を導入することで、Ｎｄ−ｓＤのトランスジェニックカイコを作出した。突然変異でない正常のカイコに同じ遺伝子を導入し、Ｎｄ−ｓＤのトランスジェニック個体と該遺伝子の発現量を比較した結果、Ｎｄ−ｓＤのトランスジェニック個体では数倍のタンパク質が合成されていることが確認された。さらに、正常個体に大量に存在する内在性のフィブロインＬ鎖タンパク質は、Ｎｄ−ｓＤのトランスジェニック個体では全く存在しないことが明らかとなった。
【選択図】 なし
【解決手段】フィブロインＬ鎖の遺伝子に異常があり、そのためフィブロインＨ鎖やＬ鎖が殆ど合成されないカイコの突然変異系統Ｎｄ−ｓＤに、フィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターにこの遺伝子のｃＤＮＡを繋ぎ、その下流にＧＦＰ遺伝子を繋いだ融合遺伝子を導入することで、Ｎｄ−ｓＤのトランスジェニックカイコを作出した。突然変異でない正常のカイコに同じ遺伝子を導入し、Ｎｄ−ｓＤのトランスジェニック個体と該遺伝子の発現量を比較した結果、Ｎｄ−ｓＤのトランスジェニック個体では数倍のタンパク質が合成されていることが確認された。さらに、正常個体に大量に存在する内在性のフィブロインＬ鎖タンパク質は、Ｎｄ−ｓＤのトランスジェニック個体では全く存在しないことが明らかとなった。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年カイコに外来遺伝子を導入し、発現させることが可能になった。カイコは高度に家畜化された昆虫で、絹糸を作るために絹糸腺と呼ばれる大きな器官を持っている。この器官の中で絹糸タンパク質が生産され、絹糸として繭中に分泌される。
【０００３】
遺伝子操作技術を利用して、組換えタンパク質を生産する方法には、大腸菌、酵母、核多核体病、動植物の培養細胞、トランスジェニック植物や動物など多くの方法が開発され、利用されている。また、トランスポゾンやマーカー遺伝子を利用したトランスジェニックカイコの作出方法が開発されている（非特許文献１〜６）。トランスジェニックカイコを利用して、異種生物のタンパク質を作る利点として、１）比較的簡単に、しかも短期間に作ることができること、２）高等生物であるため、微生物に比べ本来の構造に近い、活性型のタンパク質がえられること、３）容易に大量に増殖でき、大量飼育が可能なことがあげられる。これらに加え、絹糸腺のタンパク質合成能力は非常に高く、この点でも他の生物より優れている。
【０００４】
そのため、これまでに既にトランスジェニックカイコを利用した、ヒト・コラーゲン等の医薬品の生産についての研究が行われ、徐々に実用化に向けての研究が進んでいる（非特許文献７）。
【０００５】
しかしながら、正常なカイコでの絹糸腺では複数のタンパク質が生産されている。カイコの絹糸腺内で異種タンパク質を発現させた場合、これらの内在性のタンパク質が邪魔をして、十分な量を合成できない。また、導入した遺伝子と内在性の遺伝子の競合が起き、このことも発現量を減少させる原因となる。これに加え、内在性のタンパク質の存在は導入した遺伝子由来のタンパク質を精製する場合にも妨げる要因の一つとなり、精製操作をより複雑なものにする（非特許文献８および９）。
【０００６】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に記す。
【非特許文献１】田村俊樹（１９９９）トランスポソンを利用した形質転換カイコの作出方法．第７回昆虫機能研究会講演要旨、ｐ１０−２２．
【非特許文献２】Ｈｏｒｎ， Ｃ．， Ｂ． Ｊａｕｎｉｃｈ ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｗｉｍｍｅｒ， ２０００ Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ． Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｓ Ｅｖｏｌ ２１０： ６２３−６２９．
【非特許文献３】Ｈｏｒｎ， Ｃ．， ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｗｉｍｍｅｒ， ２０００ Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｔ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ． Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｓ Ｅｖｏｌ ２１０： ６３０−６３７．
【非特許文献４】Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ． Ｌ．， Ｍ． Ｄａ Ｒｏｃｈａ， Ａ． Ｂｅｓｓｅ， Ｂ． Ｍａｕｃｈａｍｐ ａｎｄ Ｇ． Ｃｈａｖａｎｃｙ， ２００２ ３ｘＰ３−ＥＧＦＰ ｍａｒｋｅｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ． ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔａｇｅ ｏｎｗａｒｄｓ． Ｉｎｓｅｃｔ ＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌ Ｂｉｏｌ ３２： ２４７−２５３．
【非特許文献５】Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ， Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ． （２０００） Ａ ｐｉｇｇｙＢａｃｅｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４．
【非特許文献６】Ｂｅｒｇｈａｍｍｅｒ， Ａ． Ｊ．， Ｍ． Ｋｌｉｎｇｌｅｒ ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｗｉｍｍｅｒ， １９９９ Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｉｎｓｅｃｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４０２： ３７０−３７１
【非特許文献７】富田正浩・佐藤勉・安達敬泰・宗綱洋人・田村俊樹・神田俊男・吉里勝利（２００１）ヒトコラーゲン遺伝子を組み込んだトランスジェニックカイコの作出．第２４回日本分子生物学会年会講演要旨．
【非特許文献８】水野重樹（１９８７）生化学５９巻１３０８−２０
【非特許文献９】田村俊樹 （１９９３） 遺伝子工学（蚕糸学入門，日本蚕糸学会編）ｐｐ１４８−１５３，大日本蚕糸会（東京）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、カイコにおいて、任意のペプチドを大量に製造する方法を提供することにある。より詳細には、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
カイコは絹糸線という器官でフィブロインＬ鎖、Ｈ鎖、ｐ２５及びセリシンというタンパク質を合成する。このうち、フィブロインＬ鎖とＨ鎖は絹の主成分で、絹糸線の後部で合成され、カイコが繭を作るときに絹糸腺の前部から吐糸される。本発明者らは、正常なカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターにこの遺伝子のｃＤＮＡを繋ぎ、その下流にＧＦＰ遺伝子を繋いだ融合遺伝子を作出し、この遺伝子を既に報告されたトランスジェニックカイコを作るためのベクタープラスミドに挿入した。このベクターを利用して、融合遺伝子をカイコの突然変異系統Ｎｄ−ｓＤに導入し、突然変異系統のトランスジェニックカイコを作出した。
【０００９】
この突然変異系統はＬ鎖の遺伝子に異常（ＤＮＡの欠損）があり、そのためフィブロインＨ鎖やＬ鎖が殆ど合成されない。そのため、変異体の絹糸腺は正常より遥かに小さな未発達の状態でとどまっている。
【００１０】
変異体のトランスジェニックカイコを作出することにより、１）絹糸腺の大きさが大きくなり、正常のサイズに近いものになること、２）合成された融合タンパク質が絹糸腺後部の細胞から内腔に分泌され、中部絹糸腺に蓄積すること、３）この突然変異の繭にも、蛍光タンパク質の観察やウェスタンブロッテイングにより融合タンパク質の存在が観察されたこと、４）突然変異でない正常のカイコに同じ遺伝子を導入し、発現量を突然変異のトランスジェニック個体と比較した結果、突然変異種では数倍のタンパク質が合成されていることが確認されるともに正常個体に大量に存在する内在性のフィブロインＬ鎖タンパク質は全く存在しなかったこと等の特徴が実験的に証明された。
【００１１】
即ち、本発明は、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法に関し、以下の〔１〕〜〔１３〕を提供するものである。
〔１〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、任意のペプチドの製造方法。
（ａ）絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する工程
（ｂ）該ＤＮＡが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する工程
（ｃ）選択されたトランスジェニックカイコから任意のペプチドを回収する工程〔２〕 〔１〕に記載の工程に、さらに、回収された任意のペプチドと医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
〔３〕 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、トランスジェニックカイコの製造方法。
（ａ）絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する工程
（ｂ）該ＤＮＡが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する工程
〔４〕 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコが、絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコが、突然変異系統のカイコである、〔４〕に記載の方法。
〔６〕 絹糸を構成するペプチドがフィブロインである、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕 突然変異系統のカイコがＮｄ−ｓＤである、〔５〕に記載の方法。
〔８〕 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコのトランスジェニックカイコであって、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを有するトランスジェニックカイコ。
〔９〕 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコが、絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコである、〔８〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔１０〕 絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコが、突然変異系統のカイコである、〔９〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔１１〕 絹糸を構成するペプチドがフィブロインである、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔１２〕 突然変異系統のカイコがＮｄ−ｓＤである、〔１０〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔１３〕 〔８〕〜〔１２〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコの繭。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法を提供する。トランスジェニックカイコを利用することにより、比較的簡単に、しかも短期間に任意のペプチドの製造が可能である。また、カイコは、高等生物であるため、微生物に比べ本来の構造に近い、活性型のペプチドの製造が可能である。さらに、本発明の方法によって、従来の方法よりも、カイコにおける任意のペプチドの生産量を向上させること、また、純度を高めることが可能になった。
【００１３】
本発明の任意のペプチドの製造方法においては、まず、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する。
【００１４】
本発明において、「ペプチド」とは、アミノ酸同士がペプチド結合により結合した化合物を指す。従って、鎖長の長いペプチドである「ポリペプチド」や「タンパク質」もまた本発明の「ペプチド」に含まれる。また、本発明における絹糸を構成するペプチドとしては、例えばフィブロインＬ鎖、Ｈ鎖、セリシン、ｐ２５（ｆｉｂｒｏｈｅｘａｍａｒｉｎ）が挙げられるが、好ましくはフィブロインＬ鎖またはＨ鎖であり、より好ましくはフィブロインＬ鎖である。
【００１５】
また、本発明におけるカイコとしては、好ましくは絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域（コード領域、プロモーター領域、非翻訳領域を含む）の変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコ、より好ましくは該変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されている突然変異系統のカイコ、さらに好ましくは該変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されている裸蛹系統のカイコ、さらにより好ましくはＮｄ−ｓＤが挙げられるが、絹糸を構成するペプチドの生産抑制の原因が、人為的か否か、また、変異に依存するか否かに関わらず、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコであれば、本発明のカイコに含まれる。
【００１６】
絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコは人為的に作出することが可能である。例えば、２重鎖のＲＮＡを用いることにより、カイコのある遺伝子の機能が欠損した所謂トランスジェニックカイコの作製も可能である（Ｑｕａｎ， Ｇ． Ｘ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ． ａｎｄ Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．（２００２）：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ ｅｇｇ ３ ｍｕｔａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｂｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｗｈｉｔｅ ｇｅｎｅ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１２１７−２２２）。また、カイコのある遺伝子の機能が欠損した所謂トランスジェニックカイコの作製は、ウイルスをベクターとして用いることによっても行うことができる（Ｙａｍａｏ， Ｍ．， Ｋａｔａｙａｍａ， Ｎ．， Ｎａｋａｚａｗａ， Ｈ．， Ｙａｍａｋａｗａ， Ｍ．， Ｈａｙａｓｈｉ， Ｙ．， Ｈａｒａ， Ｓ．， Ｋａｍｅｉ， Ｋ．， ＆ Ｍｏｒｉ， Ｈ． （１９９９）．Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， １３（５）， ５１１−５１６．）。
【００１７】
このように作出されたカイコにおいて、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているか否かは、絹糸腺の大きさで判断することができる。また、作出されたカイコの繭の重量、その繭の絹糸を構成するペプチドの含有量を計測することなどで判断することができる。
【００１８】
本発明においては、上記カイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する。ここで、「機能的に結合した」とは、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域に転写因子が結合することにより、任意のペプチドをコードするＤＮＡの発現が誘導されるように、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域と任意のペプチドをコードするＤＮＡとが結合していることをいう。従って、任意のペプチドをコードするＤＮＡが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００１９】
本発明において、好ましくは、トランスポソンの逆位末端反復配列（Ｈａｎｄｌｅｒ ＡＭ， ＭｃＣｏｍｂｓ ＳＤ， Ｆｒａｓｅｒ ＭＪ， Ｓａｕｌ ＳＨ．（１９９８） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５（１３）：７５２０−５）の間に、上記ＤＮＡを挿入したベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを有するベクター（ヘルパーベクター）をカイコ卵に導入する。ヘルパーベクターとしては、ｐＨＡ３ＰＩＧ （Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ， Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
また、本発明では、バキュロウイルスベクターを使用することにより、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが結合したＤＮＡを有するトランスジェニックカイコを作出することも可能である（Ｙａｍａｏ， Ｍ．， Ｎ． Ｋａｔａｙａｍａ， Ｈ． Ｎａｋａｚａｗａ， Ｍ． Ｙａｍａｋａｗａ， Ｙ． Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３： ５１１−５１６）。
【００２１】
本発明におけるトランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃが好ましいが、これに限定されるものではなく、マリーナ（ｍａｒｉｎｅｒ）、ミノス（ｍｉｎｏｓ）等を用いることもできる（Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｓｏｎｏｂｅ， Ｈ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ｋｌｉｎａｋｉｓ， Ａ． Ｇ．， Ｓａｖａｋｉｓ， Ｃ．， ＆ Ｔａｍｕｒａ， Ｔ． （２０００） Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９， ２７７−２８１；Ｗａｎｇ Ｗ， Ｓｗｅｖｅｒｓ Ｌ， Ｉａｔｒｏｕ Ｋ．（２０００） Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９（２）：１４５−５５）。
【００２２】
カイコ卵へのＤＮＡの導入は、例えば、カイコの発生初期卵へ、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃをベクターとして注射する方法（Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．，Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ，Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４）に従って行うことができる。
【００２３】
カイコ卵にＤＮＡが導入されたかどうかを調べる方法として、例えば、注射したＤＮＡを卵から再度抽出して測定する方法（Ｎａｇａｒａｊｕ， Ｊ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ｙｕｋｕｈｉｒｏ， Ｋ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， ＆ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ． （１９９６）． Ａｔｔｅｍｐｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ） ｂｙ ｅｇｇ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｔｏｍｏｌ． Ｚｏｏｌ．， ３１， ５８９−５９８）や、注射した遺伝子としてのＤＮＡの卵内での発現を見る方法（Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ｔａｋｉｙａ， Ｓ．， Ｏｋａｎｏ， Ｋ．， ＆ Ｍａｅｋａｗａ， Ｈ． （１９９０）． Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＣＡＴ ｇｅｎｅｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ｓｉｌｋｗｏｒｍ， Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ． Ｊｐｎ． Ｊ． Ｇｅｎｅｔ．， ６５， ４０１−４１０）等を挙げることができる。
【００２４】
以下、カイコ卵へのＤＮＡの導入方法を例示するが、この方法に限定されるものでない。例えば、カイコ卵へＤＮＡ注入用の管を使用して直接卵内へＤＮＡを導入することが可能であるが、好ましい態様としては、前もって物理的または化学的に卵殻に穴を空け、該穴からＤＮＡを導入する。この際、ＤＮＡ注入用の管を挿入角度が該卵の背側の側面に対してほぼ垂直となるように該穴から卵内に挿入することができる。
【００２５】
本発明において、物理的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば針、微小レーザー等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。好適には針を用いた方法によって卵殻に穴を空けることができる。該針は、カイコの卵殻に穴を空けることができるものであれば、その針の材質、強度等は、特に制限されない。なお、本発明における針とは、通常、先端が尖った棒状の針を指すが、この形状に限定されず、卵殻に穴を空けることができるものであれば、全体の形状は特に制限されない。例えば、先端の尖ったピラミッド型の物質、または先端の尖った三角錐の形状の物質もまた、本発明の「針」に含まれる。本発明においては、タングステン針を好適に使用することができる。本発明の針の太さ（直径）は、後述のキャピラリーが通過可能な穴を空けることができる程度の太さであればよく、通常２〜２０μｍ、好ましくは５〜１０μｍである。一方、化学的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば薬品（次亜塩素酸等）等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。
【００２６】
本発明において、穴を空ける位置としては、該穴からＤＮＡ注入用の管を挿入した場合に卵の背側の側面に対する挿入角度を、ほぼ垂直にできる位置ならば特に制限はないが、好ましくは背側の側面またはその反対側であり、より好ましくは背側の側面であり、さらにより好ましくは卵の背側側面のやや降誕よりの中央部である。
【００２７】
本発明において、「ほぼ垂直」とは、７０°〜１２０°を意味し、好ましくは８０°〜９０°を意味する。本発明において、「将来的に生殖細胞になる位置」としては、通常、卵の背側の卵表に近い位置（通常、卵表から０．０１ｍｍ〜０．０５ｍｍの位置）であり、好ましくは、卵の背側中央の卵表に近い位置でやや後極よりの位置である。
【００２８】
本発明のＤＮＡ注入用の管は、その管の材質、強度、内径等は特に制限されないが、ＤＮＡ注入用の管を挿入する前に、物理的または化学的に卵殻に穴を空ける場合は、空けられた穴を通過できる太さ（外径）であることが好ましい。本発明のＤＮＡ注入用の管としては、例えば、ガラスキャピラリー等を挙げることができる。
【００２９】
本発明のＤＮＡの導入方法において、好ましい態様としては、上記のカイコ卵に物理的または化学的に穴を空け、ＤＮＡ注入用の管を挿入角度が該卵の背側の側面に対してほぼ垂直となるように該穴から卵内に挿入し、ＤＮＡを注入する工程を、針とＤＮＡ注入用の管が一体型となったマニュピュレーターを使用して行う。通常、該マニュピュレーターを構成要素の１つとする装置を使用して本発明は好適に実施される。
【００３０】
このような装置としては、解剖顕微鏡、照明装置、可動式のステージ、顕微鏡に金具で固定した粗動マニュピュレーター、このマニュピュレーターに付けたマイクロマニュピュレーター、ＤＮＡを注射するための空気圧を調整するインジェクターから構成されている。インジェクターに用いる圧力は窒素ボンベから供給され、圧力のスイッチはフットスイッチによっていれることができる。注射はガラススライド等の基板上に固定した卵に対して行い、卵の位置は移動式のステージによって決める。また、マイクロマニュピュレーターのガラスキャピラリーは４本のチューブで繋がれた操作部によって操作する。実際の手順は、卵に対するタングステン針の位置を粗動マニュピュレーターで決め、ステージのレバーで水平方向に卵を動かし穴を空ける。続いて、マイクロマニュピュレーターの操作部のレバーを操作して、穴の位置にガラスキャピラリーの先端を誘導し、再びステージのレバーによりキャピラリーを卵に挿入する。この場合、卵の背側の側面に対し垂直にガラスキャピラリーが挿入される必要がある。フットスイッチを入れＤＮＡを注射し、レバーを操作して卵からキャピラリーを抜く。空けた穴を瞬間接着剤等でふさぎ、一定の温度および、一定の湿度のインキュベーターで保護する。本発明に使用される装置としては、好適には、特許第１６５４０５０号に記載の装置または該装置を改良した装置が挙げられる。
【００３１】
また、本発明の態様においては、ＤＮＡの導入に用いるカイコ卵が基板に固定されていることが好ましい。本発明の基板として、例えば、スライドグラス、プラスチック板等を用いることができるが、これらに特に制限されない。本発明の上記態様においては、カイコ卵内の将来的に生殖細胞になる位置に正確にＤＮＡを注射するために、卵の方向を揃えて固定することが望ましい。また、上記態様においては、基板へ固定するカイコ卵の数には、特に制限はない。また、複数個のカイコ卵を用いる場合、カイコ卵を基板へ固定する方向性としては、好ましくは背腹の向きが一定となるような方向である。本発明の上記カイコ卵の基板への固定は、例えば、水性の糊をあらかじめ塗布した市販の台紙（バラ種台紙）の上に産卵させ、台紙に水を加えて卵をはがし、次いで濡れた状態の卵を基板に整列させ、風乾することによって行う。卵をスライドグラス上に卵の方向を揃えて固定することが好ましい。また、卵の基盤への固定は両面テープや接着剤等を用いることによっても可能である。
【００３２】
本発明の任意のペプチドの製造方法においては、次いで、該ＤＮＡが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する。本発明において、トランスジェニックカイコを選択するには、例えば、選択マーカーを用いて行うことができる。本発明における選択マーカーとしては、当業者において一般的に使用されるマーカー、例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質や皮膚が透明になる油蚕、卵色が白くなる白卵などの突然変異に対応する野生型の遺伝子等を挙げることができる。これらマーカーを有しているカイコを、例えば、蛍光、体色、卵色などを指標に選択することができる。
【００３３】
本発明の任意のペプチドの製造方法においては、次いで、選択されたトランスジェニックカイコから任意のペプチドを回収する。回収方法としては、繭を６０％ＬｉＳＣＮで溶かし、２０ｍＭＴｒｉｓ、５Ｍ ｕｒｅａで透析することによって回収する方法（Ｉｎｏｕｅ， Ｓ．， Ｔｓｕｄａ， Ｈ．， Ｔａｎａｋａ， Ｈ．， Ｍａｇｏｓｈｉ， Ｙ ａｎｄ Ｍｉｚｕｎｏ （２００１） Ｓｅｒｉｃｏｌｏｇｉａ ４，
１５７−１６３． ）を使用することができる。
【００３４】
また、本発明は、医薬組成物の製造方法を提供する。該方法においては、回収された任意のペプチドと医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００３５】
また、本発明は、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコのトランスジェニックカイコであって、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを有するトランスジェニックカイコを提供する。このようなカイコを使用することで、任意のペプチドを大量に生産することができる。このようなカイコは、例えば、上述の方法で作出することができる。また、本発明におけるトランスジェニックカイコの状態に特に制限はなく、例えば卵の状態であってもよい。さらに、本発明は、上記トランスジェニックカイコの繭を提供する。このような繭は、任意のペプチドを大量に含有する繭として有用である。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
カイコは絹糸線という器官でフィブロインＬ鎖、Ｈ鎖、ｐ２５及びセリシンというタンパク質を合成する。このうち、フィブロインＬ鎖とＨ鎖は絹の主成分で、絹糸線の後部で合成され、カイコが繭を作るときに絹糸腺の前部から吐糸される。
【００３７】
本実施例ではフィブロインＬ鎖の遺伝子とこの遺伝子が欠失を起こしているため、正常に絹タンパク質を合成できない突然変異系統Ｎｄ−ｓＤ （Ｍｏｒｉ Ｋ， Ｔａｎａｋａ Ｋ，Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｙ， Ｗａｇａ Ｍ， Ｗａｇａ Ｓ， Ｍｉｚｕｎｏ Ｓ．（１９９５） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２５１（２）：２１７−２８）を利用した。この突然変異系統は独立法人農業生物資源研究所で保存・維持され、一般に提供されている。
【００３８】
導入する遺伝子には検出を容易にするため、フィブロインＬ鎖と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の融合遺伝子を用いた。すなわち、正常なカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターにこの遺伝子のｃＤＮＡを繋ぎ、その下流にＧＦＰ遺伝子を繋いだ融合遺伝子を作出した。この融合遺伝子を既に報告されたトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃをベクターとするトランスジェニックカイコを作るためのプラスミドに挿入し、カイコの形質転換のためのベクターとした（図１）。
【００３９】
［実施例２］
このベクタープラスミドとヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧ （Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ， Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４）を発生初期の卵に注射することにより、トランスジェニックカイコを作出した。この場合、融合タンパク質遺伝子を導入するためのホストとしてカイコの突然変異系統Ｎｄ−ｓＤと正常なカイコとを用いた。導入方法は既に報告されているカイコの発生初期卵へ、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃをベクターとして注射する方法（Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ，Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ， Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４）を用いた。
【００４０】
遺伝子が導入された個体のスクリーニングは注射後の次の世代で行い、目的とする遺伝子が導入されているかどうかはサザン及び絹糸腺でのＧＦＰ遺伝子の発現によって確かめた。融合タンパク質の合成、移動は蛍光実体蛍光顕微鏡によって観察するとともに、ノーザン及びウエスタンブロッティングにより調べた。
【００４１】
カイコの発生初期の卵に図１の遺伝子とヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧを正常系統とＮｄ−ｓＤ突然変異系統の卵に注射することにより、次世代において目的とする遺伝子が導入された２系統のトランスジェニックカイコが得られた。
【００４２】
非導入のＮｄ−ｓＤ突然変異系統ではＬ鎖の遺伝子に異常（ＤＮＡの欠損）があり、そのためフィブロインＨ鎖やＬ鎖が殆ど合成されない。かろうじて、セリシンだけが合成されるが、このタンパク質は繊維となる絹の外側を保護するための膠着性タンパク質であるため、本体である絹そのものはほとんど生成されない（Ｍｏｒｉ Ｋ， Ｔａｎａｋａ Ｋ， Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｙ， Ｗａｇａ Ｍ， Ｗａｇａ Ｓ， Ｍｉｚｕｎｏ Ｓ．（１９９５） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２５１（２）：２１７−２８）。そのため、変異体の絹糸腺は正常より遥かに小さな未発達の状態でとどまっている（図２、Ｎｄ−ｓＤ 可視光下）。一方、突然変異系統Ｎｄ−ｓＤに目的とする遺伝子を導入したトランスジェニックカイコでは、絹糸腺の大きさが大きくなり、正常のサイズに近くなるまで回復している（図２、トランスジェニック 可視光下）。融合タンパク質の発現を蛍光実体顕微鏡で観察したところ、もとの突然変異系統の絹糸腺ではフィブロインＬ鎖と融合したＧＦＰは蛍光を発するはずであるが、このような蛍光は全く観察されなかった（図２、Ｎｄ−ｓＤ 蛍光下）。しかし、突然変異系統に融合遺伝子を導入したトランスジェニックカイコでは絹糸腺後部の細胞から中部にかけて強い蛍光が観察された（図２、トランスジェニック 蛍光下）。また、後部絹糸腺の細胞をさらに拡大してみた結果、蛍光を発する物質は絹糸腺細胞ではなく、絹糸腺の内腔に存在することが分かった（図２、トランスジェニック ＰＳＧ拡大図 蛍光下）。このことから、導入された遺伝子の発現によって生じたフィブロインＬ鎖とＧＦＰの融合タンパク質は、絹糸腺の内腔に分泌され、中部絹糸腺に蓄積することが明らかになった。
【００４３】
［実施例３］
次に、この絹糸腺に蓄積したタンパク質が最終的に絹糸として吐糸されるかどうかを知るため、突然変異体とそのトランスジェニックカイコの繭の蛍光を調べた。その結果、突然変異体の繭はセリシンタンパク質のみしか含まれないため、正常なカイコでは見られない非常に層の薄い、脆弱な繭を作った（図３、Ｎｄ−ｓＤ可視光下）。しかし、この突然変異系統にフィブロインＬ鎖とＧＦＰの融合タンパク質遺伝子を導入した個体では正常なカイコが作る繭と殆ど変わらない形状の繭を作った（図３、トランスジェニック 可視光下）。これらの繭を蛍光実体顕微鏡で観察したところ、突然変異が作る繭には蛍光が全く観察されなかった（図３、Ｎｄ−ｓＤ 蛍光下）。しかし、突然変異系統のトランスジェニックカイコが作る繭には、非常に強い蛍光が観察され、大量のフィブロインＬ鎖とＧＦＰの融合タンパク質を含有していることが示唆された（図３、トランスジェニック 蛍光下）。
【００４４】
［実施例４］
次に、突然変異体のトランスジェニックカイコの繭に含まれる融合タンパク質の量と正常のカイコに同じ遺伝子を導入して作成したトランスジェニックカイコの量とを比較した。正常なカイコではフィブロインＬ鎖の遺伝子は機能しているため、フィブロインＬ鎖の抗体を用いたウェスタンブロッティングにおいて、大量のフィブロインＬ鎖が検出される（図４、レーン１）。しかし、フィブロインＬ鎖の遺伝子に異常のある突然変異系統Ｎｄ−ｓＤの繭にはフィブロインＬ鎖タンパク質は存在しない（図４、レーン３）。正常なカイコのトランスジェニック個体の繭にはフィブロインＬ鎖とＬ鎖とＧＦＰが融合したタンパク質が検出された（図４、レーン２）。しかし、突然変異体の繭から抽出したタンパク質では導入した融合タンパク質だけが検出され、Ｌ鎖タンパク質の混入はなかった（図４、レーン４）。抗体にＧＦＰを用いたウェスタンブロッティングでも同じような結果が観察された。この場合、トランスジェニックカイコにのみ融合タンパク質が合成されていることが再度確認された（図４、レーン５〜８）。バンドの強さから見ても、量的な比較では突然変異体のトランスジェニックカイコの方が正常のトランスジェニックカイコの作るタンパク量より多いことが分かった（図４、レーン６と８）。
【００４５】
絹糸腺での絹タンパクの合成系に異常があるため、正常な繭を作らない突然変異系統にフィブロインＬ鎖とＧＦＰの融合タンパク質遺伝子を導入したトランスジェニックカイコを作ることにより、大量の融合タンパク質を絹糸腺で合成し、繭中に分泌させる方法を確立した。この方法は、正常なカイコに同じ融合遺伝子を導入して、組換えタンパク質を合成する方法に比較し、突然変異種では数倍のタンパク質が合成されていることが確認されるともに正常個体に大量に存在する内在性のフィブロインＬ鎖タンパク質は全く存在しなかった。このことは遺伝子組換え手法を利用してカイコの絹糸腺において、外来の有用タンパク質の合成するうえで大きな利点がある。すなわち、１）突然変異Ｎｄ−ｓＤの利用は導入した遺伝子由来のタンパク質の合成能力を向上させる。２）内在性の類似タンパク質の混入を避けることができるため、導入した外来遺伝子による組換えタンパク質の精製が容易になる。
【００４６】
以上のことから、トランスジェニックカイコの絹糸腺を利用して医薬品などの組換えタンパク質を合成する上で、このような本来の遺伝子の発現が抑制されているカイコを利用して、その生産量を向上させ、純度を高める方法は有効な生産手段の一つと考えられ、今後カイコを用いた有用物質の生産系の効率を高める上で重要な方法であると考えられる。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、カイコにおいて任意のペプチドの生産量を向上させること、また、純度を高めることが可能になった。さらに、内在性タンパク質の混入を避けることができるため、任意のペプチドの精製が容易になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】トランスジェニックカイコの作出に用いたプラスミドベクターの構造を示す図である。矢印はトランスポソンｐｉｇｇｙＢａｃの逆位末端反復配列を示し、ｆｉＬｐはフィブロリンＬ鎖遺伝子のプロモーター領域を示し、ｆｉＬｃはフィブロリンＬ鎖遺伝子のｃＤＮＡを示し、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質遺伝子を示し、ｆｉＬポリＡはフィブロリンＬ鎖遺伝子のポリＡ領域を示す。
【図２】突然変異体Ｎｄ−ｓＤとトランスジェニックカイコの絹糸腺を示す写真である。
【図３】突然変異体Ｎｄ−ｓＤとトランスジェニックカイコの繭を示す写真である。
【図４】突然変異系統の繭糸におけるフィブロリンＬ鎖融合遺伝子産物を示す写真である。１、２、５および６はフィブロリンＬ鎖抗体との反応を示し、３、４、７および８はＧＦＰ抗体との反応を示す。また、１および３は正常カイコを示し、２および４は正常カイコのトランスジェニックを示し、５および７は突然変異系統Ｎｄ−ｓＤを示し、６および８は突然変異系統のトランスジェニックカイコを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年カイコに外来遺伝子を導入し、発現させることが可能になった。カイコは高度に家畜化された昆虫で、絹糸を作るために絹糸腺と呼ばれる大きな器官を持っている。この器官の中で絹糸タンパク質が生産され、絹糸として繭中に分泌される。
【０００３】
遺伝子操作技術を利用して、組換えタンパク質を生産する方法には、大腸菌、酵母、核多核体病、動植物の培養細胞、トランスジェニック植物や動物など多くの方法が開発され、利用されている。また、トランスポゾンやマーカー遺伝子を利用したトランスジェニックカイコの作出方法が開発されている（非特許文献１〜６）。トランスジェニックカイコを利用して、異種生物のタンパク質を作る利点として、１）比較的簡単に、しかも短期間に作ることができること、２）高等生物であるため、微生物に比べ本来の構造に近い、活性型のタンパク質がえられること、３）容易に大量に増殖でき、大量飼育が可能なことがあげられる。これらに加え、絹糸腺のタンパク質合成能力は非常に高く、この点でも他の生物より優れている。
【０００４】
そのため、これまでに既にトランスジェニックカイコを利用した、ヒト・コラーゲン等の医薬品の生産についての研究が行われ、徐々に実用化に向けての研究が進んでいる（非特許文献７）。
【０００５】
しかしながら、正常なカイコでの絹糸腺では複数のタンパク質が生産されている。カイコの絹糸腺内で異種タンパク質を発現させた場合、これらの内在性のタンパク質が邪魔をして、十分な量を合成できない。また、導入した遺伝子と内在性の遺伝子の競合が起き、このことも発現量を減少させる原因となる。これに加え、内在性のタンパク質の存在は導入した遺伝子由来のタンパク質を精製する場合にも妨げる要因の一つとなり、精製操作をより複雑なものにする（非特許文献８および９）。
【０００６】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に記す。
【非特許文献１】田村俊樹（１９９９）トランスポソンを利用した形質転換カイコの作出方法．第７回昆虫機能研究会講演要旨、ｐ１０−２２．
【非特許文献２】Ｈｏｒｎ， Ｃ．， Ｂ． Ｊａｕｎｉｃｈ ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｗｉｍｍｅｒ， ２０００ Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ． Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｓ Ｅｖｏｌ ２１０： ６２３−６２９．
【非特許文献３】Ｈｏｒｎ， Ｃ．， ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｗｉｍｍｅｒ， ２０００ Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｔ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ． Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｓ Ｅｖｏｌ ２１０： ６３０−６３７．
【非特許文献４】Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ． Ｌ．， Ｍ． Ｄａ Ｒｏｃｈａ， Ａ． Ｂｅｓｓｅ， Ｂ． Ｍａｕｃｈａｍｐ ａｎｄ Ｇ． Ｃｈａｖａｎｃｙ， ２００２ ３ｘＰ３−ＥＧＦＰ ｍａｒｋｅｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ． ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔａｇｅ ｏｎｗａｒｄｓ． Ｉｎｓｅｃｔ ＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌ Ｂｉｏｌ ３２： ２４７−２５３．
【非特許文献５】Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ， Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ． （２０００） Ａ ｐｉｇｇｙＢａｃｅｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４．
【非特許文献６】Ｂｅｒｇｈａｍｍｅｒ， Ａ． Ｊ．， Ｍ． Ｋｌｉｎｇｌｅｒ ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｗｉｍｍｅｒ， １９９９ Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｉｎｓｅｃｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４０２： ３７０−３７１
【非特許文献７】富田正浩・佐藤勉・安達敬泰・宗綱洋人・田村俊樹・神田俊男・吉里勝利（２００１）ヒトコラーゲン遺伝子を組み込んだトランスジェニックカイコの作出．第２４回日本分子生物学会年会講演要旨．
【非特許文献８】水野重樹（１９８７）生化学５９巻１３０８−２０
【非特許文献９】田村俊樹 （１９９３） 遺伝子工学（蚕糸学入門，日本蚕糸学会編）ｐｐ１４８−１５３，大日本蚕糸会（東京）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、カイコにおいて、任意のペプチドを大量に製造する方法を提供することにある。より詳細には、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
カイコは絹糸線という器官でフィブロインＬ鎖、Ｈ鎖、ｐ２５及びセリシンというタンパク質を合成する。このうち、フィブロインＬ鎖とＨ鎖は絹の主成分で、絹糸線の後部で合成され、カイコが繭を作るときに絹糸腺の前部から吐糸される。本発明者らは、正常なカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターにこの遺伝子のｃＤＮＡを繋ぎ、その下流にＧＦＰ遺伝子を繋いだ融合遺伝子を作出し、この遺伝子を既に報告されたトランスジェニックカイコを作るためのベクタープラスミドに挿入した。このベクターを利用して、融合遺伝子をカイコの突然変異系統Ｎｄ−ｓＤに導入し、突然変異系統のトランスジェニックカイコを作出した。
【０００９】
この突然変異系統はＬ鎖の遺伝子に異常（ＤＮＡの欠損）があり、そのためフィブロインＨ鎖やＬ鎖が殆ど合成されない。そのため、変異体の絹糸腺は正常より遥かに小さな未発達の状態でとどまっている。
【００１０】
変異体のトランスジェニックカイコを作出することにより、１）絹糸腺の大きさが大きくなり、正常のサイズに近いものになること、２）合成された融合タンパク質が絹糸腺後部の細胞から内腔に分泌され、中部絹糸腺に蓄積すること、３）この突然変異の繭にも、蛍光タンパク質の観察やウェスタンブロッテイングにより融合タンパク質の存在が観察されたこと、４）突然変異でない正常のカイコに同じ遺伝子を導入し、発現量を突然変異のトランスジェニック個体と比較した結果、突然変異種では数倍のタンパク質が合成されていることが確認されるともに正常個体に大量に存在する内在性のフィブロインＬ鎖タンパク質は全く存在しなかったこと等の特徴が実験的に証明された。
【００１１】
即ち、本発明は、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法に関し、以下の〔１〕〜〔１３〕を提供するものである。
〔１〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、任意のペプチドの製造方法。
（ａ）絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する工程
（ｂ）該ＤＮＡが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する工程
（ｃ）選択されたトランスジェニックカイコから任意のペプチドを回収する工程〔２〕 〔１〕に記載の工程に、さらに、回収された任意のペプチドと医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
〔３〕 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、トランスジェニックカイコの製造方法。
（ａ）絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する工程
（ｂ）該ＤＮＡが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する工程
〔４〕 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコが、絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコが、突然変異系統のカイコである、〔４〕に記載の方法。
〔６〕 絹糸を構成するペプチドがフィブロインである、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕 突然変異系統のカイコがＮｄ−ｓＤである、〔５〕に記載の方法。
〔８〕 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコのトランスジェニックカイコであって、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを有するトランスジェニックカイコ。
〔９〕 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコが、絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコである、〔８〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔１０〕 絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコが、突然変異系統のカイコである、〔９〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔１１〕 絹糸を構成するペプチドがフィブロインである、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔１２〕 突然変異系統のカイコがＮｄ−ｓＤである、〔１０〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔１３〕 〔８〕〜〔１２〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコの繭。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコを利用した任意のペプチドの製造方法を提供する。トランスジェニックカイコを利用することにより、比較的簡単に、しかも短期間に任意のペプチドの製造が可能である。また、カイコは、高等生物であるため、微生物に比べ本来の構造に近い、活性型のペプチドの製造が可能である。さらに、本発明の方法によって、従来の方法よりも、カイコにおける任意のペプチドの生産量を向上させること、また、純度を高めることが可能になった。
【００１３】
本発明の任意のペプチドの製造方法においては、まず、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する。
【００１４】
本発明において、「ペプチド」とは、アミノ酸同士がペプチド結合により結合した化合物を指す。従って、鎖長の長いペプチドである「ポリペプチド」や「タンパク質」もまた本発明の「ペプチド」に含まれる。また、本発明における絹糸を構成するペプチドとしては、例えばフィブロインＬ鎖、Ｈ鎖、セリシン、ｐ２５（ｆｉｂｒｏｈｅｘａｍａｒｉｎ）が挙げられるが、好ましくはフィブロインＬ鎖またはＨ鎖であり、より好ましくはフィブロインＬ鎖である。
【００１５】
また、本発明におけるカイコとしては、好ましくは絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域（コード領域、プロモーター領域、非翻訳領域を含む）の変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコ、より好ましくは該変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されている突然変異系統のカイコ、さらに好ましくは該変異によって絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されている裸蛹系統のカイコ、さらにより好ましくはＮｄ−ｓＤが挙げられるが、絹糸を構成するペプチドの生産抑制の原因が、人為的か否か、また、変異に依存するか否かに関わらず、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコであれば、本発明のカイコに含まれる。
【００１６】
絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコは人為的に作出することが可能である。例えば、２重鎖のＲＮＡを用いることにより、カイコのある遺伝子の機能が欠損した所謂トランスジェニックカイコの作製も可能である（Ｑｕａｎ， Ｇ． Ｘ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ． ａｎｄ Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．（２００２）：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ ｅｇｇ ３ ｍｕｔａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｂｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｗｈｉｔｅ ｇｅｎｅ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１２１７−２２２）。また、カイコのある遺伝子の機能が欠損した所謂トランスジェニックカイコの作製は、ウイルスをベクターとして用いることによっても行うことができる（Ｙａｍａｏ， Ｍ．， Ｋａｔａｙａｍａ， Ｎ．， Ｎａｋａｚａｗａ， Ｈ．， Ｙａｍａｋａｗａ， Ｍ．， Ｈａｙａｓｈｉ， Ｙ．， Ｈａｒａ， Ｓ．， Ｋａｍｅｉ， Ｋ．， ＆ Ｍｏｒｉ， Ｈ． （１９９９）．Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， １３（５）， ５１１−５１６．）。
【００１７】
このように作出されたカイコにおいて、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているか否かは、絹糸腺の大きさで判断することができる。また、作出されたカイコの繭の重量、その繭の絹糸を構成するペプチドの含有量を計測することなどで判断することができる。
【００１８】
本発明においては、上記カイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する。ここで、「機能的に結合した」とは、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域に転写因子が結合することにより、任意のペプチドをコードするＤＮＡの発現が誘導されるように、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域と任意のペプチドをコードするＤＮＡとが結合していることをいう。従って、任意のペプチドをコードするＤＮＡが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００１９】
本発明において、好ましくは、トランスポソンの逆位末端反復配列（Ｈａｎｄｌｅｒ ＡＭ， ＭｃＣｏｍｂｓ ＳＤ， Ｆｒａｓｅｒ ＭＪ， Ｓａｕｌ ＳＨ．（１９９８） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５（１３）：７５２０−５）の間に、上記ＤＮＡを挿入したベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを有するベクター（ヘルパーベクター）をカイコ卵に導入する。ヘルパーベクターとしては、ｐＨＡ３ＰＩＧ （Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ， Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
また、本発明では、バキュロウイルスベクターを使用することにより、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが結合したＤＮＡを有するトランスジェニックカイコを作出することも可能である（Ｙａｍａｏ， Ｍ．， Ｎ． Ｋａｔａｙａｍａ， Ｈ． Ｎａｋａｚａｗａ， Ｍ． Ｙａｍａｋａｗａ， Ｙ． Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３： ５１１−５１６）。
【００２１】
本発明におけるトランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃが好ましいが、これに限定されるものではなく、マリーナ（ｍａｒｉｎｅｒ）、ミノス（ｍｉｎｏｓ）等を用いることもできる（Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｓｏｎｏｂｅ， Ｈ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ｋｌｉｎａｋｉｓ， Ａ． Ｇ．， Ｓａｖａｋｉｓ， Ｃ．， ＆ Ｔａｍｕｒａ， Ｔ． （２０００） Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９， ２７７−２８１；Ｗａｎｇ Ｗ， Ｓｗｅｖｅｒｓ Ｌ， Ｉａｔｒｏｕ Ｋ．（２０００） Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９（２）：１４５−５５）。
【００２２】
カイコ卵へのＤＮＡの導入は、例えば、カイコの発生初期卵へ、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃをベクターとして注射する方法（Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．，Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ，Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４）に従って行うことができる。
【００２３】
カイコ卵にＤＮＡが導入されたかどうかを調べる方法として、例えば、注射したＤＮＡを卵から再度抽出して測定する方法（Ｎａｇａｒａｊｕ， Ｊ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ｙｕｋｕｈｉｒｏ， Ｋ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， ＆ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ． （１９９６）． Ａｔｔｅｍｐｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ） ｂｙ ｅｇｇ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｔｏｍｏｌ． Ｚｏｏｌ．， ３１， ５８９−５９８）や、注射した遺伝子としてのＤＮＡの卵内での発現を見る方法（Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ｔａｋｉｙａ， Ｓ．， Ｏｋａｎｏ， Ｋ．， ＆ Ｍａｅｋａｗａ， Ｈ． （１９９０）． Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＣＡＴ ｇｅｎｅｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ｓｉｌｋｗｏｒｍ， Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ． Ｊｐｎ． Ｊ． Ｇｅｎｅｔ．， ６５， ４０１−４１０）等を挙げることができる。
【００２４】
以下、カイコ卵へのＤＮＡの導入方法を例示するが、この方法に限定されるものでない。例えば、カイコ卵へＤＮＡ注入用の管を使用して直接卵内へＤＮＡを導入することが可能であるが、好ましい態様としては、前もって物理的または化学的に卵殻に穴を空け、該穴からＤＮＡを導入する。この際、ＤＮＡ注入用の管を挿入角度が該卵の背側の側面に対してほぼ垂直となるように該穴から卵内に挿入することができる。
【００２５】
本発明において、物理的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば針、微小レーザー等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。好適には針を用いた方法によって卵殻に穴を空けることができる。該針は、カイコの卵殻に穴を空けることができるものであれば、その針の材質、強度等は、特に制限されない。なお、本発明における針とは、通常、先端が尖った棒状の針を指すが、この形状に限定されず、卵殻に穴を空けることができるものであれば、全体の形状は特に制限されない。例えば、先端の尖ったピラミッド型の物質、または先端の尖った三角錐の形状の物質もまた、本発明の「針」に含まれる。本発明においては、タングステン針を好適に使用することができる。本発明の針の太さ（直径）は、後述のキャピラリーが通過可能な穴を空けることができる程度の太さであればよく、通常２〜２０μｍ、好ましくは５〜１０μｍである。一方、化学的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば薬品（次亜塩素酸等）等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。
【００２６】
本発明において、穴を空ける位置としては、該穴からＤＮＡ注入用の管を挿入した場合に卵の背側の側面に対する挿入角度を、ほぼ垂直にできる位置ならば特に制限はないが、好ましくは背側の側面またはその反対側であり、より好ましくは背側の側面であり、さらにより好ましくは卵の背側側面のやや降誕よりの中央部である。
【００２７】
本発明において、「ほぼ垂直」とは、７０°〜１２０°を意味し、好ましくは８０°〜９０°を意味する。本発明において、「将来的に生殖細胞になる位置」としては、通常、卵の背側の卵表に近い位置（通常、卵表から０．０１ｍｍ〜０．０５ｍｍの位置）であり、好ましくは、卵の背側中央の卵表に近い位置でやや後極よりの位置である。
【００２８】
本発明のＤＮＡ注入用の管は、その管の材質、強度、内径等は特に制限されないが、ＤＮＡ注入用の管を挿入する前に、物理的または化学的に卵殻に穴を空ける場合は、空けられた穴を通過できる太さ（外径）であることが好ましい。本発明のＤＮＡ注入用の管としては、例えば、ガラスキャピラリー等を挙げることができる。
【００２９】
本発明のＤＮＡの導入方法において、好ましい態様としては、上記のカイコ卵に物理的または化学的に穴を空け、ＤＮＡ注入用の管を挿入角度が該卵の背側の側面に対してほぼ垂直となるように該穴から卵内に挿入し、ＤＮＡを注入する工程を、針とＤＮＡ注入用の管が一体型となったマニュピュレーターを使用して行う。通常、該マニュピュレーターを構成要素の１つとする装置を使用して本発明は好適に実施される。
【００３０】
このような装置としては、解剖顕微鏡、照明装置、可動式のステージ、顕微鏡に金具で固定した粗動マニュピュレーター、このマニュピュレーターに付けたマイクロマニュピュレーター、ＤＮＡを注射するための空気圧を調整するインジェクターから構成されている。インジェクターに用いる圧力は窒素ボンベから供給され、圧力のスイッチはフットスイッチによっていれることができる。注射はガラススライド等の基板上に固定した卵に対して行い、卵の位置は移動式のステージによって決める。また、マイクロマニュピュレーターのガラスキャピラリーは４本のチューブで繋がれた操作部によって操作する。実際の手順は、卵に対するタングステン針の位置を粗動マニュピュレーターで決め、ステージのレバーで水平方向に卵を動かし穴を空ける。続いて、マイクロマニュピュレーターの操作部のレバーを操作して、穴の位置にガラスキャピラリーの先端を誘導し、再びステージのレバーによりキャピラリーを卵に挿入する。この場合、卵の背側の側面に対し垂直にガラスキャピラリーが挿入される必要がある。フットスイッチを入れＤＮＡを注射し、レバーを操作して卵からキャピラリーを抜く。空けた穴を瞬間接着剤等でふさぎ、一定の温度および、一定の湿度のインキュベーターで保護する。本発明に使用される装置としては、好適には、特許第１６５４０５０号に記載の装置または該装置を改良した装置が挙げられる。
【００３１】
また、本発明の態様においては、ＤＮＡの導入に用いるカイコ卵が基板に固定されていることが好ましい。本発明の基板として、例えば、スライドグラス、プラスチック板等を用いることができるが、これらに特に制限されない。本発明の上記態様においては、カイコ卵内の将来的に生殖細胞になる位置に正確にＤＮＡを注射するために、卵の方向を揃えて固定することが望ましい。また、上記態様においては、基板へ固定するカイコ卵の数には、特に制限はない。また、複数個のカイコ卵を用いる場合、カイコ卵を基板へ固定する方向性としては、好ましくは背腹の向きが一定となるような方向である。本発明の上記カイコ卵の基板への固定は、例えば、水性の糊をあらかじめ塗布した市販の台紙（バラ種台紙）の上に産卵させ、台紙に水を加えて卵をはがし、次いで濡れた状態の卵を基板に整列させ、風乾することによって行う。卵をスライドグラス上に卵の方向を揃えて固定することが好ましい。また、卵の基盤への固定は両面テープや接着剤等を用いることによっても可能である。
【００３２】
本発明の任意のペプチドの製造方法においては、次いで、該ＤＮＡが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する。本発明において、トランスジェニックカイコを選択するには、例えば、選択マーカーを用いて行うことができる。本発明における選択マーカーとしては、当業者において一般的に使用されるマーカー、例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質や皮膚が透明になる油蚕、卵色が白くなる白卵などの突然変異に対応する野生型の遺伝子等を挙げることができる。これらマーカーを有しているカイコを、例えば、蛍光、体色、卵色などを指標に選択することができる。
【００３３】
本発明の任意のペプチドの製造方法においては、次いで、選択されたトランスジェニックカイコから任意のペプチドを回収する。回収方法としては、繭を６０％ＬｉＳＣＮで溶かし、２０ｍＭＴｒｉｓ、５Ｍ ｕｒｅａで透析することによって回収する方法（Ｉｎｏｕｅ， Ｓ．， Ｔｓｕｄａ， Ｈ．， Ｔａｎａｋａ， Ｈ．， Ｍａｇｏｓｈｉ， Ｙ ａｎｄ Ｍｉｚｕｎｏ （２００１） Ｓｅｒｉｃｏｌｏｇｉａ ４，
１５７−１６３． ）を使用することができる。
【００３４】
また、本発明は、医薬組成物の製造方法を提供する。該方法においては、回収された任意のペプチドと医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００３５】
また、本発明は、絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコのトランスジェニックカイコであって、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを有するトランスジェニックカイコを提供する。このようなカイコを使用することで、任意のペプチドを大量に生産することができる。このようなカイコは、例えば、上述の方法で作出することができる。また、本発明におけるトランスジェニックカイコの状態に特に制限はなく、例えば卵の状態であってもよい。さらに、本発明は、上記トランスジェニックカイコの繭を提供する。このような繭は、任意のペプチドを大量に含有する繭として有用である。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
カイコは絹糸線という器官でフィブロインＬ鎖、Ｈ鎖、ｐ２５及びセリシンというタンパク質を合成する。このうち、フィブロインＬ鎖とＨ鎖は絹の主成分で、絹糸線の後部で合成され、カイコが繭を作るときに絹糸腺の前部から吐糸される。
【００３７】
本実施例ではフィブロインＬ鎖の遺伝子とこの遺伝子が欠失を起こしているため、正常に絹タンパク質を合成できない突然変異系統Ｎｄ−ｓＤ （Ｍｏｒｉ Ｋ， Ｔａｎａｋａ Ｋ，Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｙ， Ｗａｇａ Ｍ， Ｗａｇａ Ｓ， Ｍｉｚｕｎｏ Ｓ．（１９９５） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２５１（２）：２１７−２８）を利用した。この突然変異系統は独立法人農業生物資源研究所で保存・維持され、一般に提供されている。
【００３８】
導入する遺伝子には検出を容易にするため、フィブロインＬ鎖と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の融合遺伝子を用いた。すなわち、正常なカイコのフィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーターにこの遺伝子のｃＤＮＡを繋ぎ、その下流にＧＦＰ遺伝子を繋いだ融合遺伝子を作出した。この融合遺伝子を既に報告されたトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃをベクターとするトランスジェニックカイコを作るためのプラスミドに挿入し、カイコの形質転換のためのベクターとした（図１）。
【００３９】
［実施例２］
このベクタープラスミドとヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧ （Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ， Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ， Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４）を発生初期の卵に注射することにより、トランスジェニックカイコを作出した。この場合、融合タンパク質遺伝子を導入するためのホストとしてカイコの突然変異系統Ｎｄ−ｓＤと正常なカイコとを用いた。導入方法は既に報告されているカイコの発生初期卵へ、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃをベクターとして注射する方法（Ｔａｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔｈｉｂｅｒｔ，Ｃ．， Ｒｏｙｅｒ ，Ｃ．， Ｋａｎｄａ， Ｔ．， Ａｂｒａｈａｍ， Ｅ．， Ｋａｍｂａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｊ．−Ｌ．， Ｍａｕｃｈａｍｐ， Ｂ．， Ｃｈａｖａｎｃｙ， Ｇ．， Ｓｈｉｒｋ， Ｐ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｍ．， Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ， Ｊ．−Ｃ． ａｎｄ Ｃｏｕｂｌｅ， Ｐ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８， ８１−８４）を用いた。
【００４０】
遺伝子が導入された個体のスクリーニングは注射後の次の世代で行い、目的とする遺伝子が導入されているかどうかはサザン及び絹糸腺でのＧＦＰ遺伝子の発現によって確かめた。融合タンパク質の合成、移動は蛍光実体蛍光顕微鏡によって観察するとともに、ノーザン及びウエスタンブロッティングにより調べた。
【００４１】
カイコの発生初期の卵に図１の遺伝子とヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧを正常系統とＮｄ−ｓＤ突然変異系統の卵に注射することにより、次世代において目的とする遺伝子が導入された２系統のトランスジェニックカイコが得られた。
【００４２】
非導入のＮｄ−ｓＤ突然変異系統ではＬ鎖の遺伝子に異常（ＤＮＡの欠損）があり、そのためフィブロインＨ鎖やＬ鎖が殆ど合成されない。かろうじて、セリシンだけが合成されるが、このタンパク質は繊維となる絹の外側を保護するための膠着性タンパク質であるため、本体である絹そのものはほとんど生成されない（Ｍｏｒｉ Ｋ， Ｔａｎａｋａ Ｋ， Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｙ， Ｗａｇａ Ｍ， Ｗａｇａ Ｓ， Ｍｉｚｕｎｏ Ｓ．（１９９５） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２５１（２）：２１７−２８）。そのため、変異体の絹糸腺は正常より遥かに小さな未発達の状態でとどまっている（図２、Ｎｄ−ｓＤ 可視光下）。一方、突然変異系統Ｎｄ−ｓＤに目的とする遺伝子を導入したトランスジェニックカイコでは、絹糸腺の大きさが大きくなり、正常のサイズに近くなるまで回復している（図２、トランスジェニック 可視光下）。融合タンパク質の発現を蛍光実体顕微鏡で観察したところ、もとの突然変異系統の絹糸腺ではフィブロインＬ鎖と融合したＧＦＰは蛍光を発するはずであるが、このような蛍光は全く観察されなかった（図２、Ｎｄ−ｓＤ 蛍光下）。しかし、突然変異系統に融合遺伝子を導入したトランスジェニックカイコでは絹糸腺後部の細胞から中部にかけて強い蛍光が観察された（図２、トランスジェニック 蛍光下）。また、後部絹糸腺の細胞をさらに拡大してみた結果、蛍光を発する物質は絹糸腺細胞ではなく、絹糸腺の内腔に存在することが分かった（図２、トランスジェニック ＰＳＧ拡大図 蛍光下）。このことから、導入された遺伝子の発現によって生じたフィブロインＬ鎖とＧＦＰの融合タンパク質は、絹糸腺の内腔に分泌され、中部絹糸腺に蓄積することが明らかになった。
【００４３】
［実施例３］
次に、この絹糸腺に蓄積したタンパク質が最終的に絹糸として吐糸されるかどうかを知るため、突然変異体とそのトランスジェニックカイコの繭の蛍光を調べた。その結果、突然変異体の繭はセリシンタンパク質のみしか含まれないため、正常なカイコでは見られない非常に層の薄い、脆弱な繭を作った（図３、Ｎｄ−ｓＤ可視光下）。しかし、この突然変異系統にフィブロインＬ鎖とＧＦＰの融合タンパク質遺伝子を導入した個体では正常なカイコが作る繭と殆ど変わらない形状の繭を作った（図３、トランスジェニック 可視光下）。これらの繭を蛍光実体顕微鏡で観察したところ、突然変異が作る繭には蛍光が全く観察されなかった（図３、Ｎｄ−ｓＤ 蛍光下）。しかし、突然変異系統のトランスジェニックカイコが作る繭には、非常に強い蛍光が観察され、大量のフィブロインＬ鎖とＧＦＰの融合タンパク質を含有していることが示唆された（図３、トランスジェニック 蛍光下）。
【００４４】
［実施例４］
次に、突然変異体のトランスジェニックカイコの繭に含まれる融合タンパク質の量と正常のカイコに同じ遺伝子を導入して作成したトランスジェニックカイコの量とを比較した。正常なカイコではフィブロインＬ鎖の遺伝子は機能しているため、フィブロインＬ鎖の抗体を用いたウェスタンブロッティングにおいて、大量のフィブロインＬ鎖が検出される（図４、レーン１）。しかし、フィブロインＬ鎖の遺伝子に異常のある突然変異系統Ｎｄ−ｓＤの繭にはフィブロインＬ鎖タンパク質は存在しない（図４、レーン３）。正常なカイコのトランスジェニック個体の繭にはフィブロインＬ鎖とＬ鎖とＧＦＰが融合したタンパク質が検出された（図４、レーン２）。しかし、突然変異体の繭から抽出したタンパク質では導入した融合タンパク質だけが検出され、Ｌ鎖タンパク質の混入はなかった（図４、レーン４）。抗体にＧＦＰを用いたウェスタンブロッティングでも同じような結果が観察された。この場合、トランスジェニックカイコにのみ融合タンパク質が合成されていることが再度確認された（図４、レーン５〜８）。バンドの強さから見ても、量的な比較では突然変異体のトランスジェニックカイコの方が正常のトランスジェニックカイコの作るタンパク量より多いことが分かった（図４、レーン６と８）。
【００４５】
絹糸腺での絹タンパクの合成系に異常があるため、正常な繭を作らない突然変異系統にフィブロインＬ鎖とＧＦＰの融合タンパク質遺伝子を導入したトランスジェニックカイコを作ることにより、大量の融合タンパク質を絹糸腺で合成し、繭中に分泌させる方法を確立した。この方法は、正常なカイコに同じ融合遺伝子を導入して、組換えタンパク質を合成する方法に比較し、突然変異種では数倍のタンパク質が合成されていることが確認されるともに正常個体に大量に存在する内在性のフィブロインＬ鎖タンパク質は全く存在しなかった。このことは遺伝子組換え手法を利用してカイコの絹糸腺において、外来の有用タンパク質の合成するうえで大きな利点がある。すなわち、１）突然変異Ｎｄ−ｓＤの利用は導入した遺伝子由来のタンパク質の合成能力を向上させる。２）内在性の類似タンパク質の混入を避けることができるため、導入した外来遺伝子による組換えタンパク質の精製が容易になる。
【００４６】
以上のことから、トランスジェニックカイコの絹糸腺を利用して医薬品などの組換えタンパク質を合成する上で、このような本来の遺伝子の発現が抑制されているカイコを利用して、その生産量を向上させ、純度を高める方法は有効な生産手段の一つと考えられ、今後カイコを用いた有用物質の生産系の効率を高める上で重要な方法であると考えられる。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、カイコにおいて任意のペプチドの生産量を向上させること、また、純度を高めることが可能になった。さらに、内在性タンパク質の混入を避けることができるため、任意のペプチドの精製が容易になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】トランスジェニックカイコの作出に用いたプラスミドベクターの構造を示す図である。矢印はトランスポソンｐｉｇｇｙＢａｃの逆位末端反復配列を示し、ｆｉＬｐはフィブロリンＬ鎖遺伝子のプロモーター領域を示し、ｆｉＬｃはフィブロリンＬ鎖遺伝子のｃＤＮＡを示し、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質遺伝子を示し、ｆｉＬポリＡはフィブロリンＬ鎖遺伝子のポリＡ領域を示す。
【図２】突然変異体Ｎｄ−ｓＤとトランスジェニックカイコの絹糸腺を示す写真である。
【図３】突然変異体Ｎｄ−ｓＤとトランスジェニックカイコの繭を示す写真である。
【図４】突然変異系統の繭糸におけるフィブロリンＬ鎖融合遺伝子産物を示す写真である。１、２、５および６はフィブロリンＬ鎖抗体との反応を示し、３、４、７および８はＧＦＰ抗体との反応を示す。また、１および３は正常カイコを示し、２および４は正常カイコのトランスジェニックを示し、５および７は突然変異系統Ｎｄ−ｓＤを示し、６および８は突然変異系統のトランスジェニックカイコを示す。
Claims (13)
- 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、任意のペプチドの製造方法。
（ａ）絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する工程
（ｂ）該ＤＮＡが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する工程
（ｃ）選択されたトランスジェニックカイコから任意のペプチドを回収する工程 - 請求項１に記載の工程に、さらに、回収された任意のペプチドと医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
- 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、トランスジェニックカイコの製造方法。
（ａ）絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコの卵に、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを導入する工程
（ｂ）該ＤＮＡが導入された卵から生じたカイコの中から、トランスジェニックカイコを選択する工程 - 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコが、絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコが、突然変異系統のカイコである、請求項４に記載の方法。
- 絹糸を構成するペプチドがフィブロインである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 突然変異系統のカイコがＮｄ−ｓＤである、請求項５に記載の方法。
- 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコのトランスジェニックカイコであって、絹糸を構成するペプチドをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流に任意のペプチドをコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを有するトランスジェニックカイコ。
- 絹糸を構成するペプチドの生産が抑制されているカイコが、絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコである、請求項８に記載のトランスジェニックカイコ。
- 絹糸を構成するペプチドをコードする遺伝子領域の変異によって該ペプチドの生産が抑制されているカイコが、突然変異系統のカイコである、請求項９に記載のトランスジェニックカイコ。
- 絹糸を構成するペプチドがフィブロインである、請求項８〜１０のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
- 突然変異系統のカイコがＮｄ−ｓＤである、請求項１０に記載のトランスジェニックカイコ。
- 請求項８〜１２のいずれかに記載のトランスジェニックカイコの繭。
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|---|---|---|---|---|
| WO2008032748A1 (fr) * | 2006-09-12 | 2008-03-20 | Hiroshima Industrial Promotion Organization | Ver à soie transgénique capable de produire une molécule anticorps fonctionnelle |
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