CN100396699C - 导入ganp基因的转基因哺乳动物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供作为诊断以及治疗各种疾病药剂而有效的高亲和性抗体、为产生该抗体的转基因哺乳动物、使用该高亲和性抗体或高亲和性抗体产生细胞的药剂。本发明还可以提供导入GANP基因的转基因哺乳动物、其子代或它们的一部分，以及采用这些转基因哺乳动物、其子代或其一部分产生高亲和性抗体的方法。

Description

导入GANP基因的转基因哺乳动物及其应用
技术领域
本发明涉及导入GANP基因的转基因哺乳动物及其应用。本发明更详细地涉及可以高表达GANP，并且产生高亲和性抗体的转基因哺乳动物，利用该转基因哺乳动物产生高亲和性抗体的方法以及所得高亲和性抗体的利用。
背景技术
免疫系统的功能可以分为基于以T细胞作用为主的细胞性免疫反应功能和基于以抗体作用为主的体液免疫功能。实际上一般是通过这两种功能的协调来进行免疫应答。抗体是作为在骨髓中产生的B细胞细胞表面受体而呈现出来的。据说在生物体中形成的最初抗体识别的抗原多样性可达到109～1011个序列(order)，这样的抗体(抗原受体)可以识别能够在环境中存在的所有抗原确定簇。但是该多种抗原受体相对于抗原的结合能力一般都低，多数情况下产生低亲和性抗体，这样就不能形成足够的免疫应答。
淋巴细胞，特别是B细胞/免疫球蛋白(抗体)，根据其免疫反应，具有各种用途，例如作为为检测病原体等抗原的试剂盒、诊断药剂和治疗药剂使用。作为这样的抗原检测药剂，或者是各种疾病的治疗药剂中的抗体，如果使用对抗原反应性高的抗体，则对于抗原的敏感度优异，并且作为治疗药剂时，相同施用量的治疗性能优异。但是迄今为止尚不了解提高抗体亲合性的方法。
不过对于生物体，在有病原体或异物浸入时，则可以把它们作为抗原进行识别，在末稍淋巴组织中，针对与抗原直接结合的抗体V区域的基因诱导高频率体细胞超突变。一般认为在该变化中，把T细胞刺激作为必要条件，在发生中心(Germinal center)区域，接受来自活化T细胞的刺激。近年来本发明者在该区域的活化B细胞上发现了有选择性提高表达的分子GANP(国际公开WO00/50611号公报)。该分子与具有DNA解旋酶活性的、被称之为MCM(微染色体维持蛋白)的分子直接结合，还具有RNA引物酶活性，由此可见与DNA的复制相关。但是，还没有弄清楚免疫体系中的GANP的功能。
发明公开
本发明的目的在于提供作为各种疾病的诊断和治疗药剂有效的高亲合性抗体，产生该抗体的转基因哺乳动物，使用该高亲和性抗体或高亲和性抗体产生细胞的药剂。
为了解决上述课题，本发明者进行了锐意研究，结果发现如果制备导入GANP基因的转基因动物，用抗原进行免疫，该转基因动物就能够产生高亲和性抗体，从而完成了本发明。
也就是本发明的内容如下：
(1)导入GANP基因的转基因哺乳动物或其子代。
导入的GANP基因可以由B细胞表达。同时本发明的转基因哺乳动物或其子代，可以由转染了GANP基因的ES细胞生成，作为哺乳动物，可以列举如小鼠。
(2)前述转基因哺乳动物或其子代的一部分。
(3)高亲和性抗体的制备方法，其特征是对前述转基因哺乳动物或其子代施用抗原，从所得的动物或其子代采集抗体。
(4)通过前述(3)中所述方法得到的高亲和性抗体或其片段。
本发明的抗体是亲和性可表示为1×10-7(M)或以下的抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。
(5)含有前述抗体或其片段V区域的人源化抗体或人抗体或其片段。
(6)医药组合物，其中含有从由前述抗体或其片段，以及前述人源抗体或人抗体或它们的片段构成的组中选择的至少1种抗体或片段。
(7)产生高亲合性抗体的细胞，它是从施用了抗原的权利要求1～4任意一项中所述的转基因哺乳动物或其子代中采集的。
附图的简单说明
图1表示使用抗GANP单克隆抗体和ALP结合抗大鼠Ig抗体进行免疫组织化学分析的结果，标尺为100μm。
图2表示在雌NZB小鼠的膝窝淋巴结中GANPhi细胞的出现速度。标尺为100μm。
图3表示在雌NZB小鼠脾脏中GANPhi细胞的出现速度。标尺为100μm。
图4表示用抗GANP单克隆抗体对来源于多系统小鼠的脾脏切片进行染色的结果。RP；红脾髓，F；滤泡。标尺为100μm。
图5表示对脾脏红脾髓中的GANPhi细胞进行鉴定的结果。
图6表示对GANPhi细胞中的浆细胞标记物进行鉴定的结果。标尺为100μm。
图7表示在通过TD-Ag免疫得到的C57BL/6小鼠脾脏红脾髓区域中GANPhi细胞的表达。标尺为100μm。
图8的A～C表示Daudi细胞中使小鼠GANP稳定表达的转染子的体细胞超突变。
图9的A～C表示制备使GANP在B细胞上过表达的转基因小鼠的概况。
图10表示对GANP过表达的转基因(Tg)小鼠或野生型小鼠中体细胞超突变进行分析的结果。
图11的A～E表示制备B细胞特异的GANP缺失小鼠(B-GANP-/-)的概况。
图12表示对使用B细胞特异的GANP缺失小鼠(B-GANP-/-)的细胞进行表面染色的结果(流式细胞测量法)。
图13表示对B细胞增殖进行测定的结果。几乎没有差别，但是只有因抗CD40抗体刺激而引起的增殖大约减少至1/2。
图14表示没有进行免疫的Cre-flox/+小鼠以及B-GANP-/-小鼠血清中的抗体价数。各种同种型抗体价数没有差别。
图15表示对B-GANP-/-小鼠中产生的抗体进行测定的结果。
图16表示用花生凝集素对GC进行染色的结果。
图17表示对B-GANP-/-小鼠中产生的抗原特异性抗体进行测定的结果。
图18表示对用100μg的NP-GC进行免疫，在免疫后第14天以及第36天，通过差示ELISA对亲合性的成熟度进行测定的结果。
图19表示对GC-B细胞进行流式细胞测量的结果。
图20的A～F表示用PCR对Cre-flox/+的VH186.2进行扩增，并进行序列分析的结果(从A到F按顺序连续进行)。
图20的G～L表示用PCR对Cre-flox/+的VH186.2进行扩增，并进行序列分析的结果(从G到L按顺序连续进行)。
图21表示在Cre-flox/+以及B-GANP-/-小鼠中的IgG1的变异频率。
图22表示使VH186.2第33位的W变异成L时的变异频率。
图23表示对活化诱导细胞死亡(AICD)进行测定的结果以及对细胞凋亡进行抑制的结果。
图24表示相对于抗CD40以及抗CD95刺激的细胞凋亡感受性测定结果。
图25表示通过TUNEL测定对细胞凋亡细胞进行检测的结果。
图26表示通过TUNEL测定对细胞凋亡细胞进行检测的结果。
图27表示与抑制细胞凋亡相关的Bcl-2家族的RNA表达水平。
图28表示使用GANP转基因小鼠产生高亲和性抗体的结果。
图29表示使用来源于GANP转基因小鼠的杂交瘤克隆产生高亲合性抗体的结果。
图30表示通过使用来源于GANP转基因小鼠的杂交瘤克隆培养上清通过Biacore测定的结合解离曲线。
图31表示通过使用来源于GANP转基因小鼠的杂交瘤克隆培养上清通过Biacore测定的结合解离曲线。
图32表示GANP-GST融合蛋白质结构的概况。
图33表示为确定与MCM直接结合的GANP区域，进行引入测定(Pull-down assay)的结果。左边表示大小的标准位置。
图34表示使用经体外翻译的MCM进行引入测定的结果。
图35示出用免疫沉淀对GANP各构建体与MCM结合进行分析情况。
图36A～B示出用免疫沉淀对GANP各构建体与MCM结合进行分析的情况。
图37表示GANP构建体结构的概况以及构建体在细胞内的分布。
图38表示GANP构建体在细胞内的分部。
图39表示MCM3在核中的定位。
图40表示通过GANP表达诱导的MCM3的细胞质定位
图41表示在核中定位的对照蛋白质。
图42表示GANP构建体在MCM3变异体定位中的效果。
图43表示通过异核体测定检测的MCM3在核-细胞质之间的穿梭情况。
图44表示GANP在细胞周期间的定位。
实施本发明的最佳方案
以下详细说明本发明的情况。
本发明是根据把GANP基因导入到非人哺乳动物中，制备转基因动物，如果用抗原对这样的转基因动物进行免疫，就可以得到高亲合性抗体的观点而完成的。
1.GANP
GANP被称作发生中心相关核蛋白质(Germinal center-associatednuclear protein)，是与酵母Sac3蛋白质同源的210kDa的核蛋白质(WO00/50611号公报)。SAC3是针对肌动蛋白形成的抑制物质。同时GANP在被滤胞树状细胞包围的发生中心(germinal center，GC)B细胞中被选择性地进行上调，具有依赖于磷酸化作用的RNA-引物酶活性，并参与B细胞细胞周期调节(Kuwahara，K.等，.(2000)Blood95，2321-2328)。
本发明中，将小鼠的GANP蛋白质的氨基酸序列显示于序列编号2中；人的GANP蛋白质的氨基酸序列显示于序列编号4中。将小鼠GANP蛋白质编码基因(称为GANP基因)的碱基序列显示于序列编号1中；人GANP蛋白质编码基因显示于序列编号3中。关于上述氨基酸序列和碱基序列，在国际公开WO00/50611号公报中也有介绍。
GANP蛋白质可以是变异体，也可以是序列编号2或4中所介绍氨基酸序列中的1个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有RN A引物酶活性的蛋白质。例如可以使用由序列编号2或4中所示氨基酸序列中，1个或多数个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个)氨基酸缺失、1个或多数个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个)氨基酸被其它氨基酸取代，以及添加1个或多数个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个)其它氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有与上述GANP蛋白质相同RNA引物酶活性的GANP变异型蛋白质。
所谓“RNA引物酶活性”，是指合成短引物RNA的酶活性，所述的短引物RNA在合成与沿5’→3’方向进行的链伸长相反的链(后随链)的过程中作为链伸长的起点。通常使用与DNA聚合酶α相结合的、被称为α引物酶的分子。在发生中心B细胞中也可以诱导作为第二引物酶的GANP引物酶。
GANP蛋白质，除了上述序列编号2或4中所示的氨基酸序列或其变异型氨基酸序列之外，还包括具有N末端的部分序列(例如序列编号2中所示氨基酸序列的1～600位、优选139～566位)或它们的变异型氨基酸序列的蛋白质。
本发明中导入到动物中的GAPN基因，可以列举如对上述GANP蛋白质、N末端的部分序列或变异型蛋白质进行编码的基因。作为这样的基因，可以使用如具有序列编号1或3中所示碱基序列的基因。在序列编号1或3所示的碱基序列中，可以只是编码区域的碱基序列。也可以使用与上述序列编号1或3所示碱基序列互补的，在严格条件下杂交，并且编码具有RNA引物酶活性蛋白质的基因序列。
所谓“严格条件”是指进行杂交后清洗时的条件，盐(钠)浓度为150～900mM，温度为55～75℃，优选盐(钠)浓度为250～450mM，温度为68℃。
在基因中导入变异，可以采用Kun kel法和缺口双链体法等已知方法，例如采用导入变异用的试剂盒，该试剂盒是利用特异部位的突变诱导法制备的，如使用GeneTailorTM定点诱变系统(Invitrogen公司制造)，TaKaRa定点诱变系统(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ公司制造)向基因中导入变异。
变异基因的详细情况和获取方法，在国际公开WO00/50611号公报中也有介绍。
如果用抗μ抗体和抗CD-40单克隆抗体对B细胞进行体外刺激，则不仅会引起GANP表达的上调，还会引起GANP蛋白质氨基酸序列中的特定丝氨酸残基(例如第502位丝氨酸：S502)磷酸化。该反应对于GANP的RNA-引物酶活性，是很关键的反应(Kuwahara，K.等.，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，10279-10283)。GANP蛋白质的N末端的RNA-引物酶结构域含有丝氨酸残基，其磷酸化在体外中受Cdk2的催化。通过C末端侧结构域的作用，GANP结合在MCM3许可复制许可因子上(Kuwahara，K.等.，(2000)Blood 95，2321-2328；Abe，E.等.，(2000)Gene 255，219-227)。
2.导入GANP基因的转基因哺乳动物
本发明涉及导入GANP基因的转基因哺乳动物，该转基因哺乳动物，优选由B细胞表达所导入的GANP基因。
(1)GANP基因及其相关分子
在基因中诱导变异过程中，由GANP基因与其相关分子形成的复合体是直接和间接的必要分子。GANP蛋白质，在修复基因变异的过程中，具有促进诱导V区域变异的作用，由此可获得高亲和性的抗体，所以本发明的转基因哺乳动物，通过导入该GANP基因或其变异基因可以促进获得性免疫高亲和性抗体的产生。同时该基因过表达的转基因非人哺乳动物，可以迅速产生高抗原结合力的抗体。因此用规定的抗源，对上述转基因非人哺乳动物进行免疫，能够很简单地获得用过去的方法所得不到的高亲和性抗体。结果就可以得到能够排除难治病源微生物以及异物的多克隆抗体或单克隆抗体。同时通过使用本发明的转基因哺乳动物，制备人源抗体，或者通过制备含有本发明转基因哺乳动物产生抗体V区域的单链抗体，可以显著提高抗体疗法的功效。
本发明的转基因哺乳动物，通过导入GANP或其变异基因，可以促进B细胞产生高亲和性抗体，并且前述高亲和性抗体产生细胞具有阻挡诱导细胞凋亡信号的性能。
为了确认GANP是在产生获得免疫应答抗体方面可以发挥作用的分子，本发明者首先计划制备了GANP基因缺失小鼠，选择缺失了GANP基因的B细胞。结果表明即使GANP基因缺失，也观察不到对免疫系细胞的成熟、分化、增殖的影响，同时也观察不到所产生抗体总和的较大变化。
这里与抗原反应的B细胞直接增殖，分化为抗体产生细胞的B细胞，仅限于某些种类的抗原，相对于一般抗原的抗体产生必需有T细胞同时存在。把即使在没有T细胞存在下也能够产生抗体的抗原称为非T细胞依赖性抗原。与此相反，把非T细胞依赖性抗原以外的一般抗原称为T细胞依赖性抗原。对于T细胞依赖性抗原，B细胞向抗体产生细胞的分化是通过辅助T细胞辅助进行的。
多数病原病毒的抗原确定簇(也称作抗原表位)的原始自身免疫原性弱，通过由T细胞识别载体蛋白质肽抗原的作用而得到活化。
为了检测在导入GANP基因的动物中可以高频率产生，针对在一般动物中不能产生强抗体的可溶性抗原的高亲和性抗体的情况，制备了由硝基苯基(NP基)与鸡-人免疫球蛋白(丙种球蛋白)相结合的抗原(又称NP-CG)，随后对T细胞依赖性抗原反应进行了研究。
其中众所周知，仅在使用单链V区域时C57BL/6小鼠产生针对NP的高亲和性抗体。该反应仅由抗体IgG重链的V区域(称为VH186.2)和L链λ1基因控制。如果使用该体系，可以通过研究VH186.2的氨基酸序列，由IgG1同种型抗体来研究高亲和性抗体的基因突变。并且有报导指出最强的亲和性是在重链V区域(VH186.2)的氨基酸序列中，在第33位氨基酸的色氨酸(W)变异(W33-L)形成亮氨酸(L)时诱导产生的。
于是本发明者在GANP基因缺失的小鼠中，研究了使其发生W33-L变异时，是否产生高亲和性抗体的问题。结果与对照的Cre-flox/+小鼠相比，几乎观察不到高亲和性抗体产生。因此弄清了GANP基因是对产生高亲和性抗体具有重要功能的基因。为了进一步验证这一结论，制备了使GANP基因过表达的小鼠。GANP基因的过表达是通过把小鼠免疫球蛋白启动子部分和人免疫球蛋白基因内含子增强子部分连接到GANP基因的5’侧上，使其在B细胞上选择性地表达而实现的。
上述GANP过表达小鼠也能正常出生，在其淋巴组织的成熟、分化、增殖方面看不出变化。但是在对NP-CG的反应中，高亲和性型的V区域基因(W33-L)有明显增加。虽然尚未确定RNA引物酶活性在该过程中究竟起着怎样的作用，但是从(i)判断GANP分子引物酶活性指标的第502位丝氨酸残基的磷酸化程度在发生中心高亲和性B细胞产生区域的细胞(中心细胞)中高，(ii)通过向Daudi细胞中导入ganp基因的实验诱导V区域的突变频率高两方面分析，可以认为GANP分子的RNA引物酶活性或与其有关的第502位丝氨酸残基的磷酸化与高亲和性抗体产生是有关联的。该结果表明使GANP分子高表达以及使RNA引物酶活性活化对于由免疫应答引起的高亲和性抗体的产生是必要的。
(2)导入GANP基因用的哺乳动物
本发明中的“哺乳动物”的意义指的是牛、马、猪、山羊、兔子、狗、猫、小鼠、大鼠、仓鼠以及土拨鼠等任意的非人哺乳动物，优选小鼠、兔子、大鼠或仓鼠，特别优选小鼠。
本发明的转基因哺乳动物，可以通过用磷酸钙法、电泳法、脂质转染法、凝集法、微量注射法、基因枪法、DEAE-葡聚糖(右旋糖酐)法等方法向未受精卵、受精卵、含有精子及其原细胞的胚芽细胞等，优选在非人哺乳动物发生中的胚发生阶段(更优选在单细胞或受精卵细胞阶段，通常在8细胞期以前)的细胞中导入GANP基因来制备。通过上述基因导入方法也可以把目的GANP基因转移到体细胞、生物体的脏器、组织细胞等中，用于进行细胞培养和组织培养。还可以通过用已知的细胞融合法使这些细胞与上述胚芽细胞进行融合，制备转基因哺乳动物。
在把GANP基因导入到对象动物时，优选以基因构建体的形式导入该基因，在所述构建体中所述基因连接到可指导该基因在所述动物中表达的启动子的下游。具体是把在可以表达来源于具有目的GANP基因的各种哺乳动物的GANP基因的各种启动子的下游，连接GANP基因形成载体，通过微量注射把该载体导入到对象哺乳动物的受精卵(例如小鼠受精卵)中，可以制备高表达目的GANP基因的转基因哺乳动物。
(3)表达载体
作为GANP基因的表达载体，可以使用来源于大肠杆菌的质粒、来源于枯草菌的质粒、来源于酵母的质粒、λ噬菌体等噬菌体、莫洛尼白血病病毒等的反转录病毒、牛豆病毒或杆状病毒等动物或昆虫病毒。
作为对基因表达进行调节的启动子，可以使用如来源于病毒基因的启动子、来源于各种哺乳动物(人、兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)和鸟类(鸡等)基因的启动子。
作为来源于病毒的基因起动子，可以列举如来源于巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒等基因的启动子。
作为来源于各种哺乳动物和鸟类基因的启动子，可以列举白蛋白，胰岛素II，红细胞生长素，内皮素，骨钙素，肌肉肌酸激酶，来源于血小板的生长因子β，角蛋白K1、K10和K14，胶原I型和II型，心钠利尿性因子，多巴胺β-羟化酶，内皮受体酪氨酸激酶，钠钾腺苷3磷酸化酶，神经原丝轻链，金属硫因I和IIA，金属蛋白酶1组织抑制剂，MHCl类抗原，平滑肌α肌动蛋白，多肽链延长因子1α(EF-1α)，β肌动蛋白，α和β肌球蛋白重链，肌球蛋白轻链1和2，髓磷脂基础蛋白、血清淀粉样P组分，肌红蛋白，肾素等基因的启动子。
上述载体也可以具有在转基因哺乳动物中终止目的信使RNA转录的终止子。此外，为了达到进一步高表达GANP基因的目的，根据需要，也可以把各基因的剪切信号、增强子区域、真核生物基因的部分内含子的一部分连接到启动子区域的5’上游、启动子区域和翻译区域之间或者是翻译区域的3’下游。
本发明的优选方案中，通过在免疫球蛋白启动子下游连接GANP基因或者在GANP基因的5’侧连接人免疫球蛋白基因内含子增强子部分，可以选择性地由B细胞表达GANP基因。
(4)导入GANP基因
在受精卵细胞阶段导入GANP基因，优选确保其在对象哺乳动物的所有胚芽细胞和体细胞中达到过剩存在的状态。在导入基因后制备动物的胚芽细胞中，存在过多的GANP基因意味着在制备动物所有子代的所有胚芽细胞和体细胞中具有过多的GANP基因。并且接受承继基因的此种动物子代，其所有胚芽细胞和体细胞中均有过多的GANP蛋白质。
本发明中，获取在相同染色体的一方具有导入基因的异源接合体，通过对异源接合体之间进行交配，获取在相同染色体双方都具有导入基因的同源接合体，再对该雌雄动物进行交配，可以使所有子代都能稳定保持导入的GANP基因。并且还可以确认具有过多的GANP基因，能够在一般的饲养环境中进行继代繁殖。
在把与转基因对象动物所具有的内源性基因不同的基因、即外源性GANP基因转移到对象的非人哺乳动物(优选小鼠等)、或其先祖的受精卵回交过程中所使用的受精卵，可以通过对同种型雄哺乳动物和雌哺乳动物进行交配而获得。
受精卵，可以通过自然交配获取，但优选对雌性哺乳动物的性周期进行人工调节之后，使其与雄性哺乳动物进行交配的方法。作为人工调节雌性哺乳动物性周期的方法，优选通过腹腔注射等方法首先施用卵胞刺激激素(妊娠马血清性性腺刺激激素(PMSG))，接着施用黄体形成激素(人绒毛性性腺刺激激素(hCG))的方法。
在所得的受精卵中，通过前述方法导入外源性GANP基因后，通过人工移植·植入到雌哺乳动物中，就可以得到具有整合外源性基因DNA的非人哺乳动物。优选采用人工方法把受精卵移植·植入到假妊娠雌性哺乳动物中的方法，该假妊娠雌性哺乳动物是通过对雌性哺乳动物施用由能形成黄体的激素所放出的激素(LHRH)后，使其与雄性哺乳动物交配而诱发受精能力。作为导入基因的全能性细胞，对于小鼠，可以使用受精卵和初期胚。作为向培养细胞中导入基因的方法，考虑到转基因哺乳动物个体的产出效率和导入基因向子代的传递效率时，优选采用DNA的微量注射法。
注入基因的受精卵接着被移植到受体雌性哺乳动物的输卵管中，将由受精卵发育成个体的动物放到饲育亲本处进行饲养后，从动物体的某一部分(小鼠时，是从尾巴的端部)提取DNA，通过Southern印记分析和PCR法，可以确认导入基因的存在。如果把确认有导入基因存在的个体作为初代(Founder)，则导入基因可以传递到50％的子代(F1)中。再将该F1个体与野生型动物或其它F1动物进行交配，就可以制备在2倍体染色体的一方(异源接合)或双方(同源接合)中具有导入基因的个体(F2)。
或者GANP蛋白质高表达转基因哺乳动物，还可以通过把上述GANP基因导入到ES细胞(胚胎干细胞)中进行制备。例如向来源于正常小鼠胚泡(blastocyst)的HPRT阴性(缺失次黄嘌呤鸟嘌呤·磷酸核糖基转移酶基因)ES细胞中导入GANP基因。使该GANP基因在小鼠的内源性基因上引起同源重组，通过HAT选择法对整合的ES细胞进行分选。接着通过微量注射把分选的ES细胞注入到从其它正常小鼠身上获取的受精卵(胚泡)中。把所得的胚泡移植到作为临时母体的其它正常小鼠的子宫内。由临时母体生出嵌合转基因小鼠。再使出生的嵌合转基因小鼠与正常小鼠交配，可以得到异型转基因小鼠。并且使异型转基因小鼠之间进行交配，可以得到同型转基因小鼠。
本发明中，不局限于上述转基因哺乳动物，其子代以及转基因哺乳动物或其子代的一部分也属于本发范围。作为转基因哺乳动物的一部分可以列举该转基因哺乳动物或其子代的组织、器官、以及细胞等，作为器官或组织，可以列举脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓或扁桃腺等；作为细胞可以列举B细胞等。
本发明的转基因哺乳动物，还可以再与对B细胞进行活化的哺乳动物交配，这样，有可能产生高亲和性抗体。
最近有报导指出在MRL/lpr小鼠中，B细胞在末梢淋巴结的活化过程中，经过发生中心后，在T细胞区域，会进一步使V区域的突变诱导亢进。本发明者也发现了在MRL/lpr小鼠中，在非免疫状态下可以看到和使GANP基因结合在Ig启动子、增强子下游而制备的ganp转基因小鼠中所看到的相同程度高表达。这一事实揭示了在正常情况下相对于自身抗原不可能产生高亲和性抗体，与此相反，在该自身免疫疾病的小鼠中，由于可以引起GANP分子的异常活化，所以也有可能产生相对于自身抗原的高亲和性抗体。
于是，作为使上述B细胞进一步活化的动物，如果使用一般认为是自身免疫疾病小鼠的MRL/lpr，NZB，(NZBxNZW)F1等，则可以期待诱导更高的变异。
通过制备利用上述情况的MRL/lpr小鼠的GANP转基因小鼠，有可能制备产生超高亲和性抗体的小鼠。也就是通过使本发明GANP基因过表达的转基因哺乳动物和有各种自身免疫疾病的模型动物交配，可以制备能产生高亲和性抗体的哺乳动物。
3.制备高亲和性抗体
本发明中所说的抗体，表示具有与抗原进行特异结合活性的蛋白质，优选B细胞产生的抗体。本发明中把对抗原反应性高的抗体称为高亲和性抗体。所谓“高亲和性”意味着抗体与抗原结合的结合能力高，本发明中是指与使用一般小鼠等动物制备的抗体相比，抗体与抗原的结合能力高，反之，也就是从该抗原解离慢的抗体。这表明相对于抗原决定簇，进行立体紧密结合的能力高，并且具有特异性，同时由抗体结合导致抗原确定簇以及抗原结构变化的结果而显示出的强烈活性(显示生物活性，如毒性中和、阻止病毒等的感染性、使病原体失活、促进从生物体内排出，引起抗原分子变性等)。
抗体的结合能力(亲和性)，可以通过Scatchard分析和被称为Biacore的表面胞质基因共振传感器，测定解离常数(KD)、解离速度常数(Kdiss)、结合速度常数(Kass)。Biacore装置是综合传感器芯片、微形流路系统和SPR检测系统3种技术，测定分子的结合强度、速度、选择性的装置，可以不使用标记，用实时方法进行生物体分子的检测、和对多个分子间的相互作用进行监控。作为Biacore装置可以列举Biacore3000、Biacore2000、Biacore X、Biacore J、Biacore Q(均为Biacore公司制造)等。
通过上述Biacore装置测定表示抗体亲和性的参数，也就是解离常数(KD)、解离速度常数(Kdiss)[1/Sce]以及结合速度常数(Kass)[1/M.Sec]。
抗体的解离常数(KD值)越小，亲和性越高，所以优选解离常数小的抗体。抗体的结合能力(亲和性)，取决于Kdiss和Kass两个参数，用
KD[M]＝Kdiss/Kass
表示。
由于抗原种类等多种原因，所得抗体的亲和性不同，但是通常优选KD值为1×10-7(M)或其以下，例如可以列举1×10-8(M)或其以下、1×10-10(M)或其以下或1×10-11(M)或其以下的抗体。
本发明中，当制备的抗体是可以发挥上述任意一种作用或性质的抗体时，都可以判定为是“高亲和性”的。
抗体分子的亲和性亢进是由于在抗体基因的可变区域(V区域)基因中，诱导体细胞超突变(SHM)而产生的。抗体对于抗原的特异性，从对生物体进行抗原免疫的初期就可以确认，但是初期的抗体多为IgM级抗体，对抗原的结合亲和性不高，除去或钝化病原体和异物的能力低。但是，如果对生物体施用抗原，进行数次补充免疫，则可以提高抗体对于抗原的结合亲合性，在这一过程中，B细胞必需接受来自T细胞的刺激，一般认为其活化在末梢淋巴组织的发生中心区域进行。最近有报导指出，作为诱导V区域基因突变所必需的分子是在发生中心表达的RNA编辑分子AID。而且有报道称其与尿嘧啶DNA糖苷酶或作为DNA复制中所必需的聚合酶的，容易产生错误的DNA聚合酶(ξ)和ι相关。但是还没有弄清控制这些功能的分子。目前已经弄清了GANP分子，作为新型SHM诱导分子的功能，该分子的表达提高掌握着诱导SHM的重要关键。特别对为产生高亲和性抗体是非常重要的这一点已经十分明确。
对于C57BL/6小鼠，通过使用硝基苯基-鸡γ球蛋白作为半抗原·载体的抗原，进行免疫而诱导的抗体，H链使用VH186.2基因座，L链为λ1。该过程中众所周知，进行补充免疫所得到的抗体是IgG1抗体，其中特别是在结合亲合性高的抗体V区域序列中诱导的突变是第33位色氨酸变异为亮氨酸的突变。本说明书实施例中，用该模式系统诱导高亲和性型V区域突变，可以说这是在分子水平上显示诱导高亲和性抗体的明显证据。
因此通过对上述转基因哺乳动物或其子代施用抗原产生抗体，可以得到高亲和性抗体。也就是用常规方法对使GANP蛋白质高表达的动物施用目的抗原，通过致敏动物的血液或脾脏等组织(不局限于这些组织)的淋巴细胞，可以制备高亲和性抗体。高亲和性抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。
作为产生多克隆抗体的方法，例如可以把抗原施用于本发明的转基因哺乳动物中进行免疫，从免疫的哺乳动物中采集血液，再由采集的血液对抗体进行分离·纯化，就可以得到多克隆抗体。
免疫致敏的方法，在本行业中是已知的，例如可以通过施用1次或1次以上抗原的方法进行。
对于抗原的种类没有特别限定，适合采用具有作为抗原确定簇立体结构的所有物质，除了蛋白质、酶、肽、糖、脂质、DNA、RNA、朊病毒等所有的生物体成分以外，还可以使用癌抗原、病毒抗原、有机、无机合成抗原等任意抗原。
施用抗原，可以以7～30天间隔，施用2～3次。施用量，如每次可以掌握在抗原约为0.05～2mg左右。对于施用途径，没有特别限定，可以适当选择施用于皮下、皮内、腹膜腔内、静脉内、肌肉内等途径，优选通过注射方法施用于静脉内、腹膜腔内或皮下。同时还可以把抗原溶解在适当的缓冲液，例如溶解在含有完全弗氏佐剂或氢氧化铝等一般常用佐剂的适当缓冲液中使用，但是根据施用途径和条件，有时也可以不使用佐剂。
对经免疫致敏的哺乳动物进行一定时间的饲养后，采集哺乳动物的血清样，测定抗体价数。当抗体价数升高时，可以采用100μg～1000μg的抗原进行补充免疫。从最后施用抗原1～2个月后经免疫致敏的哺乳动物中采集血液，可以通过蛋白质分离中常用的各种方法，例如离心分离法、使用硫酸铵或聚乙二醇的沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析法等，对血液进行分离作为多克隆抗血清得到多克隆抗体。
作为产生单克隆抗体的方法，可以列举如杂交瘤法等。首先使构成目的抗原的肽悬浮在佐剂中，把所得的悬浮液施用到免疫动物(即本发明的转基因哺乳动物)的皮下或真皮内。抗原的种类与前面叙述的相同。作为所用的佐剂，可以列举完全弗氏佐剂、弗氏的不完全佐剂、BCG、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、脂多糖(LPS)、明矾佐剂、二氧化硅佐剂等。从抗体诱导能的关系考虑，优选配合弗氏的完全佐剂(GFA)和弗氏的不完全佐剂(IFA)使用。
在单克隆抗体产生中，优选在对免疫动物进行初次免疫后，再进行数次补充免疫、经过适当天数后，进行部分采血，测定抗体的价数。用本发明方发产生的抗体，是高亲和性抗体，所以上述免疫，有可能只进行第一次就足够了。抗体的价数，可以通过酶免疫测定(以下称为“ELISA”)法等已知方法进行测定。
接着从致敏结束后的免疫动物中取出脾脏，得到B细胞。该过程中，从能够减轻后面筛选负担的角度考虑，优选得到与抗原相结合的B细胞。在这里得到的B细胞是产生高亲和性抗体的细胞，也可以直接把该B细胞作为免疫激活剂使用。还可以直接由B细胞得到V区域基因，测定该V区域的体细胞超突变。
接着按照常规方法，使B细胞和骨髓瘤细胞融合，制备产生抗体的杂交瘤。如果是小鼠，则取出脾脏，把取出的脾脏置于Hanks的平衡盐溶液(HBSS)中，用小镊子取出细胞，得到淋巴细胞(B细胞)。用台盼蓝的染色液对所得淋巴细胞进行染色，对活细胞进行计数，使其与骨髓瘤细胞进行融合形成杂交瘤。
对用于细胞融合的骨髓瘤细胞，没有特别限定，可以使用已知的骨髓瘤。例如可以列举P3-X63.Ag8(X63)、P3-X63.Ag8.U1(P3U1)、P3/NSI/1-Ag4-1(NSI)、Sp2/0-Ag14(Sp2/0)等。在选择骨髓瘤细胞时，要适当考虑与抗体产生细胞的适应性。
细胞融合，可以在不含血清的DMEM、RPMI-1640培养基等动物细胞培养用的培养基中，对1×106～1×107个/ml的抗体产生细胞和2×105～2×106个/ml的骨髓瘤细胞进行混合(抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞比优选为5∶1)，在细胞融合促进剂存在条件下进行融合反应。
细胞的融合方法，可以选择使用本领域中的任意已知方法，如仙台病毒法、聚乙二醇法、原生质体法等，但是特别优选聚乙二醇法，因为它的细胞毒性较小，而且融合操作也简单。作为细胞融合促进剂的聚乙二醇，可以使用平均分子量为1000～6000道尔顿的聚乙二醇。如果想大量制备抗体时，优选使用通过乙烯基吡啶诱导剂进行刺激的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合的杂交瘤。
对所得的杂交瘤细胞，可以按照常规方法在HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基)中培养适当时间，对杂交瘤进行筛选。接着筛选产生目的抗体的杂交瘤，进行杂交瘤克隆。
作为筛选方法，可以使用众所周知的抗体检测方法，例如ELISA法、放射免疫分析(以下称为“RIA”)法、噬菌斑法、凝集反应法等。作为克隆方法，可以采用该领域中的众所周知的方法，例如临界稀释法、软琼脂法、和FACS法等方法。把所得的杂交瘤在适当的培养液中进行培养，或者是施用于与杂交瘤具有适应性的小鼠的腹腔内。从这样得到的培养液或腹水中通过盐析、离子交换色谱、凝胶过滤、亲和色谱法等方法可以对所需要的单克隆抗体进行分离纯化。
上述抗体的片段和V区域的单链抗体也属于本发明范围。作为抗体片段，是表示前述多克隆抗体或单克隆抗体的一部分区域，具体可以列举F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(抗体的可变区片段)、sFv、dsFv(二硫键稳定的Fv)或dAb(单结构域抗体)等。这里所谓的“F(ab’)2”和“Fab’”表示分别用蛋白分解酶的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对免疫球蛋白(单克隆抗体)进行处理而制备，在存在于绞链区域中2条H链间的二硫键的前后被消化生成的抗体片段。例如如果用木瓜蛋白酶对IgG进行处理，则在存在于绞链区域中2条H链间的二硫键上游被切断，可以制备由VL(L链可变区域)和CL(L链稳定区域)构成的L链以及由VH(H链可变区域)和CHγ1(H链稳定区域的γ1区域)构成的H链片段，在C末端区域，通过二硫键结合的2个相同的抗体片段。分别把这2个相同的抗体片段，称为Fab’。如果用胃蛋白酶对IgG进行处理，则在存在于绞链区域中2条H链间的二硫键下游被切断，可以制备比由前述2个Fab’在绞链区域相连片段稍大的的抗体片段。把该抗体片段称为F(ab’)2，单链抗体具有用连接物把VL把VH连接起来的结构。
本发明的高亲和性抗体，可以是人源抗体和人抗体。这些抗体可以通过使用把免疫系统和人的免疫系统进行更换的哺乳动物，对该哺乳动物进行免疫，与一般单克隆抗体一样，直接制备人抗体。
制备人源抗体时，可以把互补性确定区域(CDR)由小鼠抗体的可变区域移植到人可变区域中，制备由构架区域(FR)来源于人，CDR来源于小鼠构成的重组可变区域。
接着把这些经人源化重组的人(抗体)可变区域连接到人(抗体)稳定区域上。最终来源于经重组的人源抗体中人(抗体)以外的氨基酸序列部分只有CDR和极少一部分FR。CDR是由超可变氨基酸序列构成的，它不表示种特异的序列，所以可以使用具有小鼠CDR的人源抗体。人源抗体的制备方法，在本行业中是众所周知的。
人抗体可以采用任何动物制备(小鼠、大鼠)，只是通常对于V区域的抗原结合部位，也就是超可变区域(Hyper Variable region)会产生有关特异性和结合亲和性的问题。另一方面优选V区域的其它部分和稳定区域的结构具有与人抗体相同的结构。对于人，在共同基因序列方面，已经确立了通过基因工程法进行制备的方法。
对本发明抗体的同种型没有特别限定，例如可以具有IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，IgM，IgA(IgA1、IgA2)，IgD或IgE的任意同种型。
4.高亲和性抗体的利用
本发明的高亲和抗体，可用以作为诊断、治疗或预防疾病的药剂。
(1)诊断疾病
使用本发明抗体诊断各种疾病的方法，可以通过把从怀疑有各种疾病的被检者身上采集试样，例如血清等和本发明的抗体通过抗原体反应进行结合，通过结合的抗体量检测出试样中目的抗原的量的方法进行。抗体量的检测可以按照已知的免疫学测定方法进行。例如可以使用免疫沉淀法、免疫凝集法、标记免疫测定法、免疫散射测浊法、免疫比浊法等。特别优选标记免疫测定法，因为其操作简单，并且灵敏度高。标记免疫测定法中，试样中的抗体价数，除了用标记抗体直接进行检测的标记量表示以外，还可以以已知浓度或已知抗体价数的抗体作为标准液进行相对表示。也就是可以用相同检测系统对标准液和试样同时进行测定，以标准液的值作为基准，相对地表示试样中的抗体价数。
作为标记免疫测定法，可以任意利用已知的方法，如ELISA法、RIA法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等等。所用标记物质可以根据上述测定方法，对酶、放射性同位素、荧光化合物等进行适当选择。作为前述酶，可以列举如过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡糖氧化酶等。上述标记物质可以通过使用抗生素蛋白-生物素复合物提高标记物质的检测灵敏度。作为放射性同位素主要是125I，作为荧光化合物可以列举异硫氰酸荧光素(FITC)和异硫氰酸四甲基诺丹明(TRITC)等。作为化学发光化合物，可以列举氧化苦杏素、氨基苯二酰肼(鲁米诺)、光泽精等。由上述标记物产生的抗体标记，可以按照常规方法进行。以下对使用标记抗体的标记免疫测定法进行说明。
作为用标记免疫测定法检测各种疾病的方法，可以使用已知的非竞争反应系或竞争反应系进行。在非竞争反应系中，必需是固相(固相法)。在竞争反应系中不一定必需是固相(液相法)。优选使用固相法，因为其测定操作简便。作为固相材质，可以列举聚苯乙烯、尼龙、玻璃、硅胶、纤维素等，作为固相的形状，可以列举球形、孔形、管形、片形等。但不局限于这些形状。可以任意使用一般标记免疫测定法中所用的已知材质和形状。
非竞争反应系中，测定操作是对试样或本发明的抗体进行固相化后，使之与本发明的抗体或试样反应，接着加入预先标记好的抗免疫球蛋白抗体(第二抗体)与正在和经固相化处理的试样进行反应的抗体进行反应。通过该第二抗体标记，可以检测与试样结合的抗体量。被检测出的经标记的第二抗体的量，与试样中的目的抗原量成正比关系，所以由此可以求出试样中目的抗原的量。
在竞争反应系中，相对于一定量抗体使试样和一定量的目的抗原进行竞争性结合。例如，对试样进行固相化后，使其与预先添加目的抗原进行反应的本发明抗体反应。接着使与经固相化的试样进行反应的抗体与预先标记好的抗免疫球蛋白抗体(第二抗体)反应，可以通过标记物质检测抗体的量。被检测出的标记物量与添加的目的抗原量成反比(相关)关系。作为其它的竞争反应系，对本发明的抗体进行固相化，使其与试样反应后，再使其与预先标记好的目的抗原反应。被检测出的标记物量和与抗体结合的试样中的GANP蛋白质量成反比关系。
作为对前述抗原或抗体进行固相化的方法，可以使用物理吸附法、共价结合法、离子结合法、交联法等已知方法。从操作简便的角度考虑，特别优选物理吸附法。作为抗免疫球蛋白抗体(第二抗体)，可以使用如抗IgG抗体、抗IgM抗体等。这些抗体，即可以直接使用抗体分子，也可以使用含有对抗体进行酶处理所得到抗原结合部位的抗体片段的Fab、Fab’、F(ab’)2。还可以使用对抗体分子中具有特异亲和性的物质，例如使用对在IgG中具有特异亲和性的蛋白质A等进行标记，来替代标记的抗免疫球蛋白抗体。
作为前述标记免疫测定法的优选例子，可以列举以酶作为标记物的免疫测定法、ELISA法。ELISA法，例如可以在96孔板上，注入试样或其稀释液，在4℃～室温下静止放置一夜，再于37℃下静止放置1～3小时左右，使其吸附应该检测的GANP蛋白质并对其进行固相化。接着使本发明抗体反应，再与预先结合酶的抗免疫球蛋白抗体(第二抗体)进行反应。最后加入与酶发生反应的适当显色性底物(例如，当酶是磷酸酶时，用p-硝基苯基磷酸等)通过其显色对抗体进行检测。
还可以利用本发明的高亲和性抗体，对治疗各种疾病药剂的药效进行评定。利用本发明高亲和性抗体评定药效的方法是通过对患有各种疾病的患者或患有各种疾病的模型动物施用药剂后，使用本发明抗体检测这些生物体中病毒等抗原的量，并对该量进行比较，通过生物体中的抗原量，可以对作为治疗各种疾病药剂的药效进行评定。
本发明的高亲和性抗体，可以以诊断各种疾病用的试剂盒形式提供。该试剂盒，可用于本发明的诊断方法和本发明对药效进行评定的方法。本发明的试剂盒含有从以下(a)和(b)中选择的至少1种或1种以上的物质。
(a)本发明的抗体或其标记物
(b)对前项(a)中所述的抗体或其标记物进行固定的固相化试剂。
这里所谓的抗体标记物是指通过酶、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物进行标记的抗体标记物。
作为对本发明试剂盒中的抗体，或者是它们的标记物进行固定的固相材质，可以列举聚苯乙烯、尼龙、玻璃、硅胶、纤维素等；作为固相的形状，可以列举球形、孔形、管形、片形等，但是不局限于这些材质和形状。也可以用添加固相和固相化中所必需的固相化试剂的物质来替代该固相化试剂。作为固相化试剂，例如用物理吸附法进行固相化时，可以列举50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)、10mM Tris盐酸缓冲液(pH8.5、含100mM氯化钠)、PBS等涂布液，根据需要还可以使用涂布液中含0.5％明胶等的封闭液。
本发明试剂盒中的抗体，也可以是使其溶解在PBS等中的状态，或者是使其结合在凝胶上的状态(以下简称为“吸收用凝胶”)。前述吸收用凝胶，还可以是把适量的凝胶预先包装在通过批量法进行吸收处理用的0.5～2ml微型离心分离管中的状态或者是预先填充到通过色谱柱法进行吸收处理用的柱容量为0.1～5ml的微型柱中的状态。
本发明的试剂盒，除了上述结构要素以外，还可以含有为实施本发明检测的其它试剂，例如当标记物是酶标记物时，含有酶底物(显色性底物等)、酶底物溶液，酶反应终止液或者是试样用稀释液。作为前述试样用稀释液，可以列举如PBS(生理磷酸缓冲液、pH7.4)、含137mM氯化钠和3mM氯化钾的pH为7.4并且Tris盐酸缓冲液为20mM的(以下简称为“TBS”)、0.05％Tween20、含0.1～1％BSA的PSB、或TBS等。该试样用稀释液，除了用于试样稀释以外，还可以用于稀释抗体等方面。
(2)治疗或预防疾病的医药组合物
本发明的高亲和性抗体，如果是具有能够对形成疾病病原的抗原活性进行中和作用的抗体，则可以作为治疗或预防疾病的医药组合物使用。本发明的医药组合物，优选以含有本发明的高亲合性抗体或其片段作为有效成分，并且还含有在药学上允许使用的载体的医药组合物形态提供。
这里，所谓“药学上允许使用的载体”可以列举赋形剂、稀释剂、增量剂、分解剂、稳定剂、保存剂、缓冲剂、乳化剂、芳香剂、着色剂、甜味剂、增稠剂、矫味剂、溶解助剂或其它添加剂等。通过使用1种或1种以上这样的载体，可以制备片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、注射剂、液剂、胶囊剂、口含片剂、酏剂、悬浮剂、乳化剂或糖浆剂等形态的医药组合物。这些医药组合物，可以通过经口或非经口方式施用。作为为进行非经口方式施用的其它形态，还可以以含有1种或1种以上活性物质，用常规处方配制成外用药剂，还包括向肠内施用的栓剂和避孕药剂等等。
本发明的药剂施用量，视患者的年龄、性别、体重以及症状、治疗效果、施用方法、处理时间、或该药剂所含活性成分的高亲合性抗体的种类不同而异，通常成人每人每次的施用量范围可以是10μg～1000mg，优选范围是10μg～100mg，但是，并不限定在此范围内。
例如如果是注射剂，可以通过使抗体溶解或悬浮在生理食盐水或市场上出售的注射用蒸馏水等药学上允许的载体中，并使抗体浓度达到0.1μg抗体/ml载体～10mg抗体/ml载体进行制备。这样制备的注射剂，相对于需要进行处置的人患者，1次施用量可以按1kg体重为1μg～100mg的比率，优选50μg～50mg的比率，一天施用1次～数次的量进行施用。作为施用的形式，可以列举静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉内注射或腹腔内注射等形式，但优选取向静脉内注射的形式。同时注射剂，有时也可以通过非水性稀释剂(例如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油类的植物油、乙醇等醇类等)作为悬浮剂或乳浊剂进行制备。对这样的注射剂进行灭菌的方法，可以采用通过能保留细菌的过滤器进行过滤灭菌，或者是通过配合灭菌剂或通过照射方式进行灭菌。注射剂，可以以使用时再调制的形式进行制备，也就是通过冷冻干燥法等制成无菌的固体组合物，在使用前使其溶解在无菌的注射用蒸馏水或其它溶剂中使用。
5.本发明的应用
本发明者在B细胞肿瘤株上诱导GANP过表达之后，进行分析的结果表明，B细胞肿瘤株，通过导入GANP基因，具有快速诱导V区域基因体细胞超突变的效果。当使用不引起对GANP的RNA引物酶活性必不可少的第502位丝氨酸磷酸化的变异基因时，看不到这一效果，因此，要快速诱导V区域基因的体细胞超突变，RNA引物酶活性是非常必要的。该结果表明作为临床辅助免疫活化剂，GANP具有增强产生特异抗体的效果。
使用反转录病毒载体作为载体，并且同时采用通过CD40、BAFF等TNF类分子的刺激和GANP，对于临床的辅助免疫活化作用也是有效的。另外通过在骨髓细胞水平导入该基因，也能够期待在T细胞上诱导高亲和性结合。当得不到艾滋病、C型病毒肝炎、成人T细胞白血病、疯牛病等的高亲和性抗体时，或者即使得到上述高亲和性抗体，但是由于马上引起抗原变异的原因，不能持续产生足够的高亲和性抗体时，可以期待导入该基因发挥优异的效果。
本发明的GANP基因过表达的哺乳动物，对于开发对制备生物学研究试剂、临床检查试剂有效的单克隆抗体是非常有效的。例如简单制备把相对特定信号传递分子的单克隆抗体和对功能结构域以及功能基元具有特异性并且结合力高的高亲和性抗体的应用范围相当广。多数抗体，不能进行很多筛选，所以有时不能用于免疫western分析和免疫沉淀中。这时如果使用本发明的转基因哺乳动物，可以用较短的时间从比较少的克隆抗体中筛选高亲和性抗体产生细胞，能有效降低经费、时间和劳力的消耗。特别是制备磷酸化抗体，相对于基因变异部分的特异抗体，可以应用于诊断药剂或者是使用抗体的药物选择性注入法中。还可以产生与基因序列和核苷酸部分有选择性结合的高亲和性抗体。
无机物、碳水化合物、化学合成物等任意物质立体结构的一部分，都可以作为抗原基元进行识别。高亲和性抗体，在过去是得不到的，但是通过与自身免疫疾病小鼠进行交配而制备的小鼠，对于为达到获得对所有抗原都具有高亲和性抗体的目的，是非常有效的。在该方法中有可能得到结合力为10-11道尔顿的高亲和性抗体，并且通过引入ELISA法的技术开发，还有可能开发简单地对微量物质进行检测的技术。
如果按照本发明，也有可能提供含有RNA引物酶失活型GANP基因的为治疗过敏性疾病或自身免疫疾病的基因治疗剂。所谓“RNA引物酶失活型GANP基因”是指RNA引物酶结构域缺失，或者是RNA引物酶结构域变异的基因，还指通过含有第502位丝氨酸残基变异的附近的基因变异而引起GANP分子结构和功能发生变化的基因。
本发明的基因治疗剂，可以通过把含有RNA引物酶失活型GANP基因的重组载体和用于基因治疗剂的基剂一起配合进行制备。作为构建重组载体过程中所用的载体，可以列举作为病毒载体的反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、杆状病毒载体、牛痘病毒载体，或者也可以使用动物表达用的质粒。载体，优选病毒载体。当把RNA引物酶失活型GANP基因整合到病毒载体中时，制备含有重组体DNA的病毒粒子，再与基因治疗剂中所用的基剂配合在一起，就可以制备基因治疗剂。
作为用于基因治疗剂的基剂，可以使用一般注射剂中所用的基剂，例如蒸馏水、氯化钠或氯化钠与无机盐混合物等的盐溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液，甘氨酸、精氨酸等氨基酸溶液，有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等。或者还可以按照本行业的已知方法，在这些基剂中使用渗透压调节剂、pH调节剂、植物油、或表面活性剂等助剂，作为溶液、悬浮液、分散液制备注射剂。这些注射剂，可以通过使其形成粉末、冷冻干燥等操作制备成使用时进行溶解的制剂。
本发明基因治疗剂的施用方式，既可以进行一般的向静脉内、动脉内等的全身施用，也可以进行局部注射或口服施用等局部施用等方式。本发明基因治疗剂的施用量视年龄、性别、症状、施用途径、施用次数、剂型不同而异，但是如果是成年人，作为每天的重组基因的重量范围是1μg/kg～1000mg/kg左右，优选范围是10μg/kg～100mg/kg左右。对施用次数没有特别限定。
实施例
通过以下的实施例进一步具体说明本发明的情况，但本发明不受实施例的限定。
实施例1：自身免疫疾病模型动物中的GANP表达及其功能
(材料及方法)
1.动物
NZB、NZW、B/WF1、MRL/lpr以及BXSB小鼠，从日本SLC Co.购入。
C57BL/6以及BALB/c小鼠，从Charles River Japan购入。NOD小鼠，由大阪大学研究生院的宫崎博士提供。
2.抗体及试剂
针对小鼠B220(RA3-6B2)、小鼠IgM(AM/3)以及小鼠IgD(CS/15)的大鼠单克隆抗体，由杂交瘤的培养上清进行纯化。用D-生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche diagnostics，Branchburg，NJ)进行标记。生物素标记大鼠抗小鼠Syndecan-1以及抗小鼠CD5单克隆抗体，是购入的(BD PharMingen，San Diego，CA)。生物素标记花生凝集素(PNA)是从Vector Laboratories(Burlingame，CA)购入的。
3.免疫
三硝基苯基匙孔戚血蓝蛋白(Trinitrophenyl keyhole limpethemocyanin(TNP-KLH))以及TNP-Ficoll，从Biosearch Technologies(Novato，CA)购入。把在完全弗氏佐剂中乳化的100μg TNP-KLH或在PBS中的25μg TNP-Ficoll注入到小鼠的腹腔内。14天后，取其淋巴器官，与OCT化合物一起进行冷冻，用于进行免疫组织分析。
4.免疫组织分析
用丙酮对6μm的冷冻切片进行5分钟固定，用3％BSA的PBS溶液封闭15分钟，与大鼠抗小鼠GANP单克隆抗体(42-23)[KuwaharaK.，等，2000，Blood  95：2321-2328]或大鼠抗-pSer502GANP单克隆抗体(PG/103)[Kuwahara K.，等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：10279-10283 ]一起孵育1小时。用PBS对载有切片的载玻片进行数次清洗，与碱性磷酸酶(ALP)-结合山羊抗大鼠IgG抗体(ICNPharmaceuticals，Costa Mesa，CA)一起进行孵育。采用Vector Blue kit(Vector)进行显色。为了进行双重染色，配合使用生物素标记抗体和辣根过氧化物酶(HRP)-结合链霉抗生物素蛋白(Kirkegaard&PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)进行反应。用3-3’-二氨基联苯胺四氢氯化物(DAB；同仁化学)进行显色后，用1％戊二醛的PBS溶液对切片进行一分钟固定。为了进行封固，使用了Aquatex(Merck，Darmstadt，Germany)。为了在体内检测具有增殖活性的细胞，在宰杀之前2小时，把5-溴脱氧尿核苷(BrdU)(Sigma Chemicals Co.，St.Louis，MO；1mg/小鼠)注入到(小鼠的)静脉内。把进行DNA合成的细胞和抗BrdU单克隆抗体(BD PharMingen)以及ALP-结合山羊抗小鼠Ig抗体(Sigma)配合在一起进行染色，通过Vector Red(Vector)使其显色，进行检测。PAS染色，按照已经报导的方法进行。[JiangY.等、1977，J.Immunol，158：992-997]。
5.结果
(1)MRL/lpr小鼠淋巴结中GANPhi细胞的出现
GANP表达是由具有自身免疫倾向的高活性的B细胞进行高表达。表达高水平GANP的淋巴细胞(GANPhi细胞)，在非免疫状态下自发出现在MRL/lpr小鼠的末稍淋巴结中。
使用抗GANP单克隆抗体和ALP结合抗大鼠Ig抗体，对来源于自身免疫疾病模型MRL/lpr、NZB和正常C57BL/6雌小鼠膝窝的淋巴结进行了免疫组织化学分析。
把结果表示在图1中。在第7周，于MRL/lpr小鼠的淋巴结上可以观察到用Vector Blue(ALP底物)染色的GANPhi细胞，与此相反，在同龄的NZB小鼠中却观察不到，在第40周才出现该细胞(图1)。在正常的C57BL/6小鼠中，整个期间内都可以观察到极少数的GANPhi细胞。
自身免疫疾病模型小鼠，与C57BL/6小鼠相比较，其淋巴细胞增加明显，在非免疫条件下，不显示GANPhi细胞(图1)。在随着年龄增长逐渐引起自身性免疫状态的NZB小鼠淋巴结中，对这种GANPhi细胞的出现进行了研究。低龄NZB小鼠(7周龄)的膝窝淋巴结中没有GANPhi细胞，在年龄增加的NZB小鼠(40周龄)中，具有多数GANPhi细胞。
GANP RNA引物酶活性有可能在B细胞的活化和分化中起着重要作用。于是，在NZB小鼠中使用抗pSer502单克隆抗体，对RNA引物酶活性的重要磷酸化部位Ser502的磷酸化状态进行了比较。
对NZB小鼠淋巴结中的GANP和pSer502GANP的表达进行了比较。pSer502GANP，用抗pSer502GANP(PG/103)单克隆抗体(蓝)进行检测，用生物素标记抗B220单克隆抗体对整个切片进行染色后，对HRP结合链霉抗生物素蛋白和DAB(茶色)进行组合检测。图中表示2次独立实验的数据(图2)。
图2中，下图(图表)表示在年龄增长期间，滤胞外区域的GANPhi(黑色柱)和pSer502 GANPhi(斜线柱)的细胞数。
GANP的表达在第8周明显，在到达第32周的整个期间内都可以检测出GANPhi细胞(图2；上图)。对照之下，pSer502-阳性细胞数在第8周达到最大，然后阳性细胞明显减少(图2；中图)把以峰值年龄为基准通过显微镜观察到的反应性细胞数表示在图中(图2；下图)。由这些结果分析可知GANP表达在最初伴随有RNA引物酶活性，该活性在长时间内得不到调节。
(2)在自身免疫倾向小鼠脾脏红脾髓上GANPhi细胞的自发出现
对于在自身免疫倾向NZB小鼠的膝窝淋巴结处检测出的GANPhi细胞是否出现在非免疫状态下的脾脏中，进行了研究。
免疫染色按照与前述(1)相同的操作(图2)进行，图3表示由3次独立实验得到的数据(图3)。
第4周在脾脏上出现GANPhi细胞。细胞数在第12周达到最大值，但是在24周后消失(图3；上图)。第8周和12周也检测出pSer502GANP的表达(图3；中图)。与红脾髓的相对细胞数进行比较的结果表明在脾脏上出现的GANPhi细胞，在12周后转移到末梢淋巴结上。GANPhi的增加与先于自身免疫疾病发病的自身抗体的产生量成比例(图2和图3；Theofilopoulos A.N.，等、1985，Adv.Immunol.37：269-390)。
由于GANPhi细胞的出现可能与自身免疫倾向小鼠中的B细胞异常相关，所以对非免疫条件下，各种自身免疫倾向小鼠(8周龄)中DANPhi细胞的出现进行了研究。
把结果表示在图4中。GANPhi细胞在MRL/lpr、NZB以及B/WF1的红脾髓上明显出现。
GANPhi细胞的数量在SLE-模型小鼠的BXSB以及NOD的脾脏中增加得不是很多，但是如果与对照的BALB/c小鼠(图4)以及C57BL/6小鼠(图1)相比，是增加的。脾脏切片，作为GC型结构，显示出PNA+B细胞的联想和未熟的缔合。通过与GANP在对正常C57BL/6小鼠以及BALB/c小鼠，进行T细胞依赖性抗原(T cell-dependent Ags：TD-Ags)免疫制备的在GC上的表达相比较，GANP在GC型区域中的表达不高。但是GANPhi细胞在自身免疫倾向小鼠的红脾髓区域明显地出现(图4)。
还进一步通过淋巴系细胞标记(物)分析对GANPhi细胞群进行了分析。
使用生物素标记抗B220单克隆抗体、生物素标记抗Syndecan-1单克隆抗体、生物素标记抗IgM单克隆抗体以及抗IgG抗体，对NZB小鼠的脾脏切片进行双重染色，对GANPhi细胞进行了鉴定。
把结果表示在图5中。图5所示图的左侧一列，由上到下顺序是使用生物素标记抗IgM单克隆抗体、抗IgG抗体、生物素标记抗B220单克隆抗体以及生物素标记抗Syndecan-1单克隆抗体时的图。中间一列表示GANP在与分别使用上述各抗体情况相同切片上的表达。右侧一列是把左侧一列和中间一列相重叠的图。右侧一列经双重染色的细胞，显示GANPhi细胞是B220-Syndecan1+IgM+。GANP表达，在IgM、IgG以及B200的情况下用红色表示；在Syndecan-1情况下用绿色表示。标记(物)，IgM、IgG以及B200用绿色表示；Syndecan-1用红色表示。
GANPhi细胞表达B220-Syndecan-1+的表现型，在细胞中表达大量的IgM(图5)。对于CR1、Thy-1、GL-7、CD23以及PNA为阴性，这些结果表明，GANPhi细胞在B系细胞的后期成熟阶段，大概是浆细胞。为了研究该GANPhi细胞是否是增殖性原浆细胞，对NZB小鼠施用BrdU(1mg/小鼠)(注入到静脉内)，为了在体内整合BrdU，进行2小时孵育。然后由小鼠制备脾脏切片。
用抗GANP单克隆抗体(蓝)以及抗BrdU单克隆抗体(红)对切片进行双重染色。按照常规方法，进行PAS染色。
把结果表示在图6中。GC表示发生中心(左)。GANP单一阳性GANPhi细胞，用箭头表示，用箭尖表示PAS单一阳性细胞(中间)。
用生物素标记抗CD-5单克隆抗体对切片进行染色。PALS区域表示淋巴结动脉周围的鞘(右)。图6表示3次独立实验的代表性数据。
GANPhi细胞对引入BrdU不显示阳性(图6)，表明这些细胞不是增殖性的，比原浆细胞阶段要成熟。
作为B-1细胞的异常分化，在自身免疫倾向小鼠中可以观察到Mott细胞形成。Mott细胞是浆细胞的异常形态，是大量IgM分子积蓄在通过PAS染色作为细胞质内Russell小体而被检测出的粗面小胞体结合小胞上[JiangY.，等、1997，J.Immunol.158：992-997]。GANPhi细胞不被PAS-染色而染色(图6)，由此可以把GANPhi细胞和来源于B-1细胞浆细胞的Mott细胞进行区别。脾脏GANPhi群的CD5表达是阴性(图6)，由NZB小鼠(12周)得到的腹膜细胞对GANPhi细胞是阴性，这表明B-1细胞没有大量表达GANP。该结果揭示了GANPhi细胞在自身免疫状态下属于高活性B细胞，该群与B-1细胞起源属于不同的起源体系。
(3)在用TD-Ag进行免疫的正常小鼠中诱导GANPhi细胞
对次级淋巴器官中的GANPhi浆细胞出现是否只局限于自身免疫倾向小鼠中的问题进行了研究。
用TNP-Ficoll(TI-2-Ag)或TNP-KLH(TD-Ag)对雌C57BL/6小鼠(7周龄)进行了腹腔内免疫，14天后取得脾脏。用TNP-Ficoll免疫的小鼠，当用生物素标记抗IgD单克隆抗体进行对比染色时，在红脾髓区域，没有显示出GANPhi细胞(图7左)。用TNP-KLH进行免疫的小鼠，在红脾髓区域显示出GANPhi细胞(图7右)。图7中，GANPhi细胞用箭头表示。WP表示白脾髓区域。
GANPhi浆细胞群，其数量非常少，但是在通过用TD-Ags进行免疫，即使在正常C57BL/6以及BALB/c小鼠的脾脏中也能进行诱导(图7)。通过非T细胞依赖性Ag(TI-Ag)进行的免疫，在这种细胞诱导中的效果较小。GANPhi细胞群显示出与B220loIgMhiIgDloGL-7loPNAloCD5loCD40lo相同的表现型，但是显示出Syndecan-1+.
该结果表明，自身免疫倾向小鼠中的GANPhi浆细胞生成，是通过与为了对TD-Ag免疫应答而提供的相同刺激而被诱导的。经过在GC进行增殖和分化的Ag驱动B细胞，有可能一面表达GANP，一面在更长的时间内处于浆细胞阶段，定位于红脾髓区域。
实施例2：GANP的过表达
(方法)
1.向Daudi细胞的稳定转染
采用Gene Pulser II(Bio-Rad)，在Daudi细胞中对10μg经线性化的pCXN-2小鼠GANP或GANPS/A502 cDNA进行电穿孔。48小时后，利用G418(Promega；1mg/ml)开始进行筛选，可以得到稳定表达小鼠GANP的Daudi细胞。
2.Daudi转染子的IgVH转录物的分析
使用Trizol(Invitrogen)从所有细胞中提取总RNA。用已经报导的方法制备cDNA(Kuwahara，K.等.，Blood 95，2321-2328(2000))。采用以下的引物及反应液对LVH3-CH1Cμ转录物进行扩增。扩增采用Pfu Turbo(Stratagene)。
5’-LVH3引物：5’-CTATAACCATGGACCATGGACATACTTTGTTCC-3’(序列编号5)
3’-Xbal-CH1-Cμ引物：
5’-TGCATGCATTCTAGAGTTGCCGTTGGGGTGCTGGAC-3’(序列编号6)
反应液组成：
Figure C20038010283200311
反应条件：
94℃  1分钟
[94℃ 1分钟；62℃  1分钟；72℃  1分钟]×35周期
72℃  10分钟
4℃
用NcoI以及XbaI消化PCR产物，用凝胶纯化，与用NcoI-XbaI消化的质粒进行连接反应。转化感受态细菌后，通过自动测序仪(Applied Biosystems)确定由QIAprep试剂盒(QIAGEN)制备的少量质粒DNA的碱基序列。
3.GANP-转基因(Tg)小鼠的制备
导入基因，通过在pLG载体的XhoI侧，导入5.6kb的小鼠GANP基因而制备。该载体是具有人免疫球蛋白内含子增强子区域(2kbEcoRI片段)，可以在B细胞中强表达的特异载体。对该基因进行线性化处理后对小鼠进行基因导入。用微量注射法把含有小鼠GANP全长cDNA的线性化的pLG载体(Koike，M.等.Int.Immunol.7，21-30(1995))注入到C57BL/6小鼠的受精卵中，用小鼠尾的基因组DNA以及以下的引物及反应液对导入基因的存在进行筛选。
1-5’引物：5’-TCCCGCCTTCCAGCT GTGAC-3’(序列编号7)
1-3’引物：5’-GTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3’(序列编号8)
反应液组成：
Figure C20038010283200321
反应条件：
[98℃  5秒钟；59℃  5秒钟；72℃  10秒钟]×35周期
4℃
4.RT-PCR
用Trizol(Invitrogen)从脾脏或脾脏B细胞中提取总RNA；用2种引物1-5’以及1-3’进行RT-PCR，合成cDNA(Kuwahara，K.等.，Blood 95，2321-2328(2000))。通过琼脂糖凝胶电泳检测GANP转录物。
β-肌动蛋白转录物作为对照使用。
5.结果
(1)使小鼠GANP在Daudi细胞上稳定表达的转染子V区域基因的体细胞超突变(SHM)
把GANP基因导入到在体外进行SHM分析所使用的各种人B淋巴细胞中(Rogozin，I.B.，等，Nat.Immunol.2，530-536(2001)；Kuwahara，K.等.，Blood 95，2321-2328(2000)；以及Denepoux，S.等.，Immunity 6，35-46(1997))。在很多B细胞株上，不能进行转染，但是可以在维持中把GANP基因导入到表达AID的Daudi B细胞中，而AID一般不生成SHM。
与野生型或假转染的细胞相比，该克隆在V区域可以显示出高频率的SHM(5x10-4/bp)。
用PCR对VH3-CH1Cμ的片段进行扩增，在质粒上进行亚克隆，并进行测序。
细胞变异的模式图示于图8A～C中。竖线“|”表示沉默突变(氨基酸不变化)，另一个符号(竖线中带有●标记的符号)表示氨基酸取代的变异。在Daudi/mock中几乎没有变异，但是Daudi/GANP-14，-15，-17，-21的4种克隆中，可以看到许多变异，虽然在程度上有差别。在导入把与控制DNA引物酶活性相关的第502位丝氨酸取代为丙氨酸的变异体(GANPS/A)转染子中变异出现的效率降低。
SHM在恒定区基因上不产生诱导(图8A～C)。GANP的RNA引物酶活性通过S502的磷酸化进行调节，这一作用可以通过特异的单克隆抗体进行检测(Kuwahara，K.等.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 98，10279-10283(2001))。因为在体外以及体内的B细胞刺激都可以诱导S502的磷酸化(Kuwahara，K.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，10279-10283(2001))，所以对于这种该磷酸化是否与Daudi B细胞中的SHM生成有关系，进行了研究。
当导入非磷酸化GANP变异体(GANP-S502A)时，不诱发SHM(图8A)，由此可见S502的磷酸化对在GC-B细胞中的SHM生成是非常重要的。
(2)使GANP在B细胞中过表达的转基因小鼠
为了对免疫应答中GANP的参与情况进行研究，制备了在人Ig增强子和启动子控制下使小鼠GANP过表达的GANP-转基因(Tg)小鼠(图9A和B)。用RT-PCR对GANP mRNA的表达亢进进行了确认。
该小鼠，显示在B细胞上GANP表达提高(图9C)、在对骨髓、脾脏以及淋巴结的细胞表层标记分析中，显示B系细胞的一般分化。
为了对SHM中GANP在体内的作用进行研究，对于TD-Ag的NP-CG免疫后的VH186.2区域进行了研究。也就是每隔2周对GANP过表达转基因(Tg)小鼠进行3次50μg NP-CG免疫，通过PCR对VH186.2进行扩增，并分析了体细胞超突变的情况。
结果表示在图10中。变异数量在Tg中稍有增加，但是表示高亲和性的第33位W变化为L的变异(SHM)在Tg中约增加到3倍。CDR表示互补链确定区域。
VH186.2基因座对高亲和性IgG(γ1λ1)NP-应答显示特有方式的SHM。通过对用NP-CG进行免疫后的所有脾脏B细胞的序列进行分析，表明与野生型小鼠相比，在GANP-Tg小鼠中，SHM频率只有少量增加(图10)。
以前曾经报导过该变异对半抗原特异B细胞的亲和性成熟是重要的(Allen，D.等.，EMBO J.1995-2001(1988))。
实施例3：制备B细胞特异的GANP缺失小鼠(B-GANP-/-小鼠)
(方法)
1.建立CD19-Cre/+GANP flox小鼠
使用GANP基因组DNA，通过在外显子II的下游插入抗新霉素的基因(neo)制备靶向载体。在neo3’侧邻接区域和外显子I以及II之间的内含子中导入lox P位点。
也就是制备在外显子II中插入了loxP序列的flox小鼠，使其与CD19-Cre小鼠交配，建立B细胞中缺失GANP的小鼠(图11A以及B)。
通过电穿孔法把经过线性化处理的靶向载体转染到TT2 ES细胞(Yagi，T.等.，Anal.Biochem.214，70-76(1993))中。用G418进行选择后，提取出ES克隆，与蛋白酶K一起进行孵育。通过使用下述neo2引物以及CGK3’-2引物，对同源重组体进行筛选。
neo引物：5’-GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT-3 ’(序列编号9)
CGK3’-2引物：5’-GGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3’(序列编号10)
同源重组，通过使用探针A对用BamHI消化的ES克隆的DNA进行DNA印记分析加以确认。使用显示4kb带的3个阳性克隆，通过向ICR胚泡进行微量注射，制备嵌合体初代小鼠。通过DNA印记法、RT-PCR以及细胞染色可以确认看不到GANP在B细胞中表达(图11C、D以及E)。
GANP flox+小鼠与C57BL/6小鼠至少进行10次回交。为了使B细胞中的GANP基因缺失，使GANP-floxed小鼠与CD19-Cre敲除小鼠(Rickert，R.C.，等.，Nucleic Acids Res.25，1317-1318(1997))进行交配。
2.FACS分析
用各种生物素标记单克隆抗体，在冰上对来源于淋巴器官的单一细胞悬浮物进行1小时的染色。用染色缓冲液清洗后，用FITC结合链霉抗生物素蛋白(Amersham Bioscience)以及PE结合单克隆抗体对细胞进行1小时孵育。使用CellQuest软件通过FACScan(BectonDickinson)对淋巴细胞进行分析。
3.B细胞的纯化
从Cre-flox/+小鼠以及B-GANP-/-小鼠(7～8周龄)分离脾脏细胞，用0.15M氯化铵缓冲液进行处理，去除红细胞。在塑料盘上于37℃孵育30分钟后，以未粘附细胞作为淋巴细胞进行回收，按照所附的添加方案，使用Dynabeads-anti-mouse Thy1.2单克隆抗体(Dynal)去除T细胞。通过使用FITC结合抗B220单克隆抗体(BDPharmingen)的细胞表层染色确认B细胞的纯度(90％以上)。
4.体外的增殖测定
在含有10％热灭活的FCS(JRH Biosciences)，2mM的L-谷氨酸以及5x10-5M的2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基(含分裂促进剂和不含分裂促进剂)中，在96孔的微量滴定板上，以2x105细胞/孔，对纯化的B细胞孵育48小时。用0.2μCi/孔的[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷(ICN)进行16小时脉冲后回收细胞，用闪烁扫描计数器对整合后的放射活性进行测定。
分裂促进剂，使用经亲合性纯化的山羊抗小鼠μ链特异抗体(10μg/ml)[F(ab’)2](ICN)，大鼠抗小鼠CD40单克隆抗体(LB429；10μg/ml)以及LPS(Sigma；10μg/ml)。
5.抗原及免疫
TNP-KLH、TNP-Ficoll以及硝基苯基-鸡γ球蛋白(NP-CG)(23：1)，是从Biosearch Technologies购入的。向Cre-flox/+小鼠以及B-GANP-/-小鼠的腹腔内注入50μg的TNP-KLH以及NP-CG(用铝沉淀)，或25μgTN P-Ficoll(溶解于PBS中)。
6.抗原特异抗体产生的测定
在施用抗原10天后和14天后，从免疫小鼠中回收血清。在ELISA平板上覆盖5μg/孔的TNP-BSA(Biosearch Technology)。用3％BSA的PBS溶液对各孔进行封闭，与阶段稀释的血清一起进行孵育。用PBS-0.1％Tween20进行清洗后，与生物素结合同种型特异的单克隆抗体以及碱性磷酸酶(ALP)结合链霉抗生物素蛋白(SouthernBiotechnology)一起进行孵育。显色，在有底物存在的条件下进行。
为了求出血清中NP结合抗体的亲合性，通过在覆盖抗原中使用NP2-BSA(每一个分子中有2个NP结合在BSA上)以及NP25-BSA(每一个分子中有25个NP结合在BSA上)(Biosearch Technology)的差示ELISA计算出NP2结合抗体相对于NP25结合抗体的比率。
7.免疫组织化学
用丙酮对从免疫的小鼠中取出的8μm脾脏切片稍微进行固定。用3％BSA的PBS-Tween20的溶液对试样进行封闭，与抗IgD单克隆抗体和ALP-结合大鼠IgG(ICN)抗体一起进行孵育。第一显色使用Vector Blue试剂盒(Vector)进行。第二显色是把试样与生物素结合花生凝集素(PNA)(Vecor)以及辣根过氧化物酶结合链霉抗生物素蛋白(Kirkegaard & Perry)一起进行孵育，接着与3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(Dojindo)一起进行孵育。使用1％谷氨醛的PBS溶液对试样进行固定后，用Aquatex(Merck)进行封固。
8.VH186.2基因的序列分析
使用(4-羟基-5-碘-3-硝基苯基)乙酰(NIP)，通过FACSVantage(Becton Dickinson Biosciences)对来自用NP-CG免疫的Cre-flox/+以及B-GANP-/-小鼠的NP-结合IgG1dullCD38low B细胞进行分级，与蛋白酶K一起在37℃下孵育一夜。利用裂解物，按照已经报导的方法(Takahashi，Y.，等Immunity 14，181-192(2001))实施2次PCR。把VH186.2基因DNA连接到pBluescript上，通过自动测序仪测定序列。
9.凋亡细胞的检测
用各种试剂对从Cre-flox/+以及B-GANP-/-小鼠纯化的B细胞进行40小时的刺激(Watanabe，N.等.，(1998)Scand.J.Immunol.47，541-547)。进行AICD时，在24孔板上固定抗μ抗体(50μg/ml)。在其它情况下，用各种刺激物质对纯化的B细胞进行48小时刺激，接着用抗Fas单克隆抗体(Jo2；BD Pharmingen)进行4小时孵育(Wang，J.等.，(1996)J.Exp.Med.184，831-838)。使用碘化丙锭(PI)溶液(50μg/mlPI，0.1％Triton X-100，0.1柠檬酸钠)，在室温下对细胞孵育1小时，用FACSGan作为G1以下区域对细胞凋亡的细胞(％)进行计算，凋亡细胞还可以通过用台盼蓝进行染色后，在显微镜下进行确认。
10.TUNEL测定
用SRBC(羊红细胞细胞)对Cre-flox/+以及B-GANP-/-小鼠进行免疫后，分别制备脾脏切片，用4％多聚甲醛的PBS溶液对冷冻切片进行固定。用MEBSTAIN Apoptosis KitII(MBL)对切片试样进行处理，用PI进行对比染色。为了与TdT传递质dUTP-生物素-终端标记(TUNEL)检测一起进行实验，也可以对切片使用抗IgG1单克隆抗体(BD Pharmingen)以及Alexa546结合山羊抗大鼠IgG抗体(Molecular Probes)进行染色。检测阳性信号，通过荧光显微镜(BX51；Olympus)对结果进行确认。
11.结果
(1)RNA引物酶GANP的作用
为了研究RNA引物酶GANP的作用，使用Cre-loxP系统制备成为CD19+B细胞缺失GANP基因的B-GANP-/-小鼠(图11A和B)。B-GANP-/-小鼠基因缺失大部分外显子II(图11C)。B-GANP-/-细胞不表达GANPmRNA(图11D)，同时通过免疫染色，几乎不表达蛋白质(图11E)。B-GANP-/-小鼠可以正常生长发育，并且在骨髓、脾脏、胸腺、淋巴结处显示正常数量的淋巴细胞，在流式细胞测量法分析中，B-GANP-/-在骨髓、脾脏以及淋巴结的细胞中，显示与对照的Cre-flox/+小鼠相同的表面标记轮廓(图12)，与Cre-flox/+(对照)没有差别。
在B-GANP-/-的淋巴结处，表达sIgMlowsIgDhigh的成熟B细胞(IgM+IgD+)的数量减少。来源于B-GANP-/-小鼠的B细胞在体外通过抗μ抗体、抗μ抗体+抗CD40单克隆抗体、或脂多糖进行刺激后，显示一般的增殖应答(图13：B-GANP-/-为白色柱，Cre-flox/+为黑色柱)。另一方面，来源于B-GANP-/-小鼠的B细胞，通过抗CD40单克隆抗体(5，10μg/mL)刺激后，增殖活性降低(图13)。该结果表明在B-GANP-/-小鼠的B细胞增殖中，对CD40/CD145相互作用的反应，只受到很少的损害。血清Ig量与Cre-flox/+小鼠相同(图14)。
(2)B-GANP-/-小鼠中抗原特异的抗体产生
本发明者研究了通过TI-Ag以及TD-Ag进行免疫后B-GAN-/-小鼠的免疫应答。在进行TI抗原的硝基苯基(TNP)-Ficoll免疫14天后，通过ELISA测定了抗TNP抗体价数。结果表明(TNP)-Ficoll在B-GANP-/-小鼠以及Cre-flox/+小鼠中，可以诱导相同的应答，没有特别差异(图15)。
对发生中心(GC)形成进行了研究，对于TD-Ag的TNP-匙孔戚血蓝蛋白(KLH)以及NP-CG等的TD-Ags产生应答，与Cre-flox/+小鼠相比，变异体小鼠显示滞后的GC形成。
关于GC形成的峰应答，Cre-flox/+，在第10天显示出用GC-B细胞标记物花生凝集素进行染色的很成熟的GC(图16的箭头)。在进行免疫10天后，B-GANP-/-一方的GC形成较少。但是在14天后与Cre-flox/+相比，B-GANP-/-形成的GC数量增多，即使是在20天后GC形成仍在延续(图16箭头)。
B-GANP-/-小鼠，在第14天显示出形成了清晰的GC，所以测定了抗原特异的抗体应答(图17)。在用TD抗原的TNP-KLH进行的免疫中，到第10天为止，B-GANP-/-小鼠仍不显示清晰的GC，抗体价数几乎没有差别，但是在用TNP-KLH进行免疫后的第14天，在B-GANP-/-中显示出GC的阶段性增加和扩大(图17)。变异体小鼠对于TNP-KLH，显示出与Cre-flox/+小鼠相同的抗体应答。
(3)B-GANP-/-小鼠中亲和性成熟的障碍
为了进一步研究B-GANP-/-小鼠中GC的特征(抗体应答是低亲和性的)，用NP-CG对抗原特异的IgG1+GC-B细胞免疫后进行了研究。
通过使用具有不同分子量NP半抗原/蛋白质结合的差示ELISA与相对于多半抗原NP25-BSA结合的应答进行了比较。
B-GANP-/-小鼠中，对于NP2-BSA结合的抗体应答，在NP-CG免疫后第35天，是低亲和性(13％)的。该值与Cre-flox/+小鼠的值(42％)相比，抗体反应明显降低(图18)。
此外如图19所示，NP-特异的IgG1dullCD38lowB细胞，在B-GANP-/-小鼠中明显减少(图18)。也就是在免疫后第10天，在Cre-flox/+小鼠中，为1164细胞/106细胞，相对在B-GANP-/-小鼠中，为88细胞/106细胞。此外在第14天，在Cre-flox/+中，为879细胞，相对在B-GANP-/-中，为83细胞。在第20天这一倾向也是相同的。
与此相比，IgG1highCD38high记忆B细胞没有减少。这些结果表明GANP无表达变异在IgG1highCD38lowGC-细胞阶段会使B细胞分化中产生缺陷。
为了确认B-GANP-/-小鼠中抗体亲和性成熟减少，对用NP-CG免疫后的脾脏B细胞VH186.2区域的序列进行了研究。
由于SHM是在B细胞分化的该阶段产生的，所以对于VH186.2基因座的SHM，研究了各种纯化的B细胞。并且VH186.2基因座可应用于高亲和性IgG(γ1λ1)NP-应答(Cumano，A.&Rajewsky，K.(1985)Eur.J.Immunol.15，512-520)。与Cre-flox/+相比，IgM位点没有差异。
接着对Cre-flox/+或B-GANP-/-进行NP-CG免疫，对于显示NP-结合IgG1弱阳性CD38弱阳性的GC-B细胞(Ag-结合IgG1B细胞)进行分类(图19)，从分类后的细胞中提取出基因组DNA，对VH186.2进行PCR扩增，并进行测序分析，对VH186.2序列进行了比较(图20A～L)。图20A～F是对Cre-flox/+的VH186.2序列，图20G～L是对B-GANP-/-的VH186.2序列进行比较的情况。
B-GANP-/-小鼠中，IgV区域序列的所有变异为14×10-3，与Cre-flox/+小鼠(21×10-3)相比，变异的数量减少(图21)。由W33到L的高亲和性型变异(在C57BL/6小鼠中，可以清楚看到从第33位氨基酸残基色氨酸到赖氨酸的变异，)为13％(2/15V区域)，在变异型小鼠中，与Cre-flox/+小鼠的值(71％，10/14V区域)相比较，减少得更明显，亲合性下降到1/3(图22)。
以上结果表明GANP对于抗体亲合性成熟是必要的。
(4)B-GANP-/-小鼠B细胞中不受细胞凋亡影响的保护功能
可以认为，B-GANP-/-小鼠中，高亲和性抗体产生减少是由于抗原刺激后的B细胞不稳定所致。于是为了对B细胞的感受性进行研究，对在体外B细胞的细胞凋亡进行了研究。
正常的B细胞是通过强力交联的B细胞抗原受体而诱导活化诱导细胞凋亡(AICD)的。通过CD40的刺激作用，可以阻止AICD。在B-GANP-/-B细胞中，对于AICD刺激的感受性程度与正常B细胞(对照)是相同的，但是关于通过抗CD40的细胞凋亡的抑制程度，比Cre-flox/+对照B细胞还要低(图23)。该结果表明，B-GANP-/-小鼠在GC形成期期间，缺乏对抗原反应性B细胞的保护功能。
在GC中，通过经抗原刺激的B细胞和CD40/CD154的相互作用，诱导Fas/CD95的表面表达，使Fas诱导性细胞凋亡具有感受性。于是本发明者对B-GANP-/-B细胞对于在体外诱导细胞凋亡的抗CD95刺激的感受性进行了测定。
首先，用抗CD40单克隆抗体(LB429)、抗μ抗体+抗CD40单克隆抗体、IL-4抗CD40单克隆抗体以及抗μ抗体+IL-4+抗CD40单克隆抗体对脾脏B细胞进行48小时刺激，接着向培养基中添加抗CD95单克隆抗体。
结果表明B-GANP-/-小鼠B细胞的细胞凋亡应答与Cre-flox/+小鼠B细胞的应答相同，细胞凋亡应答在B-GANP-1-小鼠和Cre-flox/+小鼠中没有差别(图24)。
如上所示，即使在CD40(LB429)处理后，用抗CD95进行刺激，表达诱导在B-GANP-/-小鼠和Cre-flox/+小鼠中也没有差别。该结果表明在B-GANP-/-小鼠B细胞中，在体内，通过GC-B细胞作用，对于一般接受的细胞凋亡刺激具有感受性。于是作为TD-Ag，使用SRBC进行免疫后的组织切片进行了TUNEL测定。
结果TUNEL阳性细胞，在B-GANP-/-小鼠的GC区域增加，大部分细胞都显示为表达IgG1(图25、26)。这些结果表明B-GANP-/-小鼠的凋亡细胞大部分是GC-B细胞。(图25、26)。
接着对各种恶性淋巴瘤细胞以及被识别为对抑制正常B细胞CD40介导性细胞凋亡所必要的分子Bcl-2家族成员的RNA表达进行了研究。
如果用抗μ抗体+IL-4进行刺激，诱导Cre-flox/+B细胞中的bel-2转录的明显增加，抗CD40mAb进一步对其表达进行上调(图27)。另外在B-GANP-/-B细胞中，显示了与由抗μ抗体引起的bcl-2转录物相同的上调，但是对于抗CD40mAb(单一的抗C D40mAb或抗μAb+IL-4+抗CD40mAb)的应答却没有Cre-flox/+的B细胞那样高(图27)。也就是参与抑制细胞凋亡的Bcl-2家族的RNA表达水平，在用抗CD40抗体进行刺激时的B-GANP-/-细胞中，比对照物的表达水平还要低(图27)。
关于变异B细胞中的bcl-XL、bax以及bad与Cre-flox/+B细胞中的水平程度相同(图27)。
以上结果表明GANP在B细胞中，控制与通过CD-40的Bcl-2诱导有关的信息传递，有助于在体内的高亲和性BCR+B细胞的生存。
(5)总结
B-GANP-/-小鼠和GANP-Tg小鼠的结果证实，GANP与用YD-Ag进行免疫后高亲和性B细胞的生成有关。作为GANP的作用有可能是在GC-B细胞中，介导对DNA聚合酶的有效补充(リクル一ト)和调节。如果具有V-区域SHM的GC-B细胞取得高亲和性BCR，就应该能够对它们进行筛选，并且还可以使B细胞V区域的SHM得到抑制，在体内就应该可以保证产生高亲和性抗体。在GC-B细胞上的AID表达有可能不断生成DNA变异，所以为了在B细胞中维持高亲和性BCR，也许AID活性调节是有必要的。在B-GANP-/-小鼠中的结果表明GANP对于SHM加工是必要的。
实施例4：使用GANP转基因小鼠制备高亲和性抗体
1.通过差示ELISA进行的抗体价数比较
分别对野生型(WT)小鼠和GANP转基因(Tg)小鼠各2只进行NP-CG100μg的免疫，28天后采集血清，进行ELISA。用20μg/ml的NP2-BSA和NP17-BSA对ELISA平板在4℃下包被过夜。用3％BSA/PBS-0.1％Tween 20固定1小时，使血清反应1小时。用PBS-0.1％Tween 20清洗3次，以生物素标记抗小鼠IgG1抗体(SouthernBiotechnology)反应1小时。用PBS-0.1％Tween 20进行3次清洗，以碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白(Southern Biotechnology)反应30分钟。用PBS-0.1％Tween20清洗3次，用TBS清洗1次，以磷酸对硝基苯酯作为底物使其显色。在405nm处测定吸光度。
结果示于图28中。图28的结果表明，通过使用GANP转基因小鼠可以产生高亲和性抗体。
2.使用ELISA以及Biacore的抗原-抗体结合亲和性分析
对野生型(WT)小鼠和GANP转基因(Tg)小鼠，使用NP-CG作为免疫抗原进行免疫，分别使用各小鼠进行细胞融合，在得到的阳性杂交瘤培养上清中，使用ELISA法以及Biacore，得到抗原抗体反应的结合曲线。从所得的结合曲线，推导出Tg小鼠的可用性。
(1)材料
(a)动物
野生型(WT)小鼠和GANP转基因(Tg)小鼠。
(b)抗体及试剂
使用NP16-CG(每一个分子中16个NP结合在CG鸡免疫球蛋白上)、NP2-BSA(每一个分子中2个NP结合在BSA(牛血清白蛋白)上)、NB17-BSA(每一个分子中17个NP结合在BSA上)、HRP标记抗小鼠IgG、IgA以及IgM。
(2)方法及结果
以NP16-CG作为免疫抗原，每隔2周对野生型(WT)小鼠和GANP转基因(Tg)小鼠各5只进行3次免疫，3次免疫后采集血样，使用抗血清对抗体价数进行比较，与前述1项中所述的结果相同，可以确认GANP-Tg小鼠的可用性。
其中，使用效价高的小鼠脾细胞，与P3U1骨髓瘤细胞实施细胞融合，根据G ANP-Tg小鼠的脾细胞数(6.0×107个)、WT的脾细胞数(4.8×107个)，进行整合，使细胞达到1×105/孔，在HAT培养基中对来源于GANP-Tg小鼠的细胞600克隆，来源于WT小鼠的细胞480克隆进行培养。
使用HAT培养9天后的培养上清，以NP2-BSA(1μg/mL)作为固相化抗原，实施ELISA法。分别从GANP-Tg小鼠和WT小鼠的培养上清中，筛选出在ELISA吸光度结果中显示高亲和性抗体的产生高出2.5％的克隆，用HT培养基克隆。
使用HT培养9天后的培养上清，以NP2-BSA(1μg/m L)作为固相化抗原，实施ELISA法的结果，GANP-Tg，建立了6种克隆(克隆名称：G2-6、G2-9、G2-12、G2-14、G2-15、G2-16)、WT建立了1种克隆(克隆名称：W2-7)的杂交瘤。
把GANP-Tg小鼠、WT小鼠的各克隆在RPMI培养基中进行培养，确保每种克隆中有1mL适用于以下实验的培养上清。使用该培养上清，进行以下评定分析。
(a)ELSA法
在评定抗体价数的过程中，使用抗原性质不同的物质，即所谓每分子CG中NP含有比率不同的物质，以其ELISA反应性的比率进行评定。
本方法是可用于对NP亲合性进行测定的方法，简便并且可以进行多种检查，所以作为一次性筛选是适宜和可靠的。
首先，分别以NP2-BSA(1μg/mL)和NP17-BSA(1μg/mL)作为固相化抗原，在4℃下进行一晚的固相化。用PBS-Tween20对固相化平板进行清洗后，用脱脂乳-PBS-Tween20实施封闭。再用PBS-Tween20对平板进行清洗后，使用GANP-Tg小鼠的6种克隆(克隆名称：G2-6、G2-9、G2-12、G2-14、G2-15、G2-16)以及WT小鼠的1种克隆(克隆名称：W2-7)的RPMI培养上清(原液～256倍稀释液)在室温下使其与固相化抗原反应1小时。接着用PBS-Tween20对平板进行清洗后，使HRP标记抗小鼠IgG、IgA以及IgM在室温下反应1小时。再用PBS-Tween20对平板进行清洗后，用邻苯二胺(OPD)进行5分钟显色，采用2N硫酸终止反应。
采用ELISA READER，在490nm处测定吸光度。
把ELISA的结果表示在图29中。由图29的结果分析可知，通过使用GANP-Tg小鼠可以产生高亲和性抗体。
(b)使用Biacore的高亲合性分析
采用Biacore对上述ELISA的结果中，被认为是亲和性最高的克隆的物理化学结合能力进行了研究。
用Biacore进行分析是在以NP2-BSA(1μg/mL)作为配位体而结合在Biacore顶部的克隆中，采用一般认为作为分析(アナライト)溶液亲和性最高的Tg(G2-9)，亲合性最低的Tg(G2-15)以及WT(W2-7)3种克隆的RPMI培养上清，分别计算出结合速度常数(k ass)、解离速度常数(K diss)以及作为亲合性指标的解离常数KD(KD＝k diss/kass)，一般认为KD越小，亲和性越高。
作为结果，把G2-9(ELISA：82.9％NP2/NP17比)的Biacore图形表示在图30中。图30所示曲线(a)～(e)是抗体浓度分别为26.6、13.3、6.65、3.33以及1.66nM的图形。
从上述结果可以了解到，结合速度常数(k ass)＝1.48×105，解离速度常数(k diss)＝9.63×10-4，作为亲和性指标的解离常数KD(KD＝kdiss/k ass)＝6.50×10-9。
另一方面，把由ELISA的结果中，认为亲和性比较低的G2-15(ELISA：33.9％NP2/NP17比)的Biacore图形表示在图31中。图31所示的曲线(a)～(e)是抗体浓度分别为23.0、11.5、5.75、2.28以及1.44nM的图形。
结合速度常数(k ass)＝5.33×104，解离速度常数(k diss)＝1.56×10-2，作为亲和性指标的解离常数KD(KD＝k diss/k ass)＝2.92×10-7。该值近似于在ELISA法中也显示相同亲和性的W2-7(ELISA：31.6％NP2/NP17比)所具有活性的KD值＝1.67×10-7。
从以上述情况分析，通过使用GAPN转基因(Tg)小鼠，可以产生高亲和性抗体这一点是很明确的。
实施例5：GANP和MCM3的缔合、细胞周期中的核/细胞质之间的移动
1.概况
本实施例中，本发明者通过使用部分断裂型变异体GANP，确定GANP的MCM3结合区域，采用GANP特异区域中相对于第502位氨基酸的磷酸化丝氨酸(pSer502)特异的单克隆抗体，使NIH-3T3细胞中的GANP具有定位的特征。
引物酶和MCM的结合，是一个连动的功能，二者结合的分子复合体具有从双链中解开DNA的作用。因此可以认为如果GANP部分片段与MCM结合，则该GANP片段也可以发挥引物酶的活性，具有产生高亲和性抗体的作用。
于是采用cDNA转染和细胞融合实验对GANP及其部分片段、Map80及MCM3的核/细胞质区域的定位进行了分析。
通过所得数据，可以表明GANP和MCM3结合，还可以表明GANP的定位受MCM3表达的影响。GANP是通过与Map80结合机理不同的结合机理与MCM3缔合的。这些结果表明结合在MCM3上的GANP是通过与Map80/MCM3AP功能完全不同的独特功能而结合的。
2.材料及方法
2.1.细胞及细胞培养
把NIH-3T3、COS7、Hela以及Swiss-3T3细胞在10％热灭活FCS(大日本制药)、2mML-谷氨酸(Biowhittaker)、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素以及补充50μM 2-巯基乙醇的D-MEM培养基(Invitrogen)中，于37℃、5％CO2的条件下进行维持(Takei，Y.等.，(1998)J.Biol.Chem.273，22177-22180、Sakaguchi，N.等.，(1988)EMBO J.7，3457-3464、Kimura，H.等.，(1995)Nucl.Acids Res.23，2097-2104)。BAL17在RPMI-1640培养基(Invitrogen)中进行培养。
2.2.磷酸化GANP及MCM3的细胞内定位
在PBS(pH7.4)中，用3.7％多聚甲醛对NIH-3T3固定5分钟，再使用0.2％Triton X-100进行渗透(Kimura，H.等.，(1994)EMBO J.13，4311-4320)。使用大鼠抗pSer502GANP单克隆抗体(Kuwahara，K.等.，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，10279-10283)以及兔抗MCM3抗体(Kimura，H.等.，(1994)EMBO J.13，4311-4320)作为一次抗体。接着对于GANP使用Alexa 488结合山羊抗大鼠IgG抗体(MolecularProbes)作为第二抗体；对于MCM3使用Alexa546结合山羊抗兔IgG抗体(Molecular Probes)作为第二抗体，用碘化TOTO-3(MolecularProbes)进行对比染色，并且用共焦激光扫描显微镜(FV500；OLYMPUS)进行观察。
2.3.用于表达的cDNA构建体
关于pSRα-MCM3-HA，在文献中已有介绍(Kimura，H.等.，(1995)Nucl.Acids Res23，2097-2104)。载有SV40T-Ag的3个核定位信号(NLS)的pECFP-Nue载体，从Clontech购入。把利用以下组合的3’和5’引物所得到的PCR片段导入到pGEX-4T-1(Amersham)，利用所得的质粒使不同型小鼠ganp cDNA表达为与谷光甘肽-S-转移酶(GST)融合的融合蛋白质。
GANP1-5’：5’-GGGGATCCATACCCGG TGAACCCCTT-3’ (序列编号11)
GANP1-3’：5’-GGGTCGACGCGCACAGACTTTCCCCTGA-3’(序列编号12)
GANP2-5’：5’-GGGAATTCTCCCGCCTTCCAGCTGTGAC-3’(序列编号13)
GANP2-3’：5’-GGGTCGACGTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3’(序列编号14)
GANP3-5’：5’-GGGAATTCCATGAGCT GAGACCCTCAGC-3’(序列编号15)
GANP3-3’：5’-GGGTCGACTGAGGATGCAGGAGGCGGCT-3’(序列编号16)
GANP4-5’：5’-GGGAATTCTACGTTGGAGAGAGCCTGGC-3’(序列编号17)
GANP4-3’：5’-GGGTCGACCATGCTGTCATCTCCTGTGA-3’(序列编号18)
GANP5-5’：5’-GGGAATTCGAGAACCTGGCCAAGGGTCT-3’  (序列编号19)
GANP5-3’：5’-GGGTCGACGAAAAACCGACGGCTGAACT-3’  (序列编号20)
GANP6-5’：5’-GGGAATTCAAGCCCTTCCAGCCTGCCCT-3’  (序列编号21)
GANP6-3’：5’-GGGTCGACCGAGGGAACGTGGTATTTTC-3’  (序列编号22)
GANP7-5’：5’-GGCCCGGGCCCGTGGGATGACATCATCA-3’ (序列编号23)
GANP7-3’：5’-GGCTCGAGCATGTCCACCATCTCCAGCA-3’(序列编号24)
cDNA构建体，是通过把PCR片段导入到pSVEGFPpA中，作为对绿色荧光蛋白质(GFP)进行标记的Ganp变异体而制备的(Kuwata，N.等.，(1999)J.Immunol.163，6355-6359)。接着把这些构建体导入至pCXN2哺乳动物表达载体中(Niwa，H.等.，(1991)Gene108，193-200)。引物序列按照如下序列进行设计，以对Ganp进行编码。
Gp-gfp-5’：
5’-GGGGATCCGAATTCCACCATGGCAGTCTTCAAACCGATACC-3’(序列编号25)
Gp-gfp-3’：
5’-GCAGGGGCTCCTCCTGATCT-3’(序列编号26)
Gsac-gfp-5’：
5’-GGGGATCCGAATTCCACCATGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3’(序列编号27)
Gsac-gfp-3’：
5’-CTGTCTTGTTTCTAAGCCGC-3’  (序列编号28)
Gmap80-gfp-5’：
5’-GGGGATCCGAATTCCACCATGGAGAACCTGGCCAAGGGTCT-3’(序列编号29)
Gmap80-gfp-3’：
5’-GAGGACTTGTAGATGTTTTCACCATGG-3’(序列编号30)
使用以下引物通过PCR得到的cDNA片段导入到pCXN2中，由此构建FLAC标记的Ganp变异体。
FLAG-Gp-5’：
5’-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGCAGTCTTCAACCGATACC-3’(序列编号31)
FLAG-Gp-3’：
5’-GGGAATTCCTCCGGGTCTCCCTCAAGTA-3’(序列编号32)
FLAG-Gsac5’：
5’-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3’(序列编号33)
FLAGGsac-3’：
5’-GGGAATTCGCTGTCTTGTTTCTAAGCCG-3’(序列编号34)FLAG-Gmap-5’：
5’-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGAGAACCTGGCCAAGGGTCT-3’(序列编号35)
FLAG-Gmap-3’：
5’-GGGAATTCTGAGGACTTGTAGATGTTTT-3’(序列编号36)
关于内部缺失变异体GpΔNLS-GFP以及13变异体(MCMΔNLS-HA)，按照文献中所介绍的方法进行制备(Imai，Y.等.，(1991)Nucl.Acids Res.19，2785-2785)。所有的构建体，通过确定核苷酸序列来确认其具有正确的方向以及作为带有标记的融合蛋白质表达时具有正确的密码阅读框。由此控制其品质。具有变异体RNA/DNA引物酶结构域(PD)的表达载体在文献中已有介绍(从Ser502到Ala[GpS502A]或Glu[GpS502E]的Gp变异体)(Kuwahara，K.等.，(2001).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，10279-10283)。
2.4.用共焦显微镜检查转基因产物
用FuGENE 6(Roche Diagnostics)，以pCXN2-ganp-gfp和/或pSRα-MCM3-HA转染NIH-3T3细胞。在进行固定的16小时之前，向培养的培养基中添加细霉素B(LMB；(Kudo，N.等.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，911 2-9117)，共转染时，使用兔抗HA抗体(SantaCruz)以及Alexa546结合山羊抗兔IgG抗体；当进行单独转染时，使用Alexa488结合山羊抗兔IgG抗体(Molecular Probes)，对外源MCM3蛋白质进行染色。核酸，在共转染实验中采用碘化TOTO-3；单独转染实验中采用碘化丙锭(PI；Sigma)进行对比染色。
2.5.GST引入测定
按照文献中所介绍的方法对GST融合蛋白质进行纯化(Kuwahara，K.等.，(2000)Blood 95，2321-2328)。对固定在谷胱甘肽-Sepharose微珠(Amersham)上的各种GST融合蛋白质(5μg)与使用TNE缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 7.8]、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Nonidet P-40、10μg抑肽酶、1mM苯基甲基-磺酰氟[PMSF]))制备的BAL17裂解物一起孵育。通过8％SDS-PAGE对结合蛋白质进行分离，转到硝酸纤维素过滤膜上，进行封闭。接着将滤膜与兔抗小鼠MCM3抗体(Kimura，H.等.，(1994)EMBO J.13，4311-4320)以及过氧化物酶标记蛋白质A(Amersham)进行连续孵育，最后采用ECL检测试剂盒(A mersham)，对信号进行可视化处理。为了直接对结合进行检测，使用[35S-甲硫氨酸](Amersham)，按照制造厂家的说明书使用体外转录以及翻译结合装置(Novagen)合成放射性标记MCM3，通过放射自显影术对[35S]-标记MCM3进行检测。
2.6.转基因产物的免疫沉淀及免疫印迹法
用FuGENE6，通过pCXN2-FLAG-ganp和/或pSRα-MCM3-HA对COS7进行转染。26小时后，使用TNE缓冲液对细胞进行裂解，对所得的裂解物和与蛋白质A-Sepharose(Amersham)组合的抗HA抗体一起进行孵育。通过8％SDS-PAGE对免疫沉淀物进行分离，转到硝酸纤维素过滤膜上，进行封闭。接下来，所述滤膜与抗小鼠FLAGM2抗体(Stratagene)一起进行孵育，接着与过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Zymed)一起进行孵育。为了检测Gp-GFP及其变异体，通过兔抗GFP抗体(Santa Cruz)以及过氧化物酶结合蛋白质A(Zymed)钓(probe)经印迹的过滤膜。
2.7.异核体检测
使用FuGENE6，通过pSRα-MCM3-HA对Hela细胞进行转染。20小时后，对转染的Hela细胞以及没有转染的小鼠Swiss-3T3细胞进行胰蛋白酶处理，以1∶1的比率同时接种到培养皿中。24小时后，在室温下，使用聚乙二醇1500(Roche diagnostics)对细胞进行2分钟融合(Schmidt-Zachmann，M.S.等.，(1993)Cell 74，493-540)。用培养基对培养皿进行4次清洗后，添加含有环己亚胺的培养基，(最终浓度为20μg/ml)，在CO2孵育箱中，于37℃下对细胞进行5小时孵育。接着在250mM HEPES-NaOH(pH 7.4)中，用4％多聚甲醛对细胞进行20分钟固定，使用0.5％Triton X-100的PBS溶液处理30分钟，使细胞具有渗透性，用PBS进行清洗。使用抗HA抗体(12CA5；Covence Researeh Products)以及Cy3结合驴抗小鼠Ig抗体(Jackson)对细胞进行染色，还使用100ng/ml Hoechst 33342(Sigma)的PBS溶液对DNA进行20分钟的对比染色。使用具备100xPlanNeofluar相位差物镜(NA1.3)以及SpotIICCD的Zeiss Axioplan收集图象。
3.结果与观察报告
3.1.GANP与MCM3的缔合
到此为止，通过共免疫沉淀证实了在B细胞系中的GANP与MCM3的相互作用(Kuwahara，K.等.，(2000)Blood 95，2321-2328)。由于GANP的C末端结构域和所有Map80蛋白质相同，所以可以预测GANP在该结构域与MCM3进行缔合。为了确定哪个区域直接与MCM3缔合，本发明者使用如图32中所示的具有各种截短的GANP蛋白的GST融合蛋白进行引入测定。使GST与图32所示的1至7以及被称为5-7’的截短的GANP的N末端融合。图33下图中被称为GANP5-7’的Map80结构域，如前所示(Kimura，H.等.，(1994)EMBOJ.13，4311-4320)、由细胞提取物对MCM3进行引入。
一个惊人的发现是GANP的部分片断即GANP1以及GANP2还可以引入MCM3(图33的上图以及下图)。
接着通过网织红细胞裂解物系统，采用在体外进行合成的MCM3对该结合进行了研究(图34)。GST-GANP1以及GST-GANP2，也可以由体外翻译“鸡尾酒混合物”引入了[35S]-MCM3。
单纯使用GST的阴性对照(第一道)，或与无关蛋白质进行融合的GST没有显示信号。并且与GST-GANP1的结合比与Map80区域(GST-GANP5-7’)的结合更强。该结合也可以通过使用用FLAG标记的构建体的DNA转染实验，在细胞中加以确认(图35)。
使COS7细胞与pCXN2-FLAG-Ganp、pCXN 2-FLAG-Gp以及pCXN2-FLAG-Gmap80，结合pSRα-MCM3-HA或pSRa-I3-HA进行其转染。经使用抗HA抗体的免疫沉淀后，用抗FLAG单克隆抗体进行免疫印迹。在各道中用三角表示FLAG标记蛋白质的预计大小。虽然左图和右图中的带的迁移是相同的，但是ECL检测的暴光时间，左图是1分钟，右图是3分钟(图35)。
FLAG-Ganp、FLAG-Gp以及FLAG-Gmap80与野生型MCM3-HA(对HA抗原表位标记的MCM3)结合(图35左图)。只有FLAG-Gsac没有结合。关于与I3变异体MCM3(MCM3ΔNLS)的结合，只有FLAG-Gmap80呈现阳性结果(图35；右图)。带有N末端NLS的Gp区域，在具有大量MCM3的细胞中，一直与MCM3缔合(图35；左图)。这些结果表明GAN P通过Gp区域与MCM3的NLS区域缔合。
本发明者还研究了Gp区域的Ser502的磷酸化状态是否对与MCM3结合有影响的问题。使缺失引物酶位点的Ganp变异体(GanpΔPD-GFP)以及作为GanpS502A或GanpS502E而制备的Ser502中的Ganp变异体与GFP融合(图36A)。与pCXN2-Ganp-gfp和pSRα-MCM3-HA共转染细胞，裂解液用于使用抗HA抗体的免疫沉淀。
通过抗GFP抗体可以检测出GFP信号(图36B；上图)，这意味着GANP已结合在MCM上。
同样也进行与Ganp-GFP变异体的共转染。为了确定各蛋白质的预想位置，在SDS-PAGE上对裂解液进行分离，同样用抗GFP抗体进行印迹(图36B；下图)。
非磷酸化性变异体(GanpS502A-GFP)与类似于野生型Ganp-GFP或磷酸丝氨酸的变异体(Ganp S502E-GFP)一样与MCM3结合(图36B；上图)。非常有意思的是GanpΔPD-GFP没有与MCM3-HA产生共沉淀(图36B；上图)。
与Map80区域的潜在结合活性无关，GANP分子作为整体对其与MCM3的结合而言，RNA引物酶区域(PD)是必要的。空白三角表示GanpΔPD-GFP的位置。用黑三角表示与Ganp S502A-GFP以及Ganp S502E-GFP大小相等的Ganp-GFP的大小(图36B；下图)。这些结果表明GANP与MCM3结合通过该PD区域，但是在Ser502部位的磷酸化不影响这一结合。
通过使用截短的构建体的实验，可以显示GANP与MCM3在广泛区域内的缔合。一般认为MCM3的NLS对于与GANP末端600个氨基酸区域相关的所有GANP结合，是必要的。缺失NLS的MCM3变异体在细胞中没有能够与所有GANP分子产生有效缔合。Map80区域与NLS阴性MCM3结合，这一情况表明GANP与MCM3的结合主要是和其与Map80相互作用中所必需区域以外的区域结合。虽然可以认为Map80是MCM3输入因子，但是也许GANP与MCM3同时起着不同的作用。可以认为GANP具有多个有潜在的磷酸化部位，并且在细胞中具有多个缔合成分(Kuwahara，K.等.，(2000)Blood 95，2321-2328)。因此必需明确指出该区的磷酸化状态对GANP/MCM3缔合以及细胞质与(细胞)核区域之间的输送调节有影响的区域。
3.2.由转染所显示的Map80和Ganp变异体在细胞内的定位
GANP有两个有潜在的NLS。一个在N末端引物酶区域内，另一个在C末端Map80区域内。同时GANP还具有两个核输出信号(NES)样基元。一个在与SAC3同源的结构域和Map80结构域之间，另一个在Map80结构域之内。
用pCXN2-Ganp-gfp或pCXN2-Gmap80-gfp对NIH-3T3细胞进行转染，48小时后进行固定。在进行固定的16小时之前添加LMB，用PI对核进行预染色，采用共焦显微镜采集图象。把代表性的表达特性表示在图37中。对具有不同特性的细胞进行计数，用百分数表示(图37)。
Ganp-GFP(用GFP进行标记的几乎GANP全长)，显示核显性表达(N以及N＞C；38％)或细胞质显性表达(C以及C＞N；31％)的细胞比例有变化(从总计500个细胞中任意计算数的％)，但是可以发现Ganp-GFP存在于细胞质以及核区域双方(图37；Ganp-GFP，LMB-)。而对照试样中大部分Gmap80-GFP可以在细胞质中找到，没有显示按照发明者分类的核显性表达(N＞C，0％；N＝C，35％；C和C＞N，65％)(图37；Gmap80-GFP，LMB-)。Ganp-GFP的定位不同于Gmap80-GFP的定位。
为了确认N末端NLS基元是否为功能性的，使带有RNA/DNA引物酶结构域以及N末端NLS(但是不含NES样基元)的5’1-kb DNA片段与GFP融合(图38，Gp-GFP)。该Gp-GFP产物只存在于核中(N以及N＞C，94％)(图38)。可以确认缺失NLS的变异体Gp-GFP(GPΔNLS-GFP；如图38所示缺失氨基酸497至500)是细胞质性的，N末端NLS与核定位有关系。
本发明者对邻接的Ser502向丙氨酸的突变(GpS502A-GFP；非磷酸化型)或向谷氨酸的突变(GpS502E-GFP；仿磷酸丝氨酸型)是否对该定位产生影响进行了研究(图38)。并且本发明者观察到这些突变不改变Gp的定位。这表明N末端NLS与Ser502的磷酸化状态无关，是功能性的(图38)。作为对照，可以认为既没有N末端NLS也没有C末端NLS的Gac-GFP大部分存在于细胞质之中(N以及N＞C，0％；N＝C，3％；C以及C＞N，97％)(图38)。
这些结果表明，在Ganp向核的移入过程中，N末端NLS具有功能性作用。但是，也许NLS不是那么强烈地维持GANP在核内的表达，因为Ganp-GFP也存在于细胞质之中(图37)。为了进一步对这个问题进行研究，为了抑制向通过Crml为媒介向核中输出，在cDNA转染后，用细霉素B(LMB)对细胞进行处理(Kudo，N.等.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，9112-9117)。
在用LMB处理的细胞中，在大部分转染子中，Ganp-GFP在核中进行定位(图37)。显示显性细胞质表达的细胞部分从31％减少到4％，而形成鲜明对比的是在核中显示显性表达的细胞从38％增加到81％。因此可以认为Ganp向细胞质中的迁移是受LMB抑制的。
Gmap80-GFP的定位在LMB处理后也有很大变化(图37)。也就是显示细胞质表达的细胞部分从65％减少到37％，显示显性核表达的细胞部分从0％增加到41％。在含有COS7以及Ltk-细胞的其它细胞体系中，也可以重现这些观察结果，表明GANP由核向细胞质的输出是通过依赖Crml的途径而进行调节的。因此可以认为GANP以及Map80在核与细胞质之间进行穿梭，并且它们的局布定位似乎依赖于与其它分子一起进行的向核中移入以及输出机制之间的平衡。
3.3.共转染细胞中MCM3以及GANP的定位
接着本发明者研究了GANP的迁移与MCM3表达是否相关的问题。哺乳动物的MCM3在细胞周期中使与染色质(或核杂质)之间的结合状态发生变化，但是在整个间期，它一直只存在于核中(Kimura，H.等(1994)EMBO J.13，4311-4320)。通过pSRα-MCM3-HA或pSRα-I3-HA对NIH-3T3细胞进行转染，固定，并用抗HA抗体(Alexa488)进行免疫标记，用PI进行染色。
转染的MCM3-HA与典型NLG的存在相吻合(Kimura，H.等.，(1994)EMBOJ.13，4311-4320、Takei，Y.等.，(1998)J.Biol.Chem，273，22177-22180)，在核中进行定位(图39)。该核定位依赖于MCM3的NLS。这是由于缺失该NLS的变异体MCM3(I3；MCM3ΔNLS-HA)只在细胞质中表达的缘故(图39；右图)。
通过pCXN2-Ganp-gfp或pCXN2-Gmap80-gfp以及pSRα-MCM3-HA对细胞进行共转染，固定，并用抗HA抗体(Alexa546)进行免疫标记，用TOTO-3对核进行前染色(图40)。把细胞数表示在图的下部(图40)。
非常有意思的是使用Ganp-GFP进行共转染时，给17％的细胞中带来了MCM3的细胞质定位(图40，用白箭头表示)。使用Gmap80-GFP或Gp-GFP的共转染中，观察不到这样的结果。
为了证明Gan p对MCM3的效果是特异的，在不同ganp-gfp构建体转染的前后，对核中出现的ECFP-Nuc的表达进行了研究。图41表示用Ganp-GFP进行转染的代表性图象(图41)。ECFP-Nuc在核中的定位不因使用Ganp-GFP(图41)或Gmap80-GFP或Gp-GFP的任意一种共转染而受影响。
Ganp以及MCM3的共表达还会造成GANP定位的变化。与单独使用Ganp-GFP(38％)以及单独使用Gmap80-GFP(0％)的转染(图37)相比，使用MCM3的共转染可以提高Ganp-GFP(74％)以及Gmap80-GFP(64％)的核表达水平(图40)。MCM3把GANP以及Map80保持在核内，但是只有Ganp过表达可以促进MCM3在细胞质中出现。(图40；由Ganp-GFP表达，17％)。另一方面，不能促进Gmap80 MCM3在细胞质中的表达(由Gmap80-GFP表达，4％)。MCM3在NLS中的突变(I3；MCM3ΔNLS-HA)(结果形成MCM3存在于细胞质中)没有导致Ganp-GFP或Gmap80-GFP向核中积蓄(图42)。
如果综合考虑I3变异体(MCM3ΔNLS-HA)不与Ganp或Gp进行缔合(图35)的事实，则表明与野生型MCM3不同，MCM3的NLS基元对于细胞中与GANP的功能性缔合以及核与细胞质之间的GANP输送是必要的。
DNA转染实验，当与MCM3一起导入时，显示Ganp-GFP积蓄在核区域之中，表明形成了核中的GANP/MCM3复合体。MCM3不含可以通过Crml进行识别的明显的共同NES样基元，因此MCM3从核中的输出可能是依赖于具有NES样基元的其它结合分子或不同的输出机理。一般认为GANP上的2个NES样基元参与了LMB感受态Crml依赖性输出途径(图37)。通过GANP带有的2个NES样基元(这些也许可以通过Crml进行识别)有可能参与了复合体的输送。
最近的研究表明，带有GANP相同区域的酵母SAC3参与了某种蛋白质的核输出，并且与核膜孔复合体成分进行缔合(Jones，A.L.等.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，3224-3229)。与GANP的共表达使得MCM3对细胞质区域的定位发生变化。
采用细胞融合方法，对MCM3在核-细胞质之间的穿梭进行了研究(Schmidt-Zachmann，M.S.等.，(1993)Cell 74，493-504)。最初用MCM3-HA对HeLa细胞进行转染，接着使其与没有进行转染的小鼠Swiss-3T3细胞进行融合。为了抑制蛋白质合成，在环己亚胺存在下，进行5小时孵育，然后对细胞进行固定，对MCM3-HA进行免疫标记。通过赫斯特(Hoechst)染色对异核体进行了研究。该染色是把具有“斑点(mottle)的”异染色质小鼠的核(箭头)与人HeLa核加以区别。
如图43中的代表性结果所示，在人和小鼠的核的双方，在异核体中都可以找到MCM3-HA。没有被融合的小鼠细胞不显示这样的染色。该结果表明MCM3-HA从HeLa核被输送到细胞质中，接着又被移入到小鼠核中。
从这些结果可以分析得出MCM3-HA是穿梭蛋白质的结论。通常要证实它以与转基因产物相同的灵敏度从内源性蛋白质核向细胞质的迁移往往是很困难的(Kimura，H.，Ohtomo，T.等.，(1996)Genes Cells 1，977-993、Mizuno，T.等.，(1999)Mol.Cell.Biol.19，7886-7896)。对于本实施中所示的结果，也是如此。要证实哺乳动物细胞中的内源性MCM蛋白质，以与在如酵母那样更原始的细胞内所达到的相同灵敏度，从核向细胞质的迁移也是很困难的。
但是，本发明者的研究结果(实验是通过DNA转染法进行的)表明在未操作细胞中MCM蛋白质在核-细胞质之间的穿梭恐怕是很重要的。要更简单地清楚了解在细胞周期进行中MCM复合体在核-细胞质之间的移动，也许还需要再发现其它成分。
3.4.细胞周期间的GANP定位
在RNA/DNA引物酶结构域GANP特有抗原表位(pSer502GANP)上，使用特异的单克隆抗体，通过共焦激光扫描显微镜检测研究了NIH-3T3细胞中的GANP定位(Kuwahara，K.等.，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，10279-10283)。用抗pSer502GANP(Alexa488；绿)以及抗MCM3(Alexa546；红)对处于细胞周期不同时期的NIH-3T3细胞进行免疫染色。用TOTO-3碘化物(蓝)对核进行前染色。在间期间，上述单克隆抗体在除核小体以外核内的所有位置全部进行反应(图44)。
通过使用对抗MCM3抗体以及核酸进行染色的TOTO-3的三重标记，详细分析了有丝分裂期间的GANP定位。可以认为随着细胞由前中期向中期进展，GANP从浓缩染色质上脱离(图44)。重叠图象的黄色信号表示GANP和MCM3的共定位，但是若干蓝染色表示在前中期图象的中心部位，即使是孤立的也仍然可以看得到GANP。在这个阶段，GAN P以及MCM3与浓缩的染色体不重叠。在中期的细胞中，在纺锤体区域可以检测出GANP。并且该信号在后期染色体分离到2个子细胞的过程中减少。
在减数分裂后期，至核形成为止(终期)在细胞质区域中可以看得到大部分GANP。这些结果表明GANP与MCM3的行为类似，二者在整个间期间内，几乎在核中进行共定位。这一情况与二者的相互缔合是一致的。但是如在有丝分裂期间，用共焦显微镜检测所示，GANP和MCM3也可以分别存在(图44)。
关于第2型RNA/DNA引物酶的核-细胞质间的GANP穿梭在生物学上的意义还有待于今后弄清。它也许与DNA修复最后阶段中RNA引物的生成有关联。在正常细胞中GANP的表达水平较低，但是在细胞急速增殖的发生中心，GANP表达得以上调(Kuwahara，K.等.，(2000)Blood 95，2321-2328、Kuwahara，K.等.，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，10279-10283)。另外GANP在具有快速细胞终期的某些种细胞中，还可以以更高的水平表达。这一情况表明与MCM复合体的缔合对刺激DNA复制的可能性(Kuwahara，K.等.，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，10279-10283)。RNA/DNA引物酶活性、MCM3结合能力以及具有乙酰基转移酶结构域(Takei，Y.等.，(2001)EMBO Rep.2，119-123)的GANP表达可能与细胞周期行进过程的调节有关。
序列表
序列编号5：引物
序列编号6：引物
序列编号7：引物
序列编号8：引物
序列编号9：引物
序列编号10：引物
序列编号11：引物
序列编号12：引物
序列编号13：引物
序列编号14：引物
序列编号15：引物
序列编号16：引物
序列编号17：引物
序列编号18：引物
序列编号19：引物
序列编号20：引物
序列编号21：引物
序列编号22：引物
序列编号23：引物
序列编号24：引物
序列编号25：引物
序列编号26：引物
序列编号27：引物
序列编号28：引物
序列编号29：引物
序列编号30：引物
序列编号31：引物
序列编号32：引物
序列编号33：引物
序列编号34：引物
序列编号35：引物
序列编号36：引物
产业上的实用性
通过使用本发明所得的过表达GANP小鼠，可以迅速制备过去不可能得到的对病毒抗原特异的、高亲和性的抗体。因此可以期待能足够迅速地获得特异的有效的抗体，以赶上病毒抗原的突变速度，从而防止由延误感染引起的病情恶化，如艾滋病和C型肝炎。同时通过本发明可以对应于来自感染患者的病毒抗原变异，制备特制的特异抗体。制备抗体所需要的免疫时间为10天左右即可，其中具有高亲和性变异的抗体的产生效率可提高到接近60％。还可以期待使用来自卧床患者试样的高亲合性抗体产生的方案成为替代疫苗疗法的新型免疫疗法。
序列表
Figure C20038010283200581
Figure C20038010283200591
Figure C20038010283200601
Figure C20038010283200611
Figure C20038010283200631
Figure C20038010283200641
Figure C20038010283200651
Figure C20038010283200661
Figure C20038010283200671
Figure C20038010283200691
Figure C20038010283200711
Figure C20038010283200721
Figure C20038010283200731
Figure C20038010283200741
Figure C20038010283200761
Figure C20038010283200771
Figure C20038010283200791
Figure C20038010283200801
Figure C20038010283200811
Figure C20038010283200821
Figure C20038010283200831
Figure C20038010283200841
Figure C20038010283200851
Figure C20038010283200861
Figure C20038010283200871
Figure C20038010283200881
Figure C20038010283200901
Figure C20038010283200911
Figure C20038010283200921
Figure C20038010283200931
Figure C20038010283200941
Figure C20038010283200951
Figure C20038010283200961
Figure C20038010283200971
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Claims (9)

1.高亲和性抗体的制备方法，其特征是对导入GANP基因的转基因非人哺乳动物或其子代施用抗原，从所得到的动物或子代中采集抗体。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中，抗体的亲合性为1×10-7M以下。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中，抗体是多克隆或单克隆抗体。
4.高亲和性人源化抗体的制备方法，包括：
(i)   对导入GANP基因的转基因小鼠或其子代施用抗原，
(ii)  从所得到的小鼠或其子代中采集抗体，和
(iii) 将小鼠抗体可变区域的CDR移植到人可变区域中。
5.根据权利要求4中所述的方法，其中，抗体的亲合性为1×10-7M以下。
6.高亲和性人抗体的制备方法，包括：对导入GANP基因的转基因非人哺乳动物或其子代施用抗原，其中待施用抗原的哺乳动物的免疫系统已更换为人的免疫系统；和从所得到的动物或子代中采集抗体。
7.根据权利要求6中所述的方法，其中，抗体的亲合性为1×10-7M以下。
8.含高亲和性抗体的医药组合物的制备方法，包括：(i)对导入GANP基因的转基因非人哺乳动物或其子代施用抗原，(ii)从所得到的动物或子代中采集抗体，和(iii)用一种或多种药学上允许使用的载体制备包含所得抗体的医药组合物。
9.高亲和性抗体产生细胞，它是从施用了抗原的、导入GANP基因的转基因非人哺乳动物或其子代中采集的。
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