KR20050049490A - Ｇａｎｐ 유전자 도입 트랜스제닉 포유동물 및 그 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은, 각종 질환의 진단약 및 치료약으로서 유효한 고친화성 항체, 그 항체를 생성하기 위한 트랜스제닉 포유동물, 그 고친화성 항체 또는 고친화성 항체 생성 세포를 사용한 약제를 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, GANP 유전자를 도입한 트랜스제닉 포유동물, 그 자손 또는 그들 일부, 그리고 그것을 사용한 고친화성 항체의 생성방법이 제공된다.

Description

ＧＡＮＰ 유전자 도입 트랜스제닉 포유동물 및 그 이용 {TRANSGENIC MAMMAL CARRYING GANP GENE TRANSFERRED THEREINTO AND UTILIZATION THEREOF}

본 발명은 GANP 유전자를 도입한 트랜스제닉 포유동물 및 그 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 GANP 를 고발현하여 고친화성 항체를 생성할 수 있는 트랜스제닉 포유동물, 그 트랜스제닉 포유동물을 사용하여 고친화성 항체를 생성하는 방법 및 얻어진 고친화성 항체의 이용에 관한 것이다.

면역계의 기능은 T 세포의 효과를 주로 하는 세포성 면역반응에 기초하는 기능과 항체의 효과를 주로 하는 체액성 면역에 기초하는 기능으로 분류된다. 실제로는, 이 양자의 기능은 협조하여 면역응답이 이루어진다. 항체는 골수에서 만들어지는 B 세포의 세포 표면 리셉터로서 표출되고 있다. 생체에서 형성되는 최초의 항체가 인식하는 항원의 다양성은 10⁹∼10¹¹ 개의 오더에 이른다고 하며, 그러한 항체 (항원 리셉터) 는 환경에 존재할 수 있는 모든 항원결정기를 인식한다. 그러나, 이 다양한 항원 리셉터는 항원에 대하여 결합하는 능력이 대체로 낮아 저친화성 항체가 생성되는 경우가 많으나, 이래서는 충분한 면역응답은 되지 않는다.

림프구, 특히 B 세포/면역글로불린 (항체) 은, 그 면역반응에 기초하는 각종 용도, 예를 들어 병원체 등의 항원검출을 위한 키트, 진단약, 치료약으로서 이용되고 있다. 이러한 항원검출약 또는 각종 질환치료약에서의 항체로서 항원에 대한 반응성이 높은 항체를 사용하면, 항원에 대한 감도가 우수하고 또한 동일 투여량에서의 치료약으로서의 성능이 우수하다. 그러나, 지금까지 항체의 친화성을 높이는 수단은 알려지지 않았다.

그런데, 생체는 병원체나 이물이 체내에 침입하면 그것들을 항원으로 인식하여, 말초의 림프조직에서 항원과 직접 결합하는 항체의 V 영역의 유전자에 고빈도의 체세포 돌연변이를 유도한다. 그 변화에는 T 세포의 자극을 필요로 하고 있으며, 배 중심 (Germinal center) 영역에서 활성화 T 세포로부터 자극을 받는다고 생각된다. 최근, 본 발명자들은 이 영역의 활성화 B 세포에서 선택적으로 발현이 상승되는 분자 GANP 를 찾아내었다 (국제공개 WO00/50611호). 이 분자는 DNA 로 리가아제 활성을 갖는 MCM (minichromosome maintenance) 라 불리는 분자와 직접 결합하고, 또한 RNA 프라이마제 활성을 갖는 점에서, DNA 복제에 관련되는 것이 시사되어 있다. 그러나, 면역계에서의 GANP 의 기능에 대해서는 해명되지 않았다.

도 1 은 항 GANP 모노클로날 항체 및 ALP 결합 항 래트 Ig 항체를 사용한 면역조직 화학분석의 결과를 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎛.

도 2 는 암컷 NZB 마우스 슬와의 림프절 중 GANP^hi 세포의 출현속도를 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎛.

도 3 은 암컷 NZB 마우스 비장 중 GANP^hi 세포의 출현속도를 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎛.

도 4 는 복수계통 마우스 유래의 비장 절편을 항 GANP 모노클로날 항체로 염색한 결과를 나타낸다. RP ; 적비수(赤脾髓), F ; 여포. 스케일 바는 100 ㎛.

도 5 는 비장의 적비수에서의 GANP^hi 세포의 동정을 나타낸다.

도 6 은 GANP^hi 세포에서의 형질세포 마커의 동정을 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎛.

도 7 은 TD-Ag 면역에 의한 C57BL/6 마우스 비장의 적비수 영역에서의 GANP^hi 세포의 발현을 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎛.

도 8A∼C 는 Daudi 세포에 마우스 GANP 를 안정적으로 발현시킨 트랜스펙턴트의 체세포 돌연변이를 나타낸다.

도 9A∼C 는 B 세포로 GANP 를 과잉 발현시킨 트랜스제닉 마우스 제작의 개요를 나타낸다.

도 10 은 GANP 과잉 발현 트랜스제닉 (Tg) 마우스 또는 야생형 마우스에서의 체세포 돌연변이를 해석한 결과를 나타낸다.

도 11A∼E 는 B 세포 특이적 GANP 결손 마우스 (B-GANP^-/-) 제작의 개요를 나타낸다.

도 12 는 B 세포 특이적 GANP 결손 마우스 (B-GANP^-/-) 를 사용한 세포 표면 염색의 결과 (플로우 사이토메트리) 를 나타낸다.

도 13 은 B 세포의 증식 분석 결과를 나타낸다. 거의 차이는 없었지만, 항 CD40 항체 자극에 의한 증식만 약 1/2 로 감소하고 있었다.

도 14 는 면역하지 않는 Cre-flox/+ 마우스 및 B-GANP^-/- 마우스 혈청 중의 항체가를 나타낸다. 각종 아이소타이프의 항체가에 차이는 없었다.

도 15 는 B-GANP^-/- 마우스에서의 항체 생성을 측정한 결과를 나타낸다.

도 16 은 GC 를 피넛 아글루티닌으로 염색한 결과를 나타낸다.

도 17 은 B-GANP^-/- 마우스에서의 항원 특이적 항체 생성을 측정한 결과를 나타낸다.

도 18 은 100 ㎍ 의 NP-CG 를 면역하여, 면역후 14 일 및 35일째의 친화성 성숙 정도를 디퍼런셜 ELISA 에 의해 측정한 결과를 나타낸다.

도 19 는 GC-B 세포의 플로우 사이토메트리 결과를 나타낸다.

도 20A∼F 는 Cre-flox/+ 의 V_H186.2 를 PCR 로 증폭하여 시퀀스 해석한 결과를 나타낸다 (A 에서 F 로 순서대로 계속된다).

도 20G∼L 은 Cre-flox/+ 의 V_H186.2 를 PCR 로 증폭하여 시퀀스 해석한 결과를 나타낸다 (G 에서 L 로 순서대로 계속된다).

도 21 은 Cre-flox/+ 및 B-GANP^-/- 마우스에서의 IgG1 변이 빈도를 나타낸다.

도 22 는 V_H186.2 의 33 번째 W 를 L 로 변이시켰을 때의 변이 빈도를 나타낸다.

도 23 은 활성화 유도 세포사 (AICD) 의 측정결과 및 아포토시스의 억제결과를 나타낸다.

도 24 는 항 CD40 및 항 CD95 자극에 대한 세포의 아포토시스 감수성을 측정한 결과를 나타낸다.

도 25 는 TUNEL 분석에 의해 아포토시스 세포를 검출한 결과를 나타낸다.

도 26 은 TUNEL 분석에 의해 아포토시스 세포를 검출한 결과를 나타낸다.

도 27 은 아포토시스 억제에 관여하는 Bcl-2 패밀리의 RNA 발현 레벨을 나타낸다.

도 28 은 GANP 트랜스제닉 마우스를 사용하여 고친화성 항체를 생성한 결과를 나타낸다.

도 29 는 GANP 트랜스제닉 마우스 유래의 하이브리도마 클론을 사용하여 고친화성 항체를 생성한 결과를 나타낸다.

도 30 은 GANP 트랜스제닉 마우스 유래의 하이브리도마 클론 배양 상청을 사용한 Biacore 에 의한 결합해리 곡선을 나타낸다.

도 31 은 GANP 트랜스제닉 마우스 유래의 하이브리도마 클론 배양 상청을 사용한 Biacore 에 의한 결합해리 곡선을 나타낸다.

도 32 는 GANP-GST 융합 단백질의 구조를 개략적으로 나타낸다.

도 33 은 MCM 과 직접 결합하는 GANP 의 영역을 결정하기 위한 풀다운 분석의 결과를 나타낸다. 왼쪽의 크기는 스탠다드 위치를 나타낸다.

도 34 는 in vitro 번역된 MCM 을 사용한 풀다운 분석의 결과를 나타낸다.

도 35 는 GANP 각 구축물과 MCM 의 결합을 면역침강에 의해 나타낸다.

도 36A∼B 는 GANP 각 구축물과 MCM 의 결합을 면역침강에 의해 나타낸다.

도 37 은 GANP 구축물 구조의 개요 및 구축물의 세포 내에서의 분포를 나타낸다.

도 38 은 GANP 구축물의 세포 내에서의 분포를 나타낸다.

도 39 는 MCM3 의 핵에서의 국재화를 나타낸다.

도 40 은 GANP 의 발현에 의해 유도되는 MCM3 의 세포질 국재화를 나타낸다.

도 41 은 핵에 국재하는 대조 단백질을 나타낸다.

도 42 는 MCM3 변이체의 국재화에서의 GANP 구축물의 효과를 나타낸다.

도 43 은 헤테로칼리온 분석에 의해 검출되는 MCM3 의 핵-세포질간 셔틀링을 나타낸다.

도 44 는 세포주기 동안의 GANP 의 국재화를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 GANP 유전자를 비인간 포유동물에게 도입하여 트랜스제닉 동물을 제작하고, 그러한 트랜스제닉 동물을 항원으로 면역하면 고친화성의 항체가 얻어진다는 지견에 기초하여 완성된 것이다.

1. GANP

GANP 는 배 중심 결합 핵단백질 (Germinal center-associated nuclear protein) 이라 불리며, 효모 Sac3 단백질과 호몰로지를 갖는 210kDa 의 핵단백질이다 (WO00/50611호). 그리고, SAC3 는 액틴 형성의 억제물질로서 특징지어져 있다. 또, GANP 는 여포 수상세포 (follicular dendritic cells : FDC) 에 의해 둘러싸이는 배 중심 (germinal center, GC) B 세포에서 선택적으로 업레귤레이트되고, 인산화 의존성 RNA-프라이마제 활성이 있으며, B 세포의 세포주기 조절에 관여하고 있는 단백질이다 (Kuwahara, K. 등, (2000) Blood 95, 2321-2328).

본 발명에서는, GANP 단백질의 아미노산 서열을 마우스에 대해 서열번호 2 로, 인간에 대해 서열번호 4 로 나타낸다. 또한, GANP 단백질을 코드하는 유전자 (GANP 유전자라 함) 의 염기 서열을 마우스에 대해 서열번호 1 로, 인간에 대해 서열번호 3 으로 나타낸다. 또, 상기 아미노산 서열 및 염기 서열은 국제공개 WO00/50611호에도 기재되어 있다.

또 GANP 단백질은 변이체이어도 되고, 서열번호 2 또는 4 에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열이며 RNA 프라이마제 활성을 갖는 단백질이어도 된다. 예를 들어, 서열번호 2 또는 4 로 나타내는 아미노산 서열 중 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개∼10 개, 더욱 바람직하게는 1 개∼5 개)) 의 아미노산이 결실되어 있고, 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개∼10 개, 더욱 바람직하게는 1 개∼5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있으며, 및/또는 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개∼10 개, 더욱 바람직하게는 1 개∼5 개)) 의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상기 GANP 단백질과 동일한 RNA 프라이마제 활성을 갖는 GANP 변이형 단백질을 사용할 수도 있다.

「RNA 프라이마제 활성」이란, RNA 복제에서 5'→3' 방향으로 진행하는 쇄의 신장과는 반대 방향인 쇄 (래깅쇄) 를 합성할 때, 신장의 개시점이 되는 짧은 프라이머의 RNA 를 합성하는 효소활성을 의미한다. 통상은 α프라이마제라 불리는 DNA 폴리메라아제 α와 결합하는 분자가 사용되지만, 배 중심 B 세포에서는 제 2 프라이마제인 GANP 프라이마제도 유도되어 있다.

GANP 단백질은, 상기 서열번호 2 또는 4 로 나타내는 아미노산 서열 또는 이들의 변이형 아미노산 서열 외에 N 말단측 일부의 서열 (예를 들어 서열번호 2 로 나타내는 아미노산 서열의 1∼600 번, 바람직하게는 139∼566 번) 또는 이들 변이형 아미노산 서열을 갖는 것도 포함된다.

본 발명에 있어서, 동물에 도입하기 위한 GANP 유전자는 상기 GANP 단백질, N 말단측 일부의 서열, 또는 변이형 단백질을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 그러한 유전자로서, 예를 들어 서열번호 1 또는 3 에 나타내는 염기 서열을 갖는 것을 사용할 수 있다. 서열번호 1 또는 3 에 나타내는 염기 서열 중 코드영역만의 염기 서열이어도 된다. 또, 상기 서열번호 1 또는 3 으로 나타내는 염기 서열에 상보적인 서열과, 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고 또 RNA 프라이마제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 사용하는 것도 가능하다.

「스트린젠트한 조건」이란 하이브리다이즈시킨 후 세정할 때의 조건이며 염(나트륨) 농도가 150∼900 mM 이고 온도가 55∼75℃, 바람직하게는 염(나트륨) 농도가 250∼450 mM 이고 온도가 68℃ 인 조건을 말한다.

유전자에 변이를 도입하기 위해서는, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지 수법에 의해, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등 : 다카라바이오사 제조) 를 사용하여 실시할 수 있다.

변이 유전자의 상세 및 취득방법은 국제공개 WO00/50611 호에도 기재되어 있다.

또, 항 μ항체 및 항 CD-40 모노클로날 항체로 B 세포를 in vitro 자극하면, GANP 발현의 업레귤레이션뿐만 아니라 GANP 단백질의 아미노산 서열 중 특정한 세린 잔기 (예를 들어 502 번째 세린 : S502) 의 인산화를 야기한다. 이 반응은 GANP 의 RNA-프라이마제 활성에 대해 키(key)가 되는 반응이다 (Kuwahara, K. 등 (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10279-10283). GANP 단백질의 N 말단측의 RNA-프라이마제 도메인은 세린 잔기를 함유하고 있고, 그 인산화는 in vitro 에서 Cdk2 에 의해 촉매된다. C 말단측 도메인에 의해 GANP 는 MCM3 복제 라이센싱 인자에 결합한다 (Kuwahara, K. 등, (2000) Blood 95, 2321-2328 ; Abe, E. 등 (2000) Gene 255, 219-227).

2. GANP 유전자를 도입한 트랜스제닉 포유동물

본 발명은 GANP 유전자를 도입한 트랜스제닉 포유동물에 관한 것으로, 그 트랜스제닉 포유동물은, 바람직하게는 도입한 GANP 유전자를 B 세포로 발현할 수 있다.

(1) GANP 유전자와 그 관련분자

GANP 유전자와 그 관련분자로 형성되는 복합체는, 유전자에 변이를 유도하는 프로세스에서 직접 및 간접적으로 필요한 분자이다. GANP 단백질은, 유전자 변이를 수복할 때 고친화성 항체가 얻어지도록 V 영역 변이의 유도를 촉진시키는 능력을 보유하고 있는 점에서, 본 발명의 트랜스제닉 포유동물은 이 GANP 유전자 또는 그 변이 유전자의 도입에 의해 획득성 면역의 고친화성 항체 생성을 촉진할 수 있다. 또, 이 유전자를 과잉하게 발현하는 트랜스제닉 비인간 포유동물은, 빠르게 항원에 대한 결합력이 높은 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 상기 트랜스제닉 비인간 포유동물을 소정 항원으로 면역함으로써 종래에서는 얻어지지 않은 고친화성 항체를 간편하게 얻을 수 있다. 그 결과, 난치성 병원미생물이나 이물을 배제할 수 있는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 트랜스제닉 포유동물을 사용하여 인간형화 항체를 제작함으로써, 또는 본 발명의 트랜스제닉 포유동물이 생성하는 항체의 V 영역을 포함하는 1 개 사슬 항체를 제작함으로써, 항체요법의 효력을 비약적으로 높이는 것이 가능해진다.

본 발명의 트랜스제닉 포유동물은 GANP 또는 그 변이 유전자의 도입에 의해 B 세포로 고친화성 항체의 생성을 촉진할 수 있어, 상기 고친화성 항체 생성세포는 아포토시스를 유도하는 시그널에 대하여 저항성을 갖는다.

본 발명자들은 GANP 가 획득 면역응답의 항체 생성에 기능하고 있는 분자임을 확인하기 위해, 먼저 GANP 유전자의 결손 마우스를 B 세포 선택적으로 결손시키도록 하여 제작하였다. 그 결과, GANP 유전자가 결손되더라도 면역계 세포의 발달, 분화, 증식에는 영향이 보이지 않고, 또한 항체의 생성총합에는 큰 변화는 보이지 않는 것이 판명되었다.

여기에서, 항원과 반응한 B 세포가 그대로 증식하여 항체 생성세포로 분화하는 것은, 어떤 종류의 항원의 경우에 한정되고 있으며, 통상적인 항원에 대한 항체 생성에 대해서는 T 세포의 공존을 필요로 한다. T 세포가 존재하지 않더라도 항체가 생성되는 항원을 T 세포 비의존성 항원이라 한다. 이에 반하여, T 세포 비의존성 항원 이외의 일반적인 항원을 T 세포 의존성 항원이라 한다. T 세포 의존성 항원의 경우는 B 세포의 항체 생성세포로의 분화가 헬퍼 T 세포에 의해 보조된다.

병원(病原) 바이러스의 항원결정기 (항원 에피토프라고도 함) 의 대부분은 그 자체가 면역원성이 약하며, T 세포에 의해 인식되는 캐리어 단백질의 펩티드 항원에 의해 활성화를 받는다.

본 발명에서는, 통상의 동물에서는 강력한 항체를 생성할 수 없는 가용성 항원에 대한 항체 생성응답에 대하여, GANP 유전자 도입 동물에서는 높은 빈도로 고친화성 항체를 생성할 수 있는 것을 조사하기 위하여, 합텐으로서 해석이 진행되고 있는 니트로페닐기 (NP 기) 를 닭-감마글로불린과 결합시켜 항원 (NP-CG 라 함) 을 제작하고 T 세포성 의존성 항원의 반응을 조사하였다.

여기에서, C57BL/6 마우스의 NP 에 대한 반응은 단일 V 영역에서 이루어진다고 알려져 있다. 이 반응은 항체의 IgG 중쇄의 V 영역 (V_H186.2 이라 함) 과 L 쇄 람다 1 유전자에 의해서만 형성되는 것이다. 이 시스템을 사용하면, 아이소타이프가 IgG₁ 인 항체에 대하여 V_H186.2 의 아미노산 서열을 조사함으로써 고친화성 항체의 유전자 변이를 조사하는 것이 가능하다. 게다가, 가장 강한 친화성은 중쇄 V 영역 (V_H186.2) 의 아미노산 서열 중 33 번째의 아미노산인 트립토판 (W) 이 류신 (L) 으로 변이 (W33-L) 하였을 때 생긴다고 보고되어 있다.

그래서 본 발명자는, GANP 유전자 결손 마우스로 W33-L 변이를 일으켰을 때 고친화성 항체가 생성되는지 아닌지를 조사하였다. 그 결과, 대조인 Cre-flox/+ 마우스에 비하여 고친화성 항체 생성은 거의 보이지 않았다. 따라서, GANP 유전자는 고친화성 항체를 생성하기 위한 중요한 기능을 갖는 유전자인 것이 판명되었다. 이것을 더 검증하기 위해, GANP 유전자를 과잉하게 발현하는 마우스를 제작하였다. GANP 유전자의 과잉 발현은 마우스 면역글로불린 프로모터 부분과 인간 면역글로불린 유전자 인트론 인핸서 부분을 GANP 유전자의 5' 측에 연결하여 B 세포로 선택적으로 발현시켜 실시하였다.

상기 GANP 과잉 발현 마우스도 정상으로 태어나 림프조직의 발달, 분화, 증식에는 변화가 보이지 않지만, NP-CG 에 대한 반응에서는 현저하게 고친화성형 V 영역 유전자 (W33-L) 가 증가하고 있었다. RNA 프라이마제 활성이 이 때 어떠한 기능적인 역할을 하는지에 대해서는 아직 확정되지 않았지만, (ⅰ) GANP 분자의 프라이마제 활성을 보는 지표가 되는 502 번째의 세린 잔기의 인산화가 배 중심의 고친화성 B 세포가 만들어내는 영역의 세포 (센트로사이트) 에 높은 점, (ⅱ) Daudi 세포로 ganp 유전자를 도입하는 실험에 의해 유도되는 V 영역의 돌연변이의 빈도가 높은 점에서, GANP 분자의 RNA 프라이마제 활성 또는 그것에 관한 502 번째의 세린 잔기의 인산화가 고친화성 항체 생성에 관련되고 있다고 생각된다. 이 결과는, GANP 분자를 고발현시키는 것 및 RNA 프라이마제 활성을 부활화 (賦活化) 시키는 것이 면역응답에 의한 고친화성 항체의 생성에 필요함을 나타내는 것이다.

(2) GANP 유전자 도입용 포유동물

본 발명에서의 「포유동물」이란, 소, 말, 돼지, 염소, 토끼, 개, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터 및 모르모트 등의 임의의 비인간 포유동물을 의미하고, 바람직하게는 마우스, 토끼, 래트 또는 햄스터이며, 특히 바람직하게는 마우스이다.

본 발명의 트랜스제닉 포유동물은 미수정란, 수정란, 정자 및 그 시원(始原)세포를 포함하는 배아세포 등에 대하여, 바람직하게는 비인간 포유동물의 발생에서의 배 발생의 단계 (더욱 바람직하게는 단세포 또는 수정란 세포의 단계이며 일반적으로 8 세포기 이전) 의 세포에 대하여, 인산칼슘법, 전기펄스법, 리포펙션법, 응집법, 마이크로인젝션법, 파티클건법, DEAE-덱스트란법 등에 의해 GANP 유전자를 도입함으로써 제작할 수 있다. 또, 상기 유전자 도입 방법에 의해 체세포, 생체의 장기, 조직세포 등에 목적으로 하는 GANP 유전자를 전이시켜 세포배양, 조직배양 등에 이용할 수도 있다. 그리고, 이들 세포를 상기 서술한 배아세포와 공지된 세포융합법에 의해 융합시킴으로써 트랜스제닉 포유동물을 제작할 수도 있다.

GANP 유전자를 대상동물에 도입할 때, 해당 유전자를 대상이 되는 동물의 세포로 발현시킬 수 있는 프로모터의 하류에 연결한 유전자 구축물로서 도입하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 목적으로 하는 GANP 유전자를 갖는 각종 포유동물 유래의 GANP 유전자를 발현시킬 수 있는 각종 프로모터의 하류에, GANP 유전자를 연결한 벡터를 대상이 되는 포유동물의 수정란 (예를 들어, 마우스 수정란) 에 마이크로인젝션함으로써, 목적으로 하는 GANP 유전자를 고발현하는 트랜스제닉 포유동물을 제작할 수 있다.

(3) 발현벡터

GANP 유전자의 발현벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드, 고초균 유래의 플라스미드, 효모 유래의 플라스미드, λ파지 등의 박테리오파지, 몰로니백혈병 바이러스 등의 레트로바이러스, 백시니아 바이러스 또는 바큐로 바이러스 등의 동물 또는 곤충 바이러스 등이 사용된다.

유전자 발현을 조절하는 프로모터로는, 예를 들어 바이러스 유래 유전자의 프로모터, 각종 포유동물 (인간, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 래트, 마우스 등) 및 조류 (닭 등) 유래 유전자의 프로모터 등을 사용하는 것이 가능하다.

바이러스 유래 유전자의 프로모터로는, 예를 들어 사이토메갈로 바이러스, 몰로니백혈병 바이러스, JC 바이러스, 유방암 바이러스 등 유래 유전자의 프로모터를 들 수 있다.

각종 포유동물 및 조류 유래 유전자의 프로모터로는, 예를 들어 알부민, 인슐린 Ⅱ, 에리트로포에틴, 엔도세린, 오스테오칼신, 근(筋)크레아틴키나아제, 혈소판 유래 성장인자 β, 케라틴 K1, K10 및 K14, 콜라겐Ⅰ형 및 Ⅱ형, 심방 나트륨 이뇨성 인자, 도파민 β-수산화효소, 내피 리셉터 티로신키나아제, 나트륨칼륨아데노신 3인산화 효소, 뉴로필라멘트 경쇄, 메탈로티오네인Ⅰ 및 ⅡA, 메탈로프로티나아제 1조직 인히비터, MHC 클래스Ⅰ항원, 평활근 α액틴, 폴리펩티드쇄 연장 인자 1α(EF-1α), β액틴, α 및 β미오신 중쇄, 미오신 경쇄 1 및 2, 미엘린 기초 단백, 혈청 아밀로이드 P 콤포넌트, 미오글로빈, 레닌 등의 유전자의 블록을 들 수 있다.

상기 벡터는, 트랜스제닉 포유동물에서 목적으로 하는 메신저 RNA 의 전사를 종결하는 터미네이터를 갖고 있어도 된다. 그 외에, GANP 유전자를 더욱 고발현시킬 목적으로, 각 유전자의 스플라이싱 시그널, 인핸서 영역, 진핵 생물 유전자의 인트론의 일부를 프로모터 영역의 5' 상류, 프로모터 영역과 번역 영역 사이 또는 번역 영역의 3' 하류에 연결하는 것도 원하는 바에 따라 가능하다.

본 발명의 바람직한 태양에서는, 면역글로불린 프로모터의 하류에 GANP 유전자를 연결함으로써, 또는 인간 면역글로불린 유전자 인트론 인핸서 부분을 GANP 유전자의 5' 측에 연결함으로써, GANP 유전자를 B 세포로 선택적으로 발현시킬 수 있다.

(4) GANP 유전자의 도입

수정란 세포 단계에서의 GANP 유전자의 도입은, 대상인 포유동물의 배아세포 및 체세포 전체에 과잉 존재하도록 확보하는 것이 바람직하다. 유전자 도입후 작출동물의 배아세포에서 GANP 유전자가 과잉하게 존재하는 것은, 작출동물의 자손이 모두 그 배아세포 및 체세포 전체에 GANP 유전자를 과잉하게 갖는 것을 의미한다. 그리고, 유전자를 이어받은 이 종의 동물의 자손은 그 배아세포 및 체세포 전체에 GANP 단백질을 과잉하게 갖는다.

본 발명에서는, 도입 유전자를 상동염색체의 일방에 갖는 헤테로 접합체를 취득하여 헤테로 접합체끼리 교배함으로써, 도입 유전자를 상동염색체의 양방에 갖는 호모 접합체를 취득하여 이 자웅의 동물을 교배함으로써, 모든 자손이 도입된 GANP 유전자를 안정적으로 유지한다. 그리고, GANP 유전자를 과잉하게 갖는 것을 확인하여 통상의 사육환경에서 번식계대할 수 있다.

트랜스제닉 대상 동물이 갖는 내재성 유전자와는 다른 유전자인 외래성 GANP 유전자를 대상 비인간 포유동물 (바람직하게는 마우스 등) 또는 그 선조의 수정란 (백크로스) 으로 전이할 때 사용되는 수정란은, 동종의 웅형 포유동물과 자형 포유동물을 교배시켜서 얻어진다.

수정란은 자연교배에 의해서도 얻어지지만, 자형 포유동물의 성주기를 인공적으로 조절한 후 웅형 포유동물과 교배시키는 방법이 바람직하다. 자형 포유동물의 성주기를 인공적으로 조절하는 방법으로는, 예를 들어 처음에 난포자극 호르몬 (임마 혈청성 성선자극 호르몬 (PMSG)), 이어서 황체형성 호르몬 (인간 섬모성 성선자극호르몬 (hCG)) 을, 예를 들어 복강주사 등에 의해 투여하는 방법이 바람직하다.

얻어진 수정란에 상기 서술한 방법에 의해 외래성 GANP 유전자를 도입한 후 자형 포유동물에 인공적으로 이식, 착상함으로써 외래성 유전자를 도입한 DNA 를 갖는 비인간 포유동물이 얻어진다. 자형 포유동물에 황체형성 호르몬 방출호르몬 (LHRH) 을 투여한 후, 웅형 포유동물과 교배시킴으로써 수정능이 야기된 위임신 자형 포유동물에 수정란을 인공적으로 이식-착상시키는 방법이 바람직하다. 유전자를 도입하는 전능성 세포로는, 마우스의 경우 수정란이나 초기 배를 사용할 수 있다. 또 배양세포에 유전자를 도입하는 방법으로는, 트랜스제닉 포유동물 개체의 산출효율이나 다음 세대로의 도입 유전자의 전달효율을 고려한 경우, DNA 의 마이크로인젝션이 바람직하다.

유전자를 주입한 수정란은, 다음에 대리모의 난관에 이식되어 개체로까지 발생하여 출생한 동물을 양모 곁에 두어 사육시킨 후, 몸의 일부 (마우스의 경우에는 예를 들어 꼬리 부분 선단) 에서 DNA 를 추출하여 서던 해석이나 PCR 법에 의해 도입 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 도입 유전자의 존재가 확인된 개체를 초대 (Founder) 라 하면, 도입 유전자는 그 자식 (F1) 의 50% 에 전달된다. 그리고, 이 F1 개체를 야생형 동물 또는 다른 F1 동물과 교배시킴으로써 2배체 염색체 중 일방 (헤테로 접합) 또는 양방 (호모 접합) 에 도입 유전자를 갖는 개체 (F2) 를 제작할 수 있다.

또는, GANP 단백질 고발현 트랜스제닉 포유동물은 상기한 GANP 유전자를 ES 세포 (embryonic stem cell) 에 도입함으로써 제작할 수도 있다. 예를 들어, 정상 마우스 배반포 (blastocyst) 에서 유래되는 HPRT 음성 (히포크산틴구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 유전자가 빠져 있음) ES 세포에 GANP 유전자를 도입한다. 그 GANP 유전자가 마우스 내재성 유전자 상에 상동 재조합을 일으켜, 인터그레이트된 ES 세포를 HAT 셀렉션법에 의해 선별한다. 이어서, 선별한 ES 세포를 다른 정상 마우스에서 취득한 수정란 (배반포) 에 마이크로인젝션한다. 얻어진 배반포를 대리모로서의 다른 정상 마우스의 자궁에 이식한다. 그 후, 대리모 마우스에서 키메라 트랜스제닉 마우스가 태어난다. 태어난 키메라 트랜스제닉 마우스를 정상 마우스와 교배시킴으로써 헤테로 트랜스제닉 마우스를 얻을 수 있다. 그리고, 헤테로 트랜스제닉 마우스끼리 교배함으로써 호모 트랜스제닉 마우스가 얻어진다.

본 발명에서는, 상기한 트랜스제닉 포유동물에 한정되지 않고 그 자손 및 트랜스제닉 포유동물 또는 그 자손의 일부도 본 발명의 범위 내이다. 트랜스제닉 포유동물의 일부로는 그 트랜스제닉 포유동물 또는 그 자손의 조직, 기관 및 세포 등을 들 수 있고, 기관 또는 조직으로는 비장, 흉선, 림프절, 골수 또는 편도선 등을 들 수 있으며, 세포로는 B 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 트랜스제닉 포유동물은 B 세포를 더욱 활성화하는 포유동물과 교배하는 것도 가능하고, 이로써 더 고친화성 항체를 생성하는 것이 가능하다.

최근, MRL/lpr 마우스에서 B 세포가 말초의 림프절에서의 활성화시에 배 중심을 경과한 후, T 세포영역에서 다시 V 영역의 돌연변이 유도가 항진되고 있다고 보고되어 있다. 또, 본 발명자들도 MRL/lpr 마우스에서 GANP 유전자가 Ig 프로모터, 인핸서의 하류에 결합하여 작성한 ganp 트랜스제닉 마우스에 나타나는 것과 동등한 높은 발현이 비면역 상태에서 나타나는 것을 알아내었다. 이것은, 정상에서는 자기 항원에 대해서는 고친화성 항체는 불가능한 데 반하여, 이 자기면역 질환 마우스에서는 GANP 분자의 이상한 활성화가 일어나기 때문에, 자기 항원에 대한 고친화성 항체가 생성되게 될 가능성이 시사된다.

그래서, 상기 B 세포를 더욱 활성화하는 동물로서, 자기면역 질환 마우스라 여겨지는 MRL/lpr, NZB, (NZB ×NZW) F1 등을 사용하면 더 높은 변이유도를 기대할 수 있다.

이상을 이용한 MLR/lpr 마우스의 GANP 트랜스제닉 마우스를 제작함으로써 수퍼 고친화성 항체 생성 마우스를 작출할 수 있는 가능성이 있다. 즉, 본 발명의 GANP 유전자 과잉 발현 트랜스제닉 포유동물과 여러 가지 자기면역 질환 모델 동물의 교배에 의해 고친화성 항체를 생성할 수 있는 포유동물을 제작할 수 있다.

3. 고친화성 항체의 제작

본 발명에서 말하는 항체란 항원과 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 단백질을 의미하며, 바람직하게는 B 세포가 생성하는 것이다. 본 발명에서는, 항원에 대한 반응성이 높은 항체인 것을 고친화성 항체라 한다. 「고친화성」이란 항체가 항원과 결합하는 결합능이 높은 것을 의미하며, 본 발명에서는 항체의 결합능이 일반 마우스 등의 동물을 사용하여 제작한 항체와 비교하여 높고, 또 반대로 그 항원에서 해리되는 것이 느린 항체를 말한다. 이것은, 항원결정기 (에피토프) 에 대하여 입체적으로 밀접하게 결합하는 능력이 높고 특이적인 것을 의미하는 동시에, 항체가 결합함으로써 항원결정기뿐만 아니라 그 항원의 구조 변환을 초래하게 되어 결과적으로 강력한 활성 (독성의 중화, 바이러스 등의 감염성 저지, 병원체의 불활성화, 생체 내에서의 배제 촉진, 항원분자의 변성을 일으키는 등, 생물활성을 나타내는 것) 을 나타내는 것도 포함하고 있다.

또, 항체의 결합능 (친화성) 은 스캐차드 해석이나 Biacore 라 불리는 표면 플라즈몬 공명센서에 의해 해리 상수 (KD), 해리속도 상수 (Kdiss), 결합속도 상수 (Kass) 로서 측정할 수 있다. Biacore 장치는, 센서 칩, 마이크로 유로계, SPR 검출계의 3가지 기술을 통합하여 분자결합의 강도, 속도, 선택성을 측정하는 것으로, 표식을 사용하지 않고 리얼 타임으로 생체분자의 검출과 복수 개의 분자간에서 상호 작용을 모니터링할 수 있다. Biacore 장치로는, 예를 들어 Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J, Biacore Q (모두 Biacore 사) 등을 들 수 있다.

상기 Biacore 에 의해, 항체의 친화성을 나타내는 파라미터, 즉 해리 상수 (KD), 해리속도 상수 (Kdiss)[1/Sec] 및 결합속도 상수 (Kass)[1/M.Sec] 를 측정한다.

항체는, 해리 상수 (KD 치) 가 작은 값일수록 친화성이 높다는 점에서 바람직하다. 항체의 결합능 (친화성) 은 Kdiss 및 Kass 의 2 가지 파라미터에 의해 결정되며,

KD[M] = Kdiss/Kass

에 의해 나타난다.

항원의 종류 등 복수의 요인에 따라 얻어지는 항체의 친화성은 다르지만, 일반적으로는 KD 치는 1 ×10^-7(M) 이하인 것이 바람직하고, 예를 들어 1 ×10^-8(M) 이하, 1 ×10^-10(M) 이하, 또는 1 ×10^-11(M) 이하인 것을 들 수 있다.

본 발명에서는, 제작된 항체가 상기 어느 하나의 작용 또는 성질을 발휘하는 항체일 때 「고친화성」이라고 판단된다.

항체분자의 친화성 항진은 항체유전자의 가변영역 (V 영역) 유전자로 체세포 돌연변이 (SHM) 가 유도됨으로써 생긴다. 항체의 항원에 대한 특이성은 항원을 생체에 면역한 당초부터 인정되지만, 초기 항체의 대부분은 IgM 클래스이고, 또한 항원에 대한 결합친화성은 높지는 않으며, 병원체나 이물을 제거하거나 불활화하는 능력은 낮다. 그러나, 항원을 생체에 투여하여 수 회의 추가면역을 하면 항체의 항원에 대한 결합친화성이 높아진다. 이 때, B 세포는 T 세포로부터의 자극이 필요하며, 말초 림프조직의 배 중심 영역에서 그 활성화가 이루어진다고 되어 있다. V 영역 유전자의 돌연변이 유도에 필요한 분자로는, 최근 배 중심에서 발현하는 RNA 에디팅 분자 AID 라고 보고되어 있다. 또한, 우라실 DNA 글리코시다아제, 또 DNA 복제에 필요한 DNA 폴리메라아제로서 미스가 생기기 쉬운 DNA 폴리머라아제 제타 (ζ) 와 아이오타 (ι) 가 관여하고 있는 것이 보고되어 있으나, 이들의 기능을 제어하는 분자는 아직 밝혀져 있지 않다. GANP 분자는 새로운 SHM 유도분자로서 그 기능이 밝혀진 것이며, 그 분자의 발현 상승이 SHM 유도에 중요한 열쇠를 쥐고 있다. 특히, 고친화성 항체를 생성하기 위해 중요한 것이 밝혀져 있다.

C57BL/6 마우스에 합텐-캐리어의 항원으로서 니트로페닐-닭 γ글로불린을 면역함으로써 유도되는 항체는, H 쇄는 V_H186.2 로커스를 사용하고, L 쇄는 λ1 이다. 이 때, 추가면역하여 얻어지는 항체는 IgG₁ 항체이고, 그 중 특히 결합친화성이 높은 항체의 V 영역 서열에 유도되는 돌연변이는 33 번째의 트립토판이 류신으로 변이한 것임이 알려져 있다. 본 명세서의 실시예에서는, 이 모델 시스템에서 높은 고친화성형의 V 영역 돌연변이가 유도되고 있고, 이것은 고친화성 항체가 유도된 것을 나타내는 분자 레벨에서의 분명한 증거라고 할 수 있다.

따라서, 상기 트랜스제닉 포유동물 또는 그 자손에게 항원을 투여하여 항체를 생성함으로써 고친화성 항체를 얻을 수 있다. 즉, GANP 단백질을 고발현시킨 동물에게 목적으로 하는 항원을 통상적인 방법에 의해 투여하여, 감작된 동물의 혈액 또는 비장 등의 조직 (이들 조직에 한정되지 않음) 의 림프구에서 고친화성 항체를 조제할 수 있다. 고친화성 항체는 폴리클로날 항체이어도 되고 모노클로날 항체이어도 된다.

폴리클로날 항체를 생성하는 방법으로는, 예를 들어 항원을 본 발명의 트랜스제닉 포유동물에 투여하여 면역하고, 면역된 포유동물로부터 혈액을 채취하고, 채취한 혈액에서 항체를 분리-정제함으로써 얻을 수 있다.

면역 감작 방법은 당업자에 공지이며, 예를 들어 항원을 1 회 이상 투여함으로써 사용할 수 있다.

항원의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 항원결정기로서의 입체구조를 가질 수 있는 물질 전부가 해당하며, 단백질, 효소, 펩티드, 당, 지질, DNA, RNA, 프리온 등의 모든 생체성분 외에 암 항원, 바이러스 항원, 유기, 무기 합성 항원 등 임의의 것을 사용할 수 있다.

항원투여는, 예를 들어 7∼30 일 간격으로 2∼3 회 투여하면 된다. 투여량은 1 회에, 예를 들어 항원 약 0.05∼2㎎ 정도로 할 수 있다. 투여경로도 특별히 한정되지 않고, 피하 투여, 피내 투여, 복막강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여 등을 적절히 선택할 수 있지만, 정맥내, 복막강내 또는 피하에 주사함으로써 투여하는 것이 바람직하다. 또, 항원은 적당한 완충액, 예를 들어 완전 프로인트 아주반트 또는 수산화알루미늄 등 통상 사용되는 아주반트를 함유하는 적당한 완충액에 용해하여 사용할 수 있지만, 투여경로나 조건 등에 따라 아주반트를 사용하지 않는 경우도 있다.

면역 감작한 포유동물을 일정기간 사육한 후, 포유동물의 혈청을 샘플링하여 항체가를 측정한다. 항체가가 상승했을 때, 예를 들어 100 ㎍∼1000㎍ 의 항원을 사용하여 추가면역을 실시할 수 있다. 최후의 투여로부터 1∼2 개월 후에 면역 감작한 포유동물로부터 혈액을 채취하여, 그 혈액을 단백질의 분리에 채용되는 각종 통상적인 방법, 예를 들어 원심분리, 황산암모늄 또는 폴리에틸렌글리콜을 사용한 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 등에 의해 폴리클로날 항혈청으로서 폴리클로날 항체를 얻을 수 있다.

모노클로날 항체를 생성하는 방법으로는 하이브리도마법을 들 수 있다. 먼저, 아주반트 중에 목적으로 하는 항원을 구성하는 펩티드를 현탁하고, 얻어지는 현탁액을 면역동물 (즉, 본 발명의 트랜스제닉 포유동물) 의 피하 또는 진피내에 투여한다. 항원의 종류는 상기와 마찬가지이다. 사용되는 아주반트로는 프로인트의 완전 아주반트, 프로인트의 불완전 아주반트, BCG, 트레할로스다이마이코레이트 (TDM), 리포다당 (LPS), 명반 아주반트, 실리카 아주반트 등을 들 수 있는데, 항체의 유도능 등의 관계로부터 프로인트의 완전 아주반트 (CFA) 와 프로인트의 불완전 아주반트 (IFA) 를 조합하여 사용하는 것이 바람직하다.

모노클로날 항체의 생성에 있어서, 면역동물은 항원의 초회 면역후, 다시 추가면역을 수 회 실시하여 적당한 일수가 경과한 후에 부분 채혈하여 항체가를 측정하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법으로 생성되는 항체는 고친화성 항체이기 때문에, 상기 면역은 초회만으로 충분할 가능성이 있다. 또, 항체가는 예를 들어 효소 이뮤노 분석 (이하 「ELISA」라 함) 법 등 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다.

이어서, 감작이 종료된 면역동물로부터 비장을 적출하여 B 세포를 얻는다. 이 때, 항원에 결합하는 B 세포를 얻는 것이 그 후의 스크리닝을 경감시킬 수 있는 점에서 바람직하다. 여기서 얻어지는 B 세포는 고친화성 항체 생성세포이고, 이것을 그대로 면역 부활제로서 사용할 수도 있다. 또, B 세포로부터 직접 V 영역 유전자를 얻어 그 V 영역의 체세포 돌연변이를 측정할 수도 있다.

이어서, B 세포를 통상적인 방법에 따라 미엘로머 세포와 융합시켜 항체 생성 하이브리도마를 제작한다. 예를 들어, 마우스의 경우에는 비장을 적출하고, 적출한 비장을 예를 들어 행크스의 평형 염 용액 (HBSS) 속에 두고 핀셋으로 세포를 밀어내어 비장 림프구 (B 세포) 를 얻는다. 얻어진 비장 림프구는 트리판블루 등의 염색액으로 염색해 생세포수를 카운트하고, 미엘로마 세포와 융합시켜 하이브리도마로 한다.

세포융합에 사용되는 미엘로마 세포는 특별히 한정되지 않으며, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, P3-X63.Ag8(X63), P3-X63.Ag8.U1(P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1(NSI), Sp2/0-Ag14(Sp2/0) 등을 들 수 있다. 미엘로마 세포의 선택에 있어서는, 항체 생성세포와의 적합성을 적절히 고려한다.

세포융합은, 혈청을 함유하지 않는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물세포 배양용 배지 속에서 1 ×10⁶∼1 ×10⁷ 개/㎖ 의 항체 생성세포와 2 ×10⁵∼2 ×10⁶개/㎖ 의 미엘로마 세포를 혼합하여 (항체 생성세포와 미엘로마 세포의 세포비 5 : 1 이 바람직함), 세포융합 촉진제 존재하에서 융합반응한다.

세포의 융합방법은, 센다이 바이러스법, 폴리에틸렌글리콜법, 프로토플라스트법 등 해당 분야에서 공지된 방법을 임의로 선택하여 사용할 수 있지만, 특히 폴리에틸렌글리콜법이 세포독성이 비교적 적고 융합조작도 간단하다는 이유에서 바람직하다. 세포융합 촉진제로서의 폴리에틸렌글리콜은 평균분자량 1000∼6000 달톤인 것을 사용할 수 있다. 또, 항체를 대량으로 만들어내고자 하는 경우는, 비닐피리딘 유도체로 자극한 항체 생성세포와 골수종 세포를 세포융합시킨 하이브리도마를 사용하는 것이 바람직하다.

얻어진 하이브리도마는, 통상적인 방법에 따라 HAT 배지 (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 함유 배지) 속에서 적당한 기간 배양하여 하이브리도마를 선택한다. 이어서, 목적으로 하는 항체 생성 하이브리도마의 스크리닝을 한 후 하이브리도마를 클로닝한다.

스크리닝법으로는, 공지된 항체 검출 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 ELISA 법, 라디오 이뮤노 분석 (이하 「RIA」라 함) 법, 플라크법, 응집반응법 등을 사용할 수 있다. 또한, 클로닝법으로는 해당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 한계희석법, 연한천법 및 FACS 법 등을 사용할 수 있다. 얻어진 하이브리도마는, 적당한 배양액 속에서 배양하거나 또는 하이브리도마와 적합성이 있는, 예를 들어 마우스 복강내에 투여한다. 이렇게 하여 얻어지는 배양액 중 또는 복수 중에서 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과, 친화 크로마토그래피 등에 의해 원하는 모노클로날 항체를 단리정제할 수 있다.

또, 상기한 항체의 단편 및 V 영역의 1 개 사슬 항체도 본 발명의 범위 내이다. 항체의 단편으로는, 상기 서술한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 일부분의 영역을 의미하며, 구체적으로는 F(ab')₂, Fab', Fab, Fv (항체 가변부), sFv, dsFv (디술피드 안정화 Fv) 또는 dAb (단일 도메인 항체) 등을 들 수 있다. 여기서, 「F(ab')₂」 및 「Fab'」란 이뮤노 글로불린 (모노클로날 항체) 을 각각 단백 분해효소인 펩신, 파파인 등으로 처리함으로써 제조되며, 힌지영역 중 2 개의 H 쇄 사이에 존재하는 디술피드 결합 전후에서 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들어, IgG 를 파파인으로 처리하면, 힌지영역 중 2 개의 H 쇄 사이에 존재하는 디술피드 결합의 상류에서 절단되어 V_L (L 쇄 가변영역) 과 C_L (L 쇄 정상영역) 으로 이루어지는 L 쇄 및 V_H (H 쇄 가변영역) 과 C_Hγ1 (H 쇄 정상영역 중 γ1 영역) 으로 이루어지는 H 쇄 프래그먼트가 C 말단영역에서 디술피드 결합에 의해 결합한 상동인 2 개의 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이들 2 개의 상동인 항체 프래그먼트를 각각 Fab' 이라 한다. 또 IgG 를 펩신으로 처리하면, 힌지영역 중 2 개의 H 쇄 사이에 존재하는 디술피드 결합의 하류에서 절단되어 상기 2 개의 Fab' 가 힌지영역에서 이어진 것보다 약간 큰 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이 항체 프래그먼트를 F(ab')₂ 라 한다. 1 개 사슬 항체는 V_L 과 V_H 를 링커로 연결한 구조이다.

본 발명의 고친화성 항체는 인간형화 항체나 인간 항체이어도 된다. 이들 항체는, 면역계를 인간의 것과 교체한 포유동물을 사용하고 그 포유동물을 면역하여 통상의 모노클로날 항체와 동일하게 직접 인간 항체를 제작할 수 있다.

인간형화 항체를 제작하는 경우는, 마우스 항체의 가변영역에서 상보성 결정영역 (complementarity determining region ; CDR) 을 인간 가변영역으로 이식하고, 프레임워크 영역 (FR) 은 인간 유래인 것을, CDR 는 마우스에서 유래된 것으로 이루어지는 재구성한 가변영역을 제작한다.

다음에, 이들 인간형화된 재구성 인간 가변영역을 인간 정상영역에 연결한다. 최종적으로 재구성된 인간형화 항체의 인간 이외의 아미노산 서열에서 연유되는 부분은 CDR 및 극히 일부의 FR 뿐이다. CDR 은 초가변아미노산 서열에 의해 구성되어 있고, 이들은 종특이적 배열을 나타내지 않기 때문에 마우스 CDR 을 갖는 인간형화 항체를 사용하는 것이 가능하다. 인간형화 항체의 제작법은, 당 분야에서 주지이다.

인간 항체는 일반적으로 V 영역의 항원결합부위, 즉 초가변영역 (Hyper Variable region) 에 대해서는 그 특이성과 결합친화성이 문제가 되지만, 구조적으로 어떤 동물로든 제작해도 상관없다 (마우스, 래트 등). 한편, V 영역의 그 밖의 부분이나 정상영역의 구조는 인간의 항체와 같은 구조로 되어 있는 것이 바람직하다. 인간에게 공통된 유전자 배열에 대해서는 유전자 공학적 수법에 의해 작성하는 방법이 확립되어 있다.

본 발명의 항체의 아이소타이프는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 IgG (IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄), IgM, IgA (IgA₁, IgA₂), IgD 또는 IgE 의 임의의 아이소타이프를 가질 수 있다.

4. 고친화성 항체의 이용

본 발명의 고친화성 항체는, 질환의 진단, 치료 또는 예방을 위한 약제로서 유용하다.

(1) 질환의 진단

본 발명의 항체를 사용한 각종 질환의 진단방법은, 각종 질환의 의심이 있는 피험자로부터 채취한 검체, 예를 들어 혈청 등과 본 발명의 항체를 항원항체 반응에 의해 결합시키고 결합한 항체량에 의해 검체 중의 목적으로 하는 항원의 양을 검출함으로써 실시한다. 항체량의 검출은, 공지된 면역학적 측정법에 따라 실시하면 되고, 예를 들어 면역침강법, 면역응집법, 표식 면역 측정법, 면역비롱법(네페로메트리), 면역비탁법 등을 이용할 수 있다. 특히 표식 면역 측정법이 간편하고 또한 고감도라는 점에서 바람직하다. 표식 면역 측정법에서는, 검체 중의 항체가는 표식 항체를 사용하여 직접 검출한 표식량으로 나타내는 것 외에, 이미 알려진 농도 또는 이미 알려진 항체가의 항체를 표준액으로 사용하여 상대적으로 나타내도 된다. 즉, 표준액과 검체를 동일한 측정계로 동시에 측정하여, 표준액의 값을 기준으로 하고 검체 중의 항체가를 상대적으로 나타낼 수 있다.

표식 면역 측정법으로는, 공지된 측정법, 예를 들어 ELISA 법, RIA 법, 형광 면역 측정법, 화학발광 면역 측정법 등을 임의로 이용할 수 있다. 사용하는 표식물질은 상기 측정법에 따라 효소, 방사성 동위체, 형광 화합물 및 화학발광 화합물 등을 적절히 선택하면 된다. 상기 효소로는, 예를 들어 퍼옥시다제, 알칼리포스파타아제, 산성포스파타아제, 글루코스옥시다제 등을 들 수 있다. 상기 표식물질은 아비딘-비오틴 복합체를 사용함으로써 표식물질의 검출감도를 향상시키는 것도 가능하다. 또한, 방사성 동위체로는 주로 ¹²⁵I 가, 형광 화합물로는 플루오레세인이소티오시아네이트 (FITC) 나 테트라메틸로더민이소티오시아네이트 (TRITC) 등을 들 수 있다. 화학발광 화합물로는, 로핀, 루미놀, 루시게닌 등을 들 수 있다. 상기 표식물질에 의한 항체의 표식은 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 이하, 표식항체를 사용한 표식 면역 측정법에 대해 설명한다.

표식 면역 측정법에 의해 각종 질환을 검출하는 방법으로는, 공지된 비경합 반응계 또는 경합 반응계를 이용하여 실시할 수 있다. 비경합 반응계에서는 고상(固相)이 필요하다 (고상법). 경합 반응계에서는 반드시 고상을 필요로 하지 않지만 (액상법), 고상을 이용하는 것이 측정조작이 간편해지기 때문에 바람직하다. 고상의 재질로는, 예를 들어 폴리스티렌, 나일론, 유리, 규소고무, 셀룰로오스 등을 들 수 있고, 고상의 형상으로는 구형, 웰형, 튜브형, 시트형 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않고, 표식 면역 측정법에 사용되는 공지된 것을 임의로 사용할 수 있다.

비경합 반응계의 경우, 측정조작은 검체 또는 본 발명의 항체를 고상화한 후 본 발명의 항체 또는 검체와 반응시키고, 이어서 미리 표식해 둔 항 면역글로불린 항체 (2 차 항체) 를 첨가하여 고상화된 검체와 반응하고 있는 항체와 반응시킨다. 이 2 차 항체의 표식에 의해, 검체에 결합한 항체량을 검출할 수 있다. 검출된 표식화 2 차 항체의 양은 검체 중 목적으로 하는 항원의 양과 정상관되기 때문에, 이로써 검체 중 목적으로 하는 항원의 양을 구할 수 있다.

경합 반응계에서는, 일정량의 항체에 대하여 검체와 일정량의 목적으로 하는 항원을 경합적으로 결합시킨다. 예를 들어, 검체를 고상화한 후에, 미리 목적으로 하는 항원을 첨가하여 반응시킨 본 발명의 항체와 반응시킨다. 다음에, 고상화된 검체와 반응한 항체를, 미리 표식해 둔 항 면역글로불린 항체 (2 차 항체) 와 반응시켜, 표식물질에 의해 항체의 양을 검출할 수 있다. 검출되는 표식량은 첨가된 목적으로 하는 항원의 양과 역상관한다. 그 밖의 경합 반응계로는, 본 발명의 항체를 고상화하고, 여기에 검체와 반응시킨 후, 미리 표식해 둔 목적으로 하는 항원을 반응시킨다. 검출되는 표식량은 항체와 결합한 검체 중의 GANP 단백질량과 역상관한다.

상기한 항원 또는 항체의 고상화법으로는, 물리적 흡착법, 공유 결합법, 이온 결합법, 가교법 등 공지된 방법을 사용할 수 있다. 특히, 물리적 흡착법이 간편하다는 점에서 바람직하다. 또한, 항 면역글로불린 항체 (2 차 항체) 로는, 예를 들어 항 IgG 항체, 항 IgM 항체 등을 사용할 수 있다. 이들 항체는 항체분자를 그대로 사용해도 되며, 또는 항체를 효소 처리하여 얻어지는 항원결합부위를 포함하는 항체 프래그먼트인 Fab, Fab', F(ab')₂ 를 사용해도 된다. 또한, 표식한 항 면역글로불린 항체 대신에 항체분자에 특이적인 친화성을 갖는 물질, 예를 들어 IgG 에 특이적인 친화성을 갖는 프로테인 A 등을 표식하여 사용해도 된다.

상기 표식 면역 측정법의 바람직한 예로서, 효소를 표식으로 한 면역측정법, ELISA 법을 들 수 있다. ELISA 법은, 예를 들어 96 웰 플레이트에 검체 또는 그 희석액을 넣고 4℃∼실온에서 하룻밤 또는 37℃ 에서 1∼3 시간 정도 정치하여 검출해야 할 GANP 단백질을 흡착시켜 고상화한다. 다음에, 본 발명의 항체를 반응시키고, 이어서 미리 효소를 결합시킨 항 면역글로불린 항체 (2 차 항체) 를 반응시킨다. 마지막에 효소와 반응하는 적당한 발색성 기질 (예를 들어, 효소가 포스파타아제인 경우는 p-니트로페닐인산 등) 을 첨가하여 이 발색에 의해 항체를 검출한다.

또, 본 발명의 고친화성 항체를 이용함으로써 각종 질환의 치료약의 약효를 평가할 수 있다. 본 발명의 고친화성 항체를 이용한 약효평가방법은, 각종 질환환자 또는 각종 질환 모델 동물에 약제를 투여한 후, 이들 생체 중 바이러스 등의 항원의 양을 본 발명의 항체를 사용해 검출하고 그 양을 비교함으로써, 생체 중 항원의 양을 통해 각종 질환의 치료약으로서의 약효를 평가할 수 있다.

본 발명의 고친화성 항체는 각종 질환 진단용 키트의 형태로 제공할 수 있다. 그 키트는, 본 발명의 진단방법이나 본 발명의 약효평가방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 키트는 이하의 (a) 및 (b) 에서 선택되는 적어도 하나 이상을 포함한다.

(a) 본 발명의 항체 또는 그 표식물

(b) 전항 (a) 에 기재된 항체 또는 그 표식물을 고정한 고상화 시약

여기에서, 항체의 표식물이란 효소, 방사성 동위체, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 의해 표식된 것을 의미한다.

또 본 발명의 키트에서의 항체 또는 이들 표식물을 고정하는 고상의 재질로는, 폴리스티렌, 나일론, 유리, 규소고무, 셀룰로오스 등을 들 수 있고, 고상의 형상으로는 구형, 웰형, 튜브형, 시트형 등을 들지만 이들에 한정되지는 않는다. 그 고상화 시약 대신에 고상과 고상화에 필요한 고상화 시약을 첨부한 것이어도 된다. 고상화 시약으로서, 예를 들어 물리적 흡착에 의한 고상화인 경우, 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6), 10 mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.5, 100 mM 염화나트륨 함유), PBS 등의 코팅액과, 추가로 필요에 따라 코팅액에 0.5% 의 젤라틴 등을 함유시킨 블로킹액을 들 수 있다.

또, 본 발명의 키트에서의 항체는, PBS 등에 용해시킨 상태 또는 겔에 결합시킨 상태 (이하, 「흡수용 겔」이라 함) 이어도 된다. 상기 흡수용 겔은 추가로 적량을, 배치법에 의한 흡수처리용으로 0.5∼2 ㎖ 정도의 마이크로 원침 튜브에 미리 패키징된 상태이어도 되고, 또는 칼럼법에 의한 흡수처리용으로 칼럼용량이 0.1∼5 ㎖ 인 미니칼럼에 미리 충전된 상태이어도 된다.

본 발명의 키트는, 상기한 구성요소 외에 본 발명의 검출을 실시하기 위한 다른 시약, 예를 들어 표식물이 효소 표식물인 경우는 효소기질 (발색성 기질 등), 효소기질 용해액, 효소반응 정지액, 또는 검체용 희석액 등을 함유하고 있어도 된다. 상기 검체용 희석액으로는, 예를 들어 PBS (생리적 인산 완충액, pH 7.4), 137 mM 염화나트륨 및 3 mM 염화칼륨을 포함하는 pH 7.4 또한 20 mM 의 트리스-염산 완충액 (이하, 「TBS」라 함), 0.05% Tween20, 0.1∼1% 의 BSA 를 함유시킨 PBS, 또는 TBS 등을 들 수 있다. 그 검체용 희석액은 검체 희석 이외에 예를 들어 항체의 희석 등에 사용해도 된다.

(2) 질환의 치료 또는 예방용 의약조성물

본 발명의 고친화성 항체는, 질환의 병원이 되는 항원의 활성을 중화시키는 작용을 갖는 것이면, 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약조성물로서 유용하다. 본 발명의 의약조성물은 본 발명의 고친화성 항체 또는 그 단편을 유효성분으로서 함유하며, 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약조성물의 형태로 제공하는 것이 바람직하다.

여기서 「약학적으로 허용될 수 있는 담체」란 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해보조제 또는 그 밖의 첨가제 등을 들 수 있다. 그러한 담체의 하나 이상을 사용함으로써 정제, 환제, 산제, 과립제, 주사제, 액제, 캡슐제, 트로키제, 엘릭시르제, 현탁제, 유제 또는 시럽제 등의 형태의 의약조성물을 조제할 수 있다. 이들 의약조성물은 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위한 그 밖의 형태로는, 하나 또는 그 이상의 활성물질을 포함하며, 통상적인 방법에 의해 처방되는 외용액제, 장용내 투여를 위한 좌제 및 페서리 등이 포함된다.

본 발명의 약제의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료효과, 투여방법, 처리시간 또는 그 약제에 함유되는 활성성분인 고친화성 항체의 종류 등에 따라 다르지만, 통상 성인 한 사람당 1 회에 10 ㎍ 에서 1000 ㎎, 바람직하게는 10 ㎍ 에서 100 ㎎ 의 범위로 투여할 수 있지만, 이 범위에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어 주사제의 경우에는, 예를 들어 생리식염수 또는 시판되는 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용되는 담체 중에 0.1 ㎍ 항체/㎖ 담체∼10 ㎎ 항체/㎖ 담체의 농도가 되도록 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다. 이렇게 하여 제조된 주사제는 처치를 필요로 하는 인간 환자에 대하여 1 회의 투여시에 1kg 체중당 1 ㎍∼100 ㎎ 의 비율로, 바람직하게는 50 ㎍∼50 ㎎ 의 비율로 1 일당 1 회∼수 회 투여할 수 있다. 투여의 형태로는, 정맥내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다. 또, 주사제는 경우에 따라 비수성 희석제 (예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알코올류 등), 현탁제 또는 유탁제로 하여 조제할 수도 있다. 그러한 주사제의 무균화는 박테리아 보류 필터를 통과시키는 여과 멸균, 살균제의 배합 또는 조사에 의해 사용할 수 있다. 주사제는 사용시 조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결건조법 등에 의해 무균의 고체조성물로 하고, 사용 전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.

5. 본 발명의 응용

본 발명자들은 B 세포 종양주에 GANP 의 과잉 발현을 유도한 뒤에 해석한 결과, B 세포 종양주는 GANP 유전자 도입에 의해 비약적인 V 영역 유전자의 체세포 돌연변이 유도효과를 갖는 것을 나타내었다. 이 효과는, GANP 의 RNA 프라이마제 활성에 필요한 502 번째 세린의 인산화가 일어나지 않는 변이 유전자를 사용한 경우에는 볼 수 없다는 점에서, V 영역 유전자의 체세포 돌연변이의 비약적인 유도에는 RNA 프라이마제 활성이 필요한 것을 나타내고 있다. 이 결과는, 임상적인 보조 면역 부활제로서 GANP 가 특이적 항체 생성의 증강효과를 갖는 것을 나타내는 것이다.

벡터로서 레트로바이러스 벡터를 사용하고, CD40, BAFF 등의 TNF 패밀리 분자를 통한 자극을 GANP 와 병용하는 것도 임상적인 보조 면역 부활 작용에 있어서 효과적이다. 또, 이 유전자 도입을 골수세포 레벨로 행함으로써 T 세포에서의 고친화성 결합의 유도도 기대할 수 있다. 에이즈, C 형 간염바이러스, 성인 T 세포백혈병, 광우병 등의 고친화성 항체가 얻어지지 않는 경우나 또는 얻어졌다고 해도 바로 항원의 변이가 일어나기 때문에 충분히 고친화성 항체의 생성을 지속할 수 없는 경우에는 이 유전자 도입은 우수한 효과를 발휘한다고 기대할 수 있다.

본 발명의 GANP 유전자 과잉 발현 포유동물은, 생물학연구 시약, 임상검사 시약 제작에 유효한 모노클로날 항체의 개발에 유효하다. 예를 들어, 특정한 시그널전달분자에 대한 모노클로날 항체를 기능 도메인이나 기능 모티브에 특이적으로, 그리고 결합력이 높은 고친화성 항체를 간편하게 제작하는 것은 매우 활용되는 범위가 넓다. 많은 항체는 그다지 많은 스크리닝을 하지 않기 때문에, 웨스턴 해석과 면역침강에 사용할 수 없는 경우가 있다. 이 경우, 본 발명의 트랜스제닉 포유동물을 이용하면 비교적 적은 클론의 항체로부터 고친화성 항체 생성세포를 단시간에 선별할 수 있어, 경비, 시간, 노동력을 삭감하는 효과는 크다. 특히 인산화 항체, 유전자 변이 부분에 대한 특이항체의 제작은 진단약 또는 항체를 사용한 약물의 선택적 주입법에 응용할 수 있다. 또 유전자의 배열이나 뉴클레오티드 부분에 선택적으로 결합하는 고친화성 항체의 생성도 가능해진다.

무기물, 탄수화물, 화학합성물 등 임의의 물질의 입체구조의 일부는 항원 모티브로서 인식된다. 종래에는 고친화성 항체는 얻어지지 않았지만, 자기면역 질환 마우스와의 교배로 제작되는 마우스는 모든 항원에 대하여 고친화성 항체를 얻기 위해 유효하다. 이 방법으로 결합력이 10^-11M 오더의 고친화성 항체가 만들어질 가능성이 있어, ELISA 법의 기술개발을 도입함으로써 미량물질의 검출을 간편하게 실시하는 기술을 개발하는 것이 가능하다.

또, 본 발명에 의하면 RNA 프라이마제 불활성형 GANP 유전자를 포함하는, 앨러지 질환 또는 자기면역 질환을 위한 유전자 치료제를 제공하는 것도 가능하다. 「RNA 프라이마제 불활성형 GANP 유전자」란 RNA 프라이마제 도메인 결손 또는 RNA 프라이마제 도메인이 변이한 유전자를 의미하며, 502 번째의 세린 잔기의 변이를 포함하는 근방의 유전자 변이에 의해 GANP 분자의 구조 및 기능적인 변화가 발생한 유전자를 의미한다.

본 발명의 유전자 치료제는, RNA 프라이마제 불활성형 GANP 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유전자 치료제에 사용하는 기제와 함께 배합함으로써 제조할 수 있다. 재조합 벡터의 구축시에 사용하는 벡터로는, 바이러스 벡터로서 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노수반바이러스 벡터, 바큐로바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터 등을 들 수 있고, 또는 동물발현용 플라스미드를 사용할 수도 있다. 벡터는 바람직하게는 바이러스 벡터이다. RNA 프라이마제 불활성형 GANP 유전자를 바이러스 벡터에 넣는 경우는, 재조합체 DNA 를 함유하는 바이러스 입자를 조제하여 유전자 치료제에 사용하는 기제와 함께 배합함으로써 유전자 치료제를 제조할 수 있다.

유전자 치료제에 사용하는 기제로는, 통상 주사제에 사용하는 기제를 사용할 수 있고, 예를 들어 증류수, 염화나트륨 또는 염화나트륨과 무기염과의 혼합물 등의 염 용액, 만니톨, 락토스, 덱스트란, 글루코스 등의 용액, 글리신, 알기닌 등의 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염 용액과 글루코스 용액과의 혼합용액 등을 들 수 있다. 또는, 당업자에 이미 알려진 통상적인 방법에 따라 이들 기제에 침투압 조정제, pH 조정제, 식물유 또는 계면활성제 등의 보조제를 사용하여 용액, 현탁액, 분산액으로서 주사제를 조제할 수도 있다. 이들 주사제는 분말화, 동결건조 등의 조작에 의해 사용시 용해용 제제로서 조제할 수도 있다.

본 발명의 유전자 치료제의 투여형태로는, 통상의 정맥내, 동맥내 등의 전신투여이어도 되고, 국소주사 또는 경구투여 등의 국소투여를 해도 된다. 본 발명의 유전자 치료제의 투여량은 연령, 성별, 증상, 투여경로, 투여회수, 제형에 따라 다르지만, 일반적으로 성인에게는 1 일당 재조합 유전자의 중량으로서 1 ㎍/kg 에서 1000 ㎎/kg 정도의 범위이고, 바람직하게는 10 ㎍/kg 에서 100 ㎎/kg 정도의 범위이다. 투여회수는 특별히 한정되지 않는다.

본 발명은 각종 질환의 진단약 및 치료약으로서 유효한 고친화성 항체, 그 항체를 생성하기 위한 트랜스제닉 포유동물, 그 고친화성 항체 또는 고친화성 항체 생성세포를 사용한 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, GANP 유전자를 도입한 트랜스제닉 동물을 제작하여 항원으로 면역하면 이 트랜스제닉 동물은 고친화성 항체를 생성할 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) GANP 유전자를 도입한 트랜스제닉 포유동물 또는 그 자손.

도입한 GANP 유전자는 B 세포로 발현할 수 있다. 또, 본 발명의 트랜스제닉 포유동물 또는 그 자손은 GANP 유전자를 트랜스펙트한 ES 세포에서 발생시키는 것이 가능하다. 포유동물로는 예를 들어 마우스를 들 수 있다.

(2) 상기 트랜스제닉 포유동물 또는 그 자손의 일부.

(3) 상기 트랜스제닉 포유동물 또는 그 자손에 항원을 투여하여, 얻어지는 동물 또는 자손에서 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 고친화성 항체의 제조방법.

(4) 상기 (3)에 기재된 방법에 의해 얻어지는 고친화성 항체 또는 그 단편.

본 발명의 항체는 친화성이 1 ×10^-7(M) 이하에서 나타나는 것이다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체이어도 되고 모노클로날 항체이어도 된다.

(5) 상기 항체 또는 그 단편의 V 영역을 포함하는, 인간형화 항체 또는 인간 항체 또는 그들의 단편.

(6) 상기 항체 또는 그 단편, 및 상기 인간형화 항체 또는 인간 항체 또는 그들의 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 함유하는 의약조성물.

(7) 항원을 투여한 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 포유동물 또는 그 자손에서 채취되는 고친화성 항체 생성세포.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 자기면역 질환 모델 동물에서의 GANP 의 발현과 그 기능

(재료 및 방법)

1. 동물

NZB, NZW, B/WF1, MRL/lpr 및 BXSB 마우스는 Japan SLC Co. 에서 구입하였다.

C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 Charles River Japan 에서 구입하였다. NOD 마우스는 오사카대학 대학원의 미야자키 박사로부터 제공받았다.

2. 항체 및 시약

마우스 B220 (RA3-6B2), 마우스 IgM (AM/3) 및 마우스 IgD (CS/15) 에 대한 래트 모노클로날 항체는 하이브리도마의 배양 상청에서 정제하여, D-비오틴-N-히드록시숙신이미드에스테르 (Roche diagnostics, Branchburg, NJ) 로 표식하였다. 비오틴 표식 래트 항마우스 Syndecan-1 및 항 마우스 CD5 모노클로날 항체는 구입하였다 (BD PharMingen, San Diego, CA). 비오틴 표식 피넛 아글루티닌 (PNA) 은 Vector Laboratories (Burlingame, CA) 에서 구입하였다.

3. 면역

트리니트로페닐-키홀 림펫 헤모시아닌 (Trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin (TNP-KLH)) 및 TNP-Ficoll 은 Biosearch Technologies (Novato, CA) 에서 구입하였다. 완전 프로인트 아주반트에 유화한 100 ㎍ 의 TNP-KLH 또는 PBS 중 25 ㎍ 의 TNP-Ficoll 을 마우스의 복강 내에 주입하였다. 14 일후, 림프기관을 취득하여 면역조직 분석용으로 OCT 화합물과 함께 동결하였다.

4. 면역조직분석

6 ㎛ 의 동결절편을 아세톤으로 5 분간 고정하고 PBS 중 3% BSA 에서 15 분간 블로킹하고, 래트 항 마우스 GANP 모노클로날 항체 (42-23) [Kuwahara K., 외, 2000, Blood 95 : 2321-2328] 또는 래트 항-pSer⁵⁰² GANP 모노클로날 항체 (PG/103) [Kuwahara K., 외, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 : 10279-10283] 와 함께 1 시간 인큐베이트하였다. 절편을 올린 슬라이드글래스를 PBS 로 수 회 세정하여 알칼리포스파타아제 (ALP)-결합 염소 항 래트 IgG 항체 (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) 와 함께 인큐베이트하였다. 발색은 Vector Blue kit (Vector) 를 사용하여 실시하였다. 이중 염색을 위해 반응은 비오틴 표식 항체와 양고추냉이퍼옥시다제 (HRP)-결합 스트렙토아비딘 (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 를 조합하여 실시하였다. 3-3'-디아미노벤지딘테트라히드로클로라이드 (DAB ; 도진가가쿠) 에 의한 발색후, 절편을 PBS 중 1% 글루탈알데히드로 1 분간 고정하였다. Aquatex (Merck, Darmstadt, Germany) 를 마운팅하기 위해 사용하였다. 인 비보로 증식활성이 있는 세포를 검출하기 위해 브로모데옥시우리딘 (BrdU) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO ; 1 ㎎/마우스) 을 도살하기 2시간 전에 정맥내에 주입하였다.

DNA 합성을 하는 세포를 항 BrdU 모노클로날 항체 (BD PharMingen) 와 ALP-결합 염소 항 마우스 Ig 항체 (Sigma) 를 조합하고 염색하여 Vector Red (Vector) 에 의해 발색시켜 검출하였다. PAS 염색은 이미 공지된 대로 실행하였다 [Jiang Y 외, 1997, J. Immunol. 158 : 992-997].

5. 결과

(1) MRL/lpr 마우스의 림프절에서의 GANP^hi 세포의 출현

GANP 발현은 자기면역 경향의 고활성 B 세포로 고발현하고 있다. 고레벨의 GANP 를 발현하는 림프세포 (GANP^hi 세포) 는 MRL/lpr 마우스의 말초 림프절에서 비면역상태에서 자발적으로 출현한다.

항 GANP 모노클로날 항체 및 ALP 결합 항 래트 Ig 항체를 사용하여 자기면역 질환 모델 MRL/lpr, NZB 및 정상 C57BL/6 암컷 마우스 유래의 슬와 림프절에 대해 면역조직 화학분석을 하였다.

결과를 도 1 에 나타낸다. Vector Blue (ALP 기질) 로 염색된 GANP^hi 세포는 7 주째에 MRL/lpr 마우스의 림프절에서 관찰된 것에 반하여, 같은 연령의 NZB 마우스에서는 관찰되지 않고, 40 주째에 출현하였다 (도 1). 정상 C57BL/6 마우스에서는 극소수의 GANP^hi 세포가 전기간을 통하여 관찰되었다.

자기면역 질환 모델 마우스는, C57BL/6 마우스와 비교하여 림프세포의 증가는 현저하고, 비면역조건 하에서는 GANP^hi 세포는 나타나지 않는다 (도 1). 그러한 GANP^hi 세포의 출현을 자라는 동안 조금씩 자기면역 상태를 야기하는 NZB 마우스의 림프절에서 조사하였다. 어린 NZB 마우스 (7 주령) 는 슬와 림프절에 GANP^hi 세포를 갖지 않지만, 자란 NZB (40 주령) 는 다수의 GANP^hi 세포를 가졌다.

GANP RNA 프라이마제 활성은 B 세포의 활성화와 분화에서 중요한 역할을 담당하고 있을 가능성이 있다. 그래서, NZB 마우스에서 항 pSer⁵⁰² 모노클로날 항체를 사용하여 RNA 프라이마제 활성의 중요한 인산화 부위인 Ser⁵⁰² 의 인산화 상태를 비교하였다.

NZB 마우스의 림프절 중 GANP 및 pSer⁵⁰² GANP 의 발현을 비교하였다. pSer⁵⁰² GANP 는 항 pSer⁵⁰² GANP (PG/103) 모노클로날 항체 (청색) 로 검출하여 전체 절편을 비오틴 표식 항 B220 모노클로날 항체로 염색한 후, HRP 결합 스트렙토아비딘과 DAB (갈색) 를 조합하여 검출하였다. 2회의 독립된 실험에서 대표적 데이터를 나타내었다 (도 2).

도 2 에 있어서, 하단의 도면 (그래프) 은 자라는 동안에 여포외 영역의 GANP^hi (흑색 막대) 및 pSer502 GANP^hi (사선 막대) 의 세포수를 나타낸다.

GANP 의 발현은 8 주째에 현저하고, GANP^hi 세포가 32 주까지의 전기간을 통하여 검출되었다 (도 2 ; 위 도면). 대조적으로, pSer⁵⁰²-양성세포는 8 주째에 최대였지만, 그 후 양성세포는 현저하게 감소하였다 (도 2 ; 가운데 도면). 피크 연령에 기초한 현미경 관찰에서의 반응성 세포수를 도면에 나타낸다 (도 2 ; 아래 도면). 이들 결과로부터, GANP 발현은 최초에 RNA 프라이마제 활성을 동반하지만, 이 활성은 장기간에 걸쳐서는 조절되지 않는 것을 알 수 있다.

(2) 자기면역 경향 마우스의 비장 적비수에서의 GANP^hi 세포의 자발적 출현

자기면역 경향 NZB 마우스의 슬와 림프절에서 검출된 GANP^hi 세포가 비면역상황 하의 비장에 출현하는지 어떤지를 조사하였다.

면역염색은 상기 (1) 의 조작 (도 2) 과 동일하게 실시하였다. 3 회의 독립된 실험으로부터의 대표적 데이터를 나타내었다 (도 3).

GANP^hi 세포는 4주째에 비장에 출현하며, 세포수는 12 주째에 최대치에 이르렀지만, 24주 후에 소실되었다 (도 3 ; 위 도면). pSer⁵⁰² GANP 의 발현도 8 주째와 12 주째에 검출되었다 (도 3 ; 가운데 도면). 적비수의 상대 세포수와 비교한 결과, 비장에 출현한 GANP^hi 세포는 12 주 후에는 말초 림프절로 이동하고 있는 것을 알았다. GANP^hi 의 증가는 자기면역 질환의 발증에 선행하는 자기항체의 생성량에 비례하고 있다 (도 2 및 도 3 ; Theofilopoulos A.N., 외, 1985, Adv. Immunol. 37 : 269-390).

GANP^hi 세포의 출현은 자기면역 경향 마우스에서의 B 세포의 이상과 관련되어 있을 가능성이 있기 때문에, 비면역조건 하에서 각종 자기면역 경향 마우스 (8 주령) 에서의 GANP^hi 세포의 출현을 조사하였다.

결과를 도 4 에 나타낸다. GANP^hi 세포는 MRL/lpr, NZB 및 B/WF1 의 적비수에서 현저하게 출현하였다.

GANP^hi 세포의 수는 SLE-모델 마우스의 BXSB 및 NOD 의 비장에는 그다지 증가하지 않았지만, 대조의 BALB/c 마우스 (도 4) 및 C57BL/6 마우스 (도 1) 과 비교하면 증가하고 있었다. 비장의 절편은, GC 양 구조로서 PNA⁺B 세포의 연상 또는 미숙의 회합을 나타내었다. GC 양 영역에서의 GANP 의 발현은 정상 C57BL/6 마우스 및 BALB/c 마우스에 T 세포 의존성 항원 (T cell-dependent Ags : TD-Ags) 을 면역함으로써 제작한 GC 에서의 GANP 의 발현과 비교하여 높지 않다. 그러나, GANP^hi 세포는 자기면역 경향 마우스의 적비수 영역에서 현저하게 출현하였다 (도 4).

또한, GANP^hi 세포집단을 림프계 세포의 마커 분석에 의해 해석하였다.

비오틴 표식 항 B220 모노클로날 항체, 비오틴 표식 항 Syndecan-1 모노클로날 항체, 비오틴 표식 항 IgM 모노클로날 항체 및 항 IgG 항체를 사용하여 NZB 마우스의 비장 절편에 대해 2 중 염색하여 GANP^hi 세포를 동정하였다.

결과를 도 5 에 나타낸다. 도 5 에 나타내는 패널의 좌측 열은 위에서 아래로 순서대로 비오틴 표식 항 IgM 모노클로날 항체, 항 IgG 항체, 비오틴 표식 항 B220 모노클로날 항체 및 비오틴 표식 항 Syndecan-1 모노클로날 항체를 사용하였을 때의 도면이다. 중앙 열은 상기 각각의 항체를 사용한 것과 동일한 절편에서의 GANP 의 발현을 나타낸다. 우측 열은 좌측 열과 중앙 열을 겹친 도면이다. 우측 열의 2 중으로 염색된 세포는 GANP^hi 세포가 B220-Syndecan1⁺IgM⁺ 인 것을 나타낸다. GANP 발현은 IgM, IgG 및 B200 인 경우는 적색으로 나타내고, Syndecan-1 인 경우는 녹색으로 나타낸다. 마커는 IgM, IgG 및 B200 은 녹색으로 나타내고, Syndecan-1 의 경우는 적색으로 나타낸다.

GANP^hi 세포는 B220-Syndecan-1⁺ 의 표현형을 발현하고, 다량의 IgM 을 세포 중에 발현한다 (도 5). CR1, Thy-1, GL-7, CD23 및 PNA 에 대해서는 음성이고, 이들 결과로부터 GANP^hi 세포가 B 계 세포의 후기 성숙단계, 아마도 형질세포인 것이 나타난다. 이 GANP^hi 세포가 증식성 형질 아세포인지 아닌지를 조사하기 위하여 NZB 마우스에 BrdU (1 ㎎/마우스) 를 투여 (정맥내 주입) 하고 인 비보로 BrdU 를 넣기 위해 2시간 인큐베이트하였다. 그 후, 마우스에서 비장 절편을 조제하였다.

절편을 항 GANP 모노클로날 항체 (청) 및 항 BrdU 모노클로날 항체 (적) 로 2 중 염색하였다. PAS 염색을 통상적인 방법에 따라 실시하였다.

결과를 도 6 에 나타낸다. GC 는 배 중심을 나타낸다 (왼쪽). GANP 단일 양성 GANP^hi 세포는 화살표로 나타내고, PAS 단일 양성 세포를 화살촉으로 나타낸다 (중앙).

또, 절편을 비오틴 표식 항 CD-5 모노클로날 항체로 염색하였다. PALS 영역은 림프절 동맥 주위 외장을 나타낸다 (오른쪽). 도 6 은 3 회의 독립된 실험으로부터 대표적 데이터를 나타내었다.

GANP^hi 세포는 BrdU 도입에 대하여 양성이 아닌 점에서 (도 6), 이들 세포는 증식성이 아니라 형질 아세포 단계보다 성숙되어 있는 것이 시사된다.

B-1 세포의 이상한 분화로서 Mott 세포 형성이 자기면역 경향 마우스에서 관찰된다. Mott 세포는 형질세포의 이상한 형태이고, 다량의 IgM 분자가 PAS 염색에 의해 세포질 내 Russell 소체로서 검출되는 조면 소포체 결합 소포에 축적되어 있다 [Jiang Y, 외, 1997, J. Immunol. 158 : 992-997]. GANP^hi 세포는 RAS-염색으로 염색되지 않으며 (도 6), 이로써 GANP^hi 세포를 B-1 세포 유래 형질세포의 Mott 세포와 구별할 수 있다. 비장 GANP^hi 집단은 CD5 발현이 음성이고 (도 6), NZB 마우스 (12 주) 에서 얻은 복막세포는 GANP^hi 세포에 대하여 음성이기 때문에, B-1 세포는 다량의 GANP 를 발현하지 않은 것이 나타난다. 이들 결과로부터, GANP^hi 세포는 자기면역 상태에서 고활성의 B 세포로 분류되고, 이 집단이 B-1 세포의 기원과는 다른 기원의 계통인 것이 시사된다.

(3) TD-Ag 에서의 면역에 의한 정상 마우스에서의 GANP^hi 세포의 유도

2 차 림프기관에서의 GANP^hi 형질세포의 출현이 자기면역 경향 마우스에 한정되어 있는지 어떤지 조사하였다.

암컷 C57BL/6 마우스 (7 주령) 를 TNP-Ficoll (TI-2-Ag) 또는 TNP-KLH (TD-Ag) 으로 복강내 면역하여 14 일 후에 비장을 얻었다. TNP-Ficoll 로 면역한 마우스는 비오틴 표식 항 IgD 모노클로날 항체로 대비 염색한 경우, GANP^hi 세포를 적비수 영역에서 나타내지 않았다 (도 7 좌측). TNP-KLH 로 면역한 마우스는 GANP^hi 세포의 유도를 적비수 영역에서 나타내었다 (도 7 우측). 도 7 에서 GANP^hi 세포는 화살표로 나타낸다. WP 는 백비수 영역을 나타낸다.

GANP^hi 형질세포 집단은, 수는 매우 적지만 TD-Ags 에 의한 면역에 의해 정상 C57BL/6 및 BALB/c 마우스의 비장에서도 유도된다 (도 7). T 세포 비의존성 Ag (T cell-independent Ag : TI-Ag) 에 의한 면역은 그러한 세포의 유도에서 효과는 작다. GANP^hi 세포집단은 B220^loIgM^hiIgD^loGL-7^loPNA^loCD5^loCD40^lo 와 동일한 표현형을 나타내었지만, Syndecan-1⁺ 를 나타내었다.

이들 결과로부터, 자기면역 경향 마우스에서의 GANP^hi 형질세포의 생성은 TD-Ag 에 대한 면역응답을 위해 제공되는 것과 동일한 자극에 의해 유도되는 것이 나타난다. GC 에서 증식과 분화를 거친 Ag 구동 B 세포는 GANP 를 발현하면서 보다 오랫동안 형질세포 단계로서 적비수 영역에 국재화되어 있을 가능성이 있다.

실시예 2 : GANP 의 과잉 발현

(방법)

1. Daudi 세포로의 안정적인 트랜스펙션

10 ㎍ 의 선상화한 pCXN-2 마우스 GANP 또는 GANPS/A502 cDNA 를 Daudi 세포에, Gene Pu1ser Ⅱ (Bio-Rad) 를 사용하여 일렉트로포레이션하였다. 48 시간 후, G418 (Promega ; 1 ㎎/㎖) 에 의해 선택을 개시하여 마우스 GANP 를 안정적으로 발현하는 Daudi 세포를 얻었다.

2. Daudi 트랜스펙턴트의 IgV_H 전사물의 분석

전체 RNA 를 전체 세포로부터 Trizol (Invitrogen) 을 사용하여 추출하였다. cDNA 를 이미 알려진 대로 취득하였다 (Kuwahara, K. 등, Blood 95, 2321-2328(2000)). LV_H3-CH₁C μ전사물을 이하의 프라이머 및 반응액을 사용하여 증폭시켰다. 증폭은 Pfu Turbo (Stratagene) 를 사용하였다.

5'-LV_H3 프라이머 : 5'-CTATAACCATGGACCATGGACATACTTTGTTCC-3' (서열번호 5)

3'-XbaI-C_H1-C μ프라이머 :

5'-TGCATGCATTCTAGAGTTGCCGTTGGGGTGCTGGAC-3' (서열번호 6)

반응액 조성 :

cDNA 0.5㎕

10x 완충액 2.5㎕

10 mM dNTP mix 0.5㎕

5'-LVH3 프라이머 (10 μM) 1㎕

3'-XbaI-CH1-Cμ 프라이머 (10 μM) 1㎕

Pfu Turbo 0.5㎕

dH₂O 19.5㎕

반응조건 :

94℃ 1 분

[94℃ 1 분 ; 62℃ 1 분 ; 72℃ 1 분] ×35사이클

72℃ 10 분

4℃

PCR 산물을 NcoI 및 XbaI 로 소화하여 겔로 정제하고, NcoI-XbaI 로 소화한 플라스미드와 라이게이션하였다. 콤피텐트 세균으로 형질전환한 후, QIAprep 키트 (QIAGEN) 를 사용하여 조제한 소량의 플라스미드 DNA 의 염기 서열을 자동 시퀀서 (Applied Biosystems) 에 의해 결정하였다.

3. GANP-트랜스제닉 (Tg) 마우스의 제작

도입 유전자는 pLG 벡터의 XhoI 사이트에 5.6kb 의 마우스 GANP 유전자를 도입하여 제작하였다. 이 벡터는 인간 면역글로불린 인트론 인핸서 영역 (2kb EcoRI 프래그먼트) 를 갖고, B 세포에서의 강력한 발현을 하는 특이적 벡터이다. 이 유전자를 직선화하여 마우스에 유전자를 도입하였다. 마우스 GANP 전체길이 cDNA 를 포함하는 선상화한 pLG vector (Koike, M. 등 Int. Immunol. 7, 21-30(1995)) 를 C57BL/6 마우스의 수정란에 마이크로인젝션하였다. 마우스 꼬리의 게놈 DNA 및 이하의 프라이머 및 반응액을 사용하여 도입 유전자의 존재에 대해 스크리닝하였다.

1-5' 프라이머 : 5'-TCCCGCCTTCCAGCT GTGAC-3' (서열번호 7)

1-3' 프라이머 : 5'-GTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3' (서열번호 8)

반응액 조성 :

DNA (50ng/㎕) 1㎕

10x 완충액 2.0㎕

2.5mM dNTP mix 2.0㎕

1-5' 프라이머 (10 μM) 0.8㎕

1-3' 프라이머 (10 μM) 0.8㎕

Z-Taq DNA 폴리머라제 0.1㎕

dH₂O 13.3㎕

반응조건 :

[98℃ 5 초 ; 59℃ 5 초 ; 72℃ 10 초] ×35사이클

4℃

4. RT-PCR

전체 RNA 는 비장 또는 비장 B 세포로부터 Trizol (Invitrogen) 을 사용하여 추출하고, RT-PCR 는 2 종의 프라이머 1-5' 및 1-3' 를 사용하여 실시하여 cDNA 를 합성하였다 (Kuwahara, K. 등, Blood 95, 2321-2328(2000)). GANP 전사물은 아갈로스겔 전기영동에 의해 검출하였다. β-액틴 전사물은 대조로서 사용하였다.

5. 결과

(1) Daudi 세포에 마우스 GANP 를 안정적으로 발현시킨 트랜스펙턴트의 V 영역 유전자의 체세포 돌연변이 (SHM)

GANP 유전자를 인 비트로로 SHM 의 분석에 사용되는 각종 인간 B 림프구 세포에 도입하였다 (Rogozin, I. B., 등, Nat. Immunol. 2, 530-536(2001) ; Kuwahara, K. 등 Blood 95, 2321-2328(2000) ; 및 Denepoux, S. 등, Immunity 6, 35-46(1997)). 대부분의 B 세포주에는 트랜스펙션할 수 없었지만, 유지 중에는 SHM 을 통상은 생성하지 않는 AID 를 발현하는 Daudi B 세포에는 GANP 유전자를 도입할 수 있었다.

이 클론은 야생형 및 위조 트랜스펙션한 세포와 비교하여 빈도가 높은 SHM (5×10^-4/bp) 을 V 영역에서 나타내었다.

V_H3-C_H1Cμ의 단편을 PCR 로 증폭하고 플라스미드에 서브클로닝하여 시퀀스하였다.

체세포 변이의 모식도를 도 8A∼C 에 나타낸다. 세로선 (「｜」) 은 사일런트 뮤테이션 (아미노산이 변하지 않음), 또 하나의 기호 (세로선에 표시를 한 것) 에는 아미노산이 치환되어 있는 변이를 나타낸다. Daudi/mock 에서는 거의 변이가 들어가 있지 않지만, Daudi/GANP-14, 15, 17, 21 의 4클론은 정도의 차이는 있지만 변이를 많이 인정한다. DNA 프라이마제 활성의 제어에 관계된 502 번째의 세린을 알라닌으로 치환한 변이체 (GANP S/A) 를 도입한 트랜스펙턴트에서는 변이가 들어가는 효율이 감소한다.

SHM 은 정상영역 유전자에는 유도되지 않았다 (도 8A∼C). GANP 의 RNA 프라이마제 활성은 S502 에서의 인산화에 의해 조절되고, 이것은 특이적 모노클로날 항체에 의해 검출할 수 있다 (Kuwahara, K. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283(2001)). 인 비트로 및 인 비보에서의 B 세포의 자극은 모두 S502 의 인산화를 유도하기 때문에 (Kuwahara, K. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283(2001)), 이 인산화가 Daudi B 세포에서의 SHM 의 생성에 관여하는지 어떤지를 조사하였다.

비인산화 GANP 변이체 (GANP-S502A) 를 도입한 경우 SHM 은 유발되지 않았기 때문에 (도 8A), S502 의 인산화가 GC-B 세포에서의 SHM 의 생성에 중요하다는 것이 시사되었다.

(2) B 세포로 GANP 를 과잉 발현시킨 트랜스제닉 마우스

면역응답에서의 GANP 의 관여를 조사하기 위해, 인간 Ig 인핸서 및 프로모터의 제어 하에서 마우스 GANP 를 과잉 발현시킨 GANP-트랜스제닉 (Tg) 마우스를 제작하였다 (도 9A 및 B). GANP mRNA 발현의 항진은 RT-CR 로 확인하였다.

이 마우스는, B 세포에서 GANP 발현의 증가를 보여 (도 9C), 골수, 비장 및 림프절 세포의 표층 마커 분석에서 B 계 세포의 통상적인 분화를 나타내었다.

SHM 에서의 GANP 의 인 비보에서의 역할을 조사하기 위해, TD-Ag 인 NP-CG 의 면역 후에서의 V_H186.2 영역에 대해 조사하였다. 즉, GANP 과잉 발현 트랜스제닉 (Tg) 마우스에게 50 ㎍ 의 NP-CG 를 2 주 걸러 3 회 면역하고 V_H186.2 를 PCR 로 증폭하여, 체세포 돌연변이를 해석하였다.

결과를 도 10 에 나타낸다. 변이의 수는 Tg 에서 약간 증가하고 있지만, 고친화성을 나타내는 33 번째의 W 가 L 로 변하는 변이 (SHM) 는 Tg 에서 약 3배로 증가하고 있었다. 또, CDR 은 상보쇄 결정영역을 나타낸다.

V_H186.2 로커스는, 고친화성 IgG (γ1λ1) NP-응답에 대하여 특유한 패턴의 SHM 을 나타낸다. NP-CG 에서의 면역 후에서의 전체비장 B 세포의 배열분석에 의해 야생형 마우스와 비교하여 GANP-Tg 마우스에서는 SHM 의 빈도가 약간 증가하고 있는 것이 나타난다 (도 10).

이 변이는, 합텐 특이적 B 세포의 친화성 성숙에 중요한 것이 이전에 나타나 있다 (Allen, D. 등, EMBO J. 1995-2001(1988)).

실시예 3 : B 세포 특이적 GANP 결손 마우스 (B-GANP^-/- 마우스) 의 제작

(방법)

1. CD19-Cre/+GANP flox 마우스의 수립

GANP 게놈 DNA 를 사용하여, 엑손Ⅱ 의 하류에 네오마이신 내성 유전자 (neo) 를 삽입함으로써 타게팅 벡터를 조제하였다. loxP 부위는 neo 의 3'측의 인접영역과 엑손Ⅰ 및 Ⅱ 사이의 인트론에 도입하였다.

즉, 엑손 Ⅱ 를 loxP 배열로 삽입한 flox 마우스를 제작하여, 이것과 CD19-Cre 마우스를 교배시키고, B 세포로 GANP 가 결손하는 마우스를 수립하였다 (도 11A 및 B).

직선화한 타게팅 벡터를 TT2 ES 세포 (Yagi, T. 등 Anal. Biochem. 214, 70-76(1993)) 에 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션하였다. G418 로 선택한 후, ES 콜로니를 주워 프로테나아제 K 와 함께 인큐베이트하였다. 상동 재조합체를 하기 neo2 프라이머 및 CGK3'-2 프라이머에 의해 스크리닝하였다.

neo2 프라이머 : 5'-GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT-3' (서열번호 9)

CGK3'-2 프라이머 : 5'-GGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3' (서열번호 10)

상동 재조합은 BamHI 로 소화한 ES 클론의 DNA 를 프로브 A 를 사용하여 서던 블롯 분석함으로써 확인하였다. 4kb 의 밴드를 나타내는 3개의 양성 클론을 사용하여 ICR 배반포에 대한 마이크로인젝션에 의해 키메라 초대 마우스를 제작하였다. 또, B 세포로 GANP 의 발현이 나타나지 않는 것은 서던 블로팅, RT-PCR 과 세포염색으로 확인하였다 (도 11C, D 및 E).

GANP flox/+ 마우스는 적어도 10회, C57BL/6 마우스로 되돌려 교배하였다. B 세포에서의 GANP 유전자를 결실시키기 위해, GANP-floxed 마우스와 CD19-Cre 노크 인 마우스 (Rickert, R. C., 등, Nucleic Acids Res. 25, 1317-1318 (1997)) 를 교배하였다.

2. FACS 분석

림프기관 유래의 단일세포 현탁물을 각 비오틴 표식 모노클로날 항체에 의해 빙상에서 1 시간 염색하였다. 염색 버퍼로 세정한 후, 세포를 FITC 결합 스트렙토아비딘 (Amersham Bioscience) 및 PE 결합 모노클로날 항체로 1 시간 인큐베이트하였다. 림프세포를 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 FACScan (Becton Dickinson) 에 의해 분석하였다.

3. B 세포의 정제

비장세포를 Cre-flox/+ 마우스 및 B-GANP^-/- 마우스 (7 에서 8 주령) 로부터 단리하고, 0.15M 염화암모늄 완충액으로 처리하여 적혈구를 제거하였다. 플라스틱 접시 위에서 37℃ 로 30 분간 인큐베이션한 후 미접착 세포를 림프구로서 회수하고, T 세포를 Dynabeads-anti-mouse Thy1.2 모노클로날 항체 (Dynal) 를 첨부한 프로토콜에 따라 사용하여 제거하였다. B 세포의 순도 (90% 이상) 를 FITC 결합 항 B220 모노클로날 항체 (BD Pharmingen) 를 사용한 세포 표층 염색에 의해 확인하였다.

4. 인 비트로 증식 분석

정제한 B 세포를 10% 열 부동화 FCS (JRH Biosciences), 2 mM 의 L-글루타민 및 5×10^-5M 의 2-메르캅토에탄올을 포함하는 RPMI-1640 배지 (분열촉진제를 포함하는 것과 포함하지 않는 것) 중에서 96 웰 마이크로타이터 플레이트에서 2×10⁵세포/웰로 48 시간 인큐베이트하였다. 세포를, 0.2 μCi/웰의 [³H]-티미딘(ICN) 로 16시간 펄스하고 나서 회수하고, 도입된 방사활성을 신틸레이션(scintillation) 카운터로 측정하였다.

분열촉진제는, 친화 정제한 염소 항 마우스 μ쇄 특이적 항체 (10 ㎍/㎖)[F(ab')₂](ICN), 래트 항 마우스 CD40 모노클로날 항체 (LB429 ; 10 ㎍/㎖) 및 LPS (Sigma ; 10 ㎍/㎖) 를 사용하였다.

5. 항원 및 면역

TNP-KLH, TNP-Ficoll 및 니트로페닐-닭 γ 글로불린 (NP-CG) (23:1) 은 Biosearch Technologies 에서 구입하였다. 50 ㎍ 의 TNP-KLH 및 NP-CG (알루미늄으로 침전) 또는 25 ㎍ 의 TNP-Ficoll (PBS 에 용해) 를 Cre-flox/+ 마우스 및 B-GANP^-/- 마우스의 복강내에 주입하였다.

6. 항원 특이적 항체 생성의 측정

항원 투여 10 일 후와 14 일 후에, 면역한 마우스로부터 혈청을 회수하였다. 5 ㎍/웰의 TNP-BSA (Biosearch Technology) 를 ELISA 플레이트에 피복하였다. 각 웰을 PBS 중의 3% BSA 로 블로킹하여, 단계 희석한 혈청과 인큐베이트하였다. PBS-0.1% Tween20 으로 세정후, 웰을 비오틴 결합 isotype 특이적 모노클로날 항체 및 알칼리포스파타아제(ALP) 결합 스트렙토아비딘 (Southern Biotechnology) 과 함께 인큐베이트하였다. 발색은 기질의 존재 하에서 실시하였다.

혈청 중의 NP 결합 항체의 친화성을 구하기 위해, NP2 결합항체의 NP25 결합항체에 대한 비율을, 피복항원에 NP2-BSA (1 분자당 2 개의 NP 가 BSA 에 결합한 것) 및 NP25-BSA (1 분자당 25 개의 NP 가 BSA 에 결합한 것) (Biosearch Technology) 를 사용한 디퍼런셜 ELISA 에 의해 계산하였다.

7. 면역조직화학

면역한 마우스에서 채취한 8 ㎛ 의 비장절편을 아세톤으로 가볍게 고정하였다. 샘플을 PBS-Tween20 중 3% BSA 로 블록하여, 항 IgD 모노클로날 항체 및 ALP-결합 항 래트 IgG (ICN) 항체와 함께 인큐베이트하였다. 제 1 발색은 Vector Blue 키트 (Vector) 를 사용하여 실시하였다. 제 2 발색은 샘플을 비오틴 결합 피넛 아글루티닌 (PNA) (Vecor) 및 양고추냉이퍼옥시다제 결합 스트렙토아미딘 (Kirkegaard & Perry) 과 함께 인큐베이트하고, 다음에 3,3'-디아미노벤지딘테트라염산염 (Dojindo) 과 동시에 인큐베이트하였다. PBS 중 1% 글루탈알데히드를 사용하여 샘플을 고정한 후, Aquatex (Merck) 에 의해 마운팅하였다.

8. V_H186.2 유전자의 배열분석

NP-CG 로 면역한 Cre-flox/⁺ 및 B-GANP^-/- 마우스로부터의 NP-결합 IgG1^dullCD38^low B 세포를 (4-히드록시-5-요오드-3-니트로페닐)아세틸 (NIP) 을 사용하여 FACS Vantage (Becton Dickinson Biosciences) 로 분획하고 프로테나아제 K 와 함께 37℃ 에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 라이세이트를 사용하여 PCR 을 기보와 같이 (Takahashi, Y, 등 Immunity 14, 181-192(2001)) 2회 실시하였다. V_H186.2 유전자 DNA 를 pBluescript 에 라이게이션하여 자동 시퀀서에 의해 배열을 결정하였다.

9. 아포토시스 세포의 검출

Cre-flox/+ 및 B-GANP-/- 마우스로부터 정제한 B 세포를 40시간 여러 가지 시약으로 자극하였다 (Watanabe, N. 등 (1998) Scand. J. Immunol. 47, 541-547). AICD 에는 24웰 플레이트에 항 μ항체 (50 ㎍/㎖) 를 고정하였다. 그 외의 경우에는 정제한 B 세포를 여러 가지 자극물질로 48 시간 자극하고, 계속하여 항 Fas 모노클로날 항체 (Jo2 ; BD Pharmingen) 로 4시간 인큐베이트하였다 (Wang, J. 등 (1996) J. Exp. Med. 184, 831-838). 세포를, 프로피디움아이오다이드 (PI) 용액 (50 ㎍/㎖ PI, 0.1% Triton X-100, 0.1% 시트르산나트륨) 을 사용하여 실온에서 1 시간 인큐베이트하고, 아포토시스 세포 (%) 를 FACScan 으로 G1 이하 영역으로 하여 계산하였다. 또, 아포토시스 세포는 트리판 블루에 의한 염색 후 현미경 하에서 확인도 하였다.

10. TUNEL 분석

Cre-flox/+ 및 B-GANP-/- 마우스를 SRBC (양 적혈구 세포) 로 면역한 후, 각각의 비장절편을 조제하여 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 동결절편을 고정하였다. 절편 샘플을 MEBSTAIN Apoptosis Kit Ⅱ(MBL) 로 처리하여 PI 로 대비염색하였다. TdT 매개 dUTP-비오틴 닉-엔드 표식 (TUNEL) 분석과 함께 실시하는 실험용으로, 절편은 항 IgG₁ 모노클로날 항체 (BD Pharmingen) 및 Alexa546-결합 염소 항 래트 IgG 항체 (Molecular Probes) 를 사용한 염색도 실시하였다. 양성 시그널을 검출하여 결과를 형광 현미경 (BX51 ; 올림푸스) 에 의해 확인하였다.

11. 결과

(1) RNA 프라이마제 GANP 의 역할

RNA 프라이마제 GANP 의 역할을 조사하기 위해, Cre-loxP 시스템을 사용하여 CD19⁺ B 세포로 하여 GANP 유전자를 결실시킨 B-GANP^-/- 마우스를 제작하였다 (도 11A 및 B). B-GANP^-/- 마우스 유전자는 엑손 Ⅱ 가 거의 결손되어 있었다 (도 11C). B-GANP^-/- 세포는 GANP mRNA 를 발현하지 않고 (도 11D), 또 면역염색에 의하면 단백질을 거의 발현하지 않았다 (도 11E). B-GANP^-/- 마우스는 정상으로 육성하여 골수, 비장, 흉선, 림프절에서 정상인 수의 림프세포를 나타내었다. 플로우 사이토메트리 분석에서는, B-GANP^-/- 는 골수, 비장 및 림프절의 세포 상에 대조인 Cre-flox/+ 마우스와 동일한 표면 마커 프로파일을 나타내어 (도 12), Cre-flox/+ (대조) 와 차이는 없었다.

B-GANP^-/- 림프절에서는, sIgM^lowsIgD^high 를 발현하는 성숙 B 세포 (IgM⁺IgD⁺) 의 수가 감소하고 있었다. B-GANP^-/- 마우스 유래의 B 세포는 인 비트로로 항 μ항체, 항 μ항체 + 항 CD40 모노클로날 항체, 또는 리포다당에 의한 자극후에 통상의 증식응답을 나타내었다 (도 13 : B-GANP^-/- 는 백색 막대, Cre-flox/+ 는 흑색 막대). 한편, B-GANP^-/- 마우스 유래의 B 세포는 항 CD40 모노클로날 항체 (5, 10 ㎍/㎖) 에 의한 자극후에 증식활성이 저하되었다 (도 13). 이것은, B-GANP^-/- 마우스의 B 세포의 증식에서는 CD40/CD145 상호작용에 대한 반응이 약간 손상되어 있음을 나타낸다. 혈청 Ig 량은 Cre-flox/+ 마우스와 동일하였다 (도 14).

(2) B-GANP^-/- 마우스에서의 항원 특이적 항체 생성

TI-Ag 및 TD-Ag 에 의한 면역후의 B-GANP^-/- 마우스의 면역응답을 조사하였다. TI 항원인 트리니트로페닐(TNP)-Ficoll 을 면역하고 14 일 후에 항 TNP 항체가를 ELISA 로 측정하였다. 그 결과, (TNP)-Ficoll 은 B-GANP^-/- 마우스 및 Cre-flox/+ 마우스에서 동일한 응답을 유도하며, 특별히 차이는 없었다 (도 15).

배 중심 (GC) 형성을 조사해 보면, TD-Ag 인 TNP-keyhole limpet hemocyanin (KLH) 및 NP-CG 등의 TD-Ags 에 응답하여 변이체 마우스는 Cre-flox/+ 마우스와 비교하여 지연된 GC 형성을 나타내었다.

GC 형성의 피크응답에 대해서는, Cre-flox/+ 는 10 일째에 GC-B 세포의 마커인 피넛 아글루티닌으로 염색된 크고 성숙한 GC 를 나타내었다 (도 16 의 화살표). 면역후 10 일에서는 B-GANP^-/- 쪽이 GC 형성이 약간 적었다. 그러나, 14 일 후에는 Cre-flox/+ 에 비하여 B-GANP^-/- 쪽이 수가 많아지고, 20 일 후에도 GC 형성이 천연(遷延)되고 있었다 (도 16 의 화살표).

B-GANP^-/- 마우스는 14 일째에 GC 의 명백한 형성을 나타내었기 때문에, 항원 특이적 항체응답을 측정하였다 (도 17). TD 항원인 TNP-KLH 에 의한 면역에서는 B-GANP^-/- 마우스는 10 일째까지 명확한 GC 를 나타내지 않고, 항체가는 거의 차가 없지만, TNP-KLH 에 의한 면역후 14 일째에는 B-GANP^-/- 에서 GC 의 단계적인 증가와 확대를 나타내었다 (도 17). 변이체 마우스는 TNP-KLH 에 대하여 Cre-flox/+ 마우스와 동일한 항체응답을 나타내었다.

(3) B-GANP^-/- 마우스에서의 친화성 성숙의 장애

B-GANP^-/- 마우스에서의 GC 의 특징 (항체응답이 저친화성인 것)을 더 조사하기 위해, 항원 특이적 IgG1⁺ GC-B 세포를 NP-CG 에 의한 면역후에 조사하였다.

다른 분자량을 갖는 NP 의 합텐/단백질 콘쥬게이트를 사용한 디퍼런셜 ELISA 에 의해 멀티합텐 NP25-BSA 콘쥬게이트에 대한 응답과 비교하였다.

B-GANP^-/- 마우스에서 NP2-BSA 콘쥬게이트에 대한 항체응답은 NP-CG 면역후 35일째에서 저친화성 (13%) 이었다. 이 값은 Cre-flox/+ 마우스의 값 (42%) 과 비교하여 항체반응은 현저하게 감소되었다 (도 18).

또, 도 19 에 나타내는 바와 같이 NP-특이적 IgG1^dullCD38^low B 세포는 B-GANP^-/- 마우스에서는 현저하게 감소되었다. 즉, 면역후 10 일째에 Cre-flox/+ 마우스에서는 1,164세포/10⁶세포인 데 반하여, B-GANP^-/- 마우스에서는 88 세포/10⁶세포였다. 또한, 14 일째에는 Cre-flox/+ 가 879 세포인데 반하여 B-GANP^-/- 는 83세포였다. 또, 이 경향은 20 일째도 같았다.

대조적으로, IgG1^highCD38^high 메모리 B 세포는 감소하지 않았다. 이들 결과는, GANP 의 무발현 변이는 IgG1^highCD38^low GC-B 세포 단계에서 B 세포의 분화에 결함을 발생시키고 있는 것을 나타낸다.

B-GANP^-/- 마우스에서의 항체의 친화성 성숙의 감소를 확인하기 위하여, NP-CG 로 면역한 후의 비장 B 세포의 V_H186.2 영역의 배열을 조사하였다.

SHM 은 B 세포 분화의 이 단계에서 생기기 때문에, V_H186.2 로커스의 SHM 에 대하여 각종 정제한 B 세포를 조사하였다. 또, V_H186.2 로커스는 고친화성 IgG(γ1λ1) NP-응답을 위해 이용되고 있다 (Cumano, A. & Rajewsky, K. (1985) Eur. J. Immunol.15, 512-520). IgM 로커스는 Cre-flox/+ 과 비교하여 차이가 없었다.

다음에, Cre-flox/+ 또는 B-GANP^-/- 에 NP-CG 를 면역하여, NP-결합 IgG₁ 약양성 CD38 약양성을 나타내는 GC-B 세포 (Ag-결합 IgG₁ B 세포) 에 대하여 소팅하였다 (도 19). 또, 소팅후의 세포로부터 게놈 DNA 를 추출하고, V_H186.2 를 PCR 로 증폭하고, 시퀀스 해석을 하여, V_H186.2 의 배열을 비교하였다 (도 20A∼L). 도 20A∼F 는 Cre-flox/+ 의 V_H186.2 의 배열을, 도 20G∼L 은 B-GANP^-/- 의 V_H186.2 의 배열을 비교한 것이다.

B-GANP^-/- 마우스에서 IgV 영역 배열의 전체 변이는 14×10^-3 이며, Cre-flox/+ 마우스 (21 ×10^-3) 와 비교하여 변이의 수가 감소되었다 (도 21). 그리고, W33 에서 L 로의 고친화성형의 변이 (33 번째의 아미노산 잔기 트립토판에서 리신으로의 변이, C57BL/6 마우스에서 현저하게 나타난다) 는 13% (2/15V 영역) 이고, 변이형 마우스에서는 Cre-flox/+ 마우스의 값 (71%, 10/14V 영역) 과 비교하여 보다 현저하게 감소하여 친화성은 1/3 으로 저하하였다 (도 22).

이상의 결과로부터, GANP 는 항체의 친화성 성숙에 필수적임을 알 수 있었다.

(4) B-GANP^-/- 마우스 B 세포에서의 아포토시스로부터의 보호기능

B-GANP^-/- 마우스에서, 고친화성 항체의 생성이 감소하는 것은 항원자극후의 B 세포가 불안정하기 때문이라고 생각된다. 그래서, B 세포의 감수성을 조사하기 위해 in vitro 에서의 B 세포의 아포토시스를 검토하였다.

정상인 B 세포는 강력하게 가교한 B 세포 항원수용체에 의해 활성화 유도 세포사 (AICD) 가 유도되고, AICD 는 CD40 의 자극에 의해 저지되었다. B-GANP^-/- B 세포에서는 AICD 의 자극에 대한 감수성은 정상 B 세포 (대조) 와 동일한 정도였지만, 항 CD40 를 통한 아포토시스의 억제 정도에 대해서는 Cre-flox/+ 대조 B 세포보다도 떨어졌다 (도 23). 이것은, B-GANP^-/- 마우스는 GC 형성기 동안 항원 반응성 B 세포의 보호기능이 부족한 것을 나타낸다.

GC 에서는, 항원자극된 B 세포와 CD40/CD154 의 상호작용에 의해 Fas/CD95 의 표면 발현이 유도되어, Fas 유도성 아포토시스에 감수성을 가지게 된다. 그래서, 본 발명자는 in vitro 에서 아포토시스를 유도하는 항 CD95 자극에 대한 B-GANP^-/- B 세포의 감수성을 측정하였다.

먼저, 비장 B 세포를 항 CD40 모노클로날 항체 (LB429), 항 μ항체 + 항 CD40 모노클로날 항체, IL-4 + 항 CD40 모노클로날 항체, 및 항 μ항체 + IL-4 + 항 CD40 모노클로날 항체로 48 시간 자극하고, 이어서 항 CD95 모노클로날 항체를 배지에 첨가하였다.

그 결과, B-GANP^-/- 마우스의 B 세포의 아포토시스 응답은 Cre-flox/+ 마우스의 B 세포의 응답과 마찬가지이며, B-GANP^-/- 마우스 및 Cre-flox/+ 마우스에서는 차가 없었다 (도 24).

상기한 바와 같이 항 CD40 (LB429) 처리 후에 항 CD95 로 자극하더라도, 발현유도는 B-GANP^-/- 마우스 및 Cre-flox/+ 마우스에서는 차가 없었다. 이것은 B-GANP^-/- 마우스의 B 세포에서는 in vivo 로 GC-B 세포에 의해 통상 받는 아포토시스 자극에 대하여 감수성을 갖는 것을 나타낸다. 그래서, TUNEL 분석을, TD-Ag 로서 SRBC 를 사용해 면역한 후의 조직 절편에 대해 실시하였다.

그 결과, TUNEL 양성세포는 B-GANP^-/- 마우스의 GC 영역에서 증가하고 있어, 대부분의 세포는 IgG1 을 발현하는 것도 나타났다 (도 25, 26). 이들 결과는, B-GANP^-/- 마우스의 아포토시스 세포는 대부분이 GC-B 세포인 것을 나타낸다 (도 25, 26).

다음에, 여러 가지 악성 림프종 세포 및 정상 B 세포의 CD40 매개성 아포토시스 억제에 필요한 분자라고 인식되어 있는 Bcl-2 패밀리 멤버의 RNA 발현을 검토하였다.

항 μ항체 + IL-4 로 자극하면, Cre-flox/+ B 세포에서의 bcl-2 의 전사의 분명한 증가를 유도하여 항 CD40 mAb 는 그 발현을 더욱 업레귤레이트하였다 (도 27). 또, B-GANP^-/- B 세포에 대해서는, 항 μ항체에 의한 bc1-2 전사물과 동일한 업레귤레이션을 나타내었지만, 항 CD40 mAb (항 CD40 mAb 단독 또는 항 μAb + IL-4 + 항 CD40 mAb) 에 대한 응답은 Cre-flox/+ 의 B 세포만큼 높지는 않았다 (도 27). 즉, 아포토시스 억제에 관여하는 Bcl-2 패밀리의 RNA 발현 레벨은 항 CD40 항체로 자극하였을 때의 B-GANP^-/- 마우스 B 세포에 있어서, 대조보다도 저하하고 있었다 (도 27).

변이 B 세포 중의 bcl-X _L , bax 및 bad 에 대해서는 Cre-flox/+ B 세포의 레벨과 동일한 정도이었다 (도 27).

이상의 결과는, GANP 는 GC-B 세포에 있어서 CD-40 를 통한 Bcl-2 의 유도에 관한 정보전달을 제어하고 있어, in vivo 에서의 고친화성 BCR⁺ B 세포의 생존에 크게 기여하고 있는 것을 나타낸다.

(5) 정리

B-GANP^-/- 마우스 및 GANP-Tg 마우스의 결과는 GANP 가 TD-Ag 에 의한 면역후에서의 고친화성 B 세포의 생성에 관여하고 있는 것을 실증하고 있다. GANP 의 역할로는, GC-B 세포로 DNA 폴리메라아제의 효율적인 리크루트와 조절을 중개하고 있을 가능성이 있다. V-영역 SHM 을 갖는 GC-B 세포가 고친화성 BCR 을 취득하면 그들은 선택되어야 하며, 그리고 또한 B 세포의 V 영역의 SHM 은 억제되어 인 비보에서 고친화성 항체의 생성이 보증될 것이다. GC-B 세포에서의 AID 의 발현은 DNA 변이를 끊임없이 생성할 가능성이 있기 때문에, AID 활성의 조절이 B 세포에서의 고친화성 BCR 을 유지하기 위해 필요할지도 모른다. B-GANP^-/- 마우스에서의 결과로부터, GANP 가 SHM 프로세스에 필요한 것이 나타난다.

실시예 4 : GANP 트랜스제닉 마우스를 사용한 고친화성 항체의 생성

1. 디퍼런셜 ELISA 에 의한 항체가의 비교

야생형 (WT) 마우스와 GANP 트랜스제닉 (Tg) 마우스 2 마리씩 NP-CG 100 ㎍ 을 면역하고, 28 일 후의 혈청을 얻어 ELISA 를 하였다. 20 ㎍/㎖ 의 NP2-BSA 와 NP17-BSA 를 ELISA 플레이트에 4℃ 에서 하룻밤 코팅하였다. 3% BSA/PBS-0.1% Tween20 으로 1 시간 블록하여 혈청을 1 시간 반응시켰다. PBS-0.1% Tween20 으로 3 회 씻어, 비오틴 표식 항 마우스 IgG₁ 항체 (Southern Biotechnology) 로 1 시간반응시켰다. PBS-0.1% Tween20 로 3 회 씻어, 알칼리 포스파타아제 표식 스트렙토아비딘 (Southern Biotechnology) 으로 30 분 반응시켰다. PBS-0.1% Tween20 으로 3 회, TBS 으로 1 회 씻어 p-Nitrophenylphosphate 를 기질로서 발색시켰다. 흡광도를 405 ㎚ 으로 측정하였다.

결과를 도 28 에 나타낸다. 도 28 의 결과로부터, GANP 트랜스제닉 마우스를 사용함으로써 고친화성 항체가 생성되는 것을 알 수 있다.

2. ELISA 및 Biacore 를 사용한 항원-항체 결합 친화성 해석

야생형 (WT) 마우스와 GANP 트랜스제닉 (Tg) 마우스에 면역항원으로서 NP-CG 를 면역하고 각각의 마우스를 사용하여 세포융합하여, 얻어진 양성 하이브리도마의 배양 상청에서 ELISA 법 및 Biacore 를 사용해 항원과 반응하는 항체의 결합곡선을 얻었다. 얻어진 결합곡선으로부터 Tg 마우스의 유용성을 유도하였다.

(1) 재료

(a) 동물

야생형 (WT) 마우스와 GANP 트랜스제닉 (Tg) 마우스.

(b) 항체 및 시약

NP16-CG (1 분자당 16개의 NP 가 CG 닭 이뮤노글로불린에 결합한 것), NP2-BSA (1 분자당 2 개의 NP 가 BSA (소 혈청 알부민) 에 결합한 것), NP17-BSA (1 분자당 17 개의 NP 가 BSA 에 결합한 것), HRP 표식 항 마우스 IgG, IgA 및 IgM 을 사용하였다.

(2) 방법 및 결과

야생형 (WT) 마우스와 GANP 트랜스제닉 (Tg) 마우스 각 5 마리에 면역항원으로서 NP16-CG 를 2 주 걸러 3 회 면역하고, 3 회 면역후에 채혈하여 항혈청을 사용해 항체가를 비교하였더니, 상기 1 항에 기재된 결과와 같이 GANP-Tg 마우스의 유용성이 확인되었다.

그 중에서, 역가(力價) 가 높은 마우스의 비세포를 사용하여, P3U1 미엘로마 세포와 세포융합을 실시하고, GANP-Tg 마우스의 비세포수 (6.0 ×10⁷ 개), WT 의 비세포수 (4.8 ×10⁷) 에 근거하여 1 ×10⁵/웰이 되도록 뿌려, GANP-Tg 마우스 유래 세포는 600 클론, WT 마우스 유래 세포는 480 클론을 HAT 배지에 배양하였다.

HAT 배양 9 일 후의 배양 상청을 사용하여 NP2-BSA (1 ㎍/㎖) 를 고상화 항원으로 하여 ELISA 법을 실시하였다. GANP-Tg 마우스 및 WT 마우스의 배양 상청 각각으로부터, ELISA 흡광도 결과에서 고친화성 항체의 생성을 나타내는 상위 2.5% 의 클론을 선출하여 HT 배지에서 클로닝을 실시하였다.

HT 배양 9 일 후의 배양 상청을 사용하여 NP2-BSA (1 ㎍/㎖) 를 고상화 항원으로 하여 ELISA 법을 실시한 결과, GANP-Tg 는 6 클론 (클론명 : G2-6, G2-9, G2-12, G2-14, G2-15, G2-16), WT 는 1클론 (클론명 : W2-7) 의 하이브리도마를 수립하였다.

GANP-Tg 마우스, WT 마우스 각각의 클론을 RPMI 배지에서 배양하여, 이하의 실험에 사용하기에 알맞은 배양 상청을 1 ㎖ 씩 확보하였다. 이 배양 상청을 사용하여 이하의 평가검토를 실시하였다.

(a) ELISA 법

항체가를 평가함에 있어서, 항원의 성질이 다른 것, 이른바 CG 1 분자당 NP 함유율이 다른 물질을 사용하여 그 ELISA 반응성의 비율로 평가하였다.

본 법은 NP 의 친화성을 측정하기에 유용한 측정법이며, 간편하고 많은 검사를 할 수 있어 일차 스크리닝으로서 적당하고 신뢰할 수 있는 것이다.

먼저, NP2-BSA (1 ㎍/㎖) 와 NP17-BSA (1 ㎍/㎖) 를 각각 고상화 항원으로 사용하여 4℃ 에서 하룻밤 고상화하였다. 고상화 플레이트를 PBS-Tween20 으로 세정한 후, 스킴 밀크 PBS-Tween20 으로 블로킹을 실시하였다. 그리고 플레이트를 PBS-Tween20 으로 세정한 후, GANP-Tg 마우스의 6클론 (클론명 : G2-6, G2-9, G2-12, G2-14, G2-15, G2-16) 및 WT 마우스의 1 클론 (클론명 : W2-7) 의 RPMI 배양 상청 (원액∼256 배 희석액) 을 사용하여 실온에서 1 시간 고상화 항원과 반응시켰다. 다음에, 플레이트를 PBS-Tween20 으로 세정한 후, HRP 표식 항 마우스 IgG, IgA 및 IgM 을 실온에서 1 시간 반응시켰다. 그리고, 플레이트를 PBS-Tween20 으로 세정한 후, 오르토페닐렌디아민 (OPD) 으로 5 분간 발색하고 2N 황산을 사용하여 반응을 정지하였다.

흡광도는 ELISA READER 를 사용하여 490 ㎚ 에서 측정하였다.

ELISA 의 결과를 도 29 에 나타낸다. 도 29 의 결과로부터, GANP-Tg 마우스를 사용함으로써 고친화성 항체가 생성되는 것을 알 수 있다.

(b) Biacore 를 사용한 고친화성 해석

상기 ELISA 의 결과에서, 가장 친화성이 높다고 예상되는 클론에 대하여 Biacore 를 사용해 물리화학적 결합능을 조사하였다.

Biacore 에 의한 해석은, NP2-BSA (1 ㎍/㎖) 를 리간드로 하여 Biacore 칩에 결합시킨 것에 아날라이트 용액으로서 가장 친화성이 높다고 생각되는 Tg (G2-9), 가장 낮다고 생각되는 Tg (G2-15) 및 WT (W2-7) 의 3 클론의 RPMI 배양 상청을 사용하여, 각각의 결합속도 상수 (k ass), 해리속도 상수 (k diss) 및 친화성의 지표가 되는 해리 상수 KD (KD = k diss/k ass) 를 산출하였다. KD 가 작을수록 친화성은 높다고 평가된다.

그 결과로서, G2-9 (ELISA : 82.9% NP2/NP17 비) 의 비아코어의 패턴을 도 30 에 나타낸다. 도 30 에 나타내는 곡선 (a)∼(e) 는 항체농도가 각각 26.6, 13.3, 6.65, 3.33 및 1.66 nM 인 것이다. 상기 결과로부터, 결합속도 상수 (k ass) = 1.48 ×10⁵, 해리속도 상수 (k diss) = 9.63 ×10^-4, 그리고 친화성의 지표가 되는 해리 상수는 KD (KD = k diss/k ass) = 6.50 ×10^-9 가 되었다.

한편, ELISA 의 결과로부터 비교적 친화성이 낮다고 예상되는 G2-15 (ELISA : 33.9% NP2/NP17 비) 의 비어코어의 패턴을 도 31 에 나타낸다. 도 31 에 나타내는 곡선 (a)∼(e) 는 항체농도가 각각 23.0, 11.5, 5.75, 2.88 및 1.44 nM 인 것이다.

결합속도 상수 (k ass) = 5.33 ×10⁴, 해리속도 상수 (k diss) = 1.56 ×10^-2, 그리고 친화성의 지표가 되는 해리 상수는 KD (KD = k diss/k ass) = 2.92 ×10^-7 이 되었다. 이 값은 ELISA 법에서도 동등한 친화성을 나타내는 W2-7 (ELISA : 31.6% NP2/NP17 비)의 활성을 갖는 KD 치 = 1.67 ×10^-7 과 근사하고 있었다.

이상으로, GANP 트랜스제닉 (Tg) 마우스를 사용함으로써 고친화성 항체가 생성되는 것이 분명하다.

실시예 5 : GANP 와 MCM3 의 회합, 세포주기 중 핵/세포질 간의 이동

1. 개요

본 실시예에서는, 본 발명자는 부분절단형 변이체 GANP 를 사용함으로써 GANP 의 MCM3 결합영역을 결정하고, GANP 특이적인 영역에서의 502 번째 아미노산의 인산화세린 (pSer⁵⁰²) 에 대한 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 NIH-3T3 세포에서의 GANP 의 국재를 특징지었다.

프라이마제와 MCM 의 결합은 하나의 연동된 기능으로, 양자가 결합한 분자복합체는 DNA 를 2 중쇄에서 푸는 작용을 갖는다. 따라서, GANP 부분 단편이 MCM 과 결합하면, 해당 GANP 단편도 프라이마제 활성을 발휘하여 고친화성 항체의 생성작용을 갖는다고 생각된다.

그래서, GANP 및 그 부분 단편 Map80 및 MCM3 의 핵/세포질 구획의 국재를 cDNA 트랜스펙션과 세포융합실험을 사용하여 해석하였다.

얻어진 데이터로부터, GANP 는 MCM3 과 결합하는 것이 나타나 있고, 또한 GANP 의 국재는 MCM3 의 발현에 의해 영향받는 것이 나타나 있다. GANP 는 Map80 의 결합기전과는 다른 결합기전에 의해 MCM3 과 회합한다. 이들 결과는, MCM3 에 결합한 GANP 는 Map80/MCM3AP 의 기능과는 다른 독특한 기능을 통한 것을 나타낸다.

2. 재료 및 방법

2.1. 세포 및 세포배양

NIH-3T3, COS7, Hela 및 Swiss-3T3 세포를 10% 열 불활화 FCS (다이닛폰세이야쿠), 2 mM L-글루타민 (Biowhittaker), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 U/㎖ 페니실린 및 50 μM 2-메르캅토에탄올을 보충한 D-MEM 배지 (Invitrogen) 중에서 37℃ 로, 5% CO₂ 를 기준으로 유지하였다 (Takei, Y. 등, (1998) J. Biol. Chem. 273, 22177-22180, Sakaguchi, N. 등, (1988) EMBO J. 7, 3457-3464, Kimura, H. 등, (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104). BAL17 은 RPMI-1640 배지 (Invitrogen) 중에서 배양하였다.

2.2. 인산화 GANP 및 MCM3 의 세포내 국재화

NIH-3T3 을 PBS (pH 7.4) 중에서 3.7% 파라포름알데히드로 5 분간 고정하고, 0.2% Triton X-100 을 사용하여 투과성으로 하였다 (Kimura, H. 등, (1994) EMBO J. 13, 4311-4320). 래트 항 pSer⁵⁰² GANP 모노클로날 항체 (Kuwahara, K. 등, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283) 및 토끼 항 MCM3 항체 Kimura, H. 등, (1994) EMBO J. 13, 4311-4320 를 일차 항체로 사용하였다. 다음에, 2 차 항체로서 GANP 에 대해서는 Alexa488 결합 염소 항 래트 IgG 항체 (Molecular Probes) 를 사용하고, MCM3 에 대해서는 Alexa546 결합 염소 항 토끼 IgG 항체 (Molecular Probes) 를 사용하고, 요오드화 TOTO-3 (Molecular Probes) 로 대비염색하여 공초점 레이저 현미경 (FV500 ; 올림푸스) 로 관찰하였다.

2.3. 발현을 위한 cDNA 구축물

pSRα-MCM3-H4 는 문헌에 기재되어 있다 (Kimura, H. 등, (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104). SV40 T-Ag 의 3 가지 핵 국재화 시그널 (NLS)을 담지하는 pECFP-Nuc 벡터는 Clontech 에서 구입하였다. 아래 조합의 3' 및 5' 프라이머를 사용하여 얻은 PCR 단편을 pGEX-4T-1 (Amersham) 에 도입하고, 그들을 사용하여 다른 형의 마우스 ganp cDNA 를 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST) 와의 융합 단백질로서 조제하였다.

GANP1-5' : 5'-GGGGATCCATACCCGG TGAACCCCTT-3' (서열번호 11)

GANP1-3' : 5'-GGGTCGACGCGCACAGACTTTCCCCTGA-3' (서열번호 12)

GANP2-5' : 5'-GGGAATTCTCCCGCCTTCCAGCTGTGAC-3' (서열번호 13)

GANP2-3' : 5'-GGGTCGACGTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3' (서열번호 14)

GANP3-5' : 5'-GGGAATTCCATGAGCTGAGACCCTCAGC-3' (서열번호 15)

GANP3-3' : 5'-GGGTCGACTGAGGATGCAGGAGGCGGCT-3' (서열번호 16)

GANP4-5' : 5'-GGGAATTCTACGTTGGAGAGAGCCTGGC-3' (서열번호 17)

GANP4-3' : 5'-GGGTCGACCATGCTGTCATCTCCTGTGA-3' (서열번호 18)

GANP5-5' : 5'-GGGAATTCGAGAA CCTGGCCAAGGGTCT-3' (서열번호 19)

GANP5-3' : 5'-GGGTCGACGAAAAACCGACGGCTGAACT-3' (서열번호 20)

GANP6-5' : 5'-GGGAATTCAAGCCCTTCCAGCCTGCCCT-3' (서열번호 21)

GANP6-3' : 5'-GGGTCGACCGAGGGAACGTGGTATTTTC-3' (서열번호 22)

GANP7-5' : 5'-GGCCCGGGCC CGTGGGATGACATCATCA-3' (서열번호 23)

GANP7-3' : 5'-GGCTCGAGCATGTCCACCATCTC CAGCA-3' (서열번호 24)

cDNA 구축물은, PCR 단편을 pSVEGFP pA 에 도입함으로써 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 태그한 Ganp 변이체로서 조제하였다 (Kuwata, N. 등, (1999) J. Immunol. 163, 6355-6359). 다음으로, 이들 구축물을 pCXN2 포유동물 발현 벡터 중에 도입하였다 (Niwa, H. 등, (1991) Gene 108, 193-200). 프라이머 배열은 GanP 를 코드하도록 아래와 같이 설계하였다.

Gp-gfp-5' :

5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGCAGTCTTCAAACCGATA CC-3' (서열번호 25)

Gp-gfp-3' :

5'-GCAGGGGCTCCTCCTGATCT-3' (서열번호 26)

Gsac-gfp-5' :

5'-GGGGATC CGAATTCCACCATGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3' (서열번호 27)

Gsac-gfp-3' :

5'-CTGTCTT GTTTCTAAGCCGC-3' (서열번호 28)

Gmap80-gfp-5' :

5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGAGA ACCTGGCCAAGGGTCT-3' (서열번호 29)

Gmap80-gfp-3' :

5'-GAGGACTTGTAGATGTTTTCAC CATGG-3' (서열번호 30)

FLAG 를 태그한 Ganp 변이체에 대해서는, 이하의 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 얻은 cDNA 단편을 pCXN2 에 도입하였다. :

FLAG-Gp-5' :

5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGCAGTCTTCAA CCGATACC-3' (서열번호 31)

FLAG-Gp-3' :

5'-GGGAATTCCTCCGGGTCTCCCTCAAGTA-3' (서열번호 32)

FLAG-Gsac-5' :

5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3' (서열번호 33)

FLAG-Gsac-3' :

5'-GGGAATTCGCTGTCTTGTTTCTAAGCCG-3' (서열번호 34)

FLAG-Gmap-5' :

5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGAGAACCTGGCCAAGGGTCT-3' (서열번호 35)

FLAG-Gmap-3' :

5'-GGGAATTCTGAGGACTTG TAGATGTTTT-3' (서열번호 36)

내부 결실 변이체 GpΔNLS-GFP 및 I3 변이체 (MCMΔNLS-HA) 는 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 조제하였다 (Imai, Y. 등, (1991) Nucl. Acids Res. 19, 2785-2785). 모든 구축물은, 뉴클레오티드 배열의 결정에 의해 배향이 옳은 것 및 태그를 붙인 융합 단백질로서 코돈의 리딩 프레임이 옳은 것을 확인하여 품질을 관리하였다. 변이체 RNA/DNA 프라이마제 도메인 (PD) 을 갖는 발현 벡터는 문헌에 기재되어 있다 (Ser⁵⁰² 로부터 Ala [GpS502A] 또는 Glu [GpS502E] 까지의 Gp 변이체) (Kuwahara, K. 등, (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283).

2.4. 도입한 유전자 산물의 공초점 현미경 검사에 의한 검출

FuGENE 6 (Roche Diagnostics) 을 사용하여, pCXN2-ganp-gfp 및/또는 pSRα-MCM3-HA 에 의해 NIH-3T3 을 트랜스펙트하였다. 고정화 16시간 전에 렙토마이신 B (LMB ; (Kudo, N. 등, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117)) 를 배양 배지에 첨가하였다. 공트랜스펙션인 경우에는 토끼 항 HA 항체 (Santa Cruz) 및 Alexa546 결합 염소 항 토끼 IgG 항체를 사용하고, 그리고 단독 트랜스펙션인 경우에는 Alexa488 결합 염소 항 토끼 IgG 항체 (Molecular Probes) 를 사용하여 외인성 MCM3 단백질을 염색하였다. 핵산은, 공트랜스펙션 실험에 대해서는 요오드화 TOTO-3 을 사용하고, 단독 트랜스펙션 실험에 대해서는 요오드화 프로비듐 (PI ; Sigma) 을 사용하여 대비염색하였다.

2.5. GST 풀다운 분석

GST 융합 단백질을 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 정제하였다 (Kuwahara, K. 등, (2000) Blood 95, 2321-2328). 글루타티온-Sepharose 비드 (Amersham) 에 고정한 여러 가지 GST 융합 단백질 (5 ㎍) 을 TNE 버퍼 (10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 10 ㎍ 아프로티닌, 1mM 페닐메틸-술포닐플루오리드 [PMSF]) 를 사용하여 조제한 BAL17 용해물과 함께 인큐베이트하였다. 결합 단백질을 8% SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 니트로셀룰로오스필터에 전사하여 블록하였다. 다음에 토끼 항 마우스 MCM3 항체 (Kimura, H. 등, (1994) EMBO J. 13, 4311-4320) 및 퍼옥시다제 표식 프로테인 A (Amersham) 와 함께 연속적으로 인큐베이트하고, 최후에 ECL 검출 키트 (Amersham) 를 사용하여 시그널을 가시화하였다. 직접 결합 분석을 위해서는, [³⁵S-메티오닌] (Amersham) 을 사용하여 in vitro 전사 및 번역 결합 시스템 (Novagen) 을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 방사성 표식화 MCM3 을 합성하고, [³⁵S]-표식 MCM3 을 오토라디오그래피로 검출하였다.

2.6. 도입한 유전자 산물의 면역침강 및 웨스턴 블로팅

FuGENE 6 을 사용하여, pCXN2-FLAG-ganp 및/또는 pSRα-MCM3-HA 에 의해 COS7 을 트랜스펙트하였다. 26시간 후 TNE 버퍼를 사용하여 세포를 용해하고, 얻어진 용해물을 프로테인 A-Sepharose (Amersham) 와 조합한 항 HA 항체와 함께 인큐베이트하였다. 면역침강물을 8% SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 니트로셀룰로오스 필터에 전사하고, 블롯을 블록하고, 마우스 항 FLAG M2 항체 (Stratagene) 와 함께 인큐베이트하고, 다음에 퍼옥시다제 표식 염소 항 마우스 IgG (H+L) 항체 (Zymed) 와 함께 인큐베이트하였다. Gp-GFP 및 그 변이체의 검출을 위해서는, 블로팅한 필터를 토끼 항 GFP 항체 (Santa Cruz) 및 퍼옥시다제 결합 프로테인 A (Zymed) 에 의해 끌어 올린다.

2.7. 헤테로칼리온 분석

FuGENE 6 을 사용하여, pSRα-MCM3-HA 에 의해 Hela 세포를 트랜스펙트하였다. 20시간 후, 트랜스펙트한 HeLa 세포 및 트랜스펙트하지 않은 마우스 Swiss-3T3 세포를 트립신 처리하여 1 : 1 의 비로 함께 배양접시에 뿌렸다. 24시간 후 폴리에틸렌글리콜 1500 (Roche diagnostics) 을 실온에서 2분간 사용하여 세포를 융합시켰다 (Schmidt-Zachmann, M. S. 등, (1993) Cell 74, 493-504). 배양접시를 배지로 4회 세정한 후, 시클로헥시미드 함유 배지를 첨가하여 (최종농도 20 ㎍/㎖), 세포를 CO₂ 인큐베이터 속에서 37℃ 로 5시간 인큐베이트하였다. 다음에, 250 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) 속에서 4% 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 20 분간 고정하고, PBS 속에서 0.5% Triton X-100 을 30 분간 사용하여 투과성으로 해 PBS 로 세정하였다. 항 HA 항체 (12CA5 ; Covence Research Products) 및 Cy3 결합 당나귀 항 마우스 Ig 항체 (Jackson) 를 사용하여 세포를 염색하였다. 또, PBS 속에서 100ng/㎖ Hoechst 33342 (Sigma) 를 사용하여 DNA 를 20 분간 대비염색하였다. 100×PlanNeofluar 위상차 대물렌즈 (NA 1.3) 및 SpotⅡCCD 를 구비한 Zeiss Axioplan 을 사용하여 화상을 모았다.

3. 결과 및 고찰

3.1. GANP 와 MCM3 의 회합

지금까지, B 세포 계통에서의 GANP 와 MCM3 의 상호작용이 공면역침강에 의해 실증되고 있다 (Kuwahara, K. 등, (2000) Blood 95, 2321-2328). GANP 의 C 말단 영역은 전체 Map80 단백질과 동일하기 때문에, GANP 는 동일 영역에서 MCM3 과 회합한다고 예상된다. 본 발명자는 어떤 영역이 MCM3 과 직접 회합하는지를 결정하기 위해, 도 32 에 나타내는 여러 가지의 말단 절단형 GANP 를 갖는 GST 융합 단백질을 사용하여 풀다운 분석을 실시하였다. GST 를 도 32 에 나타내는 1 내지 7 및 5-7' 이라 부르는 절단형 GANP 의 N 말단에 융합하였다. 도 33 의 아래에 있는 패널에서 GANP5-7' 라 부르는 Map80 영역은, 이전에 나타낸 바와 같이 (Kimura, H. 등, (1994) EMBO J. 13, 4311-4320), 세포추출물로부터 MCM3 을 풀다운하였다.

놀랍게도, GANP 의 부분 단편인 GANP1 및 GANP2 도 또한 MCM3 을 풀다운하였다 (도 33 ; 위 및 아래 패널).

다음에, 망상 적혈구 용해물계에 의해 in vitro 에서 합성한 MCM3 을 사용하여 이 결합을 조사하였다 (도 34). GST-GANP1 및 GST-GANP2 도 또한 in vitro 번역 칵테일로부터 [³⁵S]-MCM3 을 풀다운하였다.

GST 단독을 사용한 음성 대조 (최초의 레인) 또는 무관한 단백질과 융합한 GST 는 시그널을 나타내지 않았다. 그리고, GST-GANP1 과의 결합은 Map80 영역 (GST-GANP5-7') 과의 결합보다도 강하였다. 이 결합은, FLAG 를 태그한 구축물을 사용한 DNA 트랜스펙션 실험에 의해 세포에서도 확인되었다 (도 35).

COS7 세포를 pSRα-MCM3-HA 또는 pSRa-I3-HA 와 조합하고, pCXN2-FLAG-Ganp, pCXN2-FLAG-Gp 및 pCXN2-FLAG-Gmap80 에 의해 공트랜스펙트하였다. 항 HA 항체를 사용한 면역침강의 후, 항 FLAG 모노클로날 항체로 웨스턴 블롯을 하였다. FLAG 표식 단백질의 예상 사이즈를 각각의 레인에서 삼각형으로 나타낸다. 왼쪽 및 오른쪽 패널은 밴드의 이동도 (migration) 가 같지만, ECL 검출의 노광시간은 왼쪽 패널이 1 분 및 오른쪽 패널은 3분이다 (도 35).

FLAG-Ganp, FLAG-Gp 및 FLAG-Gmap80 은 야생형 MCM3-HA (HA 에피토프를 태그한 MCM3) 와 결합하였다 (도 35 ; 왼쪽 패널). FLAG-Gsac 만이 결합하지 않았다. I3 변이체 MCM3 (MCM3ΔNLS) 과의 결합에 대해서는 FLAG-Gmap80 만이 양성의 결과를 나타내었다 (도 35 ; 오른쪽 패널). N 말단 NLS 를 담지하는 Gp 영역은, 대량의 MCM3 을 갖는 세포에서 일관되게 MCM3 과 회합하고 있다 (도 35 ; 왼쪽 패널). 이들 결과는 GANP 가 Gp 영역을 통해 MCM3 의 NLS 영역과 회합하고 있는 것을 나타내고 있다.

본 발명자는 또한, Gp 영역의 Ser⁵⁰² 의 인산화 상태가 MCM3 과의 결합에 영향을 주는지 아닌지를 검토하였다. 프라이마제 부위가 결손된 Ganp 변이체 (GanpΔPD-GFP) 및 GanpS502A 또는 GanpS502E 로서 조제되는 Ser⁵⁰² 에서의 Ganp 변이체를 GFP 와 융합하였다 (도 36A). 세포를 pCXN2-Ganp-gfp 와 pSRα-MCM3-Ha 에 의해 공트랜스펙트하고, 용해액은 항 HA 항체를 사용한 면역침강에 사용하였다.

GFP 시그널은 항 GFP 항체로 검출되며 (도 36B ; 위 패널), 이것은 GANP 가 MCM 에 결합한 것을 의미한다.

Ganp-GFP 변이체와의 공트랜스펙션도 마찬가지로 실시하였다. 각 단백질의 예상위치를 결정하기 위해, 용해액을 SDS-PAGE 상에서 분리하고, 동일하게 항 GFP 항체로 블롯하였다 (도 36B ; 아래 패널).

비인산화성 변이체 (GanpS502A-GFP) 는 야생형 Ganp-GFP 또는 포스포세린과 많이 닮은 변이체 (GanpS502E-GFP) 와 동일하게 MCM3 과 결합하였다 (도 36B ; 위 패널). 흥미롭게도, GanpΔPD-GFP 는 MCM3-HA 와 공침강하지 않는다 (도 36B ; 위 패널).

GANP 분자 전체로는, Map80 영역의 잠재적 결합활성에 상관없이 MCM3 과의 결합에는 RNA 프라이마제 영역 (PD) 이 필요하다. 흰 삼각형은 GanpΔPD-GFP 의 위치를 나타낸다. Ganp S502A-GFP 및 Ganp S502E-GFP 의 사이즈와 동일한 Ganp-GFP 의 사이즈를 검은 삼각형으로 나타낸다 (도 36B ; 아래 패널). 이들 결과는 GANP 의 MCM3 과의 결합은 그 PD 영역을 통과하지만, Ser⁵⁰² 부위에서의 인산화는 이 결합에 영향을 받지 않는 것을 나타내고 있다.

말단 절단형 구축물을 사용한 실험에 의해 GANP 와 MCM3 의 회합이 넓은 영역에 걸쳐 나타났지만, GANP 의 N 말단의 600 개의 아미노산 영역이 관여하는 전체 GANP 와의 결합에는 MCM3 의 NLS 가 필요하다. NLS 가 빠진 MCM3 변이체는 세포 속에서 전체 GANP 분자와 효과적으로 회합할 수 없었다. Map80 영역은 NLS 음성 MCM3 과 결합하고, 이것은 GANP 의 MCM3 과의 결합이 주로 Map80 와의 상호작용에 필요한 영역 이외와의 결합인 것을 나타내고 있다. Map80 은 MCM3 임포트 인자라고 생각되고 있으나, GANP 는 MCM3 과 공동으로 다른 역할을 할 지도 모른다. GANP 는 가능성이 있는 인산화 부위를 다수 갖고, 그리고 세포 중에 많은 회합 성분을 갖는 것처럼 생각된다 (Kuwahara, K. 등, (2000) Blood 95, 2321-2328). 따라서, 그 영역의 인산화 상태가 GANP/MCM3 회합 및 세포질과 핵 구획 사이의 수송 조절에 영향을 미치게 하는 영역을 특정할 필요가 있을 것이다.

3.2. 트랜스펙션에 의해 나타나는 Map80 및 Ganp 변이체의 세포내 국재화

GANP 는 2 개의 가능성이 있는 NLS 를 갖는다. 1 개는 N 말단 프라이마제 영역 내에 있고, 다른 1 개는 C 말단 Map80 영역 내에 있다. 또, GANP 은 2 개의 핵 수출 시그널 (NES) 양 모티브를 갖는다. 1 개는 SAC3 상동영역과 Map80 영역 사이에 있고, 다른 1 개는 Map80 영역 내에 있다.

NIH-3T3 세포를 pCXN2-Ganp-gfp 또는 pCXN2-Gmap80-gfp 에 의해 트랜스펙트하여 48 시간 후에 고정하였다. LMB 를 고정 16 시간 전에 첨가하였다. 핵을 PI 로 전염색하고, 공초점 현미경을 사용하여 화상을 집적하였다. 대표적인 발현특성을 도 37 에 나타낸다. 다른 특성을 갖는 세포수를 계수하여 퍼센트로 나타내었다 (도 37).

Ganp-GFP (GFP 에서 태그한 대략 전체길이 GANP) 는 핵 우성발현 (N 및 N > C ; 38%) 또는 세포질 우성발현 (C 및 C > N ; 31%) 을 나타내는 세포의 비율에 변동은 있었지만 (합계 500 개의 세포로부터 임의로 계산된 수의 %), 세포질 및 핵 구획의 양쪽에 존재하는 것이 발견되었다 (도 37 ; Ganp-GFP, LMB-). 대조적으로, Gmap80-GFP 는 거의 세포질에 보이며, 발명자의 분류에 의한 핵 우성발현은 나타내지 않았다 (N > C, 0% ; N = C, 35% ; C 및 C > N, 65%) (도 37 ; Gmap80-GFP, LMB-). Ganp-GFP 의 국재화는 Gmap80-GFP 의 국재화와는 다르다.

N 말단 NLS 모티브가 기능성인지 아닌지를 확인하기 위하여 RNA/DNA 프라이마제 도메인 및 N 말단 NLS 를 담지하는 (단 NES 양 모티브는 포함하지 않음) 5'1-kb DNA 단편을 GFP 와 융합시켰다 (도 38, Gp-GFP). 이 Gp-GFP 산물은 핵에만 존재하였지만 (N 및 N > C, 94%) (도 38), NLS 가 빠진 변이체 Gp-GFP (GpΔNLS-GFP ; 도 38 에 나타내는 바와 같이 아미노산 497 에서 500 이 결실되어 있다) 는 세포질성인 것을 나타내어, N 말단 NLS 가 핵 국재화에 관여하고 있는 것이 확인되었다.

본 발명자는 인접하는 Ser⁵⁰² 의 알라닌으로의 돌연변이 (GpS502A-GFP ; 비인산화형) 또는 글루타민산으로의 돌연변이 (GpS502E-GFP ; 포스포세린을 모방하는 형) 이 이 국재화에 영향을 미치는지 아닌지를 검토하였다 (도 38). 그리고, 본 발명자는 이들 돌연변이가 GP 의 국재화를 바꾸지 않는 것을 관찰하였다. 이것은, N 말단 NLS 가 Ser⁵⁰² 의 인산화 상태에 상관없이 기능성인 것을 시사하고 있다 (도 38). 대조적으로, N 말단 NLS 도 C 말단 NLS 도 갖지 않는 Gac-GFP 은, 대부분이 세포질 중에 존재한다고 생각된다 (N 및 N > C, 0% ; N = C, 3% ; C 및 C > N, 97%) (도 38).

이들 결과는, N 말단 NLS 가 GanP 의 핵으로의 이입에 기능적인 역할을 하는 것을 시사하고 있다. 그러나, NLS 는 GANP 발현을 핵 내에 유지할 정도로 강하지는 않을지도 모른다. 왜냐하면, Ganp-GFP 는 세포질 중에도 존재하기 때문이다 (도 37). 이 문제를 더 검토하기 위해, Crm1 에 의해 매개되는 핵으로의 수출을 억제하기 위해, cDNA 트랜스펙션 후, 세포를 렙토마이신 B (LMB) 로 처리하였다 (Kudo, N. 등, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117).

LMB 로 처리한 세포에서는, 대부분의 트랜스펙턴트에서 Ganp-GFP 는 핵에 국재화하였다 (도 37). 우성인 세포질 발현을 나타내는 세포 분획은 31% 에서 4% 로 감소하고, 대조적으로 핵에서 우성인 발현을 나타내는 세포가 38% 에서 81% 로 증대하였다. 따라서, GanP 의 세포질로의 이행은 LMB 에 의해 억제된다고 생각된다.

Gmap80-GFP 의 국재화도 또한 LMB 처리후 극적으로 변화하였다 (도 37). 즉, 세포질 발현을 나타내는 세포 분획이 65% 에서 37% 로 감소하고, 우성인 핵 발현을 나타내는 세포 분획이 0% 에서 41% 로 증대하였다. 이들 소견은 COS7 및 Ltk- 세포를 포함하는 다른 세포계에서도 재현되어, 핵에서 세포질로의 GANP 수출이 Crm1 의존성 경로에 의해 조절되고 있는 것을 나타내고 있다. 따라서, GANP 및 Map80 은 핵과 세포질 사이를 셔틀링 (왕복) 하고 있다고 생각되며, 그리고 그들의 국재화는 다른 분자와 공동되고 있는 핵 이입 및 수출기구 사이의 균형에 의존하는 것 같다.

3.3. 공트랜스펙트한 세포에서의 MCM3 및 GANP 의 국재화

다음에, 본 발명자는 GANP 의 이행이 MCM3 발현과 관련되고 있는지 아닌지를 검토하였다. 포유동물의 MCM3 은 세포주기 중에 크로마틴과의 결합 상태를 변화시키지만, 간기 동안에 핵에만 존재한다 (Kimura, H. 등, (1994) EMBO J. 13, 4311-4320). NIH-3T3 세포를, pSRα-MCM3-HA 또는 pSRα-I3-HA 에 의해 트랜스펙트하고, 고정하고, 항 HA 항체 (Alexa 488) 로 면역 표식하여 PI 로 염색하였다.

트랜스펙트한 MCM3-HA 는 전형적인 NLS 의 존재와 합치하여 (Kimura, H. 등, (1994) EMBO J. 13, 4311-4320, Takei, Y. 등, (1998) J. Biol. Chem. 273, 22177-22180), 핵에 국재화하였다 (도 39). 이 핵국재화는 MCM3 의 NLS 에 의존하였다. 왜냐하면, 이 NLS 가 빠진 변이체 MCM3 (I3 ; MCM3ΔNLS-HA) 은 세포질에만 발현되었기 때문이다 (도 39 ; 오른쪽 패널).

세포를, pCXN2-Ganp gfp 또는 pCXN2-Gmap80-gfp 및 α-MCM3-HA 에 의해 공트랜스펙트하고, 고정하고, 항 HA 항체 (Alexa546) 로 면역 표식하여 핵을 TOTO-3 로 전염색하였다 (도 40). 세포수는 패널 아래에 나타낸다 (도 40).

흥미롭게도, Ganp-GFP 를 사용하여 공트랜스펙션한 경우, 세포의 17% 에서 MCM3 의 세포질 국재화가 초래되었다 (도 40, 흰 화살표로 나타냄). Gmap80-GFP 또는 Gp-GFP 를 사용한 공트랜스펙션의 경우에는, 그러한 결과는 볼 수 없었다.

MCM3 으로의 Ganp 의 효과가 특이적인 것을 증명하기 위해, 핵에서 출현하는 ECFP-Nuc 의 발현을, 다른 ganp-gfp 구축물의 트랜스펙션 전후에 조사하였다. Ganp-GFP 에서 트랜스펙트한 대표 화상을 나타낸다 (도 41). ECFP-Nuc 의 핵으로의 국재화는, Ganp-GFP (도 41) 또는 Gmap80-GFP 또는 Gp-GFP 를 사용한 공트랜스펙션 어떤 것에 의해서도 영향받지 않았다.

Ganp 및 MCM3 의 공발현도 또한 GANP 국재화의 변경을 가져왔다. Ganp-GFP 단독 (38%) 및 Gmap80-GFP 단독 (0%) 의 트랜스펙션 (도 37) 과 비교하여, MCM3 을 사용한 공트랜스펙션은 Ganp-GFP (74%) 및 Gmap80-GFP (64%) 의 핵 발현 레벨을 증대시켰다 (도 40). MCM3 은 GANP 및 Map80 을 핵 내에 유지하였지만, Ganp 의 과잉 발현만이 MCM3 의 세포질에서의 출현을 촉진시켰다 (도 40 ; Ganp-GFP 발현에 의해 17%). 한편, Gmap80 MCM3 의 세포질에서의 출현을 촉진시키지 않았다 (Gmap80-GFP 발현에 의해 4%). MCM3 의 NLS 에서의 돌연변이 (I3 ; MCM3ΔNLS-HA) (그 결과, MCM3 은 세포질에 존재하게 됨) 는 Ganp-GFP 또는 Gmap80-GFP 의 핵에 대한 축적을 야기하지 않는다 (도 42).

야생형 MCM3 과는 달리, I3 변이체 (MCM3ΔNLS-HA) 는 Ganp 또는 Gp 와 회합하지 않는다 (도 35) 는 사실을 생각한다면, MCM3 의 NLS 모티브는, 세포에서 GANP 와의 기능적 회합 및 핵과 세포질 사이의 GANP 의 수송에 필요하다고 시사된다.

DNA 트랜스펙션 실험은 MCM3 과 함께 도입된 경우, Ganp-GFP 가 핵 구획에 축적하는 것을 나타내며, 핵에서의 GANP/MCM3 복합체의 형성을 시사하였다. MCM3 은 Crm1 에 의해 인식될 수 있는 분명한 공통 NES 양 모티브를 포함하지 않고, 따라서 핵으로부터의 MCM3 의 수출은 아마도 NES 양 모티브를 갖는 다른 결합분자 또는 다른 수출기구에 의존할 것이다. GANP 상의 2 개의 NES 양 모티브는 LMB 감수성 Crm1 의존성 수출경로에 관여하고 있다고 생각된다 (도 37). GANP 에 의해 담지되는 2 개의 NES 양 모티브 (이들은 Crm1 에 의해 인식되는 것일지도 모름) 는 복합체의 수송에 관여하고 있을 가능성이 있다.

최근, GANP 상동영역을 담지하는 효모 SAC3 가 어떤 단백질의 핵 수출에 관여하고, 그리고 핵막구멍 복합체의 성분과 회합하는 것이 나타났다 (Jones, A. L. 등, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3224-3229). GANP 와의 공발현은 MCM3 의 세포질 구획에 대한 국재화를 변화시켰다.

세포 융합 기법을 사용하여, MCM3 의 핵-세포질 간 셔틀링 (왕복) 을 조사하였다 (Schmidt-Zachmann, M.S. 등, (1993) Cell 74, 493-504). HeLa 세포를 최초 MCM3-HA 에서 트랜스펙트하고, 다음에 트랜스펙트하지 않는 마우스 Swiss-3T3 세포와 융합시켰다. 단백질 합성을 억제하기 위해 시클로헥시미드의 존재 하에서 5시간 인큐베이트한 후 세포를 고정하여, MCM3-HA 를 면역 표식하였다. 헤키스트 (Hoechst) 염색에 의해 헤테로칼리온을 조사하였다. 이 염색은, 「얼룩진」 헤테로 크로마틴을 갖는 마우스의 핵 (화살표) 을 인간 HeLa 핵과 구별한다.

도 43 에 대표적인 것을 나타내는 바와 같이, MCM3-HA 는 헤테로칼리온 속에 인간 및 마우스의 핵 양쪽에서 발견되었다. 융합되지 않은 마우스의 세포는 그러한 염색을 나타내지 않는다. 이것은, MCM3-HA 가 HeLa 핵으로부터 세포질로 수출되고, 다음에 마우스 핵으로 이입된 것을 나타내고 있다.

이들 결과로부터, MCM3-HA 는 셔틀링 단백질이라고 결론지어졌다. 또, 트랜스진 산물과 동일한 감도로 내인성 단백질의 핵으로부터 세포질로의 이행을 실증하는 것은 종종 곤란하다 (Kimura, H., Ohtomo, T. 등, (1996) Genes Cells 1, 977-993, Mizuno, T. 등, (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 7886-7896). 본 실시예에 나타내는 결과에 대해서도 그러하였다. 효모와 같은 보다 원시적인 세포로 달성된 것과 동일한 감도로, 포유동물 세포에서의 내인성 MCM 단백질의 핵으로부터 세포질로의 이행을 실증하는 것도 또한 곤란하다.

그러나, 본 발명자의 결과는 (실험은 DNA 트랜스펙션법에 의해 실시하였지만) 미조작 세포에서 MCM 단백질의 핵-세포질 간 셔틀링이 필시 중요하다는 것을 나타내고 있다. 세포주기의 진행 중 MCM 복합체의 핵-세포질 간 이동의 명확한 이해를 쉽게 하기 위해서는, 한층 더 성분의 발견이 필요할 지도 모른다.

3.4. 세포주기 간의 GANP 의 국재화

RNA/DNA 프라이마제 도메인의 GANP 에 특유의 에피토프 (pSer⁵⁰² GANP) 에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여, 공초점 레이저 현미경 검사에 의해 NIH-3T3 세포에서의 GANP 의 국재화를 조사하였다 (Kuwahara, K. 등, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283). 세포주기가 다른 시기에 있는 NIH-3T3 세포를 항 pSer⁵⁰²GANP (Alexa488 ; 녹색) 및 항 MCM3 (Alexa546 ; 적색) 항체로 면역염색하였다. 핵을 TOTO-3 요오드화물 (청색) 로 전염색하였다. 간기 동안 상기 모노클로날 항체는 핵소체를 제외한 핵 내의 전부에 반응하였다 (도 44).

항 MCM3 항체 및 핵산을 염색하는 TOTO-3 을 사용한 3중 표식에 의해 유사분열 동안의 GANP 의 국재화를 자세히 분석하였다. 세포가 전중기에서 중기로 진행함에 따라 GANP 는 농축 크로마틴에서 해리된다고 생각된다 (도 44). 겹친 화상의 황색 시그널은 GANP 와 MCM3 의 공국재화를 나타내지만, 약간의 파란 염색은 전중기 화상의 중심부에서 GANP 가 단독으로도 보이는 것을 나타내고 있다. 이 단계에서는 GANP 및 MCM3 은 농축된 염색체와 겹치지 않았다. 중기의 세포에서는, GANP 는 방추체 영역에서 검출된다. 그리고 이 시그널은 후기에 염색체가 2 개의 자세포로 분리되는 동안 감소한다.

감수 분열 후기에서는, GANP 의 대부분은 핵이 형성될 때까지 (종기), 세포질 구획에 보인다. 이들 결과는, GANP 및 MCM3 의 거동이 유사하여 이들 2 개는 간기 동안에 거의 핵에 공국재화하는 것을 나타내고 있다. 이는, 이들 2 개의 상호회합과 일치하고 있다. 그러나, 유사분열 동안에 공초점 현미경 검사에 의해 나타내는 바와 같이 GANP 및 MCM3 은 따로따로 존재할 수도 있다 (도 44).

제 2 형의 RNA/DNA 프라이마제에 대한 핵-세포질 간의 GANP 셔틀링의 생물학적 의미는, 금후의 해명을 기다려야 한다. 그것은 DNA 수복의 최종 단계에서의 RNA 프라이머 생성에 관련된 것인지도 모른다. 정상세포에서는 GANP 의 발현 레벨은 낮지만, 세포가 급속히 증식하는 배 중심에서는 업레귤레이션된다 (Kuwahara, K. 등, (2000) Blood 95, 2321-2328, Kuwahara, K. 등, (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283). GANP 는 또한 빠른 세포 종기를 갖는 어떤 종류의 세포에서 보다 고레벨로 발현된다. 이는, MCM 복합체와의 회합이 DNA 복제를 자극할 가능성을 시사하고 있다 (Kuwahara, K. 등, (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283). RNA/DNA 프라이마제 활성, MCM3 결합능 및 아세틸트랜스페라제 도메인 (Takei, Y. 등, (2001) EMBO Rep. 2, 119-123) 을 갖는 GANP 의 발현은 세포주기 진행의 조절에 관여하고 있을 지도 모른다.

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본 발명에 의한 GANP 를 과잉 발현한 마우스를 사용함으로써, 종래에서는 얻어질 수 없는 바이러스 항원에 특이적이고 고친화성인 항체를 빠르게 제작할 수 있다. 그 때문에, 에이즈나 C 형 간염과 같이 천연되는 감염에 의한 병상 악화를 그 바이러스 항원의 변이에 늦지 않게 특이적이고 강력한 항체를 빠르게 얻는 것이 가능해질 것으로 기대된다. 또한, 이것에 의해 감염환자로부터의 바이러스 항원의 변이에 대응하는 오더메이드의 특이적 항체를 제작할 수 있다. 항체의 제작에 필요한 면역기간은 10 일 정도로 충분하며, 그 중 고친화성의 변이를 갖는 항체의 생성효율은 60% 가까이 오른다. 베드사이드의 환자 샘플을 사용하는 고친화성 항체의 생성 프로토콜은 백신요법을 대신하는 새로운 면역요법이 된다고 기대된다.

<110> Kumamoto Technology and Industry Foundation <120> A GANP-introduced transgenic mammal and use thereof <130> P03-0152PCT <150> PCT/JP02/11598 <151> 2002-11-07 <160> 36 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 6429 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (384)..(6296) <400> 1 gttgcggtgc ggtgggcccg gtagaggctg cacgcagact gtgggcgagc acaagcgctg 60 gcgacagtgg ccgtatctgg cggacttgct cctccctccg cggcctccgc tgtcccttgt 120 gtctttgccg agttgctgaa ggccttcact agtcttcgct cgaaggcgtc tgttaaccta 180 gcggccggct tccggagtgt taagcatcgg ggataaaaag ctattatttc tagaccaggg 240 catcgcaagt tcgagttacc gggagaaaaa tgagatggtc atcctgagga tgaaggagag 300 cttcccctgg caacagataa tttaaagagg agagctactt gtgtatagtc catatttatt 360 gccttcagat aattggcttg aag atg cac ccg gtg aac ccc ttc gga 407 Met His Pro Val Asn Pro Phe Gly 1 5 ggc agc agc cca agt gct ttt gcg gta tct tcc agc acc acg gga aca 455 Gly Ser Ser Pro Ser Ala Phe Ala Val Ser Ser Ser Thr Thr Gly Thr 10 15 20 tat cag act aaa tca cca ttt cga ttt ggc cag cct 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atg ctg ctg ctt ccc ccg aaa gtg aag agt gag gag gtg gca gag gag 4775 Met Leu Leu Leu Pro Pro Lys Val Lys Ser Glu Glu Val Ala Glu Glu 1450 1455 1460 gaa ctg tcc tgg ctg tcg gct tta ctg cag ctc aag cag ctt ctg cag 4823 Glu Leu Ser Trp Leu Ser Ala Leu Leu Gln Leu Lys Gln Leu Leu Gln 1465 1470 1475 1480 gcc aag ccc ttc cag cct gcc ctg ccg ctg gtg gtc ctc gtg ccc agc 4871 Ala Lys Pro Phe Gln Pro Ala Leu Pro Leu Val Val Leu Val Pro Ser 1485 1490 1495 tcc aga ggg gac tcc gcg ggg agg gca gta gag gac ggt ctg atg tta 4919 Ser Arg Gly Asp Ser Ala Gly Arg Ala Val Glu Asp Gly Leu Met Leu 1500 1505 1510 cag gat ttg gtt tca gcc aag ctg att tcc gat tac att gtt gtt gag 4967 Gln Asp Leu Val Ser Ala Lys Leu Ile Ser Asp Tyr Ile Val Val Glu 1515 1520 1525 att cct gac tct gtt aat gat tta caa ggc aca gtg aag gtt tct gga 5015 Ile Pro Asp Ser Val Asn Asp Leu Gln Gly Thr Val Lys Val Ser Gly 1530 1535 1540 gca gtc cag tgg ctg atc tcc gga tgt cct caa gcc cta gac ctt tgc 5063 Ala Val Gln Trp Leu Ile Ser Gly Cys Pro Gln Ala Leu Asp Leu Cys 1545 1550 1555 1560 tgc cag acc ctt gtt cag tat gtt gag gat ggg atc agc cgc gag ttc 5111 Cys Gln Thr Leu Val Gln Tyr Val Glu Asp Gly Ile Ser Arg Glu Phe 1565 1570 1575 agc cgt cgg ttt ttc cac gac agg aga gag agg cgc ctg gct agc ctg 5159 Ser Arg Arg Phe Phe His Asp Arg Arg Glu Arg Arg Leu Ala Ser Leu 1580 1585 1590 ccc tcc cag gag cct agc acc att att gag ttg ttc aac agt gtg ctg 5207 Pro Ser Gln Glu Pro Ser Thr Ile Ile Glu Leu Phe Asn Ser Val Leu 1595 1600 1605 cag ttc ctg gcc tct gtg gta tcc tct gag cag ctg tgt gac atc tcc 5255 Gln Phe Leu Ala Ser Val Val Ser Ser Glu Gln Leu Cys Asp Ile Ser 1610 1615 1620 tgg cct gtc atg gaa ttt gcc gaa gtg gga ggc agc cag ctg ctt cct 5303 Trp Pro Val Met Glu Phe Ala Glu Val Gly Gly Ser Gln Leu Leu Pro 1625 1630 1635 1640 cac ctg cac tgg aac tca cca gag cat cta gcg tgg ctg aaa caa gct 5351 His Leu His Trp Asn Ser Pro Glu His Leu Ala Trp Leu Lys Gln Ala 1645 1650 1655 gtg ctt ggg ttc cag ctt cca cag atg gac ctt cca ccc cca ggg gcc 5399 Val Leu Gly Phe Gln Leu Pro Gln Met Asp Leu Pro Pro Pro Gly Ala 1660 1665 1670 ccc tgg ctc cct gtg tgt tcc atg gtc att cag tac acc tcc cag att 5447 Pro Trp Leu Pro Val Cys Ser Met Val Ile Gln Tyr Thr Ser Gln Ile 1675 1680 1685 ccc agc tca agc cag aca cag cct gtc ctc cag tcc cag gcg gag aac 5495 Pro Ser Ser Ser Gln Thr Gln Pro Val Leu Gln Ser Gln Ala Glu Asn 1690 1695 1700 ctg ctg tgc aga aca tac cag aag tgg aag aac aag agc ctc tct cca 5543 Leu Leu Cys Arg Thr Tyr Gln Lys Trp Lys Asn Lys Ser Leu Ser Pro 1705 1710 1715 1720 ggc cag gag ttg ggg cct tct gtt gcc gag atc ccg tgg gat gac atc 5591 Gly Gln Glu Leu Gly Pro Ser Val Ala Glu Ile Pro Trp Asp Asp Ile 1725 1730 1735 atc acc tta tgc atc aat cat aag ctg agg gac tgg aca ccc ccc agg 5639 Ile Thr Leu Cys Ile Asn His Lys Leu Arg Asp Trp Thr Pro Pro Arg 1740 1745 1750 ctc cct gtc aca tta gag gcg ctg agt gaa gat ggt caa ata tgt gtg 5687 Leu Pro Val Thr Leu Glu Ala Leu Ser Glu Asp Gly Gln Ile Cys Val 1755 1760 1765 tat ttt ttc aaa aac ctt tta aga aaa tac cac gtt ccc tcg tca tgg 5735 Tyr Phe Phe Lys Asn Leu Leu Arg Lys Tyr His Val Pro Ser Ser Trp 1770 1775 1780 gaa cag gcc aga atg cag acg cag cgg gaa ctg cag ctg agt cat gga 5783 Glu Gln Ala Arg Met Gln Thr Gln Arg Glu Leu Gln Leu Ser His Gly 1785 1790 1795 1800 cgt tcg ggg atg agg tcc atc cat cct cct aca agc act ttt cct act 5831 Arg Ser Gly Met Arg Ser Ile His Pro Pro Thr Ser Thr Phe Pro Thr 1805 1810 1815 cca ttg ctt cat gta cac cag aaa ggg aag aaa aag gaa gag agt ggc 5879 Pro Leu Leu His Val His Gln Lys Gly Lys Lys Lys Glu Glu Ser Gly 1820 1825 1830 cga gag ggg agc ctc agt aca gag gac ctc ctg cgg ggg gct tct gca 5927 Arg Glu Gly Ser Leu Ser Thr Glu Asp Leu Leu Arg Gly Ala Ser Ala 1835 1840 1845 gaa gag ctc ctg gca cag agt ctg tcc agc agt ctt ctg gaa gag aag 5975 Glu Glu Leu Leu Ala Gln Ser Leu Ser Ser Ser Leu Leu Glu Glu Lys 1850 1855 1860 gaa gag aac aag agg ttt gaa gat caa ctt cag cag tgg tta tcg caa 6023 Glu Glu Asn Lys Arg Phe Glu Asp Gln Leu Gln Gln Trp Leu Ser Gln 1865 1870 1875 1880 gac tca cag gca ttc aca gag tca act cgg ctt cct ctc tac ctc cct 6071 Asp Ser Gln Ala Phe Thr Glu Ser Thr Arg Leu Pro Leu Tyr Leu Pro 1885 1890 1895 cag acg cta gtg tcc ttt cct gat tct atc aaa act cag acc atg gtg 6119 Gln Thr Leu Val Ser Phe Pro Asp Ser Ile Lys Thr Gln Thr Met Val 1900 1905 1910 aaa aca tct aca agt cct cag aat tca gga aca gga aag cag ttg agg 6167 Lys Thr Ser Thr Ser Pro Gln Asn Ser Gly Thr Gly Lys Gln Leu Arg 1915 1920 1925 ttc tca gag gca tcc ggt tca tcc ctg acg gaa aag ctg aag ctc ctg 6215 Phe Ser Glu Ala Ser Gly Ser Ser Leu Thr Glu Lys Leu Lys Leu Leu 1930 1935 1940 gaa agg ctg atc cag agc tca agg gcg gaa gaa gca gcc tcc gag ctg 6263 Glu Arg Leu Ile Gln Ser Ser Arg Ala Glu Glu Ala Ala Ser Glu Leu 1945 1950 1955 1960 cac ctc tct gca ctg ctg gag atg gtg gac atg tagc tgtctgacgg 6310 His Leu Ser Ala Leu Leu Glu Met Val Asp Met 1965 1970 gagacggatc tctaattcat aatgctttgt ctgtattcaa ttgtgttata gatgctgttg 6370 gaaatgtgac tattaattat gcaaataaac tttttgaatc attccaaaaa aaaaaccat 6429 <210> 2 <211> 1971 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met His Pro Val Asn Pro Phe Gly Gly Ser Ser Pro Ser Ala Phe Ala 1 5 10 15 Val Ser Ser Ser Thr Thr Gly Thr Tyr Gln Thr Lys Ser Pro Phe Arg 20 25 30 Phe Gly Gln Pro Ser Leu Phe Gly Gln Asn Ser Thr Pro Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Ala Phe Ser Gln Val Pro Ser Phe Ala Thr Pro Ser Gly Gly Ser 50 55 60 His Ser Ser Ser Leu Pro Ala Phe Gly Leu Thr Gln Thr Ser Ser Val 65 70 75 80 Gly Leu Phe Ser Ser Leu Glu Ser Thr Pro Ser Phe Ala Ala Thr Ser 85 90 95 Ser Ser Ser Val Pro Gly Asn Thr Ala Phe Ser Phe Lys Ser Thr Ser 100 105 110 Ser Val Gly Val Phe Pro Ser Gly Ala Thr Phe Gly Pro Glu Thr Gly 115 120 125 Glu Val Ala Gly Ser Gly Phe Arg Lys Thr Glu Phe Lys Phe Lys Pro 130 135 140 Leu Glu Asn Ala Val Phe Lys Pro Ile Pro Gly Pro Glu Ser Glu Pro 145 150 155 160 Glu Lys Thr Gln Ser Gln Ile Ser Ser Gly Phe Phe Thr Phe Ser His 165 170 175 Pro Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Pro Phe Ser Phe Pro Gln 180 185 190 Val 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Leu Arg Gly Lys Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Arg Glu Glu Trp 405 410 415 Ile Tyr Ser Leu Gly Gly Val Ser Ser Leu Glu Leu Thr Ala Ile Gln 420 425 430 Cys Lys Asn Ile Pro Asp Tyr Leu Asn Asp Arg Ala Ile Leu Glu Lys 435 440 445 His Phe Ser Lys Ile Ala Lys Val Gln Arg Val Phe Thr Arg Arg Ser 450 455 460 Lys Lys Leu Ala Val Ile His Phe Phe Asp His Ala Ser Ala Ala Leu 465 470 475 480 Ala Arg Lys Lys Gly Lys Gly Leu His Lys Asp Val Val Ile Phe Trp 485 490 495 His Lys Lys Lys Ile Ser Pro Ser Lys Lys Leu Phe Pro Leu Lys Glu 500 505 510 Lys Leu Gly Glu Ser Glu Ala Ser Gln Gly Ile Glu Asp Ser Pro Phe 515 520 525 Gln His Ser Pro Leu Ser Lys Pro Ile Val Arg Pro Ala Ala Gly Ser 530 535 540 Leu Leu Ser Lys Ser Ser Pro Val Lys Lys Pro Ser Leu Leu Lys Met 545 550 555 560 His Gln Phe Glu Ala Asp Pro Phe Asp Ser Gly Ser Glu Gly Ser Glu 565 570 575 Gly Leu Gly Ser Cys Val Ser Ser Leu Ser Thr Leu Ile Gly Thr Val 580 585 590 Ala Asp Thr Ser Glu Glu Lys Tyr Arg Leu Leu Asp Gln Arg Asp Arg 595 600 605 Ile Met Arg Gln Ala Arg Val Lys Arg Thr Asp Leu Asp Lys Ala Arg 610 615 620 Ala Phe Val Gly Thr Cys Pro Asp Met Cys Pro Glu Lys Glu Arg Tyr 625 630 635 640 Leu Arg Glu Thr Arg Ser Gln Leu Ser Val Phe Glu Val Val Pro Gly 645 650 655 Thr Asp Gln Val Asp His Ala Ala Ala Val Lys Glu Tyr Ser Arg Ser 660 665 670 Ser Ala Asp Gln Glu Glu Pro Leu Pro His Glu Leu Arg Pro Ser Ala 675 680 685 Val Leu Ser Arg Thr Met Asp Tyr Leu Val Thr Gln Ile Met Asp Gln 690 695 700 Lys Glu Gly Ser Leu Arg Asp Trp Tyr Asp Phe Val Trp Asn Arg Thr 705 710 715 720 Arg Gly Ile Arg Lys Asp Ile Thr Gln Gln His Leu Cys Asp Pro Leu 725 730 735 Thr Val Ser Leu Ile Glu Lys Cys Thr Arg Phe His Ile His Cys Ala 740 745 750 His Phe Met Cys Glu Glu Pro Met Ser Ser Phe Asp Ala Lys Ile Asn 755 760 765 Asn Glu Asn Met Thr Lys Cys Leu Gln Ser Leu Lys Glu Met Tyr Gln 770 775 780 Asp Leu Arg Asn Lys Gly Val Phe Cys Ala Ser Glu Ala Glu Phe Gln 785 790 795 800 Gly Tyr Asn Val Leu Leu Asn Leu Asn Lys Gly Asp Ile Leu Arg Glu 805 810 815 Val Gln Gln Phe His Pro Asp Val Arg Asn Ser Pro Glu Val Asn Phe 820 825 830 Ala Val Gln Ala Phe Ala Ala Leu Asn Ser Asn Asn Phe Val Arg Phe 835 840 845 Phe Lys Leu Val Gln Ser Ala Ser Tyr Leu Asn Ala Cys Leu Leu His 850 855 860 Cys Tyr Phe Asn Gln Ile Arg Lys Asp Ala Leu Arg Ala Leu Asn Val 865 870 875 880 Ala Tyr Thr Val Ser Thr Gln Arg Ser Thr Val Phe Pro Leu Asp Gly 885 890 895 Val Val Arg Met Leu Leu Phe Arg Asp Ser Glu Glu Ala Thr Asn Phe 900 905 910 Leu Asn Tyr His Gly Leu Thr Val Ala Asp Gly Cys Val Glu Leu Asn 915 920 925 Arg Ser Ala Phe Leu Glu Pro Glu Gly Leu Cys Lys Ala Arg Lys Ser 930 935 940 Val Phe Ile Gly Arg Lys Leu Thr Val Ser Val Gly Glu Val Val Asn 945 950 955 960 Gly Gly Pro Leu Pro Pro Val Pro Arg His Thr Pro Val Cys Ser Phe 965 970 975 Asn Ser Gln Asn Lys Tyr Val Gly Glu Ser Leu Ala Thr Glu Leu Pro 980 985 990 Ile Ser Thr Gln Arg Ala Gly Gly Asp Pro Ala Gly Gly Gly Arg Gly 995 1000 1005 Glu Asp Cys Glu Ala Glu Val Asp Leu Pro Thr Leu Ala Val Leu Pro 1010 1015 1020 Gln Pro Pro Pro Ala Ser Ser Ala Thr Pro Ala Leu His Val Gln Pro 1025 1030 1035 1040 Leu Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ser Leu Leu Gln Ala Ser Thr Gln Pro 1045 1050 1055 Glu Val Leu Leu Pro Lys Pro Ala Pro Val Tyr Ser Asp Ser Asp Leu 1060 1065 1070 Val Gln Val Val Asp Glu Leu Ile Gln Glu Ala Leu Gln Val Asp Cys 1075 1080 1085 Glu Glu Val Ser Ser Ala Gly Ala Ala Tyr Val Ala Ala Ala Leu Gly 1090 1095 1100 Val Ser Asn Ala Ala Val Glu Asp Leu Ile Thr Ala Ala Thr Thr Gly 1105 1110 1115 1120 Ile Leu Arg His Val Ala Ala Glu Glu Val Ser Met Glu Arg Gln Arg 1125 1130 1135 Leu Glu Glu Glu Lys Gln Arg Ala Glu Glu Glu Arg Leu Lys Gln Glu 1140 1145 1150 Arg Glu Leu Met Leu Thr Gln Leu Ser Glu Gly Leu Ala Ala Glu Leu 1155 1160 1165 Thr Glu Leu Thr Val Thr Glu Cys Val Trp Glu Thr Cys Ser Gln Glu 1170 1175 1180 Leu Gln Ser Ala Val Lys Ile Asp Gln Lys Val Arg Val Ala Arg Cys 1185 1190 1195 1200 Cys Glu Ala Val Cys Ala His Leu Val Asp Leu Phe Leu Ala Glu Glu 1205 1210 1215 Ile Phe Gln Thr Ala Lys Glu Thr Leu Gln Glu Leu Gln Cys Phe Cys 1220 1225 1230 Lys Tyr Leu Gln Arg Trp Arg Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Lys Phe 1235 1240 1245 Arg Arg Gln Met Arg Ala Phe Pro Ala Ala Pro Cys Cys Val Asp Val 1250 1255 1260 Asn Asp Arg Leu Gln Ala Leu Val Pro Ser Ala Glu Cys Pro Ile Thr 1265 1270 1275 1280 Glu Glu Asn Leu Ala Lys Gly Leu Leu Asp Leu Gly His Ala Gly Lys 1285 1290 1295 Val Gly Val Ser Cys Thr Arg Leu Arg Arg Leu Arg Asn Lys Thr Ala 1300 1305 1310 His Gln Ile Lys Val Gln His Phe His Gln Gln Leu Leu Arg Asn Ala 1315 1320 1325 Ala Trp Ala Pro Leu Asp Leu Pro Ser Ile Val Ser Glu His Leu Pro 1330 1335 1340 Met Lys Gln Lys Arg Arg Phe Trp Lys Leu Val Leu Val Leu Pro Asp 1345 1350 1355 1360 Val Glu Glu Gln Thr Pro Glu Ser Pro Gly Arg Ile Leu Glu Asn Trp 1365 1370 1375 Leu Lys Val Lys Phe Thr Gly Asp Asp Ser Met Val Gly Asp Ile Gly 1380 1385 1390 Asp Asn Ala Gly Asp Ile Gln Thr Leu Ser Val Phe Asn Thr Leu Ser 1395 1400 1405 Ser Lys Gly Asp Gln Thr Val Ser Val Asn Val Cys Ile Lys Val Ala 1410 1415 1420 His Gly Thr Leu Ser Asp Ser Ala Leu Asp Ala Val Glu Thr Gln Lys 1425 1430 1435 1440 Asp Leu Leu Gly Thr Ser Gly Leu Met Leu Leu Leu Pro Pro Lys Val 1445 1450 1455 Lys Ser Glu Glu Val Ala Glu Glu Glu Leu Ser Trp Leu Ser Ala Leu 1460 1465 1470 Leu Gln Leu Lys Gln Leu Leu Gln Ala Lys Pro Phe Gln Pro Ala Leu 1475 1480 1485 Pro Leu Val Val Leu Val Pro Ser Ser Arg Gly Asp Ser Ala Gly Arg 1490 1495 1500 Ala Val Glu Asp Gly Leu Met Leu Gln Asp Leu Val Ser Ala Lys Leu 1505 1510 1515 1520 Ile Ser Asp Tyr Ile Val Val Glu Ile Pro Asp Ser Val Asn Asp Leu 1525 1530 1535 Gln Gly Thr Val Lys Val Ser Gly Ala Val Gln Trp Leu Ile Ser Gly 1540 1545 1550 Cys Pro Gln Ala Leu Asp Leu Cys Cys Gln Thr Leu Val Gln Tyr Val 1555 1560 1565 Glu Asp Gly Ile Ser Arg Glu Phe Ser Arg Arg Phe Phe His Asp Arg 1570 1575 1580 Arg Glu Arg Arg Leu Ala Ser Leu Pro Ser Gln Glu Pro Ser Thr Ile 1585 1590 1595 1600 Ile Glu Leu Phe Asn Ser Val Leu Gln Phe Leu Ala Ser Val Val Ser 1605 1610 1615 Ser Glu Gln Leu Cys Asp Ile Ser Trp Pro Val Met Glu Phe Ala Glu 1620 1625 1630 Val Gly Gly Ser Gln Leu Leu Pro His Leu His Trp Asn Ser Pro Glu 1635 1640 1645 His Leu Ala Trp Leu Lys Gln Ala Val Leu Gly Phe Gln Leu Pro Gln 1650 1655 1660 Met Asp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Trp Leu Pro Val Cys Ser Met 1665 1670 1675 1680 Val Ile Gln Tyr Thr Ser Gln Ile Pro Ser Ser Ser Gln Thr Gln Pro 1685 1690 1695 Val Leu Gln Ser Gln Ala Glu Asn Leu Leu Cys Arg Thr Tyr Gln Lys 1700 1705 1710 Trp Lys Asn Lys Ser Leu Ser Pro Gly Gln Glu Leu Gly Pro Ser Val 1715 1720 1725 Ala Glu Ile Pro Trp Asp Asp Ile Ile Thr Leu Cys Ile Asn His Lys 1730 1735 1740 Leu Arg Asp Trp Thr Pro Pro Arg Leu Pro Val Thr Leu Glu Ala Leu 1745 1750 1755 1760 Ser Glu Asp Gly Gln Ile Cys Val Tyr Phe Phe Lys Asn Leu Leu Arg 1765 1770 1775 Lys Tyr His Val Pro Ser Ser Trp Glu Gln Ala Arg Met Gln Thr Gln 1780 1785 1790 Arg Glu Leu Gln Leu Ser His Gly Arg Ser Gly Met Arg Ser Ile His 1795 1800 1805 Pro Pro Thr Ser Thr Phe Pro Thr Pro Leu Leu His Val His Gln Lys 1810 1815 1820 Gly Lys Lys Lys Glu Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ser Leu Ser Thr Glu 1825 1830 1835 1840 Asp Leu Leu Arg Gly Ala Ser Ala Glu Glu Leu Leu Ala Gln Ser Leu 1845 1850 1855 Ser Ser Ser Leu Leu Glu Glu Lys Glu Glu Asn Lys Arg Phe Glu Asp 1860 1865 1870 Gln Leu Gln Gln Trp Leu Ser Gln Asp Ser Gln Ala Phe Thr Glu Ser 1875 1880 1885 Thr Arg Leu Pro Leu Tyr Leu Pro Gln Thr Leu Val Ser Phe Pro Asp 1890 1895 1900 Ser Ile Lys Thr Gln Thr Met Val Lys Thr Ser Thr Ser Pro Gln Asn 1905 1910 1915 1920 Ser Gly Thr Gly Lys Gln Leu Arg Phe Ser Glu Ala Ser Gly Ser Ser 1925 1930 1935 Leu Thr Glu Lys Leu Lys Leu Leu Glu Arg Leu Ile Gln Ser Ser Arg 1940 1945 1950 Ala Glu Glu Ala Ala Ser Glu Leu His Leu Ser Ala Leu Leu Glu Met 1955 1960 1965 Val Asp Met 1970 <210> 3 <211> 6114 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (38)..(5977) <400> 3 gtaatactta attaccttct aataattgga gcagaag atg aac cca act aat 52 Met Asn Pro Thr Asn 1 5 cct ttc agt ggg cag cag cct agt gct ttt tcg gcg tct tct agt aat 100 Pro Phe Ser Gly Gln Gln Pro Ser Ala Phe Ser Ala Ser Ser Ser Asn 10 15 20 gta gga aca ctt cca tct aag ccg cca ttt cga ttt ggt caa cct tct 148 Val Gly Thr Leu Pro Ser Lys Pro Pro Phe Arg Phe Gly Gln Pro Ser 25 30 35 ctt ttt gga caa aac agt acc tta tct ggg aag agc tcg gga ttt tca 196 Leu Phe Gly Gln Asn Ser Thr Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Phe Ser 40 45 50 cag gta tcc agc ttt cca gcg tct tct gga gta agt cat tcc tct tca 244 Gln Val Ser Ser Phe Pro Ala Ser Ser Gly Val Ser His Ser Ser Ser 55 60 65 gtg caa aca tta ggg ttc acc caa acc tca agt gtt gga ccc ttt tct 292 Val Gln Thr Leu Gly Phe Thr Gln Thr Ser Ser Val Gly Pro Phe Ser 70 75 80 85 gga ctt gag cac act tcc acc ttt gtg gct acc tct ggg cct tca agt 340 Gly Leu Glu His Thr Ser Thr Phe Val Ala Thr Ser Gly Pro Ser Ser 90 95 100 tca tct gtg ctg gga aac aca gga ttt agt ttt aaa tca ccc acc agt 388 Ser Ser Val Leu Gly Asn Thr Gly Phe Ser Phe Lys Ser Pro Thr Ser 105 110 115 gtt ggg gct ttc cca agc act tct gct ttt gga caa gaa gct gga gaa 436 Val Gly Ala Phe Pro Ser Thr Ser Ala Phe Gly Gln Glu Ala Gly Glu 120 125 130 ata gtg aac tct ggt ttt ggg aaa aca gaa ttc agc ttt aaa cct ctg 484 Ile Val Asn Ser Gly Phe Gly Lys Thr Glu Phe Ser Phe Lys Pro Leu 135 140 145 gaa aat gca gtg ttc aaa cca ata ctg ggg gct gaa tct gag cca gag 532 Glu Asn Ala Val Phe Lys Pro Ile Leu Gly Ala Glu Ser Glu Pro Glu 150 155 160 165 aaa acc cag agc caa att gct tct ggg ttt ttt aca ttt tcc cac cca 580 Lys Thr Gln Ser Gln Ile Ala Ser Gly Phe Phe Thr Phe Ser His Pro 170 175 180 att agt agt gca cct gga ggc ctg gcc cct ttc tct ttt cct caa gta 628 Ile Ser Ser Ala Pro Gly Gly Leu Ala Pro Phe Ser Phe Pro Gln Val 185 190 195 aca agt agt tca gct acc act tca aat ttt acc ttt tca aaa cct gtt 676 Thr Ser Ser Ser Ala Thr Thr Ser Asn Phe Thr Phe Ser Lys Pro Val 200 205 210 agt agt aat aat tca tta tct gcc ttt acc cct gct ttg tca aac caa 724 Ser Ser Asn Asn Ser Leu Ser Ala Phe Thr Pro Ala Leu Ser Asn Gln 215 220 225 aat gta gag gaa gag aag aga gga cct aag tca ata ttt gga agt tct 772 Asn Val Glu Glu Glu Lys Arg Gly Pro Lys Ser Ile Phe Gly Ser Ser 230 235 240 245 aat aat agc ttc agt agc ttc cct gta tca tct gcg gtt ttg ggc gaa 820 Asn Asn Ser Phe Ser Ser Phe Pro Val Ser Ser Ala Val Leu Gly Glu 250 255 260 cct ttc cag gct agc aaa gca ggt gtc agg cag ggg tgt gaa gaa gct 868 Pro Phe Gln Ala Ser Lys Ala Gly Val Arg Gln Gly Cys Glu Glu Ala 265 270 275 gtt tcc cag gtg gaa cca ctt ccc agc cta atg aaa gga ctg aaa agg 916 Val Ser Gln Val Glu Pro Leu Pro Ser Leu Met Lys Gly Leu Lys Arg 280 285 290 aag gag gac cag gat cgc tcc cca agg aga cat ggc cac gag cca gca 964 Lys Glu Asp Gln Asp Arg Ser Pro Arg Arg His Gly His Glu Pro Ala 295 300 305 gaa gat tcg gat cct ctg tcc cgg ggc gat cat cct cca gac aaa cga 1012 Glu Asp Ser Asp Pro Leu Ser Arg Gly Asp His Pro Pro Asp Lys Arg 310 315 320 325 cct gtc cgc ctg aat cga ccc cgg gga ggt act tta ttt ggt cgg acg 1060 Pro Val Arg Leu Asn Arg Pro Arg Gly Gly Thr Leu Phe Gly Arg Thr 330 335 340 ata cag gat gtt ttc aaa agc aat aag gaa gta ggt cgt ctg ggc aac 1108 Ile Gln Asp Val Phe Lys Ser Asn Lys Glu Val Gly Arg Leu Gly Asn 345 350 355 aag gag gcc aaa aag gaa act ggc ttt gtt gag tct gca gaa agt gac 1156 Lys Glu Ala Lys Lys Glu Thr Gly Phe Val Glu Ser Ala Glu Ser Asp 360 365 370 cac atg gct atc cca gga ggg aat cag tct gtc ctg gca cct tcc cgg 1204 His Met Ala Ile Pro Gly Gly Asn Gln Ser Val Leu Ala Pro Ser Arg 375 380 385 att cca ggt gtg aat aaa gag gaa gaa act gaa agt aga gag aag aaa 1252 Ile Pro Gly Val Asn Lys Glu Glu Glu Thr Glu Ser Arg Glu Lys Lys 390 395 400 405 gaa gat tct cta aga gga act ccg gcg cgt cag agt aac aga agc gag 1300 Glu Asp Ser Leu Arg Gly Thr Pro Ala Arg Gln Ser Asn Arg Ser Glu 410 415 420 agc aca gac agt ctt ggg ggc ttg tct ccc tct gaa gtc aca gcc atc 1348 Ser Thr Asp Ser Leu Gly Gly Leu Ser Pro Ser Glu Val Thr Ala Ile 425 430 435 cag tgc aag aac atc cct gac tac ctc aac gac agg acc att ctg gag 1396 Gln Cys Lys Asn Ile Pro Asp Tyr Leu Asn Asp Arg Thr Ile Leu Glu 440 445 450 aac cat ttt ggc aaa att gct aaa gtg cag cgc atc ttt acc agg cgc 1444 Asn His Phe Gly Lys Ile Ala Lys Val Gln Arg Ile Phe Thr Arg Arg 455 460 465 agc aaa aag ctt gca gtg gta cat ttc ttt gat cat gca tct gca gcc 1492 Ser Lys Lys Leu Ala Val Val His Phe Phe Asp His Ala Ser Ala Ala 470 475 480 485 ctg gct aga aag aag ggg aaa agt ttg cat aaa gac atg gct atc ttt 1540 Leu Ala Arg Lys Lys Gly Lys Ser Leu His Lys Asp Met Ala Ile Phe 490 495 500 tgg cac agg aag aaa ata agc ccc aat aag aaa ccc ttt tcc ctg aag 1588 Trp His Arg Lys Lys Ile Ser Pro Asn Lys Lys Pro Phe Ser Leu Lys 505 510 515 gag aag aaa cca ggt gac ggt gaa gtc agc ccg agc aca gag gat gca 1636 Glu Lys Lys Pro Gly Asp Gly Glu Val Ser Pro Ser Thr Glu Asp Ala 520 525 530 ccc ttt cag cac tct cct ctt ggc aag gcc gca ggg agg act ggt gct 1684 Pro Phe Gln His Ser Pro Leu Gly Lys Ala Ala Gly Arg Thr Gly Ala 535 540 545 agc agc ctc ctg aat aaa agc tct cca gtg aag aag cca agt ctt cta 1732 Ser Ser Leu Leu Asn Lys Ser Ser Pro Val Lys Lys Pro Ser Leu Leu 550 555 560 565 aag gcc cac caa ttc gag gga gac tct ttt gac tca gcc tcc gag ggc 1780 Lys Ala His Gln Phe Glu Gly Asp Ser Phe Asp Ser Ala Ser Glu Gly 570 575 580 tcc gag ggc ctc ggg cca tgt gtg ctc tcc ctc agt acc ctg ata ggc 1828 Ser Glu Gly Leu Gly Pro Cys Val Leu Ser Leu Ser Thr Leu Ile Gly 585 590 595 act gtg gct gag aca tcc aag gag aag tac cgc ctg ctt gac cag aga 1876 Thr Val Ala Glu Thr Ser Lys Glu Lys Tyr Arg Leu Leu Asp Gln Arg 600 605 610 gac agg atc atg cgg caa gct cgg gtg aag aga acc gat ctg gac aaa 1924 Asp Arg Ile Met Arg Gln Ala Arg Val Lys Arg Thr Asp Leu Asp Lys 615 620 625 gcg agg act ttt gtt ggc acc tgc ctg gat atg tgt cct gag aag gag 1972 Ala Arg Thr Phe Val Gly Thr Cys Leu Asp Met Cys Pro Glu Lys Glu 630 635 640 645 agg tac atg cgg gag acc cgt agc cag ctg agc gtg ttc gaa gtg gtc 2020 Arg Tyr Met Arg Glu Thr Arg Ser Gln Leu Ser Val Phe Glu Val Val 650 655 660 cca ggg act gac cag gtg gac cac gca gca gct gtg aaa gag tac agt 2068 Pro Gly Thr Asp Gln Val Asp His Ala Ala Ala Val Lys Glu Tyr Ser 665 670 675 cgg tcc tcg gcg gat cag gag gag ccc ctg ccc cac gag ctg cgg ccc 2116 Arg Ser Ser Ala Asp Gln Glu Glu Pro Leu Pro His Glu Leu Arg Pro 680 685 690 ttg cca gtg ctc agc agg acc atg gac tac ctg gtg acc cag atc atg 2164 Leu Pro Val Leu Ser Arg Thr Met Asp Tyr Leu Val Thr Gln Ile Met 695 700 705 gac cag aag gag ggc agc ctg cgg gat tgg tat gac ttc gtg tgg aac 2212 Asp Gln Lys Glu Gly Ser Leu Arg Asp Trp Tyr Asp Phe Val Trp Asn 710 715 720 725 cgc acg cgt ggc ata cgg aag gat atc acg cag cag cac ctc tgt gac 2260 Arg Thr Arg Gly Ile Arg Lys Asp Ile Thr Gln Gln His Leu Cys Asp 730 735 740 ccc ctg acg gtg tcc ctg att gag aag tgc acc cgg ttt cac atc cac 2308 Pro Leu Thr Val Ser Leu Ile Glu Lys Cys Thr Arg Phe His Ile His 745 750 755 tgt gcc cac ttc atg tgt gag gag ccc atg tcc tcc ttt gat gcc aag 2356 Cys Ala His Phe Met Cys Glu Glu Pro Met Ser Ser Phe Asp Ala Lys 760 765 770 atc aat aat gag aac atg acc aag tgc ctg cag agc ctg aag gag atg 2404 Ile Asn Asn Glu Asn Met Thr Lys Cys Leu Gln Ser Leu Lys Glu Met 775 780 785 tac cag gac ctg aga aac aag ggt gtc ttc tgt gcc agc gaa gcg gag 2452 Tyr Gln Asp Leu Arg Asn Lys Gly Val Phe Cys Ala Ser Glu Ala Glu 790 795 800 805 ttc cag ggc tac aat gtt ctg ctc agt ctc aac aag gga gac atc cta 2500 Phe Gln Gly Tyr Asn Val Leu Leu Ser Leu Asn Lys Gly Asp Ile Leu 810 815 820 aga gaa gta caa cag ttc cat cct gct gtt aga aac tca tct gag gtg 2548 Arg Glu Val Gln Gln Phe His Pro Ala Val Arg Asn Ser Ser Glu Val 825 830 835 aaa ttt gct gtt cag gct ttt gct gca ttg aac agt aat aat ttt gtg 2596 Lys Phe Ala Val Gln Ala Phe Ala Ala Leu Asn Ser Asn Asn Phe Val 840 845 850 aga ttt ttc aaa ctg gtc cag tca gct tct tac ctg aac gct tgt ctt 2644 Arg Phe Phe Lys Leu Val Gln Ser Ala Ser Tyr Leu Asn Ala Cys Leu 855 860 865 tta cac tgt tac ttc agt cag atc cgc aag gat gct ctc cgg gcg ctc 2692 Leu His Cys Tyr Phe Ser Gln Ile Arg Lys Asp Ala Leu Arg Ala Leu 870 875 880 885 aac ttt gcg tac acg gtg agc aca cag cga tct acc atc ttt ccc ctg 2740 Asn Phe Ala Tyr Thr Val Ser Thr Gln Arg Ser Thr Ile Phe Pro Leu 890 895 900 gat ggt gtg gtg cgc atg ctg ctg ttc aga gac tgt gaa gag gcc acc 2788 Asp Gly Val Val Arg Met Leu Leu Phe Arg Asp Cys Glu Glu Ala Thr 905 910 915 gac ttc ctc acc tgc cac ggc ctc acc gtt tcc gac ggc tgt gtg gag 2836 Asp Phe Leu Thr Cys His Gly Leu Thr Val Ser Asp Gly Cys Val Glu 920 925 930 ctg aac cgg tct gca ttc ctg gaa cca gag gga tta tcc aag acc agg 2884 Leu Asn Arg Ser Ala Phe Leu Glu Pro Glu Gly Leu Ser Lys Thr Arg 935 940 945 aag tcg gtg ttt att act agg aag ctg acg gtg tca gtc ggg gaa att 2932 Lys Ser Val Phe Ile Thr Arg Lys Leu Thr Val Ser Val Gly Glu Ile 950 955 960 965 gtg aac gga ggg cca ttg ccc ccc gtc cct cgt cac acc cct gtg tgc 2980 Val Asn Gly Gly Pro Leu Pro Pro Val Pro Arg His Thr Pro Val Cys 970 975 980 agc ttc aac tcc cag aac aag tac atc ggg gag agc ctg gcc gcg gag 3028 Ser Phe Asn Ser Gln Asn Lys Tyr Ile Gly Glu Ser Leu Ala Ala Glu 985 990 995 ctg ccc gtc agc acc cag aga ccc ggc tcc gac aca gtg ggc gga ggg 3076 Leu Pro Val Ser Thr Gln Arg Pro Gly Ser Asp Thr Val Gly Gly Gly 1000 1005 1010 aga gga gag gag tgt ggt gta gag ccg gat gca ccc ctg tcc agt ctc 3124 Arg Gly Glu Glu Cys Gly Val Glu Pro Asp Ala Pro Leu Ser Ser Leu 1015 1020 1025 cca cag tct cta cca gcc cct gcg ccc tca cca gtg cct ctg cct cct 3172 Pro Gln Ser Leu Pro Ala Pro Ala Pro Ser Pro Val Pro Leu Pro Pro 1030 1035 1040 1045 gtc ctg gca ctg acc ccg tct gtg gcg ccc agc ctc ttc cag ctg tct 3220 Val Leu Ala Leu Thr Pro Ser Val Ala Pro Ser Leu Phe Gln Leu Ser 1050 1055 1060 gtg cag cct gaa cca ccg cct cca gag ccc gtg ccc atg tac tct gac 3268 Val Gln Pro Glu Pro Pro Pro Pro Glu Pro Val Pro Met Tyr Ser Asp 1065 1070 1075 gag gac ctg gcg cag gtg gtg gac gag ctc atc cag gag gcc ctg cag 3316 Glu Asp Leu Ala Gln Val Val Asp Glu Leu Ile Gln Glu Ala Leu Gln 1080 1085 1090 agg gac tgt gag gaa gtt ggc tct gcg ggt gct gcc tac gca gct gcc 3364 Arg Asp Cys Glu Glu Val Gly Ser Ala Gly Ala Ala Tyr Ala Ala Ala 1095 1100 1105 gcc ctg ggt gtt tct aat gct gct atg gag gat ttg tta aca gct gca 3412 Ala Leu Gly Val Ser Asn Ala Ala Met Glu Asp Leu Leu Thr Ala Ala 1110 1115 1120 1125 acc acg ggc att ttg agg cac att gca gct gaa gaa gtg tct aag gaa 3460 Thr Thr Gly Ile Leu Arg His Ile Ala Ala Glu Glu Val Ser Lys Glu 1130 1135 1140 aga gag cga agg gag cag gag agg cag cgg gct gaa gag gaa agg ttg 3508 Arg Glu Arg Arg Glu Gln Glu Arg Gln Arg Ala Glu Glu Glu Arg Leu 1145 1150 1155 aaa caa gag aga gag ctg gtg tta agt gag ctg agc cag ggc ctg gcc 3556 Lys Gln Glu Arg Glu Leu Val Leu Ser Glu Leu Ser Gln Gly Leu Ala 1160 1165 1170 gtg gag ctg atg gaa cgc gtg atg atg gag ttt gtg agg gaa acc tgc 3604 Val Glu Leu Met Glu Arg Val Met Met Glu Phe Val Arg Glu Thr Cys 1175 1180 1185 tcc cag gag ttg aag aat gca gta gag aca gac cag agg gtc cgt gtg 3652 Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ala Val Glu Thr Asp Gln Arg Val Arg Val 1190 1195 1200 1205 gcc cgt tgc tgt gag gat gtc tgt gcc cac tta gtg gac ttg ttt ctc 3700 Ala Arg Cys Cys Glu Asp Val Cys Ala His Leu Val Asp Leu Phe Leu 1210 1215 1220 gtg gag gaa atc ttc cag act gca aag gag acc ctc cag gag ctt cag 3748 Val Glu Glu Ile Phe Gln Thr Ala Lys Glu Thr Leu Gln Glu Leu Gln 1225 1230 1235 tgc ttc tgc aag tat cta cag cgg tgg agg gaa gct gtc aca gcc cgc 3796 Cys Phe Cys Lys Tyr Leu Gln Arg Trp Arg Glu Ala Val Thr Ala Arg 1240 1245 1250 aag aaa ctg agg cgc caa atg cgg gct ttc cct gct gcg ccc tgc tgc 3844 Lys Lys Leu Arg Arg Gln Met Arg Ala Phe Pro Ala Ala Pro Cys Cys 1255 1260 1265 gtg gac gtg agc gac cgg ctg agg gcg ctg gcg ccc agc gca gag tgc 3892 Val Asp Val Ser Asp Arg Leu Arg Ala Leu Ala Pro Ser Ala Glu Cys 1270 1275 1280 1285 ccc att gct gaa gag aac ctg gcc agg ggc ctc ctg gac ctg ggc cat 3940 Pro Ile Ala Glu Glu Asn Leu Ala Arg Gly Leu Leu Asp Leu Gly His 1290 1295 1300 gca ggg aga ttg ggc atc tct tgc acc agg tta agg cgg ctc aga aac 3988 Ala Gly Arg Leu Gly Ile Ser Cys Thr Arg Leu Arg Arg Leu Arg Asn 1305 1310 1315 aag aca gct cac cag atg aag gtt cag cac ttc tac cag cag ctg ctg 4036 Lys Thr Ala His Gln Met Lys Val 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caa ggt tca act aag gtt ttg caa gca gtg cag tgg ctg 4708 Asn Asp Leu Gln Gly Ser Thr Lys Val Leu Gln Ala Val Gln Trp Leu 1545 1550 1555 gtt tcc cac tgc ccc cat tcc ctt gac ctc tgc tgc cag act ctc att 4756 Val Ser His Cys Pro His Ser Leu Asp Leu Cys Cys Gln Thr Leu Ile 1560 1565 1570 cag tac gtc gaa gac ggg att ggc cat gag ttt agt ggc cgc ttt ttc 4804 Gln Tyr Val Glu Asp Gly Ile Gly His Glu Phe Ser Gly Arg Phe Phe 1575 1580 1585 cat gac aga aga gag agg cgt ctg ggc ggt ctt gct tct cag gag cct 4852 His Asp Arg Arg Glu Arg Arg Leu Gly Gly Leu Ala Ser Gln Glu Pro 1590 1595 1600 1605 ggc gcc atc att gag ctg ttt aac agt gtg ctg cag ttc ctg gct tct 4900 Gly Ala Ile Ile Glu Leu Phe Asn Ser Val Leu Gln Phe Leu Ala Ser 1610 1615 1620 gtg gtg tcc tct gaa cag ctg tgt gac ctg tcc tgg cct gtc act gag 4948 Val Val Ser Ser Glu Gln Leu Cys Asp Leu Ser Trp Pro Val Thr Glu 1625 1630 1635 ttt gct gag gca ggg ggc agc cgg ctg ctt cct cac ctg cac tgg aat 4996 Phe Ala Glu Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Pro His 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Lys Leu Arg Asp Trp Thr Pro Pro Arg Leu Pro Val Thr Ser 1750 1755 1760 1765 gag gcg ctg agt gaa gat ggt cag ata tgt gtg tat ttt ttt aaa aac 5380 Glu Ala Leu Ser Glu Asp Gly Gln Ile Cys Val Tyr Phe Phe Lys Asn 1770 1775 1780 gat ttg aaa aaa tat gat gtt cct ttg tcg tgg gaa caa gcc agg ttg 5428 Asp Leu Lys Lys Tyr Asp Val Pro Leu Ser Trp Glu Gln Ala Arg Leu 1785 1790 1795 cag acg cag aag gag cta cag ctg aga gag gga cgt ttg gca ata aag 5476 Gln Thr Gln Lys Glu Leu Gln Leu Arg Glu Gly Arg Leu Ala Ile Lys 1800 1805 1810 cct ttt cat cct tct gca aac aat ttt ccc ata cca ttg ctt cac atg 5524 Pro Phe His Pro Ser Ala Asn Asn Phe Pro Ile Pro Leu Leu His Met 1815 1820 1825 cac cgt aac tgg aag agg agc aca gag tgt gct caa gag ggg agg att 5572 His Arg Asn Trp Lys Arg Ser Thr Glu Cys Ala Gln Glu Gly Arg Ile 1830 1835 1840 1845 ccc agc aca gag gat ctg atg cga gga gct tct gct gag gag ctc ttg 5620 Pro Ser Thr Glu Asp Leu Met Arg Gly Ala Ser Ala Glu Glu Leu Leu 1850 1855 1860 gcg cag tgt ttg tcg agc agt ctg ctg ctg gag aaa gaa gag aac aag 5668 Ala Gln Cys Leu Ser Ser Ser Leu Leu Leu Glu Lys Glu Glu Asn Lys 1865 1870 1875 agg ttt gaa gat cag ctt cag caa tgg ttg tct gaa gac tca gga gca 5716 Arg Phe Glu Asp Gln Leu Gln Gln Trp Leu Ser Glu Asp Ser Gly Ala 1880 1885 1890 ttt acg gat tta act tcc ctt ccc ctc tat ctt cct cag act cta gtg 5764 Phe Thr Asp Leu Thr Ser Leu Pro Leu Tyr Leu Pro Gln Thr Leu Val 1895 1900 1905 tct ctt tct cac act att gaa cct gtg atg aaa aca tct gta act act 5812 Ser Leu Ser His Thr Ile Glu Pro Val Met Lys Thr Ser Val Thr Thr 1910 1915 1920 1925 agc cca cag agt gac atg atg agg gag caa ctg cag ctg tca gag gcg 5860 Ser Pro Gln Ser Asp Met Met Arg Glu Gln Leu Gln Leu Ser Glu Ala 1930 1935 1940 aca gga acg tgt cta ggc gaa cga cta aag cac ctg gaa agg ctg atc 5908 Thr Gly Thr Cys Leu Gly Glu Arg Leu Lys His Leu Glu Arg Leu Ile 1945 1950 1955 cgg agt tca agg gaa gag gaa gtt gcc tct gag ctc cat ctc tct gcg 5956 Arg Ser Ser Arg Glu Glu Glu Val Ala Ser Glu Leu His Leu Ser Ala 1960 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Gln Phe Glu Gly Asp Ser Phe Asp 565 570 575 Ser Ala Ser Glu Gly Ser Glu Gly Leu Gly Pro Cys Val Leu Ser Leu 580 585 590 Ser Thr Leu Ile Gly Thr Val Ala Glu Thr Ser Lys Glu Lys Tyr Arg 595 600 605 Leu Leu Asp Gln Arg Asp Arg Ile Met Arg Gln Ala Arg Val Lys Arg 610 615 620 Thr Asp Leu Asp Lys Ala Arg Thr Phe Val Gly Thr Cys Leu Asp Met 625 630 635 640 Cys Pro Glu Lys Glu Arg Tyr Met Arg Glu Thr Arg Ser Gln Leu Ser 645 650 655 Val Phe Glu Val Val Pro Gly Thr Asp Gln Val Asp His Ala Ala Ala 660 665 670 Val Lys Glu Tyr Ser Arg Ser Ser Ala Asp Gln Glu Glu Pro Leu Pro 675 680 685 His Glu Leu Arg Pro Leu Pro Val Leu Ser Arg Thr Met Asp Tyr Leu 690 695 700 Val Thr Gln Ile Met Asp Gln Lys Glu Gly Ser Leu Arg Asp Trp Tyr 705 710 715 720 Asp Phe Val Trp Asn Arg Thr Arg Gly Ile Arg Lys Asp Ile Thr Gln 725 730 735 Gln His Leu Cys Asp Pro Leu Thr Val Ser Leu Ile Glu Lys Cys Thr 740 745 750 Arg Phe His Ile His Cys Ala His Phe Met Cys Glu Glu Pro Met Ser 755 760 765 Ser Phe Asp Ala Lys Ile Asn Asn Glu Asn Met Thr Lys Cys Leu Gln 770 775 780 Ser Leu Lys Glu Met Tyr Gln Asp Leu Arg Asn Lys Gly Val Phe Cys 785 790 795 800 Ala Ser Glu Ala Glu Phe Gln Gly Tyr Asn Val Leu Leu Ser Leu Asn 805 810 815 Lys Gly Asp Ile Leu Arg Glu Val Gln Gln Phe His Pro Ala Val Arg 820 825 830 Asn Ser Ser Glu Val Lys Phe Ala Val Gln Ala Phe Ala Ala Leu Asn 835 840 845 Ser Asn Asn Phe Val Arg Phe Phe Lys Leu Val Gln Ser Ala Ser Tyr 850 855 860 Leu Asn Ala Cys Leu Leu His Cys Tyr Phe Ser Gln Ile Arg Lys Asp 865 870 875 880 Ala Leu Arg Ala Leu Asn Phe Ala Tyr Thr Val Ser Thr Gln Arg Ser 885 890 895 Thr Ile Phe Pro Leu Asp Gly Val Val Arg Met Leu Leu Phe Arg Asp 900 905 910 Cys Glu Glu Ala Thr Asp Phe Leu Thr Cys His Gly Leu Thr Val Ser 915 920 925 Asp Gly Cys Val Glu Leu Asn Arg Ser Ala Phe Leu Glu Pro Glu Gly 930 935 940 Leu Ser Lys Thr Arg Lys Ser Val Phe Ile Thr Arg Lys Leu Thr Val 945 950 955 960 Ser Val Gly Glu Ile Val Asn Gly Gly Pro Leu Pro Pro Val Pro Arg 965 970 975 His Thr Pro Val Cys Ser Phe Asn Ser Gln Asn Lys Tyr Ile Gly Glu 980 985 990 Ser Leu Ala Ala Glu Leu Pro Val Ser Thr Gln Arg Pro Gly Ser Asp 995 1000 1005 Thr Val Gly Gly Gly Arg Gly Glu Glu Cys Gly Val Glu Pro Asp Ala 1010 1015 1020 Pro Leu Ser Ser Leu Pro Gln Ser Leu Pro Ala Pro Ala Pro Ser Pro 1025 1030 1035 1040 Val Pro Leu Pro Pro Val Leu Ala Leu Thr Pro Ser Val Ala Pro Ser 1045 1050 1055 Leu Phe Gln Leu Ser Val Gln Pro Glu Pro Pro Pro Pro Glu Pro Val 1060 1065 1070 Pro Met Tyr Ser Asp Glu Asp Leu Ala Gln Val Val Asp Glu Leu Ile 1075 1080 1085 Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Cys Glu Glu Val Gly Ser Ala Gly Ala 1090 1095 1100 Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Leu Gly Val Ser Asn Ala Ala Met Glu Asp 1105 1110 1115 1120 Leu Leu Thr Ala Ala Thr Thr Gly Ile Leu Arg His Ile Ala Ala Glu 1125 1130 1135 Glu Val Ser Lys Glu Arg Glu Arg Arg Glu Gln Glu Arg Gln Arg Ala 1140 1145 1150 Glu Glu Glu Arg Leu Lys Gln Glu Arg Glu Leu Val Leu Ser Glu Leu 1155 1160 1165 Ser Gln Gly Leu Ala Val Glu Leu Met Glu Arg Val Met Met Glu Phe 1170 1175 1180 Val Arg Glu Thr Cys Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ala Val Glu Thr Asp 1185 1190 1195 1200 Gln Arg Val Arg Val Ala Arg Cys Cys Glu Asp Val Cys Ala His Leu 1205 1210 1215 Val Asp Leu Phe Leu Val Glu Glu Ile Phe Gln Thr Ala Lys Glu Thr 1220 1225 1230 Leu Gln Glu Leu Gln Cys Phe Cys Lys Tyr Leu Gln Arg Trp Arg Glu 1235 1240 1245 Ala Val Thr Ala Arg Lys Lys Leu Arg Arg Gln Met Arg Ala Phe Pro 1250 1255 1260 Ala Ala Pro Cys Cys Val Asp Val Ser Asp Arg Leu Arg Ala Leu Ala 1265 1270 1275 1280 Pro Ser Ala Glu Cys Pro Ile Ala Glu Glu Asn Leu Ala Arg Gly Leu 1285 1290 1295 Leu Asp Leu Gly His Ala Gly Arg Leu Gly Ile Ser Cys Thr Arg Leu 1300 1305 1310 Arg Arg Leu Arg Asn Lys Thr Ala His Gln Met Lys Val Gln His Phe 1315 1320 1325 Tyr Gln Gln Leu Leu Ser Asp Val Ala Trp Ala Ser Leu Asp Leu Pro 1330 1335 1340 Ser Leu Val Ala Glu His Leu Pro Gly Arg Gln Glu His Val Phe Trp 1345 1350 1355 1360 Lys Leu Val Leu Val Leu Pro Asp Val Glu Glu Gln Ser Pro Glu Ser 1365 1370 1375 Cys Gly Arg Ile Leu Ala Asn Trp Leu Lys Val Lys Phe Met Gly Asp 1380 1385 1390 Glu Gly Ser Val Asp Asp Thr Ser Ser Asp Ala Gly Gly Ile Gln Thr 1395 1400 1405 Leu Ser Leu Phe Asn Ser Leu Ser Ser Lys Gly Asp Gln Met Ile Ser 1410 1415 1420 Val Asn Val Cys Ile Lys Val Ala His Gly Ala Leu Ser Asp Gly Ala 1425 1430 1435 1440 Ile Asp Ala Val Glu Thr Gln Lys Asp Leu Leu Gly Ala Ser Gly Leu 1445 1450 1455 Met Leu Leu Leu Pro Pro Lys Met Lys Ser Glu Asp Met Ala Glu Glu 1460 1465 1470 Asp Val Tyr Trp Leu Ser Ala Leu Leu Gln Leu Lys Gln Leu Leu Gln 1475 1480 1485 Ala Lys Pro Phe Gln Pro Ala Leu Pro Leu Val Val Leu Val Pro Ser 1490 1495 1500 Pro Gly Gly Asp Ala Val Glu Lys Glu Val Glu Asp Gly Leu Met Leu 1505 1510 1515 1520 Gln Asp Leu Val Ser Ala Lys Leu Ile Ser Asp Tyr Thr Val Thr Glu 1525 1530 1535 Ile Pro Asp Thr Ile Asn Asp Leu Gln Gly Ser Thr Lys Val Leu Gln 1540 1545 1550 Ala Val Gln Trp Leu Val Ser His Cys Pro His Ser Leu Asp Leu Cys 1555 1560 1565 Cys Gln Thr Leu Ile Gln Tyr Val Glu Asp Gly Ile Gly His Glu Phe 1570 1575 1580 Ser Gly Arg Phe Phe His Asp Arg Arg Glu Arg Arg Leu Gly Gly Leu 1585 1590 1595 1600 Ala Ser Gln Glu Pro Gly Ala Ile Ile Glu Leu Phe Asn Ser Val Leu 1605 1610 1615 Gln Phe Leu Ala Ser Val Val Ser Ser Glu Gln Leu Cys Asp Leu Ser 1620 1625 1630 Trp Pro Val Thr Glu Phe Ala Glu Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Pro 1635 1640 1645 His Leu His Trp Asn Ala Pro Glu His Leu Ala Trp Leu Lys Gln Ala 1650 1655 1660 Val Leu Gly Phe Gln Leu Pro Gln Met Asp Leu Pro Pro Leu Gly Ala 1665 1670 1675 1680 Pro Trp Leu Pro Val Cys Ser Met Val Val Gln Tyr Ala Ser Gln Ile 1685 1690 1695 Pro Ser Ser Arg Gln Thr Gln Pro Val Leu Gln Ser Gln Val Glu Asn 1700 1705 1710 Leu Leu His Arg Thr Tyr Cys Arg Trp Lys Ser Lys Ser Pro Ser Pro 1715 1720 1725 Val His Gly Ala Gly Pro Ser Val Met Glu Ile Pro Trp Asp Asp Leu 1730 1735 1740 Ile Ala Leu Cys Ile Asn His Lys Leu Arg Asp Trp Thr Pro Pro Arg 1745 1750 1755 1760 Leu Pro Val Thr Ser Glu Ala Leu Ser Glu Asp Gly Gln Ile Cys Val 1765 1770 1775 Tyr Phe Phe Lys Asn Asp Leu Lys Lys Tyr Asp Val Pro Leu Ser Trp 1780 1785 1790 Glu Gln Ala Arg Leu Gln Thr Gln Lys Glu Leu Gln Leu Arg Glu Gly 1795 1800 1805 Arg Leu Ala Ile Lys Pro Phe His Pro Ser Ala Asn Asn Phe Pro Ile 1810 1815 1820 Pro Leu Leu His Met His Arg Asn Trp Lys Arg Ser Thr Glu Cys Ala 1825 1830 1835 1840 Gln Glu Gly Arg Ile Pro Ser Thr Glu Asp Leu Met Arg Gly Ala Ser 1845 1850 1855 Ala Glu Glu Leu Leu Ala Gln Cys Leu Ser Ser Ser Leu Leu Leu Glu 1860 1865 1870 Lys Glu Glu Asn Lys Arg Phe Glu Asp Gln Leu Gln Gln Trp Leu Ser 1875 1880 1885 Glu Asp Ser Gly Ala Phe Thr Asp Leu Thr Ser Leu Pro Leu Tyr Leu 1890 1895 1900 Pro Gln Thr Leu Val Ser Leu Ser His Thr Ile Glu Pro Val Met Lys 1905 1910 1915 1920 Thr Ser Val Thr Thr Ser Pro Gln Ser Asp Met Met Arg Glu Gln Leu 1925 1930 1935 Gln Leu Ser Glu Ala Thr Gly Thr Cys Leu Gly Glu Arg Leu Lys His 1940 1945 1950 Leu Glu Arg Leu Ile Arg Ser Ser Arg Glu Glu Glu Val Ala Ser Glu 1955 1960 1965 Leu His Leu Ser Ala Leu Leu Asp Met Val Asp Ile 1970 1975 1980 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ctataaccat ggaccatgga catactttgt tcc 33 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tgcatgcatt ctagagttgc cgttggggtg ctggac 36 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tcccgccttc cagctgtgac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gtgctgctgt gttatgtcct 20 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 30 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ggcaccaagc atgcacggag tacacaga 28 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ggggatccat acccggtgaa cccctt 26 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gggtcgacgc gcacagactt tcccctga 28 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gggaattctc ccgccttcca gctgtgac 28 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gggtcgacgt gctgctgtgt tatgtcct 28 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 gggaattcca tgagctgaga ccctcagc 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gggtcgactg aggatgcagg aggcggct 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gggaattcta cgttggagag agcctggc 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gggtcgacca tgctgtcatc tcctgtga 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gggaattcga gaacctggcc aagggtct 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gggtcgacga aaaaccgacg gctgaact 28 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gggaattcaa gcccttccag cctgccct 28 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gggtcgaccg agggaacgtg gtattttc 28 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ggcccgggcc cgtgggatga catcatca 28 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ggctcgagca tgtccaccat ctccagca <400> 24 ggctcgagca tgtccaccat ctccagca 28 <210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ggggatccga attccaccat ggcagtcttc aaaccgatac c 41 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 gcaggggctc ctcctgatct 20 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 ggggatccga attccaccat gtccgagggc cttggttctt g 41 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 ctgtcttgtt tctaagccgc 20 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 ggggatccga attccaccat ggagaacctg gccaagggtc t 41 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 gaggacttgt agatgttttc accatgg 27 <210> 31 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 gggaattcca ccatggatta caaggatgac gacgataagg cagtcttcaa ccgatacc 58 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 gggaattcct ccgggtctcc ctcaagta 28 <210> 33 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 gggaattcca ccatggatta caaggatgac gacgataagt ccgagggcct tggttcttg 59 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 gggaattcgc tgtcttgttt ctaagccg 28 <210> 35 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 gggaattcca ccatggatta caaggatgac gacgataagg agaacctggc caagggtct 59 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 gggaattctg aggacttgta gatgtttt 28

Claims (12)

1. GANP 유전자를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유동물 또는 그 자손.
2. 제 1 항에 있어서, 도입한 GANP 유전자가 B 세포로 발현하는 것인 트랜스제닉 비인간 포유동물 또는 그 자손.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, GANP 유전자를 트랜스펙트한 ES 세포에서 발생시킨 트랜스제닉 비인간 포유동물 또는 그 자손.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 마우스인 트랜스제닉 비인간 포유동물 또는 그 자손.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 포유동물 또는 그 자손의 일부.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 포유동물 또는 그 자손에게 항원을 투여하여, 얻어지는 동물 또는 자손에서 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 고친화성 항체의 제조방법.
7. 제 6 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 고친화성 항체 또는 그 단편.
8. 제 7 항에 있어서, 친화성이 1 ×10^-7(M) 이하에서 나타나는 것인 항체 또는 그 단편.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체인 항체 또는 그 단편.
10. 제 9 항에 기재된 항체 또는 그 단편의 V 영역을 포함하는, 인간형화 항체 또는 인간 항체 또는 그들의 단편.
11. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편, 및 제 10 항에 기재된 인간형화 항체 또는 인간 항체 또는 그들의 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 함유하는 의약조성물.
12. 항원을 투여한 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 포유동물 또는 그 자손에서 채취되는 고친화성 항체 생성세포.