WO2004040969A1 - Ｇａｎｐ導入トランスジェニック哺乳動物及びその利用 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a transgenic mammal into which a GANAP gene has been introduced, and its use. More specifically, the present invention provides a transgenic mammal capable of producing a high-affinity antibody by highly expressing GANP, and a method for producing a high-affinity antibody using the transgenic mammal. , And the use of the obtained high affinity antibody.
  • a transgenic mammal capable of producing a high-affinity antibody by highly expressing GANP
  • a method for producing a high-affinity antibody using the transgenic mammal and the use of the obtained high affinity antibody.
  • the function of the immune system is classified into a cellular immune response mainly based on the effect of T cells and a humoral immunity mainly based on the effect of antibodies. In practice, the functions of both cooperate to produce an immune response.
  • Antibodies are expressed as cell surface receptors on B cells born in the bone marrow. Diversity to recognize the first antibodies formed in vivo is said to Ru top to 1 0 9-1 0 1 1 on the order, recognize any antigen determinants that may be present in the environment. However, the ability of these diverse antigen receptors to bind to antigens is generally low, often producing low-affinity antibodies, which do not provide a sufficient immune response.
  • lymphocytes especially B cells / immunoglobulins (antibodies)
  • kits for detecting antigens such as pathogens, diagnostics, and therapeutics.
  • an antibody having high reactivity with the antigen hereinafter referred to as “high affinity antibody”
  • high affinity antibody an antibody having high reactivity with the antigen
  • the sensitivity to the antigen is excellent and the same dose is used.
  • no means for increasing the affinity of the antibody has been known.
  • An object of the present invention is to provide a high-affinity antibody effective as a diagnostic or therapeutic agent for various diseases, a transgenic mammal for producing the antibody, the high-affinity antibody or a highly affinity antibody-producing cell.
  • the purpose is to provide the used drug.
  • the present inventors first created a mouse lacking the GANAP gene so as to selectively delete B cells (Example 1). As a result, there was no effect on the development, differentiation and proliferation of cells of the immune system, and no significant change was observed in the total antibody production.
  • the nitrophenyl group (NP group) which has been analyzed as a hapten, was combined with trigamma globulin (NP-CG), and the reaction of T cell-dependent antigen was examined. It is known that the reaction of C57BL / 6 mice to NP is performed in a single V region. It is known to be formed only by the V region of the IgG heavy chain of the antibody called VH18.2 and the lambda 1 gene.
  • mice were generated that overexpress the GANP gene.
  • a part of the human immunoglobulin gene intron enhancer was ligated to the 5 side and selectively expressed in B cells. This mouse is also born normally, There is no change in development, differentiation, or proliferation.
  • the high affinity V region gene was significantly increased.
  • transgenic mammal into which the GANAP gene has been introduced, its progeny, or a part thereof.
  • the introduced GANAP gene is expressed in B cells.
  • the transgenic mammal of the present invention is generated from ES cells transfected with the GANAP gene.
  • a method for producing a high-affinity antibody which comprises administering an antigen to a transgenic mammal or a progeny thereof into which a GANAP gene has been introduced to produce an antibody.
  • a high affinity antibody or a fragment thereof produced by the method for producing a high affinity antibody described above.
  • an agent for diagnosing, treating or preventing a disease comprising the above-mentioned high affinity antibody or a fragment thereof.
  • a human antibody or a fragment thereof comprising the V region of the above antibody.
  • a drug comprising the above-mentioned humanized antibody or a fragment thereof.
  • a high-affinity antibody-producing cell collected from the above-mentioned transgenic mammal or a progeny thereof to which an antigen has been administered.
  • Figure 1 shows immunohistochemical analysis of autoimmune disease models MRL / lpr, NZB and normal C57BL / 6 using anti-GANP monoclonal antibody and ALP-conjugated anti-rat Ig antibody.
  • the results performed on popliteal lymph nodes derived from female mice are shown.
  • G AN P hi cells stained with VectorBlue (ALP substrate) has been observed in the lymph nodes of the MRL / lpr mice seven weeks, not observed in NZB mice of the same age, appeared to 40 weeks.
  • FIG. 2 shows the appearance rate of GAN P hi cells in the popliteal lymph nodes of female NZB mice.
  • pSer502 G ANP was detected with anti-pSer502 G AN P (PG / 103) monoclonal antibody (blue), all sections were stained with biotin-labeled anti-B220 monoclonal antibody, and then HRP-conjugated streptavidin and DAB (brown). Were detected in combination. Representative data from two independent experiments are shown.
  • the scale bar is 100 // m.
  • the lower panel shows the cell numbers of GAN P hi (black bars) and pSer502 GANP hi (dot bars) in the extrafollicular region during calo-age.
  • Figure 3 shows the rate of appearance of the G AN P hi cells in the spleen of female NZB mice. Staining was performed as in FIG. Representative data from three independent experiments are shown. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 4 shows the results of staining of spleen sections from multiple strains of mice with an anti-GAMP monoclonal antibody.
  • GANP hi cells appeared prominently in the red pulp of MRL / lpr, NZB and B / WFK BXSB, but not in the spleen of NOD or BAI ⁇ c mice.
  • FIG. 5 shows the identification of GANP hi cells in the red pulp of the spleen.
  • Double staining of spleen sections of NZB mice using a biotin-labeled anti-B220 monoclonal antibody (left), a biotin-labeled anti-Syndecan-1 monoclonal antibody (middle), or a biotin-labeled anti-IgM monoclonal antibody (right), and GANP hi cells was identified. Stained cells doubly indicated by arrowheads, indicating that GANP hi cells are B220-Syndecari g M +. GANP expression is indicated by ALP (blue) and other markers are indicated by HRP (brown). Representative data from three independent experiments are shown.
  • FIG. 6 shows the identification of plasma cell markers in GAN Phi cells.
  • G AN P hi cells determine whether a proliferating plasma blasts were administered BrdU (lm g / mouse) to mice. Two hours later, the mice were killed and spleen sections were prepared. Sections were double-stained with anti-GA NP monoclonal antibody (blue) and anti-BrdU monoclonal antibody (red). GC shows germinal center (left). PAS staining was performed according to a conventional method. GANP single positive GANP hi cells are indicated by arrows, and PAS single positive cells are indicated by arrowheads (middle). The sections were stained with a biotin-labeled anti-CD-5 monoclonal antibody. The PALS region is shown (right). Representative data from three independent experiments are shown. The scale bar is 1 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • Figure 7 shows the expression of G AN P hi cells in the red pulp areas of the spleen of C57BL / 6 mice by TD- Ag immunization.
  • Female C57BL / 6 mice (7 weeks old) were immunized intraperitoneally with TNP-Ficoll ( ⁇ -2-Ag) or TNP-KLH (TD-Ag), and spleens were obtained 14 days later.
  • TNP KLH in immune mice showed induction of G AN P hi cells in the red pulp area (right).
  • GANP hi cells are indicated by arrows.
  • WP indicates the white pulp region. Scale bar is 100 ⁇ .
  • Figure 8 shows somatic mutations of transfectants that stably expressed mouse GANP in Daudi.
  • the VH3-CHlCrau fragment was amplified by PCR, subcloned into plasmid, and sequenced. I is silent mutation (the amino acid remains the same), and the other symbol is a mutation in which an amino acid is substituted.
  • Daudi / mock contains almost no mutations, but Daudi / GANP14, 15, 17, and 21 clones show more or less variation, albeit with varying degrees.
  • the transmutation efficiency of the transfectant introduced with a mutant (GANP S / A) in which serine at position 502 related to the control of DNA primase activity is replaced with alanine decreases the efficiency of the mutation.
  • FIG. 9 shows the generation of transgenic mice overexpressing GANP in B cells.
  • Transgenic mice overexpressing mouse GANP under the control of the Ig Enhancer Z promoter were produced ( Figures a and b). It was confirmed by RT-PCR that GANP mRNA expression was enhanced (Fig. C).
  • Figure 10 shows that GANP overexpressing transgenic (Tg) mice were immunized three times every two weeks with 50 ⁇ g of NP-CG, VH186.2 was amplified by PCR, and somatic mutations were analyzed. The results are shown. Although the number of mutations increased slightly at Tg, the mutation in which the 33rd W, which shows high affinity, was changed to L was approximately tripled at Tg.
  • FIG. 11 shows production of a B cell-specific GANP-deficient mouse (B-K0). ⁇ mice in which exon 2 was inserted in the ⁇ sequence were produced and crossed with CD19-Cre mice to establish mice that lack GANP in B cells (FIGS. A and b). The absence of GANP expression in B cells was confirmed by RT-PCR and cell staining (FIGS. C and d).
  • FIG. 12 shows the results of cell surface staining using B cell-specific GANP-deficient mice (B-K0). There was no difference between WT (wild type) and B-K0. The IgM + IgD + population was reduced in B-K0 lymph nodes.
  • FIG. 13 shows the results of the proliferation assay. Although there was little difference, only CD40-stimulated proliferation was reduced by about half.
  • FIGS. 14 to 16 show the results of measurement of antigen-specific antibody production in B-K0 mice.
  • Anti-TNP antibody titer was measured by ELISA 14 days after immunization with TNP-Ficoll, a TI antigen, and there was no particular difference.
  • the TD antigen, TNP-KLH showed little difference after 10 days, but was slightly higher in B-K0 after 14 days.
  • Examination of germinal center (GC) formation revealed that B-K0 had slightly worse GC formation 10 days after immunization. However, after 14 days, the number of B-K0 was larger than that of WT, and GC formation was prolonged even after 20 days.
  • Figures 17 and 18 show impaired affinity maturation in B-K0 mice. After immunization with 100 ⁇ g of NP-CG, NP-bound IgGl weakly positive and CD38 weakly positive were sorted as GC-B cells (Fig. 17), genomic DNA was extracted therefrom, and VH186.2 was amplified by PCR. And sequence analysis (Fig. 18). As a result, the number of mutations decreased, and the number of mutations in which the 33rd W changed to L was reduced to 1/3 in B-K0. These results indicate that GANP is essential for affinity maturation.
  • Figure 19 shows that high affinity antibodies were produced using GANP transgenic mice.
  • the present invention relates to a transgenic mammal into which a GAMP gene has been introduced, and the transgenic mammal can preferably express the introduced GANP gene in B cells.
  • the complex formed by the GAMP gene and its related molecules is a molecule directly and indirectly required in the process of inducing mutations in the gene. Since the GANP possesses the ability to induce the induction of high-affinity mutations in the V region when repairing a gene mutation, the transgenic mammal of the present invention
  • the introduction can promote the production of high affinity antibodies for acquired immunity. Also, transgenic mammals that overexpress this gene can rapidly produce antibodies with high binding power to the antigen.
  • a high-affinity antibody that cannot be obtained by conventional methods can be easily obtained, and a monoclonal antibody that can eliminate intractable pathogenic microorganisms and foreign substances can be obtained. Further, by producing a human antibody using the transgenic mammal of the present invention, it is possible to dramatically increase the efficacy of antibody therapy.
  • the GANP protein in the present invention is a protein having a molecular weight of 210 kDa whose amino acid sequence is specified in WO 00/50611. It has been reported that GANP protein has RNA primase activity and is involved in cell cycle regulation of B cells.
  • the GANP protein and the gene encoding it are described in International Publication WOO 506111, and specifically, as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing of International Publication WOO / 50611. G specified by the described amino acid sequence An ANP protein and a gene encoding the same are included.
  • the GANP gene may be a mutant. Specifically, in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing of International Publication WOO / 50611,-or a plurality of amino acids are missing. An RNA primer in which one or more amino acids have been replaced with another amino acid and / or one or more other amino acids have been added, and are the same as the above-mentioned GANP protein. A GANP mutein having zeta activity can also be used. Details of such a mutant gene and a method for obtaining it are described in International Publication WO00 / 50611.
  • mammal in the present invention means any mammal such as a red sea lion, a buda, a goat, a gray heron, a dog, a cat, a mouse, a rat, a hamster and a guinea pig, and preferably a mouse, a gray heron, It is a rat or a hamster, particularly preferably a mouse.
  • the transgenic mammal of the present invention is preferably used for embryo development during non-human mammal development with respect to unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including sperm and their progenitor cells, and the like. More preferably, at the stage of a single cell or a fertilized egg cell and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the ribofuel method, the aggregation method, the microinjection method, the particle gun method, the DEA-dextran method, and the like By introducing a GANP gene, which is a transgene, the gene can be prepared.
  • the GANP gene of interest can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the transgenic animal can also be prepared by fusing with a cell blending method known per se.
  • the gene When introducing the GANP gene into a target animal, it is preferable to introduce the gene as a gene construct linked downstream of a promoter that can be expressed in cells of the target animal.
  • various mammals having the GANP gene of interest By injecting a vector obtained by ligating the GANP gene downstream of various promoters capable of expressing the same GANP gene into a fertilized egg of a target mammal (eg, a mouse fertilized egg), the desired GANP gene can be obtained.
  • a transgenic mammal that highly expresses the gene can be produced.
  • GANP gene expression vectors include Escherichia coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, yeast-derived plasmids, batter phage such as ⁇ phage, lettomouth wis / les such as Moroni monoleukemia virus, and vaccinia. Viruses or animal viruses such as baculovirus are used. Examples of the promoter that regulates gene expression include promoters of genes derived from viruses (cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, etc.), and mammals of various species (human, egret, dog). Genes from cats, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • birds eg, chickens
  • chickens eg, albumin, insulin II, erythropoietin, endothelin, osteocalcin, muscle creatine kinase, platelet-derived growth factor ⁇ , keratin ⁇ ⁇ , ⁇ and ⁇ 14, collagen type I and type II, atrial natriuretic factor, dopamine / 3_hydroxylase, endothelial receptor oral synthase, sodium potassium adenosine 3 kinase, di-eurofilament light chain, meta-oral thionei I and ⁇ , meta-oral proteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen, smooth muscle ⁇ -actin, polypeptide chain elongation factor la (EF-1a), ⁇ -actin, ⁇ and / 3 myosin heavy chain, myosin light Chains 1 and 2, promoters of genes such as myelin-based protein, serum amyloid II component, myoglobin, and renin].
  • the vector may have a terminator that terminates transcription of the messenger RNRN in the transgenic mammal.
  • the splicing signal of each gene, the enhancer region, and a part of the intron of the eukaryotic gene were placed 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or Ligation 3 ′ downstream of the translation region is also possible if desired.
  • the human immunoglobulin gene By linking a part of Longenhansa to the 5, side of the GANP gene, the GAMP gene can be selectively expressed in B cells.
  • the GANAP gene is introduced at the fertilized egg cell stage so that it is present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the excessive presence of the GNP gene in the germinal cells of the transgenic animal produced means that the offspring of the produced animal have the GANP gene excessively in all of its germ cells and somatic cells.
  • the offspring of such animals that have inherited the gene have an excess of G ANP protein in all of their germinal and somatic cells.
  • Fertilized eggs used to transfer an exogenous GANP gene, which is a gene different from the endogenous gene of the transgenic subject animal, to a non-human mammal (preferably a mouse or the like) or a fertilized egg of its ancestor are It is obtained by crossing male and female mammals of the same species.
  • fertilized eggs can be obtained by natural mating, a method of artificially regulating the estrous cycle of a female mammal and then mating it with a male mammal is preferred.
  • Methods for artificially regulating the estrous cycle of female mammals include, for example, follicle-stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin (PMSG)) first, and then luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin (hC)). G))) is preferably administered, for example, by intraperitoneal injection.
  • PMSG horse serum gonadotropin
  • hC human chorionic gonadotropin
  • the non-human mammal having the DNA incorporating the exogenous gene can be obtained by artificially implanting and implanting the exogenous GANP gene into a female mammal.
  • the fertilized eggs obtained in pseudopregnant female mammals in which fertilization has been induced are artificially implanted and mated by mating with male mammals.
  • the method of flooring is preferred.
  • a totipotent cell into which a gene is introduced a fertilized egg or an early embryo can be used in the case of a mouse.
  • Microinjection of DNA is preferred in consideration of the yield rate of transgenic animals and the efficiency of transgene transfer to the next generation.
  • the fertilized eggs into which the gene has been injected are then transplanted into the fallopian tube of the foster mother, and the animals that have developed and born are placed in foster parents and reared, and then a part of the body (in the case of mice, for example, the tail tip).
  • DNA can be extracted from the DNA and the presence of the transgene can be confirmed by Southern analysis or PCR. If the individual in which the presence of the transgene is confirmed is the first generation (Founder), the transgene is transmitted to 50% of its offspring (F 1). Furthermore, by crossing the F1 individual with a wild-type animal or another F1 animal, an individual (F2) having a transgene in one (heterozygous) or both (homozygous) diploid chromosomes is created. can do.
  • a transgenic mammal with a high expression of G ANP protein can also be prepared by introducing the above G ANP gene as a transgene into ES cells.
  • the G ANP gene is introduced into HPRT-negative (lacking the hypoxanthanganin. Phosphoribosyltransferase) ES cells (embryonic stem cells) derived from normal mouse blastocysts (blastcyst).
  • ES cells in which the G NP gene has been integrated into a mouse endogenous gene are selected by the HAT selection method.
  • the selected ES cells are microinjected into fertilized eggs (blastocysts) obtained from another normal mouse.
  • the blastocyst is implanted into the uterus of another normal mouse as a foster parent.
  • a chimeric transgenic mouse is born from the foster parent mouse.
  • a heterotransgenic mouse can be obtained.
  • homotransgenic mice are obtained.
  • transgenic mammals include tissues, organs and cells of the mammals.
  • organs or tissues include spleen, thymus, lymph nodes, bone marrow or tonsils, and cells. Examples include B cells.
  • the transgenic mammal of the present invention can also be bred to a mammal that further activates B cells, thereby producing a higher-affinity antibody.
  • MRL / l P r which is an autoimmune disease mouse
  • NZB x NZW mutagenesis the like
  • the present inventors have also found that the GANP gene is expressed in the MRL / lpr mouse in this manner.
  • the antibody in the present invention means a protein having an activity of specifically binding to an antigen, and is preferably produced by B cells.
  • an antibody having high reactivity with an antigen is referred to as a high affinity antibody.
  • the increased affinity of the antibody molecule is caused by the induction of somatic mutation (SHM) in the variable region (V region) gene of the antibody gene.
  • SHM somatic mutation
  • V region variable region gene of the antibody gene.
  • SHM somatic mutation
  • the antigen is administered to the living body and several times of boosting increase the binding affinity of the antibody to the antigen.
  • B cells require stimulation from T cells, and it is said that activation is performed in the germinal center region of peripheral lymphoid tissues.
  • RNA editing molecule AID expressed in the germinal center is required as a molecule required for mutagenesis of the V region gene.
  • DNA ⁇ It has been reported that lacyl glycase and DNA polymerase required for DNA replication are involved in DNA polymerases and Iota, but the molecules controlling these functions have not yet been elucidated. .
  • the GANP molecule has revealed its function as a new SHM-inducing molecule, and its increased expression is an important key to SHM induction. In particular, it proved to be important for producing high-affinity antibodies.
  • the antibody induced by immunizing C57BLZ6 mice with ditrophenyl chicken gamma globulin as a hapten carrier antigen uses VH186.2 locus for the L chain and L chain for the L chain.
  • the antibody obtained by the booster immunization is an IgG1 antibody.
  • the mutation induced in the V region sequence of the antibody having a high binding affinity is a mutation in which the third tryptophan is mutated to leucine.
  • a high-affinity V region mutation was induced in this model system, indicating that high-affinity antibodies were induced. Clear evidence at the molecular level.
  • a high-affinity antibody can be produced by administering the antigen to the transgenic mammal described in (1) or a progeny thereof to produce the antibody. That is, a target antigen is administered to an animal in which the GANAP protein is highly expressed by a conventional method, and a high-affinity antibody can be prepared from spleen lymphocytes of the sensitized animal.
  • the high affinity antibody may be a polyclonal or monoclonal antibody.
  • a method for producing a polyclonal antibody can be obtained, for example, by administering an antigen to the transgenic mammal of the present invention, collecting blood from the mammal, and separating and purifying the antibody from the collected blood.
  • the immunization method is known to those skilled in the art, and can be performed, for example, by administering the antigen one or more times.
  • the antigen may be administered, for example, two to three times at intervals of 7 to 30 days.
  • the dose may be, for example, about 0.05 to 2 mg at a time.
  • the route of administration is not particularly limited, and subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, etc.
  • the antigen can be appropriately selected, but injection is performed intravenously, intraperitoneally or subcutaneously.
  • the antigen can be used by dissolving it in an appropriate buffer, for example, an appropriate buffer containing a commonly used adjuvant such as complete Freund's adjuvant or aluminum hydroxide, but depending on the administration route and conditions, etc. Sometimes no adjuvant is used.
  • booster immunization can be performed using, for example, 100 to 100 ⁇ g of the antigen.
  • blood is collected from the immunized mammal, and the blood is collected, for example, by centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene daricol, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography.
  • a polyclonal antibody can be obtained as a polyclonal antiserum by separation and purification by a conventional method such as chromatography, affinity chromatography, and other chromatography methods.
  • the hybridoma method can be mentioned.
  • a peptide constituting an antigen of interest is suspended in an adjuvant, and the suspension is administered subcutaneously or intradermally to an immunized animal (ie, the transgenic mammal of the present invention).
  • the adjuvant used include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, BCG, trehalose dimycolate (TDM), lipopolysaccharide '(LPS), alum adjuvant, and silica adjuvant. It is preferable to use a combination of Freund's complete adjuvant (CFA) and Freund's incomplete adjuvant (IFA) in view of the inducibility and the like.
  • CFA Freund's complete adjuvant
  • IFA Freund's incomplete adjuvant
  • the immunized animal be subjected to booster immunization several times after the initial immunization of the antigen, and to perform partial blood collection after an appropriate number of days to measure the antibody titer. Since the antibody produced by the method of the present invention is a high-affinity antibody, the first immunization may be sufficient.
  • the antibody titer can be measured by a known method such as the ELISA method.
  • the spleen is removed from the immunized animal after the sensitization, and B cells are obtained.
  • B cells are high-affinity antibody-producing cells, and can be used as they are as immunostimulants. It is also possible to directly obtain V region genes and measure somatic mutations in the V region.
  • the B cells are fused with myeloma cells according to a conventional method to prepare an antibody-producing hybridoma.
  • HBSS Hanks' balanced salt solution
  • B cells spleen Get lymphocytes
  • the resulting spleen lymphocytes are stained with a trypan blue staining solution, the number of viable cells is counted, and the cells are fused with myeloma cells to obtain a hybridoma.
  • the myeloma cell used is not particularly limited, and a known myeloma cell can be used.
  • a known myeloma cell can be used.
  • P 3—X63—Ag 8—01 (X63), P 3 -NS 1-1 -Ag 4-1 (NS l), SP 2 / O-Ag 14 (SP 2/0) Can be.
  • compatibility with antibody-producing cells must be considered.
  • the cell fusion method any method known in the art, such as the Sendai virus method, the polyethylene glycol method, and the protoplast method, can be arbitrarily selected and used.In particular, the polyethylene glycol method has relatively low cytotoxicity. The fusion operation is preferred because it is simple.
  • the obtained hybridoma is cultured in an HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine) for an appropriate period according to a conventional method, and a hybrid is selected. Next, after screening the desired antibody-producing hybridoma, the cloning of the hybridoma is performed.
  • HAT medium medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • a known antibody detection method can be used, and examples thereof include an enzyme immunoassay (hereinafter referred to as “ELISA”) method, a radioimmunoassay (hereinafter referred to as “RIA”) method, a plaque method, and the like.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • An agglutination reaction method or the like can be used.
  • Ma as a cloning method, a method known in the art can be used. For example, a limiting dilution method, a soft agar method, a FACS method, or the like can be used.
  • the obtained hybridomas are cultured in an appropriate culture medium or administered intraperitoneally to mice compatible with the hybridomas, for example.
  • a desired monoclonal antibody can be isolated and purified from the thus obtained culture solution or ascites by salting out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, or the like.
  • an antibody fragment refers to a partial region of the above-described polyclonal or monoclonal antibody, and specifically includes [Fb) 2 , Fab, Fab, Fv (variable fragment of antibody), sFv, ds Fv (disulphide stabilised Fv)
  • dAb single domain antibody
  • F (ab ′) 2 ” and “Fal>” are produced by treating immunoglobulin (monoclonal antibody) with a protease such as pepsin or papine, and the like.
  • An antibody fragment produced by digestion before and after a disulfide bond existing between two heavy chains.
  • IgG when IgG is treated with papain, it is cleaved upstream of the disulfide bond existing between the two heavy chains in the hinge region (light chain variable region) and Ct (light chain constant region).
  • ⁇ chain fragment consisting of the L chain and ⁇ ⁇ ⁇ ( ⁇ chain variable region) and C H yl ( ⁇ ⁇ region in the H chain constant region) are linked by disulfide bonds at the C-terminal region.
  • Antibody fragments can be produced. Each of these two homologous antibody fragments is called Fab '.
  • the fragment When IgG is treated with pepsin, the fragment is cleaved downstream of the disulfide bond existing between the two heavy chains in the hinge region, and the antibody fragment is slightly larger than the two Fab's connected by the hinge region. Can be manufactured. This antibody fragment is called F (ab,) 2 .
  • the high affinity antibody of the present invention may be a humanized antibody or a human antibody. These antibodies can be used to immunize a mammal whose immune system has been replaced with that of a human to directly produce a human antibody in the same manner as a normal monoclonal antibody.
  • the isotype of the antibody of the present invention is not particularly limited. For example, it may have any isotype of IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgAl, IgA2), IgD or IgE.
  • the high affinity antibody described in (2) above is useful as a drug for diagnosis, treatment or prevention of disease.
  • the method for diagnosing various diseases using the antibody of the present invention is performed by binding a sample, for example, serum or the like, from a subject suspected of various diseases to the antibody of the present invention by an antigen-antibody reaction, and determining the amount of the bound antibody. This is performed by detecting the amount of the target antigen in the sample.
  • the amount of the antibody may be detected according to a known immunoassay, and for example, immunoprecipitation, immunoagglutination, labeled immunoassay, immunoassay, immunoturbidimetry, and the like can be used.
  • a labeled immunoassay is preferred in that it is simple and highly sensitive.
  • the antibody titer in a sample can be expressed by the amount of label detected directly using the labeled antibody, or can be expressed relatively by using an antibody with a known concentration or known antibody titer as a standard solution. ,. That is, a standard solution and a sample are simultaneously measured by the same measurement system, and the antibody titer in the sample can be relatively expressed based on the value of the standard solution.
  • the labeling immunoassay a known assay such as ELISA, RIA, fluorescence immunoassay, chemiluminescence immunoassay and the like can be arbitrarily used.
  • an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound, a chemiluminescent compound, and the like may be appropriately selected according to the above-described measurement method.
  • the enzyme include peroxidase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase and the like.
  • an avidin-biotin complex as the labeling substance, the detection sensitivity of the labeling substance can be improved.
  • the radioactive isotopes are mainly 1251 force.
  • the fluorescent compounds include fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC). I can do it.
  • chemiluminescent compounds include oral fins, luminol, and lucigenin. Labeling of the antibody with the labeling substance can be performed according to a conventional method. Hereinafter, a labeled immunoassay using a labeled antibody will be described.
  • Non-competitive reaction systems require a solid phase (solid phase method).
  • a solid phase is not necessarily required (liquid phase method). It is preferable to use a solid phase because the measurement operation is simplified.
  • the material of the solid phase include polystyrene, nylon, glass, silicone rubber, and cellulose, and examples of the shape of the solid phase include a sphere, a well, a tube, and a sheet.
  • the present invention is not limited thereto, and any known one used for the labeling immunoassay can be used arbitrarily.
  • the measurement is performed by immobilizing the sample or the antibody of the present invention, reacting the sample with the antibody or the sample of the present invention, and then labeling a previously labeled anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody). ) To react with the antibody reacting with the immobilized sample. By labeling this secondary antibody, the amount of antibody bound to the sample can be detected. The amount of the detected labeled secondary antibody is positively correlated with the amount of the target antigen in the sample, whereby the amount of the target antigen in the sample can be determined.
  • secondary antibody an anti-immunoglobulin antibody
  • a sample and a certain amount of the target antigen are competitively bound to a certain amount of antibody.
  • the antigen of interest is added in advance and reacted with the antibody of the present invention.
  • the antibody that has reacted with the immobilized sample is reacted with a pre-labeled anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody), and the amount of the antibody can be detected using the labeling substance.
  • the amount of label detected is inversely related to the amount of antigen of interest added.
  • the antibody of the present invention is immobilized, reacted with a sample, and then reacted with a pre-labeled target antigen.
  • the amount of label detected is inversely correlated with the amount of GANAP protein in the sample bound to the antibody.
  • the solid-phase method for the antigen or antibody described above includes a physical adsorption method, a covalent bonding method, Known methods such as an on-bonding method and a crosslinking method can be used. In particular, physical adsorption is preferred because of its simplicity.
  • the anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) for example, an anti-IgG antibody, an anti-IgM antibody and the like can be used.
  • the antibody molecule may be used as it is, or Fab, Fab ', F (ab') 2 which is an antibody fragment containing an antigen-binding site obtained by enzymatically treating the antibody may be used.
  • a substance having an affinity specific to the antibody molecule for example, protein A having an affinity specific to IgG, may be labeled and used.
  • the labeled immunoassay include an immunoassay using an enzyme as a label, and an ELISA assay.
  • a GANP protein to be detected is placed in a 96-well plate by placing a sample or a diluent thereof at room temperature at 4 ° C to room temperature or at 37 ° C for 1 to 3 hours. Adsorb and solidify. Next, the antibody of the present invention is reacted, and then an anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) to which an enzyme has been previously bound is reacted. Finally, an appropriate chromogenic substrate that reacts with the enzyme (for example, p-nitrophenyl phosphate if the enzyme is phosphatase) is added, and the antibody is detected by the color development.
  • an appropriate chromogenic substrate that reacts with the enzyme for example, p-nitrophenyl phosphate if the enzyme is phosphatase
  • the drug efficacy evaluation method using the high-affinity antibody of the present invention comprises administering a drug to various disease patients or various disease model animals, and then measuring the amount of antigen such as virus in a living body using the antibody of the present invention. By detecting and comparing the amounts, it is possible to evaluate the efficacy as a therapeutic agent for various diseases through the amount of the antigen in the living body.
  • the high affinity antibody of the present invention can be provided in the form of a kit for diagnosing various diseases.
  • the kit can be used for the diagnostic method of the present invention and the drug efficacy evaluation method of the present invention.
  • the kit of the present invention includes at least one or more selected from the following (a) and (b).
  • the antibody of the present invention or a labeled product thereof (b) Immobilized reagent on which the antibody or its label described in (a) above is immobilized.
  • the labeled substance of the antibody is labeled with an enzyme, radioisotope, fluorescent compound, or chemiluminescent compound.
  • Examples of the material of the solid phase for immobilizing the antibody or these labeled substances in the kit of the present invention include polystyrene, nylon, glass, silicon rubber, and cellulose, and the shape of the solid phase is spherical or pear-shaped. , A tube, a sheet and the like, but are not limited thereto.
  • a solid phase and a solid phase immobilization reagent required for solid phase immobilization may be attached.
  • As a solid phase reagent in the case of immobilized by e.g. physical adsorption, 50 mM carbonate buffer (pH 9. 6), 10 raM Tris - HCl buffer (. P H8 5, lOOmM sodium chloride-containing), PBS And a blocking solution containing 0.5% gelatin or the like in the coating solution, if necessary.
  • the antibody in the kit of the present invention may be in a state of being dissolved in PBS or the like, or in a state of being bound to a gel (hereinafter abbreviated as “absorption gel”).
  • absorption gel a gel for absorption
  • An appropriate amount of the above-mentioned gel for absorption may be packaged in advance in a microcentrifuge tube of about 0.5 to 2 ml for absorption by the batch method, or a column for absorption by the column method. It may be pre-filled in a mini-column with a volume of 0.1 to 5 ml.
  • the kit of the present invention includes, in addition to the above-mentioned components, other reagents for performing the detection of the present invention, for example, when the label is an enzyme label, an enzyme substrate (a chromogenic substrate, etc.), an enzyme substrate solution , An enzyme reaction stop solution, a sample diluent, or the like.
  • the sample diluent include PBS (physiological phosphate buffer, pH 7.4), Tris-HCl buffer (pH 7.4 and 20 mM) containing 137 mM sodium chloride and 3 mM chloride, "TBS" is abbreviated), 0.05% Tween 20, PBS containing 0.1 to 1% BSA, or TBS.
  • the sample diluent may be used for diluting an antibody, for example, in addition to diluting the sample.
  • the high-affinity antibody of the present invention is also useful for treating or preventing a disease as long as it has an action of neutralizing the activity of an antigen causing a disease.
  • the drug of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition containing the high-affinity antibody of the present invention or a fragment thereof as an active ingredient, and further containing a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, coloring agents, sweeteners, thickeners. And flavoring agents, solubilizing agents or other additives.
  • tablets, pills, powders, granules, injections, liquids, capsules, troches, elixirs, suspensions, emulsions or syrups can be used.
  • a composition can be prepared.
  • These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.
  • Other forms for parenteral administration include topical solutions, suppositories and pessaries for enteral administration which contain one or more active substances and are formulated in a conventional manner.
  • the dosage of the drug of the present invention varies depending on the patient's age, gender, body weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, type of high-affinity antibody as an active ingredient contained in the drug, and the like. Usually, it can be administered in the range of 10 / ig to 1000 rag per adult, preferably in the range of 100 mg / capita, but is not limited to this range.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection to a concentration of 0.1 g antibody Zml carrier to 10 mg antibody Zml carrier.
  • it can be produced by suspending.
  • the injection thus produced is applied to a human patient in need of treatment at a rate of 1 jug to 100 mg / kg body weight per administration, preferably 50 / g to 100 mg / kg body weight. It can be administered once to several times a day at a rate of 50 rag.
  • the form of administration includes intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc., preferably intravenous injection.
  • Injectables may be used as a non-aqueous diluent (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.), suspensions or emulsions. Prepare You can also.
  • injections can be sterilized by filtration sterilization through a bacteria retaining filter, blending of a bactericide or irradiation.
  • Injectables can be manufactured in the form of a fresh preparation. That is, a sterile solid composition can be prepared by freeze-drying or the like, and dissolved in sterile distilled water for injection or another solvent before use.
  • the present inventors conducted an analysis after inducing GANP overexpression in a B cell tumor cell line, and as a result, it was found that the gene transfer had a remarkable effect of inducing somatic mutation of the V region gene. This effect is not seen when using a mutant gene that does not cause phosphorylation of serine at position 502 required for RNA primase, indicating that RNA primase activity is required. Is shown. This result indicates an effect of enhancing specific antibody production as a clinical auxiliary immunostimulation. It is also effective to use a retrovirus vector as a vector and to use a combination of stimulation via TNF family molecules such as CD40 and BAFF. By performing this gene transfer at the bone marrow cell level, high affinity binding in T cells can also be expected.
  • the mammal overexpressing the GANP gene of the present invention is effective for developing a monoclonal antibody that is effective for preparing a biological research reagent and a clinical test reagent. For example, it is very widely applicable to easily produce a monoclonal antibody against a specific signaling molecule specifically for a functional domain or functional motif and a high-affinity antibody having a high binding force.
  • the transgenic mammal of the present invention high-affinity antibody-producing cells can be selected in a short time from relatively few clones of antibodies, and the cost, time, and labor can be reduced. Is big.
  • the production of phosphorylated antibodies and specific antibodies to the gene mutation portion can be applied to diagnostic agents or selective injection of drugs using antibodies. It also allows the production of high affinity antibodies that selectively bind to the nucleotide sequence of the gene.
  • the antigen motif recognizes a part of the three-dimensional structure of any substance, such as inorganic substances, carbohydrates, and chemical compounds.
  • mice created by crossing with autoimmune disease mice are effective in obtaining high-affinity antibodies against any antigen.
  • high-affinity antibodies with a binding strength of 10-order can be produced by this method, and by introducing the technology development of the ELISA method, it is possible to develop a technology that can easily detect trace substances. is there.
  • a gene therapy agent for an allergic disease or an autoimmune disease which comprises an RNA primase inactive G ANP gene.
  • the gene therapy agent of the present invention can be produced by blending a recombinant vector containing an RNA primase inactive G ANP gene together with a base used for a gene therapy agent.
  • the vector used in the construction of the recombinant vector include a vinoless vector such as a retrovirus vector, an adenowinores vector, an adeno-associated virus vector, a baculoinores vector, a vaccinia peninores vector, or an animal expression vector. You can also use a brass rim.
  • the vector is preferably a viral vector.
  • a gene therapy agent is manufactured by preparing virus particles containing recombinant DNA and blending it with the base used for the gene therapy agent be able to.
  • the base used for the gene therapy agent those usually used for injections can be used.
  • salt solutions such as sodium chloride or a mixture of sodium chloride and an inorganic salt, mannitol, lactose Dextran, glucose and the like; amino acid solutions such as glycine and arginine; organic acid solutions or mixed solutions of salt solutions and glucose solutions.
  • these bases may be supplemented with osmotic agents, pH adjusters, vegetable oils, or surfactants, etc. according to standard methods known to those skilled in the art.
  • injectables can also be prepared as solutions, suspensions and dispersions using the agents.
  • These injections can also be prepared as preparations for dissolution at the time of use by operations such as powdering and freeze-drying.
  • the administration form of the gene therapy agent of the present invention may be systemic administration such as usual intravenous or arterial administration, or local administration such as local injection or oral administration.
  • the dosage of the gene therapy agent of the present invention varies depending on age, gender, symptoms, administration route, administration frequency, and dosage form.In general, in adults, the weight of the recombinant gene per day is from lw gZ kg to 100 OragZk. g, preferably about 10 / ig Z kg to about 100 mg / kg.
  • the frequency of administration is not particularly limited.
  • NZB, NZW, B / WF1, MRL / lpr, and BXSB mice were purchased from Japan SLC Co.
  • C57BL / 6 and BALB mice were purchased from Charles River Japan.
  • NOD mice were provided by Dr. Miyazaki of Osaka University.
  • Rat monoclonal antibodies against mouse B220 (RA3-6B2), mouse IgM (AM / 3) and mouse IgD (CS / 15) were purified from culture supernatants of hybridomas and purified from D-Pyotin-N-hydroxysuccinimide. Labeled with Doestenore (Roche diagnostics, Branchburg, NJ).
  • Piotin-labeled rat anti-mouse Syndecan-1 and anti-mouse CD5 monoclonal antibodies were purchased (BD PharMingen, San Diego, CA).
  • Piotin-labeled peanut agglutun (PNA) was purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA). 3 immunity
  • TNP-KLH Nitrophenyl-keyhole limpet hemocyanin
  • TNP-Ficoll 100 ⁇ g of TNP-KLH emulsified in complete Freund's adjuvant or 25 ⁇ g of TNP-Ficoll in PBS was injected intraperitoneally. After 14 days, lymphoid organs were obtained and frozen with OCT compounds for immunohistochemical analysis.
  • the slides were washed several times with PBS and incubated with alkaline phosphatase (ALP) -conjugated goat anti-rat IgG antibody (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA). Color development was performed using the Vector Blue kit (Vector). For double staining, reactions were performed using a combination of a biotin-labeled antibody and horseradish peroxidase (HRP) -conjugated streptavidin (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). After color development with 3-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Dojindo), sections were fixed with 1% glutanrealaldehyde in PBS for 1 minute.
  • ALP alkaline phosphatase
  • HRP horseradish peroxidase
  • DAB 3-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride
  • GANP expression is highly expressed in highly active B cells with a tendency to autoimmunity. Lymphocytes expressing high levels of GAMP (GANP hi cells) spontaneously appear in non-immune conditions in peripheral lymph nodes of MRL / lpr mice. The increase was significant compared to C57BL / 6 mice, and no GANP hi cells were shown under non-immune conditions ( Figure 1). The appearance of the good Una G AN P M cells, was investigated in the lymph nodes of NZB mice that cause the autoimmune condition little by little during aging. Young NZB mice (7 weeks old) did not have GAN P hi cells in the popliteal lymph nodes, whereas aged NZBs (40 weeks old) had large numbers of GANP hi cells.
  • GANP RNA-primase activity may play an important role in B cell activation and differentiation. Therefore, we compared the phosphorylation status of Ser 5G2 , an important phosphorylation site for RNA primase activity, using an anti-pSer 5 ° 2 monoclonal antibody in NZB mice [19].
  • GANP expression was prominent at 8 weeks, and GANP M cells were detected throughout the entire period up to 32 weeks ( Figure 2; upper panel).
  • pS er 5G2 although positive cells was filed in up to 8 weeks, then positive cells was significantly reduced (Fig. 2; in the middle figure). The figure shows the number of reactive cells by microscopic observation based on peak age (Fig. 2; lower panel).
  • G AN P hi cells in the spleen of autoimmune-prone mice splenic red pulp are non-immune shape ⁇ I checked whether it would appear.
  • the increase in GANP hi is proportional to the amount of autoantibody produced prior to the onset of autoimmune disease (FIGS. 2 and 3; Theofilopoulos AN, et al., 1985, Adv. Immunol. 37: 269-390).
  • GANP hi cells Since the appearance of GANP hi cells may be associated with the B cells in autoimmune-prone mice abnormal, the appearance of GANP hi cells definitive for various autoimmune-prone mice with a non-immune conditions (8 weeks old) Examined. GANP hi cells were significantly increased in MRL / lpr, NZB and B / WF1. The number of GANP hi cells did not increase so much in BXSB and N0D of SLE-model mice, but increased when compared to control BALB mice (FIG. 4) and C57BL / 6 mice (FIG. 1). Spleen sections showed associative or immature association of PNA + B cells as GC-like structures.
  • the GAN Phi cell population was further analyzed by marker analysis of lymphoid cells. They express the B220-Syndecan-II phenotype and express large amounts of IgM in cells (Figure 5). CR1, Thy - 1, and negative for GL- 7, CD23 and PNA, these results do et al, G AN P hi cells late stage of maturation B lineage cells, probably be a plasma cell shown. To determine if these cells were proliferative blast blast cells, NZB mice were injected intravenously with BrdU and spleen sections were prepared by killing after incubating for 2 hours for BrdU-incorporating cells in vivo. . GANP hi cells were not positive for BrdU incorporation (Figure 6), suggesting that these cells were not proliferative and were more mature than the plasma germ cell stage.
  • Mott cells are an abnormal form of plasma cells in which large amounts of IgM molecules accumulate in rough endoplasmic reticulum-associated vesicles that are detected as cytosolic Russell bodies by PAS staining (Jiang Y., et al. 1997, J. Immunol. 158: 992-997].
  • G AN P hi cells not stained with PAS- staining (Fig. 6), thereby Mott the GANP hi cells B-1 cell-derived plasma cells Can be distinguished from cells.
  • LV H 3- C H 1C ⁇ transcript 5 -LV H 3 primers (5, -CTATAACCATGGACCATGGACATACTTTGTT CC- 3,) and 3 '-Xbal- C H 1- primer (5, -TGCATGCATTCTAGAGTTGCCGTTGGGGTGCTGGA C-3' ) by Amplification was performed using Pfu Turbo (Stratagene).
  • the PCR product was digested with Ncol and Xbal, gel purified, and ligated with Ncol-Xbal digested plasmid. After transformation into a competent bacterium, the nucleotide sequence of a small amount of plasmid DNA prepared using the QIAprep kit (QIAGEN) was determined using an automated sequencer (Applied Biosysteras).
  • the transgene was prepared by introducing a 5.6 kb mouse GAMP gene into the Xhol site of the pLG vector.
  • This vector has a human immunoglobulin intron enhancer region (2 kb EcoRI fragment) and is a specific vector for strong expression in B cells.
  • This gene was linearized and transfected into mice.
  • a linearized pLG vector (Koike,. Et al. Int. Immunol. 7, 21-30 (1995)) containing the mouse ganp full-length cDNA was microinjected into fertilized eggs of C57BL / 6 mice.
  • primer 5, -TCCCGCCTTCCAGCT GTGAC-3,
  • primer 3 primer 5, -GTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3 '
  • RNA and cDNA synthesis were performed as described previously (Kuwahara, K. et al., Blood 95, 2321-2328 (2000)). GANP transcripts were detected with the two primers 1-5 'and 1-3' described above. RNA recovery was monitored using / 3-actin. 5. Establishment of CD19-Cre + / GANP flo mice
  • a targeting vector was prepared by inserting a neomycin resistance gene (neo) downstream of exon II using the GNAP genome DNA.
  • the ⁇ site was introduced into the intron between the 3 ′ flanking region of neo and exons I and II.
  • the linearized targeting vector was transfected into TT2 ES cells (Yagi, T. et al. Anal. Biochem. 214, 70-76 (1993)) by electroporation. After selection with G418, ES colonies were picked up and incubated with proteinase K.
  • the homologous recombinants were screened with neo2 primer (5'-GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT-3 ') and CGK3'-2 primer (5'-GGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3'). Homologous recombination was confirmed by Southern blot analysis of the DNA of the ES clone digested with BamHI using probe A. Using three positive clones showing a 4 kb band, chimeric primary mice were produced by microinjection into ICR blastocysts. Mating GAN P-floxed mouse with CD19—Cre knock-in mouse (Rickert, RC, et al., Nucleic Acids Res. 25, 1317-1318 (1997)) for cells lacking the ganp gene in B cells did.
  • Spleen cells were isolated from wild-type and GANP- mice (7-8 weeks old) Red blood cells were removed by treatment with 0.15 M ammonium chloride buffer. After 30 minutes incubation at 37 ° C on a plastic dish, unadhered cells are collected as lymphocytes, and T cells are collected using Dynabeads-anti-mouse Thyl. 2 monoclonal antibody (Dynal) according to the attached protocol. Removed. The purity of B cells (90% or more) was confirmed by cell surface staining using FITC-conjugated anti-B220 monoclonal antibody (BD Pharmingen).
  • Purified B cells are converted to RPMI-1640 medium containing 10% heat-inactivated FCS (JRH Biosciences;), 2 raM L-glutamine and 5 x 10 " 5 M 2-mercaptoethanol (including mitogens). And without) in a 96-well microtiter plate for 48 hours in 2 ⁇ 10 5 cells Zell. Cells were incubated with 0.2 ⁇ Ci / well [3 ⁇ 4] -thymidine (ICN). The cells were recovered after pulsing for 16 hours, and the incorporated radioactivity was measured with a scintillation counter.
  • TNP-KLH, TNP-Ficoll and NP-CG were purchased from Biosearch Technologies. 50 ⁇ g of TNP-KLH and NP-CG (precipitated with aluminum) or 25 g of TNP-Ficoll (dissolved in PBS) were injected intraperitoneally into wild-type and GANAP mice.
  • Serum was collected from the immunized mice 10 and 14 days after challenge.
  • ELISA plates were coated with 5 / g Nowell TNP-BSA (Biosearch Technology). Each well was blocked with 3% BSA in PBS and incubated with serially diluted serum. After washing with PBS-0.1% Tween 20, the wells were incubated with a biotin-conjugated isotype-specific monoclonal antibody and Streptavidin conjugated with an alkaline phosphatase (Southern Biotechnology). Color development in the presence of substrate went.
  • NIP-conjugated IgGl ⁇ CDSS ⁇ B cells of mice immunized with NP-CG were fractionated by FACS Vantage (Becton Dickinson) and incubated with proteinase K at 37 ° C for 10 days. Using the lysate, PCR was performed twice as previously reported (Takahashi, Y., et al. Immunity 14, 181-192 (2001)). VH gene cDNAs were ligated into pBluescript and sequenced by an automatic sequencer.
  • Somatic mutation (SHM) of V region gene of transfectant which stably expressed mouse GANP in Daudi
  • the GAMP gene was introduced into various human B lymphocyte cells used for the analysis of SHM in vitro (Rogozin, IB, et al., Nat. Immunol. 2, 530-536 (2001); Kuwahara, K et al. Blood 95, 2321-2328 (2000); and Denepoux, S. et al., Immunity 6, 35-46 (1997)). Many B cell lines could not be transfected, but the ganp gene could be introduced into Daudi B cells expressing AID, which does not normally produce SHM during maintenance. This clone showed a higher frequency of SHM (5xl (T 4 / bp) in the V-region compared to wild-type and mock-transfected cells. SHM was not induced by the constant region gene.
  • Sex IgG ( ⁇ 1 ⁇ 1) ⁇ ⁇ —Response
  • the SHM shows a special pattern. Sequence analysis of whole spleen B cells after immunization with NP-CG showed a slight increase in the frequency of SHM in GAMP-Tg mice compared to wild-type mice (FIG. 10). ). This mouse showed a third increase in SHM from W to L (33 fold). This mutation has previously been shown to be important for affinity maturation of hapten-specific B cells
  • RNA-primase GANP we used the Cre- ⁇ system to generate GANP-B-mouse that targeted CD19 + B cells and deleted the GANP gene (a and b in Figure 11).
  • Floxed B cells do not express GANP mRNA (c in FIG. 11) and, according to immunostaining, express little protein (d in FIG. 11).
  • GANP— ⁇ ⁇ -mice grew normally and showed normal numbers of lymphocytes in bone marrow, spleen, and lymph nodes. Flow cytometry analysis showed a normal staining profile for surface markers on bone marrow, thymus and spleen cells (Figure 12).
  • TNP tri-nitrophenyl
  • TD-Ags such as ⁇ -keyhole limpet hemocyanin (KLH) and NP-CG
  • mutant mice showed delayed GC formation compared to wild type.
  • GANP B-mice showed a gradual increase and expansion of GC on day 14 after immunization with force TNP-KLH that did not show a clear GC until day 10 (FIG. 15).
  • IgM locus was not different compared to wild type. Therefore, Ag-binding IgGl B cells were purified as shown in FIG. 17 and the sequences of VH 186.2 were compared (FIG. 18).
  • the overall mutation of the IgV-region sequence of GANP B-mouse was the same as that of wild-type, but the high affinity mutation from W33 to L (C57BL / 6 mouse Was significantly reduced in the mutant mice.
  • the results for GANP- ⁇ - ⁇ and GANP-Tg mice demonstrate that GANP is involved in the generation of high affinity B cells after immunization with TD-Ag.
  • the role of G ANP may be to mediate the efficient recruitment and regulation of DNA polymerase in GC-B cells. If GC-B cells with V-region SHMs acquire high-affinity BCRs, they should be selected, and further SHM in V-regions of B cells is suppressed, producing high-affinity antibodies in vivo Should be guaranteed. Modulation of AID activity may be necessary to maintain high affinity BCR in B cells, since expression of AID in GC-B cells can constantly generate DNA mutations. GA NP B-mice results indicate that GANP is required for the SHM process.
  • a mouse overexpressing GANAP By using a mouse overexpressing GANAP according to the present invention, it is possible to quickly produce a high-affinity antibody specific to a virus antigen that could not be obtained conventionally. Therefore, it is expected that a specific and powerful antibody can be promptly obtained without delaying the deterioration of the disease state due to a prolonged infection such as AIDS or hepatitis C without being delayed by the mutation of the virus antigen. In addition, this makes it possible to prepare a tailor-made specific antibody corresponding to a mutation of a virus antigen from an infected patient. An immunization period of about 10 days is sufficient for the production of monoclonal antibodies, of which the production efficiency of antibodies with high-affinity mutations is close to 60%. High-affinity antibody production protocols using bedside patient samples are expected to be a new immunotherapy alternative to vaccine therapy.

Abstract

　本発明の目的は、各種疾患の診断薬及び治療薬として有効な高親和性抗体、当該抗体を産生するためのトランスジェニック哺乳動物、該高親和性抗体又は高親和性抗体産生細胞を用いた薬剤を提供することである。本発明によれば、ＧＡＮＰ遺伝子を導入したトランスジェニック哺乳動物、その子孫又はそれらの一部、並びにそれを用いた高親和性抗体の産生方法が提供される。

Description

明細書
G A N P導入トランスジエニック哺乳動物及びその利用 技術分野
本発明は、 G A N P遺伝子を導入したトランスジエニック哺乳動物及ぴその利 用に関する。 より詳細には、 本発明は、 G A N Pを高発現し、 高親和性抗体を産 生することができるトランスジエニック哺乳動物、 該トランスジエニック哺乳動 物を用いて高親和性抗体を産生する方法、 並びに得られた高親和性抗体の利用に 関する。 背景技術
免疫系の機能は、 T細胞の効果を主とする細胞性免疫反応と抗体の効果を主と する液性免疫とに分類される。 実際は、 この両者の機能は協調して免疫応答が行 われる。抗体は骨髄で生まれる B細胞の細胞表面レセプターとして表現している。 生体で形成される最初の抗体の認識する多様性は 1 0 9〜1 0 1 1のオーダーに上 ると言われ、 環境に存在しうるあらゆる抗原決定基を認識する。 しかしながら、 この多様な抗原レセプターは抗原に对して結合する能力は概して低く、 低親和性 の抗体が産生されることが多いが、 これでは十分な免疫応答とはならない。
リンパ球、 特に B細胞/免疫グロブリン （抗体） による免疫反応は病原体等の 抗原検出のためのキット、 診断薬、 治療薬において利用されている。 このような 抗原検出薬、 あるいは各種疾患治療薬における抗体としては、 抗原に対する反応 性が高い抗体 （以下 「高親和性抗体」 という。） を使用すると、 抗原に対する感度 が優れ、 かつ同一投与量での治療薬としての性能が優れる。 しかしながら、 これ までの所、 抗体の親和性を高める手段は知られていない。
生体は病原体や異物が体内に侵入すると、 それらを抗原として認識して、 末梢 のリンパ組織において、 抗体遺伝子の抗原と直接結合する V領域の遺伝子に高頻 度の体細胞突然変異を誘導する。 その変化には T細胞の刺激を必要としていて、 胚中心領域で活性化 T細胞から刺激を受けると考えられる。 近年、 本発明者らは この領域の活性化 Β細胞で選択的に発現が上昇する分子 G A N Ρを見出している (国際公開 WO O 0 / 5 0 6 1 1号公報）。この分子は D N Aヘリカーゼ活性を有 する M C M分子と直接結合し、さらに R N Aプライマーゼ活性を有することから、 D N A複製に関連することが示唆されている。 しかしながら、 免疫系における G A N Pの機能については解明されていなかった。 発明の開示
本発明の目的は、 各種疾患の診断薬及び治療薬として有効な高親和性抗体、 当 該抗体を産生するためのトランスジュニック哺乳動物、 該高親和性抗体又は高親 和性抗体産生細胞を用いた薬剤を提供することである。
本発明者らは、 先ず G A N P遺伝子の欠損マウスを B細胞選択的に欠損するよ うに企図して作成した（実施例 1 )。 その結果、 免疫系の細胞の発達、 分化、 増殖 には影響が見られず、 また抗体の産生総和には大きな変化は見られなかった。 ま た、 ハプテンとして解析がすすんでいるニトロフエニル基 （NP 基）をトリガンマ グロブリンと結合させて（NP - CG)、 T細胞性依存性抗原の反応を調べた。 C57BL/6 マウスの NP対する反応は単一の V領域で行われることが知られている。 それは VH 1 8 6 . 2と呼ばれる抗体の IgG重鎖の V領域とラムダ 1遺伝子によってのみ 形成されることが知られている。 このシステムを使えば抗体が IgGl で VH186. 2 を見ることによつて高親和性抗体の B細胞の遺伝子変異を調べることが可能であ る。 しかも最も強い親和性は 3 3番目のアミノ酸であるトリプトファンが口イシ ンに変異 (W33 - L)したときに生じることが報告されている。 G A N P遺伝子欠損マ ウスでそのことを調べたところ、 野生型マウスに比べて高親和性抗体産生がほと んど見られなかった （実施例 1 )。
このことをさらに検証するために、 G A N P遺伝子を過剰に発現するマウスを 作成した。 ヒ ト免疫グロブリン遺伝子イントロンェンハンサ一部分を 5， 側に連 結して B細胞で選択的に発現させた。 このマウスも正常に生まれ、 リンパ組織の 発達、 分化、 増殖には変化が見られない。 しかし、 NP- CG に対する反応では著し くその高親和性型の V領域遺伝子 (W33 - L)が増加していた。 これらの結果から、 G A N P分子を高発現させること、 および R N Aプライマーゼ活性を賦活化するこ とが免疫応答で高親和性抗体の産生に必要であることを示す（実施例 2 )。本発明 は、 これらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 G A N P遺伝子を導入したトランスジヱニック哺乳動 物、 その子孫又はそれらの一部が提供される。
好ましくは、 導入した G A N P遺伝子を B細胞で発現される。
好ましくは、 本発明のトランスジヱニック哺乳動物は、 G A N P遺伝子をトラ ンスフエクシヨンした E S細胞から発生させる。
本発明の別の側面によれば、 G A N P遺伝子を導入したトランスジエニック哺 乳動物又はその子孫に抗原を投与して抗体を産生する、 高親和性抗体の産生方法 が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した高親和性抗体の産生方法により産 生される高親和性抗体又はその断片が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した高親和性抗体又はその断片を含有 する、 疾患の診断、 治療又は予防のための薬剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した抗体の V領域を含むヒ ト型抗体又 はその断片が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記したヒト型抗体又はその断片を含む薬 剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 抗原を投与した上記したトランスジェニッ ク哺乳動物又はその子孫から採取される、 高親和性抗体産生細胞が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 免疫組織化学分析を、 抗 G A N Pモノクローナル抗体および ALP結合 抗ラット Ig抗体を用いて自己免疫疾患モデル MRL/lpr、 NZBおよび正常 C57BL/6 雌マウス由来の膝窩リンパ節で行った結果を示す。 VectorBlue (ALP基質） で染 色された G AN Phi細胞は 7週目に MRL/lprマウスのリンパ節で観察されたが、 同年齢の NZBマウスでは観察されず、 40週目に出現した。 正常 C57BL/6マウス では、 極少数の GANPhi細胞が全期間を通じて観察された。 スケールバーは 1 00 μ。
図 2は、雌 NZBマウスの膝窩のリンパ節中の G AN Phi細胞の出現速度を示す。 NZBマウスのリンパ節中の GANP (上部）および pSer502 G AN P (真中）の発現 を比較した。 pSer502 G AN Pは抗 pSer502 G AN P (PG/103)モノクローナル抗 体 (青）で検出し、全切片をビォチン標識抗 B220モノクローナル抗体で染色した後、 HRP結合ス トレプトアビジンと DAB (茶色）を組み合わせて検出した。 2回の独立し た実験から代表的データを示した。 スケールバーは 100 //m。 下段の図は、 カロ 齢の間に濾胞外領域の G AN Phi (黒の棒）および pSer502 GANPhi (点の棒）の 細胞数を示す。
図 3は、 雌 NZBマウスの脾臓中の G AN Phi細胞の出現速度を示す。 染色は図 2と同様に行った。 3回の独立した実験からの代表的データを示した。 スケール バーは 100 μ m。
図 4は、 複数系統のマウス由来の脾臓切片を抗 G AN Pモノクローナル抗体で 染色した結果を示す。 GANPhi細胞は MRL/lpr、 NZB、 B/WFK BXSBの赤脾髄で 顕著に出現したが、 NOD又は BAI^cマウスの脾臓には出現しなかった。 RP;赤脾 髄， F; 濾胞、 スケールバーは 100 μ m。
図 5は、 脾臓の赤脾髄における GANPhi細胞の同定を示す。 ピオチン標識抗 B220モノクローナル抗体 （左）、 ピオチン標識抗 Syndecan- 1モノクローナル抗体 (真中）、 又はピオチン標識抗 IgMモノクローナル抗体 （右） を用いて NZBマウス の脾臓切片について二重染色を行い、 GANPhi細胞を同定した。 二重に染色さ れた細胞は矢頭で示し、 これは GANPhi 細胞が B220—SyndecarigM+であること を示す。 GANP発現は ALP (青色）で示し、 他のマーカーは HRP (茶色）で示す。 3回の独立した実験から代表的データを示した。 スケールバーは 50 //m。 図 6は、 G AN Phi細胞における形質細胞マーカーの同定を示す。 G AN Phi細 胞が増殖性形質芽細胞であるかどうかを調べるために、 マウスに BrdU (l mg /マ ウス）を投与した。 2時間後、 マウスを殺し、 脾臓切 j†を調製した。 切片を抗 GA NPモノクローナル抗体 （青） 及び抗 BrdUモノクローナル抗体 （赤） で二重染色 した。 GCは胚中心を示す （左）。 PAS染色は常法に従って行った。 GANP単一 陽性 GANPhi細胞は矢印で示し、 PAS単一陽性細胞が矢頭で示した （真中）。 切 片はピオチン標識抗 CD- 5モノクローナル抗体で染色した。 PALS領域を示した（右）。 3回の独立した実験から代表的データを示した。 スケールバ一は 1 Ο Ο μπι。
図 7は、 TD- Ag免疫による C57BL/6マウスの脾臓における赤脾髄領域における G AN Phi細胞の発現を示す。 雌 C57BL/6 マウス（ 7週齢）を、 TNP-Ficoll (ΤΙ-2-Ag)又は TNP- KLH (TD- Ag)で腹腔内免疫し、 1 4 日後に脾臓を得た。 TNP-Ficollで免疫したマウスは、 ピオチン標識抗 IgDモノクローナル抗体で対比 染色した場合、 G AN Phi細胞を赤脾髄領域で示さなかった （左）。 TNP- KLHで免 疫したマウスは 、 G AN Phi細胞の誘導を赤脾髄領域で示した （右）。 GANP hi細胞は矢印で示す。 WPは白脾髄領域を示す。 スケールバーは 100 μπι。
図 8は、 Daudi にマウス GANPを安定的に発現させたトランスフエクタント の体細胞突然変異を示す。 VH3- CHlCrauの断片を PCRで増幅してプラスミ ドにサブ クローエングし、 シークェンスした。 Iはサイレントミューテーシヨン （ァミノ 酸が変わらない）、 もう一つの記号はアミノ酸が置換している変異。 Daudi/mock ではほとんど変異が入っていないが、 Daudi/GANP14， 15， 17, 21の 4クロー ンは程度の差はあるが変異を多く認める。 DNA プライマーゼ活性の制御に関係す る 502番目のセリンをァラニンに置換した変異体（GANP S/A)を導入したトラ ンスフエタタントでは変異の入る効率が減少する。
図 9は、 B細胞で GANPを過剰発現させたトランスジエニックマウスの作製 を示す。 Igェンハンサー Zプロモータ一制御下にマウス GANPを過剰発現させ たトランスジエニックマウスを作製した （図 a及び図 b)。 GANP mR Aの発現 が亢進していることは RT-PCRで確認した （図 c)。 図 10は、 G AN P過剰発現トランスジエニック（Tg)マウスに 50μ gの NP- CG を 2週間おきに 3回免疫して、 VH186.2を PCRで増幅し、 体細胞突然変異を解析 した結果を示す。 変異の数は Tgでやや増加しているが、 高親和性を示す 33番目 の Wが Lに変わる変異は Tgで約 3倍になっていた。
図 1 1は、 B細胞特異的 GANP欠損マウス（B- K0)の作製を示す。 ェクソン 2 を ΙοχΡ配列で挿んだ Ποχマウスを作製し、これと CD19 - Creマウスと交配させて、 B細胞で GANPが欠損するマウスを樹立した（図 a及び図 b)。 B細胞で GAN Pの発現が見られないことは、 RT - PCRと細胞染色で確認した （図 c及び図 d)。 図 1 2は、 B細胞特異的 GANP欠損マウス（B-K0)を用いた細胞表面染色の結 果を示す。 WT (野生型） と B- K0で差はなかった。 B-K0のリンパ節で IgM+IgD+の 集団が減少していた。
図 1 3は、 増殖アツセィの結果を示す。 ほとんど差はなかったが、 CD40刺激の 増殖のみが半分くらいに減少していた。
図 14から図 16は、 B-K0マウスにおける抗原特異的抗体産生を測定した結果 を示す。 TI抗原である TNP- Ficollを免疫して 14日後の抗 TNP抗体価を ELISAで 測定したが、 特に差はなかった。 TD抗原である TNP- KLHでは 10 日後ではほとん ど差はなかったが、 14 日後では B-K0でやや高かった。 胚中心 (GC)形成を調べて みると、 免疫後 10日では B-K0の方が GC形成がやや悪かった。 し力 し、 14日後 では WTに比べて B-K0の方が数が多くなつており、 20日後でも GC形成が遷延し ていた。
図 1 7及び図 18は、 B-K0マウスにおける親和性成熟の障害を示す。 100μ g の NP- CGを免疫し、 NP -結合 IgGl弱陽性 CD38弱陽性を GC- B細胞としてソーティ ングし （図 1 7)、 そこからゲノム DNAを抽出し、 VH186.2を PCRで増幅し、 シー クエンス解析を行った （図 1 8)。 その結果、 変異の数が減少し、 33番目の Wが L に変わる変異は B-K0で 1/3に低下した。 この結果より、 GANPは親和性の成熟 に必須であることが示された。
図 1 9は、 GANPトランスジヱニックマウスを用いて高親和性抗体を産生し た結果を示す, 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
(1) G AN P遺伝子を導入したトランスジエニック哺乳動物
本発明は、 G AN P遺伝子を導入したトランスジエニック哺乳動物に関するも のであり、 当該トランスジエニック哺乳動物は好ましくは、 導入した GANP遺 伝子を B細胞で発現することができる。
G AN P遺伝子とその関連分子で形成される複合体は遺伝子に変異を誘導する プロセスで直接および間接的に必要な分子である。 GANPは、 遺伝子変異を修 復する際に V領域の高親和性の変異の誘導を促す能力を保有していることから、 本発明のトランスジヱニック哺乳動物は、 この GANP又はその変異遺伝子の導 入によって獲得性免疫の高親和性抗体産生を促進することができる。 また、 この 遺伝子を過剰に発現するトランスジエニック哺乳動物は、 速やかに抗原に対する 結合力の高い抗体を産生することができるため、 このトランスジエニック非ヒト 哺乳動物に抗原を免疫することで、 従来では得られないような高親和性の抗体を 簡便に得ることができ、 難治性の病原微生物や異物を排除できるモノクロナ一ル 抗体を得ることができる。 また、 本発明のトランスジエニック哺乳動物を用いて ヒ ト型抗体を作成することによって、 抗体療法の効力を飛躍的に高めることが可 能である。
本発明における GANP蛋白質とは WO 00/5061 1号公報にそのァミノ 酸配列が特定されている 210 kD aの分子量を有する蛋白質である。 GANP 蛋白質は RN Aプライマーゼ活性を有し、 B細胞の細胞周期調節に関与している ことが報告されている。
GANP蛋白質及びそれをコードする遺伝子は、 国際公開 WOO 0 506 1 1号公報に記載されており、 具体的には国際公開 WOO 0/5061 1号公報の 配列表の配列番号 1または配列番号 3に記載のアミノ酸配列により特定される G ANP蛋白質、 及びそれをコードする遺伝子が挙げられる。
また GANP遺伝子は変異体でもよく、 具体的には、 国際公開 WOO 0/50 6 1 1の配列表の配列番号 1または配列番号 3に記載のァミノ酸配列において、 —若しくは複数のァミノ酸が欠失しており、 一若しくは複数のァミノ酸が他のァ ミノ酸で置換されており、 及び 又は一若しくは複数の他のアミノ酸が付加され たアミノ酸配列からなり、 かつ上記 GANP蛋白質と同様の RNAプライマーゼ 活性を有する GANP変異蛋白質を使用することもできる。 そのような変異遺伝 子の詳細並びに取得方法は国際公開 WO00/506 1 1号公報に記載されてい る。
本発明における 「哺乳動物」 とは、 ゥシ、 ブダ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 マウス、 ラット、 ハムスター及びモルモッ ト等の任意の哺乳動物を意味し、 好ま しくはマウス、 ゥサギ、 ラットまたはハムスターであり、 特に好ましくはマウス である。
本発明のトランスジヱニック哺乳動物は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒ ト哺乳動物の発生にお ける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一 般に 8細胞期以前） において、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフエタ シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEA E—デキストラン法などにより導入遺伝子である GANP遺伝子を導入すること により作製することができる。 また、 該遺伝子導入方法により、 体細胞、 生体の 臓器、 組織細胞などに目的とする GANP遺伝子を転移し、 細胞培養、 組織培養 などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の 細胞配合法により融合させることにより トランスジヱニック動物を作製すること もできる。
G A N P遺伝子を対象動物に導入させる際、 当該遺伝子を対象となる動物の細 胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子構築物として導入するこ とが好ましい。 具体的には、 目的とする GANP遺伝子を有する各種哺乳動物由 来の G A N P遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、 該 G A N P遺伝 子を連結したベクターを、対象となる哺乳動物の受精卵 （例えば、 マウス受精卵） へマイクロインジェクションすることによって、 目的とする G A N P遺伝子を高 発現するトランスジェニック哺乳動物を作製することができる。
G A N P遺伝子の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草菌由 来のプラスミ ド、酵母由来のプラスミ ド、 λ ファージなどのバタテリオファージ、 モロニ一白血病ウイ スなどのレト口ウイ/レス、 ワクシニアウィルスまたはバキ ュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 遺伝子発現の調節を行うプ 口モーターとしては、 たとえばウィルス （サイトメガロウィルス、 モロニ一白血 病ウィルス、 JCウィルス、 乳癌ウィルス、 など） 由来遺伝子のプロモーター、 各 種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラッ ト、 マ ウスなど） および鳥類 （ニヮトリなど） 由来遺伝子 [例えば、 アルブミン、 イン スリン II、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 ォステオカルシン、 筋クレアチン キナーゼ、 血小板由来成長因子 β、 ケラチン ΚΙ, ΚΙΟおよび Κ14、 コラーゲン I 型および II型、 心房ナトリウム利尿性因子、 ドーパミン /3 _水酸化酵素、 内皮レ セプターチ口シンキナーゼ、 ナトリウムカリウムアデノシン 3 リン酸化酵素、 二 ユーロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび ΙΙΑ、 メタ口プロティナ一 ゼ 1組織ィンヒビター、 MHCクラス I抗原、 平滑筋 α ァクチン、 ポリぺプチド鎖 延長因子 l a (EF-1 a ) 、 β ァクチン、 α および /3 ミオシン重鎖、 ミオシン軽 鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク、 血清アミロイ ド Ρコンポーネント、 ミオ グロビン、 レニンなどの遺伝子] のプロモーターなどが挙げられる。 上記べクタ 一は、 トランスジエニック哺乳動物において目的とするメッセンジャー R N Αの 転写を終結するターミネタ一を有していてもよい。 その他、 G A N P遺伝子をさ らに高発現させる目的で、 各遺伝子のスプライシングシグナル、 ェンハンサー領 域、 真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の 5' 上流、 プロモ 一ター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3' 下流 に連結することも所望に より可能である。 本発明の好ましい態様では、 ヒ ト免疫グロブリン遺伝子イント ロンェンハンサ一部分を G A N P遺伝子の 5， 側に連結することにより、 G AN P遺伝子を B細胞で選択的に発現させることができる。
受精卵細胞段階における G A N P遺伝子の導入は、 対象の哺乳動物の胚芽細胞 および体細胞の全てに過剰に存在するように確保することが好ましい。 トランス ジエニック後の作出動物の胚芽細胞において G A N P遺伝子が過剰に存在するこ とは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに G A N P遺伝子 を過剰に有することを意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその 胚芽細胞および体細胞の全てに G A N P蛋白質を過剰に有する。 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、 また、 該遺伝子を過剰に有 することを確認して、 通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
トランスジエニック対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である 外来性 G A N P遺伝子を対象非ヒト哺乳動物 （好ましくはマウスなど） またはそ の先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は、 同種の雄哺乳動物と雌哺乳 動物を交配させることによって得られる。 受精卵は自然交配によっても得られる が、 雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、 雄哺乳動物と交配させる方法が 好ましい。 雌哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、 例えば初めに 卵胞刺激ホルモン （妊馬血清性性腺刺激ホルモン （P M S G) ) 、 次いで黄体形 成ホルモン （ヒ ト絨毛性性腺刺激ホルモン （hC G) ) を例えば腹腔注射などによ り投与する方法が好ましい。
得られた受精卵に前述の方法により外来性 G A N P遺伝子を導入した後、 雌哺 乳動物に人工的に移植 ·着床することにより、 外来性遺伝子を組み込んだ D N A を有する非ヒト哺乳動物が得られる。 好ましくは、 黄体形成ホルモン放出ホルモ ン （L H R H) を投与後、 雄哺乳動物と交配させることにより、 受精能を誘起さ れた偽妊娠雌哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植 ·着床させる方法が好ま しい。 遺伝子を導入する全能性細胞としては、 マウスの場合、 受精卵や初期胚を 用いることができる。 また培養細胞への遺伝子導入法としては、 トランスジェニ ック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、 D N Aのマイクロインジェクションが好ましい。
遺伝子を注入した受精卵は、 次に仮親の卵管に移植され、 個体まで発生し出生 した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、 尾部先端） から D N Aを抽出し、 サザン解析や P C R法により導入遺伝子の存在 を確認することができる。 導入遺伝子の存在が確認された個体を初代 （Founder) とすれば、 導入遺伝子はその子 （F 1 ) の 5 0 %に伝達される。 さらに、 この F 1個体を野生型動物または他の F 1動物と交配させることにより、 2倍体染色体 の片方 （ヘテロ接合） または両方 （ホモ接合） に導入遺伝子を有する個体 （F 2 ) を作成することができる。
あるいは、 G A N P蛋白質高発現トランスジエニック哺乳動物は、 上記した G A N P遺伝子を導入遺伝子として ES 細胞に導入することによって作製すること もできる。 例えば、 正常マウス胚盤胞 （blastcyst) に由来する HPRT陰性 （ヒポ キサンチングァニン . フォスフオリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いてい る） E S細胞 （embryonic stem cell) に、 G A N P遺伝子を導入する。 該 G A N P遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされた E S細胞を HATセレク シヨン法により選別する。 次いで、 選別した E S細胞を、 別の正常マウスから取 得した受精卵 （胚盤胞） にマイクロインジェクションする。 該胚盤胞を仮親とし ての別の正常マウスの子宮に移植する。 そうして該仮親マウスから、 キメラトラ ンスジエニックマウスが生まれる。 該キメラトランスジエニックマウスを正常マ ウスと交配させることによりヘテロトランスジエニックマウスを得ることができ る。 該ヘテロ トランスジエニックマウス同士を交配することにより、 ホモトラン スジエニックマウスが得られる。
上記した本発明のトランスジエニック哺乳動物の子孫、 並びに該トランスジェ ニック哺乳動物の一部も本発明の範囲内である。 トランスジエニック哺乳動物の 一部としては、 該哺乳動物の組織、 器官及び細胞などが挙げられ、 器官または組 織としては、 脾臓、 胸腺、 リンパ節、 骨髄あるいは扁桃腺などが挙げられ、 細胞 としては B細胞などが挙げられる。
本発明のトランスジエニック哺乳動物は、 B細胞をさらに活性化する哺乳動物 と交配することも可能であり、 これによりさらに高親和性抗体を産生することが 可能である。 例えば、 自己免疫疾患マウスであるとされる MRL/lPr， NZB, (NZB x NZW) F1などを用いればさらに高い変異誘導を期待できる。 最近、 MRL/lprマウス で B細胞が末梢のリンパ節での活性化の際に胚中心を経過したあと T細胞領域で さらに V領域の突然変異誘導が更新していることが報告されている。 また、 本発 明者らも MRL/lprマウスにおいて G A N P遺伝子がこのように発現していること を見出している。 このことを利用して MLR/lprマウスの G A N Pトランスジェニ ックマウスを作成することによって、 ス一パー高親和性抗体産生マウスとなる可 能性がある。 本発明の G A N P遺伝子過剰発現トランスジエニック哺乳動物とさ まざまな自己免疫疾患モデル動物との交配により、 高親和性抗体を産生できる哺 乳動物を作製することができる。
( 2 ) 高親和性抗体の作製
本発明でいう抗体とは、抗原と特異的に結合する活性を有する蛋白質を意味し、 好ましくは B細胞が産生するものである。 本発明では、 抗原に対する反応性が高 い抗体のことを高親和性抗体と言う。
抗体分子の親和性亢進は抗体遺伝子の可変領域 （V領域） 遺伝子に体細胞突然 変異 （S HM) が誘導することによって生まれる。 抗体の抗原に対する特異性は 抗原を生体に免疫した当初から認められるが、 初期の抗体の多くは I g Mクラス であり、 また抗原に对する結合親和性は高くなく、 病原体や異物を除去したり、 不可化する能力は低い。 しカゝし、 抗原を生体に投与して数回の追加免疫によって 抗体の抗原に対する結合親和性が高まる。 この際、 B細胞は T細胞からの刺激が 必要で、 末梢のリンパ組織の胚中心領域でその活性化が行われるとされている。 V領域遺伝子の突然変異誘導に必要な分子としては最近、 胚中心で発現する R N Aエディティング分子 A I Dが必要であると報告されている。 さらに、 D N Aゥ ラシルグリカーゼ、 また D N A複製に必要な D N Aポリメラーゼとしてミスを生 じゃすい D N Aポリメラーゼゼ一タとアイオタが関与していることが報告されて いるが、 これらの機能を制御する分子はまだ明らかにされていない。 G A N P分 子は新たな S HM誘導分子としてその機能を明らかにしたもので、 その分子の発 現上昇が S HM誘導に重要な鍵を握る。 とりわけ、 高親和性抗体を産生するため に重要であることが明らかになった。
C 5 7 B L Z 6マウスにハプテン · キヤリァの抗原として二トロフエニル鶏 γ グロブリンを免疫すると誘導される抗体は、 Η鎖は V H 1 8 6 . 2ローカスを用 い、 L鎖は λ ΐである。 この際、 追加免疫をして得られる抗体は I g G 1抗体で あり、 そのうち特に結合親和性の高い抗体の V領域配列に誘導される突然変異は 3 3番目のトリプトファンがロイシンに変異したものであることが知られている, 本明細書の実施例ではこのモデルシステムで高い高親和性型の V領域突然変異が 誘導されており、 これは、 高親和性抗体が誘導されたことを示す分子レベルでの 明らかな証拠である。
即ち、 上記 （1 ) に記載のトランスジヱニック哺乳動物又はその子孫に抗原を 投与して抗体を産生することによって高親和性抗体を産生することができる。 即 ち、 G A N P蛋白質を高発現させた動物に目的とする抗原を常法によって投与し、 感作された動物の脾臓のリンパ球より高親和性抗体を調製することができる。 高 親和性抗体はポリクローナル抗体でもモノクロナール抗体でもよい。
ポリクローナル抗体を産生する方法としては、 例えば、 抗原を本発明のトラン スジエニック哺乳動物に投与し、 該哺乳動物から血液を採取し、 採取した血液か ら抗体を分離 ·精製することにより得ることができる。 免疫感作の方法は当業者 に公知であり、 例えば抗原を 1回以上投与することにより行うことができる。 抗 原投与は、 例えば 7〜3 0日間隔で 2〜3回投与すればよい。 投与量は 1回につ き、 例えば抗原約 0 . 0 5〜2 m g程度とすることができる。 投与経路も特に限 定されず、 皮下投与、 皮内投与、 腹膜腔内投与、 静脈内投与、 筋肉内投与等を適 宜選択することができるが、 静脈内、 腹膜腔内もしくは皮下に注射することによ り投与することが好ましい。 また、 抗原は適当な緩衝液、 例えば完全フロイント アジュバント又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有す る適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、 投与経路や条件等に応じてァ ジュバントを使用しない場合もある。
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、 該哺乳動物の血清をサンプリン グし、 抗体価を測定する。 抗体価が上昇してきたら、 例えば 1 0 0 g〜 1 0 0 0 μ gの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。 最後の投与から 1〜 2ケ 月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、 該血液を、 例えば遠心分離、 硫酸アンモニゥム又はポリエチレンダリコールを用いた沈澱、 ゲルろ過クロマト グラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ 一等のクロマトグラフィ一等の常法によって分離 ·精製することにより、 ポリク ローナル抗血清として、 ポリクローナル抗体を得ることができる。
モノクローナル抗体を産生する方法としては、 ハイプリ ドーマ法を挙げること ができる。先ず、アジュバント中に目的とする抗原を構成するペプチドを懸濁し、 該懸濁液を、 免疫動物 （即ち、 本発明のトランスジュニック哺乳動物） の皮下ま たは真皮内に投与する。 用いられるアジュバントとしては、 フロイントの完全ァ ジュバント、 フロイントの不完全アジュバント、 B C G、 トレハロースダイマイ コレート （T DM)、 リポ多糖 '（L P S )、 ミヨウバンアジュバント、 シリカアジ ュバント等が挙げられるが、 抗体の誘導能等の関係から、 フロイントの完全アジ ュバント （C F A) とフロイントの不完全アジュバント （I F A) とを組み合わ せて使用することが好ましい。
モノクローナル抗体の産生において、 免疫動物は抗原の初回免疫後、 更に、 追 加免疫を数回行い、 適当な日数を経過した後に部分採血を行い、 抗体価を測定す ることが好ましい。 本発明の方法で産生される抗体は高親和性抗体であるため、 上記免疫は初回のみで十分である可能性がある。 なお、 抗体価は、 例えば E L I S A法等、 公知の方法により測定することができる。
次いで、 感作の終了した免疫動物から脾臓を摘出し、 B細胞を得る。 この際、 抗原に結合する B細胞を得ることが、 その後のスクリーユングの軽減の点から好 ましい。 ここで得られる B細胞は高親和性抗体産生細胞であり、 これをそのまま 免疫賦活剤として使用することもできる。 また直接、 V領域遺伝子を得て、 その V領域の体細胞突然変異を測定することもできる。 次いで、 B細胞を常法に従い ミエ口一マ細胞と融合させて抗体産生ハイプリ ドーマを作製する。 例えば、 マウ スの場合であれば、 頸椎脱臼によって屠殺し、 脾臓を摘出し、 摘出した脾臓を、 例えば、 ハンクスの平衡塩溶液 （HB S S) 中に置き、 ピンセッ トで細胞を押し 出して脾臓リンパ球 （B細胞） を得る。 得られた脾臓リンパ球は、 トリパンブル 一等の染色液で染めて生細胞数をカウントし、 ミエローマ細胞と融合させてハイ ブリ ドーマとする。
用いられるミエローマ細胞は特に限定されず、 公知のものを使用できる。 例え ば、 P 3— X63— Ag 8— 01 (X63)、 P 3 -N S 1 - 1 -Ag 4- 1 (N S l)、 S P 2/O-Ag 14 (S P 2/0) 等を挙げることができる。 ミエロー マ細胞の選択にあたっては、 抗体産生細胞との適合性を考慮する必要がある。 細胞の融合方法は、 センダイウィルス法、 ポリエチレングリコール法、 プロト プラスト法等、 当該分野で公知の方法を任意に選択して用いることができるが、 特にポリエチレングリコール法が、 細胞毒性が比較的少なく、 融合操作も簡単で あるという理由から好ましい。 なお、 抗体を大量に作り出したい場合は、 ビュル ピリジン誘導体で刺激した抗体産生細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイプリ ドーマを用いることが好ましい。
得られたられたハイプリ ドーマは、常法に従い、 HAT培地（ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 およびチミジン含有培地） 中で適当な期間培養し、 ハイブリ ド 一マの選択を行う。 次いで、 目的とする抗体産生ハイブリ ドーマのスクリーニン グを行った後、 該ハイプリ ドーマのクローニングを行う。
スクリーユング法としては、公知の抗体検出方法を用いることができ、例えば、 酵素ィムノアッセィ （以下 「EL I SA」 という） 法、 ラジオィムノアッセィ （以 下 「R I A」 という） 法、 プラーク法、 凝集反応法等を用いることができる。 ま た、 クローニング法としては、 当該分野で公知の方法を用いることができ、 例え ば、 限界希釈法、 軟寒天法および F A C S法等を用いることができる。 得られた ハイプリ ドーマは、 適当な培養液中で培養するか、 あるいはハイプリ ドーマと適 合性のある、 例えばマウス腹腔内に投与する。 こうして得られる培養液中または 腹水中から、 塩析、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 ァフィ二ティー クロマトグラフィー等により、 所望のモノクローナル抗体を単離精製することが できる。
また、 上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。 抗体の断片としては、 前 述したポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、 具 体的に【ま F b ) 2、 Fab 、 Fab、 F v (variable fragment of antibody) 、 s F v、 d s F v (disulphide stabilised Fv) あるレヽは d A b (single domain antibody) 等が挙げられる。 ここで、 「F (ab' ) 2」 及び 「Fal>，」 とは、 ィムノグロ ブリン （モノクローナル抗体） を、 蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイ ン等で処理することにより製造され、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在するジ スルフィ ド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。 例 えば、 I g Gをパパインで処理すると、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在する ジスルフィ ド結合の上流で切断されて ( L鎖可変領域） と Ct ( L鎖定常領域） からなる L鎖、 及 Χ νΗ (Η鎖可変領域） と CH y l (H鎖定常領域中の γ ΐ領域） とからなる Η鎖フラグメントが C末端領域でジスルフィ ド結合により結合した相 同な 2つの抗体フラグメントを製造することができる。 これら 2つの相同な抗体 フラグメントを各々 Fab'という。 また I g Gをペプシンで処理すると、 ヒンジ領 域中の 2本の H鎖間に存在するジスルフィ ド結合の下流で切断されて前記 2つの Fab'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造する ことができる。 この抗体フラグメントを F (ab，）2という。
本発明の高親和性抗体はヒ ト型化抗体ゃヒ ト抗体でもよい。 これらの抗体は、 免疫系をヒ トのものと入れ換えた哺乳動物を用いて、 該哺乳動物を免疫して、 通 常のモノクローナル抗体と同様に直接ヒ ト抗体を作製することができる。 本発明の抗体のアイソタイプは特に限定されず、例えば、 IgG(IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4) 、 IgM、 IgA (IgAl、 IgA2) 、 IgDまたは IgEの任意のアイソタイプを有す ることができる。
( 3 ) 高親和性抗体の利用
上記 （2 ) に記載した高親和性抗体は、 疾患の診断、 治療又は予防のための薬 剤として有用である。
( i ) 疾患の診断
本発明の抗体を用いた各種疾患の診断方法は、 各種疾患の疑いのある被験者か ら採取した検体、 例えば血清等と本発明の抗体とを抗原抗体反応によって結合さ せ、 結合した抗体量により検体中の目的とする抗原の量を検出することにより行 う。 抗体量の検出は、 公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、 例えば、 免疫 沈降法、 免疫凝集法、 標識免疫測定法、 免疫比ろう法、 免疫比濁法等を用いるこ とができる。 特に標識免疫測定法が簡便かつ高感度という点で好ましい。 標識免 疫測定法では、 検体中の抗体価は標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほ 力、 既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として用いて相対的に表しても よレ、。 すなわち、 標準液と検体を同測定系にて同時に測定し、 標準液の値を基準 にして検体中の抗体価を相対的に表すことができる。
標識免疫測定法としては、 公知の測定法、 例えば、 E L I S A法、 R I A法、 蛍光免疫測定法、 化学発光免疫測定法等を任意に利用することができる。 用いる 標識物質は、 上記測定法に応じて、 酵素、 放射性同位体、 蛍光化合物、 および化 学発光化合物等を適宜選択すればよい。 前記酵素としては、 例えば、 ペルォキシ ダーゼ、 アルカリホスファターゼ、 酸性ホスファターゼ、 グルコースォキシダー ゼ等を挙げることができる。 上記標識物質はァビジン一ビォチン複合体を用いる ことにより、 標識物質の検出感度を向上させることも可能である。 また、 放射性 同位体としては、 主に 1251力 蛍光化合物としては、 フルォレセィンィソチオシ ァネート （FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネート （RITC) 等が挙 げられる。 化学発光化合物としては、 口フィン、 ルミノール、 ルシゲニン等が挙 げられる。 上記標識物質による抗体の標識は、 常法に従って行うことができる。 以下、 標識抗体を用いた標識免疫測定法について説明する。
標識免疫測定法による、 各種疾患を検出する方法としては、 公知の非競合反応 系あるいは競合反応系を用いて行うことができる。 非競合反応系においては、 固 相が必要である （固相法)。 競合反応系においては、 必ずしも固相を必要としない (液相法） 力 固相を用いた方が、 測定操作が簡便になるため好ましい。 固相の 材質としては、 例えば、 ポリスチレン、 ナイロン、 ガラス、 シリコンラバー、 セ ルロース等が挙げられ、 固相の形状としては、 球状、 ゥエル状、 チューブ状、 シ ート状等が挙げられるが、 これらに限定されず、 標識免疫測定法に用いられる公 知のものを任意に用いることができる。
非競合反応系の場合、 測定操作は、 検体または本発明の抗体を固相化した後、 本発明の抗体または検体と反応させ、 次いであらかじめ標識しておいた抗免疫グ ロブリン抗体 （二次抗体） を加えて固相化した検体と反応している抗体と反応さ せる。 この二次抗体の標識により、 検体に結合した抗体量を検出することができ る。 検出された標識化二次抗体の量は、 検体中の目的とする抗原の量と正相関す るので、 これにより検体中の目的とする抗原の量を求めることができる。
競合反応系では、 一定量の抗体に対して、 検体と一定量の目的とする抗原を競 合的に結合させる。 例えば、 検体を固相化した後に、 あらかじめ目的とする抗原 を添加し反応させた本発明の抗体と反応させる。 次に、 固相化された検体と反応 した抗体を、 あらかじめ標識しておいた抗免疫グロブリン抗体 （二次抗体） と反 応させ、 標識物質によって抗体の量を検出することができる。 検出される標識量 は、 添加された目的とする抗原の量と逆相関する。 そのほかの競合反応系として は、 本発明の抗体を固相化して、 これに検体と反応させた後、 あらかじめ標識し ておいた目的とする抗原を反応させる。 検出される標識量は、 抗体と結合した検 体中の G A N P蛋白質量と逆相関する。
前記した抗原または抗体の固相化法としては、 物理的吸着法、 共有結合法、 ィ オン結合法、 架橋法等、 公知の方法を使用できる。 特に、 物理的吸着法が簡便と いう点で好ましレ、。 また、抗免疫グロプリン抗体（二次抗体） としては、例えば、 抗 IgG抗体、 抗 IgM抗体等を用いることができる。 これらの抗体は、 抗体分子を そのまま使用してもよいし、 あるいは抗体を酵素処理して得られる抗原結合部位 を含む抗体フラグメントである Fab、 Fab'、 F (ab' ) 2を使用してもよレ、。 さらに、 標識した抗免疫グロプリン抗体の代わりに、 抗体分子に特異的な親和性をもつ物 質、 例えば IgGに特異的な親和性をもつプロテイン A等を標識して使用してもよ レ、。
前記標識免疫測定法の好適な例として、 酵素を標識とした免疫測定法、 E L I S A法を挙げることができる。 E L I S A法は、 例えば、 9 6穴プレートに検体 またはその希釈液を入れて、 4 °C〜室温で一晚、 または 3 7 °Cで 1〜3時間程度 静置して検出すべき G A N P蛋白質を吸着させて固相化する。 次に、 本発明の抗 体を反応させ、 次いであらかじめ酵素を結合させた抗免疫グロブリン抗体 （二次 抗体） を反応させる。 最後に酵素と反応する適当な発色性の基質 （例えば、 酵素 がホスファターゼなら p —ニトロフエニルリン酸等） を加え、 この発色によって 抗体を検出する。
また、 本発明の高親和性抗体を利用することにより、 各種疾患の治療薬の薬効 評価を行うことができる。 本発明の高親和性抗体を利用した薬効評価方法は、 各 種疾患患者あるいは各種疾患モデル動物に対して薬剤を投与後、 これら生体中の ウィルス等の抗原の量を本発明の抗体を用いて検出し、 その量を比較することに より、 生体中の抗原の量を通して各種疾患の治療薬としての薬効を評価すること ができる。
本発明の高親和性抗体は、 各種疾患診断用キットの形態で提供することができ る。 該キットは、 本発明の診断方法や本発明の薬効評価方法に使用することがで きる。 本発明のキットは以下の （a ) 及び （b ) から選ばれる少なくとも一つ以 上を含む。
( a ) 本発明の抗体またはその標識物 ( b ) 前項 （a ) 記載の抗体またはその標識物を固定した固相化試薬 ここで、 抗体の標識物とは、 酵素、 放射性同位体、 蛍光化合物、 または化学発 光化合物によって標識されたものを意味する。
また本発明のキットにおける抗体、 もしくはこれらの標識物を固定する固相の 材質としては、 ポリスチレン、 ナイロン、 ガラス、 シリ コンラバ一、 セルロース 等が挙げられ、 固相の形状としては、 球状、 ゥエル状、 チューブ状、 シート状等 が挙げられるが、 これらに限定されない。 該固相化試薬の代わりに、 固相と固相 化に必要な固相化試薬を添付したものでもよい。 固相化試薬として、 例えば物理 的吸着による固相化の場合は、 50mM炭酸塩緩衝液 （pH 9. 6)、 10 raM トリス-塩酸 緩衝液（PH8. 5、 lOOmM塩化ナトリウム含有）、 PBS等のコーティング液と、 さらに 必要に応じてコーティング液に 0. 5%のゼラチン等を含有させたプロッキング液 が挙げられる。
また、 本発明のキッ トにおける抗体は、 PBS等に溶解させた状態、 あるいはゲ ルに結合させた状態 （以下、 「吸収用ゲル」 と略す） であってもよい。 前記吸収用 ゲルはさらに適量を、 バッチ法による吸収処理用に 0. 5〜2m l程度のマイクロ遠 沈チューブに予めパッケージングされた状態であってもよく、 あるいはカラム法 による吸収処理用にカラム容量が 0. 1〜5 mlのミニカラムに予め充填された状態 であってもよい。
本発明のキットは、 上記した構成要素のほか、 本発明の検出を実施するための 他の試薬、 例えば標識物が酵素標識物の場合は、 酵素基質 （発色性基質等）、 酵素 基質溶解液、 酵素反応停止液、 あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。 前 記検体用希釈液としては、例えば PBS (生理的リン酸緩衝液、 p H 7 . 4 )、 137mM 塩化ナトリゥムおよび 3mM塩化力リゥムを含む pH7. 4かつ 20mMのトリス-塩酸緩 衝液（以下、 「TBSと」略す）、 0. 05%Tween20、 0. 1〜1%の BSAを含有させた PBS、 あるいは TBS等を挙げることができる。 該検体用希釈液は、 検体希釈以外、 例え ば抗体の希釈等に用いてもよい。
( i i ) 疾患の治療又は予防 本発明の高親和性抗体は、 疾患の病原となる抗原の活性を中和させる作用を有 するものであれば、疾患の治療又は予防のためにも有用である。本発明の薬剤は、 本発明の高親和性抗体またはその断片を有効成分として含み、 さらに薬学的に許 容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
ここで「薬学的に許容され得る担体」 とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、 安定剤、 保存剤、 緩衝剤、 乳化剤、 芳香剤、 着色剤、 甘味剤、 粘稠剤、 矯味剤、 溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。 そのような担体の一つ以上 を用いることにより、 錠剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 注射剤、 液剤、 カプセル剤、 トロー剤、 エリキシル剤、 懸濁剤、 乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成 物を調製することができる。 これらの医薬組成物は、 経口あるいは非経口的に投 与することができる。 非経口投与のためのその他の形態としては、 一つまたはそ れ以上の活性物質を含み、 常法により処方される外用液剤、 腸溶内投与のための 坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
本発明の薬剤の投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重及び症状、 治療効果、 投与 方法、 処理時間、 あるいは該薬剤に含有される活性成分である高親和性抗体の種 類などにより異なるが、 通常成人一人当たり、 一回につき 10 /i gから 1000rag、 好 ましくは カゝら lOOmgの範囲で投与することができるが、 この範囲に限定さ れるものではない。 例えば、 注射剤の場合には、 例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等 の薬学的に許容される担体中に 0. 1 g抗体 Zml担体〜 10mg抗体 Zml担体の濃度 となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。 このように して製造された注射剤は、 処置を必要とするヒ ト患者に対し、 1回の投与におい て 1 k g体重あたり、 1 ju g〜100mgの割合で、好ましくは 50 // g〜50ragの割合で、 1日あたり 1回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、 皮下注射、 皮内注射、 筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、 好ま しくは静脈内注射である。 また、 注射剤は、 場合により、 非水性の希釈剤 （例え ばプロピレンダリコール、ポリエチレングリコ一ル、ォリーブ油のような植物油、 エタノールのようなアルコール類など） 、 懸濁剤あるいは乳濁剤として調製する こともできる。 そのような注射剤の無菌化は、 バクテリア保留フィルターを通す 濾過滅菌、 殺菌剤の配合または照射により行うことができる。 注射剤は、 用時調 製の形態として製造することができる。 即ち、 凍結乾燥法などによって無菌の固 体組成物とし、 使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用する ことができる。
( 4 ) 本発明の応用
本発明者らは、 B細胞腫瘍株に対する G A N P過剰発現を誘導した上での解析 を行った結果、 遺伝子導入で飛躍的な V領域遺伝子の体細胞突然変異誘導効果が あることが判明した。 この効果は、 RNA プライマーゼに必要な 5 0 2番目のセリ ンのリン酸化が起こらないような変異遺伝子を用いた場合には見られないことか ら、 RNA プライマーゼ活性が必要であることを示している。 この結果は、 臨床的 な補助免疫賦活として特異的抗体産生の増強効果を示すものである。 ベクターと してレトロウイルスベクターを使用し、 CD40, BAFFなどの TNFファミリー分子 を介する刺激を併用することも効果的である。 この遺伝子導入を骨髄細胞レベル で行うことによって T細胞における高親和性結合も期待できる。 エイズ、 C型肝 炎ウィルス、 成人 T細胞白血病、 狂牛病などの高親和性抗体が得られないか、 得 られたとしてもすぐに抗原の変異が起こるために十分に高親和性抗体の産生が持 続できない場合にはこの遺伝子導入は優れた効果を発揮すると期待できる。 本発明の G A N P遺伝子過剰発現哺乳動物は、 生物学研究試薬、 臨床検查試薬 作成に有効なモノクロナール抗体の開発に有効である。 例えば、 特定のシグナル 伝達分子に対するモノクロナール抗体を機能ドメインや機能モチーフに特異的に そして結合力の高い高親和性抗体を簡便に作成することは非常に活用される範囲 が広い。 多くの抗体はそれほど多くのスクリーニングをかけないため、 ゥエスタ ン解析と免疫沈降に用いることができない場合がある。 この場合、 本発明のトラ ンスジュニック哺乳動物を用いれば、 比較的少ないクローンの抗体から高親和性 抗体産生細胞を短時間で選別することができ、 経費、 時間、 労力の削減する効果 は大きい。特にリン酸化抗体、遺伝子変異部分に対する特異抗体の作成は診断薬、 あるいは抗体を用いた薬物の選択的注入法に応用できる。 また遺伝子の配列ゃヌ クレオチド部分に選択的に結合する高親和性抗体の産生も可能となる。 抗原のモ チーフは無機物、 炭水化物、 化学合成物など、 任意の物質の立体構造の一部を認 識する。 従来には高親和性抗体は得られていないが、 自己免疫疾患マウスとの交 配で作成されるマウスは、 あらゆる抗原に対して高親和性抗体を得るために有効 である。 この方法で結合力が 1 0— オーダーの高親和性抗体ができる可能性 があり、 ELISA 法の技術開発を導入することにより、 微量物質の検出を簡便に行 う技術を開発することが可能である。
また、 本発明によれば、 RNAプライマーゼ不活性型 G A N P遺伝子を含む、 了 レルギ一疾患又は自己免疫疾患のための遺伝子治療剤を提供することも可能であ る。 本発明の遺伝子治療剤は、 RNAプライマーゼ不活性型 G A N P遺伝子を含む 組み換えべクターを、 遺伝子治療剤に用いる基剤と一緒に配合することにより製 造することができる。 組み換えベクターの構築の際に用いるベクターとしては、 ウイノレスベクターとしてレトロウイルスベクター、 アデノウイノレスベクター、 ァ デノ随伴ウィルスベクタ—、 バキュロウイノレスベクター、 ワクシニアゥイノレスべ クタ一などが挙げられ、あるいは動物発現用ブラスミ ドを使用することもできる。 ベクターは好ましくはウィルスベクターである。 RNAプライマーゼ不活性型 G A N P遺伝子をウィルスベクターに組み込んだ場合は、 組換え体 D N Aを含有する ウィルス粒子を調製し、 遺伝子治療剤に用いる基剤と一緒に配合することにより 遺伝子治療剤を製造することができる。
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、 通常注射剤に用いる基剤を使用すること ができ、 例えば、 蒸留水、 塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合 物等の塩溶液、マンニトール、 ラク トース、デキストラン、 グルコース等の溶液、 グリシン、 アルギニン等のアミノ酸溶液、 有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶 液との混合溶液等が挙げられる。 あるいはまた、 当業者に既知の常法に従って、 これらの基剤に浸透圧調整剤、 p H調整剤、 植物油、 もしくは界面活性剤等の助 剤を用いて、 溶液、 懸濁液、 分散液として注射剤を調製することもできる。 これ らの注射剤は、 粉末化、 凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製する こともできる。
本発明の遺伝子治療剤の投与形態としては、 通常の静脈内、 動脈內等の全身投 与でもよいし、 局所注射又は経口投与等の局所投与を行ってもよい。 本発明の遺 伝子治療剤の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤型によって 異なるが、 一般に、 成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として l w gZ k g から 1 0 0 OragZk g程度の範囲であり、 好ましくは 1 0 /i g Z k gから 1 0 0 mg/ k g程度の範囲である。 投与回数は特に限定されない。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。 実施例
実施例 1 ：
(材料及び方法）
1 . 動物
NZB、 NZW、 B/WF1、 MRL/lpr、 及び BXSB マウスは Japan SLC Co.から購入した。 C57BL/6及び BALBんマウス Charles River Japanから購入した。 NODマウスは大 阪大学の宮崎博士から供与された。
2 . 抗体及び試薬
マウス B220 (RA3- 6B2)、 マウス IgM (AM/3) 及びマウス IgD (CS/15)に対する ラットモノクローナル抗体はハイプリ ドーマの培養上清から精製し、 D -ピオチン - N -ヒ ドロキシスクシンィミ ドエステノレ (Roche diagnostics, Branchburg, NJ)で 標識した。ピオチン標識ラッ ト抗マウス Syndecan- 1及び抗マウス CD5モノクロ一 ナル抗体は購入した （BD PharMingen, San Diego, CA)。 ピオチン標識ピーナッツ ァグルチュン（PNA)は Vector Laboratories (Burlingame, CA)から購入した。 3 . 免疫
ト ί)ニトロフエニル- keyhole limpet hemocyanin (TNP- KLH)及び TNP- Ficoll は Biosearch Technologies (Novato, CA)から購入した。 完全フロイントアジュ バンドに乳化した 1 0 0 μ gの TNP-KLHまたは PBS中の 25 μ gの TNP- Ficollを腹 腔内に注入した。 1 4日後、 リンパ器官を取得し、 免疫組織分析用に OCT化合物 とともに凍結した。
4 . 免疫組織分析
6 μ mの凍結切片をァセトンで 5分間固定し、 PBS中の 3% BSAで 1 5分間ブロ ッキングし、 ラット抗マウス G A N Pモノクローナル抗体（42-23) [Kuwahara K. , 他、 2000, Blood 95： 2321 - 2328]またはラット抗- pSer502 G A N Pモノクローナ ル抗体 （PG/103) [Kuwahara Κ· ,他、 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98： 10279- 10283]と一緒に 1時間インキュベートした。スライ ドを PBSで数回洗浄し、 アルカ リ ホ ス フ ァ ターゼ （ALP) -結合ャギ抗ラ ッ ト IgG 抗体（ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA)と一緒にインキュベー卜した。 発色は Vector Blue kit (Vector)を用いて行った。 二重染色のためには、 反応はピオチン標識抗 体と西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP) -結合ス トレプトアビジン（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を組み合わせて行った。 3-3' -ジァミノ ベンジジンテトラヒ ドロクロライ ド（DAB ; 同仁化学）による発色後、 切片を PBS 中 1%グルタノレアルデヒ ドで 1分間固定した。 Aquatex (Merck, Darmstadt, Germany)をマウンティングのために用いた。 インビボで増殖活性のある細胞を検 出するために、ブロモデォキシゥリジン （BrdU) (Sigma Chemicals Co. , St. Louis, M0; 1 mg/マウス）を殺す 2時間前に静脈内に注入した。 DNA合成を行う細胞を抗 BrdU モノクローナル抗体 （BD PharMingen)と ALP-結合ャギ抗マウス Ig 抗体 (Sigma)とを組み合わせて染色し Vector Red (Vector)により発色させて検出した。 PAS染色は既報の通り行った [Jiang Y.他、 1997, Immunol. 158 : 992-997]。 (結果）
1. MRL/lpr マウスのリンパ節における G AN Phi細胞の出現
GANP発現は自己免疫傾向の高活性 B細胞で高発現している。 高レベルの G AN Pを発現するリンパ細胞 （GANPhi細胞）は、 MRL/lprマウスの末梢リンパ 節において非免疫状態において自発的に出現する。 C57BL/6 マウスと比較して増 加は顕著であり、 非免疫条件下では GANPhi細胞は示されない （図 1)。 そのよ うな G AN PM細胞の出現を、 加齢の間少しずつ自己免疫状態を引き起こす NZB マウスのリンパ節で調べた。 若い NZBマウス （7週齢） は、 膝窩リンパ節に G AN Phi 細胞を有さないが、 加齢した NZB (40 週齢）は多数の GANPhi 細胞を有し た。
GANP RNA-プライマーゼ活性は B 細胞の活性化と分化で重要な役割を担つ ている可能性がある。 そこで、 NZBマウスで抗 pSer5°2モノクローナル抗体を用い て、 RNAプライマーゼ活性の重要なリン酸化部位である Ser5G2のリン酸化状態を 比較した [19]。 GANPの発現は 8週目で顕著であり、 GANPM細胞が32週 までの全期間を通じて検出された （図 2;上図）。対照的に、 pSer 5G2-陽性細胞は 8 週目に最大であつたが、その後、陽性細胞は顕著に減少した（図 2；真中の図）。 ピ ーク年齢に基づく顕微鏡観察での反応性細胞数を図に示す（図 2 ；.下図）。 これら も結果から、 GANP発現は最初に RNA-プライマーゼ活性を伴うが、 この活性は 長期間に渡っては調節されていないことが分かる。
2. 自己免疫傾向マウスの脾臓の赤脾髄における G AN Phi細胞の自発的出現 自己免疫傾向 NZBマウスの膝窩リンパ節で検出された G AN Phi細胞が非免疫状 況下の脾臓に出現するかどうかを調べた。 G AN Phi細胞は 4週目に脾臓に出現し、 細胞数は 1 2週目に最大値に達したが、 24週後に消失した（図 3；上図）。 pSer502 GANPの発現も 8週目と 12週目に検出された （図 3;真中の図）。 赤脾髄の相 対細胞数と比較した結果、脾臓に出現した GANPhi細胞は 1 2週後には末梢リ ンパ節に移動していることが分かる。 GANPhi の増加は、 自己免疫疾患の発症 に先行する自己抗体の産生量に比例している （図 2及び図 3； Theofilopoulos A.N.,他、 1985， Adv. Immunol. 37: 269-390)。
GANPhi細胞の出現は自己免疫傾向マウスにおける B細胞の異常と関連して いる可能性があるので、 非免疫条件下で各種の自己免疫傾向マウス （8週齢） に おける G A N P hi細胞の出現を調べた。 GANPhi細胞は MRL/lpr、 NZB及び B/WF1 で顕著に増加していた。 G A N Phi細胞の数は SLE-モデルマウスの BXSB及び N0D ではそれほど増加しなかったが、 対照の BALBんマウス （図 4) 及び C57BL/6マ ウス （図 1 )と比較すれば増加していた。脾臓の切片は、 GC様構造として PNA+ B細 胞の連想又は未熟の会合を示した。 GC様領域での G AN Pの発現は、正常 C57BL/6 マウス及ぴ BALB/cマウスに TD- Agsを免疫することによつて作製した GCと比較し て高くない。 しかし、 GANPhi細胞は、 自己免疫傾向マウスの赤脾髄領域で顕 著に出現していた（図 4)。
G AN Phi細胞集団を、 リンパ系細胞のマーカー分析によってさらに解析した。 それらは B220— Syndecan- Γの表現型を発現し、多量の IgMを細胞中に発現する（図 5)。 CR1、 Thy - 1、 GL- 7、 CD23及び PNAについては陰性であり、 これらの結果か ら、 G AN Phi細胞が B系細胞の後期成熟段階、 おそらく形質細胞であることが 示される。この細胞が増殖性形質ブラス ト胚細胞であるかどうかを調べるために、 NZBマウスに BrdU を静脈内注入し、 インビボで BrdUを取り込ま細胞ために 2時 間インキュベートした後に殺して脾臓切片を調製した。 G AN Phi細胞は BrdU取 り込みについて陽性ではないことから （図 6)、 これらの細胞は増殖性ではなく、 形質胚細胞段階より成熟していることが示唆された。
B-1細胞の異常な分化として、 Mott細胞形成が自己免疫傾向マウスで観察され る。 Mott細胞は形質細胞の異常な形態であり、 多量の IgM分子が、 PAS染色によ り細胞質内 Russell 体として検出される粗面小胞体結合小胞に蓄積している [Jiang Y.,他、 1997， J. Immunol. 158： 992-997]。 G AN Phi細胞は PAS-染色 で染色されず（図 6 )、 これにより G A N P hi細胞を B-1細胞由来形質細胞の Mott 細胞と区別できる。 脾臓 G AN Phi 集団は CD5発現が陰性であり（図 6)、 NZBマ ウス（12週）から得た腹膜細胞は GANPhi 細胞について陰性であったことか ら、 B-1 細胞は多量の GANPを発現していないことが示される。 これらの結果 から、 GAN Phi細胞は自己免疫状態で高活性の B細胞に分類され、 この集団が B-1細胞の起源とは異なる起源の系統であることが示唆される。
3. TD-Agでの免疫による正常マウスにおける G AN Phi細胞の誘導
二次リンパ器官における G AN Phi形質細胞の出現が自己免疫傾向マウスに限 られているかどうか調べた。 数は非常に少ないが、 G AN Phi 形質細胞集団は、 TD-Agsによる免疫によつて正常 C57BL/6及び BALB/c マウスの脾臓においても誘 導される（図 7)。 T細胞依存性 Ag (TI- Ag)による免疫はそのような細胞の誘導に おいて効果は少ない。 G AN Phi細胞集団は
Figure imgf000029_0001
と同様の表現型を示したが、 Syndecan- Γを示した。 これらの結果から、 自己免疫 傾向マウスにおける G AN PM 形質細胞の生成は、 TD- Agに対する免疫応答のた めに提供される同様に刺激によって誘導されることが示される。 GCで増殖と分化 を経た Ag駆動 B細胞は、 GANPを発現しながらより長い間、形質細胞段階とし て赤脾髄領域に局在化している可能性がある。 実施例 2 ：
(方法)
1. Daudi細胞への安定なトランスフエクシヨン
10 μ gの線状化した p CXN— 2マウス g a n p又は g a n p S/A 502 c DN Aを Daudi細胞に、 Gene Pulser II (Bio- Rad)を用いてエレク トロポレー シヨンした。 48時間後、 G418 (Promega; 1 mg/ml)により選択を開始して、 マウ ス GANPを安定に発現する Daudi細胞を得た。
2. Daudi トランスフエクタントの Ig VH転写物の分析 全 RNAを全細胞から Trizol (Invitrogen)を用いて抽出した。 cDNAを既報の通 り取得した (Kuwahara, K. et al.， Blood 95, 2321-2328 (2000))。 LVH3- CH1C ^転写物を 5， -LVH3プライマー（5， -CTATAACCATGGACCATGGACATACTTTGTT CC- 3， ) 及び 3' -Xbal- CH1- プライマー （5， -TGCATGCATTCTAGAGTTGCCGTTGGGGTGCTGGA C-3' ) により Pfu Turbo (Stratagene)を用いて増幅した。 PCR産物を Ncol及ぴ Xbalで消化し、 ゲルで精製し、 Ncol- Xbalで消化したプラスミ ドとライゲーショ ンした。 コンビテント細菌に形質転換後、 QIAprep キット（QIAGEN)を用いて調製 した少量のプラスミ ド DN Aの塩基配列を自動シークェンサ一 （Applied Biosysteras) により決定した。
3. G AN P-トランスジエニック （Tg) マウスの作製
導入遺伝子は、 pLGベクターの Xholサイ トに 5.6 kbのマウス G AN P遺伝子 を導入して作成した。 このべクタ一はヒ ト免疫グロブリンイントロンェンハンサ 一領域 （2kb EcoRIフラグメント） を持ち、 B細胞での強力な発現を行う、 特異 的べクタ—である。 この遺伝子を直線化してマウスに遺伝子導入を行った。 マウ ス g a n p全長 c DNAを含む線状化した pLG vector (Koike, . et al. Int. Immunol. 7, 21-30 (1995)) を C57BL/6 マウスの受精卵にマイクロインジェク シ ヨ ンした。 マ ウスの尾のゲノ ム D N Aおよび 1-5， プライマー (5， - TCCCGCCTTCCAGCT GTGAC- 3， ) と 卜 3， プ ラ イ マ ー (5， -GTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3 ' ) を用いて導入遺伝子の存在についてスクリー ユングした。
4. RT-PCR
全 RNAの調製及び c DNA合成は既報の通り行った （Kuwahara, K. et al. , Blood 95, 2321-2328 (2000))。 GANP 転写物は上記した 2種のプライマー 1 - 5' 及び 1-3' により検出した。 /3—ァクチンを用いて RNAの回収をモニタ一 した。 5 . CD19-Cre+/G A N P flo マウスの樹立
G A N Pゲノム D N Aを用いて、 ェクソン I Iの下流にネオマイシン耐性遺伝 子 （neo) を挿入することによってタ一ゲッティングベクターを調製した。 ΙοχΡ 部位を、 neo の 3 ' 側の隣接領域とェクソン I及び I Iの間のイントロンに導入 した。直線化したターゲッティングベクターを TT2 ES細胞（Yagi， T. et al. Anal. Biochem. 214, 70-76 (1993) ) にエレク トロポレ一シヨンにより トランスフエク シヨンした。 G418で選択後、 ES コロニーを拾い上げ、 プロテナーゼ K と一緒に イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 相 同 組 換 え 体 を neo2 プ ラ イ マ ー (5' -GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT-3 ' ) 及 び CGK3' -2 プ ラ イ マ ー (5' -GGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3 ' ：)によりスクリーニングした。 相同組み 換えは、 BamHIで消化した ESクローンの DNAをプローブ Aを用いてサザンブロッ ト分析することにより確認した。 4 k bのバンドを示す 3個の陽性クローンを用 いて、 ICR胚盤胞へのマイクロインジェクションによりキメラ初代マウスを作製 した。 B細胞における g a n p遺伝子を欠失さ細胞ために、 G A N P- floxed マ ウスと CD19— Creノックインマウス （Rickert, R. C. , et al. , Nucleic Acids Res. 25, 1317-1318 (1997) ) とを交配した。
6 . FACS分析
リンパ器官由来の単一細胞懸濁物を、 各ビォチン標識モノクローナル抗体によ り氷上で 1時間染色した。染色バッファーで洗浄後、細胞を FITC結合ストレブト アビジン （Amersham Bioscience)及び PE結合モノクローナル抗体で 1時間ィンキ ュベートした。 リンパ細胞を、 CellQuest ソフトウェアを用いて FACScan (Becton Dickinson)により分析した。
7 . B細胞の精製
脾臓細胞を野生型マウス及び G A N P— -マウス（7から 8週齢）から単離し、 0. 15 M塩化アンモニゥム緩衝液で処理して赤血球を除いた。 プラスチック皿上で 3 7 °Cで 3 0分間インキュベーションした後、 未接着細胞をリンパ球として回収 し、 T細胞を Dynabeads-anti- mouse Thyl. 2 モノクローナル抗体（Dynal)を添付 のプロトコールに従って使用して除去した。 B細胞の純度（90%以上）を FITC結合 抗 B 2 2 0モノクローナル抗体（BD Pharmingen)を用いた細胞表層染色により確 認した。
8 . インビトロ增殖アツセィ
精製した B細胞を、 10%熱不働化 F C S (JRH Biosciences；)、 2 raMの L -グルタミ ン及ぴ 5 X 10"5 Mの 2-メルカプトエタノールを含む RPMI- 1640 培地 （分裂促進 剤を含むものと含まないもの） 中において、 9 6穴マイクロタイタープレートで 2 X 105 細胞 Zゥエルで 4 8時間インキュベートした。 細胞を、 0. 2 ^ Ci/ゥエル の [¾]-チミジン（ICN)で 1 6時間パルスしてから回収し、 取り込まれた放射活性 をシンチレーシヨンカウンターで測定した。
9 . 抗原及び免疫
TNP- KLH、 TNP- Ficoll及び NP- CG (23 : 1)は、 Biosearch Technologiesから購入 した。 5 0 μ gの TNP-KLH及び NP- CG (アルミ二ゥムで沈殿）、 又は 2 5 gの TNP- Ficoll (PBSに溶解）を野生型及び G A N P マウスの腹腔内に注入した。
1 0 . 抗原特異的抗体産生の測定
抗原投与の 1 0日後と 1 4日後に、 免疫したマウスから血清を回収した。 5 / gノウエルの TNP- BSA (Biosearch Technology) を ELISAプレートに被覆した。 各ゥエルを P B S中の 3% BSAでブッロキングし、段階希釈した血清とインキュべ 一トした。 PBS- 0. 1% Tween 20で洗浄後、 ゥエルをピオチン結合 isotype特異的 モノクローナル抗体及びアル力リ ホスファターゼ結合ス ト レプトァビジン (Southern Biotechnology)とともにィンキュベートした。 発色は基質の存在下で 行った。
1 1. VH186.2 遺伝子の配列分析
NP-CG で免疫したマウスの NIP-結合 IgGl^CDSS^ B 細胞を、 FACS Vantage (Becton Dickinson)で分画し、 プロテナーゼ Kと一緒に 37°Cで一晚インキュべ 一卜した。 ライセートを用いて、 PCR を既報の通り （Takahashi, Y. , et al. Immunity 14, 181-192 (2001)) 2回実施した。 VH遺伝子 cDNAs を pBluescript にライグーションし、 自動シ一タエンサ一により配列を決定した。
(結果)
1. Daudi にマウス GANPを安定的に発現させたトランスフエクタントの V領 域遺伝子の体細胞突然変異 （SHM)
G AN P遺伝子を、 インビトロで SHMの分析に使用される各種ヒ ト Bリンパ 球細胞に導入した (Rogozin, I. B. , et al. , Nat. Immunol. 2, 530 - 536 (2001); Kuwahara, K. et al. Blood 95, 2321-2328 (2000); 及ぴ Denepoux, S. et al. , Immunity 6, 35-46 (1997))。 多くの B細胞株にはトランスフエクシヨンできな かったが、 維持中は SHMを通常は生成しない A I Dを発現する Daudi B細胞に は g a n p遺伝子を導入できた。 このクローンは、 野生型及び偽トランスフエク シヨンした細胞と比較して高頻度の SHM (5x l(T4/bp)を V-領域で示した。 SHMは、 定常領域遺伝子には誘導されなかった（図 8)。 GANPの R Aプライマーゼ活性 は S502でのリン酸化により調節され、これは特異的モノクローナル抗体により検 出できる （Kuwahara, K. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98， 10279—10283 (2001) )0 インビトロ及びインビボでの B細胞の刺激は共に S502のリン酸化を誘 導するので (Kuwahara, K. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279 - 10283 (2001))、 このリン酸化が Daudi B細胞での SHMの生成に関与するかどうかを調べ た。 非リン酸化 GANP変異体（GANP-S502A)を導入した場合、 SHM は誘発さ れなかったことから （図 8)、 S502のリン酸化が、 GC-B細胞での SHMの生成に重 要であることが示唆された。
2. B細胞で G AN Pを過剰発現させたトランスジエニックマウス
免疫応答における GANPの関与を調べるために、ヒ ト Igェンハンサー及びプ 口モーターの制御下の GANP-トランスジエニック （Tg)マウスを作製した （図 9の a及び b )。このマウスは、 B細胞で G AN Pの発現の増加を示し（図 9の c )、 骨髄、 脾臓及びリンパ節の細胞の表層マーカー分析により B系細胞の通常の分化 を示した。 SHMにおける G A N Pのインビボでの役割を調べるために、 TD-Ag NP-CG での免疫後における VH186.2 領域について調べた。 VH186.2 ローカスは、 高親和
3 .
性 IgG (γ 1 λ 1) ΝΡ—応答について 特 3有のパターンの SHMを示す。 NP- CGでの 免疫後における全脾臓 B細胞の配列分析により、 野生型マウスと比較して G AN P-Tg マウスでは SHMの頻度が僅かに増加していることが示された（図 1 0)。 こ のマウスは、 3 3番目の Wから Lへの SHMの増加を示した（〜 3倍）。この変異は、 ハプテン特異的 B 細胞の親和性成熟に重要であることが以前に示されている
(Allen, D. , et al. , ΕΜΒΟ J. 1995-2001 (1988))。
3. Β細胞特異的 GANP欠損マウス（Β-ΚΟ)の作製
RNA-プライマーゼ GANPの役割を調べるために、 Cre- ΙοχΡシステムを用いて CD19+B細胞をターゲットにして GANP遺伝子を欠失させた GANP — B-マウ スを作製した（図 1 1の a及び b)。 floxed B細胞は GANP mRNA (図 1 1の c) を発現せず、 また免疫染色によればタンパク質 （図 1 1の d) をほとんど発現し ない。 GANP— ΛΒ-マウスは正常に成育し、 骨髄、 脾臓、 リンパ節で正常な数の リンパ細胞を示した。 フローサイトメ トリー分析では、 骨髄、 胸腺及び脾臓の細 胞の表面マーカーについて正常の染色プロフィールを示した （図 1 2)。リンパ節 では、
Figure imgf000034_0001
を発現する成熟 B細胞の数が減少していた。 GANP— β- マウス由来の Β細胞は、インビトロで抗 μ抗体、抗 μ抗体 +抗 CM0モノクローナ ル抗体、 またはリポ多糖による刺激後に通常の増殖応答を示した （図 1 3)。 血清 Ig量は野生型と同様であった。
4. G AN P — B-マウスにおける抗原特異的抗体産生
TI-Ag及び TD- Agによる免疫に対する G AN P B-マウスの応答を調べた。 免 疫の 14日後に、 トリニトロフエニル（TNP)- Ficoll は G AN Ρ—Λ B-マウス及び 野生型マウスにおいて同様の応答を誘導した（図 1 4)。 ΤΝΡ- keyhole limpet hemocyanin (KLH)及び NP- CGなどの TD— Agsに応答して、 変異体マウスは野生型 と比べて遅延した GC形成を示した。 GANP B-マウスは 10日目まで明確な GCを示さなかった力 TNP- KLHによる免疫後の 14日目に GCの段階的な増加と拡 大を示した （図 15)。 GC 形成のピーク応答は野生型と比較して遅延しており、 野生型は、 10日目に GC-B細胞のマーカーであるピーナッツァグルチニンで染色 された大きな成熟した GCを示した。 GANP B-マウスは 14日目に GCの明白 な形成を示したので、抗原特異的抗体応答を測定した （図 16)。 変異体マウスは T P-KLHに対して同様の抗体応答を示した。
5. G AN ρ- B-マウスにおける親和性成熟の障害
GANP— B-マウスにおける GC の特徴をさらに調べるために、 抗原特異的 IgGl GC-B 細胞を NP- CG による免疫後に調べた。 図 1 7に示す通り、 NP-特異的 IgGlhighCD38low B 細胞は G AN P— B-マウスでは著しく減少した。 対照的に、 IgGlhighCD38highメモリー B細胞は減少しなかった。 これらの結果は、 GANP の 空の変異は IgGlhighCD38lOT GC-B細胞段階で B細胞の分化に欠陥を生じさせている ことを示す。 SHMは B細胞分化のこの段階で生じるため、 VH186.2ローカスの SHM について各種の精製した B細胞を調べた。 VH186.2ローカスは、 高親和性 IgG (y Ιλΐ) NP-応答のために利用されている。 IgMローカスは野生型と比較して差異が なかった。 そこで、 Ag-結合 IgGl B細胞を図 1 7に示す通り精製し、 VH186.2 の 配列を比較した（図 18)。 GANP B-マウスの IgV-領域配列の全体の変異は 野生型と同様であつたが、 W33から Lへの高親和性型の変異 （C57BL/6マウスで 顕著に見られる） は、 変異型マウスでは顕著に減少していた。
6. まとめ
GANP— ΛΒ -マウス及び GANP- Tgマウスの結果は、 GANPが TD- Agによ る免疫後における高親和性 B細胞の生成に関与していることを実証している。 G ANPの役割としては、 GC-B細胞で DNAポリメラーゼの効率的なリクル一トと調 節を仲介している可能性がある。 V-領域 SHMを有する GC-B細胞が高親和性 BCR を取得すると、 それらは選択されるべきであり、 そしてさらに B細胞の V領域の SHMは抑制されて、インビボで高親和性抗体の産生が保証されるはずである。 GC-B 細胞での AIDの発現は DNA変異を絶えず生成する可能性があるため、 AID活性の 調節が B細胞での高親和性 BCRを維持するために必要であるかもしれない。 GA N P B-マゥスでの結果から、 GANPが SHMプロセスに必要であることが示さ れる。 実施例 3 ： GANPトランスジエニックマウスを用いた高親和性抗体の産生 野生型 （WT) マウスと GANPトランスジエニック （Tg) マウスの 2匹づ つに NP- CG 100 μ gを免疫し、 28日後の血清を取り、 ELISAを行った。 20μ g/ m 1の NP2- BSAと NP17-BSAを ELISAプレートに 4°Cで 1晚コーティングした。 3% BSA/PBS-0. l%Tween20 で 1 時間ブロック し、 血清を 1 時間反応させた。 PBS-0. l%Tween20 で 3回洗い、 ビォチン標識抗マウス IgGl 抗体（Southern Biotechnology)で 1時間反応させた。 PBS- 0. l%Tween20で 3回洗い、 アル力リホ スファターゼ標識ストレプトアビジン（Southern Biotechnology)で 30分反応させ た。 PBS- 0. l%Tween20で 3回、 TBSで 1回洗い、 p- Nitrophenyl phosphateを基質 として発色させた。 吸光度を 405nmで測定した。 結果を図 1 9に示す。 図 1 9の 結果から、 GANPトランスジエニックマウスを使用することにより高親和性抗 体が産生されることが分かる。 産業上の利用の可能性
本発明による G A N Pを過剰発現したマウスを用いることによって、 従来では 得られることのできなかったウィルス抗原に特異的で高親和性の抗体を速やかに 作成することができる。 そのため、 エイズや C型肝炎のように遷延する感染によ る病状悪化を当該のウィルス抗原の変異に遅れないで特異的で強力な抗体を速や かに得ることが可能となると期待される。 また、 これによつて、 感染患者からの ウィルスの抗原の変異に対応するオーダーメードの特異的抗体を作成することが できる。モノクロナール抗体の作成に必要な免疫期間は 1 0日程度で十分であり、 そのうち高親和性の変異を持つ抗体の産生効率は 6 0 %近くに上る。 べッドサイ ドの患者サンプルを用いる高親和性抗体の産生プロ トコールはワクチン療法に変 わる新しい免疫療法となると期待される。

Claims

請求の範囲
1. GANP遺伝子を導入したトランスジエニック哺乳動物、 その子孫又は それらの一部。
2. 導入した G AN P遺伝子を B細胞で発現する、 請求項 1に記載のトラン スジエニック哺乳動物、 その子孫又はそれらの一部。
3. GANP遺伝子をトランスフエクションした E S細胞から発生させた、 請求項 1又は 2に記載のトランスジエニック哺乳動物、 その子孫又はそれらの一 部。
4. 請求項 1から 3の何れかに記載のトランスジエニック哺乳動物又はその 子孫に抗原を投与して抗体を産生する、 高親和性抗体の産生方法。
5. 請求項 4に記載方法により産生される高親和性抗体又はその断片。
6. 請求項 5に記載の高親和性抗体又はその断片を含有する、 疾患の診断、 治療又は予防のための薬剤。
7. 請求項 5に記載の抗体の V領域を含むヒ ト型抗体又はその断片。
8. 請求項 7に記載のヒ ト型抗体又はその断片を含む薬剤。
9. 抗原を投与した請求項 1から 3の何れかに記載のトランスジエニック哺 乳動物又はその子孫から採取される、 高親和性抗体産生細胞。
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